KR20060000774A

KR20060000774A - Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법

Info

Publication number: KR20060000774A
Application number: KR1020040049740A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 조광명; 신용욱; 엄혜원
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2006-01-06
Anticipated expiration: 2024-06-29
Also published as: KR100651220B1; EP1765979A4; EP1765979A1; US20080194030A1; JP2008504048A; US7790424B2; WO2006001616A1

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌을 생산하는 균주에서 L-메씨오닌 생합성에 관여하는 단백질을 과발현시켜 고수율로 L-메씨오닌을 생산하는 균주를 제조하는 방법, 이러한 방법으로 제조된 균주 및 이러한 균주를 이용하여 L-메씨오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 세린 하이드록시메틸트랜스페라제, L-메씨오닌, S-아데노실-메씨오닌

Description

Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한 Ｌ-메씨오닌의 생산방법{L-methionine producing microorganism and method of producing L-methionine using the microorganism}

도 1은 본 발명의 상세도이다.

도 2는 메씨오닌 함유 및 비함유 배지에서의, 돌연변이에 의해 메씨오닌 요구성이 해제된 CJM002 균주, 메씨오닌 요구성 균주인 TF4076이 glyA-metF로 형질전환되어 메씨오닌 요구성이 해제된 배양 결과를 나타내는 사진이다.

도 3 은 tdcB, metB, metC 유전자를 tdcB-metB, tdcB-metBC 오페론 형태로 제작한 플라스미드 pSE tdcB-metB, pSE tdcB-metBC, pCL tdcB-metB와 오페론 제작시 주형으로 사용된 플라스미드 pSEtdcB, pSEmetB, pSEmetC 이다.

도 4은 ilvA, metB, metC 유전자를 오페론 형태로 제작한 플라스미드 pSE ilvA-metB, pSE ilvA-metBC와 오페론 제작시 주형으로 사용된 플라스미드 pSEilvA 이다.

도 5은 glyA, metF 유전자를 glyA-metF 오페론 형태로 제작한 플라스미드 pSE glyA-metF와 오페론 제작시 주형으로 사용된 플라스미드 pSEglyA, pSEmetF 이다.

본 발명은 L-메씨오닌 생산에 관한 것으로서, 구체적으로는 L-쓰레오닌을 생산하는 균주에서 L-메씨오닌 생합성에 관여하는 단백질을 과발현시켜 높은 수율로 L-메씨오닌을 생산하는 균주를 제조하는 방법, 이러한 방법으로 제조된 균주 및 이러한 균주를 이용하여 L-메씨오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

메씨오닌은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 메씨오닌은 콜린(레시틴)과 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로 작용하며 시스테인과 타우린의 합성원료로도 쓰인다. 또한, 황을 제공하는 역할을 한다. S-아데노실-메씨오닌은 L-메씨오닌으로부터 유래하며 생체내에서 메칠기를 제공하는 역할을 하며 뇌의 다양한 신경전달물질(neurotransmitter) 합성에 관련되어 있다. 메씨오닌 및/또는 S-아데노실-L-메씨오닌(SAM)은 생체 내에서 간과 동맥에서 지방축적을 억제하고 우울, 염증, 간질환, 근육통을 완화하는 등의 다양한 역할을 한다.

지금까지 알려진 메씨오닌 및/또는 S-아데노실-L-메씨오닌의 생체내 역할을 다음과 같다.

1) 지방대사를 촉진하는 간과 동맥에서 지방 침착을 억제하며, 뇌, 심장, 신장의 혈류를 증진시키는 역할을 한다(J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401).

2) 소화를 촉진하고, 독성물질의 해독과 배설을 촉진, 납과 같은 중금속의 배설을 촉진한다.

3) 메씨오닌은 하루 매일 800-1,600mg의 투여로 우수한 항우울제가 된다고 알려져 있다(Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S).

4) 간질환에서 간기능 향상 작용을 한다(FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26). 특히 알코올에 의한 간질환에 효과적이다(Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).

5) 골관절 질환에 항염효과가 좋고 관절회복을 촉진한다(ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30).

6) 메씨오닌은 머리카락에 필수영양소이다. 잘 부서지는 머리카락에 영양을 공급하고 탈모를 방지한다(Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266).

상기와 같이 메씨오닌을 동물 사료를 비롯한 식품과 의약품에서 이용하기 위해서는 화학합성과 생물학적 합성을 통하여 생산할 수 있다.

화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메씨오닌을 생산한다. 그러나 이런 화학 합성을 통하여 생산된 메씨오닌은 L-형과 D-형이 혼 합된 형태로 생산된다는 단점이 있다.

생물학적 공정은 메씨오닌 생성에 관여하는 단백질을 이용하는 방법이다. L-메씨오닌은 metA, metB, metC, metE, metH 유전자로부터 발현되는 효소 단백질의 작용에 의하여 호모세린에서 메씨오닌으로 생합성된다. 구체적으로, metA는 메씨오닌 생합성의 첫 번째 효소인 호모세린 아세틸트랜스페라제(homoserine acetyltransferase)를 코딩하는 유전자로 호모세린을 O-숙시닐-L-호모세린으로 전환하는 기능을 한다. metB가 코딩하는 O-숙시닐호모세린 리아제(O-succinylhomoserine lyase) 효소는 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타씨오닌(cystathionine)으로 전환하는 기능을 한다. metC가 코딩하는 시스타씨오닌 베타 리아제(cystathionine beta lyase) 효소는 시스타씨오닌을 L-호모시스테인으로 전환하는 기능을 한다. metE가 코딩하는 코발라민-비의존적 메씨오닌 신타제와 metH가 코딩하는 코발라민-의존적 메씨오닌 신타제가 L-호모시스테인을 L-메씨오닌으로 전환시킨다. 이 때 metF가 코딩하는 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)와 glyA가 코딩하는 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제(serin hydroxymethytransferase)는 함께 작용하여 L-메씨오닌 합성에 필요한 메틸기를 제공하는 N(5)-메틸테트라아하이드로폴레이트(N(5)-methyltetraahydrofolate)를 합성하는 기능을 한다.

L-메씨오닌은 상기 효소들에 의한 일련의 유기적인 반응을 통하여 합성되게 되고 상기 단백질과 상기 단백질에 영향을 주는 단백질에 유전적인 조작을 가할 경우 L-메씨오닌 합성과 그 조절에 유용하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 일본국 공개 특허 공보 제2000/139471호에는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하며 게놈 유전자상의 thrBC, metJ를 제거하고 metBL을 과발현하고 metK를 리키형으로 제작하여 L-메씨오닌을 생산하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 출원 공개 제US2003/0092026 A1호에는 코리네박테이움(Corynerbacterium) 속에 속하며 L-메씨오닌 합성의 저해인자인 metD 유전자를 제거한 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 출원 공개 제US2002/0049305호에는 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제(metF)의 발현을 증가시켜 L-메씨오닌 생산을 증가시키는 방법이 기재되어 있다.

이런 생물학적 공정으로 생산되는 메씨오닌은 L 형이라는 장점이 있으나 그 양이 매우 미량이다. 생물학적 공정에 의한 L-메씨오닌을 비롯한 L-아미노산의 생산량을 증가시키기 위하여 발효학적 공정, 영양배지 조성 및 크로마토그래피등의 분리공정을 개선을 통해서 이를 개선하고자 하였으나 이것만으로는 근본적인 개선이 이루어지지 않는다. 또한, 메씨오닌이 일정 수준이상으로 합성되면 최종 산물인 메씨오닌이 메씨오닌 합성을 개시하는 초기 단백질 metA 유전자 전사를 피드백으로 억제한다. metA 유전자는 전사 단계에서는 메씨오닌에 의해 저해를 받고 해독 단계에서는 세포내의 단백질 분해효소들에 의해 분해되는 기작으로 메씨오닌 양을 조절하므로 metA 유전자 고발현만으로는 메씨오닌의 양을 일정수준 이상으로 증가시킬 수 없다(Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron : Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis : Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443).

이러한 문제점을 극복하고자 본 발명자들은 metB 유전자가 코딩하는 효소 O-숙시닐호모세린 리아제가 메씨오닌 생합성에서 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타씨온으로 변환하는 기능 외에도 쓰레오닌의 분해 산물인 2-옥소부타노에이트를 기질로 사용하여 메씨오닌 생합성의 중간체인 O-숙시닐-L-호모세린을 합성할 수 있다는 보고(Markus C. Wahl et al., FEBS Letters, Volume 414, Issue 3, 15 September 1997, Pages 492-496,, Hiroshi Kanzaki et al., FEMS Microbiology Letters, Volume 33, Issue 1, January 1986, Pages 65-68)에 착안하여, L-쓰레오닌 고생산 균주를 이용하여 L-메씨오닌을 생산하고자 하였으며, 또한 상기한 L-쓰레오닌 고생산 균주로부터 유래된 메씨오닌 요구성이 해제된 균주에서 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제를 과발현하였으며, 그 결과 metA 단백질을 이용한 방법에 비하여 고농도의 메씨오닌 하에서도 이의 합성이 저해를 받지 않으면서 메씨오닌을 높은 수율로 생산할 수 있었다.

또한, L-쓰레오닌 고생산 균주에서 메씨오닌 생합성 경로상에서 메틸기 공여에 관여하는 단백질인 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제을 동시 발현시킨 결과 메씨오닌 요구성이 해제되었으며, L-쓰레오닌 고생산 균주로부터 유래된 메씨오닌 요구성이 해제된 균주에서 glyA 및 metF 유전자를 과발현시켜 메씨오닌을 높은 수율로 생산할 수 있었다.

더 나아가, L-메씨오닌 생합성 과정에 관여하는 유전자와 메틸기 제공에 관여하는 유전자를 함께 적용한 결과 메씨오닌을 보다 높은 수율로 생산할 수 있었다.

본 발명의 목적은 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 중에서 선택된 2개 내지 5개의 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생산 균주를 형질전환시켜 고수율로 L-메씨오닌을 생산하는 L-메씨오닌 생산 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법으로 제조된 균주를 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 균주를 이용하여 L-메씨오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 중에서 선택된 2개 내지 5개의 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생산 균주를 형질전환시킴을 특징으로 하여, L-메씨오닌 생산 균주를 제조하는 방법을 제공한다.

하나의 바람직한 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주를 O-숙시닐호모세린 리아제, 및 시스타씨오닌 베타 리아제 및 쓰레오닌 디하이드라타제중에서 선택된 하나 또는 이둘 모두를 과발현하는 재조합 벡터로 형질전환시켜서 L-메씨오닌 을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다.

구체적 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주에서 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제를 과발현시키거나, L-쓰레오닌 생산 균주에서 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제를 과발현시키거나, L-쓰레오닌 생산 균주에서 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제를 과발현시켜 L-메씨오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제공한다.

본원에서 쓰레오닌 디하이드라타제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 쓰레오닌을 2-옥소부타노에이트로 분해하는 활성을 가지며, 이러한 활성을 가지는 유전자는 tdcB(Datta P, Goss TJ, Omnaas JR, Patil RV (1987), Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84(2); 393-7), ilvA(Lawther RP, Wek RC, Lopes JM, Pereira R, Taillon BE, Hatfield GW (1987), Nucleic Acids Res 1987; 15(5); 2137-55), sdaA, B가 있다:

L-쓰레오닌 + H₂O <=> 2-옥소부타노에이트 + H₂O + NH₃

O-숙시닐호모세린 리아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타씨오닌으로 합성하는 활성과 2-옥소부타노에이트(2-ketobutyrate , 2-oxobutyric acid , α-oxobutyric acid , α-ketobutyrate , α-ketobutyric acid , 2-oxo-butyrate , 2-keto-butyrate , 2-ketobutyric acid)를 O-숙시닐-L-호 모세린으로 합성하는 활성을 가지며(Clausen T, Huber R, Prade L, Wahl MC, Messerschmidt A, EMBO J. 1998 Dec 1; 17(23): 6827-38), 이러한 활성을 가지는 유전자는 metB(Martel A, Bouthier de la Tour C, Le Goffic F (1987), Biochem Biophys Tes Commun 1987; 147(2); 565-71) 등이 있다:

L-시스테인 + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 시스타씨오닌

2-옥소부타노에이트 + 숙시네이트 + NH₃ <=> O-숙시닐-L-호모세린 + H₂O

시스타씨오닌 베타 리아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 O-숙시닐호모세린 리아제에 의해 합성된 시스타씨오닌을 호모시스테인으로 합성하는 활성을 가지며, 이러한 활성을 가지는 유전자는 metC(Dwivedi CM, Ragin RC, Uren JR (1982). Biochemistry 1982; 21(13); 3064-9. PMID: 7049234) 등이 있다:

시스타씨오닌 + H₂O <=> 피루베이트 + NH₃ + 호모시스테인

상기한 바와 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 공지되어 있으며, 문헌(Blattner et. al., Science 277 : 1453-1462 (1997))에 의하여 공개된 이.콜라이의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다(Accession no. AAC75876). 또한, 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.

생물학적으로 동등한 활성을 나타내는 단백질을 발현할 수 있는 한, 상기한 바와 같은 유전자의 단편 및 이러한 유전자의 변형체도 본 발명에 사용할 수 있다.

상기한 방법에서, 각각의 효소 단백질의 과발현은 이들을 코딩하는 유전자(예: tdcB, ilvA, metB, metC)를 포함하는 제조합 벡터를 통해 달성된다. 이러한 재조합 벡터는 pSE tdcB-metB, pCL tdcB-metB, pSE ilvA-metB, pCL ilvA-metB, pSE metB-metC, pCL metB-metC, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metBC, pCL tdcB-metBC, pCL ilvA-metBC 등을 포함한다.

상기한 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생산 균주를 형질전환시켜 L-메씨오닌 생산 균주를 제조할 수 있다.

본 발명에서 "L-쓰레오닌 생산 균주"란 L-쓰레오닌을 생물체내에서 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주를 말한다. 예를 들어, L-쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물 균주, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)가 L-메씨오닌 생산에 사용된다.

또한, L-쓰레오닌 생산 균주는 천연 미생물 균주뿐만 아니라 변이 미생물도 포함한다. 이러한 변이 미생물의 예에는 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유 사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가지는 미생물; 내재적 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자가 게놈 함유된 유전자 외에 추가로 1 카피 이상 염색체 DNA 중에 삽입된 변이 미생물; L-메씨오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate, OAA)를 포스포에놀 파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물; L-메씨오닌의 생합성에 관여하는 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 tyrR 유전자가 불활성화된 미생물; 및 당전달에 관련된 galP 유전자의 발현을 억제하는 galR 유전자가 불활성화된 미생물이 포함된다. 상기 L-라이신 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나이상의 화합물일 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 L-쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 콜라이 변이 균주 TF4076(KFCC 10718, 한국특허공고 제92-8365호)을 변이시킨 L-쓰레오닌 생산 및 L-메씨오닌-비요구성 CJM002를 사용하였다. TF4076은 메씨오닌 요구성, 메씨오닌 유사체 (예, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예, α-아미노부티릭산) 대한 내성, 메씨오닌의 유사체 (예, 에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주를 세린 하이드록시메틸트랜스페라제와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 과발현하는 재조합벡터로 형질전환시켜서 L-메씨오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다.

본원에서 상기한 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 metH 단백질이 호모시스테인에서 메씨오닌으로 합성시에 호모시스테인에 메틸기를 전달하는 활성에 관여되어 있으며(Sheppard CA, Trimmer EE, Matthews RG (1999), J Bacteriol 1999; 181(3); 718-25., Shostak K, Schirch V (1988), Biochemistry 1988; 27(21); 8007-14), 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제의 유전자는 metF(Saint-Girons I, Duchange N, Zakin MM, Park I, Margarita D, Ferrara P, Cohen GN (1983), Nucleic Acids Res 1983; 11(19); 6723-32) 등이 있으며, 세린 하이드록시메틸트랜스페라제의 유전자는 glyA(Plamann MD, Stauffer LT, Urbanowski ML, Stauffer GV (1983), Nucleic Acids Res 1983; 11(7); 2065-75) 등이 있다:

NADH + 5,10-메틸-THF <=> NAD + 5-메틸-THF

L-세린 + THF <=> 5,10-메틸-THF + 글리신 + H₂O

상기한 방법에서, 각각의 효소 단백질의 과발현은 이들을 코딩하는 유전자(예: glyA, metF)를 포함하는 제조합 벡터를 통해 달성된다. 이러한 재조합 벡터는 바람직하게는 pSE glyA-metF, pCL glyA-metF 등을 포함한다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산균주를 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 중에서 선택된 2개 내지 3개의 단백질을 발현하는 상이한 2개 이상의 재조합 벡터로 공동-형질전환시켜서 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다.

구체적 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 균주를 O-숙시닐호모세린 리아제, 및 시스타씨오닌 베타 리아제 및 쓰레오닌 디하이드라타제중에서 선택된 하나 또는 이둘 모두를 발현하는 제1 재조합 벡터와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 발현하는 제2 재조합 벡터로 공동-형질전환시켜서 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다.

보다 구체적인 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주를 쓰레오닌 디하이드라타제(tdcB, ilvA)와 O-숙시닐호모세린 리아제를 발현하는 제1 재조합벡터와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 및 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 발현하는 제2 재조합벡터로 공동-형질전환시켜시켜 L-메씨오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다. 또한, L-쓰레오닌 생산 균주를 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제를 발현하는 제1 재조합벡터와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 발현하는 제2 재조합벡터로 공동-형질전환시켜 L-메씨오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다. 또한, L-쓰레오닌 생산 균주를 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제를 발현하는 제1 재조합벡터와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 발현하는 제2 재조합벡터로 공동-형질전환시켜 L-메씨오닌을 고수율로 생산하는 균주를 제조한다.

보다 바람직한 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주를 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제를 발현하는 제1 재조합 벡터와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 발현하는 제2 재조합벡터로 공동-형질전환시켜 L-메씨오닌을 과발현시킨다.

가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 균주를 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제를 발현하는 제1 재조합 벡터와 세린 하이드록시메틸트랜스페라제와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 발현하는 제2 재조합벡터로 공동-형질전환시켜 L-메씨오닌을 과발현시킨다.

상기한 방법에서, 각각의 효소 단백질을 코딩하는 유전자(tdcB, ilvA, metB, metC, glyA, metF)를 포함하는 재조합 벡터 중, 제1 재조합 벡터는 바람직하게는 pSE tdcB-metB, pCL tdcB-metB, pSE ilvA-metB, pCL ilvA-metB, pSE metB-metC, pCL metB-metC, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metBC, pCL tdcB-metBC 또는 pCL ilvA-metBC를 포함하며, 제2 재조합 벡터는 pSE glyA-metF 또는 pCL glyA-metF를 포함한다.

바람직하게는, 제1 재조합 벡터로서 pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metBC, pCL tdcB-metBC 또는 pCL ilvA-metBC가 사용되고, 제2 재조합 벡터로서 pSE glyA-metF 또는 pCL glyA-metF를 사용하여 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 및 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 모두를 과발현시킨다.

상기한 바와 같은 본 발명의 L-메씨오닌 생산 균주의 제조방법에서, L-쓰레오닌 생산 균주는 L-메씨오닌-비요구성 에스케리키아 콜라이가 바람직하며, 메씨오닌 요구성을 갖는 TF4076 균주에 NTG에 의한 인공돌연변이법을 통해 메씨오닌 요구성이 해제된 에스케리키아 콜라이 CJM002가 보다 바람직하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 L-메씨오닌 생산 균주 및 상기한 균주를 이용하여 L-메씨오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

구체적 실시 양태에서, 유전자 재조합을 통한 L-메씨오닌 생산 균주의 제조 및 이를 이용한 L-메씨오닌 생산은 다음 단계를 포함한다:

(1) L-메씨오닌 생합성 과정에 관여하는 유전자 및/또는 메틸기 제공에 관여하는 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 등의 유전자를 분리하고 PCR 증폭한다.

L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자를 증폭한다. tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자를 증폭하기 위해 이러한 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭 방법을 이용할 수 있다. PCR 증폭 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis 등, Academic Press (1990) 참조). PCR은 게놈 DNA, 적합한 효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정한다.

본 발명에서 과발현을 위한 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA를 코딩하는 유전자는 상기한 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 상기한 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 동등한 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 포함하며, 또한 유사 활성을 나타내는 한 치환, 결실, 삽입 등에 의한 변이체도 포함한다.

(2) 상기 유전자를 단백질 발현 벡터로 삽입하여 재조합 벡터를 제작한다.

상기 수득된 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 등의 유전자를 적합한 T-벡터내로 클로닝하고, 형성된 재조합 벡터를 형질전환에 의해 이.콜라이와 같은 숙주 세포내로 도입한다. 형질전환체를 배양하고 세포를 분리한 다음, 이들로부터 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자를 갖는 재조합 벡터를 분리한다.

분리된 재조합 벡터를 프라이머 제작시에 삽입한 제한효소 NheI, SacI으로 절단하여 trc 프로모터를 함유한 벡터에 삽입한다. 이와 같이 제작된 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자들을 tdcB-metB, tdcB-metBC, ilvA-metB, ilvA-metBC, glyA-metF와 같은 오페론 형태로 제작하였다.

(3) 재조합 벡터를 L-쓰레오닌 생산 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제작한다.

상기 폴리뉴클레오티드 서열을 L-쓰레오닌, L-메씨오닌을 생산할 수 있는 균주에 전기천공법과 같은 통상의 기술에 의해 유입시킨 다음, 항생제 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자가 과발현된 균주를 분리한다.

본 발명자들은 재조합 플라스미드 pSE tdcB-metB, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metB, pSE ilvA-metBC, pSE glyA-metF을 제작하여 상기 플라스미드를 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산에 대한 내성을 가지며 메씨오닌 요구성을 갖는 TF4076 균주에 NTG에 의한 인공돌연변이법을 통해 메씨오닌 요구성이 해제된 에스케리키아 콜라이 CJM002에 각각 전기천공법으로 유입시켰다. 그 결과, 모균주인 CJM002에 비해 고농도의 L-메씨오닌을 생성하는 것을 확인하였다.

L-쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC 10718, 한국 특허공고 제92-8365호)는 메씨오닌 요구성, 메씨오닌 유사체 (예, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예, α-아미노부티릭산) 대한 내성, 메씨오닌의 유사체 (예, 에씨오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다. 상기 한국 특허의 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 이러한 TF4076은 메씨오닌 요구성 균주로 세포내에서 메씨오닌은 합성하지 못한다. 본 발명자들은 이러한 메씨오닌 요구성을 해제하여 메씨오닌 생산 균주로 이용하기 위하여 NTG를 이용한 인공적인 돌연변이 법을 사용하여 메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 에스케리키아 콜라이 CJM002를 제조하였다.

메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 에스케리키아 콜라이 CJM002는 Escherichia coli MF001로 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국 서울 서대문구 홍재 1동 유림 빌딩, 361-221)에 2004년 4월 9일자로 제KCCM-10568호로 기탁하였다.

상기 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환(transformation), 접합(conjugation), 형질도입(transduction) 또는 전기천공(electroporation)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

(4) 상기 형질전환 균주를 배양하여그 배양물로부터 L-메씨오닌을 생산한다.

상기 제조된 L-메씨오닌 과발현 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에 는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 L-메씨오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는10 내지 160 시간이다.

L-쓰레오닌을 고생산하는 미생물에서 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 과발현시키기 위해 상기한 단백질을 코딩하은 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 trc, tac 등과 같은 과발현 프로모터로 교체하고/하거나 metJ 불활성화, metR 과발현, tdcR, tdcA 과발현과 같은 전사 인자의 발현 조절을 통하여 균주를 제작할 수 있다.

본 발명에 따라 생산되는 메씨오닌은 L-형이다. L-형은 생체내에서 합성되는 형태이며 생물체가 바로 이용할 수 있는 형태이므로 D-형 보다 유용하다. L-메씨오닌은 사료 및 식품 첨가물, 의약 원료, 황의 제공, 의약품 등으로 사용된다.

L-메씨오닌은 이의 주요 대사경로 중의 하나가 아데노실화(adenosylation)에 의해 S-아데노실-메씨오닌을 형성하는 것이므로, L-메씨오닌의 합성이 증가하면 그의 주요 대사산물인 S-아데노실-메씨오닌의 합성도 같이 증가하게 된다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 S-아데노실-메씨오닌의 생산, 구체적 으로 S-아데노실-메씨오닌 생산 균주의 제조방법, 이러한 방법으로 제조된 균주 및 이러한 균주를 이용한 S-아데노실-메씨오닌의 생산 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : TF4076 균주에서의 메씨오닌 요구성 해제

1-1) 인공돌연변이에 의한 메씨오닌 요구성의 해제

인공적인 변이 균주인 TF4076(KFCC10718, 한국 특허공고 제92-8365호)은 메씨오닌에 대하여 요구성을 갖는 균주이다. TF4076의 메씨오닌 요구성을 해제하고자 TF4076 균주를 NTG(1-Methyl-3-Nitro-1-Nitrosoguanidine)를 이용한 인공돌연변이 실험을 실시하였다. TF4076 균주를 LB 액체 배지에서 밤새 배양한 다음 새로운 LB 액체 배지에 옮겨 6시간 동안 배양하였다. 배양한 배양액을 원심 분리를 통하여 균체를 얻어 식염수에 2회 재혼탁하고 다시 원심분리를 통하여 얻어진 균체를 시트레이트 완충액에서 재혼탁한 다음 400ug/ml 농도의 NTG를 첨가후 30분 동안 배양하였다. 배양을 통해 얻어진 돌연변이주를 원심 분리하여 균체를 분리하고 분리된 균체를 식염수로 2회 재혼탁하고 M9 최소한천배지(Na2HPO4 12.8 g/L, KH2PO4 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH4Cl 1 g/L, 20% Glucose 10ml/L, 1M CaCl2 0.1ml/L, 1M MgSO4 2ml/L)에서 배양하여 생장하는 메씨오닌 요구성 해제주를 선별하였다. 도 2는 메씨오닌 요구성이 해제된 것을 나타낸 그림이다. 이렇게 메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산균주를 CJM002 이라 명명하였다.

메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 에스케리키아 콜라이 CJM002는 Escherichia coli MF001로 KCCM에 2004년 4월 9일자로 제KCCM-10568호로 기탁하였다.

1-2) 유전자 치환에 의한 메씨오닌 요구성의 해제

인공적인 변이 균주인 TF4076은 메씨오닌에 대하여 요구성을 갖는 균주이다. TF4076의 메씨오닌 요구성을 해제하고자 야생형의 메씨오닌 생합성 유전자와 TF4076 균주의 메씨오닌 생합성 유전자들간의 DNA 염기서열을 비교하였고 이들중 야생형 유전자 DNA와 많은 차이를 보이는 TF4076의 유전자인 glyA, metF 유전자를 야생형의 유전자로 치환하였다. 그 결과 glyA, metF 두 유전자를 야생형의 유전자로 치환한 TF4076 균주에서 메씨오닌 요구성이 해제되었음을 확인하였다. 메씨오닌 요구성 해제시에 사용된 플라스미드 pSE glyA-metF는 아래의 실시예 3에서 제작에 관하여 상세히 기술하였다. 도 2는 메씨오닌 요구성이 해제된 것을 나타낸 그림이다.

실시예 2 : tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA를 함유한 재조합 플라스미드 제작.

본 실시예에서는 이.콜라이 (Escherichia coli)내의 쓰레오닌 디하이드라타제 , O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 유전자 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자를 trc 프로모터로 교체하고 이를 포함하는 벡터를 제조하였다.

먼저, 게노믹-팁 시스템 (Genomic-tip system)(QIAGEN 사)을 이용하여 쓰레오닌 생산 이.콜라이 TF4076 균주(KFCC 10718)로부터로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 이.콜라이 게놈 DNA를 주형(template)으로 한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 tdcB, ilvA, metB, metC, metF, glyA 유전자의 ORF(Open Reading Frame) DNA 절편, 약 1003bp, 1558bp , 1161bp, 1185bp, 903bp, 1266bp를 얻었다. 이때 사용된 프라이머의 서열 번호는 아래 표와 같고 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 60℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 내지 3분 30초 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

유전자별 프라이머 서열번호

유전자	프라이머 서열번호
tdcB	1, 2
ilvA	3, 4
metB	5, 6
metC	7, 8
glyA	9,10
metF	11,12
Trc-SacⅠ	13
Trc-XhoⅠ	14

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1003bp, 1558bp, 1161bp, 1185bp, 903bp, 1266bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 pCR2.0 클로닝 벡터 (Invitrogen Co. 사)에 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pTotdcB, pToilvA, pTometB, pTometC, pToglyA, pTometF을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체 LB 배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit) (QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 NheI과 SacI으로 처리한 후 각 유전자의 ORF 부분을 함유한 단편을 얻었다. 이렇게 얻어진 단편은는 trc 프로모터를 함유한 벡터인 pSE380 (Invitrogen Co.)을 NheI과 SacI으로 절단된 단편과 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pSE tdcB, pSE ilvA, pSE metB, pSE metC, pSE glyA, pSE metF을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

재조합 플라스미드 pSE tdcB, pSE ilvA, pSE metB, pSE metC, pSE metF, pSE glyA들을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린과 가나마이신(각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체 LB 배지에 도말하여 32℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)(QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 도 3는 제작된 재조합 플라스미드 pSE tdcB, pSE ilvA, pSE metB, pSE metC, pSE metF, pSE glyA 의 플라스미드 지도이다.

실시예 3 : tdcB-metB, tdcB-metBC, ilvA-metB, ilvA-metBC, glyA-metF 오페론 구조를 함유한 플라스미드의 제작

본 실시예에서는 이.콜라이내의 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 세린 하이드록시메틸트랜스페라제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제를 동시에 과발현시키기 위해 상기의 tdcB 유전자와 metB 유전자, tdcB 유전자와 metBC 유전자, ilvA 유전자와 metB 유전자, ilvA 유전자와 metBC 유전자, glyA 유전자와 metF 유전자를 오페론 구조로 제작하고 이를 함유한 벡터를 제조하고, 제작된 벡터를 이.콜라이 숙주 세포에 형질전환한 다음, 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제, 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제와 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제를 동시에 과발현하는 플라스미드를 제작하였다.

실시예 2에서 제작된 플라스미드를 이용하여 trc 프로모터로 교체된 오페론 구조의 tdcB-metB, ilvA-metB, glyA-metF를 제작하기 위하여 metB와 metF 유전자를 함유한 플라스미드인 pSE metB, pSE metF를 주형(template)으로 하고 중합효소 연쇄반응을 수행하여 trc 프로모터의 리보좀 결합 부위를 포함한 metB와 metF ORF DNA 절편, 약 1279 bp와 903bp를 얻었다. 사용된 프라이머로서 서열번호 13번과 서열번호 6번, 서열번호 13과 서열번호 12번의 올리고뉴클레오타드를 사용하였고, 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 60℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 내지 1분 30초 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1279 bp , 903bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 pCR2.0 클로닝 벡터 (Invitrogen Co.)에 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pTRmetB, pTRmetF을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체 LB 배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit) (QIAGEN)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 SacI으로 처리한 후 metB, metF 유전자의 RBS 및 ORF 부분을 함유한 단편을 얻었다. 이렇게 얻어진 단편은 trc 프로모터를 함유한 벡터인 pSE tdcB, pSE ilvA, pSE glyA을 SacI으로 절단된 fragment와 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드pSE tdcB-metB, pSE ilvA-metB, pSE glyA-metF을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린과 가나마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)(QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다.

또한 실시예 2에서 제작된 플라스미드를 이용하여 trc 프로모터로 교체된 오페론 구조의 tdcB-metBC와 ilvA-metBC를 제작하기 위하여 metC 유전자를 함유한 플라스미드인 pSE metC를 주형(template)으로 하고 중합효소 연쇄반응을 수행하여 trc 프로모터의 리보좀 결합 부위를 포함한 metC ORF DNA 절편 약 1306 bp 를 얻었다. 사용된 프라이머로서 서열번호 14과 서열번호 8번의 올리고뉴클레오타드를 사용하였고, 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 60℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 내지 1분 30초 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1306 bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 pCR2.0 클로닝 벡터 (Invitrogen Co. 사)에 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pTRmetC을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체 LB 배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit) (QIAGEN)를 이용하여 플라스미 드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 XhoI으로 처리한 후 metC 유전자의 RBS 및 ORF 부분을 함유한 단편을 얻었다. 이렇게 얻어진 단편은 trc 프로모터를 함유한 벡터인 pSE tdcB-metB와 pSE ilvA-metB를 XhoI으로 절단된 단편 각각과 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pSE tdcB-metBC와 pSE ilvA-metBC를 이.콜라이 NM522에 각각 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

도 3, 4, 5은 제작된 재조합 플라스미드 pSE tdcB-metB, pSE ilvA-metB, pSE ilvA-metBC, pSE tdcB-metBC, pSE glyA-metF의 플라스미드 지도이다.

재조합 플라스미드 pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metBC 및 pSE glyA-metF는 각각 Escherichia coli CJM004(pSE tdcB-metBC), Escherichia coli CJM005(pSE ilvA-metBC) 및 Escherichia coli CJM006(pSE glyA-metF)으로 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국 서울 서대문구 홍재 1동 유림 빌딩, 361-221)에 2004년 6월 14일자로 제KCCM-10577호, KCCM-10578호 및 KCCM-10579호로 기탁하였다.

실시예 4 : pSC101 Ori와 tdcB-metB 오페론을 함유한 재조합 플라스미드의 제작

위에서 제작된 tdcB-metB 오페론과 메씨오닌 생합성과정에서 메틸 리사이클링에 관여하는 glyA-metF 오페론을 2개의 플라스미드에 의해 생산 균주내에서 동시에 발현 시키고자 pSE380 플라스미드와는 다른 재조합 기원을 함유한 벡터인 pCL1920에 tdcB-metB 오페론을 클로닝하고자 하였다.

실시예 3에서 제작된 pSE tdcB-metB 플라스미드를 제한 효소 Pvu II와 Hind III, 스펙티노마이신 내성 유전자와 pSC101 Ori를 함유한 벡터 pCL1920을 제한 효소 Sma I과 Hind III로 절단하고 절단된 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 약 3.4kb와 4.5kb 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 16℃에서 밤새 연결시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pCL tdcB-metB을 이.콜라이 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L), 스펙티노마이신 (100mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린과 스펙티노마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)(QIAGEN)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다.

도 3 은 제작된 재조합 플라스미드 pCL tdcB-metB의 플라스미드 지도이다.

실시예 5 : 재조합 플라스미드pSE tdcB-metB, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metB, pSE ilvA-metBC, pSE glyA-metF를 함유한 메씨오닌 생산 균주의 제작

실시예 3에서 제작된 재조합 플라스미드 pSE tdcB-metB, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metB, pSE ilvA-metBC, pSE glyA-metF를 메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 CJM002에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였고 형질전환된 균주를 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하여 콜로니를 얻었다.

실시예 6 : 재조합 플라스미드 pSE glyA-metF, pCL tdcB-metB를 동시에 함유한 메씨오닌 생산 균주의 제작

실시예 3, 4에서 제작된 재조합 플라스미드 pSE glyA-metF, pCL tdcB-metB 를 메씨오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 CJM002에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였고 형질전환된 균주를 카베니실린(50 mg/L), 스펙티노마이신(100mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하여 콜로니를 얻었다.

실시예 7 : 제작된 균주에 대한 삼각 플라스크에서 메씨오닌 생산 역가 비교 실험

실시예 5, 6 에서 나타낸 바와 같이, 항생제 카베니실린, 카베니실린과 스펙티노마이신이 함유된 고체배지에 도말하여 선별한 각 균주에 대한 콜로니 30주씩을 선발하여 표 2에 나타낸 메씨오닌 역가 배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 메씨오닌 생산성을 비교하였다.

메씨오닌 역가 배지

조성	농도(리터당)
포도당	40 g
황산암모늄	28 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5 g
FeSO₄ㆍ7H₂O	5 mg
MnSO₄ㆍ8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
탄산칼슘	30 g
Vitamin B12	0.02 mg
IPTG	0.1mM
CaCO₃	30 g
효모엑기스	2 g
pH (7.0)

31℃의 배양기에서 LB 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 31℃에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다.

배양물로부터 L-메씨오닌을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 모 균주인 이.콜라이 CJM002 균주는 48시간 발효시간에 5 mg/L 이하인 반면, 플라스미드 pSE tdcB-metB, pSE tdcB-metBC, pSE ilvA-metB, pSE glyA-metF를 함유한 균주는 48 시간의 발효시간에 각각 40, 66, 48, 50, 47.7mg/L의 메씨오닌을 생산하였으며 pCL tdcB-metB와 pSE glyA-metF 두가지의 플라스미드를 함유한 균주는 160 mg/L의 메씨오닌을 생산하였다.

재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

플라스미드 1 (ColE1 Ori)		pSE tdcB- metB	pSE tdcB- metBC	pSE ilvA- metB	pSE ilvA- metBC	pSE glyA- metF	pSE glyA- metF
플라스미드 2 (pSC101 Ori)							pCL tdcB- metB
L-쓰레오닌 (g/L)	16.0	7.5	5.9	6.0	6.1	11.5	5.6
L-메씨오닌 (mg/L)	5	40	66	48	50	47.7	160

상기한 결과로부터 확인되는 바와 같이, 쓰레오닌 생산 균주에서의 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제 단백질의 과발현에 의하여 미생물의 L-메씨오닌 생합성능이 향상되었다. 이는 쓰레오닌 디하이드라타제에 의해 분해된, 분해산물인 2-오소부타노에이트가 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제에 의해 메씨오닌 합성에 사용되어 메씨오닌의 생합성이 증가되는 것으로 여겨진다. 또한, 메씨오닌 생합성 경로상의 메틸 리사이클링에 관여하는 단백질인 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제를 고발현한 경우에도 메씨오닌 생합성능이 향상되었다. 특히, 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제(또는 쓰레오닌 디하이드라타제와 O-숙시닐호모세린 리아제와 시스타씨오닌 베타 리아제)를 발현하는 제1 플라스미드 및 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제와 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제를 발현하는 제2 플라스미드를 사용한 2개의 플라스미드 형태로 동시에 발현할 경우 L-메씨오닌 생합성능이 월등히 향상되었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따라 제조된 L-메씨오닌 생산 균주를 사용하여 L-메씨오닌을 고수율로 생산함으로써 사료 및 식품 첨가제, 의약용 및 의약품의 원료 등의 다양한 분야에 널리 사용될 수 있다.

<110> CJ Corporation <120> L-methionine producing microorganism and method of producing L-methionine using the microorganism <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of tdcB <400> 1 gctagcaatg catattacat acgatctgcc 30 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of tdcB <400> 2 gagctcttaa gcgtcaacga aaccgg 26 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ilvA <400> 3 gctagcaatg gctgactcgc aaccc 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ilvA <400> 4 gagctcctaa cccgccaaaa agaacc 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metB <400> 5 gctagccatg acgcgtaaac aggc 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metB <400> 6 gagctcttac cccttgtttg cagccc 26 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metC <400> 7 gctagccatg gcggacaaaa agct 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metC <400> 8 gagctcttat acaattcgcg caaaac 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glyA <400> 9 gctagcgatg ttaaagcgtg aaat 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glyA <400> 10 gagctcttat gcgtaaaccg ggtaac 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metF <400> 11 gctagctatg agcttttttc acgc 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metF <400> 12 gagctcttat aaaccaggtc gaaccc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for isolation of pSE-metB fragment(1279bp) and pSE-metF fragment(903bp) <400> 13 gagctcgagg taattataac ccgggc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for isolation of pSE-metC fragment (1306bp) <400> 14 ctcgaggagg taattataac ccgggc 26

Claims

L-쓰레오닌 생산 균주를 쓰레오닌 디하이드라타제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타씨오닌 베타 리아제, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제 중에서, 선택된 2개 내지 5개의 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환시킴을 특징으로 하여, L-메씨오닌 생산 균주를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, O-숙시닐호모세린 리아제, 및 시스타씨오닌 베타 리아제 및 쓰레오닌 디하이드라타제중에서 선택된 하나 또는 이둘 모두를 발현하는 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생산 균주를 형질전환시키는 방법.
제1항에 있어서, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 발현하는 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생산 균주를 형질전환시키는 방법.
제1항에 있어서, L-쓰레오닌 생산 균주를 O-숙시닐호모세린 리아제, 및 시스타씨오닌 베타 리아제 및 쓰레오닌 디하이드라타제중에서 선택된 하나 또는 이둘 모두를 발현하는 재조합 벡터와 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 발현하는 재조합 벡터로 공동-형질전환시키는 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, L-쓰레오닌 생산 균주가 L-메씨오닌-비요구성인 방법.
제5항에 있어서, L-메씨오닌-비요구성인 L-쓰레오닌 생산 균주가 에스케리키아 콜라이 MF001(KCCM-10568)인 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 방법으로 제조된 L-메씨오닌 생산 균주.
L-메씨오닌 생산 에스케리키아 콜라이 MF001(KCCM-10568) 균주.
제7항의 L-메씨오닌 생산 균주를 배양함을 특징으로 하여, L-메씨오닌을 생산하는 방법.