KR20060058476A - 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체로부터조혈모세포로의 분화 촉진 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우가 배아줄기세포 자체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우나 배아체 자체를 계속 분화시킨 경우보다 매우 현저하게 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시킴을 증명함으로써 본 기술은 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 면역세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있다.
Description
도 1은 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체로부터 조혈모세포로의 분화 촉진 기술 흐름도이다.
도 2는 인간배아 줄기세포 집락 배양(도 2a) 및 Alkaline Phosphatase 염색 모습(도 2b)을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다.
도 3은 인간 배아줄기세포로부터 배아체 분화 유도 1일 째(도 3a) 및 5일 째(도 3b) 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다.
도 4는 인간 배아체와 복합배양하는 인간 골수기질세포의 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다.
도 5는 인간 골수 기질세포에 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과이다.
도 6은 인간 배아줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 배아체만을 단독으로 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과이다.
도 7은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도를 위한 최적 배양기간의 확인한 결과를 나타낸그래프이다.
도 8은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 집락형성 단위(colony forming unit, CFU) 형성 수의 극대화를 위한 최적 배양기간 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다.
배아 줄기세포는 내배엽, 중배엽, 외배엽 분화가 모두 가능한 전분화능(totipotency)을 지니고 있기 때문에 난치병 치료를 위한 중요한 연구대상으로 현재 주목을 받고 있다. 그런데, 이와 같은 배아 줄기세포의 전분화능은 배아 줄기세포로부터 특정 세포를 생산하기 위한 표적 분화(directed differentiation) 기술 개발의 면에서는 장애로 작용할 수 있다. 그러므로, 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화를 유도하는 기술 개발을 위해서는 그 목표 달성을 위한 최적의 배양조건을 조성함으로써 배아 줄기세포로부터 원하는 특정 세포로의 분화 효율을 극대화시키고자 하는 조건의 탐색이 우선되어야 하며 이에 관련된 연구 및 기술 개발이 전세계적으로 진행이 되고 있는 실정이다.
본 기술 또한 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화 촉진을 위한 최적의 배양조건을 탐색하는 과정에서 개발된 것으로, 인간 배아 줄기세포로부터 배아체로 분화를 유도한 뒤 이를 인간 기질세포와 복합배양함으로써 조혈모세포의 생산을 촉진시키는 내용으로 아직 국내외적으로 보고되거나 개발된 바 없었다.
현재, 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화 촉진 기술은 배양 조건의 적절한 조절을 통하여 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 여러 다양한 세포들 중 조혈모세포가 다른 계통의 세포들보다 상대적으로 잘 생존하게 하는 개념을 근간으로 하고 있다.
인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화유도를 촉진하는 대표적인 기술은 2001 년 Kaufman 등에 의하여 최초로 보고된 바 있었다. Kauffman 등은 인간배아 줄기세포를 cytokine 첨가 없이 fetal bovine serum(FBS)만을 포함한 배지에서 H1 인간 배아 줄기세포 주를 바로 쥐의 기질세포인 S17 세포 혹은 배아 12 일째 쥐 난황에서 비롯된 C166 세포와 같이 배양하여 배양 3-5일에 기질세포에 약하게 부착되어 있는 작고 둥근 모양의 세포들을 관찰 후 이들을 17일간 계속 H1/S17 세포 혹은 H1/C166 세포로 분화시킨 다음 CD34+ 조혈모세포를 분리하고 hematopoiestic growth factor 가 포함된 semisolid methylcellulose-based medium 배양을 통하여 혈액세포 전구체(progenitors) 집락군을 관찰함으로써 조혈모세포의 존재와 기능을 증명한 바 있었다. 그 후 여러 기술 개발이 시도되고 있으나 모두 Kaufman 등이 제시한 기술을 근간으로 하고 있다. 그런데 Kaufman 등은 인간 배아 줄기세포를 쥐의 기질세포인 S17 세포 혹은 배아 12 일째 쥐 난황에서 비롯된 C166 세포와 같이 배양하였는데, 이는 연구목적일 경우에는 모르겠으나 직접 인체에 적용을 하기 위한 조혈모세포를 배양하는 목적으로 사용하기에는 문제(인간 배아 줄기세포와 쥐의 기질세포의 상호 작용 속에서 유전자적으로 변형된 인간 조혈모세포가 발생할 가능성)가 있을 수 있다고 여겨진다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 인간 골수기질세포를 이용하여 인간 배아체로부터 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체의 인간 조혈모세포로의 분화 촉진용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
본 기술개발의 목적은 정상 인간 골수 기질세포를 이용하여 인간 배아체로부터 조혈모세포로의 분화 촉진을 유도하는 기술을 개발함으로써 보다 효율적으로 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 보다 안전하게 인체에 적용할 수 있는 조혈모세포 생산 기술을 개발함에 있다. 이를 위하여 출원인 등은 인간 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 이를 인간 골수 기질세포와의 배양을 시도하였고 그 결과를 유세포분석법 및 배양을 통한 집락형성 단위 측정을 통하여 증명하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배아체는 배아줄기세포를 종괴로 배양한 어떤 배아체도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 인간 배아 줄기세포로부터 4-6일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 인간 골수 기질세포는 인간 골수기질세포를 화학제로 불활성화한 어떤 인간 골수기질세포도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 인간 골수기질세포를 1,000-2000 cGy의 방사선을 조사하고 20-30 시간 배양한 후 배양용기의 바닥에 지지세포층이 형성되면 배아체를 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간 골수기질세포를 함유하는 인간 배아체의 조혈모세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 인간 골수기질세포 외에 조혈모세포의 분화에 도움을 줄 수 있다고 종래 알려진 보조인자를 더 포함할 수 있으나, 바람직하게는 소태아혈청(fetal bovine serum), 말혈청(horse serum), L-글루타민 및 페니실린에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.
본 기술은 인간 배아줄기세포로부터 배아체의 형성과 형성된 배아체를 인간 골수기질세포와의 복합배양 등 크게 2단계로 이루어 진다. 이에 관한 기술개발 흐름도는 (도 1)과 같다. 우선 SNUhES-3 인간 배아 줄기세포(세포응용연구사업단, 서울대학교 문신용 교수)의 배양을 위하여 약 150-300 세포 정도로 구성된 인간 배아 줄기세포 종괴(clump)를 쥐 배아 섬유아세포로 이루어진 지지세포(STO cell, ATCC, USA) 위에 접종한다. 접종된 인간 배아 줄기세포를 DMEM/F-12(GIBCO, USA), 20% Knockout SR(GIBCO, USA), 0.1 mM nonessential amino acid(GIBCO, USA), 0.1 mM β- mercaptoethanol(Sigma, USA), 100 U/ml penicillin G(Sigma, USA), 100 g/mL streptomycin((Sigma, USA), 4 ng/mL recombinant human βFGF(invitrogen, USA)으로 구성된 인간 배아 줄기세포 배양액을 well 당 0.8 mL 를 첨가하여 37℃, 5% CO2, 습도 95%의 조건에서 배양한다. 배양 48 시간 후 인간 배아 줄기세포가 지지세포 위에 정착하였음을 확인한 후 배양용기로부터 배양액을 제거하고 serum 이 제거된 인간 배아 줄기세포 배양액으로 세척한 다음 다시인간 배아 줄기세포 배양액을 well 당 0.8 mL 를 첨가한다. 이러한 과정으로 배양액을 48시간마다 교환하였다. 약 6-7 일이 경과하면 인간 배아 줄기세포 종괴가 커지면서 내부에서는 분화가 발생하기 시작하기 때문에 지속적인 현미경 육안 관찰을 통하여 종괴의 크기가 충분히 커지고 내부에서 분화가 시작되는 증거가 관찰되면 미분화된 인간 배아 줄기세포 종괴를 물리적인 방법으로 분리하여 다시 계대배양을 시행한다. 그리고 배양된 인간배아 줄기세포 종괴는 ALP 염색 및 SSEA 면역화학법으로 배아 줄기세포 주의 성상을 유지하고 있음을 확인한다(도 2). 배아 줄기세포로부터 배아체 분화, 형성을 위하여 배아 줄기세포 종괴를 계대 배양할 때의 크기보다 3-4 배정도 크게 분리한다. 분리된 종괴를 배양액(DMEM-F12, FBS, βFGF, GIBCO BRL, USA)에서 1시간 동안 응집시킨 후 다시 βFGF가 없는 DMEM-F12 배지에 혼합한다. 이를 48시간동안 incubator 에서 배양한 후 pasteur pipette 과 spoid 를 사용하여 종괴를 둥글게 조작하면서 배지를 1/2 정도 교환시켰다. 이런 방법으로 종괴(배양체)부터 5 일 간 배양하여 배아체를 형성시킨다(도 3).
배양된 배아체로부터 조혈모세포의 분화 유도 촉진을 목적으로 한 인간 골수 기질세포(도 4)와의 복합배양을 위하여 인간 골수 기질세포(human stromal cell)를 1,500 cGy의 방사선을 조사하고 well 에서 24 시간 배양한 후 well 의 바닥에 지지세포층이 형성되면 배양된 배아체를 첨가하여 복합배양을 시행한다. 이 때 배지에는 IMDM(KDR, USA)를 사용하고 그 외에 fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine, penicillin 등이 첨가되나 조혈성장촉진인자는 포함되지 않는다. 배지액은 1 주일마다 교환한다.
본 기술의 효과 판정을 위하여 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율 및 집락형성 단위(colony forming unit, CFU)의 측정, 비교를 시행한다. 우선 인간 골수 기질세포에 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 분석, 비교하고 다음 단계로 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 비교하여 분석한다(도 4, 5). 그리고 인간 골수 기질세포를 배아체와 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화, 생산이 가장 극대화되는 배양기간을 검증하기 위하여 배양 3일, 5일, 7일, 10일 이후까지의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 분석, 비교한다.
CD34+CD45- 세포의 백분율을 측정을 위하여 유세포 분석법(flowcytometry, Beckton-Dickinson, USA)을 이용하였다. 우선 각 배양군으로부터 단핵구를 분리 후 단핵구에 FITC가 부착된 항 CD34 및 CD45 단클론 항체(anti-HPCA-2, Beckton-Dickinson, Mountain View, CA)를 20uL씩 첨가한 후 암소에서 4oC로 25분간 반응시켰다. 이를 0.1%의 sodium azide(Sigma)와 2% 우태아혈청이 함유된 세척액 1mL 및 2mL로 300g에서 각각 7분씩 2회 원침세척한 후, 1mL의 세척액에 부유시켜 FACS scan(Becton-Dickinson, USA)을 이용하여 CD34+CD45- 세포함유 정도를 측정하였다. 이 때 음성 대조군으로는 상기 CD34 양성 단클론 항체와 같은 종류인 anti-mouse IgG2 단세포군 항체를 동일한 조건으로 반응시킨 상층액을 사용하였다.집락형성 단위(CFUs)의 측정, 비교를 위하여 Semisolid methylcellulose-based medium 배양 중 Methocult H4444(Terry Fox Laboratory, USA) 법을 이용하였다. 우선, 각 배양군으로부터 Ficoll-Hypaue(Histopaque: Sigma, USA)을 이용한 밀도 구배 원심 분리법(density gradient centrifugation) 을 통하여 단핵구를 분리하였다. 이 단핵구들은5% 우 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA, Sigma, USA)과 phosphate-buffered saline(PBS, Sigma, USA)로 1회 세척 후 거름망(30 um mesh)으로 걸러내었다. 그리고, 단핵구를 모아 CD34 단클론 항체 (QBend-10 mouse IgG1, Miltenyi reagent A2)를 이용하여 고 구배 면역자장 분리법(high gradient immunomagnetic separation, HGIS: MidiMACS, Miltenyi biotech, Sunnyvale, CA, USA)을 이용해서 분리하였다. 4℃에서 30 분간 단 클론 항체와 반응시킨 세포들을 PBS 로 1회 세척하며 자장이 걸려있는 분리 컬럼(column)을 통과시컨 CD34+ 세포를 분리하였다. 분리된 CD34+ 세포의. CFUs 집락 배양을 위하여 CD34+ 세포의 최종 농도를 2X103/mL 로 한 다음 이를 H-4444 배지와 10:1 의 비율로 혼합한 후 37℃, 5% CO2, 습도 95%의 조건에서 배양하여 14일 째에 도립 현미경을 통하여 집락 수를 측정하였다.
본 기술 발명은 특히 세포 치료에 필요한 혈액세포 생산 및 인공 혈액의 생산에 매우 유용하게 응용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1:
배아체와의 복합배양을 위한 골수기질세포 제조 및 배양 기술
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 비롯한 배아체와 복합 배양 시킴으로써 조혈모세포의 생산을 촉진하기 위한 인간 골수기질세포를 제조하기 위한 기술에 관한 것이다. 우선 1,500 cGy의 방사선을 조사한 정상 골수 기질세포(도 4)와 배아체를 복합 배양을 시행할 배양 용기에에서 24 시간 배양을 시행한다. 24시간 후 배양 용기의 바닥에 지지세포층이 형성됨이 육안적으로 확인이 되면 인간 배아 줄기세포로부터 생산된 배아체를 첨가하여 복합배양을 시행한다. 이 때 배지에는 IMDM(KDR, USA)를 사용하고 그 외에 fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine, penicillin 등이 첨가되나 조혈성장촉진인자는 포함되지 않는다. 도 4는 인간 배아체와 복합배양하는 인간 골수기질세포의 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다.
실시예 2:
인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 생산 효과
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화 촉진 효과를 증명하기 위하여 유세포분석법(flowxytometry)를 이용하여 인간 골수 기질세포에 5일간 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 차이 및 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 차이를 비교하여 분석하였다.
그 결과, 배아 줄기세포 자체를 바로 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우, 배양 5일 째에 유세포분석법으로 검출된 CD34+45- 세포의 백분율은 0.00-0.23%로 그 중앙값이 0.09%이었음에 반하여 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 골수기질세포와 복합배양한 경우 배양 5일째에 CD34+45- 세포의 백분율이 0.92-1.97%로 그 중앙값이 1.16%로 검출됨으로써 유의하게(P<0.01) 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서 D34+CD45- 세포 검출이 높았음을 관찰할 수 있었다(도 5). 도 5는 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율의 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 인간 골수 기질세포에 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과, 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양 군에서 유의하게 증가되었다.
또한, 배아체 자체만을 분화시킨 경우(0.00-018%)와 비교하여 보아도 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서CD34+45- 세포 검출율이 높았음을 확 인할 수 있었다(도 6). 도 6은 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율의 측정결과를 나타낸 그래프이다. 인간 배아줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 배아체만을 단독으로 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과, 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양 군에서 유의하게 증가되었다(1.36% ㅁ 0.55) (p < 0.01).
실시예 3:
인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 집락형성 단위(CFUs) 형성 효과
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 집락형성 단위(CFUs) 형성 효과 를 증명하기 위하여 고 구배 면역자장 분리법(MACS)을 이용하여 인간 골수 기질세포에 5일간 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CFUs 형성 차이 및 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CFUs 형성 차이를 분석하였다.
그 결과, 배아 줄기세포 자체를 바로 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우, 배양 5일 째에 CFUs는 거의 측정디지 않았음에 반하여 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 골수기질세포와 복합배양한 경우 CFUs는 60-130으로 유의하게(P<0.01) 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우(2-10)보다 CFUs 형성이 많았음을 관찰할 수 있었다. 또한, 배아체 자체만을 분화시킨 경우(CFUs: 0-9)와 비교하여 보아도 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서 CFUs 형성이 많았음을 확인할 수 있었다.(도 6, 7 참조)
실시예 4:
인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 생성 및 집락형성단위(CFUs) 최적 생산기간
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화 촉진 및 CFUs 형성이 현저히 촉진됨을 확인 후 인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 및 집락형성단위(CFUs) 최적 생산기간 을 확인하기 위하여 본 실험을 실시하였다. Flowxytometry법으로 실험한 결과, 배양 3-7 일 사이에 CD34+45- 세포가 분리됨을 확인할 수 있었다. 배양기간별로 분리된 세포 수의 중앙값을 살펴보면 배양 3 일에는0.7(0.4-1.2) X 104, 5 일에는 1.8(1.4-2.6) X 104, 7 일 에는 0.6(0.5-0.7) X 104이었으며 배양 1일째 및 배양 10 일 이후에는 CD34+ 세포가 분리되지 않았다(도 7). 그리고, 배양 5일 째에 다른 배양 시간에 비하여 유의하게(P<0.01) 가장 많은 세포가 분리됨을 확인할 수 있었다. 도 7은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도를 위한 최적 배양기간의 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
그리고, H-4444 Methocult 배양법으로 실험한 결과, CFUs 형성 수에서도 배양 3일에는 0.5(0.2-0.8) X 102, 5 일에는 1.0(0.6-1.3) X 102, 7일에는 0.2(0.1-0.4) X 102으로 배양 5일 째에 다른 배양 시기에 비하여 유의하게(P<0.01) 가장 많은 CFUs 집락이 형성되었음을 관찰할 수 있었다(도 8). 도 8은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 집락형성 단위(colony forming unit, CFU) 형성 수의 극대화 를 위한 최적 배양기간 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이상 설명한 바와 같이,본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우가 배아줄기세포 자체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우나 배아체 자체를 계속 분화시킨 경우보다 매우 현저하게 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시킴을 증명함으로써 본 기술은 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 혈액세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명으로 정상 인간 골수 기질세포가 인간 배아체로부터 비롯한 배아체로부터 조혈모세포로를 분화 촉진을 유도하는 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 상기 인간 골수 기질세포는 기조 기술인 쥐의 골수 기질세포를 이용하는 경우보다 안전하게 인체에 적용할 수 있는 조혈모세포를 생산할 수 있으리라고 기대된다.
Claims (5)
- 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 배아체는 인간 배아 줄기세포로부터 4-6일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 인간 골수 기질세포를 1,000-2000 cGy의 방사선을 조사하고 20-30 시간 배양한 후 배양용기의 바닥에 지지세포층이 형성되면 배아체를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 인간 골수기질세포를 함유하는 인간 배아체의 조혈모세포 분화 유도용 배지 조성물.
- 제 4항에 있어서, 소태아혈청(fetal bovine serum), 말혈청(horse serum), L-글루타민 및 페니실린에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020040097538A KR20060058476A (ko) | 2004-11-25 | 2004-11-25 | 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체로부터조혈모세포로의 분화 촉진 방법 |
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| KR1020040097538A KR20060058476A (ko) | 2004-11-25 | 2004-11-25 | 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체로부터조혈모세포로의 분화 촉진 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100773253B1 (ko) * | 2007-03-26 | 2007-11-05 | 주식회사 알앤엘바이오 | 성체줄기세포와의 공동배양을 통한 조혈모세포의 배양 및증식방법 |
| WO2009120043A3 (ko) * | 2008-03-28 | 2009-12-30 | 경희대학교 산학협력단 | 중배엽 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 cd45+ 세포 또는 cd45+ 세포 배양액의 용도 |
| KR100981093B1 (ko) * | 2008-01-21 | 2010-09-08 | 고려대학교 산학협력단 | 인간 태반 중간엽줄기세포를 이용한 인간 골수 및 제대혈단핵세포로부터 ｃｄ34+ 조혈모세포 또는 ｃｄ14+단핵구로의 분화배양 방법 |
| KR101065066B1 (ko) * | 2008-10-23 | 2011-09-15 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 태아 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모 세포의 동시 이식에 기반한 인간화 ｎｏｇ 마우스 모델 및 그의 제조 방법 |
| US8507275B2 (en) | 2008-02-18 | 2013-08-13 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology (Kaist) | Method of inducing differentiation of embryonic stem cells into hemangioblast |
-
2004
- 2004-11-25 KR KR1020040097538A patent/KR20060058476A/ko not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100773253B1 (ko) * | 2007-03-26 | 2007-11-05 | 주식회사 알앤엘바이오 | 성체줄기세포와의 공동배양을 통한 조혈모세포의 배양 및증식방법 |
| KR100981093B1 (ko) * | 2008-01-21 | 2010-09-08 | 고려대학교 산학협력단 | 인간 태반 중간엽줄기세포를 이용한 인간 골수 및 제대혈단핵세포로부터 ｃｄ34+ 조혈모세포 또는 ｃｄ14+단핵구로의 분화배양 방법 |
| US8507275B2 (en) | 2008-02-18 | 2013-08-13 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology (Kaist) | Method of inducing differentiation of embryonic stem cells into hemangioblast |
| WO2009120043A3 (ko) * | 2008-03-28 | 2009-12-30 | 경희대학교 산학협력단 | 중배엽 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 cd45+ 세포 또는 cd45+ 세포 배양액의 용도 |
| KR101077042B1 (ko) * | 2008-03-28 | 2011-10-26 | 경희대학교 산학협력단 | 중배엽 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 ｃｄ45+ 세포 또는 ｃｄ45+ 세포 배양액의 용도 |
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