KR20050096499A - 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법 - Google Patents
키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법(ELISA)에 관한 것으로, 특이항체를 이용한 신속, 정밀한 정량분석법에 있어서, 우선 키토산올리고당(COS6), 키틴올리고당(NACOS6)을 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin)에 공유결합시켜 준비한 면역원을 실험동물에 면역하여 항COS6 항체와 항NACOS6 항체를 각각 생산한 다음, 이들 특이항체와 COS6-HRP 결합체(conjugate)나 NACOS6-HRP 결합체를 각기 이용한 직접경합ELISA(cdELISA)의 조건을 확립하고, 각 cdELISA의 표준곡선으로 부터 COS6와 NACOS6의 검출한계를 확인하였으며, 이들 항체들의 COS(GlcN, COS2∼COS6) 및 NACOS(GlcNAc, NACOS2∼NACOS6)에 대한 교차반응성을 검토하였다.
상기 본 발명에 따른 cdELISA에 의한 COS와 NACOS 분석법은 기기분석 등 기존의 방법보다 신속, 간편하고 손쉽고 경제적이면서 정밀성에서 우수하며 식품과 같은 혼합물에서도 분석이 용이한 특성을 가지고 있다.
Description
본 발명은 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법(ELISA)에 관한 것으로, 특이항체를 이용한 신속, 정밀한 정량분석법에 있어서, 우선 키토산올리고당(COS6), 키틴올리고당(NACOS6)을 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin)에 공유결합시켜 준비한 면역원을 실험동물에 면역하여 항COS6 항체와 항NACOS6 항체를 각각 생산한 다음, 이들 특이항체와 COS6-HRP 결합체(conjugate)나 NACOS6-HRP 결합체를 각기 이용한 직접경합ELISA(cdELISA)의 조건을 확립하고, 각 cdELISA의 표준곡선으로 부터 COS6와 NACOS6의 검출한계를 확인하였으며, 이들 항체들의 COS(GlcN, COS2∼COS6) 및 NACOS(GlcNAc, NACOS2∼NACOS6)에 대한 교차반응성을 검토하였다.
상기 본 발명에 따른 cdELISA에 의한 COS와 NACOS 분석법은 기기분석 등 기존의 방법보다 신속, 간편, 손쉽고 경제적이면서 정밀성에서 우수하며 식품과 같은 혼합물에서도 분석이 용이한 특성을 가지고 있다.
기존의 COS 검출방법으로는 HPLC와 TLC, 그리고 비색법 등이 있다. 이러한 방법들은 추출과 정제과정에서 시간을 많이 요할 뿐만 아니라, 식품과 같은 matrix로부터 미량의 COS를 회수하기가 대단히 어렵다. 또한, COS는 NACOS와 달리 탈아세틸화(deacetylation)되어 있어, HPLC에 의한 분석 시 UV 검출기가 아닌 RI 검출기를 사용해야 하므로, 낮은 농도에서 감도가 좋지 못하고 식품으로부터 추출하여, 정량화할 경우 순수분리가 어려운 점이 있다.
TLC에 의한 COS의 분석은 정량적이라기보다 정성적이고, HPLC의 경우와 마찬가지로 몇 단계의 분리를 거쳐야 하며 닌히드린(ninhydrin spray)에 의한 발색은 COS에 대해서만 일어나는 특이적 반응이 아니다. 다음으로, 비색법의 경우도 방해물질에 의하여 영향을 많이 받으며, 올리고머에 대한 정량보다는 글루코사민 모노머에 대한 반응이 우선적으로 잘 일어나 올리고머의 정량이 정확하지 못하다. Park 등(Park. W. K., Y. H. Park., H. K. Kim, and B. H. Park. 1996. Formation of chitin oligosaccharides during fermentation of toha-jeot(salt-fermented toha Shrimp. J. Korean soc. Food Sci. Nutr. 25(5): 791-795.)은 토하젓의 숙성과정 중 생성되는 키틴올리고당을 겔투과크로마토그래피(GPC)로 분자량 분포를 조사하여 보고하였는데, 이는 아마도 단백질의 분해정도를 측정한 것으로 생각되며, COS를 직접 분석한 것으로는 보기에는 무리가 있다.
한편, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 성질을 이용하여 불순물의 방해작용을 효과적으로 배제함으로써, 특정성분의 분석 효율성을 높이는 효소면역측정법 (enzymed-linked immunosorbent assay, ELISA)이 근년 식품성분분석에 활용되고 있다. 일반적으로 활용되고 있는 면역분석법은 labeled immunoassay로써, 이것은 표식(label)으로써 사용되는 물질에 따라 방사성면분석법(radioimmunoassay, RIA)과 형광면역분석법(fluorescence immunoassay, FIA)과 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) 등으로 나누어 진다. RIA의 경우 검출감도는 매우 높으나 방사성 시약 및 그 취급에 필요한 장비가 필요하며(Yalow, R. S. and S. A. Berson. 1959. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods. Nature 184: 1643-1644.), FIA는 형광시약 및 그 취급에 필요한 장비가 필요하다. ELISA는 상기의 면역분석법들보다 비교적 간편하고, 비용이 저렴하고, 검출감도가 높아서, 정성적 screening 방법 및 정량적 진단방법으로 현재 가장 널리 사용하고 있는 분석법이다. 이 ELISA 분석시스템은 항체 또는 표준 항원에 표식물질로서 효소를 결합시킨 것을 사용함으로써, 최종적으로 기질을 분해할 때 생기는 색깔의 농도를 흡광도계로 측정하는 것을 원리로 하고 있다.
COS의 분석에 Kim 등(Kim, S. Y., D. H. Shon, and K. H. Lee. 2000. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of chitooligosaccharides. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 696-701.)은 ELISA를 COS분석에 활용하였는데, COSM(키토산의 분해물로서 COS 혼합물임)을 합텐(hapten)으로 하여 생산한 특이항체를 코팅용 항체로 이용하여 COSM을 검출하는 직접경합ELISA(competitive direct ELISA)를 도입하였으며, Eum 등(Eum, B. W., B. Y. Kwak, S. Y. Kim, D. H. Shon, and K. H. Lee. 2003. Enhancement of chitooligosaccharides in Doenjang (soybean paste) and Kanjang (Soy Sauce) using Bacillus subtilis Koji and Rhizopus oryzae Koji. Korean J. Food Sci. Techinol. 35: 291-296.)은 이와 같은 항체와 ELISA방식으로 전통장류(된장 및 간장) 중 COS의 검출을 보고하였다. 그러나, 상기의 연구에서 합텐으로 사용한 COSM은 그 중합도가 서로 다른 COS의 혼합물이어서, 이로부터 생산된 특이항체도 매우 불균일한 것으로 생각된다. 따라서, 일정한 분자량의 COS를 합텐으로 사용함으로써, 보다 균일한 특이항체를 얻는 것이 바람직할 것으로 예상된다. 또한, 상기의 연구에서는 COS의 검출에 초점을 맞춤으로써 시료 중에 함께 존재하는 NACOS의 검출은 거의 불가능한 문제가 있다.
따라서, 본 발명에서는 상기한 점을 감안하여 이루어진 것으로, 특이항체를 이용한 신속, 정밀한 정량분석법에 있어서, 우선 합텐으로서 균일한 물질인, 중합도6의 키토산올리고당(COS6) 및 키틴올리고당(NACOS6)을 소혈청알부민에 공유결합시켜, 항COS6 항체와 항NACOS6 항체를 각각 생산한 다음, 이들 특이항체와 COS6-HRP 결합체나 NACOS6-HRP 결합체를 각기 이용한 cdELISA의 조건을 확립하고, COS6와 NACOS의 검출한계를 확인하여, 이들 항체들의 COS 및 NACOS에 대한 교차반응성을 검토함으로써, 기기분석 등 기존의 방법보다 신속, 간편하고 손쉽고 경제적이면서 정밀성에서 우수할 뿐만 아니라 식품과 같은 혼합물에서도 분석이 용이한 COS 및 NACOS의 ELISA분석법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 특이항체를 이용한 신속, 정밀한 cdELISA에 있어서, 우선 키토산올리고당(COS6), 키틴올리고당(NACOS6)을 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin)에 공유결합시켜, 준비한 면역원을 실험동물에 면역하여 항 COS6항체와 항 NACOS6항체를 각각 생산한 다음, 이들 특이항체와 COS6-HRP 결합체(conjugate)와 NACOS6-HRP 결합체를 각기 이용한 직접경합ELISA(cdELISA)의 조건을 확립하고, 각 cdELISA의 표준곡선으로 부터, COS6와 NACOS6의 검출한계를 확인하였으며, 이들 항체들의 COS(GlcN, COS2∼COS6) 및 NACOS(GlcNAc, NACOS2∼NACOS6)에 대한 교차반응성을 검토한 점이 특징이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다.
실시예
본 실시예에서는 (1).면역원의 제조, (2). Horseradish peroxidase conjugate, (3). 특이항체의 생산, (4). cdELISA에 의한 항COS6 항체와 항NACOS6 항체의 교차반응성조사의 순서로 실험하였다.
I. 실험재료
본 실험에 사용된 면역원 제조를 위해 1-에틸-3,3'-디메틸아미노프로필카르보다이이미드(EDC), 1,1'-카르보닐다이이미다졸(CDI), 소혈청알부민(BSA)은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, 무수 메틸설폭사이드는 알드리치사(Aldrich Chemical, Milwaukee, Wl, USA)로부터 구입하였다. Horseradish peroxidase(HRP), 그리고 코팅버퍼(coating buffer)로서 TRIZMA PRE-SET CRYSTALS (트리스하이드록시메틸아미노메탄, 0.05M, pH 9.0)와 워싱버퍼(washing buffer)로서 Tween 20이 함유된 phosphate buffered saline(PBST; 0.01M phosphate buffer with 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, 0.05% Tween 20)을, 기질용액으로는 phosphate-citrate buffer tablets(0.05M phosphate-citrate buffer, pH 5.0, 1 tablet/100ml), 또한 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate, Freund's complete adjuvant(FCA), Freund's incomplete adjuvant(FIA), dialysis tubing(benzoylated cellulose tubing), goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate와 D-글루코사민(GlcN) 등은 시그마사로부터 구입하여 사용하였다.
글루코사민(GlcN), 키토바이오스(COS2), 키토트리오스(COS3), 키토테트라오스(COS4), 키토펜타오스(COS5), 키토헥사오스(COS6), N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), N-아세틸키토바이오스(NACOS2), N-아세틸키토트리오스(NACOS3), N-아세틸키토테트라오스(NACOS4), N-아세틸키토펜타오스(NACOS5), 및 NACOS6은 세이카쿠사(Seikagaku, Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 기타의 시약과 유기용매는 GR급 이상을 사용하였다. Homogenizer는 ULTRA TURRAX(T25 basic KIA-WERKE, Germany), microtiter plates는 눈크사(Nunc)의 MaxisorpTM(Cat#446612, Roskilde Denmark)을, microplate reader는 몰레큘라디바이시스사(Molecular Devices, Sunnyvale, CA. USA)의 THERMOmaxTM을 사용하였다.
II. 실험방법
1. 면역원의 제조
특이항체는 비장(spleen)이나 임파절(lymph node)의 백혈구(T cell, B cell, macrophage)가 면역과의 특이적이며 계속적인 상호작용으로 생산된다. 이때 면역원은 그 분자량이 어느 정도 커야만(약 10 kDa 이상), 동물의 항체생산을 효과적으로 유도할 수 있다. Immunoassay에 의한 진균독소의 분석. 식품영양정보: 5:134-141.). 그러나, COS나 NACOS는 대체로 분자량이 2,000 이하로서 단독으로는 항체생산을 유도할 수 없으므로, 이들을 운반 단백질(carrier protein)과 공유결합 시킨 것을 면역원으로 사용하였다. 항COS6항체의 생산은 Stowell 등(Stowell, C. P. and Y. C. Lee. 1981. Neoglycoproteins: the preparation and application of synthetic glycoprotein. Adv. carbohydr. chem. biochem. 37: 225-281.), Longren 등(Longren, J., I. J. Goldstein, and J. E. Neiderhuber. 1976. Aldonate coupling, a simple procedure for the preparation of carbohydrate-protein conjugates for studies of carbohydrate-binding proteins. Arch. Biochem. Biophys. 175: 661-669.)과 Kim 등(Kim, S. Y., D. H. Shon, and K. H. Lee. 2000. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of chitooligosaccharides. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 696-701.)의 연구방법을 응용하여 생산하였다.
간략히 설명하면, COS6를 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보다이이미드)의 존재 하에서 BSA와 반응시킴으로써 COS6-BSA를 만들었다. 즉, 200 mg의 BSA를 2 ml의 증류수에 녹인 후, 650 mg의 COS6를 빠르게 교반하면서 첨가하고, 1 N HCl로 pH 4.75가 되도록 조절한 뒤, EDC용액(315 mg/ml)을 30분에 걸쳐 점적하였다. 그리고 실온에서 0.5 N HCl로 pH 4.75가 되도록 조절한 뒤, 6시간 후 pH 4.75를 확인하고, 72시간 후 증류수에 대하여 투석하였다. 투석을 마친 후 냉동 건조하여 면역원으로 사용하였다.
항NACOS6 항체의 생산은 NACOS6를 합텐으로 하고 카르보닐다이이미다졸(CDI)를 cross-linker로 사용하여 운반 단백질(BSA)에 결합시킴으로써 면역원으로 제조하였다. CDI는 메틸설폭사이드, 무수하에서 NACOS6의 하이드록시기와 반응하여 중간체를 만든 다음, 운반 단백질의 아민기와 결합시켜 아마이드결합을 형성시켰다. 즉, 25 mg의 NACOS6와 25 mg의 CDI를 150 ㎕ 메틸설폭사이드안하이드로스에 2시간 실온에서 점적하였고 0.01 M 소디움카르보네이트버퍼 (pH 9.0) 1 ml에 20 mg의 BSA녹인 후 점적한 용액 100 ㎕를 혼합하여 투석하였다.
2 Horseradish peroxidase conjugate의 제조
직접경합 ELISA에 사용하기 위한 COS6-HRP 결합체를 준비하고자 1 mg periodate activated HRP을 0.2 M 소디움카르보네이트버퍼를 이용하여 pH 9.0로 보정한 1 mL에, 0.5 mg의 COS6을 첨가하여 2시간 반응시킨 다음, 여기에 100 ㎕의 환원제용액(0.1 M NaBH4)을 첨가하여 4℃에서 2시간 처리하였다. 여기에 PBS에 투석한 뒤 Sephadex G-25 (25×1.5 cm)컬럼으로 결합체를 정제 회수하여 냉장하면서 사용하였다. NACOS6-HRP 결합체는 25 mg의 NACOS6와 25 mg의 카르보닐다이이미다졸(CDI)를 150 ㎕ 메틸설폭사이드안하이드로스에 2시간 실온에서 점적하였고 1 ml 소드움카르보네이트버퍼에 20 mg의 BSA녹인 후 점적한 용액 25 ㎕를 준비하여, 0.01 M 소디움카르보네이트버퍼 (pH 9.0) 1 ml에 HRP 50 mg을 녹인 용액과 혼합 후, 4℃에서 24시간 방치하였다. 이후 PBS에 대하여 투석한 뒤부터는 위와 동일하게 하였다.
3. SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)의 실시
Separating 겔의 농도는 폴리아크릴아미드 8%와 stacking gel 5%를 사용하였다. SDS-PAGE에 의한 단백질의 분자량 측정을 위해 표준 분자량 marker(myosin, 200 kDa; a-galactosidase, 116.2 kDa; phosphorylase b, 97.4 kDa; albumin, 66.2 kDa; ovalbumin)를 이용하였다. Loading 양은 단백질량을 기준하여 BSA와 NACOS6-BSA 그리고 COS6-BSA가 각각 0.5 ug으로 하였으며, 전기영동은 100 V, 12 mA에서 1시간 동안 수행되었고, 전기영동 후 단백질 염색은 Coomassie brilliant blue R-250(CB)로 염색하였다.
4. 특이항체의 생산
COS와 NACOS에 대한 다클론 특이항체(polyclonal antibody)의 생산을 위하여 위에서 준비한 단백질을 PBS에 용해하여 면역하였다. 즉, COS6-BSA와 NACOS6-BSA의 2종을 각기 3마리씩의 토끼에 1회분의 면역원을 500 ug으로 하여 PBS에 용해시킨 후, Freund's complete adjuvant와 1:1로 혼합하고 유제(emulsion)를 만들었다. 그 다음, 이를 3마리 토끼의 뒷다리 발바닥에 각각 1 ml(0.5 mg/head)씩 피하주사를 하여 1차 면역을 실시하였다. 2차부터 4차까지의 추가면역은 2주 간격(첫 면역 후 3, 5, 7주)으로 실시하였으며, Freund's incomplete adjuvant를 이용하여 유제를 제조한 다음, 1 ml(0.5 mg/head)씩 토끼의 등이나 대퇴부에 나누어 피하주사 하였다. 면역 후 각각 1주일 후에 토끼의 귀정맥으로부터 마리 당 80 ml 가량씩 채혈하였다. 채혈 후 1시간 가량 실온에 방치하여 혈액을 응고시키고, 2시간 동안 냉장에서 방치한 다음, 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 항혈청을 분리하여 sodium azide(NaN3)를 0.02% 수준으로 첨가하여 실험 전까지 냉동보관 하였다.
5. 간접 비경합 ELISA(non-competitive indirect Enzyme-linked immunosorbent assay)
항체가 측정을 위해 다음과 같이 간접 비경합 ELISA를 실시하였다. 코팅버퍼에 용해시킨 면역원(2 ㎍/ml)을 microplate에 각 well 당 100 ㎕씩 분주하여 4℃의 냉장고에서 하룻밤 정치하였다. 코팅된 microplate를 워싱버퍼 150 ㎕로 3회 세척한 후, 생산된 두 종류의 항혈청은 1% BSA가 첨가된 PBST에 1/10,000로 희석한 다음, 각 well 당 100 ㎕씩 첨가한 후, 1 시간 동안 상온에서 항원-항체반응을 시켰다. 다시 워싱버퍼로 3회 세척한 후, 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate를 1/10,000로 PBST에 희석하여 well 당 100 ㎕를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 다음, well 당 100 ㎕의 기질 용액으로 상온에서 30분 동안 발색시킨 후, 2 M H2SO4를 50 ㎕씩 각 well에 넣어 발색 반응을 중지시켰다. 발색정도는 microplate reader로 흡광도(450 nm)를 측정하였다. 각 시료 당 3개씩의 well를 사용하여 얻은 흡광도의 평균값으로 분석하였다.
6. 직접 경합 ELISA (competitive direct ELISA, cdELISA)
시료 중 COS 및 NACOS의 농도 측정을 하기 위해 확립한 직접 경합 ELISA의 과정은 다음과 같다. 즉, 포획 단백질(capture protein)로 protein A/G (2 ㎍/ml)을 코팅버퍼에 용해시켜 microplate에 각 well 당 100 ㎕씩 분주하여 4℃의 냉장고에서 하룻밤 정치하고, 코팅된 microplate를 워싱버퍼 150 ㎕로 3회 세척하였다. PBST에 1/5,000로 희석된 항혈청을 well에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 처리 후, COS6-HRP 결합체(또는 NACOS6-HRP 결합체)와 COS6 (또는 NACOS6) 용액을 1:1로 혼합한 것을 각 well에 100 ㎕씩 넣었다. 상온에서 1시간 동안 처리 후 3회 세척한 다음, 기질용액 100 ㎕씩을 넣고 상온에서 1시간 처리후 흡광도를 측정하였다.
cdELISA의 교차 반응률은 사용한 표준 물질에 대한 항체의 결합 정도가 50%되는 농도(IC50)를 시험한 물질의 IC50으로 나눈 값으로 구하였다.
III. 실험결과 및 고찰
1. 면역원의 제조
기존 COS 분석으로 사용한 특이항체는 COSM을 합텐으로 하여 생산하였으며, COS의 분석은 용이하였지만 NACOS의 분석은 어려웠다. 따라서, 본 연구는 COS와 NACOS의 분석을 할 수 있는 특이항체를 모두 생산하고자 2종류의 면역원을 준비하였다.
즉, 2종류의 합텐인 COS6 및 NACOS6를 BSA에 공유결합시켜, 각각의 결합체들을 준비하였으며, 이들에 대한 SDS-PAGE를 실시하였다.
도 1은 COS6-BSA, NACOS6-BSA의 SDS-PAGE 패턴을 나타내는 도면이다.
도면에서, 1번 레인, 분자량 마커; 2번 레인, 소혈청알부민(BSA); 3번 레인, NACOS6-BSA 결합체; 4번 레인, COS6-BSA 결합체이다.
도 1에 나타난 바와 같이, COS6-BSA는 분자량이 66 kDa에서 200 kDa까지 넓게 끌렸다. 이러한 사실로부터 COS6의 결합으로 인하여 BSA의 분자량이 커진 것을 알 수 있었고, NACOS6-BSA는 BSA부근의 위쪽 밴드를 강하게 나타내었으나 NACOS6와 BSA가 균일하게 결합되었음을 확인할 수 있었다. 또한 BSA와 BSA간에 결합은 적었다.
2. 항혈청의 생산
여기서 준비된 COS6-BSA와 NACOS6-BSA를 각각 세 마리의 토끼에 면역하여 항혈청을 생산하였고, 특이항체의 역가(항체가)를 비경합 간접 ELISA로 비교하였다.
그 결과, COS6-BSA를 면역한 경우, 3 마리 토끼가 모두 비슷한 경향을 보였는데, 2차 면역 후 항체가는 1차 면역의 2배 이상의 역가를 나타냈으며, 2차 면역 후에는 비교적 큰 변화가 없는 것으로 나타났다.(도 2 참조)
NACOS6-BSA를 면역한 경우, 세마리 토끼 모두 대체로 양호한 항체가가 생성되었음을 확인할 수 있었는데, 특히, normal rabbit serum(NRS)에 비해 2차 면역 후에 점차 증가하기 시작하여 3차와 4차 면역 후에 최대치를 나타냈다.(도 3 참조)
3. cdELISA확립
앞서 생산한 2종의 특이항체를 이용하여 cdELISA의 조건을 확립하였다. 다만, 본 연구에서는 실험방법에서 설명한 바와 같이, protein A/G를 microplate에 코팅한 다음 특이항체를 고정(capture)하는 방식의 cdELISA를 행하였다. Protein A/G로 코팅한 후 특이항체를 고정하는 방식은 굳이 항혈청을 정제하지 않고도 항체가 정제가 되는 효과를 가져옴으로써, 결과적으로 항체의 불순물을 제거하기 때문에 분석에 용이하였다. 또한 2종류의 항체에 모두 적용이 가능한 장점이 있었다. 그리하여 각각의 특이항체를 사용한 cdELISA의 표준곡선은 작성하였다. 이때, 항COS6 항체는 COS6의 농도를 달리하였고, 항NACOS6 항체의 경우는 NACOS6의 농도를 달리하였다. 항COS6 항체의 검출한계는 2 ng/ml이고, 항NACOS6 항체의 검출한계는 0.2 ng/ml로 나타났다. 이는 항NACOS6 항체가 항COS6 항체의 검출한계보다 10배 정도의 감도가 우수하다는 것을 알 수 있었다.
4. 교차반응
특이항체들의 올리고머의 중합도에 따른 표준곡선으로부터 교차반응성을 조사하였다. 이때 사용한 올리고머들은 GlcN, COS2∼COS6, COSM의 키토올리고사카라이드와 GlcNAc, NACOS2∼NACOS6의 N-아세틸키토올리고사카라이드에 대한 특이항체의 교차반응을 cdELISA로 검토하였다.
먼저, 항COS6 항체의 경우 특성을 조사하기 위하여, COS6를 기준으로 하여 COS와 NACOS에 대한 교차반응을 ㎍/ml 단위로 나타낸 결과, COS2, COS3, COS4, COS5, COS6, COSM은 항COS6 항체에 대한 COS6-HRP 결합체의 결합을 저해하였으며 각각의 IC50값 (0.40, 0.16, 0.08, 0.09, 0.06, 0.10 ㎍/ml)으로부터 그 교차반응율은 13.8, 34.4, 68.8, 61.1, 100, 55.6%로 나타났다(도 4 및 하기 표 1 참조)
| Oligosaccharides | Oligosaccharides displacing 50% COS6-HRP (㎍/ml) | Cross-reactivitya (%) |
| GlcNCOS2COS3COS4COS5COS6COSM | 540.400.160.080.090.060.10 | 0.1013.834.468.861.110055.6 |
| GlcNAcNACOS2NACOS3NACOS4NACOS5NACOS6 | 33068984715685 | 0.020.090.060.130.040.07 |
a Conc. of COS6 displacing 50% of COS6-HRP
------------------------------------------------------ x 100
Conc. of oligosaccharides displacing 50% of COS6-HRP
여기에서 COS는 중합도가 커질수록 교차반응율이 높아짐을 알 수 있었다. 그러나, 항COS6 항체의 NACOS에 대한 반응성은 0.13% 이하로 매우 낮게 나타났으며, 대체로 NACOS의 중합도가 짝수인 경우는 높게 나타났으며, 홀수인 경우는 낮게 나타나는 경향을 보였다.
다음으로 항NACOS6 항체는 NACOS6를 기준으로 하여 각각의 COS와 NACOS에 대한 교차반응을 ㎍/ml 단위로 나타낸 결과, NACOS3, NACOS4, NACOS5, 그리고 NACOS6는 항체에 대한 NACOS6-HRP 결합체의 결합을 저해하였으며, 각각의 IC50값 (0.039, 0.0064, 0.0085, 그리고 0.0099 ㎍/ml)으로부터 그 교차반응율은 25.4, 155, 116, 그리고 100 %로 나타났다 (도 5, 하기 표 2 참조).
| Oligosaccharides | Oligosaccharides displacing 50% NACOS6-HRP (㎍/ml) | Cross-reactivitya (%) |
| GlcNCOS2COS3COS4COS5COS6COSM | N.D.b N.D.b 2350323712.5 | 0.000.000.030.010.020.020.05 |
| GlcNAcNACOS2NACOS3NACOS4NACOS5NACOS6 | N.D.b 4.70.0390.00640.00850.0099 | 0.000.2125.4155116100 |
a Conc. of NACOS6 displacing 50% of NACOS6-HRP
------------------------------------------------------ x 100
Conc. of oligosaccharides displacing 50% of NACOS6-HRP
b Not determiable
특히, NACOS4와 NACOS5가 NACOS6보다 교차율이 높게 나타났다. 그리고 다른 COS의 경우는 교차반응이 0.05% 이하로 거의 반응성을 보이지 않았다. 항NACOS6 항체는 항COS6 항체와 달리 COS에 대한 종합적인 교차반응은 상당히 낮아 실제 COS의 검출에 영향을 미치지 못할 것이다.
본 연구에 생산한 2종 항체의 특성을 종합하면, 첫째, 항COS6 항체의 경우 합텐으로 사용한 COS6의 모노머(GlcN)를 조금 인식하였지만, 항NACOS6 항체는 합텐으로 사용한 NACOS6의 모노머(NAGlcN)를 전혀 인식하지 못하였다. 둘째, 항COS6 항체는 합텐으로 사용한 COS6의 다이머(COS2) 이상을 잘 인식하는데 반하여, 항NACOS6 항체는 합텐으로 사용한 NACOS6의 다이머(NACOS2)는 잘 인식하지 못하고 트리머(NACOS3∼NACOS6) 이상은 잘 인식하였다. 셋째, 항COS6 항체의 COS에 대한 반응성은 그 중합도가 커질수록 반응성이 높아져, COS2 < COS3< COS4 < COS5 < COS6 순이었다. 반면에, 항NACOS6 항체의 경우는 NACOS에 대한 반응성은 중합도 (NACOS4∼NACOS6)가 커질수록 대체적으로 낮아져, NACOS4 > NACOS5 > NACOS6 (> NACOS3 > NACOS2) 순으로 나타났다. 이로서 본 연구에 생산한 특이항체을 이용한 cdELISA로 식품중의 COS 및 NACOS의 검출이 가능할 것으로 생각된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 1). COS6-BSA 결합체 및 NACOS6-BSA 결합체를 제조하고 이를 실험동물에 면역하여 각기 특이항체를 생산하고, 2). 이들 특이항체와 COS6-HRP 결합체 및 NACOS6-HRP 결합체를 이용한 직접경합 ELISA(cdELISA)의 조건을 확립하였으며, 그 검출한계는 각각 2 ng/ml 및 0.2 ng.ml로 나타나, 검출감도가 양호하였으며, 3). 항COS6 항체는 COS(1∼6mer 및 COSM)에 대한 반응성이 우수하나, NACOS(1∼6mer)에 대한 교차반응성은 매우 낮아 COS에 대한 특이성이 우수하였으며, 4). 이와는 대조적으로 항NACOS6 항체는 NACOS(1∼6mer)에 대한 반응성이 우수하나, COS(1∼6mer 및 COSM)에 대한 교차반응성은 매우 낮아 NACOS에 대한 특이성이 우수하였으며, 5). 본 발명에서 확립한 cdELISA에 의한 COS 및 NACOS 분석법은 키틴, 키토산유래의 올리고당 소재나 이들을 함유하고 있는 식품의 분석 및 검출키트의 개발에도 활용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 COS6-BSA, NACOS6-BSA의 SDS-PAGE 패턴을 나타내는 도면
도 2는 준비된 COS6-BSA를 각각 세 마리의 토끼에 면역하여 항혈청을 생산하고, 특이항체의 역가(항체가)를 비경합 간접 ELISA로 비교한 그래프
도 3은 준비된 NACOS6-BSA를 각각 세 마리의 토끼에 면역하여 항혈청을 생산하고, 특이항체의 역가 (항체가)를 비경합 간접 ELISA로 비교한 그래프
도 4A,B는 직접경합 ELISA에 의한 항COS6 항체의 교차반응성을 나타낸 그래프
도 5A,B는 직접경합 ELISA에 의한 항NACOS6 항체의 교차반응성을 나타낸 그래프
Claims (5)
- 중합도6인 키토산올리고당(COS6)를 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)과 함께 수용성 카르보다이이미드(water soluble carbodiimide, WSC) 방법으로 결합체를 형성시킨 후, 면역보강체(adjuvant)와 유제(emulsion)를 만들어 실험동물용 토끼에 면역함으로써, 혈청 중 COS에 대한 특이성이 우수한 항체를 생산함을 특징으로 하는 항COS 항체(anti-COS antibody) 생산방법
- 중합도6인 키틴올리고당(NACOS6)를 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)과 함께 카르보닐다이이미다졸(carbonyldiimidazole, CDI) 방법으로 결합체를 형성시킨 후, 면역보강체(adjuvant)와 유제(emulsion)를 만들어 실험동물용 토끼에 면역함으로써, 혈청 중 NACOS에 대한 특이성이 우수한 항체를 생산함을 특징으로 하는 항NACOS 항체(anti-NACOS antibody) 생산방법
- 제 1항과의 특이항체인 항COS 항체(anti-COS antibody)와 COS6-horseradish peroxidase(HRP)를 이용하여 COS를 정밀하게 분석하는 것을 특징으로 하는 직접경합 효소면역측정법(competitive direct ELISA, cdELISA)
- 제 2항과의 특이항체인 항NACOS 항체(anti-NACOS antibody)와 NACOS6-horseradish peroxidase(HRP)를 이용하여 NACOS를 정밀하게 분석하는 것을 특징으로 하는 직접경합 효소면역측정법(competitive direct ELISA, cdELISA)
- 제 3항의 COS 분석법과 제 4항의 NACOS 분석법으로 구성됨을 특징으로 하는 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 종합적인 분석을 위한 효소면역측정법의 분석시스템
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| KR1020040021892A KR20050096499A (ko) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법 |
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| KR1020040021892A KR20050096499A (ko) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | 키토산올리고당 및 키틴올리고당의 효소면역측정법 |
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|---|---|---|---|---|
| CN111374987A (zh) * | 2020-02-29 | 2020-07-07 | 湖北工业大学 | 一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法 |
| WO2021151180A3 (pt) * | 2020-01-31 | 2021-10-28 | Fundação Oswaldo Cruz | Anticorpo, seu uso, composição farmacêutica o compreendendo, método de diagnóstico de infecções fúngicas, kit de diagnóstico de infecções fúngicas e método para tratamento de infecções fúngicas |
| WO2023120903A1 (ko) * | 2021-12-23 | 2023-06-29 | 주식회사 에스엠엘제니트리 | 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법 |
-
2004
- 2004-03-31 KR KR1020040021892A patent/KR20050096499A/ko not_active Ceased
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