KR20060067203A - 인간 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다.
신경전구체세포, 단일클론항체, 52-A11
Description
도 1은 Miz-hES1에서 인간 신경전구체세포인 hNPST1을 유도하기 위해 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅된 플레이트에서 13일 배양 후 신경전구체세포 구를 형성하는 것을 보여주는 것이고,
도 2는 도 1의 신경전구체세포를 생쥐에 복강 주사 한 후 얻은 혈청에 존재하는 다클론 항체인 IgG와 IgM 형의 항체가 신경전구체세포의 표면에 결합하는 것을 형광 세포염색을 통하여 나타내는 그림이고(이때, 실선은 다클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다),
도 3은 형광 세포염색을 통하여 hNPST1 세포가 신경전구체 세포마커인 CD133과 NCAM에 대해 양성인 것을 보여주고 본 발명의 단일클론항체 52-A11가 hNPST1에 결합하는 것을 나타내는 그림이고(이때, 실선은 단일클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다),
CD133 : 신경전구체 세포에 결합하는 항체(양성대조군),
NCAM : 신경전구체 세포에 결합하는 항체(양성대조군),
도 4는 형광 세포염색을 통하여 본 발명의 단일클론항체 52-A11가 인간배아줄기세포 Miz-hES1에 여전히 결합하지만 암세포인 Choi-CK, SCK, 인간 PBL(peripheral blood lymphocyte)에는 결합하지 않는 것을 보여주는 그림이고(이때, 실선은 단일클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다),
도 5는 면역 형광 세포염색을 통하여 본 발명의 단일클론항체 52-A11이 또 다른 인간배아줄기세포인 HSF6에서 유도된 신경전구체세포에 결합하는 것을 보여주는 그림으로 신경전구체세포가 전구체마커인 네스틴(nestin) 양성이고 52-A11도 그 세포에 결합하고 함께 이중 염색된다는 것을 보여주며(이때, DAPI은 핵만을 염색한 것이고 Merge는 네스틴과 52-A11염색을 합친 것으로 노란색으로 나타난다),
도 6는 면역 형광 세포염색을 통하여 본 발명의 단일클론항체 52-A11이 또 다른 인간배아줄기세포인 HSF6에서 유도된 신경전구체세포에 결합하는 것을 보여주는 그림으로 신경전구체세포가 초기 뉴런마커인 TuJ1 양성이고 52-A11도 TuJ1 항체 염색된 부분과 일부 이중염색된다는 것을 보여주며(이때, DAPI은 핵만을 염색한 것이고 Merge는 TuJ1과 52-A11염색을 합친 것으로 노란색으로 나타난다),
도 7는 면역 형광 세포염색을 통하여 본 발명의 단일클론항체 52-A11이 또 다른 인간배아줄기세포인 HSF6에서 유도된 신경전구체 세포에 결합하는 것을 보여주는 그림으로 신경전구체세포가 성상세포(Astrocyte) 마커인 GFAP 음성이고 52-A11와 전혀 겹치지 않는다는 보여주는 그림이다(이때, DAPI은 핵만을 염색한 것이고 Merge는 GFAP과 52-A11염색을 합친 것으로 노란색으로 나타난다).
본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물의 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서, 이 세포 내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있 는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.
인간 배아줄기세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass)만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화 상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000). 배아줄기세포의 배양은, 1981년 처음으로 생쥐의 배아줄기세포 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서의 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol. Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 생쥐 배아줄기세포 연구에 비해 인간 배아줄기세포 연구는 아주 짧은 역사를 지니고 있지만, 인간 배아줄기세포 연구를 통해 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝힐 수 있으므로, 현재 그 연구가 활발히 진행되고 있다.
파킨슨병(Parkinson's disease), 알쯔하이머병, 탈수초질환(demyelinating disease), 루게릭병(amyotro- phic lateral sclerosis) 및 척추손상에 의한 사지마비 등의 뇌신경 퇴행성 질환은 뇌신경조직에 특정 신경세포의 영구적 손실 및 기능장애에 의해 초래되며 뇌신경조직은 손상 시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 근본적인 치료법이 없는 실정이다. 뇌 신경조직이 신경세포 간의 시냅스에 의한 회로에 의해 그 기능을 담당하고 있다는 점을 고려할 때, 손상된 뇌조직의 재건을 위해서는 신경줄기세포로부터 신경세포의 분화 유도, 분화된 신경세포로부터 표적물로 축색의 연장 및 새로운 기능적 시냅스 형성이 도모되어야 한다. 아직까지 이들 각 단계가 어떤 기전에 의한 것인지 알려지지 않았는데 이는 적절한 실험 시스템이 구축되지 않았기 때문이다.
초기 신경 배양물(primary neuronal culture)이나 암 유전자를 도입한 신경세포주는 이미 분화가 끝났거나 암 세포주라는 이유로 그 이용에 한계가 있으나 신경줄기세포는 시험관 내(in vitro)에서 미토겐(mitogen)에 의해 증식을 유도할 수 있고, 여러 가지 방법으로 분화도 유도할 수 있으므로 이를 이용한 연구는 다양한 뇌질환 치료에 응용할 수 있을 것이다(Rosaria, et al., J. Neurochem. 89, 286-306, 2004).
한편, 인간 신경줄기세포는 태아나 성인조직에서 얻을 수 있으나 이는 윤리적인 문제가 따르며, 많은 환자들에게 필요한 만큼의 충분한 양을 얻을 수 없다. 중뇌(midbrain)의 흑질(substantia nigra)에 위치한 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)가 점차적으로 죽거나 손상되면서 야기되는 퇴행성 뇌신경질환인 파킨슨병이 태아의 중뇌조직 이식으로 뚜렷한 호전을 보였으나, 환자 한 사람당 발생 6 내지 10주된 낙태아 6 내지 10명 정도의 뇌 조직에서 분리한 전구세포가 필요하는 등의 실질적인 어려움이 있다(Kordower et al., J. Comp. Neurobiol., 370: 203-230, 1996). 배아줄기세포로부터 다수의 도파민성 신경세포의 전구세포(dopaminergic neuronal precursor cells)를 배양해 낼 수 있다면 윤리적 문제도 피할 수 있고, 무제한적으로 유도해 낼 수 있음으로 그 치유의 길은 아주 밝은 편이다. 실제로 생쥐 배아줄기세포 연구에서 밝혀진 결과에 의하면, 줄기세포로부터 얻어진 동일한 네스틴(Nestin)-양성의 줄기세포는 적당한 분화조건에 따라 신경세포세포로 분화될 수 있으며, 질환동물모델 생쥐에다 이식하였을 때 그 병세가 호전될 수 있는 것으로 보고 된 바 있다(Kim et al., Nature, 418: 50-56, 2002; Lee et al., Nature Biotechnol. 18: 675-679, 2000). 이러한 연구결과는 인간 배아줄기세포에서 얻어진 네스틴-양성 세포로부터 기능성 신경세포를 배양해 낼 수 있음을 시사해 주었다. 실제로 인간 배아줄기세포에서 신경 전구세포를 유도하여 다양한 기능성 신경세포로 분화시킬 수 있음이 보고 되었다(Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19: 1129 - 1133; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 19: 1134 - 1140, 2001).
뇌질환 세포 치료법에서 배아줄기세포를 이용하여 신경줄기세포로의 분화 유도가 이루어지면 그 다음 중요한 것은 다량의 신경 줄기세포만을 순수 분리해 내 직접 사용하거나 다음 단계의 기능성 신경세포로 분화를 유도하는 것이다. 현재까지 인간 신경줄기세포를 동정하기 위한 마커들은 대부분 세포내 존재하는 것으로 중간적 필라멘트인(intermediate filament) 네스틴(Nestin)(Lendhal, et al., Cell 60:585-595, 1990), Vimentin(Kilpatrick et al., Neuron 10:255-265, 1993), A2B5(Mujtaba, et al., Dev. Biol. 214:113-127, 1999), RNA 결합 단백질 Musashi-1(Good, et al Genomics 2:382-384, 1998)등이 있으며, 세포표면에 존재하는 마커로는 PSA-NCAM(polysialylated neuronal cell adhesion molecule)과 CD133(Uchida, et al., PNAS 97:14720-14725, 2000)이 있다. PSA-NCAM 항체는 메닝고코커스 그룹 B(Meningococcus Group B) 다당류에 대해 만들어진 단일클론항체로서, 생쥐의 배아 또는 성체에서 약 180kD 당단백질인 NCAM의 폴리시알로실(polysialosyl) 단위를 인식하며, 플로우 사이토미트리(Flow cytometry)에 이용이 불가능하여 세포분리에는 이용할 수 없다(Rougon, G. et al., J. Cell. Biol. 103, 2429-2437, 1986). CD133 항체는 인간 조혈모세포인 CD34 양성세포에서 발현하는 약 97 kD 단백질을 인식하는 항체로서, CD133은 신경줄기세포에서도 발현이 확인되었다. 그러나, 이들 마커와 이에 대한 항체로는 복잡한 신경전구체의 분화과정을 정확히 규정하기 힘들며, 표면 분자인 CD133을 제외하고는 신경줄기세포를 온전하게 분리하는데 응 용할 수 없다. 따라서 신경줄기세포의 연구와 응용 및 분리를 위한 더 많은 세포표면 마커의 개발이 절실하다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 인간 배아줄기세포에서 유도한 인간 신경전구체세포(출원번호 10-2004-0011705)를 직접 면역주사하여 신경전구체세포의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제조하여 신경전구체세포의 다분화능을 포함한 특성분석과 세포 치료법에 응용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 검정 키트를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단 일클론항체에 관한 것이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11를 제공한다.
본 발명에서 용어 “단일클론항체”란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다.
항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 특히 CDR(complementarity determining region)이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은, 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명자는 미분화된 인간 배아줄기세포에서 분화 유도한 인간 신경전구체세포(특허출원 출원번호 10-2004-0011705)에 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위해, 인간 신경전구세포구를 대량으로 배양하고 그 특성을 분석한 후 배양 세포가 인간 신경전구체세포임을 확인하고, 이를 생쥐에 면역 주사한 후 분리한 비장세포 를 암세포와 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 본 발명의 단일클론항체 52-A11을 분리, 정제하고, 상기 항체가 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 단일클론항체(IgM 타입)는 공지된 CD133 항체(IgG 타입) 및 NCAM 항체가 인식하는 항원과 다른 항원을 인식하는 새로운 항체임을 확인하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
구체적 실시에서, 본 발명의 하이브리도마는 인간 신경전구체세포를 스크래퍼로 긁어 모아 DNAse를 처리한 후 잘게 쪼갠 후 생쥐에 복강에 주입한 후 상기 생쥐의 비장에서 림파구를 분리하여 상기 림파구를 골수종 암세포와 융합하여 제조하였다.
단일클론항체 52-A11을 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.
단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시에서는 본 발명의 단일클론항체의 대량 생산을 위해, 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액에서 배양하고 이를 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피을 이용하여 분리하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 사용하여 인간 신경전구체세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 단일클론항체는 세포치료를 위해 이식될 세포 중에 존재하는 신경전구체세포가 아닌 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있으며, 신경전구체세포 만을 선택적으로 분리하기 위해서, 본 발명의 단일클론항체를 공지의 겔과 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 그 외도 구슬(bead)이나 폴리머(polymer)등이 있으나 이로 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포의 검정 키트에 관한 것이다.
본 발명의 단일클론항체는 항원-항체 복합체 반응을 통해 인간 신경전구체세 포를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 검정 키트에는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레 아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy)3]
2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57
Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186
Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간 신경전구체세포의 배양
본 발명자들은 인간 배아줄기세포 Miz-hES1을 성삼의료재단 미즈메디병원(대한민국 서울시 강서구 내발산동 701-4)으로부터 분양 받아서, 인간 배아줄기세포로부터 분화시킨 인간 신경전구체세포를 만들어 hNPST1이라 명명하였다(10-2004-0011705)(도 1). 상기의 인간 신경전구체세포를 N2 배지(DMEM/F12, 25㎍/㎖ 인슐린(insulin, Sigma), 100㎍/㎖ 트랜스페린(transferrin, Sigma), 60μM 푸트레신(putrescine, Sigma), 20nM 프로게스테론(progesterone, Sigma), 30nM 소듐셀레나이트(sodium selenite, Sigma), 2㎍/㎖ 헤파린(heparin, Sigma), 20ng/㎖ bFGF(Invitrogen))에 배양하고, 배지는 2일에 한번씩 교체하였으며, 6일 간격으로 계대배양하였다. 계대배양은 0.25% 트립신(trypsin)/0.1 mM EDTA 2㎖을 넣고 37℃, 3분간 처리한 후, 트립신 활성을 억제하기 위해 피더(feeder) 배지 8㎖을 첨가해서 1200rpm, 3분 동안 원심분리하여 상기의 신경전구체세포만을 분리한 후, 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅된 100㎜ 플레이트에 2 × 106개의 세포를 접종시킨 후 배양하였다.
<실시예 2> 생쥐 하이브리도마의 제조
<2-1> 생쥐에 인간 신경전구체세포의 면역주사
상기 실시예 <1>의 방법으로 배양한 인간 신경전구체세포를 스크래퍼(scraper)로 긁어모아 파이펫팅을 수행하여 단일세포로 분리한 후, 37℃에서 30분 간 DNase(80 Units/㎖)를 처리한 다음, PBS로 2회 세척하였고, 약 2× 106의 세포를 200㎕의 PBS에 부유하여 상기 신경전구체세포를 Balb/c 생쥐(한국생명공학연구원 실험동물실)의 복강에 3주 간격으로 3회 반복 투여한 후 채혈하여 FACS를 수행하여 인간 신경전구체세포에 대한 항체가 형성되는지를 확인한 다음(도 2), 세포융합 3일 전에 다시 주사하였다.
<2-2> 단일클론 항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마의 제조
피더(feeder) 세포를 채취하기 위하여, 세포융합 하루 전에 건강한 생쥐의 복막에 DMEM(GIBC0) 배지를 20㎖을 채웠다 다시 빨아내는 방법으로 복강내에 있는 세포를 채취한 다음 원심분리하여 얻은 세포와 정상 비장을 갈아서 추출한 세포를 섞은 다음 20% 우태아혈청을 넣고, 웰당 1× 105개 세포가 되도록 96웰 플레이트에 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 2주 전부터 비장세포와 융합할 NS1 골수종(myeloma) 세포주(ATCC, USA)도 RPMI-1640(GIBCO사)과 10%의 우태아혈청을 혼합한 배지에서 배양하였다.
상기 실시예 <2-1>에서와 같이 인간 신경전구체세포로 면역시킨 생쥐로부터 비장을 채취하여 RPMI-1640(GIBCO사)으로 세척하고 유리봉으로 분쇄한 후 세포 부유물을 15㎖ 튜브에서 방치하여 찌꺼기가 가라앉으면 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 세포수를 계산하였고, NS1 세포를 원심분리하여 취한 후 10㎖ RPMI-1640에 현탁하 여 세포수를 계수하였다. 1× 107개의 NS1 세포와 1× 108개의 비장세포를 50㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200× g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 37℃ 물이 채워진 비이커에 2분간 방치한 후 천천히 흔들면서 1 ㎖ PEG 용액(GIBCO사)을 1분 동안 첨가하였다. 100× g, 2분간 원심분리하고 5㎖ RPMI-1640 배지를 3분에 걸쳐 서서히 넣고, 다시 5㎖의 RPMI-1640 용액을 2분에 걸쳐 서서히 넣은 다음 200× g로 원심분리하여 세포들을 회수하고, 30㎖의 정상 배지(RPMI-1640 + 20% 우태아혈청)에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO2 배양기에서 30분간 방치한 후 미리 배양하여 둔 MEF 세포(피더 세포)가 깔린 96웰 플레이트에 웰당 70㎕씩 1× 105개의 세포가 되도록 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 다음 날 70㎕ HAT를 더하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다.
항체가 발현되는 클론을 선별하기 위하여 샌드위치 ELISA(Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100㎕을 첨가해 37℃에서 1시간 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액을 넣어 1시간 반응시켰다. 0.05%의 트윈-20(Tween-20, Sigma)을 첨가한 PBS로 플레이트를 3회 세척하고, OPD(Sigma)와 H2O2가 포함된 기질용액을 첨가한 후, 492㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 우선적으로 선별하였다.
<실시예 3> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체의 제조
<3-1> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선발
상기 <실시예 2>의 방법으로 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 조사하였다. 구체적으로, 배양한 인간 신경전구제세포에 세포분리 완충액(cell dissociation buffer, GIBCO)으로 37℃, 40분 처리하여 뭉쳐 있는 인간 신경전구체세포를 단일세포로 분리한 뒤, 40㎕ 스트레이너(strainer)를 통과시켜 2 × 105개의 세포를 플로우 사이토미트리(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일세포화된 인간 신경전구체세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)에 부유시키고 각각의 항체 상층액을 4℃에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 1300rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBA로 2회 세척하였다. 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석해서 4℃, 30분 반응시킨 다음 PBA로 2회 세척하고, PI(Propidium Iodide) 음성인 세포들만 골라 FACS 칼리버(caliber)로 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 분석하였다.
그 결과를 바탕으로, 인간 신경전구체세포에 결합하는 항체를 분비하는 다양한 하이브리도마들을 선발하여 계속 계대배양하면서 서브클로닝하였다. 확실하게 안정성을 유지하고 인간 신경전구체세포에 대한 특이성을 유지한 항체를 분비하는 하이브리도마 52-A11를 선발하였다.
상기 단일클론항체 52-A11를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.
<3-2> 생쥐 단일클론항체의 정제
상기 실시예 <3-1>에서 선별한 하이브리도마로부터 항체 52-A11를 분리하였다. 구체적으로, 52-A11 항체를 정제하기 위하여, 일주일 전에 0.5㎖의 프리스탄(pristane)을 접종한 Balb/c 생쥐의 복강에 상기 하이브리도마 세포를 ㎖당 1X107개의 세포수로 0.5㎖의 인산완충액에 용해시켜 주사하고, 주사 10-14일 후 주사기로 복수를 추출하고, 상기 복수를 원심분리하여 상층액만 모았다. 상기 복수액 1㎖에 인산완충액을 첨가하여 2㎖로 희석시켰다. 또한, 1nM의 EDTA와 0.02%의 NaN3을 상기 복수액에 첨가하고, 0.22㎛ 여과기로 여과하였다. 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 회전하면서 항체를 결합시키고 컬럼을 똑바로 세워서 혈청 분리관을 이용하여 컬럼의 벽면을 세척액(0.5 M의 NaCl, 0.1 M의 Tris, pH 8.0)으로 세척하고, 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 세척액으로 충분히 세척하였다. 세척 완료후, 0.2M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때, 미리 준비한 1M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다.
<실시예 4> 단일클론항체의 특이성 분석
상기 실시예<3-2>에서 정제한 52-A11 항체의 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 형광 세포염색을 통하여 상기 실시예<3-1>과 동일한 방법으로 조사하였다(도 3). 도 3 에서 왼쪽은 기존에 신경줄기세포의 마커로 알려진 NCAM과 CD133에 대한 염색을 통해 이 세포가 신경전구체세포임을 확인하는 것이고 오른쪽은 본 발명의 단일클론항체 52-A11가 신경전구체세포에 결합하는 것을 보여 주는 것이다. 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것으로 음성대조군을 말하는 것이고 파란 실선은 52-A11 항체가 인간 신경줄기세포에 강하게 결합함을 보여 준다.
또한, 인간 배아줄기세포(Miz-hES1), 담도암 세포(Choi-CK, SCK), 간암세포(HepG2), PBL(peripheral blood lymphocytes) 세포에 대한 결합능을 조사하기 위해, 먼저 상기 세포를 각각 배양한 후, 콜라겐 분해효소 Ⅳ나 세포분리 완충액를 처리하여 분리하였다. 상기 52-A11 항체를 상기와 동일한 방법으로 플로우 사이토미트리를 수행하였으며, 그 결과 52-A11 항체가 상기 인간 신경전구체세포, 인간 배아줄기세포, HepG2 세포에는 결합하고, Choi-CK, SCK, PBL 세포에는 결합하지 않음을 확인하였다(도 4).
<실시예 5> 다른 신경전구체 세포에 대한 반응성
상기 52-A11 항체가 다른 인간배아줄기세포인 HSF6(Abeyta, et al. Hum. Mol. Genet. 13:601-608, 2004)에서 유래한 인간 신경전구체세포에 대해 결합하는 능력을 면역세포화학적(immunocytochemistry) 분석을 통하여 조사하였다(도 5). HSF6 세포를 CF1 피더에서 배양 후 1주일 간격으로 콜라겐 분해효소 IV로 30분 동안 처리한 후, 스크래퍼로 긁어서 가라앉은 세포를 사용하여 계대하였다. HSF6를 지지세포인 PA6에서 1주일 동안 ITSA 배지(2.5μg/㎖ insulin, 25μg/㎖ transferrin, 30nM sodium selenite, 0.2m Mascorbic acid)에서 키우고 콜라겐 분해효소로 처리한 후, PA6-shh(shh이 트랜스펙션된 세포l)에서 1주일 동안 배양하고, 다시 콜라겐 분해효소로 처리하여 O/F(폴리-L-오르니틴(15 μg/ml)과 피브로넥틴(1 μg/ml)) 코팅된 접시에서 ITSA와 bFGF 20ng/ml로 일주일에서 2주일 동안 배양하여 신경 전구체세포를 만들었다. 이 세포를 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시키고, 0.1% BSA/PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, 블록킹 용액(10% normal goat serum, 0.3% triton X-100, 0.1% BSA, PBS)으로 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 이어서 1차 항체를 10% 정상 염소 혈청, 0.1% BSA가 PBS에 섞인 용액에 섞고 4℃ 밤새 반응시켰다. 52-A11 이외의 이중염색을 위해 사용된 1차 항체는 토끼 항-네스틴(nestin)(1:50), 토끼 항-TuJ1(1:2000), 토끼 항-GFAP(1:400)이다. 사용한 2차 항체는 52-A11(IgM) 항체의 경우 FITC 결합된 anti-생쥐 IgM(Sigma)를 100배 희석해 사용하고, 생쥐 IgG를 1차 항체로 사용하는 경우 로다민 결합된 anti-생쥐 IgG (Vector)를 400배 0.1% BSA/PBS에서 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척은 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 후 물로 2회 수행하고, DAPI가 포함된 Vectashield로 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 확인하고 사진을 찍었다.
도 5는 52-A11 항체와 인간 신경전구체세포의 마커인 네스틴이 거의 일치하는 것을 보여주는 것으로 52-A11이 신경전구체의 또 다른 마커임을 나타낸다. 도 6은 초기 뉴런의 마커인 TuJ1와는 일부만 이중염색됨으로 52-A11이 초기 뉴런 이전의 신경전구체 마커임을 나타낸다. 도 7에서 보이는 것처럼 성상세포 마커인 GFAP는 전혀 함께 염색되지 않았다. 이런 결과로부터, 52-A11 항체는 분화되기 전의 신경전구체 마커를 인식하는 새로운 항체임이 입증되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하므로, 인간 신경전구체세포의 연구 및 세포 치료시 인간 신경전구체 분리에 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (4)
- 기탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11.
- 기탁번호 KCTC 10744BP로 기탁된 하이브리도마.
- 제1항의 단일클론항체 52-A11를 포함하는, 인간 신경전구체세포 분리용 조성물.
- 제1항의 단일클론항체 52-A11를 포함하는, 인간 신경전구체세포 검정 키트.
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2004
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Comment text: [Withdrawal of Procedure relating to Patent, etc.] Withdrawal (Abandonment) Patent event code: PC12021R01D Patent event date: 20080827 |
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| WITB | Written withdrawal of application |