KR20060059886A - 사다리형 공중합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사다리 구조의 다리/측면으로 기능하는 두개의 백본을 가진 구조에 근거하여 사다리형 공중합체로 명명된 공중합체에 관한 것이다. 이러한 두개의 백본(둘 중 하나는 핵산 또는 핵산 유사 폴리머이고 사다리의 다리/측면으로서 서로 결합되어 있음)은 가로대에 의해 서로 결합된다.
사다리형, 핵산, 폴리머, 공중합체, 핵산, 다리, 측면, 가로대
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2003년 5월 29일에 출원된 가출원 제60/473,915호에 근거하여 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 취합되어 있다.
정부의 라이선스 권리
본 출원에서 수행된 실험은, 해군 연구국(Office of Naval Research)의 허가 번호 N00014-98-1-0093호와, 국립보건원(National Institute of Health)의 허가 번호 GM-29554호와, 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 허가 번호 CHE-0079702호, DMI-0210844호, EIA-0086015호, DMR-01138790, 및 CTS-0103002호, 그리고 DARPA/AFSOR의 허가번호 F30602-01-2-0561호로서 부분적으로 지원받았다. 미국 정부는 본 발명에 이미 불입한 라이선스를 가지고 있고, 제한된 환경하에서 특허권자로 하여금 위 허가들의 기간에 의해 제공되는 적당한 기간으로 다른 이들에게 라이선스하도록 요구할 권리를 갖는다.
발명의 배경
발명의 분야
본 발명은 2개의 백본(사다리 구조의 다리 또는 측면) 중의 하나가 핵산 또는 핵산 유사 폴리머로 형성되는 사다리형 공중합체에 관한 것이다.
관련 기술의 상세한 설명
지난 반세긴 동안에 핵산의 알려진 기능은 유전 정보 전달체 및 메신저로부터 확대되어 수많은 세포 공정의 촉매 및 조절까지 포함하게 되었다. 추가로 많은 핵산에 기초한 구조들이 약학적 적용, 촉매 특성 및 전생물적 화학(prebiotic chemistry) 문제와 함께 발달되어 왔다(Pearson, 2003; Dennis, 2002; Couzin, 2002). 주목할 만한 예로서 안티센스의 작용제(antisense agent)(Uhlmann et al., 1990)가 있는데, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)(Nielsen, 1999), 디옥시뉴클레익 구아니딘(DNG)(Barawkar et al., 1999), 고정 DNA(LNA)(Vester et al., 2002; Demidov, 2003)이 있다. DNA자임(DNAzymes)은 촉매 능력을 향상시키기 위하여 기능화된 뉴클레오티딜 그룹과 함께 발달되어 왔다(Santoro et al., 2000; Thum et al., 2001; Lermer et al., 2002). TNA, (3',2')-α-L-트레오스 핵산은 RNA 및/또는 DNA의 혁신적인 원조로서 제시되어 왔다. (Schoning et al., 2000; Chaput et al., 2003).
본 발명자들의 목적은 DNA 나노기술의 적용 및 범위를 확대시키기 위하여 핵산에 기초한 신규 물질을 개발하는 것이다(Seeman, 1999). 정의된 서열 및 비범한 구조적 모티프와 함께, 수많은 위상군, 물체, 장비 및 2D 어레이가 기존의 DNA 분자로부터 준비되었다(Seeman, 2003; 미국 특허 제5,386,020; 미국 특허 6,072,044; 미국 특허 6,255,469). 이러한 구조들의 유사한 DNA/유기 폴리머 결합은 실용적인 흥미를 제공한다. 예를 들어, DNA 2D 어레이 (Winfree et al., 1998)은 분자 전자 장치를 정확하게 조립하기 위한 플랫폼으로서 작용하거나, 안정성 및 다른 바람직한 유기물질의 특성을 향유하는 비-DNA 폴리머릭 2D 네트웍을 합성하기 위한 템플 레이트로서 작용한다. 한가닥 DNA는 인위적인 연결을 가지는 DNA 올리고들의 고분자화를 지시하는데 사용된다(Li et al., 2002; Schmidt et al., 1997; Seitz et al., 2001). 본 발명의 목적은, 독특한 구조를 가지는 유기 물질을 조립하기 위하여, 2차 및 3차 DNA 구조 모티프에 달려있는, DNA 나노기술의 모든 역량을 이용하는 것이고, 또한 본 발명의 접근은 비-DNA 엔티티들 사이의 위치특이성 화학을 수반한다.
본 명세서에 인용된 문헌들은, 본 출원의 청구범위의 특허성에 관련한 선행기술이라거나 또는 중요 자료임을 인정하는 자료로서 의도된 것이 아니다. 문헌의 내용 또는 날짜에 관한 언급은 출원 당시 출원인이 입수가능한 정보에 근거한 것이고, 이러한 언급의 정확성에 대하여 출원인이 자인하였다고 볼 것은 아니다.
발명의 개요
본 발명은, 사다리 구조의 가로대(rung)로서 작용하는 백본들 사이의 결합과 함께, 사다리 구조의 측면 또는 다리들로서 작용하는 2개의 백본을 가지는 사다리형 공중합체를 제공한다. 사다리형 공중합체는 하기의 일반식 1을 포함하는 구조를 갖는다.
[일반식 1]
상기 식에서,
A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;
G, J, L, M, Q = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹 ;
B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;
E= CR, N, NR+, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라마이드, 포스포나마이드, 포스피나마이드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 대칭 또는 비대칭 원자 중심
R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹;
X-Y, W-Z 쌍 = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 화학 결합을 형성하거나, 또는 W가 Z와 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리; 및
S = 리보스 또는 변형된 리보스, DNA 유사 구조와 결합된 비환식(acyclic) 또는 유사 사이클릭 빌딩 블락.
본 발명은 사다리형 공중합체의 합성 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 안정한 안티센스 분자로서 사다리형 공중합체를 이용함으로써 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 발생을 저지하는 방법을 제공한다.
도 1은 변형된 포스포라미다이트로부터 비결합 가닥, 그리고 사다리형 올리고머/공중합체를 형성하기 위한 라이게이션에 이르는 사다리형 올리고머/공중합체의 합성을 보여주는 개략도이다. R 1 : - DMTr; R 2 : - P(NiPr2)(OCH2CH2CN); 회색 및 검정색 점은 각각 카르복실 및 아미노 그룹; p1 및 p2는 각각의 보호 그룹이다. 하나씩 걸러 "P"를 가지는 수직 사슬은 핵산 백본을 나타낸다; 핵산 백본 반대편의 수직 사슬은 나일론 백본을 나타낸다; 평행선(오른쪽)은 사다리형 올리고머/공중합체에서의 "가로대(rung)"를 나타낸다. 가장 오른쪽의 구조는 하기의 실시예에서 제조된 사다리형 공중합체를 나타낸다.
도 2는 핵산 노트(도 2a)와 펜던트 그룹을 가지는 핵산 노트(도 2b)를 도시 한 것이고, 위 펜던트 그룹은 사다리형 공중합체를 형성하도록 결합될 수 있다(도 3c). 펜던트 공중합체의 결합은, 핵산으로부터 방출될 때, 폴리머가 노트 구조를 유지하도록 한다(도 2D).
도 3은 2'-디옥시-2'-알킬티오우리딘 포스포라미다이트 합성의 개략을 나타낸 것으로서, 여기서 반응물과 조건은 다음과 같다: (i) RI(1a, 1b) 또는 RBr(1c, 1d), DIEA/CH3CN, 상온, 10 시간; (ii) DMTrCl/피리딘, 상온, 2시간,; (iii) NH2NH2/CH3OH, 환류, 3시간; (iv) CF3CO2Et/CH3OH, 상온, 16시간; (v) ClP(NiPr)2(OCH2CH2CN)/CH2Cl2, TEA, DMAP, 상온, 30분, (a: R=CH2CH(CH2CH2NPhth)2; b: R = CH2CH(CH2CH2CO2Bn)2; c: R=(CH2)4NPhth; d: R= (CH2)4CO2Et; e: R= CH2CH(CH2CH2NHCOCF3)2; f: R=(CH2)4NHCOCF3).
도 4는 2'-변형된 뉴클레오티딜 단위의 구조를 나타낸다.
도 5는 비결합 1 , 5'(dT)6UnUc(dT)8 (톱) 및 결합 가닥 생성물 1C (바닥)의 메트릭스 보조 레이저 탈착 비행 시간형 질량분석기(matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight(MALDI-TOF)의 스펙트럼이다.
도 6은 비결합 ODN 2 , 5'(dT)3UNUC(dT)2UnUC(dT)2UNUC(dT)3(톱) 및 결합 가닥 생성물 2C (바닥)의 MALDI-TOF 질량 분석기 스펙트럼이다.
도 7은 비결합 ODN 3 , 5'-(dT)7UNUCCUN(dT)6 (톱) 및 결합 가닥 생성물 3C (바닥)의 MALDI-TOF 질량 분석기 스펙트럼이다.
도 8은 비결합 ODN 4 , 5'-(dT)7UCUNNUC(dT)6 (톱) 및 결합 가닥 생성물 4C (바닥)의 MALDI-TOF 질량 분석기 스펙트럼이다.
도 9는 비결합 ODN 5 , 5'-(dT)6UCUNNUCCUN(dT)6 (톱) 및 결합 가닥 생성물 5C (바닥)의 MALDI-TOF 질량 분석기 스펙트럼이다.
도 10a 및 10b는 비결합 ODN, 5'-(dT)xUN(dT)nUC(dT)y (x+n+y=14)의 결합 조건하에 처리되기 전(도 10a) 및 후(도 10b)의 MALDI-TOF 질량 분석기 스펙트럼이다.
도 11은 DNA-나일론 결합물 1C , 3C , 4C 및 5C 의 화학구조를 나타낸 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 사다리형 구조의 다리/측면으로서 작용하는 서로 다른 2개의 백본 폴리머를 가지기 때문에 사다리형 공중합체라고 명명한 공중합체에 관한 것이다. 이들 2개의 백본은 그 중 하나가 핵산 또는 핵산 유사 폴리머이고, 사다리 구조의 다리/측면이 사다리의 가로대에 의하여 서로 결합되는 것에 의하여, 서로 연결되어 있다. "핵산"이라는 용어는 DNA, RNA 및 이들 둘의 혼합을 가리킨다. 나아가 핵산 백본 구조는 자연으로부터 이론적으로 만들어지는 임의의 것을 닮을 필요가 없다.
본 발명의 사다리형 공중합체의 일반적인 구조식은 하기의 일반식 1에 의하여 나타내어진다.
[일반식 1]
상기 식에서,
A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;
G, J, L, M, Q = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹 ;
B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;
E= CR, N, NR+, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라마이드, 포스포나마이드, 포스피나마이드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 대칭 또는 비대칭 원자 중심
R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아 로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹;
X-Y, W-Z 쌍 = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 화학 결합을 형성하거나, 또는 W가 Z와 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리; 및
S = 리보스 또는 변형된 리보스, DNA 유사 구조와 결합된 비환식(acyclic) 또는 유사 사이클릭 빌딩 블락.
위에서 아래첨자 예컨대, 1, 2, n, 등은 공중합체를 형성하는 사슬 단위(괄호)에서의 서열을 나타낼 뿐만 아니라, B, W, Z, X, Y등의 문자에 의해 명시되는 모이어티들이 단위들끼리 서로 같거나 같지 않을 수 있다는 것을 표시한다.
X-Y 및 W-Z 쌍은 바람직하게는 전자고리화 반응과 같은 아마이드, 에스테르, 포스포에스테르 또는 알켄 결합을 형성한다. 비록 X-Y 및 W-Z 쌍이 같은 결합을 가질 수도 있으나, 바람직하게는 그들은 서로 다른 결합이다. 더욱 바람직하게는, X-Y 쌍은 아마이드 본드를 형성하고, W-Z 쌍은 핵산 백본에 존재하는 포스포에스테르 본드를 형성한다. 이는 하기에 설명되는 실시예들로부터 명확하게 알 수 있다.
핵산 백본은 단일한 인접 리보스-포스페이트 또는 디옥시리보스-포스페이트 백본을 가질 필요가 없다. 단순한 무기 또는 유기 모이어티 또는 폴리뉴클레오티드 단편들 사이의 중합 스페이서를 채용할 수 있다. 폴리에틸렌, 폴리비닐 고분자, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스티렌, 폴리펩티드(효소, 항체 등), 펩티드 핵산(PNA), 폴리사카라이드(전분, 셀룰로오스 등) 실리콘, 실란 및 공중합체 등과 같은 스페이서들이 채용될 수 있다. 그와 같은 하이브리드 구조의 예는 한편에 포스포라미다이트를 가지는 도데카디올이다. 이러한 구조는 4개의 T 뉴클레오티드를 대신하여 상기 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 헤어핀 루프를 형성하도록 공유결합되어 삽입된다. 상기 용어 "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 이 모든 구조들을 포괄하도록 의도된 것이다.
더욱이, W-Z 쌍이 가장 바람직하게 포스포에스테르 결합을 형성하는 경우에 핵산 백본을 따라서 특정 W-Z 쌍이 포스포에스테르 결합을 형성하지 않는 위치가 또한 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 단일 인접 리보스-포스페이트 또는 디옥시리보스-포스페이트 백본이 존재하지 않는 이러한 불균일성에 의하여 "핵산 유사"로 지칭되는 고분자 또는 백본이 얻어진다. "핵산 유사"인 상기 변형된 백본의 몇몇 예들이 프라이어 등(Freier et al.)의 연구(1997)에 나타나 있으며, 그 전체 내용이 여기에 참조로서 결합되어 있다.
상기 핵산 또는 핵산 유사 고분자 백본 가닥은 다섯 가지 표준인 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U)이 아닌 염기들(B)을 채용할 수 있다. 피리미딘 및 퓨린의 다른 유도체들 및 이노신, K, X, pi, 아미노-아데닌, 이소-시토신, 이소-구아닌과 같은 기타 특이 염기들 및 유도/변형(예를 들어, 메틸화)된 염기들이 사용될 수 있다. 유도/변형된 염기들의 몇몇 예들이 프라이어 등(1997)에 나타나 있다. 상기 염기들을 선택함에 있어서의 바람직한 특성은 그들이 특히 쌍으로 끌어당길 수 있도록 그들의 반대 염기와 상호작용할 수 있다는 점이다. 천연 DNA 및 RNA에 있어서, 수소 결합은 이와 같은 상호작용을 형성한다. 그러나, 반대 이온 전하, 소수성 상호작용 및 반데르 발스 힘은 또한 수용가능한 상호작용의 형태이다. 이러한 상호작용은 자연적으로 발생하는 염기들에 관한 선택의 폭을 넓혀서 더욱 폭 넓은 물리적 성질을 부여한다.
특정 가닥 내에서, 헤테로사이클릭 염기는 슈가 모이어티로부터 완전히 누락될 수 있다. 이는 상기 가닥이 구부려지고 접점을 형성하는 경우나, 더 적은 힘으로 상기 가닥을 결합하기를 원하는 경우에 특히 바람직하다.
S는 리보스 또는 변형된 리보스 또는 DNA와 같은 구조(예를 들어, PNA 및 모르폴리노 백본)와 결합된 비환식(아시클릭) 또는 유사한 사이클릭 빌딩 블록을 나타낸다. 리보스, 변형된 리보스 및 유사한 빌딩 블록 단위들의 비제한적인 실시예들이 아래에 나타나 있다.
변형된 리보스/슈가의 부가적이고 비제한적인 실시예들이 프라이어 등(1997)에 나타나 있다.
핵산 백본 내에 있는 W-Z 결합의 균일성에 대한 선호는 X-Y 결합에도 마찬가지로 적용된다. 그러나, 본 발명은 또한 상기 핵산 또는 핵산 유사 백본과 반대되는 백본에 있어서의 비균일 X-Y 결합들의 존재를 극복하고자 하는 것이다. 측쇄의 존재는 X-Y 쌍들을 가지는 반대 백본 상에서도 바람직할 수 있다는 것이 또한 이해되어야 한다. 예를 들어, 반대 백본 상에 금 입자들을 DNA 회전 당 한번씩 부착하고자 하는 경우에 금 입자와 결합을 형성할 수 있는 설프하이드릴 측쇄를 포함하는 다양한 디아미노 또는 디카르복실 그룹이 적절한 위치에서 상기 백본으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 사다리형 공중합체의 바람직한 실시예에서는 핵산이나 핵산 유사 백본에 반대되는 백본이 폴리아마이드 백본이며, 상기 사다리형 공중합체는 일반식 2를 포함한다.
[일반식 2]
여기서,
A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;
L, M = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹 ;
B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;
R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹;
W-Z = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 화학 결합을 형성하거나, 또는 W가 Z와 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리; 및
S = 리보스 또는 변형된 리보스, DNA 유사 구조와 결합된 비환식(acyclic) 또는 유사 사이클릭 빌딩 블락.
본 발명의 사다리형 공중합체의 바람직한 제2 실시예에 있어서 백본 중의 하나는 핵산 백본이고 상기 사다리형 공중합체는 일반식 3을 포함한다.
[일반식 3]
여기서,
A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;
G, J, Q = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹 ;
B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;
E= CR, N, NR+, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라마이드, 포스포나마이드, 포스피나마이드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 대칭 또는 비대칭 원자 중심
R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹; 및
X-Y = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 화학 결합을 형성하거나, 또는 W가 Z와 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리.
본 발명의 사다리형 공중합체의 또 다른 바람직한 실시예로서, 상기 두가지 백본은 핵산 백본 및 폴리아마이드 백본이다. 가장 바람직한 실시예는 일반식 4를 포함한다.
[일반식 4]
여기서, B는 U, T, A, G, C로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 핵산 염기 및 그 유도체이다. 그리고, 상기 일반식 4의 사다리형 공중합체는 리보스 링들의 2' 위치를 경유하여 폴리아마이드 백본에 공유결합되는 DNA 백본을 구비한다. 링크(사다리의 가로대 부분)가 각 뉴클레오티드에 대하여 존재하며, 하나의 아마이드 결합은 링크된 뉴클레오티드에 대하여 존재한다. 일반식 3(Ⅲ) 및 4(Ⅳ)에 나타난 폴리아마이드 백본은 나일론 5, 7의 등가물에 근접한다. 다른 적절한 폴리아마이드 또는 나일론 백본들이 본 발명의 사다리형 공중합체 내에서 사용될 수 있다. 뉴욕, 제이. 아이. 크로슈위츠(J.I. Kroschwitz) 및 엠. 하우베-그란트(M. Howe-Grant), 존 윌리 앤드 존스(Jone Wiley & Sons) 편집의 커크-오스머(Kirk-Othmer) 화학 기술 대백과(Encyclopedia of Chemical Technology) 4판의 19권 454-559 페이지의 섬유 내의 폴리아마이드 및 폴리아마이드(일반)에 관한 부분에 그 예들이 나와 있으며, 그 전체 내용은 여기에 참조로서 결합되어 있다.
본 발명은 또한 DNA 백본을 가지는 본 발명의 사다리형 공중합체를 형성/생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 2'-β-치환 포스포라미다이트를 합성하고, 이 후, 합성된 2'-β-치환 포스포라미다이트로부터의 펜던트 그룹과 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이어서 상기 펜던트 그룹을 커플링하여 사다리형 공중합체를 제조한다. 일반식 4(Ⅳ)에 대하여, 커플링되는 펜던트 그룹은 아민 및 카르복실레이트 그룹이다. 상기 사다리형 공중합체의 제조 과정이 도 1에 나타나 있다.
본 발명에 따른 상기 사다리형 공중합체는 DNA 또는 RNA와의 이중 또는 삼중 가닥 형성의 안정성을 유지하거나 향상하면서도 뉴클레아제 분해에 안정성을 부여할 것이다. 더욱이, 핵산 백본과의 사다리형 공중합체나 그렇지 않으면 핵산 유사 백본과의 사다리형 공중합체는 다른 사다리형 공중합체 또는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA와 결합하여 A 형태의 헬릭스를 형성할 것이다.
더욱이 반대 백본은 상기 헬릭스의 외측에 위치하여 이중 또는 삼중 가닥 형성에 있어서 염기쌍 형성에 간섭하지 않도록 염기쌍 형성 기능으로부터 격리될 것이 예상된다. 따라서, 상기 사다리형 공중합체는 안티센스 기술에 대하여 유리한 성질들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 사다리형 공중합체는 타겟 센스 mRNA와 안정한 듀플렉스를 형성하는 염기 서열로 디자인되어 상기 타겟을 정상적으로 또는 센스 mRNA를 비활성으로서 번역되지 않도록 할 수 있다. 그러므로, 본 발명은, 안정적인 듀플렉스를 형성하기 위하여 어닐(anneal)하거나/하이브리다이즈(hybridize)하는 타겟 mRNA와 안티센스 올리고머로 작용하는 본 발명에 의한 사다리형 공중합체를 접촉시켜 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하는, mRNA로 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하기 위한 방법을 또한 제공한다.
상기 사다리형 공중합체는 고유의 분자 위상(토폴로지)[가트너 등(Gartner et al.) 2002]를 갖는 바람직한 고분자들, 즉, 산업용 고분자들을 생산하기 위하여 또한 사용될 수 있다. DNA 노트(도 2의 a 참조)은 독특한 분자 위상(토폴로지)(Mueller et al., 1991; Du et al., 1992; Seeman, 1992; Wang et al., 1993; Seemam et al., 1993; Du et al., 1994; Du et al., 1995)의 비제한적인 실시예이다. DNA (노트)이 바람직한 고분자, 즉, 독특한 분자 모르폴로지가 유리한 섬유 고분자의 예인 나일론과 함께 사다리형 공중합체의 집합체(도 2의 b 및 c 참조)를 템플레이트하기 위하여 사용된다면, 상기 DNA는 상기 바람직한 고분자가 상기 노트 구조(도 2의 d 참조)를 보유하도록 한 상태에서 제거될 수 있다. 또한, 예를 들어, 나일론을 사용한다면, 나일론계 DNA 사슬 메일 유사 구조가 DNA로부터 나일론 구성요소 펜던트를 링크함으로써 형성될 수 있다. DNA를 제거하면 현저한 강도를 보여주는 철 사슬 메일과 분자적으로 유사한 나일론 사슬 메일을 얻을 수 있다.
본 발명에 대하여 이제까지 일반적으로 기술한 바와 같이, 본 발명을 제한하는 것이 아닌 단지 예시로서 제공되는 다음 예를 참조하여 본 발명이 더욱 상세히 이해될 것이다.
실시예
여기서, 본 발명자들은 DNA 백본이 유기 고분자인 나일론에 공유결합되는 제1 핵산-염기 구조에 대하여 보고한다. 합성 과정은 2'-β-치환 포스포라미다이트의 제조, 부가된 아민 및 카르복실레이트 그룹과 올리고뉴클레오타이드(ODNs)의 합성, 및 나일론-DNA 사다리형 공중합체(도 1)를 제조하도록 각 뉴클레오타이드 쌍에 공유결합된 올리고아마이드 가닥을 형성하는 펜던트 그룹을 커플링하는 3 단계로 수행되었다. 상기 방법은 일반적인 것으로서 다양한 나일론계 물질을 생산하거나 다른 유기 고분자들의 집합체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
물질 및 방법들
모든 화학물질들 및 용매들은 다양한 상업적 소스들로부터 필요한 순도를 가지도록 얻어졌다. CH2Cl2 및 CH3CN은 CaH2로 환류하여 건조되었다. 모든 반응들이 아르곤 가스의 방호하에서 수행되었다. 필요한 경우 탈수 조건을 이용하였다. 1H NMR, 13C NMR, 31P NMR 및 1H COSY 데이터가 Varian Gemini-200 또는 300 MHz 스펙트로미터 상에 기록되었다. 양의 모드의 매트릭스로 보조된 레이저 탈착 이온화 흐름 속 도(MALDI-TOF) 질량 스펙트라는 매트릭스로서 α-시아노-4-하이드록시시나믹 산(CHCA)를 사용하는 크라토스 MALDI-I 스펙트로미터로 측정되었다. 음의 모드의 I-TOF 질량 스펙트라는 매트릭스로서 트리하이드록시아세토페논(THAP) 및 동시 매트릭스로서 암모늄 타르트레이트를 사용하는 브루커 옴니플렉스 스펙트로미터로 측정되었다. 화합물 2'-데옥시-2'-S-(4-메톡시벤질)우리딘(Divakar et al., 1982) 및 1a(Zhu et al., 2002)가 기록 과정을 위하여 준비되었다. 화합물 1a 및 1b의 합성은 다음과 같다.
2-(2'-
프탈로일에틸
)-4-
프탈로일
-1-
부텐
(B1)
THF(3.0ml) 및 디브로모메탄(0.2mL) 중의 아연 더스트(0.89g, 13.7mmol, 326메쉬)의 서스펜션을 15분간 환류하에 가열하였다. 그런 다음 트리메틸실일클로라이드 (0.5-0.7mL)를 5분간 아르곤 하에서 소니케이션한 혼합물에 첨가하였다. 용매를 진공 하에 건조시켜 제거하였다. 상기 활성화된 아연에 무수 DMSO(5.0mL)를 아르곤 하에서 첨가하였다. 미리 THF(20mL) 중에 용해시킨 N-브로모메틸프탈이미드(3.0g, 12.5mmol)을 한방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였고 여분의 아연을 침전시키기 위해 정치시켰다. 유기 아연 화합물의 맑은 용액을 -60℃에서 주사기를 통해 THF(40mL), CuCN(0.9g, 10mmol), LiCl(1.0g, 23.6mmol) 및 3-요오도-2-요오도메틸-프로펜34(2.5mmol)의 용액에 한방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 72시간동안 격렬히 교반하고 포화 NH4Cl 용액(150mL)으로 중지시켰다. 유기상을 분리하고 유기상을 에틸 에테르로 3회 추출하였다. 유기상을 조합하고 MgSO4 상에서 건조한 후 진공 하에서 농축시켰다. 상기 조 산물을 초기에는 9:1 헥산/에틸 아세테이트를 사용하고 그 다음에 점차 8:2 헥산/에틸 아세테이트로 극성을 높이면서 실리카겔로 크로마토그래피를 수행하여 0.68g(71%)의 산물을 얻었다.
2-(2'-
프탈로일에틸
)-4-
프탈로일
-
부탄올
(B2)
THF 중의 BH3의 1.0M 용액(5.8ml, 5.8mmol)을 THF(50mL) 중의 B1(2.0g, 5.3mmol) 용액에 0℃에서 20분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 추가로 0℃에서 15분간 교반한 후 30% 과산화수소(2.0mL)를 수소의 방출이 중단될 때까지 한방울씩 첨가하여 중지시켰다. 30% NaOH 4-5mL를 이용하여 상기 용액을 염기성으로 만들고 15분간 교반하였다. 상기 혼합물에 물(150mL) 및 에틸 에테르(150mL)를 첨가하였다. 유기상을 분리하고 수상을 에틸 에테르로 3회 추출하였다. 유기상을 조 합하고 MgSO4 상에서 건조한 후 여과하였다. 용매를 진공 하에 제거하고 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피(9:1 CHCl3 : 에틸에테르)하여 1.18g(57%)의 산물을 얻었다.
2-(2'-
프탈로일에틸
)-4-
프탈로일
-1-
요오도
-부탄 (1a)
화합물 B2 (39.0mg, 0.1mmol), 트리페닐포스핀(79.0mg, 0.3mmol), 요오드(56.0mg, 0.3mmol) 및 이미다졸(21.0mg, 0.3mmol)을 THF(1.0mL) 중에 용해시켰다. 그 용액을 실온에서 1시간동안 교반시켜 많은 흰색 침전물이 형성되었다. 용액을 CH2Cl2 및 물 간에 분별시켰다. 유기상을 물로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 진공 하에서 용매를 제거한 후 잔사를 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (20/1 내지1/1)로 크로마토그래피 하여 순수한 화합물 1a(49.1mg)을 98%의 수율로 얻었다.
디벤질
-4-
옥소피멜레이트
(B3)
γ-케토피멜산(3.5g, 20mmol)을 무수 DMF(80mL)에 용해시켰다. 이어서, DIEA(14mL, 80mmol) 및 벤질브로마이드(5.3mL, 44mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 그 용액을 80℃에서 20시간동안 가열하였다. 진공하에서 용매를 제거한 후에 Et2O(200mL) 및 물(100mL) 간에 분별시켰다. 유기상을 물(2 x 50mL)로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 건조시키고 디벤질-4-옥소피멜레이트를 Et2O/석유 에테르로부터 94%의 수율로 재결정화하였다.
디벤질
-4-
메틸렌헵탄디오에이트
(B4)
메틸트리페닐포스포늄 브로마이드(536mg, 1.5mmol)을 -5℃에서 무수 THF(1.0mL) 중에 현탁시켰다. NaHMDS(1.0M, 1.5mL, 1.5mmol)의 THF 용액을 한방울씩 첨가하여 0℃ 미만의 온도로 유지시켰다. 그 혼합물을 0.5시간동안 0℃ 에서 교반한 후 -78℃ 로 냉각시켰다. 이 용액에 THF(1.0mL) 중의 디벤질-4-옥소피멜레이트(354mg, 1.0mmol) 용액을 한방울씩 첨가하고 온도를 -50℃ 미만으로 유지시켰다. 첨가 후 교반하면서 온도를 1.5시간동안 실온으로 올라가도록 방치하였다. 그 반응 혼합물을 냉수(25mL)에 붓고 Et2O(2 x 25mL)로 추출하였다. 유기상을 염수(20mL)로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 제거하고 잔사를 실리카 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 1/10까지)를 하여 화합물 B4(197mg)를 얻었다. 수율은 56%이었다.
디벤질
-4-(
요오도메틸
)
헵탄디오에이트
(1b)
화합물 B4 (176mg, 0.5mmol)을 무수 THF(0.5mL) 중에 용해시켰다. 그 용액을 0℃ 로 냉각시키고 주사기를 통해 BH3-THF(2.0M, 0.25mL, 0.5mmol)을 첨가하였다. 그 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 메탄올 NaOAc(3.0mL, 1.0M, 3.0mmol), 수성 NaI(3.0mL, 1.0M, 3.0mmol) 및 메탄올 클로르아민-T(6.0mL, 0.5M, 3.0mmol)를 실온에서 유기보란 용액에 순차적으로 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 10분간 교반하고 수성 Na2S2O3(1.0M)으로 중지시켰다. 그 혼합물을 Et2O(50mL) 및 H2O(50mL) 간에 분별하고 유기상을 염수(30mL)로 세척한 후 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고 잔사를 실리카 크로마토그래피(CH2Cl2/헥산, 2/100 내지 7/100)하여 화합물 1b (85mg)를 얻었다. 수율은 35%이었다.
2'-
데옥시
-2'-S-(4-
프탈이미딜부틸
)
우리딘
(화합물 2c)
TFA (12.0mL) 중의 2'-데옥시-2'-S-(4-메톡시벤질)우리딘(1.14g, 3.0mmol) 및 페놀(423mg, 4.5mmol) 용액을 환류하에 2시간동안 가열하였다(욕 온도 100℃ ). 냉각한 후 용매를 감압하에 제거하였다. 잔사를 CH3CN (10mL)로 3회 공동증발시킨 후 Et2O (2mL) 중에 용해시켰다. 조(crude) 2'-데옥시-2'-머캅토우리딘을 헥산 (20mL) 첨가에 의해 침전시키고 -20℃ 에서 30분간 유지시켰다. 그 용액을 옮겨붓고 잔사를 헥산(3 x 10mL)으로 세척한 후 진공하에서 건조시켰다(15분). 조(crude) 2'-데옥시-2'-머캅토우리딘을 CH3CN (3.0mL) 중에 용해시키고 이어서 N-(4-브로모부틸)프탈이미드(846mg, 4.5mmol)를 첨가하였다. 디이소프로필 에틸아민(DIEA)(2.6mL, 15.0mmol)을 격렬히 교반하면서 상기 반응 혼합물에 한방울씩 첨가하였다. 그 용액을 실온에서 16시간동안 교반한 후 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔사를 EtOAc(100mL) 중에 용해시키고 포화 수성 NaHCO3 (2 x 50mL) 및 염수(30mL)로 2회 순차적으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하고 잔사를 실리카 크로마토그래피(2% CH3OH/CH2Cl2)하여 2c(1.18g)을 얻었다. 수율은 85%이었다.
2'-
데옥시
-2'-S-(4-
에톡시카르보닐부틸
)
우리딘
(화합물 2d)
상기 화합물 2c 제조를 위해 사용한 절차에 따라 에틸 5-브로모발레레이트(bromovalerate)로 2'-데옥시-2'-머캅토우리딘을 알킬화함으로써 화합물 2d를 제조하였다.
화합물 2a
상기에서 화합물 2c 제조를 위해 사용된 절차에 따라 화합물 1a로 2'-데옥시-2'-머캅토우리딘을 알킬화함으로써 화합물 2a를 제조하였다.
화합물 2b
상기에서 화합물 2c 제조를 위해 사용한 절차에 따라 조 화합물 1b로 2'-데옥시-2'-머캅토우리딘을 알킬화함으로써 화합물 2b를 제조하였다.
5'-O-
DMT
-2'-
데옥시
-2'-S-(
프탈이미딜부틸
)
우리딘
(화합물 3c)
화합물 2c (693mg, 1.5mmol)을 무수 피리딘(12mL)에 용해시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(250mg, 0.74mmol)을 첨가하고 그 용액을 실온에서 계속 교반하였다. 4,4-'디메톡시트리틸 클로라이드(258mg, 0.76mmol)의 또 다른 배치를 한 시간 후에 상기 용액에 첨가하고 그 혼합물을 한시간 더 교반한 후 CH3OH (1mL)로 중지시켰다. 그 용액을 다시 5 분간 교반한 후 진공 하에 용매를 제거하였다. 잔사를 EtOAc (150mL) 중에 용해시키고 포화 NaHCO3(2 x 50mL) 및 염수(50mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에 제거한 다음 조 산물을 용출제로서 0.5% TEA를 함유하는 EtOAc/CH2Cl2 (0/100 내지 4/100)를 이용하여 실리카 크로마토그래피하여 순수한 산물(937mg)을 얻었다. 수율은 82%이었다.
5'-O-
DMT
-2'-
데옥시
-2'-S-(4-
에톡시카르보닐부틸
)
우리딘
(화합물 3d)
상기 기재된 화합물 3c 제조를 위해 사용된 절차에 따라 화합물 2d를 5'-O-디메톡시트리틸화하여 화합물 3d를 얻었다.
5'-O-
DMT
-2'-
데옥시
-2'-S-[N-(
트리플루오로아세틸
)-2-
아미노부틸
]
우리딘
(화합물 3f)
히드라진(200㎕)을 화합물 3c(937mg, 1.2mmol)의 메탄올(20mL) 용액에 첨가하였다. 그 용액을 3시간동안 환류하에 교반하였다. 냉각한 후 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔사를 CH3CN (2 x 10mL) 중에 재-용해시키고 잔사인 히드라진을 제거하기 위해 증발시켰다. 탈보호된 조 산물인 5'-O-DMT-2'-데옥시-2'-S-(4-아미노부 틸)우리딘을 진공-건조시킨 후 드라이 CH3OH (7.4mL)에 용해시킨 후 트리에틸아민(TEA)(0.37mL) 및 에틸 트리플루오로-아세테이트(857㎕, 7.2mmol)를 첨가하였다. 그 용액을 실온에서 16시간동안 교반한 후 용매를 진공 하에 증발시켰다. 잔사를 EtOAc (150mL) 중에 용해시키고 5% NaHCO3(2 x 50mL) 및 염수(50mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에 제거한 후 조 산물을 용출제로서 0.2% TEA가 함유된 CH3OH/CH2Cl2 (0/100 내지 2/100)를 사용하여 실리카 크로마토그래피하여 순수 산물(670mg)을 얻었다. 수율은 77%이었다.
화합물 3b
상기에서 언급한 화합물 3c의 제조를 위해 사용된 절차에 따라 화합물 2b를 5'-O-디메톡시트리틸화시켜 화합물 3b를 얻었다.
화합물 3e
상기에 기재한 바와 같이 화합물 3c의 제조를 위해 사용된 절차에 따라 화합물 2a를 5'-O-디메톡시트리틸화하여 화합물 3a를 얻었다.
상기에 기재된 화합물 3f를 제조하기 위한 절차에 따라 화합물 3a로부터 화 합물 3e를 제조하였다.
3'-O-[(2-
시아노에틸
)(
디이소프로필아미노
)]
포스피노
-5'-O-
DMT
-2'-
데옥시
-2'-S-(4-에톡시카르보닐부틸)우리딘 (화합물 4d)
화합물 3d (539mg, 0.78mmol)를 드라이 CH2Cl2 (4.7mL) 중에 용해시킨 후 효소적 양의 DMAP(~2mg), TEA(435㎕, 3.1mmol) 및 2-시아노에틸 클로로디이소프로필아미노 포스포라미다이트(312㎕, 1.4mmol)를 첨가하였다. 30분 후에 용매를 진공 하에서 제거하고 잔사를 EtOAc(100mL)에 용해시키고 5% NaHCO3(2 x 30mL) 및 염수(30mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후 조 산물을 실리카 크로마토그래피(CH2Cl2/EtOAc, 100/0 내지100/25, 0.2% TEA)하여 492mg의 순수 산물을 얻었다. 수율은 71%이었다.
3'-O-[(2-
시아노에틸
)(
디이소프로필아미노
)]
포스피노
-5'-O-
DMT
-2'-
데옥시
-2'-S-[N-(트리플루오로아세틸)-2-아미노부틸]우리딘 (화합물 4f)
상기 기재된 화합물 4d를 제조하기 위한 방법에 따라 화합물 3f의 포스피틸레이션(phosphitylation)을 수행하여 화합물 4f를 얻었다.
화합물 4b
상기 기재된 화합물 4d를 제조하기 위한 방법에 따라 화합물 3b의 포스피틸레이션을 수행하여 화합물 4b를 얻었다.
화합물 4e
상기에 기재된 화합물 4d를 제조하기 위한 방법에 따라 화합물 3e의 포스피틸레이션을 수행하여 화합물 4e를 얻었다.
일반적인 올리고 뉴클레오티드 합성 방법
본 연구에서 사용된 포스포라미다이트는 드라이 CH3CN을 사용하여 0.1M으로 희석하였다. 상업적으로 입수가능한 T-포스포라미다이트는 Applied Biosystems에서 구입하였고, 4b, 4d-f 포스포라미다이트는 위에 설명한 바와 같이 합성하였다.
본 연구에서 설명한 올리고 뉴클레오티드는 Applied Biosystems의 380B 자동 DNA 합성장치에 의해 통상의 포스포라미다이트 방법으로 합성되었다. (Caruthers, 1985). 다만, 서열이 4b, 4d, 4e, 또는 4f 중 어느 하나를 포함하는 시점에서는 커플링 시간을 30분으로 증가시켰다.
합성 지지대 (support)에서 ODN을 분리시키는 일은 CPG 컬럼을 취하여 이를 피페리딘이 0.2N NaOH/MeOH에 10%(v/v) 포함된 용액 1000㎕을 담은 에펜도프(Eppendorf) 튜브내에 위치시켜 진행하였다. 이 튜브는 밤새 교반(shake)시켜 회전시켜 그 상층액을 890 mM Tris·HCl, pH 8.3, 890mM 붕산, 20mM EDTA (10 x TBE) 200㎕에 첨가, 완전히 혼합시켰다. 본 용액은 ca. 600㎕까지 증발 시켰으며 50㎕ 분취량을 두 개의 Microspin Sephadex G 25 컬럼을 통해 여과시켰다 (Amersham Biosciences). 그 결과로 얻어진 용액 내의 DNA를 UV spectroscopy (OD260)을 사용하여 그 양을 측정하였다.
각각의 커플링 반응 전에 이 물질의 분취량을 0.5-1 M NH4Cl내에서 200㎕로 맞추었다. 100% 에탄올을 1000㎕ 첨가하였으며 이는 -78°C로 45분간 냉각하였다. 이 용액을 13,000rcf에서 30분간 회전시켜 그 상층액은 제거하고 다시 0.5-1M NH4Cl 200㎕에 재용해시켰다. 본 침전/회전/재용해 과정을 두 번 반복하였으며 그 펠렛은 70% 에탄올 500㎕로 세척하여(-20℃) 건조 시킨 후 물에 재현탁하였다.
일반적인 아마이드 결합 형성 방법
축합제인 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (DMT-MM) (13.8 mg, 0.05 mmol)을 MOPS 완충액 (0.1M 1.0M NaCl, pH 7.0, 1.0mL)에 용해시켰다. 그 결과로 얻어진 DMT-MM 용액(50mM, 10㎕)은 아미노 및 카르복실 기로 변형된 ODN (200pmol)을 포함한 에펜도프 바이알(Eppendorf vial)에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 잘 보텍싱한 뒤 원심분리시켜 실온에서 48시간동안 보관하였다. 이 샘플에 300㎕의 물을 첨가한 뒤 600㎕ 부탄올로 추출하였다. 이 용액은 1M NH4Cl로 맞추어졌고 이에 1000㎕의 에탄올을 첨가하였다. 이 용액은 -78°C로 45분간 냉각시킨 뒤 13,000rcf에서 30분간 회전하고 그 상층액을 제거한 뒤 그 용액을 물에 재용해 시켰다.
일반적인
MALDI
-
TOF
MS 분석 방법
CH3CN/H2O (1:1 v:v)내 THAP 매트릭스 스톡 용액 (0.2M)은 THAP (33mg, 0.2mmol)을 CH3CN (0.5mL) 와 H2O (0.5mL)에 용해 시켜 준비하였다. 이 스톡 용액은 -20°C에 보관시 3주 정도까지 사용 가능하다. 소용되는 매트릭스 용액은 측정 직전에 스톡 용액(30㎕)을 공동 매트릭스(co-matrix) 암모니움 타르트레이트 용액(0.1M 비이온화 된 물에서, 70㎕)과 혼합하여 준비하였다. ODN 샘플 (1-10 pmole/㎕, 0.5㎕)은 위 매트릭스 용액(5㎕)과 보텍싱하여 혼합하였으며 이 이질 혼합물은 13,000rcf에서 25초간 회전한 뒤 그 상층액을 7x7 타겟 각 웰에 1㎕씩 넣었다. 소 인슈린 또는 ODN 일정량이 외적 또는 내적 측정 요소로 사용되었다. 사안에 따라 적절한 레이저 양을 가하였다.
결과
초기 합성 프로토콜은 보호된 리보뉴클레오티드의 2‘OH-알킬화로 시도하였으나, 이 방법은 가려진 친전자체로 인해 비효율적이었다(Zhu 등, 2002). 그러나 2’-디옥시-2‘-머캡토우리딘13을 1a 및 1b로 알킬화하여 2’-S-알킬화된 뉴클레오시드를 독점적으로 얻었다(도 3). 2b의 트리틸화 및 포스피틸화는 변형된 포스포라미다이트 4b를 제공하였다. 2개의 추가적인 단계를 거쳐 3a의 안정된 프탈리이미딜기를 DNA 합성기기 친화적인 트리플루로아세틸 기로 치환하였다 (Telser 등, 1989). 그 결과로 얻어진 뉴클레오시드 3e의 포스피틸화는 아미노로 변형된 포스포라미다이트 4e를 제공하였다. 모노 아미노 및 카르복실 로 변경된 포스포라미다이트 4d 및 4f는 유사한 방법으로 준비하였다. 각각의 뉴클레오티딜 기의 보호되 지 않은 상태는 도 4에 제시되어 있다.
변형된 포스포라미다이트는 종래의 ODN 합성 방법에 의해 16-머(mer) ODN으로 통합되었으며 그 서열은 표 1에 제시되어 있다. 표 1은 합성 ODNs의 MALDI-MS 특성 및 서열을 나타낸다.
| ODN 수치 | ODN 서열 | m/z[M-1]- | |||
| 계산치 | 관측치 | 결합된 계산치 | 결합된 관측치 | ||
| 1 | 5'-(dT)6UNUC(dT)8 | 5011.4 | 5011.4 | 1C -4993.4 | 1C -4993.7 |
| 2 | 5'-(dT)3UNUC(dT)2UNUC(dT)2UNUC(dT)3 | 5426.0 | 5427.0 | 2C -5372.0 | 2C -5371.4 |
| 3 | 5'-(dT)7UNUCCUN(dT)6 | 5172.7 | 5172.4 | 3C -5136.6 | 3C -5136.2 |
| 4 | 5'-(dT)7UCUNNUC(dT)6 | 5172.7 | 5172.8 | 4C -5136.6 | 4C -5136.9 |
| 5 | 5'-(dT)6UCUNNUCCUN(dT)6 | 5333.9 | 5333.6 | 5C -5279.8 | 5C -5280.3 |
CPG 지지대(support)에서 가닥을 탈보호화 시키고 제거하기 위해 메탄올릭 NaOH가 사용되었다. 통상의 농축된 암모니움 하이드록시드를 사용한 방법은 NH3와 에스테르 모이어티 간의 가아민분해반응 때문에 사용하지 않았다 (Berthod 등, 1996). 아크릴로니트릴과 탈보호화된 아민간의 Michael 가반응을 배제하면서 탈보호화하기 위해 (Avino 등, 1994) 메탄올릭 NaOH 내에 10% 피페리딘을 포함하였다. 아세테이트 이온(실패한, 캡이 있는 가닥의 5‘-아세틸기의 가수분해로 생성되는)이 또 다른 커플링 상대로 작용, 경쟁하는 것을 방지하기 위하여 이들을 아마이드 커플링 조건에 놓여지기 전에 트리플 에탄올 침전으로 제거하였다. 위 상용화된 프로토콜을 사용하여 아미노 및 카르복실 기의 탈보호화 및 CPG지지대 (support)에서 ODN을 제거하는 일을 동시적으로 할 수 있었다. ODN은 MALDI-TOF 질량 분석기로 특징지었다. (Pieles 등, 1993, Li 등, 1998) (표1).
ODN 1 을 먼저 아마이드 커플링 조건하에 놓았다. 축합제인 DMT-MM (4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-메틸모르폴리늄 클로라이드; 쿠니쉬마 등(Kunishima et al.), 2001 및 류 등(Liu et al.), 2002) 및 EDC (N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보다이이미드; 슈미트 등(Schmidt et al., 1997 및 세이츠 등(Seitz et al., 2001) 둘다 다양한 버퍼 조건 하에서 U N 및 U C 간의 가닥 내부 아마이드 형성 반응을 촉진하는 데에 효과적인 것으로 판명되었다. DMT-MM은 잔류 공유 어덕트를 남기지 아니하였으므로, 더 바람직하다. 커플링 반응의 수율은 MALDI-TOF 분석에 의해 예측되었다 (Sarracino et al., 1996 and Berggren et al., 2002). 1 로부터 ODN 1C 의 수율은 95% 이상인 것으로 예측된 반면(도 5), 3개의 아마이드 본드를 갖는 2C 의 수율은 78%이었고(도 6), 이는 또한 95% 이상의 단일 아마이드 본드-형성 수율을 나타내었다(이 예측치들은 하한치로서 스펙트럼 내의 적은 양의 소디움과 같이 모호하고 출발 물질 피크를 인위적으로 부풀렸다). 2 에서 U C 를 대체하는 레귤러 T 잔기들로 ODN을 이용하여 하는 콘트롤 커플링 반응은 매스 손실을 나타내지 아니하였다.
이성질체 3 및 4는 커플링 조건 하에서 처리하여, MALDI-TOF MS에 의해 특징지워진 바와 같이(표 1; 도 7 및 8), 포스포다이에스테르 백본 및 새로 형성된 지방족 카르복사미드 구조 둘다를 포함하는 두개의 융합된 21-멤버 고리를 클로징하는 두개의 아마이드 결합을 갖는 ODN을 얻었다. ODN 5 의 응축으로 세개의 아마이드 결합을 만들어 세개의 융합된 21-멤버 고리를 갖는 5C (도 9)를 형성하였다. 5C 에서, 실현성이 더 적은 위상학적 이성질체가 이러한 반응 조건 하에서 가능하다. 대조 실험을 수행하여, 스페이서에 의해 분리된 아미노 및 카르복실기 간의 커플링 반응의 거리 의존성을 연구하였다(도 10a 및 10b). 여기서 가닥들 5'-(dT)x U c (dT)n U N (dT)y (x + n + y = 14, n = 0, 1, 2, 3, 6, 10)을 아마이드-결합 촉진 조건하에 종속시켰다. 커플링 수율은 스페이서의 길이 (dT)n에 크게 의존한다는 것을 발견하였다. n이 2이상인 경우 수율은 50% 미만이었고, n이 6 또는 10인 경우 거의 커플링된 산물이 검출되지 아니하였다. 따라서 아마이드 결합은 편향되어 인접한 뉴클레오티딜 잔기 상의 아미노 및 카르복실기 간에 형성되었다. 몇몇 산물 가닥의 구조가 도 11에 나타나 있다. 선형 폴리아마이드 백본은 필수적으로 Nylon-5,7이다.
본 발명은 완전히 기술되었으며, 과도한 실험이 없이도 본 발명의 본질 및 범위를 벗어남이 없이 폭넓은 범위의 동등한 파리미터와 집중 연구 및 조건 내에서 동등한 발명이 수행될 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.
본 발명이 상기 특정 실시예들과 함께 설명되었지만, 더 많은 변형들이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 출원은 본 발명의 개시로부터의 변형이 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 알려진 또는 관습적인 관행의 범위 내가 되도록 또한 다음과 같이 첨부된 청구범위 내에서 제시된 본질적인 특질들에 적용되도록 포함하고 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 본 발명의 많은 변형과 용도 또는 적용들을 포괄하도록 의도되었다.
저널 또는 요약본, 공개되거나 또는 대응되는 미국 또는 외국 특허 출원, 간행된 미국 또는 외국 특허들 또는 다른 참조 문헌들을 포함하는 여기 인용된 모든 참조 문헌들은 상기 인용된 문헌들에 제공된 모든 데이터, 표, 도면 및 텍스트를 포함하여 여기에 완전히 참조로서 결합된다. 더욱이, 여기서 인용된 참조 문헌 내에서 인용된 참조 문헌들의 모든 내용이 또한 완전히 참조로서 결합되어 있다.
알려진 방법들의 단계, 종래의 방법들의 단계, 알려진 방법들 또는 종래의 방법들은 어떠한 경우에도 본 발명의 측면, 설명, 실시예들을 관련 분야에서 교시하거나 공개하거나 제시하는 것으로 인정되지 않는다.
앞서 기술한 특정 실시예들은 본 발명의 일반적인 특질들을 완전히 드러낼 것이며 당해 기술 분야의 통상의 지식을 적용하는 것에 의하여 당업자는 과도한 실험이 없이도 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어남이 없이 상기한 특정 실시예들의 다양한 적용 및/또는 변형을 얼마든지 수행할 수 있을 것이다. 따라서, 여기에 제공된 개시나 안내에 기초하여 상기한 적용이나 변형을 하는 것은 개시된 실시예들의 등가물의 의미나 범위내에 있도록 의도된다. 여기 사용된 어구나 용어는 설명의 목적으로 사용된 것이고 본 발명을 제한하기 위한 목적으로 사용되는 것이 아니며, 본 발명의 상세한 설명의 용어나 어구가 여기에 제공된 교시나 안내의 관점에서 당해 기술 분야의 통상의 지식과 함께 채택되는 경우 당업자에게 충분히 해석될 수 있음이 이해될 것이다.
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Claims (16)
- 일반식 1을 포함하고,사다리 구조의 가로대로서 작용하는 백본 사이의 결합과 함께사다리 구조의 측면 또는 다리로서 2개의 백본을 가지는 사다리형 공중합체.[일반식 1]상기 식에서,A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;G, J, L, M, Q = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹;B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;E= CR, N, NR+, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라마이드, 포스포나마이드, 포스피나마이드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 대칭 또는 비대칭 원자 중심R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹;X-Y, W-Z 쌍 = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 화학 결합을 형성하거나, 또는 W가 Z와 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리; 및S = 리보스 또는 변형된 리보스, DNA 유사 구조와 결합된 비환식(acyclic) 또는 유사 사이클릭 빌딩 블락.
- 제1항에 있어서,X-Y 및 W-Z 쌍은 전자고리화 반응으로부터 아마이드, 에스테르, 포스포에스테르 또는 알켄 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- 제1항에 있어서,상기 S는 하기의 하나 또는 2 이상의 것으로 구성되는 그룹으로 선택되는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- 제1항에 있어서,상기 백본 중 하나는 폴리아마이드 백본이고, 사다리형 공중합체는 하기 일반식 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.[일반식 2]상기 식에서,A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;L, M = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로 마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹 ;B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹;W-Z = 유기 합성 기술에 의하여 W가 Z와 함께 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리; 및S = 리보스 또는 변형된 리보스, DNA 유사 구조와 결합된 비환식(acyclic) 또는 유사 사이클릭 빌딩 블락.
- 제4항에 있어서,W-Z는 전자고리화 반응으로부터 아마이드, 에스테르, 포스포에스테르 또는 알켄 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- 제4항에 있어서,상기 S는 하기의 하나 또는 2 이상의 것으로 구성되는 그룹으로 선택되는 것 을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- 안티센스 올리고머로서 작용하는 제4항의 사다리형 공중합체를 안정한 듀플렉스를 형성하기 위하여 어닐되는 타겟 mRNA와 접촉하게 함으로써, mRNA로부터 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산 억제 방법.
- 제1항에 있어서,백본 중의 하나는 핵산 백본이고, 사다리형 공중합체는 하기의 일반식 3을 포함하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.[일반식 3]상기 식에서,A= O, S, Se, 및 Te로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 VI족 원소;G, J, Q = C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹, -O-, -S-, 카르보닐, 카르복실, -SiR2-, 및 -OSiR2O- 으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 링커 그룹;B= U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스;E= CR, N, NR+, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라마이드, 포스포나마이드, 포스피나마이드로 구성되는 그룹으로 부터 선택된 대칭 또는 비대칭 원자 중심R= H, C1-C18 분지 또는 선형 사슬 알킬 그룹, C6-C24 치환 또는 비치환된 아로마틱과 1-3 헤테로 원자 (N, S, O) 또는 할로겐 치환체를 가지는 헤테로아로마틱 그룹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 말단 그룹; 및X-Y = 유기 합성 기술에 의하여 X가 Y와 함께 화학 결합을 형성할 수 있게 하는 결합 자리.
- 제8항에 있어서,X-Y는 전자고리화 반응으로부터 아마이드, 에스테르, 포스포에스테르 또는 알켄 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- DNA 백본을 가지는 제8항의 사다리형 공중합체를 생성하는 방법으로서,2'-β-치환된 포스포라미다이트를 합성하는 단계;2'-β-치환된 포스포라미다이트로부터 펜던트 그룹을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및펜던트 그룹을 결합시켜 사다리형 공중합체를 형성하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체의 형성 방법.
- 안티센스 올리고머로서 작용하는 제8항의 사다리형 공중합체를 안정한 듀플 렉스를 형성하기 위하여 어닐되는 타겟 mRNA와 접촉하게 함으로써, mRNA로부터 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산 억제 방법.
- 제1항에 있어서,상기 2개의 백본은 하나의 폴리아마이드 백본과 하나의 핵산 백본인 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.
- 제12항에 있어서,상기 사다리형 공중합체는 일반식 4를 포함하는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체.[일반식 4]상기 식에서 B는 U, T, A, G, C 및 이들의 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 베이스.
- DNA 백본을 가지는 제13항의 사다리형 공중합체를 생성하는 방법으로서,2'-β-치환된 포스포라미다이트를 합성하는 단계;2'-β-치환된 포스포라미다이트로부터 펜던트 아민 및 카르복실레이트 그룹을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및펜던트 그룹을 결합시켜 나일론 -DNA 사다리형 공중합체를 형성하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 사다리형 공중합체의 형성 방법.
- 안티센스 올리고머로서 작용하는 제12항의 사다리형 공중합체를 안정한 듀플렉스를 형성하기 위하여 어닐되는 타겟 mRNA와 접촉하게 함으로써, mRNA로부터 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산 억제 방법.
- 안티센스 올리고머로서 작용하는 제1항의 사다리형 공중합체를 안정한 듀플렉스를 형성하기 위하여 어닐되는 타겟 mRNA와 접촉하게 함으로써, mRNA로부터 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산 억제 방법.
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