KR20050060079A

KR20050060079A - 비타민 ｃ의 생성 방법

Info

Publication number: KR20050060079A
Application number: KR1020057005261A
Authority: KR
Inventors: 다쓰오 호시노; 다로 미야자키; 데루히데 스기사와
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2005-06-21
Anticipated expiration: 2023-09-22
Also published as: US20060121582A1; AU2003280338A1; CN100347309C; JP2006500051A; CN1685050A; US7544494B2; JP4566000B2; KR101031451B1; WO2004029269A1; EP1543137A1

Abstract

본 발명은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) DSM 4025 (FERM BP-3812)로부터 단리된 알데하이드 탈수소 효소를 사용하여 L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시키는 방법에 관한 것인데 상기 효소는 하기의 물리화학적 물성을 갖는다: (a) 150,000 ± 6,000 Da 또는 230,000 ± 9,000 Da (2 또는 3개의 상동성 아단위로 구성되고, 각각의 아단위는 75,000 ± 3,000 Da의 분자량을 갖는다)의 분자량; (b) 알데하이드 화합물에서 활성인 기질 특이성; (c) 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴(heme) c인 보조인자; (d) L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시킴에 있어서 6.4 내지 8.2의 최적 pH; 및 (e) 억제제로서 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌다이아민 테트라아세트산. 본 방법은 적합한 전자 수용체의 존재 하에서 수행되고 비타민 C는 반응 혼합물로부터 단리된다.

Description

비타민 Ｃ의 생성 방법{PROCESS FOR PRODUCING VITAMIN C}

본 발명은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) DSM 4025 (FERM BP-3812)의 무세포 추출물로부터 정제된 알데하이드 탈수소 효소, 즉 L-소르보손 탈수소 효소를 이용하여 L-소르보손으로부터 L-아스코브산(비타민 C)을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

상기 효소는 유럽 특허 공개 제 0 922 759 호(A2)에 개시되어 있고 L-소르보손의 2-케토-L-굴론산(2-KGA)으로의 산화 반응을 촉매작용한다.

비타민 C는 인류에게 매우 중요하고 필수적인 영양 요소이다. 비타민 C는 "라이히스타인(Reichstein) 방법"에 의해 산업적으로 합성된다. D-글루코손 및 L-소르보손은 콩 및 시금치의 비타민 C 생합성의 추정 중간체이고, L-소르보손의 비타민 C로의 산화 반응을 촉매작용하는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 인산(NADP)-의존 효소는 부분적으로 정제된다. 그러나, 세균 공급원으로부터 생성되는 효소의 사용에 의한 L-소르보손으로부터 비타민 C로의 전환에 대한 보고는 없었다. 놀랍게도 이 효소가 L-소르보손을 2-KGA로 뿐만 아니라 특정 반응 하에서 비타민 C로 전환할 수 있다는 것이 발견되었다.

본 발명은 전자 수용체의 존재 하에서 L-소르보손을 하기의 물리화학적 물성을 갖는 정제된 L-소르보손 탈수소 효소와 접촉시키고 반응 혼합물로부터 생성된 비타민 C를 단리시킴을 포함하는 L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시키는 방법을 제공한다:

(a) 분자량: 150,000 ± 6,000 Da 또는 230,000 ± 9,000 Da (2 또는 3개의 상동성 아단위(subunit)로 구성되고, 각각의 아단위는 75,000 ± 3,000 Da의 분자량을 갖는다);

(b) 기질 특이성: 알데하이드 화합물에서 활성;

(c) 보조인자: 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴(heme) c;

(d) 최적 pH: L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시킴에 있어서 6.4 내지 8.2; 및 (e) 억제제: Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌다이아민 테트라아세트산.

본 발명의 목적에 있어서, 용어 "정제된"은 또한 자연적 환경으로부터 단리되는 것도 포함한다.

전자 수용체의 존재 하에서 L-소르보손의 비타민 C로의 산화는 하기의 반응식에 따라 일어난다.

효소는 전자 수용체로서 산소와 함께 작용하지 않는다. 더욱이, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD) 및 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 인산(NADP)은 적합한 전자 수용체가 아니다. 그러나, 다른 통상적인 전자 수용체가 본 발명의 방법과 결합되어 사용될 수 있다. 2,6-다이클로로페놀린도페놀(DCIP), 페나진 메토설페이트(PMS), 페리시아나이드 및 시토크롬 c가 바람직한 전자 수용체이다.

효소 분석은 하기와 같이 수행될 수 있다:

a) L-소르보손 탈수소 효소 활성의 생성물(비타민 C) 분석

물과의 최종 부피 100 μl 중에 1.0 mM PMS, 25 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0), 1.0 μM 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ), 1.0 mM CaCl₂, 50 mM L-소르보손 및 효소 용액으로 구성되는 반응 혼합물이 분석 직전 제조된다. 달리 언급되지 않으면 반응은 30℃에서 60 분 동안 수행된다. 생성된 비타민 C의 양은 264 nm의 파장에서 UV 검출기(TOSOH UV8000; 일본 도쿄도 주오쿠 교바시 3-2-4 소재의 토소사(TOSOH Co.)), 이중 펌프(TOSOH CCPE; 토소사), 적산기(Shimadzu C-R6A; 일본 교토시 주쿄쿠 니시노쿄 구와하라초 1 소재의 시마츠사(Shimadzu Co.)) 및 칼럼(YMC-Pack polyamide-II; 미국 노쓰캐롤라이나주 28403 윌밍톤 번트 밀 드라이브 3233 소재의 YMC사(YMC, Inc.))이 부착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정되었다. 생성된 2-KGA의 양은 HPLC에 의해 측정된다. 효소 활성 1 단위는 반응 혼합물 중에서 60 분내에 1 mg의 비타민 C 또는 2-KGA를 생성시키는 효소의 양으로서 정의된다.

b) L-소르보손 탈수소 효소 활성의 광도 측정 분석

물과의 최종 부피 100 μl 중에 0.1 mM DCIP, 1.0 mM PMS, 25 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0), 1.0 μM PQQ, 2.0 mM L-소르보손 및 효소 용액으로 구성되는 반응 혼합물이 분석 직전 제조된다. 반응은 L-소르보손과 25℃에서 시작되고, 효소 활성은 600 nm에서 DCIP의 초기 환원 속도로서 측정된다. 효소 활성 1 단위는 분 당 1 μM DCIP의 환원을 촉매작용하는 효소의 양으로서 정의된다. pH 7.0에서의 DCIP의 소멸 계수는 14.2 mM^-1로서 정해진다. 참조 큐벳(cuvette)은 L-소르보손을 제외한 상기 모든 구성 성분을 함유한다.

본 발명의 L-소르보손 탈수소 효소는 유럽 특허 공개 제 0 922 759 호(A2)에 기술된 방법에 따라 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)의 무세포 추출물로부터 단리될 수 있다.

따라서, 본 발명은 L-소르보손 탈수소 효소가 균주 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812), 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)와 동일한 특성을 갖는 글루코노박터 속에 속하는 미생물 또는 이들의 돌연변이체로부터 유도되는 상기의 L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시키는 방법을 제공한다.

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025는 부다페스트 조약의 조항에 기초하여 독일 괴팅겐(Gottigen)에 소재하는 독일 미생물 및 세포배양 도서관 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 DSM 번호 제 4025 호로서 1987년 3월 17일자로 기탁되었다. 기탁자는 중국 북경시 산리헤길 52 중국과학원 내 미생물학 연구소의 동양 과학 기구 수출입 회사(Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute of Microbiology)였다. 실제 기탁자는 상기 연구소로 완전한 주소는 중국 100080 북경시 총구안쿤 하이디안 중국 과학원 미생물학 연구소이다.

균주의 계대배양물 또한 일본 305-8566 이바라키 쓰쿠바 히가시 1-1-1 쓰쿠바 센트럴 6 소재의 국립 고등 산업과학 및 기술 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST)에 역시 부다페스트 조약의 조항에 따라 기탁 번호 FERM BP-3812로 1992년 3월 30일자로 기탁되었다. 기탁자는 일본 105-8532 도쿄도 미나토쿠 시바 2초메 6-1 소재의 일본 로슈사(Nippon Roche K.K.)이다. 이 계대배양물은 또한 본 발명에서 가장 바람직하게 사용된다.

효소는 미생물, 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)의 배양 후에 하기와 같이 단리되고 정제될 수 있다:

(1) 세포를 원심 분리 또는 여과에 의해 액체 배양액으로부터 수확한다.

(2) 수확된 세포를 물, 생리 식염수 또는 적당한 pH를 갖는 완충 용액으로 세척한다.

(3) 세척된 세포를 완충 용액 중에 현탁하고, 균질화기, 초음파기 또는 프랑스 압착기(French press)에 의해 또는 리소자임 등에 의한 처리에 의해 파괴하여 파괴된 세포 용액을 수득한다.

(4) 상기 효소를 파괴된 세포의 무세포 추출물로부터, 바람직하게는 미생물의 시토졸 분획으로부터 단리하고 정제한다.

본 발명에 의해 제공된 방법에 적용된 효소는 L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성하는데 촉매로서 유용하다. 반응은 약 6.4 내지 9.0의 pH 범위와 약 20℃ 내지 약 60℃의 온도 범위에서 약 0.5 내지 48 시간 동안 전자 수용체, 예를 들면 DCIP, PMS 등의 존재 하에서 용매, 예컨대 인산염 완충액, 트리스-완충액 등에서 수행될 수 있다. 약 7.0 내지 8.2의 pH 범위, 약 20℃ 내지 50℃의 온도 범위, 약 0.5 내지 24 시간의 반응시간이 L-소르보손이 효율적으로 비타민 C로 전환되는 조건이다.

따라서, 본 발명의 방법에 있어서 반응은 약 6.4 내지 약 9.0의 pH 및 약 20℃ 내지 약 60℃의 온도에서 약 0.5 내지 약 48 시간 동안 수행된다. 바람직한 반응은 약 7.0 내지 약 8.2의 pH 및 약 20℃ 내지 50℃의 온도에서 약 0.5 내지 약 24 시간 동안 수행된다.

반응 혼합물 중의 L-소르보손의 농도는 다른 반응 조건에 따라 변할 수 있지만 일반적으로 약 0.5 내지 50 g/L, 바람직하게는 약 1 내지 약 30 g/L이다.

본 발명에 따르면 촉매 반응은 물 중에서 또는 수성 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이러한 용매 중 임의의 하나 및 물의 혼합물 중에서 수행되지만, 경제 및 손쉬운 취급의 관점에서 물이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서 효소는 적당한 운반체와 함께 고정화된 상태로 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 당업계에 알려진 효소를 고정화하는 임의의 수단이 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 작용기를 갖는 막, 과립 또는 수지류에 직접 결합될 수 있거나 또는 하나 이상의 작용기를 갖는 가교 화합물, 예를 들면 글루타르알데하이드를 통해 수지에 결합될 수 있다.

반응 혼합물 중에 생성된 비타민 C는 당업계에 알려진 통상적 방법에 의해 단리될 수 있고, 염, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 등으로서 분리될 수 있다. 이 염은 당업계에 알려진 통상적 방법에 의해 자유산으로 전환될 수 있다. 구체적으로, 분리는 하기 단계의 임의의 적합한 조합 또는 반복에 의해 수행될 수 있다: 생성물과 주변 불순물 사이의 물성의 차이(예컨대 용해도, 흡수도 및 용매 사이의 분배 계수)를 사용한 염의 형성; 및 흡수(예를 들면 이온 교환 수지 등의 상에서). 임의의 이러한 절차의 단독 또는 조합이 생성물을 단리하는 편리한 수단을 구성한다. 따라서 얻어지는 생성물은 통상의 방법, 예를 들면 재결정 또는 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 추가적으로 설명한다.

실시예 1: L-소르보손 탈수소 효소의 제조

모든 조작을 8℃에서 수행하였고, 달리 언급되지 않으면 완충액은 0.05 M 인산 칼륨(pH 7.0)이었다.

(1) 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)의 배양:

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)를 5.0% D-마니톨, 0.25% MgSO₄ㆍ7H₂O, 1.75% 옥수수 침지수 농축물, 5.0% 빵효모, 0.5% 우레아, 0.5% CaCO₃ 및 2.0% 한천을 함유하는 한천 접시 상에서 27℃에서 4 일 동안 배양하였다. 한 루프의 세포를 500 ml 용량의 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중의 2% L-소르보스, 0.2% 효모 추출물, 0.05% 글리세롤, 0.25% MgSO₄ㆍ7H₂O, 1.75% 옥수수 침지수 농축물, 0.5% 우레아 및 1.5% CaCO₃를 함유하는 50 ml 종자 배양 배지 속으로 주입하고, 30℃에서 1800 rpm으로 하루 동안 회전 진탕기(rotary shaker)에서 배양하였다.

종자 배양액(10 ml)을 100 ml의 동일한 종자 배양 배지를 함유하는 500 ml 용량의 에를렌마이어 플라스크로 옮기고 상기와 동일한 방법으로 배양하였다. 따라서, 제조된 종자 배양액을 15 L(리터)의 배지의 주입에 사용하는데, 배지는 30 L 용량의 발효조(jar fermenter)에 8.0% L-소르보스, 0.05% 글리세롤, 0.25% MgSO₄ㆍ7H₂O, 3.0% 옥수수 침지수 농축물, 0.4% 효모 추출물 및 0.15% 소포제를 함유하였다. 발효 변수는 800 rpm의 교반 속도와 30℃의 온도에서 0.5 vvm(공기부피/배지부피/분)의 통기였다. 발효 동안 수산화나트륨으로 pH를 7.0으로 유지하였다. 48 시간의 배양 후에 2 세트의 발효조를 사용하여 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812) 세포를 함유하는 30 L 배양액을 연속 원심분리에 의해 수확하였다. 세포를 함유하는 펠릿(pellet)을 회수하고 적당한 부피의 식염수에 현탁하였다.

현탁액을 2,500 rpm(1,000 x g)에서 원심분리한 후에, 배지의 성분인 옥수수 침지수 농축물 및 효모 추출물로부터 유도된 불용성 물질을 제거하기 위해 세포를 함유하는 상청액을 회수하였다. 이어서, 상청액을 8,000 rpm(10,000 x g)에서 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 결과로서 30 L의 배양액으로부터 123 g의 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812) 세포(습윤중량)를 얻었다.

(2) 시토졸 분획의 제조:

세포 펠릿(64.2 g)을 280 ml 완충액으로 현탁하고, 프랑스 압력 세포 압착기를 지나도록 통과시켰다. 손상되지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 후에 상청액을 무세포 추출물로서 지정하고, 무세포 추출물을 100,000 x g에서 60 분간 원심분리하였다. 얻어진 상청액(227 ml)을 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)의 가용 분획으로 지정하였다. 이 분획을 완충액에 대해 투석한 후에, 0.107 단위/mg단백질의 고유 활성을 갖는 150 ml의 투석된 분획을 다음 정제 단계에 사용하였다.

(3) 다이에틸아미노에틸(DEAE)-셀룰로오스 칼럼 크로마토그래피:

투석물(150 ml)을 평형화된 DEAE-셀룰로오스 칼럼(와트만(Whatman) DE-52, 3 x 50 cm)을 지나도록 한 후, 완충액으로 세척하여 부(minor) 단백질을 용출하였다. 다음, 수지에 결합된 단백질을 완충액 중의 0.28, 0.32, 0.36 M NaCl로 단계적으로 용출하였다. 주(major) 효소 활성은 0.36 M NaCl에서 용출되었다. 활성 분획(143 ml)을 수집하였다.

(4) 카복시메틸-셀룰로오스 칼럼 크로마토그래피:

이전 단계의 활성 분획의 일부(127 ml)를 한외 여과기(센트리프렙(Centriprep)-10, 아미콘(Amicon))로 여과하여 농축하였다. 농축된 시료(28 ml)를 완충액에 대하여 투석한 후, 투석된 분획(31 ml) 중 28 ml를 완충액으로 평형화된 카복시메틸-셀룰로오스 칼럼(와트만 CM-52, 3 x 23 cm)을 지나도록 하였다. 수지에 결합되지 않고 칼럼을 통과한 단백질을 수집하였다.

(5) Q-세파로즈 칼럼 크로마토그래피(#1):

모아진 활성 분획(43 ml)을 한외 여과기(센트리프렙-10)로 농축하였다. 이전 단계의 농축된 분획(10 ml)의 일부(9.5 ml)를 완충액으로 평형화된 Q-세파로즈 칼럼(파마시아(Pharmacia), 1.5 x 50 cm)을 지나도록 하였다. 0.3 M NaCl을 함유하는 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 0.3 내지 0.6 M의 선형 구배의 NaCl을 완충액에 첨가하였다. 활성 분획이 0.55 내지 0.57 M 범위의 NaCl 농도에서 용출되었다.

(6) Q-세파로즈 칼럼 크로마토그래피(#2):

이전 단계의 모아진 활성 분획(22 ml)을 한외 여과기(센트리프렙-10)로 농축하였다. 농축액(3.0 ml)을 완충액에 대하여 투석하였다. 투석된 시료(3.5 ml)를 완충액으로 평형화된 Q-세파로즈 칼럼(파마시아, 1.5 x 50 cm)을 지나도록 하였다. 0.35 M NaCl을 함유하는 완충액으로 칼럼을 세척한 후 0.35 내지 0.7 M의 선형 구배의 NaCl을 완충액에 첨가하였다. 활성 분획이 0.51 내지 0.53 M 범위의 NaCl 농도에서 용출되었다.

(7) 겔 여과(세파크릴(Sephacryl) S-300 고해상도) 칼럼 크로마토그래피:

이전 단계의 모아진 활성 분획(20 ml)을 한외 여과기(센트리프렙-10)로 농축하였다. 농축되고 탈염된(0.1 M NaCl 미만) 시료(2.0 ml)의 1.5 ml 부분을 0.1 M NaCl을 함유한 완충액으로 평형화된 세파크릴 S-300 고해상도 칼럼(파마시아, 1.5 x 120 cm)을 지나도록 하였다. 활성 분획(12 ml)을 수집하고 완충액에 대하여 투석하였다.

(8) 소수성 칼럼(리소스(RESOURCE) ISO) 크로마토그래피:

이전 단계의 투석된 활성 분획을 한외 여과기(센트리프렙-10)로 농축하였다. 농축된 시료(1.75 ml)의 일부(1.5 ml)를 3M 황산 암모늄을 함유하는 동일한 부피(1.5 ml)의 완충액에 첨가하였다(최종 농도: 1.5 M). 시료의 원심분리(15,000 x g) 후에, 상청액을 1.5 M 황산 암모늄을 함유한 완충액으로 평형화된 리소스 ISO 칼럼(파마시아, 1.0 ml)을 지나도록 하였다. 1.5 M 황산 암모늄을 함유한 완충액으로 칼럼을 세척한 후에, 단백질을 1.5 내지 0.75 M의 황산 암모늄 선형 구배를 함유하는 완충액으로 용출하였다. L-소르보손 탈수소 효소에 상응하는 활성 분획은 1.12 내지 1.10 M 범위의 황산 암모늄 농도에서 용출되었다. 활성 분획을 투석 컵(투석-컵 MWCO 8000, 다이이치 순수 화학(Daiichi pure chemicals))을 사용하여 완충액에 대하여 투석하였다. 그 다음, 활성 분획을 수집하고 -20℃에서 저장하였다. 효소 정제 과정의 요약이 하기 표 1에 주어진다.

실시예 2: L-소르보손으로부터의 반응 생성물에 대한 pH 영향

다양한 100 mM 완충액 100 μl 중의 정제된 효소(0.42 μg), L-소르보손(50 mM), PMS(1 mM), CaCl₂(1 mM) 및 PQQ(1 μM)로 구성된 반응 혼합물을 1 시간 동안 30℃에서 배양하였다. 반응 생성물을 박막 크로마토그래피(실리카 겔 60F₂₅₄, 머크(MERCK)) 및 HPLC에 의해 분석하였다. 비타민 C 생성을 6.4 내지 약 8.0의 pH 범위에서 검출하였다. 반면에, 2-KGA 생성을 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 5.4 내지 약 9.0의 pH 범위에서 검출하였다.

실시예 3: 활성에 대한 온도 영향

25 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 중에 0.42 μg의 정제된 L-소르보손 탈수소 효소, 50 mM L-소르보손, 1 μM PQQ, 1 mM CaCl₂및 1 mM PMS를 함유하는 반응 혼합물을 60 분 동안 다양한 온도에서 배양하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 L-소르보손을 비타민 C 및 2-KGA로 전환하였다.

Claims

전자 수용체의 존재 하에서 L-소르보손을 하기의 물리화학적 물성을 갖는 정제된 L-소르보손 탈수소 효소와 접촉시키고 반응 혼합물로부터 생성된 비타민 C를 단리시킴을 포함하는 L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시키는 방법:

(a) 분자량: 150,000 ± 6,000 Da 또는 230,000 ± 9,000 Da (2 또는 3개의 상동성 아단위(subunit)로 구성되고 각각의 아단위는 75,000 ± 3,000 Da의 분자량을 갖는다);

(b) 기질 특이성: 알데하이드 화합물에서 활성;

(c) 보조인자: 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴(heme) c;

(d) 최적 pH: L-소르보손으로부터 비타민 C를 생성시키는 경우 6.4 내지 8.2;

(e) 억제제: Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌다이아민 테트라아세트산.
제 1 항에 있어서,

L-소르보손 탈수소 효소가 균주 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) DSM 4025 (FERM BP-3812), 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 (FERM BP-3812)와 동일한 특성을 갖는 글루코노박터 속에 속하는 미생물 또는 이들의 돌연변이체로부터 유도되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

반응이 약 6.4 내지 약 9.0의 pH 범위와 약 20℃ 내지 약 60℃의 온도 범위에서 약 0.5 내지 약 48 시간 동안 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응이 약 7.0 내지 약 8.2의 pH 범위와 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도 범위에서 약 0.5 내지 약 24 시간 동안 수행되는 방법.