KR20060056978A

KR20060056978A - 올리고뉴클레오티드 유사체 및 플라비바이러스 감염을치료하는 방법

Info

Publication number: KR20060056978A
Application number: KR1020067002321A
Authority: KR
Inventors: 패트릭 엘. 이베르센; 데이비드 에이. 스테인
Original assignee: 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2006-05-25
Anticipated expiration: 2024-08-05
Also published as: JP2010042015A; JP2013212110A; DE602004030583D1; WO2005030800A2; CA2533218C; US20050096291A1; ATE491791T1; CA2533218A1; KR100943473B1; EP1654363B1; WO2005030800A3; US9347063B2; US20150038462A1; AU2004276226A1; EP1654363A2; KR20100003302A; CN1829794B; US7807801B2; JP2007527227A; US20100292189A1

Abstract

포유동물 세포에서 플라비바이러스의 복제를 억제하는 방법, 및 이 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재된다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 (i) 뉴클레아제 내성 골격을 갖고, (ii) 세포에 의해 섭취될 수 있으며, (iii) 8-40개의 뉴클레오티드 염기를 함유하고, (iv) SEQ ID NOS:1-4의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는다. 플라비바이러스로 감염된 세포의 유사체에 대한 노출은 세포 내에서 이루어지는 것이 효과적이고, 유사체는 바이러스 ssRNA와 올리고뉴클레오티드로 구성된 헤테로듀플렉스 구조이며, 적어도 45℃의 해리 온도(Tm)를 갖고, 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이에 파괴된 염기쌍을 갖는 것을 특징으로 한다.

플라비바이러스, 올리고뉴클레오티드 유사체.

Description

올리고뉴클레오티드 유사체 및 플라비바이러스 감염을 치료하는 방법{OLIGONUCLEOTIDE ANALOG AND METHOD FOR TREATING FLAVIVIRUS INFECTIONS}

본 발명은 동물에 있어서 플라비바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 유사체, 유사체를 사용하는 항바이러스 방법, 및 바이러스 게놈 표적 부위와 유사체의 결합을 모니터하는 방법에 관한 것이다.

참고문헌

(배경기술)

플라비비리데과는 9-15kb 게놈 크기를 갖은 단일, 양성-가닥 RNA 바이러스 군이다. 이들은 약 40-50nm의 외피 보유 바이러스이다. 플라비바이러스 속은 플라 비비리데과에 속하고, 이것은 원형 황열 바이러스(YFV), 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형(DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 머레이 밸리 뇌염 바이러스(MVEV), 쿤진 바이러스(KUN), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(SLEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV), 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBEV), 및 약 70종의 다른 질환 유발 바이러스를 포함한다.

대부분의 플라비바이러스 감염은 열을 내리는 해열제, 액체, 2차 박테리아 감염에 대한 항생제, 필요한 경우 호흡 보조제 등과 같은 보조적 처치로 치료된다. 리바비린의 사용은 다양한 RNA 바이러스에 대한 유의한 항바이러스 화학요법 작용을 나타내며, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 라사 열 바이러스, 및 한타 바이러스 감염의 치료에 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다양한 인터페론 약제와 조합한 리바비린을 C형 간염 바이러스 감염을 치료하는데 사용하였다. 그러나, 뎅기 및 황열과 같은 플라비바이러스에 대한 리바비린의 생체외 및 생체내 활성은 매우 미약하였다(Leyssen, De Clercq 등, 2000).

40년간의 연구 노력에도 불구하고, 뎅기와 같은 대분분의 플라비바이러스에 대한 안전하고 효과적인 백신은 여전히 이용가능하지 않다. 황열 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스에 대한 효과적인 백신은 존재하지만, 이들 바이러스는 여전히 전세계에서 유의한 질환을 일으키고 있다. 효과적인 뎅기 백신을 개발하고자 하는 노력은 바이러스의 전염성에 의해서 난관에 부딪히고 있다. 어떤 특정 뎅기 혈청형에 대해 면역은 특정 혈청형에 대해서는 평생 동안 면역을 유발하지만, 다른 혈청형을 이용한 제2의 감염은 뎅기 출혈열 및 뎅기 쇼크 신드롬(DHF/DSS)(20% 이상의 치사 율을 갖는 심각한 유형의 뎅기 감염)을 유발할 수 있다. (Mongkolsapaya, Dejnirattisai 등, 2003).

플라비바이러스 감염과 관련된 질환의 심각성 및 동물 및 특히 사람에 있어서 그들의 전파력을 고려할 때, 플라비바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 치료 화합물 및 방법이 요구된다.

(발명의 개요)

본 발명은 한 양태에서, 포유동물 및 조류 세포를 포함하는 포유동물 세포에서 플라비바이러스의 복제를 억제하는 방법을 포함한다. 방법의 실행에 있어서, (i) 뉴클레아제-내성 골격을 갖고, (ii) 세포에 의해 섭취될 수 있으며, (iii) 8-40개의 뉴클레오티드 염기를 함유하고, (iv) SEQ ID NOS:1-4로 표시된 서열(각각의 서열은 2개의 광범위한 플라비바이러스문 중 하나에 있어서 바이러스 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열을 나타낸다) 중 어느 하나의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체에 세포를 노출시킨다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 바이러스 게놈 양성 가닥에서 3' 고리화 서열 SEQ ID NOS:3 또는 4의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는다. 화합물에 대한 노출은 세포 내에서 이루어지는 것이 효과적이고, 화합물은 바이러스 ssRNA 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 헤테로듀플렉스 구조를 갖으며, 적어도 45℃의 해리 온도(Tm) 및 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이에 파괴된 염기쌍을 갖는 것을 특징으로 한다(이러한 특징으로 세포에서 바이러스 복제의 억제를 나타낼 수 있다).

한 구체예에서, 유사체는 서열 SEQ ID NOS:1-4 중 하나의 모두 또는 일부분에 상보적이다. 다른 구체예에서, 유사체는 게놈의 5'고리화 서열의 일부분 및 개놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 바이러스 서열로 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다.

세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스-1, 2, 3, 및 4 형, 또는 웨스트 나일 바이러스의 복제를 억제하는데 사용하기 위해서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NOS:1 또는 3, 및 바람직하게는 SEQ ID NO:3의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈의 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:1으로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분과 SEQ ID NO:3로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다.

진드기 매개 뇌염 바이러스, 포와젠 바이러스, 라우핑 일 바이러스, 키아사누르 포레스트 질환 바이러스, 및 알쿠르마 바이러스 중 어느것의 복제를 억제하는데 사용하기 위해서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NOS:2 또는 4, 및 바람직하게는 SEQ ID NO:4의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:2로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분과 SEQ ID NO:4로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 서열과 헤 테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다.

바람직한 올리고뉴클레오티드 유사체는 비하전, 또는 실질적으로 비하전 골격(예를 들어, 도 2A-2G에 도시된 구조 중 어느 하나)을 가지고, 바람직하게는 실질적으로 비하전, 인-함유 골격(예를 들어, 도 3A-3D에 도시된 구조)으로 연결된 8-25개의 모르폴리노 서브유닛으로 이루어져 있다. 하나의 바람직한 유사체는 도 3B에 도시된 구조를 갖고, X 는 NR₂이고, R은 H 또는 CH₃ 이고, Y 및 Z 는 각각 O 이다.

사람 피험체를 포함하는 동물 피험체에서 플라비바이러스 감염을 치료하기 위해서는, 감염된 피험체에 비경구 또는 경구 투여하는 것에 의해서 감염된 세포가 올리고뉴클레오티드 유사체에 노출되도록 한다. 방법은 올리고뉴클레오티드 유사체 및 바이러스 게놈의 상보적 부분으로 이루어진 헤테로듀플렉스 출현에 대해서 체액을 모니터하는 단계를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 동물 세포에서 플라비바이러스의 복제를 억제하는데 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 유사체는 (i) 뉴클레아제-내성 골격을 갖고, (ii) 동물 세포에 의해서 섭취될 수 있으며, (iii) 8-40개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, (iv) SEQ ID NOS:1-4로 표시된 바이러스 게놈 서열(각각의 서열은 2개의 광범위한 플라비바이러스문 중 하나에 있어서 바이러스 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열을 나타낸다) 중 어느 하나의 적어도 일부분을 포함하는 플라비바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖 으며, (v) 플라비바이러스 ssRNA 게놈과 해리 온도(Tm)는 적어도 45℃이고, 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이에 파괴된 염기쌍을 갖는 것을 특징으로 하는 (이러한 특징으로 세포에서 바이러스 복제 억제를 나타낼 수 있다) 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 유사체는 항바이러스 요법에서 유사체 사용과 관련된 상기에 기재된 예들을 포함하여 다양한 구체예들을 갖는다.

본 발명의 목적 및 특징은 수록된 도면을 참조하여 다음 상세한 설명을 읽을 때 더욱 분명해질 것이다.

도 1은 도시된 바와 같은 2차 구조 및 도면 상부에 박스로 표시한 5' 및 3' 고리화 서열을 갖는 플라비바이러스 게놈의 5'-말단, 3'-말단 부분을 나타낸다.

도 2A-2D는 비하전 골격을 갖는 다양한 올리고뉴클레오티드 유사체의 골격 구조를 나타낸다.

도 3A-3D는 3A-3D로 표시되는, 대표적인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복 서브유닛 부분을 나타낸다.

도 4A 및 4B는 TBEV 안티센스(도 4A) 및 스크램블 서열 안티센스(도 4B)의 농도 증가에 따른 TBEV 및 WNV의 반응 플롯이다.

도 5A-5D는 DEN 안티센스(SEQ ID NO:27)에 대한 4개의 뎅기 바이러스 혈청형의 반응 플롯이다.

I. 정의

본원에 사용될 때, 하기의 용어는 다르게 언급되지 않은 한, 다음 의미를 갖는다.

용어 "올리고뉴클레오티드 유사체"는 (i) 예를 들어, 천연 올리고- 및 폴리뉴클레오티드에서 발견된 표준 포스포디에스테르 연결을 제외한 골격과 같은 변형된 골격 구조 및 (ii) 선택적으로, 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 부분을 제외한 모르폴리노 부분과 같은 변형된 당 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 유사체는 표준 폴리뉴클레오티드 염기와 와슨-크릭 염기쌍 형성으로 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하며, 유사체 골격은 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단일 가닥 RNA 또는 단일 가닥 DNA)중의 염기 사이에 서열 특이적 형태로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 바람직한 유사체는 실질적으로 비하전, 인 함유 골격을 갖는 것이다.

올리고뉴클레오티드 유사체에서 실질적으로 비하전, 인 함유 골격은 대부분의 서브유닛 결합(예를 들어, 60-100%)이 생리학적 pH에서 비하전이고, 1개의 인 원자를 포함하는 것이다. 유사체는 8 내지 40개의 서브유닛, 전형적으로는 약 8-25개의 서브유닛, 바람직하게는 약 12 내지 25개의 서브유닛을 포함한다. 유사체는, 하기에 기재된 바와 같이, 표적 서열에 정확한 서열 상보성을 갖거나 또는 거의 상보성을 갖는 것이다.

올리고뉴클레오티드 유사체의 "서브유닛"은 유사체의 1개의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 단위를 지칭한다. 용어는 "하전된 서브유닛"을 지칭하는 경우에는, 전하가 일반적으로는 서브유닛간 결합 내에 남아있지만(예를 들어, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 결합), 부착된 서브유닛간 결합을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드 단위를 지칭할 수 있다.

"모르폴리노 올리고뉴클레오티드 유사체"는 도 3A-3D에 도시된 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성된 올리고뉴클레오티드 유사체이고, (i) 구조는 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 연결하는 1 내지 3개 원자 길이의 인 함유 결합으로 서로 연결되고, (ii) Pi 및 Pj 는 염기 특이적 수소 결합에 의해서 폴리뉴클레오티드 중의 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분은 일반적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징은 U.S.특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337에 기재되어 있고, 상기 문헌은 참고문헌으로서 본원에 수록된다.

도 3B에 도시된 서브유닛 및 결합은 도 3B에 도시된 바와 같이 6-원자 반복 단위 골격에 사용된다(도 3B에서, 6개의 원자는 모르폴리노 질소, 연결된 인 원자, 인 원자를 5' 환외 탄소에 연결하는 원자(일반적으로 산소), 5' 환외 탄소, 및 다음 모르폴리노 고리의 2개의 탄소 원자를 포함한다). 이들 구조에서, 인 기에 5' 환외 모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y₁은 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인에 매달려 있는 X 부분은 염기 특이적 수소 결합을 방해하지 않는 어떤 안정한 기이다. 바람직한 기 X는 플루오로, 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 및 고리형 아민을 포함하는 알킬 아미노를 포함하고, 이들 모두는 염기 특이적 결합이 깨지지 않는 범위내에서 다양하게 치환될 수 있다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게는 1-6개의 탄소 원자를 포함한다. 알킬 아미노는 바람직하게는 저급 알킬(C₁ 내지 C₆) 치환을 가리키고, 고리형 아민은 바람직하게는 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 1-2개의 추가의 헤테로원자를 선택적으로 포함하는 5- 내지 7-원 질소 헤테로사이클이다. Z 는 황 또는 산소이고, 바람직하게는 산소이다.

바람직한 모르폴리노 올리고머는 포스포로디아미데이트-결합 모르폴리노 올리고머이고, 본원에서 PMO로 지칭된다. 이러한 올리고머는 도 3B에 도시된 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, X=NH₂, NHR, 또는 NR₂이고(R은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸이다), Y=O이고, Z=0이고, Pi 및 Pj는 염기 특이적 수소 결합에 의해서 폴리뉴클레오티드 중의 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘이다. 또한 도 3B에 있어서, X=저급 알콕시(메톡시 또는 에톡시)이고, Y=NH 또는 NR(R은 저급 알킬이다)이고, Z=O 인 포스포로디아미데이트 결합을 갖는 구조가 바람직하다.

용어 "치환된"은, 특히 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 또는 알킬아미노기에 관하여 사용될 때, 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 티올, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 이미노, 옥소(케토), 니트로, 시아노, 또는 카르복실산, 술폰산, 또는 포스폰산과 같은 다양한 산 또는 에스테르와 같은 헤테로원자 함유 치환기를 이용한 탄소 상의 수소 원자 치환을 지칭한다. 알킬, 카르보닐, 또는 다른 탄소 함유기를 이용한 헤테로원자(예를 들어, 아민 히드로겐) 상의 수소 원자의 치환을 지칭할 수 있다.

본원에 사용될 때, 바이러스 게놈 RNA와 관련된 용어 "표적"은 바이러스 게놈 RNA를 지칭하고, 바이러스의 복제 가닥에 해당하는 양성 가닥 RNA 또는, 양성 가닥 RNA의 다수의 새로운 복제물 생산에서 형성되는 음성 또는 안티센스 가닥을 포함할 수 있다.

용어 "표적 서열"은 올리고뉴클레오티드 유사체가 유도되는 표적 RNA 부분 즉, 올리고뉴클레오티드 유사체가 혼성화하는 서열을 지칭한다. 표적 서열은 SEQ ID NOS:1-4(하기에 더 논의된 바와 같이 2개의 광범위한 플라비바이러스문 중 하나에 있어서 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열을 나타낸다)로 표시된 서열 중 하나의 적어도 일부분을 포함한다. 하기에 기재되는 바와 같이, 표적 서열은 바이러스 게놈의 연속적인 영역일 수 있거나 또는 게놈의 5' 및 3' 고리화 서열 모두에 상보적인 단편으로 구성될 수 있다.

용어 "표적화 서열"은 RNA 게놈에서 표적 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 유사체 내의 서열이다. 유사체의 전 서열, 또는 그것의 단지 일부분이 전체 유사체 서열의 표적 서열, 또는 그것의 단지 일부분에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 20개의 염기를 갖는 유사체에서, 단지 8-12개만이 표적화 서열일 수 있다. 전형적으로, 표적화 서열은 유사체에서 연속적인 염기로 구성되지만, 예를 들어, 유사체의 반대 말단에서 함께 배치될 때 표적 서열을 포함하는 서열을 구성하는 비연속 서열로 구성될 수 있다. 하기에 기재되는 바와 같이, 표적 및 표적화 서열은 유사체와 바이러스 게놈의 결합이 게놈 내의 5' 및 3' 고리화 서열에 의해서 형성된 RNA 2차 구조의 형성을 방해하거나 예방하는 방식으로 작용하도록 선택된다.

표적 및 표적화 서열은 혼성화가 역평행 구조로 발생할 때 서로 "상보적인 것"으로 기재된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드에 "상보적"일 수 있다. 표적화는 표적 서열에 "거의" 또는 "실질적으로" 상보성을 갖으며, 본 발명의 목적에 있어서 여전히 기능한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드 유사체는 10개의 뉴클레오티드 중의 표적 서열과 기껏해야 1개의 미스매치, 및 바람직하게는 20개 중에 기껏해야 1개의 미스매치를 갖는다. 또는, 사용된 안티센스 올리고머는 본원에 기재된 대표적인 표적화 서열과 적어도 90% 상동성, 및 바람직하게는 적어도 95% 상동성을 갖는다.

올리고머가 생리적 조건하에서 표적과 혼성화하고, Tm이 실질적으로 45℃ 이상, 바람직하게는 적어도 50℃, 및 일반적으로는 60℃-80℃ 또는 그 이상이라면, 올리고뉴클레오티드 유사체는 표적 폴리뉴클레오티드와 "특이적으로 혼성화한다". 이러한 혼성화는 바람직하게는 긴축 혼성화 조건에 해당한다. 허용된 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 온도를 가르킨다. 이러한 혼성화는 안티센스 올리고머가 표적 서열에 완전한 상동성을 갖는 경우뿐만 아니라, "거의" 또는 "실질적" 상동성을 갖는 경우이다.

"뉴클레아제-내성" 올리고머 분자(올리고머)는 체내에서 일반적인 세포외 및 세포내 뉴클레아제에 의한 뉴클레아제 절단에 실질적으로 내성이 있는 비혼성화 또는 혼성화된 형태의 올리고머 골격을 지칭한다. 즉, 올리고머가 체내에 노출되는 일반적인 뉴클레아제 조건하에서 올리고머는 뉴클레아제 절단을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.

"헤테로듀플렉스"는 올리고뉴클레오티드 유사체 및 표적 RNA의 상보적 부분 사이의 듀플렉스를 지칭한다. "뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스"는 안티센스 올리고머를 그것의 상보적 표적과 결합시키는 것에 의해서 형성되고 따라서, 세포내 및 세포외 뉴클레아제(예를 들어, 이중-가닥 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 복합체를 절단할 수 있는 RNAseH)에 의한 생체 분해에 실질적으로 내성이 있는 헤테로듀플렉스를 지칭한다.

"표적 RNA를 포함하는 염기 특이적 세포내 결합 사건"은 세포 내에서 올리고뉴클레오티드 유사체와 표적 RNA 서열간의 특이적 결합을 지칭한다. 이러한 결합의 염기 특이성은 서열 특이적이다. 예를 들어, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 서열내의 상보적인 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.

감염 ssRNA 바이러스에 대하여 표적화된 안티센스 올리고머의 "유효량"은 감염 바이러스의 복제 속도 및/또는 바이러스 로드, 및/또는 바이러스 감염과 연관된 징후를 감소시키기에 충분한 양이다.

본원에 사용될 때, 용어 "체액"은 피험체로부터 얻어진 뇨, 타액, 혈장, 혈액, 척수액, 또는 피부 세포 또는 피부 찌꺼기와 같은 다른 생물학적 기원을 갖는 샘플을 포함하는 다양한 샘플 유형을 포함한다.

용어 "비교양"은 시험 측정과 대조군 측정의 비교에 사용된다. 반응에서 복합체를 형성하는 시약의 비교양은 대조군 견본과 반응하는 양과 비교할 때 시험 견본과 반응하는 양이다. 대조군 견본은 동일한 분석에서 별개로 수행될 수 있거나 또는 동일한 샘플의 일부분(예를 들어, 조직 절편에서 악성 영역을 둘러싸고 있는 정상 조직)일 수 있다.

개체 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연적인 진행을 변경하기 위한 수단으로 제공된 어떤 형태의 간섭이다. 치료는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 약학적 조성물의 투여를 포함하고, 예방적으로, 또는 병리학적 치료 개시 직후에 또는 병인성 약제와 함께 이루어질 수 있다. 특정 바이러스로 감염된 것으로 진단된 환자와 관련된 용어 "개선된 치료적 결과"는 바이러스 또는 바이러스 로드의 성장에 있어서 또는 특정 바이러스에 의한 감염과 관련된 검출가능한 징후의 지연 또는 감소를 지칭한다.

약제가 세포막을 통해 수동 확산이 아닌 다른 메카니즘에 의해서 세포로 들어가는 경우에 약제가 "포유동물 세포에 의해서 능동적으로 섭취된다"라고 한다. 약제는 예를 들어, ATP-의존성 수송 메카니즘에 의한 포유동물 세포막을 통한 약제의 수송을 지칭하는 "능동 수송" 또는 약제가 수송 단백질에 결합하여 막을 통한 결합제의 통과를 촉진하는 수송 메카니즘에 의한 세포막을 통한 안티센스 약제의 수송을 지칭하는 "촉진 수송"에 의해서 수송될 수 있다. 능동 수송 및 촉진 수송 양자의 경우에, 올리고뉴클레오티드 유사체는 하기에 기재된 바와 같이, 실질적으로 비하전된 골격을 갖는다. 또는, 안티센스 화합물은 복합체 형태(예를 들어, 양이온 리피드 또는 리포솜과 복합체를 형성하는 음이온 골격을 갖는 약제)로 조제될 수 있고 엔도시토시스 메카니즘에 의해서 세포에 섭취될 수 있다. 유사체는 예를 들어, 그것의 5' 또는 3' 말단에서 예를 들어, HIV TAT 단백질 또는 폴리아르기닌과 같은 아르기닌 풍부 펩티드에 결합되어서 표적 숙주 세포로의 수송을 촉진할 수 있다.

II. 표적 플라비바이러스

본 발명은 (i) 플라비바이러스 RNA의 3'-CS(또는 5'-CS)영역에 표적화되고, (ii) 숙주세포 내에서 유사체와 바이러스 RNA 사이의 효과적인 상호작용을 허용하는 물리적 및 약물동력학적 특징을 갖는 올리고머 유사체에 플라비바이러스-감염 세포를 노출시키는 것에 의해서 플라비바이러스 복제의 효과적인 억제가 이루어질 수 있다는 발견에 기초한다. 한 양태에서, 유사체는 바이러스로 감염된 포유동물 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기에 기재된 바이러스를 포함하는 플라비비리데 과의 플라비바이러스 속 멤버에 관한 것이다. 플라비바이러스 속, 및 그에 속하는 멤버들의 다양한 물리적, 형태학적, 그리고 생물학적 특징은 예를 들어, Textbook of Human Virology, R. Belshe, ed., 제2판, Mosby, 1991, 및 상기에 열거된 하나 이상의 참고문헌에서 확인할 수 있다. 각각의 플라비바이러스 멤버의 주요한 생물학적, 병리학적 역학적 특징이 하기에 요약된다.

플라비바이러스 복제

플라비바이러스는 단일, 양성 가닥, 게놈 RNA, 짧은 5' 및 3' 비번역 영역(NTR)을 함유하는 길이 약 10,500 뉴클레오티드, 하나의 긴 오픈리딩프레임, 5' 캡, 및 비폴리아데닐화 3'말단을 포함하는 작은, 외피 보유 바이러스이다. 모든 4개의 뎅기 혈청형, 황열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 진드기 매개 뇌염 바이러스를 포함하는 많은 플라비바이러스 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열이 밝혀졌다. 모든 플라비바이러스 단백질은 숙주에 의해서 그리고 바이러스에 의해서 코딩된 프로테아제에 의해서 매개된 정확한 프로세싱 과정을 통해 1개의 긴 다단백질로부터 유래된다. 단일의 오픈리딩 프레임에 의해서 코딩된 10개의 유전자 생성물은 캡시드(C), 프레멤브레인(prM, 세포로부터 비리온을 방출시키기 직전에 멤브레인(M)으로 프로세싱된다), 외피(E), 및 7개의 비구조(NS) 단백질: NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4a, NS4b, 및 NS5(Leyssen, De Clercq 등, 2000; Brinton 2002)의 순서대로 구성된 다단백질로서 번역된다.

모든 모기 매개 플라비바이러스는 보존된 RNA 서열 및 구조를 공유한다(Proutski, Gould 등, 1997; Zeng, Falgout 등, 1998; Li, Li 등, 2002). 플라비바이러스 3'-NTR 및 5'-NTR의 서열 비교 및 RNA 2차 구조 예측으로 수개의 짧고, 잘 보존된 서열을 밝혀냈고, 이것은 3'-말단 영역(약 90개의 염기)이 보존된 스템-루프 구조로 폴딩될 수 있다는 것을 의미한다(Hahn, Hahn 등, 1987). 보존된 스템 루프 구조는 많은 양성 가닥 RNA 바이러스에서 바이러스 복제에 중요한 것으로 밝혀졌다. 플라비바이러스 3' 스템-루프 구조 제 1 서열은 플라비바이러스 간에 보존적이지 않지만, 제 2 구조는 상당히 보존적이다. 짧은 보존된 서열(3'-CS, SEQ ID NO:3)이 보전된 스템-루프 구조의 업스트림(즉, 5' 방향)에서 확인되었다. 게놈의 5' 말단에서 3'-CS와 보존된 서열(5'-CS, SEQ ID NO:1) 사이의 상보성은 긴 범위의 분자간 RNA 상호작용 또는 게놈 RNA의 고리화가 결과된다는 것을 제안한다(Hanh, Hanh 등 1987; You, Falgout 등, 2001; Corver, Lenches 등, 2003). 최근의 실험은 이들 서열 간의 염기쌍 형성이 쿤진 바이러스 레플리콘의 RNA 복제에 필수적이라는 것을 제안한다(Khromykh, Meka 등, 2001). 컴퓨터 계산으로 예측된 뎅기 바이러스의 5'-CS 및 3'-CS 사이의 2차 구조는 도 1(Khromykh, Meka 등, 2001)에 도시되어 있고, 5'-CS 및 3'-CS 는 도면 상단부의 박스내에 표시되고, 본원에서 각각 SEQ ID NOS:1 및 3으로 표시된다. 짧은 상보성 서열은 진드기 매개 뇌염 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 영역(각각, SEQ ID NOS:2 및 4)에서 확인되고, 강력한 고리화 서열과 유사하게 기능하는 것으로 제안된다(Khromykh, Meka 등, 2001).

뎅기 바이러스

플라비바이러스 전염 및 감염 병리학은 다양한 바이러스에 있어서 매우 상이하지만, 뎅기 바이러스가 플라비바이러스 속의 대표적인 예로서 설명된다. 뎅기 바이러스는 절지동물 매개 바이러스(아르보바이러스)이고 Adeds 속(주로 A. aegypti 및 A. Albopictus)에 속하는 모기에 의해서 인간에 전염된다. 바이러스는 고열, 두통, 근육통 및 관절 통증, 및 발진으로 나타나는 질환을 일으킨다. 어떤 경우에, 일반적으로는 아이들에게 있어서, 뎅기 출혈열/뎅기 쇼크 신드롬(DHF/DSS)(심한 출혈, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하고 쇼크를 일으킨다)을 포함한 중증 형태의 감염이 나타난다. 특정 뎅기 혈청형으로 감염된 다음 연속적으로 다른 종류의 혈청형으로 감염된 개체는 DHF/DSS에 대해 유의하게 높은 위험성을 갖는다. 진단 및 신속한 의학적 처치가 이루어지지 않는다면, DHF/DSS의 갑작스러운 발병 및 신속한 진행은 치명적일 수 있다.

4가지 유형의 뎅기 바이러스 중 하나 이상에 의해서 야기된 뎅기 풍토병은 많은 열대 및 아열대 지방에서 주요한 공중 보건상의 문제이다. 100만 이상의 개체를 포함하는 간헐적인 전염성 뎅기가 계속 발병하고 있다. 뎅기 바이러스는 전세계적인 질환 및 사망률의 관점에서 가장 유의한 절지동물 전달 바이러스 군이고, DHF/DSS 환자 500,000명을 포함하여 1억 명 정도의 뎅기열 환자가 매년 발생하는 것으로 추정된다. 전세계적인 인구 증가, 특히 열대 지방에 전역에 걸친 집단의 도시화, 및 지속적인 모기 억제 조치의 결여로, 뎅기 보유 모기 벡터가 열대, 아열대 및 일부 온대성 지역에 걸쳐 그들의 분포를 확장하고 있으며, 전 세계 인구의 반 이상이 뎅기 감염의 위험에 노출되어 있다. 현대의 제트 여행 및 이민은 뎅기 혈청형의 전세계적인 분포를 촉진하여 다수의 뎅기 혈청형이 현재 많은 지역에서 풍토병이 되었다. 이와 수반하여 지난 15년 동안 뎅기 전염병 및 DHF/DSS 발병 빈도가 증가하였다. 예를 들어, 동남아시아에서, DHF/DSS가 입원 및 유아 사망의 주요 원인이다(Hayes 및 Gubler 1992).

상기에 기재된 바와 같이, 플라비바이러스 속에 속하는 많은 다른 멤버가 또한 황열, 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염, 오스트레일리아 뇌염, 및 진드기 매개 뇌염과 같은 심각한 질환의 병인성 인자이다.

황열 바이러스

황열에 대한 효과적인 백신이 수년 동안 사용되었지만, 이 바이러스는 계속적으로 50% 정도의 치사율을 갖는 출혈성 열병의 주요한 원인이 되고 있다. 전세계적으로, 매년 (사망 30,000명) 황열을 갖는 환자는 200,000명으로 추정된다. 또한, 적은 수의 유입된 환자가 황열이 없는 나라에서 발생한다(WHO, Fact Sheet 100, 2001).

일본 뇌염 바이러스

이 아르보바이러스는 전세계 바이러스성 뇌염의 주요 원인이다. 대략 50,000 환자가 매년 아시아에서 발생하며 높은(30%) 치사율을 보이거나 또는 생존 환자에 있어서 영구적인 신경병적 후유증(30%)을 일으킨다. JEV로 발생한 전염성 발병은 열대 및 아열대 아시아의 인구 밀집 지역에서 심각한 공중 위생 문제를 지속적으로 일으키기 있다. 모기의 Culex 속에 속하는 종에 의해 전파되며, 질환은 임상적으로 뇌염으로 밝혀졌고, 종종 중증을 나타내며, 유아와 성인에 있어서 높은 치사율을 갖는다. JEV는 또한 돼지 및 말과 같은 가축을 감염시킨다. 최근 20년 동안, 불활성화된 JEV 백신을 사용한 면역화가 일본, 한국 및 타이완에 있어서 질환을 통제가능하게 하였다. 그러나, 백신 제조에 드는 많은 비용 때문에, 백신이 가장 필요한 나라들에서는 거의 이용가능하지 않다(CDC, Japanese Encephalitis Fact Sheet, 2001).

머레이 밸리 뇌염 바이러스 및 쿤진 바이러스

이들 바이러스는 무균성 수막염 및/또는 뇌염을 특징으로 하는 임상 증후를 갖는 "오스트레일리아 뇌염"에 대한 원인성 인자이다. 이들은 아르보바이러스이고, Culex 모기에 의해서 전파되고, 북부 오스트레일리아의 풍토병이다. 머레이 밸리 뇌염 징후는 거의 불변적으로 갑작스러운 발열; 식욕부진 및 두통을 포함한다. 수일 후에 뇌 기능장애를 경험할 수 있고 코마 및 사망 모두가 유발될 수 있다. 어떤 정신적 후유증 또는 기능상 장애 없이 뇌염 신드롬으로부터 회복하는 것은 드문 일이다. 웨스트 나일 바이러스에 가장 밀접하게 관련된 바이러스인 쿤진 바이러스(Scherret, Poidinger 등, 2001)는 머레이 밸리 뇌염 바이러스에 임상적으로 유사한 질환을 유발하지만 일반적으로는 덜 심각하고 사람 감염은 많지 않은 것으로 보고되었다.

웨스트 나일 바이러스

다른 절지동물 매개 플라비바이러스인 웨스트 나일 바이러스(WNV)가 최근 수년 동안 사람뿐만 아니라 말 및 새와 같은 다른 동물 종에게도 심각한 생명 위협원으로서 등장하였다. 1999년에, 뉴욕은 북아메리카에서 웨스트 나일 바이러스 감염 환자를 보고한 최초의 지역이였다. 사람에 있어서 웨스트 나일 바이러스 감염은 이전에는 아프리카, 중동 및 동유럽에서만 확인되었다. 바이러스는 감염된 새를 무는 것에 의해 바이러스를 획득하는 모기에 의해서 사람 및 몇몇 동물 종에 전파된다. 웨스트 나일 바이러스는 공중 위생에 대한 지속적인 위협으로 남아있다. 역학 연구 및 바이러스 연구는 생존 바이러스가 모기 및 새 집단에서 생존한다는 것을 보여준다. 모기 억제 조치가 뉴욕, 뉴저지 및 코네티컷, 및 많은 다른 동부지역에서 수행되었지만, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 새로운 환자가 진단되었다. 현재, 웨스트 나일 바이러스가 미국의 거의 모든 주에서 확인되었다(Enserink 2002).

웨스트 나일 바이러스 감염된 사람 중에서, 대략 150 내지 300명 중 한 명이 열, 근육통 및 잠재성 발진을 앓는다. 증상을 보이는 사람들 중에서, 대략 10-15%가 수막염(두통, 목경직) 또는 뇌염(정신 상태 변화, 말초 신경 이상, 근육 약화)증상을 보일 것이다. 50세 이상의 사람은 거의 모두 사망한다. 중추신경계 감염을 앓는 환자의 치사율은 5% 내지 11%이다. 사망은 환기 보조물을 필요로 하고 2차 합병증을 유발하는 지속적인 중추 신경계 이상에 기인한다. 지속적인 신경병적 징후가 웨스트 나일 바이러스 유발 뇌염의 생존자에게서 확인되었다.

세인트 루이스 뇌염 바이러스

최근에는 전염성 세인트 루이스 뇌염 바이러스는 발병되지 않았지만, 이것은 미국 서부에서 풍토병으로 남아있고, 무균성 수막염 및/또는 뇌염을 포함하는 심각한 질환의 원인이 된다. 다른 아르보바이러스, SLEV가 1975년과 1990년 미국에서 가장 높은 발병율을 나타낸 예측불능의 간헐적인 전염병의 원인이다.

진드기 매개 뇌염

진드기 매개 뇌염(TBE)은 유럽과 아시아 많은 지역에서 발생하는 가장 위험한 사람 감염 중 하나이다. 병인성 인자는 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBEV)이다. TBEV로 매년 러시아에서 89-166명의 사망을 포함하여 적어도 11,000명의 뇌염 환자가 발생하고, 유럽의 다른 지역에서 약 3000명의 뇌염 환자가 발생하는 것으로 여겨진다(Ternovoi, Kurzhukov 등, 2003). TBE 바이러스는 경증 또는 무증후에서 종종 40%에 이르는 치사율을 갖는 심각한 뇌염에 이르는 징후를 나타내는 병원성이다. 동일한 그룹에 속하는 관련 바이러스인, 라우핑 일 바이러스(LIV) 및 포와젠 바이러스(POW)는 또한 전염병 규모로는 아니지만 사람 뇌염을 유발한다. 동일한 그룹에 속하는 2개의 다른 바이러스, 키아사누르 포레스트 질환 바이러스(KFD) 및 알쿠르마 바이러스(ALK)는 TBE 복합체 바이러스에 밀접하게 연관되어 있으며 뇌염보다는 치명적인 출혈열을 유발하는 경향이 있다(Gritsun, Lashkevich 등, 2003).

III. 바이러스 표적 영역 및 표적화 서열

바람직한 표적 서열은 인접한 서열이고 양성 가닥 플라비바이러스 RNA의 5'-CS 또는 3'-CS 서열의 적어도 일부분 (예를 들어, 적어도 2-8개 염기)를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, 이들 보존된 고리화 서열(CS)은 RNA 복제를 개시하기 위해서 바이러스 RNA의 3' 및 5' 영역이 근접하도록 배치하는 것에 의해서 바이러스 복제에서 어떤 역할을 하는 것 같다(Hanh, Hanh 등, 1987; Khromyhk, Meka 등, 2001). 다양한 플라비바이러스 게놈 서열은 NCBI 진뱅크 데이터베이스와 같은 잘 알려진 공급원으로부터 이용가능하다. 또는, 당업자는 예를 들어, 지정된 바이러스에 대한 서열 정보를 개시하는 참고문헌을 조사하는 것에 의해서 공개된 문헌에서 많은 대상 바이러스에 대한 서열을 확인할 수 있다. 일단 전체 또는 일부 바이러스 서열을 얻은 후에, 바이러스의 5' 및 3'CS 서열을 동정한다.

상응하는 바이러스 게놈에 있어서 5'-CS 및 3'-CS 말단 종결 서열을 포함하는 대표적인 바이러스 핵산 서열에 대한 진뱅크 기준은 하기의 표 1에 열거되어 있다. 입수가능한 문헌 또는 특허 자료의 유전자-서열 데이터베이스들로부터 서열이 이용가능하기 때문에, 이들 서열들은 플라비바이러스 속에 속하는 다른 서열들의 단지 일례라는 것이 이해될 것이다. SEQ ID NOS:1-15로 표시된 하기의 서열은 본 명세서의 표 3에 또한 열거되어 있다. 보존된 5'-CS 및 3'-CS는 표 1에 굵은 글자체로 표시되고, 표 1에 SEQ ID NOS:1-4로 열거되어 있다.

다른 군의 대표적인 표적 서열은 SEQ ID NOS:5-15의 보체이다; 즉, 동정된 서열 5-15 중 하나에 상보적인 역평행 서열을 갖는 서열이다. 예로서, SEQ ID NO:5(5'-GUCAAUAUGCUAAAACGCGG-3')의 보체는 5'-CCGCGUUUUAGCAUAUUGAC-3'이다.

표적 및 표적화 서열 사이의 상보성 정도는 안정한 듀플렉스를 형성하는데 충분한 정도이다. 안티센스 올리고머와 표적 RNA 서열의 상보성 영역은 8-11 염기로 짧을 수 있지만, 바람직하게는 12-15 또는 그 이상의 염기, 예를 들어, 12-20 염기, 또는 12-25 염기이다. 약 15 염기의 안티센스 올리고머는 일반적으로 바이러스 게놈에서 독특한 상보 서열을 갖기에 충분한 길이이다. 더욱이, 하기에 논의되는 바와 같이, 필수 결합 Tm을 얻기 위해서는 최소 길이의 상보적 염기가 필요할 수 있다.

40 염기 길이의 올리고머가 적당할 수 있으며, 여기에서 적어도 최소수의 염기 예를 들어, 8-11, 바람직하게는 12-15 염기가 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 일반적으로, 촉진 또는 활성화된 세포내 섭취는 약 30 미만 길이, 바람직하게는 25 미만, 및 더욱 바람직하게는 20 미만의 올리고머 길이에서 최적화된다. 아래에 더 논의된 PMO 올리고머의 경우에, 결합 안정성 및 섭취 간의 최적의 균형은 13-23 염기 길이에서 이루어진다.

올리고머는 바이러스 핵산 표적 서열에 100% 상보적이거나, 또는 올리고머 및 바이러스 핵산 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 충분히 안정적이어서 세포 뉴클레아제 및 생체내에서 발생할 수 있는 다른 양태의 분해 작용을 견딜 수 있다면, 예를 들어, 변이체를 수용하기 위해서 미스매치를 포함할 수 있다. 뉴클레아제에 의한 절단에 덜 반응성인 올리고머 골격이 하기에 논의된다. 존재한다면, 미스매치는 중간보다는 하이브리드 듀플렉스 말단 영역에 대하여 덜 불안정하다. 허용된 미스매치 수는 듀플렉스 안정성에 관한 잘 이해된 원칙에 따라서, 올리고머 길이, 듀플렉스내의 G:C 염기쌍 비율, 및 듀플렉스내의 미스매치의 위치에 의존적일 것이다. 이러한 안티센스 올리고머가 반드시 바이러스 핵산 표적 서열에 100% 상동성일 필요는 없지만, 핵산 표적의 생물학적 활성(예를 들어, 바이러스 RNA의 고리화)이 조정될 수 있도록 표적 서열에 안정되고 특이적으로 결합하는 것이 효과적이다.

올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm 과 듀플렉스의 세포 효소적 분해에 대한 민감성의 함수이다. 상보성 서열 RNA에 관한 안티센스 화합물의 Tm은 Hames 등, Nucleic Acid Hybridization, IRL 출판사, 1985, pp. 107-108에 기재된 방법과 같은 종래의 방법에 의해서 측정될 수 있다. 각각의 안티센스 올리고머는 상보적-서열 RNA 에 대하여, 체온 이상, 바람직하게는 45℃ 이상의 결합 Tm을 가져야만 한다. 60-80℃ 또는 그 이상의 Tm 이 바람직하다. 잘 알려진 원칙에 따라서, 상보성-기초 RNA 하이브리드에 대하여, 올리고머 화합물의 Tm은 듀플렉스내의 C:G 염기쌍의 비율을 증가시키는 것에 의해서, 및/또는 헤테로듀플렉스의 (염기쌍) 길이를 증가시키는 것에 의해서 높아질 수 있다. 동시에, 세포 섭취를 최적화하기 위해서, 올리고머의 크기를 제한하는 것이 유리할 것이다. 이러한 이유로, 15 미만의 염기 길이에서 높은 Tm(50℃ 또는 그 이상)을 나타내는 화합물이 높은 Tm 값에 대하여 20+ 염기를 필요로 하는 화합물보다 바람직하다.

하기의 표 2에는 플라비바이러스 속에 속하는 선택된 바이러스에 있어서 5'-CS 및 3'-CS에 대하여 유도된 대표적인 표적화 서열이 열거되어 있다. SEQ ID NOS:16-27로 표시된 이들 서열은 상보적이고, 상기 SEQ ID NOS:5-15로 표시된 서열에 역평행이다(SEQ ID NO:19는 SEQ ID NO:8에 상보적이고, SEQ ID NO:9와 1개의 미스매치를 포함하지만 상보적이고, SEQ ID NO:27은 뎅기 2형 바이러스 3'-고리화 서열에 표적화된다). 상기에 언급된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 유사체 중의 실제 표적 서열은 표 1에 기재된 상응하는 표적 서열의 단지 일부분에 상보적일 수 있으며, SEQ ID NO:1 서열 중의 일부분 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:3, 또는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:4를 포함한다.

더욱 일반적으로는, 본 발명은 대표적인 표적화 서열로서, 5'-CS로 확인된 일군의 플라비바이러스에 대한 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열 SEQ ID NO:1의 적어도 일부분 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:3, 또는 5'-CS로 확인된 일군의 플라비바이러스에 대한 SEQ ID NO:2 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:4를 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적화 서열은 일 군의 플라비바이러스에 대하여 SEQ ID NO:3로서 확인되고 다른 군의 플라비바이러스에 대하여 SEQ ID NO:4로서 확인된 게놈의 3' 고리화 서열의 적어도 일부분에 상보적이다. 표적화 서열은 CS 서열내에 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이의 염기쌍 형성을 방해하는(도 1에 예시된 바와 같이 고리화 박스에 도시된 쌍을 형성한 염기 스템 2차 구조를 방해한다) 충분히 많은 염기를 포함한다. 이 구조를 방해하는데 필요한 표적화 서열의 수는 2개의 상보적 고리화 서열 중 하나에 상보적인 2-4 염기 및 인접한 표적 서열 염기에 상보적인 염기이다.

한 구체예에서, 표적화 서열은 선택된 바이러스 즉, SEQ ID NOS:1-4 중 어느 것의 전체 5' 또는 3' 고리화 서열에 상보적인 염기를 포함한다.

다른 구체예에서, 표적화 서열은 2개의 고리화 서열의 상응하는 상보적 영역에 상보적이다. 예로서, 도 1의 서열 박스의 상부에 기재된 2개의 고리화 서열의 상보적인 4-염기 부분을 포함하는 8-염기 표적 서열은 불연속성 서열 5'CAUA…UAUG3'를 갖는다. 이 서열에 결합하여 이 서열을 깨뜨리기에 효과적인 표적화 서열은 서열 5'CAUA…TATG3'를 갖고, 여기에서 "…"는 직접적인 5'-3'서브유닛 결합이거나 또는 표적 서열 내에 불연속성을 수용하도록 설계된 PEG 링커와 같은 스페이서일 수 있다.

후자의 구체예는 본 발명의 다른 양태에 따라서, RNA 중에 "스템" 2차 구조를 형성하는 서열의 상보적 부분에 대하여 유도되고, 표적화 염기로서, 스템 구조를 파괴하기 위해서, 스템 구조의 양 가닥에 상보적인 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체에 관한 것이다.

표 1의 표적 서열은 RNA에 특징적인 우라실(U) 염기를 포함하는 것으로 확인되고, 표 2의 표적화 서열은 DNA에 특징적인 티민 염기를 포함하는 것으로 확인된다. 표적화 서열 염기는 일반적인 DNA 염기 또는 그것의 유사체일 수 있으며, 예를 들어, 표적 서열 RNA 염기와 와슨 크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 우라실일 수 있다.

IV. 안티센스 올리고머

A. 성질

상기에 기술된 바와 같이, 안티센스 올리고머는 바이러스 게놈의 표적화된 부분, 바람직하게는 5'-CS 또는 3'CS로 유도된 염기 서열을 갖는다. 더욱이, 감염된 숙주 세포 예를 들어, 감염된 동물 피험체에 투여되는 경우에, 올리고머는 감염성 바이러스를 효과적으로 표적화할 수 있다. 올리고머 화합물이 (a) 포유동물 세포에 의해서 능동적으로 섭취될 수 있는 능력을 갖고, (b) 일단 섭취되면, 약 50℃ 이상의 Tm에서 표적 ssRNA와 듀플렉스를 형성할 수 있는 경우에 상기 요건이 충족된다.

하기에 기재된 바와 같이, 세포에 의해서 섭취될 수 있는 능력은 올리고머 골격이 실질적으로 비하전일 것을 요구하며, 바람직하게는 올리고머 구조가 세포 막을 통해 능동 또는 촉진 수송을 위한 기질로서 인식될 필요가 있다. 올리고머가 표적 RNA와 안정한 듀플렉스를 형성하는 능력은 올리고머 골격 및 상기에 언급된 요소(표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 길이 및 상보성 정도, G:C 내지 A:T 염기 매치의 비율, 및 어떤 미스매치된 염기의 위치)에 의존적이다. 안티센스 올리고머가 세포 뉴클레아제에 저항하는 능력은 생존 및 약제의 세포 세포질로의 최종 송달을 촉진한다.

어떤 특정의, 실질적으로 비하전 골격이 이들 요건을 만족시키는 능력을 갖는지를 시험하는 방법이 아래에 기재되어 있다.

A1. 세포에 의한 능동 또는 촉진 섭취

안티센스 화합물은 유리(비-복합체화) 형태로 투여된다면, 숙주 세포막을 통해 촉진 또는 능동 수송에 의해서 또는, 복합체 형태로 투여된다면 엔도시토시스 메카니즘에 의해서 숙주 세포에 섭취될 수 있다.

약제가 유리 형태로 투여되는 경우에, 안티센스 화합물은 실질적으로 비하전이여야만하고, 이것은 그것의 서브유닛간 결합의 대부분이 생리적 pH에서 비하전이라는 것을 의미한다. 본 발명을 증명하기 위해 수행된 실험은 작은 수의 순전하(예를 들어, 15- 내지 20-머 올리고머에 대하여 1-2)가 실제로 실질적으로 비하전 골격을 갖는 어떤 올리고머의 세포내 섭취를 증가시킬 수 있다는 것을 증명한다. 전하는 올리고머 그 자체에(예를 들어, 골격 결합에) 보유될 수 있거나 또는 말단의 하전된 기 부속물에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 하전된 결합의 수는 4개의 비하전 결합 당 1개 미만의 하전된 결합이다. 더욱 바람직하게는, 하전된 결합의 수는 10개의 비하전 결합 당 1개 미만, 또는 20개의 비하전 결합 당 1개 미만이다. 한 구체예에서, 올리고머는 전체적으로 비하전이다.

반대 전하가 대략적으로 동일한 수로 존재하는 한, 올리고머는 음성 및 양성으로 하전된 골격 결합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 어느 한 전하를 3-5개 이상 연속적인 서브유닛으로 포함하지 않는다. 예를 들어, 올리고머는 일정 개수의 음이온 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 N3'→N5' 포스포르아미데이트 결합) 및 비슷한 수의 양이온 결합(예를 들어, N,N-디에틸렌디아민 포스포르아미데이트)을 포함할 수 있다(Dagle, Littig 등, 2000). 순전하는 바람직하게는 중성이거나 올리고머당 기껏해야 1-2 순전하이다.

실질적으로 또는 전체적으로 비하전인 것에 추가적으로, 안티센스 약제는 바람직하게는 세포막을 통한 올리고머를 촉진 수송할 수 있거나 능동 수송할 수 있는 막 수송 시스템(즉, 막 단백질 또는 단백질들)에 대한 기질이다. 이 특징은 다음에 기술된 바와 같이, 올리고머 상호작용 또는 세포 섭취에 대한 다양한 테스트로 결정될 수 있다.

제1의 테스트로 올리고머 화합물의 치환할 수 있는 능력 세포 표면상에서 예를 들어 포스포로티오에이트 올리고머와 같은 선택된 하전된 올리고머에 의해서 치환될 수 있는 능력을 검사함으로써 세포 표면 수용체와의 결합을 평가한다. 세포를 약 10-300nM의 최종 농도로 일반적으로 형광 표지된, 허용된 양의 테스트 올리고머와 인큐베이션한다. 그 다음 바로, 예를 들어, 10-30분 후에(테스트 올리고머의 유의한 내재화가 발생하기 전에), 치환 화합물을 농도를 증가시키면서 첨가한다. 테스트 화합물이 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다면, 치환 화합물이 테스트 화합물을 치환한다는 것이 관찰될 것이다. 치환 화합물이 테스트 화합물 농도의 10X 미만의 농도에서 50% 치환을 일으키는 것으로 관찰되었다면, 테스트 화합물은 세포 수송 시스템에 대해 치환 화합물과 동일한 인식 부위에 결합하는 것으로 생각된다.

제2의 테스트로 테스트 화합물이 표지된 리포터(예를 들어, 형광 리포터)를 세포로 수송하는 능력을 검사함으로써 세포 수송을 측정한다. 최종 농도 약 10-300nM 로 첨가된 표지된 테스트 화합물의 존재하에서 세포를 인큐베이션하였다. 30-120분동안 인큐베이션 한 후에, 예를 들어, 현미경을 사용하여 세포내 표지에 대해서 검사한다. 유의한 세포내 표지의 존재는 테스트 화합물이 촉진 또는 능동 수송에 의해서 수송된다는 증거이다.

안티센스 화합물은 또한 복합체 형태로 투여될 수 있으며, 복합체 형성제는 일반적으로 폴리머이고(예를 들어, 양이온 리피드, 폴리펩티드, 또는 비생물학적 양이온 리피드), 안티센스 화합물의 어떤 순전하에 대해 반대 전하를 갖는다. 음이온 올리고뉴클레오티드와 양이온 리피드 또는 다른 폴리머 성분 사이에 이중층 복합체를 포함하는 복합체를 형성하는 방법이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 양이온 리피드 DOTMA(N-[1-(2,3-디오레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드) 및 중성 포스포리피드 DOPE(디오레일 포스파티딜 에탄올아민)을 포함하는 리포솜 조성물 Lipofectin

이 광범위하게 사용된다. 투여 후에, 복합체는 전형적으로는 엔도솜 바디 내에서의 입자 캡슐화를 포함하는 엔도시토시스 메카니즘을 통해 세포에 섭취될 수 있다.

안티센스 화합물은 또한 안티센스 올리고머의 5' 또는 3' 말단에 결합된 아르기닌 풍부 펩티드와 결합된 형태로 투여될 수 있다. 펩티드는 일반적으로 8-16 아미노산 길이이고 아르기닌 및 페닐알라닌 및 시스테인을 포함하는 다른 아미노산의 혼합물로 구성된다. 펩티드 결합된 올리고머의 세포 노출은 향상된 세포내 섭취 및 RNA 표적으로의 송달을 유도한다(Moulton, Nelson 등 2004).

본 발명의 한 양태에 따라서, 어떤 특정 골격을 갖는 올리고머에 요구되는 성질은 표지된 화합물을 동물에 투여하고, 올리고머 투여 수시간 후에 동물로부터 채취된 체액 샘플을 표적 RNA와 헤테로듀플렉스를 형성했는지에 대해 분석하는 간단한 생체내 테스트에 의해서 확인될 수 있다. 이 방법은 하기 D 단락에 상세하게 기재되어 있다.

A2. RNaseH 에 대한 실질적 내성

안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 발현의 억제를 설명하기 위해 2개의 일반적인 메카니즘이 제안되었다(Agrawal, Mayrand 등, 1990; Bonham, Brown 등, 1995; Boudvillain, Guerin 등, 1997). 첫째로, 올리고뉴클레오티드 및 바이러스 RNA 사이에 형성된 헤테로듀플렉스는 RNaseH에 대한 기질로서 작용하여 바이러스 RNA의 절단을 유도한다. 이 부류에 속하거나 속하는 것으로 제안된 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 포스포디에스테르(비변형 "천연" 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 이러한 화합물은 올리고머:RNA 듀플렉스 구조 중의 바이러스 RNA를 RNaseH에 의한 가수분해에 노출하여 그것의 기능을 상실하게 한다.

"입체적 차단제" 또는 "RNaseH 불활성" 또는 "RNaseH 내성"으로 지칭되는 제2 부류의 올리고뉴클레오티드 유사체는 RNaseH에 대한 기질로서 작용하는 것으로 관찰되지 않았으며, 표적 RNA 핵세포질 이송, 스플라이싱, 번역, 또는 복제를 입체적으로 차단함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 이 부류는 메틸포스포네이트(Toulme, Tinevez 등, 1996), 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 어떤 2'-0-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드(Bonham, Brown 등, 1995), 및 N3'→P5' 포스포르아미데이트(Ding, Grayaznov 등, 1996; Gee, Robbins 등, 1998)을 포함한다.

테스트 올리고머는 Stein 등에 기재된 바와 같이 테스트 화합물과 RNA:올리고머 듀플렉스를 형성한 다음, 듀플렉스를 표준 분석 조건하에서 RNaseH와 인큐베이션함으로써 그것의 RNaseH 내성에 대해서 분석될 수 있다. RNaseH에 대해 노출한 다음, 완전한 듀플렉스의 존재 또는 부재가 겔 일렉트로포레시스 또는 질량 분광계에 의해서 모니터될 수 있다.

A3. 생체외 섭취

본 발명의 다른 양태에 따라서, 사용된 안티센스 올리고머 유형이 상기에 기재된 요구되는 특징들 즉, 높은 Tm, 숙주 세포에 의해서 능동적으로 섭취될 수 있는 능력, 및 RNaseH에 대한 실질적인 내성을 제공한다는 것을 증명하기 위한 간단하고 신속한 테스트가 제공된다. 방법은 적절하게 설계된 안티센스 화합물이 포유동물 피험체에 투여되는 경우에 바이러스 RNA 표적의 상보적 부분과 안정한 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있고, 그 다음 헤테로듀플렉스는 뇨 (또는 다른 체액)으로 배출될 수 있다는 발견에 기초한다. 방법의 상세한 설명은 "표적 RNA를 검출하기 위한 비침습적 방법(비침습 방법)"이란 명칭으로 공동출원된 U.S.특허출원번호 09/736,920에 기재되어 있으며, 그 기재는 본원에 참고문헌으로 포함된다.

요약하면, 공지된 RNA 에 대하여 표적화된 염기 서열을 갖는, 평가 대상인 골격을 포함하는 테스트 올리고머를 예를 들어, 포유동물 피험체에 주입한다. 안티센스 올리고머는 숙주 RNA 또는 감염성 바이러스의 RNA를 포함하는 어떤 세포내 RNA 에 대하여 유도될 수 있다. 투여 후 수시간(전형적으로는 8-72시간)에서, 뇨를 분석하여 안티센스-RNA 헤테로듀플렉스 존재를 검출한다. 헤테로듀플렉스가 검출되었다면, 골격은 본 발명의 안티센스 올리고머의 사용에 적합한 것이다.

테스트 올리고머는 후속 분석을 용이하게 하기 위하여 그것이 포유동물 피험체에 적합하다면, 예를 들어, 형광 또는 방사성 태그로 표지화할 수 있다. 분석은 어떤 적합한 고체상 또는 액체 포맷일 수 있다. 일반적으로, 고체상 분석은 우선 헤테로듀플렉스 분석대상물과 고체상 지지체(예를 들어, 입자 또는 폴리머 또는 테스트-스트립 기판)를 결합시키는 단계, 및 결합된 헤테로듀플렉스의 존재/양을 검출하는 단계를 포함한다. 액체상 분석에서, 분석대상물 샘플은 일반적으로 예비처리되어 간섭 샘플 성분을 제거한다. 올리고머가 표지화된 경우에, 헤테로듀플렉스의 존재는 라벨 태그를 검출하는 것에 의해서 확인된다. 비표지화 화합물의 경우에, 헤테로듀플렉스는 고체상 포맷을 사용한 경우라면 면역분석에 의해서 검출될 수 있고, 용액 또는 현탁액 포맷을 사용한 경우라면 질량 분광계 또는 다른 알려진 방법에 의해서 검출될 수 있다.

안티센스 올리고머가 바이러스 게놈의 바이러스 특이적 영역(예를 들어, 플라비바이러스 5'-CS 및 3'-CS를 포함하는 영역)에 상보적인 경우에는, 이 방법은 허용된 ssRNA 바이러스의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 방법은 또한 치료 방법 동안에 바이러스의 양의 감소를 모니터하는데 사용될 수 있다.

B. 대표적인 올리고머 골격

올리고뉴클레오티드 유사체에 사용될 수 있는 비이온성 결합의 예는 도면 2A-2G에 도시된다. 이들 도면에서, B는 염기 특이적 수소 결합에 의해서 폴리뉴클레오티드 중의 염기(바람직하게는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실로부터 선택된다)와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분을 나타낸다. 적합한 골격 구조는 카르보네이트(2A, R=0) 및 카르바메이트(2A, R=NH₂) 결합(Mertes 및 Coats 1969; Gait, Jones 등. 1974); 알킬 포스포네이트 및 포스포트리에스테르 결합(2B, R=알킬 또는 -O-알킬)(Lesnikowski, Jaworska 등 1990); 아미드 결합(2C)(Blommers, Pieles 등, 1994); 술폰 및 술폰아미드 결합(2D, R₁, R₂=CH₂)(Roughten, 1995; McElroy, 1994); 및 티오포름아세틸 결합(2E)(Matteucci, 1990; Cross, 1997)을 포함한다. 후자는 포스포로티오에이트 안티센스 화합물에 대하여 향상된 듀플렉스 및 트리플렉스 안정성을 갖는 것으로 보고되었다. 또한, 3'-메틸렌-N-메틸히드록실아미노 화합물이 구조 2F로 보고된다(Mohan, 1995).

펩티드 핵산(PNA)(도 2G)은 DNA 유사체이고, 이것의 골격은 데옥시리보스 골격과 구조적으로 동일형태로서, 피리미딘 또는 퓨린 염기가 부착된 N-(2-아미노에틸)글리신 단위로 구성된다. 천연 피리미딘 및 퓨린 염기를 포함하는 PNA는 와슨 크릭 염기쌍 형성 규칙에 따라 상보적인 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고, 염기쌍 인식의 관점에서 DNA를 모방한다(Egholm 등, 1993). PNA의 골격은 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합에 의해서 형성되며 안티센스 이용에 있어서 특히 적합하게 된다. 골격은 비하전이고, 일반적인 말단보다 우수한 말단 안정성을 나타내는 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 듀플렉스를 생성한다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해서 인식되지 않는다.

바람직한 올리고머 구조는 상기에 기재된 바와 같이, 비하전 결합으로 연결된, 염기쌍 형성 부분을 포함하는 모르폴리노 기초 서브유닛을 포함한다. 실질적으로 비하전 포스포로디아미데이트 결합 모르폴리노 올리고머(예를 들어, 도 3A-3D에 예시)가 특히 바람직하다. 안티센스 올리고머를 포함하는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드가 예를 들어, 공유 U.S.특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506,5,166,315, 5,185,444, 5,521,063, 및 5,506,337에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다.

모르폴리노 기초 서브유닛의 중요한 특징은 안정한, 비하전 골격 결합에 의해서 올리고머 형태로 결합될 수 있는 능력; 형성된 폴리머가 표적 RNA를 포함하는 상보적 염기 표적 핵산과, 올리고머가 10-14개의 염기로 짧은 경우조차도, 높은 Tm으로 혼성화할 수 있도록 뉴클레오티드 염기(예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실)를 지지하는 능력; 올리고머를 포유동물 세포에 능동 수송할 수 있는 능력; 및 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스가 RNAse 분해에 내성을 나타낼 수 있는 능력을 포함한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 대표적인 골격 구조는 도 3A-3D에 도시된 β-모르폴리노 서브유닛 형태를 포함하고, 각각은 비하전, 인 함유 서브유닛 결합으로 연결되어 있다. 도 3A는 5개의 원자 반복 단위 골격을 형성하는 인 함유 결합을 도시하고, 모르폴리노 고리는 1-원자 포스포아미드 결합으로 연결되어 있다. 도 3B는 6-원자 반복 단위 골격을 생성하는 결합을 나타낸다. 이 구조에서, 인 기에 5' 모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y는 황, 질소, 탄소, 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인에 매달려 있는 X 부분은 플루오르, 알킬, 또는 치환 알킬, 알콕시 또는 치환 알콕시, 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시, 또는 비치환, 단일치환, 또는 2치환된 질소일 수 있으며, 모르폴린 또는 피페리딘과 같은 고리 구조를 포함한다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게는 1-6개의 탄소 원자를 포함한다. Z 부분은 황 또는 산소이고, 바람직하게는 산소이다.

도 3C 및 3D에 도시된 결합은 7-원자 단위 길이 골격이다. 구조 3C에서, X 부분은 구조 3B와 동일하며, 부분 Y는 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소이다. 구조 3D에서, X 및 Y 부분은 구조 3B에서와 동일하다. 특히 바람직한 모르폴리노올리고뉴클레오티드는 도 3B에 도시된 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조(구조식에서, X=NH₂ 또는 N(CH₃)₂, Y=O, 및 Z=O이다)로 구성된 것을 포함한다.

상기에 언급된 바와 같이, 실질적으로 비하전 올리고머는 제한된 수의 하전된 결합 예를 들어, 5개의 비하전 결합마다 약 1 이하, 더욱 바람직하게는 10개의 비하전 결합마다 약 1 이하의 하전된 결합을 포함하는 것이 유리하다. 따라서, 적은 수의 하전된 결합(예를 들어, 하전된 포스포르아미데이트 또는 포스포로티오에이트)이 올리고머에 포함될 수 있다.

안티센스 화합물은 상기에 언급된 참고문헌에 상세하게 기술된 방법을 사용하여 단계별 고체상 합성에 의해서 제조될 수 있다. 어떤 경우에, 화합물의 약물동태를 향상시키기 위해서 또는 화합물의 포획 또는 검출을 용이하게 하기 위해서 안티센스 화합물에 추가의 화학 부분을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 부분은 표준 합성 방법에 따라서, 일반적으로는 올리고머의 말단에 공유결합으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 부분 또는 다른 친수성 폴리머(예를 들어, 10-100 모노머 서브유닛을 갖는 것)를 첨가하는 것이 용해도를 증가시키는데 유용할 수 있다. 하나 이상의 하전된 기(예를 들어, 유기산과 같은 음이온 하전된 기)가 세포 섭취를 향상시킬 수 있다. 리포터 부분(플루오레세인 또는 방사성 표지된 기)이 검출 목적으로 부착될 수 있다. 또는, 올리고머에 부착된 리포터 표지는 표지된 항체 또는 스트렙타비딘을 결합할 수 있는 리간드 (예를 들어, 항원 또는 비오틴)이다. 안티센스 올리고머의 부착 또는 변형을 위한 부분을 선택함에 있어서, 일반적으로는 생적합성이고, 원하지 않는 부작용 없이 피험체에서 내성화될 가능성이 있는 화학적 화합물을 선택하는 것이 바람직하다.

V. 바이러스 복제의 억제

상기에 상세하게 기재된 안티센스 화합물은 포유동물 세포(예를 들어, 사람 세포, 및 조류 세포)를 포함하는 동물 세포에서 플라비바이러스의 복제를 억제하는데 유용하다. 한 구체예에서, 이러한 억제는 이들 바이러스에 의한 숙주 동물의 검염을 치료하는데 효과적이다. 한 구체예에서, 이 방법은 감염된 세포를 특정 바이러스 복제의 억제에 효과적인 안티센스 약제를 갖는 바이러스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, 안티센스 약제는 적당한 약제학적 담체를 이용하여 특정 바이러스로 감염된 포유동물 피험체(예를 들어, 사람 또는 가축용 동물)에 투여된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 숙주에서 RNA 바이러스의 증식을 정지시키는 것으로 예상된다. RNA 바이러스는 숫자 면에서 감소되거나 또는 숙주의 일반적인 성장 또는 발생에 해로운 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않고 제거될 수 있다.

A. 감염 인자의 동정

감염을 야기시키는 특정 바이러스는 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 혈청학적 또는 배양 방법), 또는 본 발명의 안티센스 올리고머를 사용하는 방법에 의해서 결정될 수 있다.

혈청학적 동정은 피험체의 생물학적 표본(예를 들어, 변, 뇨, 뇌척수액, 혈액 등)으로부터 분리된 바이러스 샘플 또는 배양물을 사용한다. 바이러스 검출을 위한 면역분석은 일반적으로 당업자에게 일상적으로 사용되는 방법(예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯)을 사용하여 수행된다. 더욱이, 특정 바이러스 균주 또는 종에 특이적인 단일클론 항체는 종종 상업적으로 입수가능하다.

이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 배양 조건하에서 증식 속도 및 형태와 같은 특징을 비교하는 단계를 포함하는 기술을 사용하는 배양 방법에 의해서 특정 형태의 바이러스를 분리 및 동정할 수 있다.

감염된 피험체에서 바이러스성 감염 인자를 동정하는 다른 방법은 일군의 플라비바이러스 종을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고머를 사용한다. 어떤 특징적인 바이러스 RNA를 표적화하는 서열이 사용될 수 있다. 소망의 표적 서열은 바람직하게는 (i) 광범위한 바이러스과/속에 공통적이고, (ii) 예를 들어, 사람과 같은 감염된 숙주에서는 발견되지 않는 것이다. 다수의 감염성 바이러스에 특징적인 핵산 서열은 공개 데이터베이스로부터 이용가능하고, 특정 올리고머 설계를 위한 기초자료가 된다.

다수의 올리고머 각각에 대해서, 다음 단계가 수행된다: (a) 피험체에 올리고머가 투여된다; (b) 상기 투여 후 선택된 시간에서, 피험체로부터 체액 샘플을 얻는다; 그리고 (c) 안티센스 올리고머 및 바이러스 게놈의 상보적 부분을 포함하는 뉴클레아제 내성 헤테로듀플렉스의 존재 여부에 대하여 샘플을 분석한다. 단계 (a)-(c)는 이러한 올리고머의 적어도 하나에 대하여 수행되거나 또는, 바이러스 또는 바이러스 과를 동정하기 위해서 필요한 만큼의 올리고머에 대하여 수행된다. 올리고머는 연속적으로 또는 더욱 편리하게는, 동시에 투여되고 분석될 수 있다. 바이러스는 안티센스 올리고머 및 특정의 알려진 바이러스 또는 바이러스 과의 바이러스 게놈의 상보적 부분을 포함하는 헤테로듀플렉스의 존재(또는 부재)에 기초하여 동정된다.

바람직하게는, 우선 광범위한 과를 표적화하는 한군의 올리고머가 이용되고 그 다음, 이것에 의해서 확인된 광범위한 과/속에 속하는 구체적인 속 및/또는 종 및/또는 균주에 상보적인 올리고머를 선택한다. 이 제2의 올리고머 군은 광범위한과/속에 속하는 구체적인 속 및/또는 종 및/또는 균주에 관한 표적화 서열을 포함한다. 몇몇의 다른 제2의 올리고머 콜렉션 즉, 제1단계에서 시험된 각각의 광범위한 바이러스 과/속에 대한 것이 일반적으로 제공된다. (i) 시험 대상인 각각의 속/종/균주에 대해 특이적이고 (ii) 사람에게서 발견되지 않는 서열이 선택된다.

B. 안티센스 올리고머의 투여

안티센스 올리고머의 표적 핵산으로의 효과적인 송달은 중요한 치료 양태이다. 본 발명에 따라서, 안티센스 올리고머 송달 경로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구 및 비경구 경로(예를 들어, 정맥내, 피하내, 복강내, 및 근육내, 및 흡입, 경피내, 및 국부 송달)을 포함하는 다양한 전신성 경로를 포함한다. 적당한 경로는 치료를 받는 피험체의 조건에 적절하게 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 피부의 바이러스 감염 치료에 있어서 안티센스 올리고머의 송달에 적합한 경로는 국부 송달이다. 그러나, 바이러스성 호흡기 감염의 치료에 있어서 안티센스의 송달은 흡입에 의한 것이다. 올리고머는 또한 바이러스 감염 부위에 직접적으로 또는, 혈관에 송달될 수 있다.

안티센스 올리고머는 생리적으로 허용가능한 어떤 편리한 비히클로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 당업자가 사용하는 약제학적으로 허용되는 다양한 표준 담체를 포함할 수 있다. 그 예로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 식염수, 인산 완충 식염수(PBS), 물, 수성 에탄올, 에멀젼(오일/수 에멀젼 또는 트리글리세리드 에멀젼), 정제 및 캡슐을 포함한다. 생리적으로 허용가능한 적당한 담체는 선택된 투여 양식에 따라서 다양하게 선택된다.

어떤 예에서, 리포솜은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포로의 섭취를 촉진하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Williams, S.A.Leukemia 10(12):1980-1989, 1996; Lappalainea 등, Antiviral Res. 23:119, 1994; Uhlmann 등, ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: A NEW THERAPEUTIC PRINCIPLE, Chemical Reviews, Volume 90, No. 4, 544-584, 1990; Gregoriadis, G., Chapter 14, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, pp.287-341, Academic Press, 1979를 참조하시오). 히드로겔은 예를 들어, WO 93/01286에 기재된 바와 같이 안티센스 올리고머 투여를 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 미소구체 또는 미세입자로 투여될 수 있다(예를 들어, Wu, G.Y. 및 Wu, C.H., J. Biol. Chem 262:4429-4432, 1987). 또는, US 특허번호 6,245,747에 기재된 바와 같이, 안티센스 올리고머와 복합체를 형성한 가스 충전된 마이크로버블의 사용이 표적 조직으로의 송달을 향상시킬 수 있다.

서방출성 조성물이 사용될 수 있다. 이들은 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 모양을 갖춘 물품의 형태로 반투과성 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다.

방법의 한 양태에서, 피험체는 사람 피험체(예를 들어, 국부성 또는 전신성 바이러스 감염된 것으로 진단받은 환자)이다. 환자 상태는 본 발명의 안티센스 올리고머의 예방적 투여를 필요로 할 수 있는데, 예를 들어, (1) 면역약화되어 있거나, (2) 화상 환자이거나; (3) 유치 카테터를 갖거나; 또는 (4) 수술예정되어 있거나 최근에 수술을 받은 환자의 경우에 적용된다. 바람직한 구체예에서, 올리고머는 약학적으로 허용가능한 담체에 포함되어 경구 송달되는 포르포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다. 다른 바람직한 구체예에서, 올리고머는 약학적으로 허용가능한 담체에 포함되어서 정맥내(IV)로 송달되는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.

방법의 다른 이용에 있어서, 피험체는 가축 동물(예를 들어, 닭, 칠면조, 돼지, 암소, 또는 염소 등)이고, 치료는 예방적이거나 치료적이다. 다른 이용에서, 치료 대상인 감염된 동물은 하나 이상의 플라비바이러스로 감염된 야생 동물(예를 들어, 바다표범, 펭귄, 또는 매)일 수 있다. 본 발명은 또한 상기에 기재된 유형의 항바이러스 안티센스 화합물이 치료 적 수준 이하의 양으로 보충된 곡물 사료를 포함하는 가축 및 가금류 사료 조성물을 포함한다. 항바이러스가 치료수준 이하로 보충된 사료 곡물을 이용하여 가축 및 가금류에 먹이를 공급하는 방법에 있어서, 상기에 기재된 바와 같이 곡물 사료에 항바이러스 올리고뉴클레오티드 조성물이 치료수준 이하의 양으로 보충된다는 점에서 개선이 기대된다.

안티센스 화합물은 일반적으로 적어도 200-400nM 안티센스 올리고머의 최대 혈액 농도를 일으키기에 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 전형적으로는, 1회분 이상의 안티센스 올리고머 투여량이 일반적으로는 약 1 내지 2주 동안 규칙적인 간격으로 투여된다. 경구 투여를 위한 바람직한 투여량은 70kg 당 약 1-25mg 올리고머이다. 어떤 경우에, 환자당 25mg 이상의 올리고머 투여량이 요구된다. IV 투여의 경우에, 바람직한 투여량은 70kg 당 약 0.5mg 내지 10mg이다. 안티센스 올리고머는 짧은 기간 동안 규칙적인 간격(예를 들어, 2 주 미만 동안 매일)으로 투여된다. 그러나, 어떤 경우에 올리고머는 장기간동안 간헐적으로 투여된다. 투여는 항생제 투여 또는 다른 요법적 치료 후에 또는 이와 동시에 이루어질 수 있다. 치료 섭생법은 치료를 받는 피험체의 면역분석, 다른 생화학적 테스트 및 생리적 검사 결과에 기초하여 지시된 대로 (투여량, 빈도, 경로 등에서) 조정될 수 있다.

C. 치료 모니터

본 발명의 안티센스 올리고머를 사용한 효과적인 생체내 치료 섭생법은 투여 기간, 투여량, 투여빈도, 및 투여경로, 및 치료대상 피험체의 상태에 따라서 다양할 것이다(즉, 국부 또는 전신성 감염인지에 따라서 예방적 투여 대 투여). 따라서, 생체내 요법이 최적의 치료 결과를 얻기 위해서는 테스트가 치료 대상이 된 특정 형태의 바이러스 감염에 적절한지를 모니터하는 단계와 투여량 또는 치료 섭생법에서 상응하는 조정을 하는 단계가 필요할 것이다. 치료는 전혈구 측정(CBC), 핵산 검출 방법, 면역진단 시험, 바이러스 배양, 또는 헤테로듀플렉스의 검출과 같은 감염의 일반적인 지표에 의해서 모니터될 수 있다.

한 유형 이상의 RNA 바이러스의 증식을 억제 또는 제거하는데 있어서 본 발명의 생체내 투여된 안티센스 올리고머의 효험은 안티센스 올리고머의 투여 직전에, 기간 동안 및 투여 후에 피험체로부터 채취된 생물학적 샘플(조직, 혈액, 뇨 등)로부터 측정될 수 있다. 이러한 샘플의 분석은 (1) 당업계에 알려진 방법을 사용하여(예를 들어, 일렉트로포레틱 겔 이동 분석) 표적 및 비표적 서열과의 헤테로듀플렉스 형성의 존재 또는 부재를 모니터하는 단계; (2) ELISA 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 표준기술에 의해서 측정된 바이러스 단백질 생산 양을 모니터하는 단계; (3) 예를 들어, Spearman-Karber 방법에 의해서 바이러스 적정농도에 대한 효과를 측정하는 단계(예를 들어, Pari, G.S. 등, Antimicrob. Agents and Chemotherapy 39(5):1157-1161, 1995; Anderson, K.P. 등, Antimicrob. Agents and Chemotherapy 40(9):2004-2011, 1996, Cottral, G.E.(ed) in: Manual of Standard Methods for Veterinary Microbiology, pp. 60-93, 1978)를 포함한다.

안티센스 올리고머 치료의 효험을 모니터하는 바람직한 방법은 안티센스-RNA 헤테로듀플렉스의 검출에 의한 것이다. 안티센스 올리고머 투여 후 선택된 시간에서, 체액을 수거하여 샘플내의 헤테로듀플렉스 종의 존재를 검출하고 그리고/또는 헤테로듀플렉스 종의 수준을 측정한다. 전형적으로, 투여 후 3-24시간에서, 바람직하게는 투여 후 약 6-24시간에서 체액 샘플을 수거한다. 상기에 기재된 바와 같이, 체액 샘플은 뇨, 타액, 혈장, 혈액, 척수액, 또는 다른 생물학적 기원의 액체 샘플일 수 있으며, 그 안에 현탁된 세포 또는 세포 단편, 또는 액체 배지 및 그것의 용질을 포함할 수 있다. 수거된 샘플의 양은 전형적으로는 0.1 내지 10ml 범위로, 바람직하게는 약 1ml 미만이다.

원하지 않는 성분이 제거되도록 샘플을 처리하고/또는 원하지 않는 ssRNA 오버행 영역이 제거되도록 샘플 내의 헤테로듀플렉스 종을 처리한다(예를 들어, RNase로 처리함). 물론, 헤테로듀플렉스 검출이 크기 분리에 의존하는 경우에(예를 들어, 일렉트로포레시스 또는 질량 분광계) 오버행을 제거하는 것이 특히 중요하다.

샘플로부터 원하지 않는 성분을 제거하는데 있어서 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 헤테로듀플렉스가 순음전하를 갖기 때문에, 일렉트로포레틱 또는 이온 교환 기술을 사용하여 중성 또는 양성 하전된 물질로부터 헤테로듀플렉스를 분리한다. 또한, 샘플을 표면 결합 항체 또는 헤테로듀플렉스에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 약제를 갖는 고체 지지체와 접촉시킨다. 비결합 물질을 제거하기 위해서 지지체를 세척한 후에, 헤테로듀플렉스가 실질적으로 정제된 형태로 방출되고, 이를 예를 들어, 일렉트로포레시스, 질량 분광계 또는 면역분석과 같은 더 이상의 분석에 사용한다. 다음 실시예는 본 발명을 제한하도록 의도된 것이 아니며 예시하는 것이다.

실시예1 : 생체외에서 웨스트 나일 바이러스의 안티센스 억제

2개의 PMO 올리고머를 배양된 베로 세포중의 웨스트 나일 바이러스에 대한 그들의 활성에 대하여 평가하였다. 하나의 20mer PMO 올리고머는 웨스트 나일 바이러스의 3'-CS 영역(WNV 3'CS, SEQ ID NO.26)을 표적화하고, 다른 20mer PMO 화합물은 사람, 원숭이 또는 WNV 유전자 서열(NC-1)과 어떤 유의한 상동성을 갖지 않는 "넌센스" 서열(5'-AGTCTCGACTTGCTACCTCA-3')이였다. 2개의 PMO 올리고머 모두는 5' 말단에서 펩티드(R₉F₂C-5'-PMO)와 결합하여 생체외에서 세포내 섭취를 향상시켰다. 2% 송아지 태아 혈청을 보충한 표준 포유동물 조직 배양 배지에 현탁된 세포에 바이러스 접종물과 함께 각각의 PMO 올리고머를 첨가함으로써 2개의 분리된 실험 "2 포인트" 및 "8 포인트 투여량 반응"을 수행하였다. 24시간 후에 현미경하에서 시각적으로 그리고, "뉴트럴-레드 염료 분석"(Morrey, Smee 등, 2002에 기재)을 사용하여 마이크로플레이트 리더로 정량적으로 세포변성 효과에 대하여 기록하였다. 바이러스 적정농도의 50% 감소를 일으키는 효과적인 농도(EC50)가 20 마이크로몰 이상이라면 당업자는 낮은 항바이러스 활성을 갖는 것으로 판단하지만, 20 마이크로몰 미만의 EC50은 실질적인 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 판단한다. 하기의 표는 이들 결과를 요약한다.

2 포인트 투여량 반응

PMO 화합물 명칭	EC50
WNV3'CS(SEQ ID NO:26)	7 마이크로몰
NC-1Z	＞20 마이크로몰

8 포인트 투여량 반응

PMO 화합물 명칭	EC50
WNV3'CS(SEQ ID NO:26)	10 마이크로몰
음성 PMO	＞56 마이크로몰

실시예 2: 진드기 매개 뇌염의 안티센스 억제

이 실시예는 2개의 플라비바이러스; 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBE) 및 웨스트 나일 바이러스(WN)에 대한 본 발명 안티센스 PMO 화합물의 항바이러스 활성을 시험하기 위해 설계되었다. 항바이러스 활성에 대하여 2개의 PMO 올리고머를 평가하였다; TBE 3'CS, SEQ ID NO:25 및; 스크램블 대조군 서열 DS-scr(5'-AGTCTCGACTTGCTACCTCA-3'). 미국 특허출원 60/466,703 및 Moulton, Nelson 등, 2004에 기재된 바와 같이 2개의 PMO 올리고머를 아르기닌 풍부 펩티드(R₉F₂C-5'-PMO)와 5'말단에서 결합시켜서 세포내 섭취를 향상시켰다. WN 바이러스 감염은 음성 대조군 감염을 제공하였는데, WN 과 TBE 3'CS 표적화 PMO 간에 상동성이 없기 때문이다. 이 대조군은 PMO 각각의 비특이적 바이러스 억제 수준을 나타낸다. PMO 화합물을 제조하여 2mM 스톡 용액을 제공하였고, 후에 용액은 조직 배양 세포상의 바이러스 표준 투여량에 대하여 적정화된다. 세포를 하나의 수회 감염(moi)으로 감염시켰고 감염 후 18시간에서 취한 상청액 배지 샘플 중의 바이러스 산출량을 평가하였다.

2개의 바이러스 균주를 이 실험에 사용하였다.

1) TC 401 웨스트 나일 99-34940-31A(뉴욕 균주) 계대 2

2) TC 339 진드기 매개 뇌염 바이러스(Hypr 균주) 계대 49

계대 130에서 4개의 T175 조직 배양 플라스크(NUNC)의 SW 13 세포(RPMI 1640 배지+5% FBS에서 배양된 사람 코카시안 부신피질 선암종 세포주 ECAAC 87031801)를 트립신-EDTA(1X)로 2회 세척하여 37℃에서 2-3분 동안 인큐베이션하였다. 플라스크 당 11.5ml 증식 배지 중에서 세포를 재현탁하고 수거하였다. 수거된 세포 현탁액상에서 세포를 카운팅하였고 결과는 99% 생존성을 갖는 1.74 x 10⁶ 세포/ml이다. 세포 현탁액의 6ml를 4개의 T175 플라스크를 접종하는데 사용하였고 40ml의 세포 현탁액을 희석하여 270ml가 되도록 하였다. 이것을 15개의 6-웰 플레이트 중의 웰 마다 3ml 알리쿼트로 분배하였다. 플레이트를 하룻밤동안 인큐베이션하여 융합성 세포 단층을 형성하였다.

각각의 PMO 화합물을 4ml 무혈청 RPMI 1640 배지 중에서 25, 20, 15, 10, 및 5μM으로 희석하였다. 2개의 6-웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하였다. 2ml의 적당한 화합물 희석액을 플레이트의 모든 웰에 분배하고, 이것을 PMO 화합물 모두에 대해서 별개의 플레이트상에서 반복하였다. 플레이트를 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. -70℃ 냉동기로부터 2개의 바이러스를 제거하였고 빠르게 용해시켰다. 각각의 바이러스를 2 x 10⁶pfu/ml로 희석하여 42ml 무혈청 배지를 얻었다. 인큐베이터 및 모든 웰로부터 흡인된 예비처리된 배지로부터 6-웰 플레이트를 제거하였다. 1ml 배지를 대조군 플레이트(화합물 없음)의 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 플레이트 세트는 웰 당 2 x 10⁶ pfu/ml로 희석된 TBE 또는 WN 중 어느 하나를 1ml씩 포함한다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였고 그 다음 배지를 제거하고 2ml RPMI 1640 + 1% FBS + 세포의 예비처리에 사용된 것과 동일한 농도의 테스트 화합물로 대체하였다. 플레이트를 18시간동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

바이러스 적정농도 측정을 위한 24개의 웰 플레이트를 제조하기 위해서, 계 대 131에서 8개의 T175 조직 배양 플라스크(NUNC)의 SW 13 세포를 트립신-EDTA(1X)로 2번 세척하였고 37℃에서 2-3분 인큐베이션하였다. 플라스크 당 11.5ml 증식 배지에서 세포를 재현탁하였고 수거하였다. 수거된 세포 현탁액상에서 세포를 카운팅하였고 결과는 99% 생존성을 갖는 1.74 x 10⁶ 세포/ml이다. 세포 현탁액의 80ml를 680ml가 되도록 희석하였다. 이들 세포를 8개의 24-웰 플레이트 중의 웰마다 1ml 알리쿼트로 분배하였다. 플레이트를 하룻밤동안 인큐베이션하여 융합 단층을 형성하였다.

감염 후 18시간에서 PMO-처리, 바이러스 감염된 6-웰 플레이트의 상청액 배지를 각각의 웰로부터 수집하였다. 각각의 수집물의 30㎕를 270㎕ 무혈청 배지를 포함하는 96웰 플레이트의 1개의 컵에 배치하였다. 나머지 샘플을 냉동튜브에 배치하였고 -70℃에서 저장하였다. 24-웰 플레이트로부터 배지를 제거하였고 250㎕의 적정 희석액을 96-웰 플레이트로부터 24웰 플레이트로 옮겼고, 이를 1시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 배지에 덧씌워진 1ml 아가로스를 각각의 웰에 첨가하였고 아가로스가 실온에서 고정되도록 한 다음, 플레이트를 5일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후에 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하였고, 1ml 10% 포르몰 식염수를 각각의 웰에 첨가하였고 플레이트를 3시간 동안 실온에서 방치하였다. 흐르는 물로 플레이트를 세척하여 아가로스 배지를 제거하였고 남아있는 플레이트를 세척하는 동안 반대로 배수되도록 방치되었다. 그 다음 각각의 웰은 1ml의 0.1% 나프탈렌 블랙 착색제를 포함하고 착색제를 제거하기 전에 30분 동안 플레이트를 방 치하였고 플레이트를 흐르는 물로 세척하였다. 그 다음, 플레이트를 3시간 동안 (반대로) 방치하여 건조되도록 하였다. 바이러스 플라크를 카운팅하여 적정농도를 결정하였다.

도 4A 및 도 4B는 TBEV 또는 WNV 중 어느 하나로 감염된 바이러스 감염 세포를 사용하고, TBE 안티센스 화합물(도 4A, 화합물은 SEQ DI NO:25를 갖는다) 또는 대조군 화합물(도 4B, 스크램블 서열) 중 어느 하나로 처리된 PMO 처리된 감염으로부터 얻은 바이러스 적정농도를 비처리 대조군 %로서 나타낸다. 도 4A 및 4B에서 바이러스 적정농도의 비교로부터 알 수 있는 바와 같이, 화합물의 농도가 증가할수록 모든 세포(처리 및 대조군)에서 바이러스 적정농도가 감소되는데, 안티센스 및 대조군 화합물 모두에 존재하는 부착된 아르기닌 풍부 펩티드의 세포 독성 효과에 기인하는 것으로 생각된다. 15μM 이상의 화합물 농도에서, WNV에 관하여(도 4A), 그리고 스크램블 서열 대조군(도 4A 와 4B 비교)에 관하여 TBE 바이러스 억제에 있어서 서열 특이적 증가가 관찰된다.

실시예 3: 안티센스 PMO 를 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 1-4의 억제

뎅기열/뎅기 출혈열(DF/DHF)은 지난 20년 동안 전세계의 주요한 건강 문제가 되었다. 뎅기 바이러스(DEM)의 지리적 분포, 그것의 모기 벡터 및 그것이 야기한 질환이 계속 증가하고 있다. 세계 보건 기구는 매년 5천 내지 1억의 감염자가 발생하는 것으로 추정하고 있다. DF/DHF가 남아시아에서 입원 및 유아 사망의 주요한 원인이 되고 있으며, 미국에서 그 발생율이 현저하게 증가추세에 있다. 현재 어떠한 백신도 효과적인 치료제도 없다. 성공적인 백신 또는 치료제로서의 요건은 DEN 의 모든 4가지 사람 혈청형에 대하여 효과적이어야 한다는 것이다. 이 연구의 목적은 배양물 중의 베로 세포내의 4가지 혈청형의 DEN 복제를 억제하는데 있어서 3' CS를 표적화하는 PMO의 효험과 특이성을 평가하는 것이다.바이러스 복제 및/또는 번역(4,5)에서 중요한 것으로 판단되는 양성가닥 DEN2 RNA 중의 서열 요소를 표적화하도록 5 PMO 화합물을 설계하였다. 이 연구에서 베로 E6 세포로의 도입을 촉진하도록 PMO를 아르기닌 풍부 펩티드와 결합시킨다.

뎅기 2 바이러스(DEN2)의 3'-CS 영역에 혼성화하도록 설계된 PMO가 포유동물 세포 배양에서 뎅기 바이러스 복제를 억제하는 능력을 갖는지에 대해서 평가하였다. PMO는 짧은 아르기닌 풍부 펩티드(R₉F₂C-5'-PMO)와 결합하여 PMO가 배양물 중의 세포로 도입되는 것을 촉진한다. 베로 E6 세포를 DEN 혈청형 1-4와 접종된 PMO 제제와 인큐베이션하였고, 5-8일 후에 플라크 분석에 의해서 바이러스 적정농도를 측정하였다. 대조군과 비교할 때, 3' 고리화 서열(3'CS PMO)를 표적화하는 화합물은 도 5A에서 도시된 바와 같이 4-6일에 걸쳐 투여량 의존적이고 서열 특이적인 방식으로 3 차수 크기로 DEN2의 적정농도를 감소시켰다. 각각의 3'CS PMO의 10μM 용액은 도 5B-5D에 도시된 바와 같이 2 차수 크기로 4개의 모든 뎅기 혈청형의 적정농도를 감소시키며, 어떤 경우에는 검출가능한 한계선 이하이다. 효과적인 항-DEN 화합물은 베로 E6 세포에서 배양된 웨스트 나일 바이러스(WNV)의 적정농도를 변경하지 않았다. 이들 데이터는 3'CS PMO 화합물이 강력한 DEN 1-4 치료제라는 것을 나타낸다.

전술한 기재로부터, 본 발명의 다양한 목적 및 특징이 어떻게 충족되는지를 이해할 수 있다. 표적 서열은 몇몇의 플라비바이러스에 있어서 보존적이기 때문에, 단일 올리고뉴클레오티드 유사체가 몇몇 바이러스의 각각을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:1 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:3에 대하여 유도된 단일 유사체가 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스 1,2,3 및 4형, 및 웨스트 나일 바이러스의 복제를 억제하는데 사용될 수 있으며 SEQ ID NO:2 또는 그것의 보체 SEQ ID NO:4에 대하여 유도된 단일 유사체가 진드기 매개 뇌염 바이러스, 포와젠 바이러스, 라우핑 일 바이러스, 키아사누르 포레스트 질환 바이러스, 및 알쿠르마 바이러스를 치료하는데 사용될 수 있다.

표적 서열이 하나 또는 상보적인 고리화 서열에 한정되는 경우에, 유사체는 게놈 센스 가닥 및 제1복제, 안티센스 가닥 모두의 고리화 스템 2차 구조를 파괴하는데 효과적이고, 이에 의해서 양성 및 음성 가닥 모두의 복제 수준에서 바이러스 복제가 억제된다.

유사체는 체내에서 안정하며 예를 들어, PMO와 같은 어떤 유사체 구조의 경우에는 경구 투여될 수 있다. 더욱이, 유사체와 바이러스 표적 사이의 헤테로듀플렉스의 형성은 플라비바이러스에 의한 감염의 존재 또는 부재 확인에 있어서 그리고/또는 숙주에 의한 치료제의 섭취 확인에 있어서 사용될 수 있다.

<110> AVI BioPharma, Inc. Iversen, Patrick L. Stein, David A. <120> OLIGONUCLEOTIDE ANALOG AND METHOD FOR TREATING FLAVIVIRUS INFECTIONS <130> 504508059WO0 <140> PCT/US2004/025335 <141> 2004-08-06 <150> US 60/512,003 <151> 2003-10-16 <150> US 60/493,043 <151> 2003-08-05 <160> 31 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Dengue virus <400> 1 ucaauaug 8 <210> 2 <211> 11 <212> RNA <213> Tick-borne encephalitis virus <400> 2 ggagaacaag a 11 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Dengue virus <400> 3 cauauuga 8 <210> 4 <211> 11 <212> RNA <213> Tick-borne encephalitis virus <400> 4 ucuuguucuc c 11 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> St. Louis encephalitis virus <400> 5 gucaauaugc uaaaacgcgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Japanese encephalitis virus <400> 6 aucaauaugc ugaaacgcgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 7 gucaauaugg uacgacgagg 20 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Dengue virus <400> 8 cuuucaauau gcugaaacgc g 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Dengue virus <400> 9 cuaucaauau gcugaaacgc g 21 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Tick-borne encephalitis virus <400> 10 cagcuuagga gaacaagagc ug 22 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> West Nile virus <400> 11 ggcugucaau augcuaaaac 20 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> St. Louis encephalitis virus <400> 12 aacagcauau ugacaccugg ga 22 <210> 13 <211> 23 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 13 ugggaccaua uugacgccag gga 23 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Dengue virus <400> 14 aaacagcaua uugacgcugg ga 22 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Tick-borne encephalitis virus <400> 15 cgguucuugu ucucccugag cc 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 16 ccgcgtttta gcatattgac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 17 ccgcgtttca gcatattgat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 18 cctcgtcgta ccatattgac 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 19 cgcgtttcag catattgaaa g 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 20 cagctcttgt tctcctaagc tg 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 21 gttttagcat attgacagcc 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 22 tcccaggtgt caatatgctg tt 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 23 tccctggcgt caatatggtc cca 23 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 24 tcccagcgtc aatatgctgt tt 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 25 ggctcaggga gaacaagaac cg 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 26 caggtgtcaa tatgctgttt tg 22 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic antisense oligomer <400> 27 cccagcgtca atatgctg 18 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> St. Louis encephalitis virus <400> 28 ccgcguuuua gcauauugac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic target sequence <400> 29 agtctcgact tgctacctca 20 <210> 30 <211> 149 <212> RNA <213> Dengue virus type 2 <400> 30 aguuguuagu cuacguggac cgacaaagac agauucuuug agggagcuaa gcucaacgua 60 guucuaacag uuuuuuaauu agagagcaga ucucugauga auaaccaacg aaaaaaggcg 120 agaaguacgc cuuucaauau gcugaaacg 149 <210> 31 <211> 112 <212> RNA <213> Dengue virus type 2 <400> 31 aaaaaacagc auauugacgc ugggaaagac cagagauccu gcugucuccu cagcaucauu 60 ccaggcacag aacgccagaa aauggaaugg ugcuguugaa ucaacagguu cu 112

Claims

(a) (i) 뉴클레아제 내성 골격을 갖고, (ii) 세포에 의해 섭취될 수 있으며, (iii) 8-40개의 뉴클레오티드 염기를 함유하고, (iv) SEQ ID NOS:1-4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체를 세포에 노출하는 단계, 및

(b) 상기 노출에 의해서, 상기 세포 내에 바이러스 ssRNA 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 헤테로듀플렉스 구조을 형성하는 단계를 포함하며, 해리 Tm 은 적어도 45℃이고, 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이에 파괴된 염기쌍을 갖는 것을 특징으로 하는 동물 세포에서 플라비바이러스 복제를 억제하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NOS:3-4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 3'고리화 서열의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NOS:1 및 2로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 고리화 서열의 적어도 일부분 및 각각 SEQ ID NOS:3 및 4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적인 부분을 포함하는 바이러스 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 방법은 세이트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스-1, 2, 3, 및 4 형, 또는 웨스트 나일 바이러스의 복제를 억제하기 위한 것이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 각각 SEQ ID NOS:1 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 및 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:3 에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:1으로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분 및 SEQ ID NO:3로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 방법은 진드기 매개 뇌염 바이러스, 포와젠 바이러스, 라우핑 일 바이러스, 키아사누르 포레스트 질환 바이러스, 및 알쿠르마 바이러스의 복제를 억제하기 위한 것이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 각각 SEQ ID NOS: 2 및 4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:4에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:2 로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분 및 SEQ ID NO:4로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열을 포함하는 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 실질적으로 비하전, 인 함유 골격으로 결합된 8-25개의 모르폴리노 서브유닛으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 모르폴리노 서브유닛과 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 환외 탄소와 연결시키는 인-함유 서브유닛간 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방 법.
제 11 항에 있어서, 세포가 노출되는 유사체 중의 모르폴리노 서브유닛은 다음 구조식을 갖는 포스포로디아미데이트 결합으로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.

상기식에서, Y₁=O, Z=O, P_j 는 염기 특이적 수소결합에 의해서 폴리뉴클레오티드의 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 형성 부분이고, X는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 아미노 또는 디알킬아미노를 포함하는 알킬 아미노이다.
제 12 항에 있어서, 방법은 사람 피험체에서 플라비바이러스 감염을 치료하기 위한 방법이며, 상기 노출은 피험체에 경구로 올리고뉴클레오티드 유사체를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 방법은 사람 피험체에서 플라비바이러스 감염을 치료하기 위한 방법이며, 상기 노출은 피험체에 올리고뉴클레오티드 유사체를 투여하는 단계를 포함하며, 이 방법은 올리고뉴클레오티드 유사체 및 바이러스 게놈의 상보적 부분으로 구성된 헤테로듀플렉스의 출현에 대해서 체액을 모니터하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 방법은 포유동물 피험체에서 웨스트 나일 바이러스를 치료하기 위한 방법이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:26으로 표시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 방법은 포유동물 피험체에서 뎅기 바이러스, 1-4형을 치료하기 위한 방법이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NOS:24 및 27로 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 뉴클레아제-내성 골격을 갖고,

(ii) 바이러스 감염된 동물 세포에 의해서 섭취될 수 있으며,

(iii) 8-40 개의 뉴클레오티드 염기를 포함하고,

(iv) SEQ ID NOS:1-4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖으며, 그리고

(v) 플라비바이러스 ssRNA 게놈과 해리 Tm 은 적어도 45℃이고, 바이러스 5' 및 3' 고리화 서열 사이에 파괴된 염기쌍을 갖는 것을 특징으로 하는 헤테로듀플렉 스 구조를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 동물세포에서 플라비바이러스 복제를 억제하는데 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 유사체.
제 17 항에 있어서, SEQ ID NOS:3 및 4로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스 게놈 3' 고리화 서열의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, SEQ ID NOS:1 및 2로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분 및 각각 SEQ ID NOS:3 및 4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적인 부분을 포함하는 바이러스 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, 유사체는 세이트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스-1, 2, 3, 및 4 형, 또는 웨스트 나일 바이러스의 복제를 억제하기 위한 것이며, 각각 SEQ ID NOS:1 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 및 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:3 에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으 로 하는 유사체.
제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:1으로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분 및 SEQ ID NO:3로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, 유사체는 진드기 매개 뇌염 바이러스, 포와젠 바이러스, 라우핑 일 바이러스, 키아사누르 포레스트 질환 바이러스, 및 알쿠르마 바이러스를 치료하기 위한 것이며, 각각 SEQ ID NOS: 2 및 4로 구성된 군으로부터 선택된 게놈의 5' 또는 3' 고리화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 바이러스 양성 가닥 RNA 게놈 영역에 상보적인 적어도 8개의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:4의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:2 로 표시된 게놈의 5' 고리화 서열의 일부분 및 SEQ ID NO:4로 표시된 게놈의 3' 고리화 서열의 상보적 부분을 포함하는 서열과 헤테로듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, 모르폴리노 서브유닛과 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 환외 탄소와 연결시키는 인-함유 서브유닛간 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, 모르폴리노 서브유닛은 다음 구조식을 갖는 포스포로디아미데이트 결합으로 연결되는 것을 특징으로 하는 유사체.

상기식에서, Y₁=O, Z=O, P_j 는 염기 특이적 수소결합에 의해서 폴리뉴클레오티드의 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 형성 부분이고, X는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 아미노 또는 디알킬아미노를 포함하는 알킬 아미노이다.
제 17 항에 있어서, 유사체는 웨스트 나일 바이러스를 치료하기 위한 유사체이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NO:26으로 표시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 17 항에 있어서, 유사체는 뎅기 바이러스, 1-4 형을 치료하기 위한 유사체이며, 세포에 노출되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 SEQ ID NOS:24 및 27로 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.