KR20040081741A

KR20040081741A - 인간 배아 줄기세포 유래의 조혈세포

Info

Publication number: KR20040081741A
Application number: KR10-2004-7008756A
Authority: KR
Inventors: 바티아믹키; 매드러나스조퀸; 페르버이리스아; 마줌다르애니쉬센
Original assignee: 제론 코포레이션; 로바츠 리서치 인스티튜트
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2002-12-06
Publication date: 2004-09-22
Also published as: GB2399572B; CN102008503A; CN1630716A; CN102008503B; GB0503865D0; AU2002366603A1; CA2469483C; IL162130A; EP1463803A4; WO2003050251A2; GB2399572A; GB0414957D0; GB2412379A; EP1463803A2; WO2003050251A3; IL162130A0; EP1463803B1; KR20100120723A; US20030153082A1; GB2412379B

Abstract

본 발명은 배아 줄기세포로부터 조혈 계통의 세포를 제조하기 위한 시스템을 제공한다. 분화는 조혈 시토카인 및 본 명세서 나열된 다른 인자의 존재하에서 수행된다. 수득되는 세포 집단은, 자기-복제능을 갖는 초기 조혈 전구체의 마커인 CD45 양성 세포를 현저하게 풍부하게 한다. 분화 과정 동안 골형태형성 단백질을 포함하는 것은, 2차 콜로니를 형성하기 위한 세포 집단의 능력을 강화시킨다. 배아 줄기세포의 거대한 복제능으로 인해, 본 발명은 조혈 세포의 중용한 신규의 상업적 공급원을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기세포 유래의 조혈세포{HEMATOPOIETIC CELLS FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}

관련 출원의 참조

본 출원은 2001년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 60/338,979 의 우선권적 이익을 청구한다.

배경기술

백혈병은 잔혹한 예후를 갖는 혈액 형성 세포의 암이다. Leukemia Society of America 는 1998년에 미국에서 28,700명이 백혈병을 갖는 것으로 추정하였다. 최근 10년간, 조사(radiation) 또는 화학요법과 병용하여, 동종이계(allogeneic) 또는 자가유래 조혈 줄기세포를 이용하는 백혈병 치료에 있어 상당한 진전이 있었다. 또한, 자가유래 이식편이 말기 유방, 난소 및 전립선 암의 치료에 사용되고 있다. 현재, 줄기세포 이식은 혹독한 생명 위협 자가면역 질환에 대한 치료로서 임상평가에서 시험되고 있다.

불행하게도, 적합한 조혈 줄기세포는 이러한 병상의 치료를 위해 종종 이용가능하지 않다. 또다른 공여자로부터의 동종이계 세포는 매치시키기 어렵고, 이는 치료 세포가 환자 자신의 골수로부터 유도되는 자가유래 공여의 개발을 이끈다. 자가유래 공여는 이식편으로 충분한 세포를 제조하기 위한 시간을 요구하고, 암 세포가 세포를 투여한 환자에게 재도입될 위험이 항상 존재한다.

진행중인 기저 상의 조혈계를 다시 보충하는 것으로 여겨지는, 인간 혈액 및 골수에 존재하는 줄기세포를 특징분석하기 위한 상당한 연구가 수행되었다. Gunsiliun 등 (Biomed. Pharmacother. 55: 186, 2001) 은 일반적인 리뷰를 제공하였다. USP 5,750,397 에는, CD34 양성이고 증식 및 분화될 수 있는, 인간 골수 샘플 유래의 인간 조혈 줄기세포의 배양를 보고하였다. USP 5,192,553 은 태아 및 신생아 줄기세포 및 혈액 선조세포의 단리를 보고하였다. USP 5,635,386 은 인간 조혈세포 배양에서 특이적 세포 계통을 조절하는 방법을 보고하였다. 유럽특허 공보 EP 455,482 A3 는 CD38 이 결핍되어 있지만 CD34 를 발현하는 인간 선조세포의 아류를 보고하였다.

Vaziri 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9857,1994) 은 인간 조혈 줄기세포 시기의 텔로머성 DNA 의 유실을 보고하였다. Chiu 등 (Geron Corporation; Stem Cells 14: 239,1996) 은 성체 인간 골수 유래의 조혈 선조세포에서 텔로머라아제 활성의 분화 발현을 기재하였다. Gaffney 등 (Blood 91: 1662,1998) 은 1차 인간 CD34 양성 골수 선조세포 상의 Flt-3 리간드 및 인간 골수 기질(stroma) 유래 인자의 효과를 보고하였다. Koller 등 (J. Hematother. 5: 449,1996) 은 생체외조혈세포 확장 자극제로서 Flt-3 리간드 및 c-kit 의 효과를 비교하였다.

Bhatia 등 (Proc.Natl. Acad. Sci 94: 5320,1997) 등은, 면역결핍 마우스를 재생시킬 수 있는 원시 인간 조혈세포의 정제를 보고하였다. Bhatia 등 (Nature Med. 4: 1038, 1998) 은 SCID 재생 활성을 갖는 인간 조혈세포의 부류를 보고하였다. Gallacher 등 (Blood 96: 1,2000) 은 새로운 순환 인간 배아 혈액 줄기 세포의 단리를 보고하였다. 국제특허공보 WO 99/23205 는 CD34 음성 및 Lin 음성인 인간 조혈 줄기세포의 실질적으로 균일한 집단을 청구한다. Karanu 등 (J. Exp. Med. 192: 1365, 2000) 은 조혈 줄기세포에 대한 성장인자로서 Notch 리간드 Jagged-1 을 보고하였다. Bhatia 등 (J. Exp. Med. 189: 1139,1999) 은 골형태형성 단백질이 인간 조혈 줄기세포의 발생 프로그램을 조절한다는 것을 보고하였다. Karanu 등 (Blood 97: 1960,2001) 은 Delta-2 및 Delta-4 가 원시 인간 조혈세포의 체세포분열 조절자로서 기능한다는 것이 보고되었다. Bhardwaj 등 (Nature Immunol 2: 172,2001) 은 인자 소닉 헷지혹(sonic hdegehog) 이 인간 조혈세포의 증식을 유도함을 보고하였다.

인간 골수 및 제대 혈액 유래의 중요한 조혈 선조세포가 동정되었고, 이들을 시험관내에서 제조하기 위한 효과적인 방법이 발견되었다. 그러나, 공여 세포 집단의 백분율로서 이들 세포의 소수성은 문제로 남는다.

대안적인 공급원은 초기 배아 조직으로부터 단리된 분화다능 세포이다. 인간 ES 세포 (Thomson 등, Science 282: 114,1998 ; USP 6,090,622 & 6,200, 806) 및 인간 배아 생식 세포 (Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998 ; USP 6,090,622) 를 단리하고 배양하기 위한 기술이 최근에 개발되었다. 국제특허공보 WO 99/20741 및 WO 01/51616 (Geron Corp.) 은 영장류 유래 시원 줄기세포를 피더 (feeder)가 없는 배양배지에서 성장시키기 위한 방법 및 재료를 제공하며, 이는 인간 치료를 위한 이러한 세포 및 이들의 유도체의 제조를 상당히 용이하게 한다.

인간 분화다능 줄기세포를 조혈 계통의 세포로 분화시키기 위한 기존의 노력은 Li 등 (Blood 15: 98, 2001); USP 6,280,718 (Wisconsin); 및 Kaufman 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10716, 2001 b) 에 의해 보고되었다. 뮤린 골수 세포 또는 난황낭 내피세포와 공배양하는 것은 조혈 마커를 갖는 세포를 생성하기 위해 필요하였다.

배아 줄기세포 유래의 조혈세포가 상업적으로 성장가능한 제안이 되기 위해서, 기질 세포와 공배양할 필요성을 제거하고, 골수로부터 이용가능한 세포와 비교하여 실질적으로 개선된 수율을 제공하는 새로운 절차를 개발할 필요가 존재한다.

본 발명은 일반적으로는 세포 생물학, 배아 줄기세포 및 세포 분화 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 약물 개발 및 이식 요법에 사용하기 위한 조혈능을 갖는 분화 세포를 제공한다.

개요

본 발명은 분화다능 세포로부터 조혈 계통의 세포로 분화된 영장류 세포의 효율적인 제조를 위한 시스템을 제공한다. 조혈 선조세포가 상당히 풍부한 세포 집단이 기술된다. 이어서, 조혈 선조세포는 적혈구계, 과립구, 단구(monocyte), 거핵구 및 림프구 세포주의 콜로니로 더 분화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법 및 기술은 약물 스크리닝 및 다양한 형태의 임상 치료를 포함하는 각종적용을 위해 상당한 유망성을 갖는다.

본 발명의 하나의 구현예는 배양배지에서 증식하여 조혈 세포의 특정한 특성 특징을 갖는 집단이다. 세포 집단은, 인간 배아 줄기 세포의 확립된 세포주에 의해 예시되는 영장류 줄기 (pPS) 세포를 분화시키는 것에 의해 수득된다. 세포의 1% 이상이 CD45 양성이고, 하기에 나열된 조혈세포의 기타 마커 특징을 가지며, 최소한의 비율의 미분화 pPS 세포를 갖는 집단이 포함된다. 상기 세포 집단은 조혈 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 대한 메틸-셀룰로오스 검사에서 높은 치상 효율성 (plating efficiency)을 갖는 콜로니를 형성할 수 있고, 이어서 2차 CFU 검사에서 재치상되는 경우, 2차 콜리니를 형성할 수 있다. NOD-SCID 마우스에 주입하는 경우, 상기 세포는 순환 적혈구계 세포, 과립구 세포, 단구, 거핵구 또는 림프구 세포를 형성할 수 있다. 유전자 치료의 목적을 위한 이종성 유전자를 발현하도록, 또는 세포 재생능을 확장하도록 유전적으로 변경된 세포가 포함된다.

본 발명의 또다른 구현예는 본 명세서에 나열된 특성, 예를 들어 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는 인간 조혈 세포 집단이다: 약 20% 이상의 세포가 내재 유전자로부터 CD34 를 발현하거나; 약 2% 이상의 세포가 내재 유전자로부터 CD45 를 발현하거나; 또는 상기 세포는 CFU 검사에서 높은 치상 효율성을 갖는 콜로니를 형성함. 이는, 제한되지는 않지만, 인간 분화다능성 줄기세포의 분화를 포함하는 임의의 방법, 또는 특정 항체 (예컨대, 항-CD34 항체) 또는 이의 동등물을 사용하여 세포 분리를 포함하지 않는 임의의 다른 방법에 의해서 제조된 인간 세포 조성물을 포함한다.

본 발명의 또다른 구현예는 pPS 세포를 분화시키는 것에 의한 조혈세포의 제조 방법이다. 예를 들어, pPS 세포는 피더가 없는 배양배지로부터 회수한 후, 배양체를 형성하는 것에 의해 또는 일부 다른 수단에 의해 분화 경로를 개시시킬 수 있다. 이어서, 개시된 세포는 조혈 성장인자의 혼합물과 함께 배양함으로써, CFU 검사에서 콜로니를 형성하는 세포를 수득할 수 있다. 조혈 성장인자의 혼합물은 하기의 조혈 분화인자 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 줄기세포인자 (SCF), FLT-3 리간드, IL-3, IL-6, G-CSF, 소닉 헷지혹, 또는 본 명세서에 나열된 기타 시토카인, 가능하게는 BMP-4 와 같은 골형태형성 단백질과 조합됨. 외래 기질세포 또는 상이한 게놈을 갖는 임의의 다른 세포와 함께 공배양하는 것은 통상적으로 필요하지 않다. 상기 방법은 조혈 선조세포, 또는 적혈구계 세포, 과립구 세포, 단구 세포, 거핵구 또는 림프구 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 조혈 세포 기능을 변형시키는 능력을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법이다. 상기 화합물은 본 발명의 세포 집단과 결합시켜, 초래되는 세포집단의 임의의 표현형적 또는 대사적 변화에 대해 모니터링된다.

본 발명은 또한 면역 관용을 유도하기 위한 시스템을 제공한다. 결핍 조직 기능을 재생하는 목적으로 제공된 2차 세포 집단에 대해 대상체가 면역관용이 되도록 하는 영장류 분화다능 줄기 (pPS) 세포 유래의 관용화 세포 집단이 대상체에 투여된다. 예시적인 hPS 세포는, 예를 들어 인간 포배로부터 수득될 수 있는 인간 배아 줄기 (hES) 세포, 또는 이들의 등가물이다. 1차 세포 집단은 통상적으로 2차 세포 집단에 대한 MHC 적합성 (compatible)을 갖고, 아마도 동일한 hPS 세포주로부터 유도될 것이다. 상기 방법은 간세포, 뉴론, 희돌기세포 및 기타 글리아 세포, 심근세포, 골원세포 (osteogenic cell), 간엽 세포, 조혈 세포, 호르몬 분비 세포, 예컨대 섬(islet) 세포, 및 연골세포와 같은 조직의 이식을 강화시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 및 기타 구현예는 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 미분화 인간 배아 줄기 (hES) 세포의 유세포 분석 (flow cytometry analysis) 을 나타낸다. 세포를, 생존성 (7AAD 음성; 패널 i) 및 크기 (ii) 에 대해 게이팅(gating)한 후, 미분화 ES 세포 집단에서 조혈 세포 표면 마커의 발현 (iii-vi) 에 대해 게이팅하였다. 어떠한 세포도, 인간 조혈 마커 CD45 를 발현하지 않았고, 단지 1.2%만이 CD34 양성 (원시 인간 조혈 세포의 마커) 였다.

도 2는 hES 세포의 H1 세포주를 분화시키는 것에 의해 수득되는 조혈세포의 유세포 분석을 나타낸다. 분화는 20% FBS 를 포함하는 배지에서 10 일 동안 응집체로서 hES 세포의 스트립 (strip)을 성장시키는 것에 의해서 개시되었다. 이어서, 세포를 조혈 성장인자 (SCF 인 HGE, Flt-3 리간드, IL-3, IL-6 및 G-CSF) 를 함유하는 무혈청 배지 (SF) 에서 골형태형성 단백질 4 (BMP-4) 의 존재 또는 부재하에 배양하였다. CD45 마커로 조혈 선조세포를 동정하였다.

도 3은 hES 세포의 H1 세포주를 조혈 선조세포로 분화시키는 도식이다. FCS 함유 배지 중에서의 분화 후, 전체 배양물 (왼쪽) 또는 개별적인 배양체 (오른쪽) 를 콜로니 형성 (CFU) 검사에서 줄기세포 인자, GM-CSF, IL-3 및 EPO 를 함유하는 메틸 셀룰로오스 중에 위치시켰다. 형성된 콜로니를 유세포분석에 의해 조혈 표현형에 대해 특징분석하고, 2차 CFU 검사로 계대하였다.

도 4는 도 3 의 왼쪽 측 상의 도식에 따라 전체 배양체 배양물로부터 형성된 조혈세포를 나타낸다. 전체 CFU 검사가 분석되는 경우 (패널 A), 83-86% 가 CD45 에 대해 염색되었고 (이는 조혈세포의 존재에 대해 확인시켜준다), 4% 가 글리코포린 A (4%) 에 대해 염색되었다 (이는 적혈구계 세포의 존재를 확인시켜준다). 형태 평가를 패널 B 에 나타낸다. 47 개의 콜로니는 20,000 개의 투입 세포로부터 제조되었고, 치상 효율은 425 분의 1 이었다. 패널 C 에 나타낸 콜로니는 마커 분석을 위해 픽킹되었고, 81-92% 의 세포가 CD45 양성이었고, 73% 가 CD13 양성이었다.

도 5는 도 3 의 오른쪽 측 상의 도식에 따라 단리된 배양체 배양물로부터 형성된 조혈세포를 나타낸다. 적혈구계 세포, 과립구 세포 및 대식세포의 콜로니를 CFU 검사에서 모두 동정하였다. 두 개의 적혈구계 콜로니가 유세포분석에 의해 분석되었고, 93% 글리코포린 A 양성인 것으로 확인되었다.

도 6은 도 3 에 나타낸 CFU 검사로부터 픽킹된 두 개의 콜로니가 2차 CFU 검사에서 재치상되는 경우 발생하는 것을 나타낸다. 패널 A 는 82,500 개의 세포 (각각의 콜로니 형태의 수를 하기에 나타낸다) 를 함유하는 1차 과립구 콜로니로부터 유도된 상이한 2차 콜로니를 나타낸다. 상기 2차 콜로니는 과립구, 대식세포, 적혈구계 세포 및 GEMM 콜로니 (조혈 세포 형태의 혼합물) 의 특징을 갖는다. 높은 수준의 CD45 및 CD13 발현이 존재하였지만, 낮은 수준의 CD34 및 CD14 가 존재하였다. 또다른 1차 과립구 콜로니 (12,500 개 세포) 가 2차 CFU 검사 (패널 A) 로 계대되었고, 14 개의 콜로니를 형성하였으며, 모두 단구 세포의 특징을 가졌다.

도 7은 제대혈액 단핵 세포 (CBMC) 및 미분화 hES 세포주 H1, H7 및 H9 상에서의 주요 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 I 및 클래스 II 항원의 발현을 나타낸다. 회색선은 MHC 염색에 대한 염색화를 나타내고; 굵은선은 항체 대조군을 나타내다. 미분화 hES 세포는, 심지어 인터페론 γ (삽입도) 의 처리 후에도, MHC 클래스 I 에 대해서는 양성이었지만, 클래스 II 에 대해서는 음성이었다.

도 8은 혼합된 림프구 반응 중에서 미분화 hES 세포의 효과를 나타낸다. 패널 A 에서, hES 세포는 동종이계 혈액 또는 제대혈액 단핵 세포의 증식을 자극하지 못하였다. 패널 B 에서, 모든 세가지 hES 세포주는, 심지어 단구 결핍에 의한 T 세포에 대한 응답 집단의 풍부화 후에도, 증식을 자극하지 못하였다. 패널 C 에서, HES 세포는 IFN-γ 와 배양함으로써 제조되어 MHC 클래스 I 을 증가시켰으나, T 세포의 증식을 자극하지는 못하였다.

도 9는 hES 세포가 제 3 자의 항원제시세포에 의해 자극된 혼합 림프구 반응을 또한 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 패널 A 에서, 동종이계 수상 세포 (DC) 에 의해서 T 세포가 자극되는 경우, 격렬한 증식성 응답이 관찰되었다. 배양물에 인간 섬유아세포를 첨가하는 것은 최소한의 효과를 갖지만, 미분화 hES 세포를 첨가하는 것은 상기 응답을 제거하였다. 패널 B 에서, 억제 효과가 MLR 에 존재하는 hES 세포의 수에 의존하는 것으로 보여진다. 상기 반응은 3 ×10⁴hES 세포 만큼 낮게 현저하게 억제되었다.

도 10은 면역결핍 Prk-/-SCID 마우스로 세포를 주입하는 것에 의해 생성되는 반응을 나타낸다. MBA-1 기질세포 및 태아 단핵 세포는 과립구 침투 반응을 유도할 수 있었지만, 미분화 hES 세포는 효과가 관찰되지 않았다.

도 11은 야생성 CD-1 마우스로 세포를 주입하는 것에 의해 생성되는 반응을 나타낸다. PBS 만을 함유하는 내독소의 주입은 주입 부위에서 림프구 및 과립구 침투를 유도하였다. 그러나, hES 세포와 함께 운반체를 주입하는 것은 백혈구의 침투를 완전히 제거한 반면 (오른쪽), MBA-1 세포는 침투 (삽입도)를 억제하지 못하였다. 미분화 hES 세포는 이 상황에서 거부 반응을 명백히 유도할 수 없었고, 이들은 주입 부위에서 숙주세포 침투를 억제하였으며, 이는 염증 억제능을 증명한다.

도 12는, 배양체 형성 후 그 다음날, 시토카인 및/또는 BMP-4 중에서 hPS 세포를 배양하는 것에 의해 수득되는 조혈세포의 표현형적 및 기능성 특성을 나타낸다. 시토카인은 총 세포 수율을 향상시켰고, CD45 양성 세포 및 CFU 를 형성하는 세포의 비율 상당히 개선시켰다.

도 13은 2차 CFU 의 결과를 나타내고, 이는 초기 분화 과정 동안의 BMP-4 의 중요성을 강조한다. BMP-4 (시토카인의 존재 또는 부재하에서) 를 사용하여 제조된 조혈세포는 높은 비율의 2차 콜로니를 생성하였다. 이는 BMP-4 의 존재하에hES 세포를 분화시키는 것이 상당히 자기 복제능을 갖는 조혈 선조세포를 생성함을 증명한다.

도 14는 세포 표현형 및 기능의 동역학이 분화 과정 동안에 수행되는 프로토콜의 결과를 나타낸다. CD45 양성 세포는 15일째에 나타났고, 22일째에 상당히 증가하였다. 콜로니생성 활성이 15일째에 높았고, 22일째에서의 증가는 유의하지 않았다. 이러한 조건하에서, 처음 15일은 직접적인 조혈 분화를 위한 시토카인 및 BMP 의 중요한 기회를 나타낼 수 있다.

상세한 설명

본 발명은 분화다능 줄기세포로부터 효율적으로 분화시키는 방법을 보여주는 것에 의해, 인간 조혈세포의 큰 집단을 생성하는 문제점을 해결한다.

인간 배아 줄기세포는 비특이적 방식으로 분화를 개시시킨 후, 분화 인자의 칵테일 중에서 개시된 세포를 배양하는 것에 의해, 조혈 분화 경로를 따라 움직여질 수 있음을 발견하였다. 상이한 조합의 성장인자는 조혈 세포를 촉진함에 있어 효과적이다. 특히 효과적인 조합은, 줄기세포 인자 (SCF), Flt-3 리간드, IL-3, IL-6 및 G-CSF 를 포함한다. 적절한 기간 동안 상기 칵테일 중에서 배양하는 것은, 각종 조혈 세포 계통에 대해 다능성이고 배양배지 중에서 활발하게 증식하는 조혈 전구체 세포가 상당히 풍부한 집단을 생성한다. 이어서, 조혈 전구체는, SCF, GM-SCF, IL-3 및 에리트로포이에틴 (EPO) 과 함께 배양하는 것에 의해 미엘로이드 분화 경로로 더 하위 유도될 수 있다.

Kaufman 등 (supra) 에 의해 보고된 바와는 달리, 본 명세서는 기질 세포와의 공배양은 유도화의 수행에 필요한 부분이 아니라는 것을 인식시킨다.

반대로, 본 명세서의 기술을 사용하여, 조혈 표현형이 상당히 풍부한 분화 세포의 집단을 생성하는 것이 가능하다. 분화 칵테일에 시토카인 및 골형태형성 단백질 4 (BMP-4) 를 포함시키는 것에 의해서, 8% 의 CD45 양성 세포 (다능성 조혈 세포에 대한 마커) 및 22% 의 CD34 양성 세포 (원시 조혈 선조세포에 대한 마커) 를 함유하는 세포 집단이 수득되었다. 중요하게는, 5% 초과의 세포는 CD45 및 CD34 에 대해 이중 양성이었다. CD45 마커의 존재는 CFU 검사에서 측정된 활성 콜로니 형성 세포와 관련되어 있다. 배아 줄기세포로부터 유도된 조혈세포는 상당히 높은 치상 효율로 콜로니를 생성한다.

이런 발견은, 말초 혈액, 성체 골수 또는 심지어는 제대혈액을 포함하는 임의의 현 공급원으로부터 명백히 수득되는 것보다 더 많이 조혈 선조세포를 함유하는 것으로 보여지는 조혈 세포 집단이 제공되기 때문에, 중요하다. 인간 제대혈액 (182) 또는 말초혈액 (249) 에서 이동된 골수와 비교하여, 약 137 이상의 조혈 선조세포의 시토카인 수율로 1 ×10⁵hES 세포의 출발 집단을 분화시켰다. 무한하게 증식하는 인간 배아 줄기세포가 유발될 수 있기 때문에, 본 발명은 한정되지 않은 양의 조혈 선조세포 및 조혈 아류 중 하나로 수임된 자손세포를 생성하거나, 성숙 적혈구 또는 림프구로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 시스템을 제공한다.

하기의 설명은 본 발명의 조혈 세포의 제조 및 시험에 대한 추가적인 정보를 제공한다. 또한, 혈액 관련 비정상의 연구, 약제 개발 및 치료 관리에 이들 세포를 사용할 수 있는 방법에 대한 확장된 예시를 제공한다.

정의

본 명세서의 목적을 위해, 용어 "조혈 세포" 는 조혈 경로 유래의 임의의 세포를 지칭한다. 상기 세포는 허용되는 형태학적 특징 및 조혈 계통의 특징인 표현형적 마커 (하기에 예시됨) 의 일부를 발현한다. 조혈 선조세포, 수임된 복제-적합 또는 콜로니 형성 세포 및 완전히 분화된 세포가 포함된다.

"조혈 선조세포", "조혈 전구체" 또는 "조혈 줄기세포" 는 완전히 분화된 조혈 세포를 생성하는 능력을 갖고 자기-복제능을 갖는 세포이다. 전형적으로는, 이는, 일부 방식으로 탈분화 또는 재프로그래밍되지 않는다면, 시험관내에서 그 자체로 배양하는 경우, 다른 배아 배엽의 자손세포를 생성하지 않는다.

세포 개체발생과 관련하여, 형용사 "분화된" 은 상대적인 용어이다. "분화 세포" 는 비교되는 세포보다 더 하위의 발생 경로를 진행한 세포이다. 따라서, 분화다능성 배아 줄기세포는 계통 제한 전구체 세포, 예컨대 적혈구계, 과립구, 단구, 거핵구 및 림프구 세포주의 각각의 세포를 형성하는 능력을 갖는 다능성 조혈 선조세포로 분화할 수 있다. 이러한 선조세포는, 이러한 4 가지의 조혈 세포주 중 단지 하나의 세포를 형성하기 위해 수임된 자기-복제성 세포로 더 분화할 수 있다. 이어서, 이들은 특징적인 역할을 수행하는 말단-단계의 분화세포로 더 분화될 수 있고, 추가적인 증식능을 유지하거나 유지하지 않을 수 있다. 적혈구, 단구, 대식세포, 호중구(neutrophil), 호산구 (eosinophil), 호염기성구 (basophil), 혈소판 및 림프구는 최종적으로 분화된 세포의 예이다.

본 명세서에서 사용된 "분화제" 는, 조혈 계통의 분화세포 (전구체 세포 및 최종적으로 분화된 세포) 를 생성하기 위해, 본 발명의 배양계에서 사용되는 화합물의 집합 중 하나에 관한 것이다. 화합물의 작용 방식에 대해서 한정을 의도하지는 않는다. 예를 들어, 분화제는 표현형의 변화의 유도 또는 보조, 특정 표현형을 갖는 세포의 성장 촉진 또는 그외의 것의 성장 지연, 또는 비공지된 메커니즘을 통한 다른 제제와의 동시 작용에 의해서, 분화 과정을 보조할 수 있다.

원형 "영장류 다능성 줄기 세포" (pPS 세포)는 수정 후 임의 시점의 전배아, 배아 또는 태아의 조직으로부터 유래된 분화다능성 세포이고, 표준 기술 허용 테스트에 따라, 모든 3가지 배엽 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 유도체인 여러 상이한 세포 유형의 자손세포를 적절한 조건 하에 생산할 수 있는 특징, 예컨대 8-12 주령 SCID 마우스에서 기형종을 형성하는 능력을 갖는다. 이 용어는 각종 종류의 줄기 세포의 확립된 세포주, 및 상기한 방식으로 분화다능성인 1차 조직으로부터 수득된 세포를 모두 포함한다.

pPS 세포의 정의에는 다양한 유형의 배아 세포가 포함되고, 인간 배아 줄기 (hES) 세포 [Thomson 등, Science 282:1145, 1998)]; 다른 영장류로부터의 배아 줄기 세포, 예컨대 붉은털 원숭이(Rhesus) 줄기 세포 (Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995), 명주 원숭이(marmoset) 줄기 세포 (Thomson 등, Biol. Reprod. 55:254, 1996) 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 (Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998) 가 포함된다. 다른 유형의 분화다능성 세포도 또한 이 용어에 포함된다. 배아 조직, 태아 조직 또는 기타 기원에서 유래되었는지의 여부와 상관없이, 모든 3가지 배엽의 유도체인 자손세포를 생산할 수 있는 영장류 기원의 임의의 세포가 포함된다. pPS 세포는 악성 종양원으로부터 유도되지 않는 것이 바람직하다. 상기 세포는 일반적인 핵형을 갖는 것이 바람직하다 (그러나, 항상 그럴 필요는 없음).

pPS 세포 배양물은 집단 내의 줄기 세포 및 이들의 유도체의 상당한 부분이, 배아 또는 성체 기원의 분화된 세포와 명백하게 구별되도록 하는, 미분화 세포의 형태학적 특징을 나타내는 경우 "미분화" 로서 기술된다. 미분화 pPS 세포는 당업자에게 용이하게 인식되고, 2차원 현미경 관찰에서 핵/세포질 비율이 높고, 돌출된 인을 갖는 세포의 콜로니에서 전형적으로 나타난다. 집단 내의 미분화 세포의 콜로니는 종종 분화된 이웃 세포로 둘러싸일 것으로 이해된다.

"피더(feeder) 세포" 는 또 다른 유형의 세포와 공배양되어 제 2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는 한 유형의 세포를 기술하기 위해 사용되는 용어이다. 특정 유형의 pPS 세포는, 1차 마우스 배아 섬유아세포, 불사(不死)의 마우스 배아 섬유아세포, 또는 hES 세포로부터 분화된 인간 섬유아세포형 세포에 의해 지지될 수 있다. pPS의 성장을 지지하기 위해 새로운 피더 세포가 첨가되지 않은 분할 후 적어도 1회의 라운드를 통해 세포가 성장하면, pPS 세포 집단은 피더 세포가 "본질적으로 없는" 것으로 언급된다.

용어 "배양체 (embryoid body)"는 "응집체 (aggregate bodies)"와 동일한 의미의 기술 용어로, pPS 세포가 단층 배양물에서 과성장되거나 현탁액 배양물에서유지될 때 나타나는 각종 크기의 분화 및 미분화 세포들의 응집물을 가리킨다. 배양체는 형태학적 기준 및 면역세포화학에 의해 검출가능한 세포 마커로 구별할 수 있는, 전형적으로 여러 배엽으로부터의, 상이한 세포 유형의 혼합물이다.

"성장 환경" 은 목적 세포가 시험관내에서 증식, 분화 또는 성숙하는 환경이다. 상기 환경의 특징은 세포가 배양되는 배지, 존재할 수 있는 임의의 성장인자 또는 분화유도 인자, 및 존재하는 경우 지지성 구조 (예컨대, 고체 표면 상의 기질) 을 포함한다.

인공적인 조작의 임의의 적당한 수단에 의해 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 도입하는 경우, 또는 세포가 폴리뉴클레오타이드를 유전하는 본래 변형된 세포의 자손 세포인 경우, 세포는 "유전적으로 변형된" 또는 "형질감염된" 이라고 말한다.

일반적인 기술

분자 유전학 및 유전공학의 일반적인 방법들은 하기 문헌에 기재되어 있다:Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook 등,Cold Spring Harbor) 의 현판;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller & Calos 편저); 및Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel 등 저, Wiley & Sons). 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기술은 하기에서 찾아질 수 있다: Current Protocols in Protein Science (J.E. Colligan 등 저, Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J.S. Bonifacino 등, Wiley & Sons) 및 Current Protocols in Immunology (J.E. Colligan 등 저, Wiley & Sons). 본 명세서에서, 시약, 클로닝 벡터, 및 유전적 조작을 위한 키트는 BioRad, Stratagene,Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co. 과 같은 상업적 판매사로부터 구입할 수 있다.

세포 배양 방법은 일반적으로 하기의 현판에 기재되어 있다:Culture of Animal Cells: A manual of Basic Technique(R.I. Freshney ed., Wiley & Sons);General Techniques of Cell Culture(M.A. harrison & I.F. Rae, Cambridge Univ. Press), 및Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols(K. Turksen 저, Humana Press). 조직배양 공급물 및 시약은 Gibco/SRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co., 및 ICN Biomedicals 와 같은 상업적 판매사로부터 구입할 수 있다.

본 발명에 관련된 구체적인 참고서는,Blood Cell Biochemistry, Plenum Pub. Corp. 및 Kluwer Academic Publishers;Primary Hematopoietic Cells(Human Cell Culture, Vol. 4), M.R. Koller & B. Palsson 저, Kluwer Academie Publishers, 1999;Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of Myeloproliferative Diseases: 11th Symposium, Bormio, June 1998(Acta Haematologica, 101/2), N.G. Abraham 저, S. Karger Publishing, 1999;The Essential Dracula,B. Stoker, L. Wolf & C. Bing, Penguin Putnam, 1993;Hematopoiesis: A Developmental Approach, L.I. Zon 저, 1st edition, Oxford University Press, 2001 이 포함된다.

줄기 세포의 공급원

본 발명은 다양한 형태의 줄기 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 줄기 세포는 잉태 후 형성된 조직, 예컨대 포배, 또는 잉태 동안 임의의 시점에 얻은 태아 또는 배아 조직으로부터 유래된 영장류 분화다능성 줄기 (pPS) 세포이다. 비제한적인 예는 하기에 예시된 배아 줄기 세포 또는 배아 생식 세포의 1차 배양물 또는 확립된 세포주이다.

본 발명의 기술은 또한 1차 배아 또는 태아 조직을 이용하여 직접적으로 실시하여, 미분화 세포주를 우선 확립하지 않아도, 조혈 세포를 상승시킬 수 있는 능력을 갖는 1차 세포로부터 직접적으로 조혈세포를 유도할 수 있다. 특정 상황하에서, 본 발명의 측면은 또한 제대혈액, 태반 또는 특정 성체 조직 유래의 다능성 세포를 사용하여 실행될 수 있다.

배아 줄기세포

배아줄기세포는 영장류 종 구성원의 포배로부터 단리될 수 있다 (USP 5,843,780; Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844,1995). 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 Thomson 등 (USP 6,200,806; Science 282: 1145,1998 ; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998) 및 Reubinoff 등 (Nature Biotech. 18: 399, 2000) 에 의해 기재된 기술을 사용하여 인간 포배 세포로부터 제조될 수 있다. hES 세포와 동등한 세포 유형에는, 이들의 다능성 유도체, 예컨대 WO 01/51610 (Bresagen) 에 개요된 원시 내배엽-유사 (EPL) 세포가 포함된다.

hES 세포는 인간 이식전 배로부터 수득될 수 있다. 다르게는, 시험관내 수정 (IVF) 배가 사용될 수 있거나, 또는 단일세포 인간 배를 포배 단계로 확장시킬 수 있다 (Bongso 등, Hum Reprod 4: 706,1989). 배는 G1.2 및 G2.2 배지에서 배양하여 포배 단계로 배양된다 (Gardner 등, Fertil. Steril. 69: 84, 1998). 투명대 (zona pellucida) 를 프로나아제 (Sigma) 에 간단히 노출시켜 발생된 포배로부터 제거한다. 내부 세포 질량물은, 포배를 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청의 1:50 희석액에 30 분 동안 노출시킨 후 DMEM 으로 5 분 동안 3회 세척하고 기니픽 컴플리먼트 (Gibco) 의 1:5 희석액에 3 분 동안 노출시키는 면역외과술에 의해서 단리한다 (Solter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 5099,1975). DMEM 으로 2 회 더 세척한 후, 용해된 트로펙토덤 (trophectoderm) 세포를 부드러운 피펫팅에 의해서 온전한 내부 세포 질량물 (ICM) 으로부터 제거하고, ICM 을 mEF 피더층 상에 치상한다.

9 내지 15 일 후, 내부 세포 질량물 유래의 파생물을, 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산 완충된 식염수 (PBS) 에 1mM EDTA 와 함께 노출시키는 것에 의해서, 디스파아제(dispase) 또는 트립신에 노출시키는 것에 의해, 또는 마이크로피펫을 이용한 기계적 해리에 의해서 클럼프 (clump) 로 해리시킨 후; 갓 제조한 배지 중 mEF 상에 재치상한다. 미분화 형태를 갖는 성장 콜로니를 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선택하고, 클럼프로 기계적으로 해리한 후, 재치상한다. ES-유사 형태는 명백하게 높은 핵 대 세포질 비율 및 돌출된 인을 갖는 조밀한 콜로니를 특징으로 한다. 이어서, 생성된 ES 세포는 간단한 트립신 처리, 둘베코의 PBS (2 mM EDTA 함유) 에의 노출, IV형 콜라게나아제 (약 200 U/㎖; Gibco) 에의 노출에 의해서, 또는 마이크로피펫을 이용한 개별 콜로니의 선별에 의해서, 매 1-2 주마다 통상적으로 분할한다. 약 50 내지 100 세포의 클럼프 크기가 최적이다.

배아 생식 세포

인간 배아 생식 (hEG) 세포는 마지막 월경 주기 후 약 8-11주 경과한 인간 태아 제재내에 존재하는 시원 생식 세포 (primordial germ cell)로부터 제조될 수 있다. 적합한 제조 방법은 Shamblott 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 13726, 1998) 및 미국특허 6,090,622에 기재되어 있다.

간단하게는, 생식 릿지(genital ridge)를 가공하여, 탈응집화 세포를 형성한다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 ㎎/ℓ의 D-글루코오스, 2200 ㎎/ℓㆍmM NaHCO₃; 15%의 ES에 적합한 우태아 혈청 (BRL); 2 mM 글루타민 (BRL); 1 mM 나트륨 피루베이트 (BRL); 1000-2000 U/㎖ 의 인간 재조합 백혈병 억제 인자 (LIF, Genzyme); 1-2 ng/㎖ 의 인간 재조합 bFGF (Genzyme); 및 10 μM 포르스콜린 (10% DMSO 내에 존재)를 함유한다. 96웰 조직 배양 플레이트를, LIF, bFGF 또는 포르스콜린이 없는 변형 EG 성장 배지 중에서 3일간 배양된 피더 세포 (예컨대, STO 세포, ATCC 접근번호 CRL 1503)의 서브컨플루언트층 (sub-confluent layer)을 이용하여 제조되고, 5000 rad 의 γ-조사에 의해 불활성화된다. 약 0.2 ㎖의 1차 생식 세포 (PGC) 현탁액을 각 웰에 첨가한다. 1차 계대를 EG 성장 배지 중에서 7-10 일 후에 수행하고, 각 웰을 조사된 STO 마우스 섬유아세포를 이용하여 사전에 제조된 24웰 배양 디쉬의 웰로 옮긴다. EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관찰될 때까지, 전형적으로는 7-30일 또는 1 내지 4 계대 후까지, 매일 배지를 교체하면서 세포를 배양한다.

미분화 상태의 pPS 세포의 증식

pPS 세포는 분화를 촉진함 없이 증식을 촉진하는 배양 조건을 사용함으로써, 배양 중에 연속적으로 증식될 수 있다. 예시적인 혈청 함유 ES 배지는, 80% 의 DMEM (예컨대, 녹아웃 DMEM, Gibco), 20% 의 규정된 우태아 혈청 (FBS, Hyclone) 또는 혈청 대체물 (WO 98/30679), 1% 비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올을 이용하여 제조된다. 사용 직전에, 인간 bFGF 가 4 ng/㎖ 로 첨가된다 (WO 99/20741, Geron Corp).

통상적으로, ES 세포는 피더 세포, 전형적으로는 배아 또는 태아 조직으로부터 유도된 섬유아세포의 층 상에서 배양된다. 배는 임신 13일째의 CF1 마우스로부터 채취하고, 2 ㎖ 트립신/EDTA 로 옮긴 후, 미세하게 썰고, 37℃ 에서 5 분 동안 배양한다. 10% FBS 를 첨가하고, 잔해물을 침전시키고, 세포를 90% DMEM, 10% FBS 및 2 mM 글루타민 중에서 증식시킨다. 피더 세포층을 제조하기 위하여, 증식을 억제하지만 ES 세포를 지지하는 인자의 합성은 가능하도록 세포를 조사한다 (약 4000 rad 의 γ-조사). 배양 플레이트를 0.5% 젤라틴으로 하룻밤동안 피복하고, 웰당 375,000 개의 조사된 mEF 를 치상하고, 치상 후 5 시간 내지 4 일째에 사용하였다. 배지를 pPS 세포의 접종 바로 직전에 갓 제조한 hES 배지로 교체하였다.

Geron 의 과학자들은, pPS 세포가 심지어 피더 세포 없이도 미분화 상태로 유지될 수 있다는 것을 발견하였다. 피더 없는 배양을 위한 환경은 적합한 배양 기질, 특히 Matrigel또는 라미닌과 같은 세포외 매트릭스를 포함한다. pPS 세포를 약 15,000 세포/㎠ 초과 (최적으로는, 90,000 개/㎠ 내지 170,000 개/㎠) 로 치상한다. 전형적으로는, 세포가 완전히 분산되기 전에 (즉, 콜라게나아제 IV 를이용하여 약 5 분 동안) 효소 절단을 중지한다. 이어서, 약 10 내지 2,000 개 세포의 클럼프를 추가 분산 없이 기질 상에 직접 치상한다. 다르게는, 세포가 컨플루언스에 도달하기 전에, PBS 중 0.5 mM EDTA 의 용액 중에서 약 5 분 동안 배양하는 것에 의해서 효소 없이 세포를 채취할 수 있다. 배양 용기로부터 세척한 후, 세포를 추가 분산 없이 새로운 배양배지에 치상한다.

피더 없는 배양물은 분화 없이 세포의 증식을 지지하는 인자를 포함하는 영양 배지에 의해서 지지된다. 이러한 인자는 이러한 인자를 분비하는 세포, 예컨대 조사된 (약 4,000 rad) 1차 마우스 배아 섬유아세포, 텔로머화 마우스 섬유아세포 또는 pPS 세포로부터 유도된 섬유아세포-유사 세포를 함유하는 배지를 배양하는 것에 의해 배지로 도입될 수 있다. 배지는, 무혈청 배지, 예컨대 20% 혈청 대체물 및 4 ng/㎖ bFGF 를 보충한 KO DMEM 중에 피더를 약 5-6 ×10⁴/㎠ 의 밀도로 치상하는 것에 의해 조건화될 수 있다. 1-2 일 동안 조건화된 배지에 추가의 bFGF 를 보충하고, 1-2 일 동안 pPS 세포 배양물을 지지하기 위해서 사용된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 분화 없이 증식의 지지를 도울 수 있는 다른 인자, 예컨대 FGF-2 또는 FGF-4 수용체에 대한 리간드, c-kit 에 대한 리간드 (예컨대, 줄기 세포 인자), gp130 에 회합되는 수용체에 대한 리간드, 인슐린, 트랜스페린, 지질, 콜레스테롤, 뉴클레오사이드, 피루베이트, 및 β-메르캅토에탄올과 같은 환원제가 첨가될 수 있다. 피더 없는 배양 방법의 특징은, 국제특허공보 WO 01/51616; 및 Xu 등, Nat. Biotechnol. 19: 971, 2001 에 추가로 검토되어 있다.

현미경하에서, ES 세포는 높은 핵/세포질 비율, 돌출된 인, 및 불량하게 식별가능한 세포 연접부를 갖는 조밀한 콜로니 형성이 명백하다. 영장류 ES 세포는 단계-특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 지칭되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커를 발현한다 (Thomson 등, Science 282: 1145,1998). 마우스 ES 세포는 SSEA-1 에 대한 양성 대조군, SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 에 대한 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. SSEA-4 는 인간 배아 암종 (hEC) 세포 상에서 일관되게 나타난다. 시험관내 pPS 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현의 유실, 및 hEG 세포 상에서 또한 발견되는 SSEA-1 의 증가된 발현을 초래한다.

조혈세포 및 이들의 유도체의 제조를 위한 재료 및 절차

본 발명의 조혈세포는, (목적하는 세포의 파생에 의해서, 또는 다른 세포 형태의 억제 또는 사멸에 의해서) 요구되는 표현형을 갖는 세포를 풍부하게 하는 종 성장 환경 중에서 줄기세포를 배양하거나, 분화시키거나 재프로그래밍하는 것에 의해 수득된다. 이러한 방법은, 상기 섹션에 기재된 영장류 분화다능성 줄기 (pPS) 세포를 포함하는 수많은 형태의 줄기세포에 적용가능하다.

pPS 세포의 확립된 세포주로부터 유도되는 경우, 본 발명의 세포집단 및 단리된 세포는 이들이 유도되는 세포주와 동일한 게놈을 가질 것이다. 이는, 임의의 핵형 비정상을 넘어서서, 크로모좀 DNA 가 pPS 세포 및 조혈세포 사이에 90% 초과의 동일성이 있다는 것을 의미하고, 이는 조혈세포가 정상적인 유사분열을 통해 미분화 세포주로부터 수득된다면 유추될 수 있다. 트랜스진을 도입하거나 내재적 유전자를 녹아웃시키는 재조합 방법에 의해서 처리된 세포는, 조작되지 않은 모든 유전적 요소가 보존되기 때문에, 이들이 유도되는 (또는 이들의 자손세포인) 세포주와 동일한 게놈을 갖는 것으로 여전히 간주한다.

분화 과정의 개시

본 발명에 따른 조혈세포의 유도에 필수적이지는 않을지라도, 유도를 수행하기 위한 효율적인 방식은 비특이적 방식으로 분화를 개시함을 발견하였다. 하나의 방법은 배양체 또는 응집체를 형성하기 위해 pPS 세포를 하기에 의해서 형성하는 것이다: 예를 들어, 공여자 pPS 세포 배양물의 파생에 의해서, 또는 흡착 특성이 낮은 기질을 갖는 배양 용기 중의 현탁액에 pPS 세포를 배양하는 것에 의해서. 미분화 pPS 세포는 배양물로부터 채취되고, 클러스터로 해리되고, 미흡착 세포 배양 플레이트 중에 치상되고, 분화를 지지하는 배지 중에서 배양된다 (실시예 1). 상기 다양한 방법에서, pPS 세포는 미분화 세포 배양물로부터 스트립으로 박리되고, 이는 분화배지 중에서 배양시, 둥근 세포 중량물로 응집된다 (실시예 2).

분화를 억제하는 인자 (예컨대, pPS 세포의 배양에 사용되는 조건화 배지 중에 존재할 수 있는 인자) 를 제거하는 것은 분화 과정의 부분이다. 일부 상황에서, 예를 들어 피더 세포의 더욱 낮은 밀도를 갖도록 조건화된 배지를 사용하여, 이러한 인자를 점차적으로 제거하는 것이 이로울 수 있다 (실시예 3). 비특이적 방식으로 pPS 세포를 분화시키는 다른 방법이 공지되어 있고, 조혈 세포를 생성하는 공정을 하기에 의해 개시함에 있어 또한 적합할 수 있다: 예를 들어, 배양 배지 중에 레티노산 (RA) 또는 디메틸술폭시드 (DMSO) 를 포함시키는 것에 의해; 그 위에서 세포가 배양되는 통상적인 세포외 기질로부터 제거하는 것에 의해서 (WO 01/51616), 또는 원시 외배엽 유사 세포를 형성하는 것에 의해서 (Rathjen 등, J. Cell Sci. 112: 601, 1999).

조혈세포로의 분화 유도

배양물을 조혈 경로로 유도하기 위해서, 미분화 pPS 세포 또는 개시된 세포 집단을 조혈 분화인자의 칵테일 중에서 배양한다. 단독 또는 조합으로, 각각의 인자는 세포를 표적하여, 조혈 경로를 하위 분화시키거나, 조혈 표현형을 갖는 세포의 파생을 초래하거나, 다른 세포 형태의 성장을 억제하거나, 다른 방식으로 조혈 세포를 풍부하게 한다: 본 발명의 실시를 위해서 작용 메커니즘을 이해할 필요는 없다.

예에는, 조혈성 시토카인, 예컨대 줄기세포 인자 (SCF), 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 6 (IL-6), 과립구-콜로니-자극 인자 (G-CSF) 의 조합 (단독, 또는 골형태형성 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-4 또는 BMP-7 과 조합됨) 이 있다. SCF 는, 혈소판 유도 성장인자 (PDGF) 에 대한 수용체, 대식세포 콜로니-자극인자 (M-CSF), Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 에 관련된 수용체 티로신 키나아제인 c-kit 의 리간드-매개 이합체화에 의한 세포내 시그널에 의해서 유도된다. 관심있는 다른 인자에는, 소닉 헷지혹 (SHH), Delta-1, Jagged-1 및 트롬보포이에틴 (TPO) 이 포함된다. 실시예 9 및 10 에서 보는 바와 같이, 시토카인은 CD45 표현형 (조혈 전구체 세포) 의 형성을 촉진하는 반면, 골형태형성 단백질은 자기 복제능을 갖는 전구체 세포의 확장을 촉진하는 것으로 보여진다.

전형적으로, 적어도 둘 또는 셋 이상의 상기 인자가 결합되어, 분화 칵테일이 생성된다. 인간 단백질이 바람직하지만, 종 상동체 및 변이체가 또한 사용될 수 있다. 임의의 상기 인자 대신에, 동일한 수용체에 결합하거나 동일한 신호전달 경로를 자극하는 다른 리간드, 예컨대 수용체-특이적 항체가 사용될 수 있다. 또한, 다른 성분이 상이한 경로 하위 분화를 유도하기 위해 존재할 수 있는 다른 인자의 효과를 중화시키는 배지 중에 포함될 수 있다. 예로는, 신경 분화의 방향으로 세포의 손실을 최소화시키는 것을 돕는 것으로 생각되는 신경 성장인자에 대한 항체가 있다. 분화 칵테일은 목적하는 세포 집단의 확장을 지지하는 영양배지, 예컨대 소알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 함유하는 무혈청 배지 (SF) 에서 제조된다.

미분화 또는 개시된 pPS 세포는, 목적하는 표현형이 나타내도록 하는 충분한 시간 동안 인자 칵테일 중에서 배양된다. 영양 배지의 선택은, 일부 제형이 분화 과정에 더욱 지지성이기 때문에, 중요할 수 있다. 배지 중에 우태아혈청 (또는 이의 등가물)을 포함시키는 것은, 단지 알부민 및 호르몬만을 혼합하는 단순한 혼합물 보다 훨씬 더 조혈 분화 인자의 활성을 강화시킨다. 일부 환경에서, 조혈 증식을 지지하는 피브로넥틴과 같은 기질 상에서 상기 배양을 수행하는 것이 또한 이로울 수 있다.

종래의 예상과는 반대로, pPS 세포의 조혈세포로의 분화는 심지어 공배양 기질 세포의 부재하에서도 매우 효율적인 방식으로 수행될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명은, 적어도 주요한 집단에서 조혈 표현형이 나타날 때까지,pPS 세포의 분화된 자손세포가 상이한 게놈을 갖는 세포의 부재하에서 배양되는, 조혈세포 형성 방법을 포함한다. 이는, 배양물에 존재하는 동종이계 또는 이종성 세포, 예컨대 피더세포, 기질 세포 또는 분화인자 또는 지지성 매트릭스를 제공하는 다른 세포가 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, 명시적으로 배재되는 것을 제외하고는, 이 과정으로의 부가물로서 배양배지 중의 상기 세포를 포함하는 것이 가능하다. 분화과정을 강화시킬 수 있는 세포에는, 인간 골수로부터 단리된 1차 기질세포, 및 MS-5 뮤린 기질 세포주의 세포가 포함된다.

본 발명의 기술을 사용함으로써, 조혈세포의 집단은 전례없는 비율을 갖는 자손세포 표현형을 갖는 pPS 세포로부터 유도될 수 있다. SHH, BMP-4, SCF, IL-3, Flt-3L 및 IL-6 은 각종 조합으로, 표현형적 및 기능적 조혈 자손세포를 유도할 수 있다. 실시예 3 내지 5 에서는, 배양체를 10 일 동안 배양한 다음, 모두 100-300 ng/㎖ 의 SCF 및 Flt-3L, 10-50 ng/㎖ 의 IL-3, IL-6 및 G-SCF, 100 ng/㎖ 의 SHH 및 5-100 ng/㎖ 의 BMP-4 를 포함하는 환경에 치상하는 것에 의해, 모두 20% 우태아혈청을 함유하는 배지 또는 알부민, 트랜스페린 및 인슐린을 함유하는 무혈청배지 중에서, pPS 세포의 분화가 개시되었다. 8 내지 15 일 후, 8% 가 CD45 양성이고, 22% 가 CD34 양성이며, 5.6% 가 두 가지 모든 마커에 대한 이중 양성인 조혈세포가 나타났다. CFU 검사에서 시험되었을 때, 치상 효율성은 재현가능하게 약 350 분의 1 이었다. 실시예 9 및 10 에서는, 배양체 형성 후 그 다음날에 시토카인 및 BMP-4 를 배양물에 첨가하고, 15 내지 22 일 후 CD45 양성 세포의 비율을 추가로 강화시켰다. BMP-4 의 존재는 4, 10 또는 그 이상의 2차 CFU 가 각각의 1차 CFU로부터 형성되는 집단을 수득가능하도록 하고, 이는 자기 복제성 조혈 자손세포의 존재를 나타낸다.

pPS 유래의 조혈세포의 추가적인 성숙화

상기한 상세한 설명에 따라 수득한 pPS 유래의 조혈세포는, 특히 일반화된 조혈 불충분증의 치료 및 시험관내에서의 조혈 분화의 연구에 있어 가치있는 자손세포를 높은 비율로 포함한다. 본 발명은 또한 특정한 병상의 치료 및 특정한 시험관내 약물 스크리닝에 유용한 더욱 성숙한 세포 집단을 포함한다.

본 발명에 따른 성숙 조혈세포를 수득하기 위한 두 가지 방법이 존재한다. 하나의 방법에서는, 상기 기재된 바와 같이 수득된 조혈세포 집단이 적절한 성숙인자를 함유하는 배지 중에서 배양함으로써 더 분화될 수 있다. 다른 방법에서는, 비특이적인 방식으로 분화가 개시된 세포 집단이 성숙 단계에서 직접적으로 채취된다.

사용되는 성숙 인자는 목적하는 최종 세포 유형에 의존한다. 실시예 4 에서 보여진 바와 같이, 조혈 세포의 콜로니는, SCF, GM-CSF, IL-3 및 에리트로포이에틴 (EPO) 를 함유하는 환경에서 배양하는 것에 의해, 배양체 세포로부터 생성될 수 있다. 이는 배양물을 미엘로이드 세포로 유도하여, 약 66% 의 적혈구계 콜로니, 약 19% 의 단구 콜로니 및 약 15% 의 과립구 콜로니를 함유하는 배양물을 생성한다. 사용될 수 있는 다른 인자에는, 과립구 세포에 대한 G-CSF, 단구 세포에 대한 M-CSF, 림프구 세포에 대한 IL-2 및 IL-4, 거핵구에 대한 TPO, 및 적혈구계 세포에 대한 EPO 가 포함된다.

조혈 세포의 특징

세포는 수많은 표현형적 기준에 따라 특징화될 수 있다. 상기 기준은, 한정되지는 않지만, 형태적 특징의 현미경 관찰, 발현된 세포 마커의 검출 또는 정량, 실험관에서 측정가능한 기능적 기준, 및 숙주 동물로의 주입시의 양상을 포함한다.

표현형적 마커

본 발명의 세포는, 이들이 각종 종류의 조혈세포의 특징인 표현형적 마커들을 발현하는지에 따라 특징화될 수 있다. 관심있는 마커에는 하기가 포함된다:

ㆍ 미분화 hES 세포: SSEA-4, Oct-4

ㆍ 원시 조혈세포: CD34, AC133, c-kit, CD38

ㆍ 성숙 다능성 조혈세포: CD45

ㆍ 적혈구계 세포: 글리코포린 A

ㆍ 초기 미엘로이드: CD33

ㆍ 단구: CD14, CD64, HLA 클래스 II

ㆍ 과립구: CD13, CD15

ㆍ 림프구: CD19, 면역글로불린 (B 세포), CD3 (T 세포)

ㆍ 거핵구: CD56

조직-특이적 마커는 임의의 적당한 면역학적 기술, 예컨대 세포 표면 마커에 대한 유면역세포화학 (flow immunocytochemistry) 또는 (예컨대, 고정된 세포 또는 조직 단편의) 면역조직화학을 사용하여 검출될 수 있다. 조혈세포의 유세포분석을 위한 상세한 방법은 Gallacher 등, Blood 96: 1740, 2000 에 제공되어 있다. 세포-표면 항원의 발현은, 임의로는 세포 고정 후에, 임의로는 표지된 2차 항체 또는 표지를 증폭하기 위한 다른 공액체를 사용하여, 표준 면역세포화학 또는 유세포분석에서 유의적으로 검출가능한 양의 항체가 항원에 결합한다면, 양성으로써 정의된다.

또한, 조직-특이적 유전자 산물의 발현은, 노던 블랏 분석, 도트-블랏 하이브리드형성 분석, 또는 표준 증폭 방법으로 서열-특이적 프라이머를 사용하는 역전사 개시 폴리머라아제 연쇄반응 (RT-PCR) 에 의해서, mRNA 수준에서 검출될 수 있다. 추가 설명은 USP 5,843,780 참조. 본 개시에서 나열된 트정 마커에 대한 서열 데이터는 GenBank 와 같은 공개 데이터베이스로부터 입수가능하다.

본 발명의 특정 구현예는 적어도 5%, 10%, 20% 또는 40% 가 CD34 양성이고; 1%, 2%, 5% 또는 10% 가 CD45 양성이며 (또는 CD34 를 갖는 이중 양성); 50%, 70% 또는 90% 가 CD14, CD14, CD19 에 대해서 양성이고; 5%, 1% 또는 0.2% 미만이 SSEA-4 양성 또는 Oct-4 양성인 조혈세포에 관한 것이다. 이러한 특성의 다양한 조합이 특정한 세포 집단에 존재할 수 있다.

기능적 특징

또한, 본 발명의 세포는 기능적 기준에 따라 특징화될 수 있다 (조혈 및 선조세포에 대한 검사 시스템의 리뷰에 대해, T. A. Bock (Stem Cells 15 Suppl 1: 185, 1997) 참조).

복제성 조혈 세포에 대해 빈번히 사용되는 시험은, 콜로니 형성 (CFU) 검사에서 콜로니를 형성하는 이러한 세포의 능력이다. 전통적인 검사는 Till 및McCulloch (Ser. Haematol. 5: 15, 1972) 의 비장 콜로니 형성 검사이다. 요즘, 콜로니 형성 검사는 통상적으로 성장인자를 보충한 메틸셀룰로오스 매트릭스 중에서 수행된다. 달리 명시적으로 요구하는 것을 제외하고는, 본 명세서에 관련된 결정적인 CFU 검사는 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행된다.

콜로니가 일단 형성된다면, 이들은 형태학적 기준에 의해 평가될 수 있고, 폭발적인 형성 유닛-적혈구 (BFU-E), 콜로니 형성 유닛-과립구-대식세포 (CFU-GM), 콜로니 형성 유닛-거핵구 (CFU-M), 콜로니 형성 유닛-적혈구 (CFU-E), 및 모든 4 가지 형태를 만드는 다능성 콜로니 (CFU-GEMM) 로써 분류된다. 치상 효율성은 투입 세포 대 형성된 콜로니의 비율이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 조혈세포는 2,000 분의 1, 500 분의 1, 특정 상황 하에서는 100 분의 1 초과의 치상 효율성을 가질 수 있다.

최종적으로 분화된 세포의 기능적 기준은, 이러한 세포의 공지된 하기의 특징에 따라 결정될 수 있다: 예를 들어, 존재하는 항원인 입자를 식작용하는 대식세포의 능력, 또는 적절한 시토카인에 반응하는 능력; 적절한 매개자를 방출하는 과립구 및 혈소판의 능력; 및 혼합 림프구 반응 중 조사된 동종이계 자극자 세포에 대응하여 증식하는 림프구의 능력.

동물 모델 실험

숙주 동물의 조혈계를 재구성하는 세포 집단의 능력은, 임상적용을 위한 조혈세포의 목적을 위해 상당한 관심을 받는다. 재구성은 각종 잘 확립된 동물모델을 사용하여 검사될 수 있다.

조혈적합성 세포의 투여에 의한 재생은, 이종이식 거부를 미연에 방지하기 위해 유전적으로 가공된 마우스에서 평가될 수 있다. 심각한 조합 면역결핍 (SCID) 를 갖는 마우스와 교배한 비-비만성 당뇨병 (NOD) 유전자형을 함유하는 NOD/SCID 마우스가 특히 고려된다. 이런 모델의 사용은, Larochelle 등, Nat. Med. 2: 1329, 1996 ; Dick 등, Stem Cells 15: 199, 1997 ; 및 Vormoor 등, J. Hematother. 2: 215, 1993 에 기재되어 있다. 간단하게는, 마우스를 치사량에 가깝게 조사한 후, 약 3 내지 4 ×10⁶개의 CD34 양성 세포를 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 8 주 후, 골수 세포를 대퇴골, 경골 또는 장골능으로부터 수집하고, 투여된 인간 세포에 의한 재생의 증거를 위해, 표면 표현형 및 CFU 검사로 분석하였다. 재생은 키메라 형상 및 면역 관용도를 형성하기 때문에, 조혈세포는 덜 심각하게 타협된 면역계, 예컨대 (증가된 엄격성의 순서로) 조사된 NOD/SCID 마우스, 통상적인 SCID 마우스, 누드 마우스 및 면역 적합성 마우스에서 검사될 수 있다.

조혈능에 대해서 다른 동물모델에서 추가적인 예비임상 연구가 수행될 수 있다. 적당하게 큰 동물 이종이식 모델에는, 골수 조건화 없이 조혈 줄기세포 이식을 가능하게 하는 태아 면역 미성숙 및 태아 골수에서의 발생 공간의 이점을 갖는 양이 있다. 이는 조사, 화학요법 또는 유전적으로 결핍된 마우스에 관련된 가능한 기질 비정상을 피한다. 이 동물 모델에서, 인간 줄기 세포는 콜로니를 형성하고, 여러해 동안 골수에서 영향이 남아 있어, 복수계통 분화를 가능하게 하고, 인간 시토카인에 대한 반응성을 보여주며, 2차 수용자로의 이식능을 유지한다 (Zanjani 등, Int. J. Hemato. 63: 179, 1996 ; 및 Zanjani 등, J. Clin. Invest. Med. 93: 1051, 1994 참조). 영장류 모델은 C. E. Dunbar, J. Intern. Med. 249: 329, 2001 및 Donahue 등, Hum. Gene Ther. 12: 607, 2001 에 제공된다. 또한, 본 발명의 세포 집단은, 매칭된 비-인간 pPS 세포 제제를 사용하여 조혈 세포로 분화시킴으로써, 비-인간 영장류에서 시험될 수 있다 (Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844,1995 ; 및 Thomson 등, Biol. Reprod. 55: 254, 1996 참조).

조혈세포의 유전적 변형

본 발명의 조혈세포는 실질적인 증식능을 갖는다. 목적하는 경우, 세포에서 텔로머라아제 역전사효소 (TERT) 의 수준을 증가시키는 것에 의해, 내재적 유전로부터의 전사를 증가시키거나 트랜스진을 도입하는 것에 의해서, 복제능을 추가로 강화시킬 수 있다. 국제특허출원 WO 98/14592 에서 제공되는 인간 텔로머라아제 (hTERT) 의 촉매 성분이 특히 적합하다. 인간 세포에서 텔로머라아제의 형질감염 및 발현은 Bodnar 등, Science 279: 349, 1998 및 Jiang 등, Nat. Genet. 21: 111, 1999 에 기재되어 있다. 유전적으로 변경된 세포는 RT-PCR 에 의한 hTERT 발현, 텔로머라아제 활성 (TRAP 검사), hTERT 에 대한 면역세포화학적 염색, 또는 복제능에 대해 표준 방법에 따라 평가될 수 있다. myc, SV40 거대 T 항원 또는 MOT-2 를 코딩하는 DNA 로 세포를 형질전환하는 것 (USP 5,869,243, 국제특허출원 WO 97/32972 및 WO 01/23555) 과 같은 세포를 불사화하는 다른 방법이 또한 고려된다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 세포 집단은 미분화 pPS 세포가 현저하게 없다. 목적하는 경우, 시험관내에서 미분화 세포를 제거하거나, 생체내에서 귀선유전체 (revertant) 에 대해 보호하도록 세포를 제조하거나 추가로 처리할 수 있다. 상기 집단으로부터 미분화 줄기 세포를 고갈시키는 하나의 방법은, 미분화 세포에서 편향적인 발현을 유도하는 프로모터, 예컨대 TERT 프로모터 또는 OCT-4 프로모터의 조절하에 효과자 유전자가 존재하는 벡터로 상기 집단을 형질감염시키는 것이다. 상기 효과자 유전자는 세포 분류를 유도하는 리포터, 예컨대 녹색 형광 단백질일 수 있다. 상기 효과자는, 예를 들어 독소 또는 아폽토시스 매개자, 예컨대 카스파아제 (Shinoura 등, Cancer Gene Ther. 7: 739, 2000) 를 코딩하여, 세포에 직접적으로 용해성일 수 있다. 상기 효과자 유전자는 외부 작용제 (예컨대, 항체 또는 프로드럭)의 독성 효과에 대해 세포가 감수성이 되도록 하는 효과를 가질 수 있다. 예에는, 발현하는 세포가 간시클로비르에 감수성이 되도록 유도하는 헤르페스 단순 티미딘 키나아제 (tk) 유전자가 있다 (WO 02/42445). 다르게는, 상기 효과자는, 미분화 표현형으로 귀선유전하는 임의의 세포가 생체내에서 천연존재 항체에 대해 감수성이 되도록 하는 외래 항원결정기의 표면 발현을 초래할 수 있다 (GB 0128409.0).

또한, 본 발명의 세포는, 조직 재생에 관련되어 있거나 치료될 대상체에 치료 유전자를 전달하는 능력을 강화시키기 위해서, 유전적으로 변경될 수 있다. 벡터는, 목적 유전자에 대한 공지의 코딩 서열을 이용하여 고안되고, 조혈 세포에서 본래 활성이거나 특이적으로 활성인 프로모터에 조작가능하게 연결된다. 유전자에서 트랜스진의 사용은 하기에 기술한다.

조혈 전구체 세포 및 이들의 유도체의 사용

본 발명은 많은 수의 조혈 전구체 세포, 및 적혈구, 과립구, 단구, 거핵구 및 림프구 계통의 조혈 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 세포 집단은, 수많은 연구, 개발 및 상업적 목적을 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 세포는, 다른 계통 유래의 세포에서 편향적으로 발현되는 cDNA 에 상대적으로 오염되지 않은 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 분화된 세포는 표준 방법에 따라 조혈 전구체 및 이들의 유도체의 마커에 대해 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

약물 개발, 조혈 병리학의 임상적 치료, 및 이식 치료의 다른 유형에 관련하여 선별적인 면역관용의 유도를 위한, 본 발명의 조성물의 용도가 특히 목적된다.

약물 스크리닝

본 발명의 조혈세포는, 조혈 전구체 세포 및 이들의 각종 자손세포의 특징에 영향을 미치는 인자 (예컨대, 용매, 소형 분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경적 조건 (예컨대, 배양 조건 또는 조작법) 에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

일부 적용에 있어서, pPS 세포 (미분화 또는 분화) 는 조혈세포로의 성숙화를 촉진하거나, 장시간 배양에서 이러한 세포의 증식 및 유지를 촉진하는 인자를 스크리닝하기 위해 사용된다. 예를 들어, 후보 성숙인자 또는 성장인자는, 상이한 웰에서 이들을 세포에 첨가한 다음, 추가적인 배양을 위해 요구되는 기준 및 사용되는 세포에 따라, 생성되는 임의의 표현형적 변화를 결정하는 것에 의해 시험된다.

본 발명의 다른 스크리닝 적용은, 조혈세포 성장, 발생 또는 독성에 대한 잠재적인 효과를 위한 약학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 화합물은 조혈세포에 대한 약리학적 효과를 갖도록 고안되었기 때문에, 또는 화합물은 효과를 갖는 것외에 조혈계 상에 목적하지 않는 부작용을 가질 수 있기 때문에, 스크리닝이 수행될수 있다.

일반적으로, 표준교과서In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997, 및 USP 5,030,015 이 참조된다. 후보 약학적 화합물의 활성 평가는, 일반적으로 본 발명의 분화 세포와 후보 화합물을 단독으로 또는 기타 약물과의 조합으로 결합하는 것을 포함한다. 조사자는, 형태, 마커 표현형, 또는 화합물에 기인한 세포의 기능적 활성 (비처리 세포 또는 비활성 화합물로 처리된 세포와 비교) 에 있어서의 임의의 변화를 결정한 다음, 관찰된 변화와 화합물의 효과를 상관짓는다.

세포독성은, 우선 예를 들어, 세포 생존능력, 생존, 형태, 및 특정 마커 및 수용체의 발현에 대한 효과에서 의해서 결정될 수 있다. 크로모좀 DNA 에 대한 약물의 효과는, DNA 합성 또는 복구의 측정에 의해서 결정될 수 있다. 특히 세포 주기에서 계획되지 않은 시점에서의 또는 세포 복제에 요구되는 수준을 초과하는 [³H]티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치않는 효과는 또한, 중기 확산에 의해 측정된 딸 크로마티드 교환의 보통이 아닌 속도를 포함한다. 추가적인이해를 위해서, A. Vickers (pp 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997) 가 참조된다.

세포 기능의 효과는, 조혈세포의 표현형 또는 활성을 관찰하기 위한 임의의 표준 검사를 사용하여 평가될 수 있다. 표현형적 마커, 및 약물 노출로부터 초래되는 각종 표현형의 균형에 있어서의 변화의 분석이 포함된다. 또한, 상기 기재된 콜로니 형성 검사 및 재구성 검사가 포함된다.

조혈 재구성

본 발명은 또한, 상기 치료가 필요한 환자에서 조혈 기능을 저장하기 위한 조혈 전구체 세포 또는 이들의 유도체의 용도를 제공한다.

조혈 전구체 세포 집단 및 유도체 집단은, 급성 또는 만성 조혈 기능부전의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 병상은, 적혈구계, 과립구, 대식세포, 거핵구 또는 림프구 세포 계통의 유전 또는 후천적 유전자 결핍, 빈혈증(anemia) 또는 면역 결핍을 유발하는 불충분한 조혈능, 또는 조혈 독성을 포함한다. 예로는, 겸형 세포 빈혈증, 재생 불능 빈혈증, 골수이형성 증후군, 조사에의 사고 노출, 및 낭창과 같은 생명위협 자가면역질환이 있다.

백혈병, 림프종 및 특정 화합요법 민감성 및 전이활성 고형 종양, 예컨대 미엘로마 및 유방암 등의 암 치료가 특히 관심있다. 환자에게, 골수제거 조사 (1200 cGy), 또는 시클로포스파미드, 티오테파 또는 에토포시드와 같은 약제를 이용한 화학요법을 수행한 다음, 본 발명의 조혈세포를 이용하여 재구성한다. 많은 수의 상기 세포를 사전에 성장시키는 능력은, 자가유래 골수 이식의 시간적 제약을 덜고,자가유래 세포 제제에서 자가유래 잔류 종양세포에 의한 악성종양의 재도입 위험을 제거한다.

치료할 환자의 조직적합 유형과 투여될 세포의 조직적합 유형을 매치시키는 것은 언제나 이로울 수 있다. 동일한 매치, 또는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 좌위에서 매치된 세포가 최적이다. pPS 세포 유래 조혈 선조세포, 특히 HLA 대립유전자가 동일한 세포의 커다란 은행의 이용성은 매치를 용이하게 한다. 정확한 매치가 이용가능하지 않다면, 하나 또는 두 개의 클래스 I 또는 클래스 II 좌위에서의 매치가 도움이 될 것이다. 이러한 일부 상황에서, 세포의 추가적인 조작 (예컨대, (예를 들어, CD2, CD3 또는 CD4 에 대한 항체를 이용한) 투여되는 집단으로부터 T 세포의 고갈화) 은 숙주이식거부 (graft-versus-host) 질환 (GVHD) 을 최소화하는데 도움이 될 수 있다.

조혈세포는, 전형적으로는, 투여를 위해 무균 등장 완충액 중의 농축된 세포 현탁액으로서 제조된다. 냉장 또는 저온보관 줄기세포의 백(bag) 을 상온으로 해빙하고, 중심 정맥 카테터(catheter) 를 통해 20 내지 50 ㎖ 분액으로 주입된다. 매우 대략적으로는, kg 당 3.5 ×10⁶분량의 CD3 양성 세포가 적절할 수 있고, 이는 CFU 검사 치상 효율성에 의존한다. 골수제거 후, 호중구 계수는, 10,000/㎕ 미만의 수혈-의존성 혈소판감소와 함께, 100 세포수/㎕ 미만으로 감소시킬 수 있고, 환자는 혈소판 및 매치된 적혈구로 지지된다. 합체 (engraft) 는 우선 혈액 및 초기 조혈 재구성에서 호중구의 관찰에 의해 두드러진 약 7 내지 21 일째에 나타난다.일단 합체가 확립되면, 조혈 재구성이 신속하고, 적절한 호중구 (1000/㎕) 및 혈소판 (20,000/㎕) 이 14 일 내지 28일째에 발생한다. G-CSF 및 GM-CSF 와 같은 성장인자는 치료를 증대시킬 수 있다.

임상 의학에서 조혈 세포 및 이의 전구체의 사용을 위한 일반적인 접근법은, 표준 교과서, 예컨대 Textbook of Internal Medicine, 3^rdEdition, W. N. Kelleyed., Lippincott-Raven, 1997 ; 및 Hematopoietic Stem Cell Transplantation, A. D. Ho 등 저, Marcel Dekker, 2000; Hematopoietic Cell Transplantation E. D. Thomas 등 저, Blackwell Science Inc, 1999; Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000 과 같은 구체적화된 참조문헌에 제공된다.

임상 치료에서 조혈 줄기세포의 사용은 발전하는 분야이고, 다른 사용은 임상적 실제에 발생할 것이다. 항상, 본 발명의 세포의 사용 및 분량에 대한 궁극적인 책임은, 담당 의사의 책임이다.

유전자 치료

본 발명의 세포는 조혈 기능을 재구성하기 위해서 뿐만 아니라, 유전자 치료에서 다루어지는 임의의 다른 결핍을 보정하거나 보충하기 위해서도 사용될 수 있다. 조혈세포는 유전자 발현을 위한 저장소로서 특정한 하기의 이점을 갖는다: 이들은 몸 전체를 순환하고, 진행 저부 상에서 재생한다. 세포는 유전적으로 변형되고, 투여전에 시험관내에서 시험되어, 환자로의 유전자의 불특정한 투여를 피하도록 한다.

본 발명에 따른 유전자 치료를 수행하기 위해서, 세포는, 본래의 또는 조혈세포 특이적 프로모터의 제어하에 안정한 변형을 생성하는 기술 (예컨대, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터) 을 사용하여 치료제를 코딩하는 영역을 포함하는 트랜스진을 이용하거나, 상동성 재조합에 의해서 변형된다. 상기 변형은 조혈세포의 증식배양 상에서 수행될 수 있다. 다르게는, 상기 변형은, 미분화인 pPS 세포를 분화 패러다임에 적용하면서 수행될 수 있다. 이어서, 상기 세포는 조혈기능 및 트랜스진의 발현에 대해 평가된다.

적절한 시험 후, 이어서 세포를 유전자 치료를 필요로 하는 환자에게 투여한 다음, 결핍 보정에 대해서 생화학 및 임상적으로 모니터링될 수 있다. 조성물은 치료할 환자에 적합한 HLA 를 갖지만, 환자 자신의 세포의 혼합 집단 및 유전적으로 변형된 세포가 치료제 유전자의 발현을 위한 충분한 저장소를 제공하다면, 치료 전에 골수제거를 필요로 하지 않을 수 있다.

자궁내 유전자 치료에 대한 신규한 표적으로서 조혈줄기세포의 상세한 설명에 대해서는 Murdoch 등 (FASEB J. 15: 1628,2001) 참조. 일반적인 참조문헌에는, Stem Cell Biology and Gene Therapyby P. J. Quesenberry 등 저, John Wiley & Sons, 1998; 및 Blood Cell Biochemistrytherapy: Hematopoiesis and Gene Therapy (Blood Cell Biochemistry, Vol. 8), L. J. Fairbairn & N. G. Testa 저, Kluwer Academic Publishers, 1999 가 포함된다. 상기 참조문헌은 유전자를 위한 운반체; 유전자 치료를 위한 전달계, 및 예시적인 임상 적용으로서 줄기세포의 치료적 잠재성에 대한 논의를 제공한다.

재생 의약에서 특이적 면역관용을 유도하기 위한 세포조합

본 발명의 세포는 또한, 환자에 매치되지 않은 동종이계 이식편의 이식을 위한 제제에 있어서, 특정한 조직 유형에 대한 면역관용을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 관용화 세포는 동종이계 이식편과 조직적합성 마커를 공유하도록 선택되고, 환자에게 필요한 세포 기능을 제생하는 세포유형을 이용한 치료 전에 또는 치료 동안에 환자에게 투여된다. 이어서, 생성된 면역관용은 동종이계 이식편의 급성 또는 만성 거부의 위험을 감소시킨다.

효과적인 세포 조합은 하기의 두 가지 성분을 포함한다: 면역관용을 유도하기 위한 제 1 세포 유형; 및 필요한 기능을 재생하는 제 2 세포 유형. 각종 임상적으로 유용한 세포 형태는, 재생 의약 목적을 위해 pPS 세포 및 그외의 공급원으로부터 유도될 수 있다.

예시하자면, 신경 세포는 국제특허출원 WO 01/88104 및 출원 PCT/US02/19477 (Geron Corporation) 에 기재된 방법에 따라 pPS 세포로부터 생성될 수 있다. 미분화 pPS 세포 또는 배양체 세포는 하나 이상의 뉴로트로핀 및 하나 이상의 마이토젠을 함유하는 배지 중에서 배양하여, 약 60% 이상의 세포가 A2B5, 폴리시알릴화 NCAM 또는 Nestin 을 발현하고, 배양에서 약 20 회 이상 배가될 수 있는 세포집단을 생성한다. 마이토젠의 예에는, EGF, 기저 FGF, PDGF 및 IGF-1 이 있다. 뉴로트로핀의 예에는, NT-3 및 BDNF 가 있다. 이어서, 증식 세포는, 마이토젠의 부재하에 뉴로트로핀과 함께 배양함으로써 말단 분화를 수행하기 위해 유도될 수 있다.도파민성 뉴론의 특징인 티로신 히드록실라아제 양성 세포를 고비율로 함유하는 세포 집단이 생성될 수 있다.

희돌기세포는, FGF 와 같은 마이토젠, 및 트리요오도티로닌, 셀레늄 및 레티노산과 같은 희돌기세포 분화인자를 함유하는 배지 중에서 현탁된 세포 응집체로서 이들을 배양하는 것에 의해서 pPS 세포로부터 생성될 수 있다. 이어서, 상기 세포를 고체 표면 상에 치상하고, 레티노산을 제거하고, 집단을 확장시킨다. 최종 분화는, 폴리-L-리신 상에 치상하고 모든 성장인자를 제거하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 90% 초과의 세포가 GalC 양성인 집단이 수득될 수 있다.

간세포는, USP 6,458,589 및 PCT 공보 WO 01/81549 (Geron Corporation) 에 기재된 방법에 따라 pPS 세포로부터 생성될 수 있다. 미분화 pPS 세포는 히스톤 데아세틸라아제 억제제의 존재하에 배양된다. 예시적인 방법으로, 분화를 1% DMSO (4 일), 및 이어서 2.5 mM 의 히스톤 데아세틸라아제 억제제 n-부티레이트로 개시시킨다. 수득된 세포를, n-부티레이트, DMSO, 및 EGF 와 같은 성장인자, 간세포 성장인자, 및 TFG-α를 함유하는 간세포 배양배지에서 4 일간 배양하는 것에 의해서 성숙시킨다.

심근세포 또는 심근세포 전구체는 PCT/US02/22245 에 제공된 방법에 따라 pPS 세포로부터 생성될 수 있다. 상기 세포는 DNA-메틸화에 영향을 미치는 심장작용 인자, 예컨대 5-아자시티딘을 포함하는 성장 환경 중에서 배양된다. 이어서, 자발적으로 수축하는 세포는 집단 중의 다른 세포로부터 밀도 원심분리에 의해서 분리될 수 있다. 추가적인 방법의 단계로, 크레아틴, 카르니틴 또는 타우린을 함유하는 배지 중에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

골아세포 및 이의 선조세포는, PCT/US02/20998 에 기재된 방법에 따라 pPS 세포로부터 생성될 수 있다. pPS 유래 간엽 세포는, 골생성 인자, 예컨대 골형태형성 단백질 (특히, BMP-4), 인간 TGF-β수용체에 대한 리간드, 또는 인간 비타민 D 수용체에 대한 리간드를 함유하는 배지중에서 분화될 수 있다. 인슐린 또는 다른 췌장 호르몬을 분비하는 세포는, 액티빈 A, 니코틴아미드, 및 미국특허출원 60/338,885 에 나열된 다른 인자와 같은 인자 중에서 pPS 세포 또는 이의 유도체를 배양하는 것에 의해서 생성될 수 있다. 연골세포 또는 이들의 선조세포는, 미국특허출원 60/339,043 에 나열된 분화 인자의 효과적인 조합을 이용하여 미세응집체 중에서 pPS 세포를 배양하는 것에 의해서 생성될 수 있다.

동종이계 수용자로 이식되는 임의의 상기 분화세포에 대한 관용성을 유도하기 위해서, 환자는 "관용화" 세포 (주입 부위에서의 백혈구의 침투, 항체 또는 MLR 활성의 유도, 또는 동종이계 이식편 세포의 증가된 생존 시간에 의해서 측정하였 때, 동종이계 이식편 세포에 대한 낮은 염증반응 또는 면역반응을 초래하는 세포 집단) 로 예비처리되거나 동시 처리된다. 목적은 동종이형-특이적 관용을 촉진하는 것이지만, 관용화 세포로 동종이계 이식편 세포에 "MHC 적합성" 인 것이 선택된다. 이는, 최소한, 관용화 세포가 동종이계 이식편 세포와 공유하는 A, B 또는 C 좌위에서 하나 이상의 MHC 클래스 I 반수체형(haplotype) 을 갖는 것을 의미한다. 관용화 세포가 하나 또는 둘의 동종이계 이식편의 A 반수체형 및/또는 B 반수체형을 갖는 매치가 매우 바람직하다. 정확한 매치가 되지 않는다면, 상이한 세포주로부터의 MHC 적합성 세포의 혼합물을 생성하는 것에 의해서 동종이계 이식편 집단의 복수의 반수체형을 포함하도록 관용화 집단이 제조될 수 있다. 또한, 동일한 pPS 세포주로부터 모든 양 세포집단을 유도하는 것에 의해서, 동종이식편 세포에 관용화 세포를 정확하게 일치시키는 것이 또한 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에 의하면, 관용화 세포는, 상기한 바와 같이 수득되고 하나 이상의 특징적인 표현형적 또는 기능적 특성을 갖는, pPS 유래의 조혈세포이다. 면역조절 T 세포, 수상세포 및 이의 전구체, 또는 투여시 면역학적 키메라 현상을 형성할 수 있는 세포를 포함하거나 상승시킬 수 있는 조혈세포 집단이 목적된다. 다른 구현예에 의하면, 면역관용을 유도하기 위해 사용되는 세포 (또는 이의 부분)은 여전히 미분화 pPS 세포의 특징을 갖는다. 실시예 6-8 에서 보여진 바와 같이, 미분화 pPS 세포는 종종 실질적인 MHC 클래스 II 항원이 없는 것으로 나타난다. 이들은 염증반응, 및 동종이계 및 이종성 면역 반응 (그 자체에 대한 면역반응, 및 제 3 의 자극자 세포에 대한 면역반응) 모두를 활발하게 억제한다.

특정한 상황하에서, 미분화 pPS 세포 또는 초기 선조세포는 투여후 제어되지 않은 방식으로 성장되거나 분화되어, 악성종양 또는 원치않는 과형성증을 상승시키는 것에 대한 문제가 존재한다. 이러한 문제를 다루기 위한 각종 선택사항이 존재한다. 하나의 접근법은, 프로드럭 간시클로비르가 세포에 독성이 되도록 하는 자살 유전자 (예컨대, 티미딘 키나아제) 를 미분화세포에 장착하는 것이다 (WO 02/42445). 관용 유도 후, 미분화 pPS 세포는 이어서 프로드럭 투여에 의해 대상체로부터 추려질 수 있다. 또다른 접근법은, 생체내에서는 더 이상 증식할 수는없지만 면역억제에 요구되는 활성은 여전히 수행할 수 있는 정도로 미분화 pPS 세포를 불활성화시키는 것이다 (실시예 7 및 8). 미분화 pPS 세포는, 조사 (약 1000 내지 3000 rad) 에 의해서, 또는 마이토마이신 c 또는 일부 다른 불활성화 화학요법제, 가교제 또는 알킬화제로 처리하는 것에 의해서 세포 분할을 억제하거나 방지하도록 사전에 불활성화시킬 수 있다.

이 섹션에 기재된 세포 조합은 재생 의약에서 중요한 신규한 계를 제공한다. 국제특허공보 WO 02/44343 은, 관용화 프로토콜의 생존성 및 이후의 조직 재생의 평가를 위한 각종 설치류 및 비인간 영장류 모델을 제공한다.

인간 대상체의 치료는, 제 2 세포 집단에 대한 관용을 유도하는 방식으로 제 1 세포 집단을 투여하는 것에 의해서 진행된다. 국부 염증를 완화시키기 위한 보조제로서, 관용화 세포는 재생 동종이계 이식편을 투여하는 동일한 부위에 투여될 수 있다. 다르게는, 조혈 키메라 현상을 생성하기 위한 보조제로서, 관용화 세포는 전신적으로 투여될 수 있다. 관용 유도는, 자극자로서 동종이계 이식편의 세포를 사용하여, 한 단계 혼합 림프구 반응에서 환자의 혈액 림프구를 시험하는 것에 의해서 결정될 수 있다 (실시예 7). 성공적인 관용 유도는, 증식 반응 감소에 의해 증명될 수 있다. 수용자의 조혈 키메라 현상은 조혈 표면 마커와 함께, HLA 유형에 대한 순환 단구를 평가하는 것에 의해 평가할 수 있다.

환자는, 동시에 또는 순차적으로 적합성 뉴론, 희돌기세포, 간세포, 심근세포, 간엽 세포, 조골세포, 호르몬 분비 세포, 연골세포, 조혈세포, 또는 병상을 치료하기 위한 기타 다른 세포 유형이 투여된다. 절차 후, 이들은 필수적인 양의 부양 보호를 받고, 적절한 생화학적 마커 및 개선된 기능에 대한 임상적 기준에 의해 모니터링된다.

본 명세서에 기재된 임의의 치료 목적을 위해서, 본 발명의 조혈 또는 면역관용화 세포는, 전형적으로는, 인간 투여를 위해 충분히 무균 상태하에서 제조된 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 공급된다. 효과적인 세포 조합이 개별적으로, 또는 키트 형태로 개별 용기 중에 포장되어 분배되거나, (동일 부위에 동시 투여하기 위해서) 이들은 함께 혼합될 수 있다. 본 발명은 또한, 제조, 분배 또는 사용 동안에 임의의 시점에서 존재하는 세포의 세트를 포함한다. 상기 세포 세트는, 본 명세서에 기재된 둘 이상의 세포 집단의 임의의 조합, 예를 들면, 한정되지는 않지만, 종종 동일한 게놈 또는 MHC 반수체형을 공유하는 미분화 pPS 세포 또는 기타 분화 세포 형태와 조합된 분화 pPS 세포의 형태 (조혈세포, 신경 세포 등)를 포함한다. 상기 세트에서 각각의 세포 형태는, 동일한 함유물 또는 업무 관련성을 공유하는 상이한 함유물의 제어하에, 함께, 또는 동일한 장비 중 개별적인 용기 중에서, 또는 상이한 위치에서 포장될 수 있다.

세포 조성물의 제형화에 있어 일반적인 원칙에 대해서는, Cell Therapy : Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan 저, Cambridge University Press, 1996 가 참조된다. 약리학적 분배 및 사용을 의도하는 조성물 및 조합물은, 요구되는 목적, 예컨대 조혈 기능의 재구성, 유전자 치료 또는 면역관용의 유도에 대해 적혀진 지침과 함께 임의로 포장된다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예의 비제한적인 추가의 설명으로써 제공된다.

실시예 1: 배아 줄기세포의 피더 없는 증식

미분화 인간 배아 줄기 (hES) 세포의 확립된 세포주를 피더세포가 실질적으로 없는 배양 환경 중에서 유지시켰다.

표준 절차 (WO 01/51616) 에 따라 단리된 1차 마우스 배아 섬유아세포 (mEF) 를 사용하여 조건화 배지를 사전에 제조하였다.

hES 배양물을 Matrigel피복된 플레이트 상에서 계대하였다. 접종 약 1 주일 후, 배양물은 컨플루언트하게 되었고, 계대될 수 있었다. 180 일 초과 동안 이러한 조건하에서 유지된 배양을 지속함으로써, ES-유사 형태를 나타내었다. SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 알칼리성 포스파타아제는, 면역조직화학법으로 평가하였을 때, hES 콜로니에 의해서는 발현되었지만, 상기 콜로니중 분화 세포에서는 발현되지 않았다. 특정한 세포 형태를 제조하기 위한 확립된 프로토콜을 수행하는 것에 의해서, 분화다능성이 확인되었다.

실시예 2: 미분화 hES 세포 배양에서 조혈 표현형의 결여

H1 hES 세포주의 미분화 세포는 유세포분석 및 콜로니 형성 (CFU) 검사에 의해서 분석하여, 조혈 세포의 임의의 특징이 미분화 상태에서 존재하는지를 결정하였다.

상온에서 10 분 동안 트립신-EDTA (1% 트립신, 2% EDTA; Gibco) 를 사용하거나, 37℃ 에서 10 분 동안 세포 해리 완충액 (CDB) 를 사용하여 (EDTA 및 다량 염, Gibco), 피더없는 배양물로부터 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 회전 침전시키고, 10% FCS 를 함유하는 IMDM (이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지) 중에 재현탁한 다음, 85 ㎛ 나이론 메쉬를 통해 여과하였다. 이들을 3% FCS 를 함유하는 200 ㎕ PBS 중에 재현탁하고, 2 ㎕ 의 항체와 함께 15 분 동안 상온에서 배양하였다. 세포를 2회 세척한 다음, 15 ㎕/㎖ 의 7AAD (Immunotech) 로 상온에서 15 분 동안 염색하였다.

도 1은 그 결과를 나타낸다. 생존 세포 (7AAD 음성으로 게이팅됨; 패널 i) 는 크기에 의해 추가로 게이팅하여 (ii), 미분화 ES 세포 집단에서 조혈세포 표면 마커의 발현을 분석하였다 (iii-vi). 150 미만의 전방 산란 특성을 갖는 사건은 배지 제어에 기초하여 배재하였다. 세포 백분율은, 각각의 플롯의 상부에 나타낸 독립적인 실험의 수 (n) 에 기초하여, 평균 ±SEM 으로서 표현하였다.

미분화 H1 (A, B) 및 H9 세포 (C, D) 는, 각각의 이소타입 대조군 (삽입도) 에 기초한 사분원을 사용하여, 각종 인간 조혈 마커의 발현에 대해 분석되었다 (iii-vi). 어떠한 세포도 인간 조혈 마커 CD45 를 발현하지 않았고, 단지 1.2% 만이 CD45 양성 (원시 인간 조혈 세포의 마커; 패널 iii)이었다. 상기 세포는 하기를 포함하는 다른 원시 조혈 마커의 발현에 대해 분석되었다: c-Kit (iv), CD38 (v) 및 AC133 (v). CD38 은 실제로 존재하지 않았지만, 22-33% 는 c-Kit 양성이었고, 13-52% 는 AC133 양성이었다. 12-38% 는 MHC 클래스 I 항원 (HLA-A, B 및 C) 를 발현하였다 (vi).

CFU 검사는 하기와 같이 수행되었다. 미분화 hES 세포를 회수하고, 2 ×10⁵의 트립판 블루 음성 세포를, 50 ng/㎖ 의 SCF, 10 ng/㎖ 의 GM-CSF (Novartis), 10 ng/㎖ 의 IL-3 (Novartis) 및 3 U/㎖ 의 EPO (Amgen) 을 함유하는 Methocult^TMH4230 메틸셀룰로오스 (StemCell Technologies Inc., Vancouver BC) 로 치상하였다. 성장인자 칵테일에 25 ng/㎖ 의 BMP-4 및 300 ng/㎖ 의 Flt-3 을 첨가하는 것은, 미분화 hES 세포주로부터 조혈 콜로니형성 선조세포의 검출을 강화시키지 못하였다. 배양물을 가습 대기하에서 5% CO₂로 37℃ 에서 배양하였고, 40 일까지 콜로니의 발생에 대해서 모니터링하였다. 콜로니 아형은, 이들의 형태적 특성, 및 (적혈구계 계통의 경우에) 헤모글로빈화를 나타내는 붉은색에 의해서 구별되었다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

미분화 hES 세포의 CFU 잠재성
hES 세포주	CFU 에 대한 양성인 웰	CFU 갯수	CFU 아형
H9 (n = 3)	1/6 ( = 16.6%)	3	적혈구계
H1 (n = 4)	0/9 ( = 0%)	0	없음

H1 세포주의 미분화 hES 세포는 4 번의 개별적인 실험, 9 개의 개별적인 웰에서 조혈 콜로니를 생성하지 못하였다. 3 개의 소형 적혈구계 콜로니가 형성된 한 번의 실험을 제외하고는, 유사한 결과가 미분화 H9 세포에 대해서도 수득되었다.

실시예 3: 조혈 분화 인자와 함께 배양된 hES 세포에서의 조혈 표현형

본 실험에서, hES 세포의 H9 세포주는 조혈 선조세포로 분화시켰고, 표현형을 유세포분석에 의해서 평가하였다.

세포 축적이 형성될 때까지 파스퇴르 피펫을 이용하여 컨플루언트 6웰 플레이트의 직경을 좌우로 움직여서, hES 세포의 스트립을 형성하였다. 각각의 스트립을 비조건화 배지 (20% FCS 를 함유하는 KO DMEM) 중에 현탁하고, 10 일 동안 배양하였다. 이때, 배양물은 둥근볼의 세포를 포함하였고, 이후의 실시예에서 배양체로서 언급하였다. 형태학적 기준 및 트립판 블루 염색에 의해서 평가하였을 때, 많은 세포가 비생존성이었다.

배양체 세포를 흡착 조직 배양 디쉬 또는 피브로넥틴 피복된 디쉬로 회수, 분산 및 접종하였다. 배양배지는 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 및 하기의 재조합 인간 성장인자를 보충한 BIT 배지 (BSA, 인슐린 및 트랜스페린; StemCell Technologies, Vancouver BC) 였다: 300 ng/㎖ 의 줄기세포인자 (SCF, Amgen), 300 ng/㎖ 의 Flt-3 리간드 (Flt-3L, R&D Systems, Minneapolis MN), 50 ng/㎖ 의 G-CSF (Amgen), 10 ng/㎖ 의 IL-3 (Novartis, Dorval QC) 및 10 ng/㎖ 의 IL-6 (R&D Systems). 분화 후, H9 세포를 조혈 세포 표면 마커의 발현에 대해 유세포분석을 통해 평가하였다.

도 2는, 미분화 hES 세포 및 이의 유도체 상에서 검출되는 세포 표면 마커를 비교한다. 유세포 분석 데이터를 적절하게 평가하기 위해 사용되는 게이팅 전략은, 150 미만인 전방 산란 특성에 의해 정의된 잔해물의 배재 (패널 A i), 사멸되고 생존성 염색 7AAD 를 사용하여 염색되는 세포의 배재를 포함하였고, 상기 염색에 대한 양성은 이소타입 대조군 (삽입도) 에 따라 사분원을 정의하는 것에 의해배제되는 세포 (패널 A ii) 를 정의한다. 백분율은 이소타입 대조군의 염색에 대해 보정하였다. 미분화 세포는 CD45 를 갖지 않고, 0.1% 의 세포만이 Cd34 양성이었다 (패널 A iv). 35% 의 미분화 H9 세포는 AC133 을 발현하였다 (패널 A v). 골수로부터 단리된 AC133 양성 및 CD34 음성인 원시 조혈세포는, 면역결핍 마우스를 재생시킬 수 있었다.

BMP-4 의 부재 (패널 B) 또는 존재 (패널 C) 하에, SF + HGF 와 함께 배양하는 것에 의해서 분화된 세포의 분석은 하기와 같다. 분화 후, 0.9% 의 세포에서 CD45 의 발현이 있었고, 원시 표면 마커 CD34 는 0.1% 에서 1.5% 로 증가하였다 (패널 B iv). 양 마커 모두를 발현하는 세포는 없었다. AC133 양성 세포는 35% 에서 14% 로 감소하였다 (패널 B v). 이들 무혈청 배양물에 BMP-4 를 포함시키는 것은, 미분화 hES 세포와 유사하게, CD45 양성 세포 (0.3%) 및 CD34 양성 세포 (0.2%) 의 비율을 갖는 세포를 생성하였다. 그러나, BMP-4 의 존재하에서의 분화는, 다시 AC133 의 발현을 감소시켰다 (10%; 패널 C iv).

실시예 4: 분화 hES 세포에 의한 조혈 콜로니 형성

도 3은 hES 세포의 H1 세포주로부터 분화된 세포의 조혈능을 평가하기 위한 도식을 나타낸다. 분화는 통상적인 밀도의 절반으로 배양된 mEF 로부터 제조된 조건화 배지 중에서 3회 계대하는 것에 의해서 개시되었다. 이어서, 세포의 스트립을 KO DMEM + 20% FCS 중에서 배양하여, 전술한 바와 같이 배양체를 형성하였다. 이때, 웰의 전체 함유물 (배양체 세포 및 사멸 세포 모두 포함)을 회수하거나, 개별적인 배양체를 단리하여 사멸 세포를 피하였다. 회수된 세포를 CFU 검사에 의해평가하였다 (BMP-4 의 존재 또는 부재하에서 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행하였고, 효과는 거의 관찰되지 않았다). 이어서, CFU 검사로부터의 세포를 표면 표현형에 대한 유세포분석으로 평가하였다.

도 4는 그 결과를 나타낸다. 상부 왼쪽 코너의 현미경사진은 CFU 검사에서 전형적인 배양 웰의 외관을 나타낸다 (100배 배율). 이 배양물은, 대량 증식될 수 있는 세포, 및 대식세포, 과립구 및 적혈구계 형태의 선조세포를 추론시키는 각종 형태학적 특징을 포함하였다. 소형의 어두운 패치는 검사 배양물에서 사멸 세포이다. 타원형은 적혈구계 세포를 나타내는 헤모글로빈화 (적색) 를 증명하는 세포의 클러스터를 나타낸다.

CFU 배양물이 모아졌고, 글리코포린 A (적혈구 전구체를 나타냄); CD45 (조혈세포를 나타냄); CD34, CD38 및 AC133 (모두 원시 인간 조혈세포를 나타냄); 및 CD19 (B 림프구를 나타냄) 에 대한 1차 항체를 사용하여 염색하였다. CD45 에 대한 양성 염색 (83-86%) 은 조혈 세포의 존재를 확인시켰다 (패널 A i 및 ii). 글리코포린 A 에 대한 양성 염색 (4%) 은 적혈구계 세포의 존재를 확인시켰다 (패널 A i). 예상한 바와 같이, 글리코포린 A 양성 세포는 CD45 에 대해 염색되지 않았다. 0.7% 만이 CD34 양성이었고 0.2% 만이 AC133 양성이었기 때문에, 초기 조혈 선조세포는 낮은 백분율로 상기 배양물을 구성하였다. CFU 배양물은 CD19 양성 세포 (B 림프구) 가 없었고, 낮은 백분율의 CD33 양성 세포 (0.9%) 가 있었다. CD33 은 미엘로이드 경로에서 초기 세포에 대한 마커로, 림프구 계통으로부터 구별된다. CFU 검사는 미엘로이드 선조세포의 형성에 관한 것이기 때문에, 림프구 세포가 관찰되지 않는 것은 놀라운 것이 아니다.

검사 배양물에서 CFU 의 아형은 패널 B 에 나타낸다. 배양물로의 총 투입량은 20,000 세포이었고, 총 CFU 계수는 47 이었으며, 이는 단일 콜로니를 형성하는 평균 세포수 (치상 효율성) 가 425 분의 1 이라는 것을 의미한다.

유세포분석은 또한, 정의된 아형의 개별적으로 픽킹된 콜로니 상에서 수행되었다. 패널 C 에서 사진으로 나타낸 (50배 배율) 과립구 형태를 갖는 두 개의 콜로니가 선별되었다. 콜로니는, 과립구 콜로니에서 예상된 바와 같이, 81-92% 가 CD45 양성이었고 (패널 C i 및 iv), 73% 가 CD13 양성 (패널 C i) 이었다. 낮은 수준의 CD15 가 발생의 미엘로사이트 단계에서 조혈 직계세포내에 위치되었다. CD34 및 c-kit 와 같은 원시 마커가 또한 상기 콜로니 상에서 각각 6% 및 12% 존재하는 것으로 밝혀졌지만, AC133 은 발현되지 않았다.

배양체 단독의 선조세포 기여를 결정하기 위해서, 개별적인 배양체를 분화 배양물로부터 단리하고, 전술한 바와 같이 CFU 에 대해 검사하였다. 총 50,000 개의 분화 세포가 각각의 검사에 위치되었고, 평가 전 11 일 동안 배양하였다.

도 5는 그 결과를 나타낸다. 각종 CFU 아형이 나타났다: 적혈구계 세포 (100배 배율), 과립구 세포 (100배 배율) 및 대식세포 (200배 배율). 배양물 (77 개의 콜로니) 중 선조세포의 총수에 기초한 정량적 평가는, 649 개의 투입 세포 당 하나의 콜로니의 치상 효율성으로, 적혈구계 계통에 대한 성향을 나타내었다 (패널 B). 두 개의 적혈구계 콜로니가 유세포분석에 의해 분석되었고, 93% 가 글로코포린 A 양성인 것으로 밝혀졌다.

실시예 5: 2차 콜로니 형성

2차 선조세포의 존재는, 마지막 실시예에서 CFU 의 평가로부터 개별적인 콜로니를 픽킹하고 이들을 2차 CFU 검사에 재치상하는 것에 의해서 평가하였다. 전체 함유물 분화 프로토콜 상에서 수행된 CFU 검사로부터의 두 개의 1차 콜로니, 및 단리된 배양체 분화 프로토콜로부터의 두 개의 콜로니를 각각 2차 CFU 검사로 계대하였다.

도 6은 그 결과를 나타낸다. 전체 함유물 프로토콜로부터의 두 개의 과립구 콜로니가 2차 검사에서 수많은 콜로니를 형성하였다.

패널 A 는 82,500 개의 하나의 단일 1차 콜로니로부터 유도된 상이한 2차 콜로니를 나타내고, 이는 과립구 세포, 대식 세포, 적혈구계 세포 및 GEMM 콜로니 (과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵구 세포 유형의 혼합물) 의 콜로니를 나타내었다. 콜로니 수는 하기에 나타낸다. 2차 콜로니를 회수하고, 유세포 분석을 위해 모두 모았다. CD45 발현 (46%, 조혈 비-적혈구계 세포를 나타냄) 의 수준은 높았지만, CD34 (패널 A v) 의 수준은 낮았다. 2차 검사에서의 세포는, 그가 유도된 1차 콜로니와 같이, CD13 양성 (35%; 패널 A vi) 이었다. CD14 (단구를 나타냄) 는 낮았다 (2%; 패널 A vii). 글리코포린 A 양성 세포는 단지 낮은 비율의 집합된 검사 배양물 (1.2%; 패널 A viii) 이었지만, 적혈구계 선조세포는 형태적 기준에 의해 검사된 바와 같이 분명히 존재하였다.

패널 B 는 상이한 1차 과립구 콜로니로부터 수득된 12,000 개의 세포로 이루어진 2차 콜로니를 나타낸다. 14 개의 2차 콜로니가 전체적으로 수득되었고, 이들모두는 대식세포-유사 콜로니이었다. 전체 CFU 검사 집단의 유세포분석은, 상기 세포가 50% 는 CD45 양성이고, 0.7% 는 CD34 양성이며, 57% 는 CD13 양성이라는 것을 보여주었고, 이는 단구 또는 과립구 세포 유형의 존재를 나타낸다.

2차 콜로니 형성의 증명은, 본래 세포가 1차 CFU 검사에서 콜로니를 형성하는 전형적인 골수세포 보다 높은 증식능을 갖는 원시 선조세포이었다는 것을 나타낸다.

실시예 6: 미분화 hES 세포 상에서의 MHC 발현의 특징분석

인간 조직 상에서의 MHC 항원의 발현은, 시험관내 및 생체내 알로(allo)-특이적 T 세포 반응의 결과를 결정한다. MHC 클래스 II 는 골수 유래 세포 및 흉선 상피에서 우선적으로 발현된다. 이는, 특이적 면역반응을 개시하기 위한 목적으로 항원을 면역계로 제시한다. 반대로, MHC 클래스 I 은 실제로 모든 포유동물 세포에 의해 발현된다. 이는 면역계의 효과자 분지 (effector arm) 의 역할을 하며, 숙주세포가 실제로 감염되거나, 조직-비적합성이거나, 다르게는 외래 항원을 함유하는 경우, 특이적 T 림프구에 의해서 인식된다.

미분화 hES 세포 상에서의 MHC 의 발현은 면역염색 및 유세포계에 의해서 분석되었다. 이들 연구에 사용되는 hES 세포주는 하기와 같았다: H1 (계대 36 내지 45), H7 (계대 37 내지 43) 및 H9 (계대 31 내지 40). 하기 항체가 사용되었다: HLA-A, B, C; HLA-DP, DQ, DR (BD-Pharmingen). 세포를 0℃ 에서 항체와 함께 배양하고, 세척한 다음, 프로피듐 요오드로 대조염색하였다. 유세포분석은 FACScan^TM또는 FACScalibur^TM(Becton Dickinson) 유세포계 상에서 수행되었다.

도 7은 그 결과를 나타낸다. 회색선은 MHC 항체 염색을 나타내고; 굵은선은 이소타입 대조군을 나타낸다. 인간 태아 제대혈액 단핵 세포 (CBMC; n = 4) 와 동일하게, H1, H7 및 H9 hES 세포주는 모두 MHC 클래스 I (n = 26) 을 발현하였다. hES 세포는 MHC 클래스 II (DP, DQ, DR 반수체형) 가 검출가능하지 않은 반면, CBMC 의 일부는 낮은 수준의 클래스 II (제 2 의 험프(hump)) 를 발현하였다. 마지막 패널의 삽입도는, 50-100 유닛의 인터페론 γ(IFN) 에 의한 hES 세포의 처리도 여전히 MHC 클래스 II 의 검출가능한 발현을 유도하지 않음을 나타낸다.

실시예 7: 배양물에서 미분화 hES 세포에 의한 면역억제

동종이계 T 세포의 증식을 유도하는 hES 세포의 능력은, 혼합 림프구 반응 (MLR) 에서 측정되었다. hES 세포주는, 1차 인간 T 세포에서, 심지어 IFN-γ 에 의한 자극 후에도, 알로-반응성을 유도할 수 없다는 것이 발견되었다.

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 는, Ficoll-Hypaque^TM밀도 구배 (Amersham Pharmacia) 를 사용하여 헤파린화 혈액으로부터 단리하고, 10% FBS 를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 재현탁하였다. 다르게는, T 림프구를 풍부하도록 하기 위해서, 분리된 세포를 37℃ 에서 2 시간 동안 배양하고, 비흡착 세포를 수집하여, 이후의 사용을 위해, 60% AIM-V, 30% 우태아혈청 (FBS), 10% DMSO 중에서 동결시켰다. 수상세포 (DC) 는, 10 ng/㎖ 의 인간 재조합 GM-CSF 및 10 ng/㎖ 의 IL-4 (R&D Systems) 를 함유하는 AIM-V 중에서 7 일 동안 잔류 흡착 세포를 배양하는 것에 의해서 제조하였다. 혼합 림프구 반응은 하기와 같이 수행하였다: 자극자 세포를 조사한 다음 (DC, 3000 Rad; BJ 섬유아세포, 3000 Rad; 또는 hES 세포주, 1000 Rad), 1 ×10⁵내지 1 ×10²세포를 96웰 둥근바닥 플레이트내 AIM-V 배지 중에 치상하였다. 반응자 PBMC 또는 T 세포를 웰당 1 ×10⁵의 농도로 첨가하고, 플레이트를 AIM-V 배지 중에서 5 일 동안 배양하였다. 이어서, 웰을 [³H]티미딘 (웰당 1 μCi) 과 함께 16-20 시간 동안 펄스시키고, 회수하고, 계수하였다.

도 8은 그 결과를 나타낸다 (이는 3 공여자로부터의 다중 웰의 자극지수 ±SEM 을 의미한다). hES 세포는 PBMC 반응자에서 T 세포 증식을 유도하지 못한 반면, PBMC 가 자극자로서 사용되는 경우 현저한 T 세포 증식이 관찰되었다. 유사하게, 태아 혈액 단구를 반응자로서 사용하면, hES 세포가 자극자로서 사용되는 경우, 현저한 증식이 보여지지 않았다 (패널 A). hES 세포주 H1, H7 및 H9 의 T 세포 자극능력의 결여는, T 세포가 풍부한 (단구가 고갈된) PBMC 가 반응자로서 사용되는 경우에도, 또한 보여졌다 (패널 B). IFN-γ와의 배양은 MHC 클래스 I 발현의 현저한 상승 조절을 유도하였다 (삽입도: 회색선 = 비처리 hES 세포; 점선 = IFN-γ처리 세포; 어두운 선 = 이소타입 대조군). 그러나, MHC 발현을 증가시키기 위해 IFN-γ와 함께 배양함으로써 제조된 hES 세포주 H1 및 H9 는 여전히 T 세포 증식을 자극하지 못하였다 (패널 C). 관련 실험에서, IFN-γ 함께 배양하여 인간 포피(foreskin) 섬유아세포를 제조하는 것은, 더욱 우수하게 T 세포를 자극할 수 있도록 하였다.

미분화 hES 세포가 제 3 의 자극자 세포에 대한 알로-MHC 반응을 활발하게 조절하는지를 결정하기 위해서, 억제 실험이 수행되었다. 반응자 T 세포 (1 ×10⁵) 는 다양한 수의 조사된 인간 섬유아세포 및 hES 세포와 함께 0 또는 2 시간 동안 배양되었다. 이어서, 1 ×10⁴의 조사된 수상 세포를 웰마다 첨가하였다. 5 일간 배양한 후, 세포를 [³H]티미딘 (웰당 1 μCi) 과 함께 16-20 시간 동안 펄스시키고, 회수하고, 계수하였다.

도 9는 그 결과를 나타낸다 (평균 ±SEM). hES 세포는 동종이계 수상 세포에 의해 자극된 T 세포 증식을 제거하였다. PBMC 가 동종이계 전문항원제시 수상 세포와 함께 10:1 의 비율로 공배양되는 경우, 격렬한 증식 반응이 검출되었다. 그러나, 이들 공배양물에 임의의 미분화 hES 세포주를 첨가하는 것은, 시험관내 T 세포 증식을 강력하게 억제하였다 (패널 A). 동등한 수의 인간 섬유아세포의 첨가는, 억제 효과를 갖지 않았다 (패널 A). hES 수의 일련의 감소는, 억제 효과의 점진적인 유실을 초래하였고, 이는 혼합 림프구 반응에서 알로(allo)활성화의 hES 세포에 의한 억제가 분량-의존적이라는 것을 보여준다 (패널 B). MLR 은 1:1 또는 1:3 의 hES 세포 : T 세포의 비율에서 억제되었다.

실시예 8: 생체내에서 미분화 hEs 세포에 의한 알로자극의 결여

생체내 세포면역 반응을 자극하는 세포의 능력을 시험함으로써, 미분화 hES 세포의 면역원성이 또한 평가되었다.

면역 결핍 Prk-/- SCID 마우스에, 2 내지 5 ×10⁶의 미분화 hES 세포, 태아 단핵 세포, 또는 MBA-1 인간 거핵구 세포주를 근육내 주사하였다. 48-72 시간 후, 조직을 고정하고, 임베딩한 후, 냉각기 상에서 절단하였다. 매 두번째 단편은 헤마토크실린 및 에오신 (H&E) 염색을 위해 유지시켰다. 1000배 배율의 H&E 염색된 단편내 형태적 특징에 의해서, 백혈구의 존재가 동정되었다 (맹목 수행 분석; R > 0.97).

도 10은 이 실험의 결과를 나타낸다. MBA-1 세포 및 단핵 제대 세포 모드는 Prk-/- SCID 마우스에서 과립구 침투 반응을 유도할 수 있었다. 반대로, 미분화 hES 세포를 주사한 동물의 주입 부위에서는 과립구의 침투가 관찰되지 않았다.

도 11은 야생형의 면역적합성 CD1 마우스를 사용하는 이후의 실험 결과를 나타낸다. Prk-/- SCID 마우스와는 달리, PBS 운반체를 함유하는 내독소의 주입은 주입부위에서 림프구 및 과립구 침투를 유도하였다 (하부 왼쪽 패널). 그러나, hES 세포와 함께 운반체를 투입하는 것은, 백혈구 침투를 완전히 제거하였다 (하부 오른쪽 패널). 동일한 운반체 중에 재현탁된 MBA-1 세포의 주사는 백혈구 침투를 억제하지 못하였다 (삽입도).

이 연구로부터 두 가지의 결론이 존재한다. 우선, hES 세포는 면역결핍 또는 면역적합 마우스에서 그 자신에 대한 반응을 유도하지 않는다. 이는, 이들이 다르게는 이종성 반응일 수 있는 것을 억제하는 능력을 가짐을 제안한다. 이종성 숙주에 세포를 투여하는 것은, 원칙적으로는 동종이계 인간에게 투여하는 것보다,항원 불일치의 수준이 훨씬 더 높기 때문에 훨씬 더 엄격하다. 둘째로, hES 세포는 또한 내독소에 반응하여 달리 발생하는 비특이적 침투 (항원 특이적이지 않은 염증 반응) 를 명백하게 억제할 수 있다.

본 명세서에서 앞서 나타낸 바와 같이, 면역 및 염증 반응 모두를 활발하게 억제하는 미분화 hES 세포의 능력은 임상 치료를 위한 중요한 암시를 갖는다.

실시예 9: BMP 는 hES 세포 유래의 조혈 선조세포의 자기-복제를 촉진한다

다음의 일련의 실험에서, 조혈세포는 변형된 분화 시간표를 사용하여 hES 세포로부터 수득되었다.

피더없는 배양에서 미분화 hES 세포는 콜라게나아제 IV 로 처리되고, 스트립에서 Matrigel매트릭스를 제거하였다. 이어서, 이들을 낮은 부착 플레이트로 옮기고, 20% 비가열 불활성화 FBS 를 함유하는 분화 배지 중에서 하룻밤 동안 배양체를 형성하였다. 배지를 바로 그 다음날 조혈 시토카인 (300 ng/㎖ 의 SCF; 300 ng/㎖ 의 Flt-3 리간드, 10 ng/㎖ 의 IL-6 및 50 ng/㎖ 의 G-SCF); 또는 BMP-4 (50 ng/㎖); 또는 시토카인 및 BMP-4 모두를 포함하는 배지로 바꾸었다. 대조군 배양은, 임의의 첨가되는 인자가 없이 동일한 분화 배지에서 지속하였다. 배지는 매 3 일마다 바꾸었다.

도 12는, 총세포 계수 및 수득된 CD45 양성 조혈 선조세포의 수를 나타내다. 또한, 10⁵투입 세포마다 수득되는 1차 CFU 의 수를 나타낸다. 시토카인은, 대조군과 비교하여, CD45 양성 세포의 수율 (p < 0.02) 및 CFU (p < 0.01) 를 상당히 개선하였다. 임의의 이러한 기준에 의하면, 시토카인의 존재 또는 부재하에서, BMP-4 의 효과는 무시할 수 있다.

도 13은, BMP-4 의 중요성을 강조하는 2차 CFU 의 결과를 나타낸다. 대조군 조건하에서 hES 세포로부터 유래되는 조혈 선조세포의 자기-복제는, 빈번하지 않은 사건이고, 1차 CFU 의 단지 6% 에서만 발생한다 (왼쪽 패널). 반대로, 시토카인에 의한 hES 세포의 분화처리는, 검사된 모든 1차 CFU 의 21% 까지 자기-복제능을 강화시켰다. 선조세포 자기-복제 빈도는 세포가 시토카인에 의해 분화되는 경우 증가하는 반면, 대조군 또는 시토카인 유래 조혈 선조세포 모두로부터의 자기-복제의 크기는 1차 CFU 당 검출된 2차 CFU 가 각각 평균 0.5 및 0.3 으로 최소였다 (오른쪽 패널). hES 세포가 시토카인 및 BMP-4 모두에 의해서 분화되는 경우, 36% 의 1차 CFU 가 2차 CFU 를 생성하였다. 시토카인 + BMP-4 의 존재하에서 분화된 hES 세포로부터 생성된 개별적인 1차 CFU 는, 1차 CFU 당 4 이하의 2차 CFU 를 생성하였고, 자기 복제 크기는 대조군 또는 시토카인 단독 처리 보다 8 배 더 높았다. BMP-4 단독에 의해 hES 세포를 분화시키는 처리는 기본적인 잠재성 초과로 조혈 세부요소를 강화시킬 수는 없었지만 (실시예 2 및 3), 본 실시예에서는, BMP-4 가 1차 조혈 선조세포의 자기-복제능에 영향을 미치는 것으로 보여졌다. BMP-4 의 존재하에서 생성되는 50% 초과의 1차 CFU 는 자기-복제될 수 있고 (왼쪽 패널), 1차 CFU 당 10 이하의 2차 CFU 를 형성하는 평균적인 능력 (오른쪽 패널) 을 갖고, 대조군 또는 시토카인 분화 세포 보다 자기-복제능이 20 배 증가한다.

hES 유래의 조혈 선조세포 및 수임된 조혈 조직의 공지된 공급원 사이의 선조세포 자기-복제의 빈도 및 크기를 비교하기 위해서, 인간 제대혈액 샘플로부터 생성된 1차 CFU 에서 동일한 방식으로 자기-복제능에 대해 평가하였다 (오른쪽 패널, 삽입도). 제대혈액으로부터의 1차 CFU 는, 개별적으로 검사하는 경우, 2차 선조세포를 생성하지 않았다. 그러나, 복수의 1차 콜로니가 모아지는 경우, 선조세포 자기-복제가 1차 CFU 당 0.5 의 2차 CFU 빈도로 관찰되었다. 이는, BMP-4 의 존재하에서 분화한 hES 세포로부터의 조혈 선조세포와 비교하여, 수임된 조혈 조직에서는 자기-복제성 선조세포가 희귀함을 보여준다.

이러한 결과는, BMP-4 의 존재하에서의 hES 세포의 분화는 우수한 자기-복제능을 갖는 조혈 선조세포를 생성함을 증명한다.

실시예 10: 선조세포 유도의 동역학

본 실시예에서는, 조혈 세포 분화의 동역학이 추가로 검사되었다. 세포를 HGF 시토카인 및 BMP-4 와 함께 배양하였고, 배양체 형성 후에 날짜를 시작하였다. 세포는 배양중 각종 시점에서 샘플링되었고, CD45 및 1차 CFU 에 대해서 분석하였다.

도 14는 그 결과를 나타낸다. 시토카인 및 BMP-4 와 함께 배양한지 3일, 7일 또는 10 일째에는 조혈 세포가 관찰되지 않았다. CD45 양성 세포의 빈도는 15일 및 22일째에 상당히 증가하였다. 7일 및 10일째에, CFU 검사에서 콜로니형성 효율성은 15,000 분의 1 미만이었지만, 15일째에는 262 분의 1 이었다. 15일 및 22일째의 콜로니형성 효율성에 있어서의 증가는 통계학적으로 유의하지 않고, 이는 15일 및 22일 사이에서 수임된 조혈세포의 증식이 선조세포 기능의 분화 및 손실과함께 발생한다는 것을 제안한다.

본 명세서는 hES 세포의 직접적인 조혈 분화에 관한 개념적 모델을 제공한다. 이 모델은 중요한 과정의 적용을 강화시키기 위해서 단독으로 제공되고; 명백하게 요구되는 경우, 본 발명의 한정을 의도하지 않는다.

hES 세포로부터 조혈 자손세포의 생성은 2 단계로 발생할 것이다 - 조혈 시토카인에 의해 개시된 프로그램에 의해 통치되는 유도 단계 후, 수임된 조혈 세포의 증식단계. 시토카인은 다중계통 성숙이 가능한, CD45 로 표시되는 수임된 조혈 선조세포를 유도한다. 제어 조건하에서 hES 세포의 자발적인 분화로부터 생성된 일부 수임된 조혈 선조세포는 2차 CFU 검사에서 자기-복제될 수 있고, 따라서 아마도 최종적으로 분화된다. 따라서, hES 세포 분화를 통치하는 본래의 프로그램은, 시토카인 및 BMP-4 처리에 의해 유도되는 유지능을 생성하지 못한다.

결과로, BMP-4 (단독 또는 시토카인과의 조합) 는 hES 세포로부터 수득되는 조혈 선조세포의 빈도 또는 총 수에 대해 효과를 갖지 않는다. 그러나, BMP-4 의 존재하에 hES 세포의 유도는 우수한 자기-복제능을 갖는 독특한 조혈 선조세포를 생성한다. BMP-4 는, 선조세포 재생에 기여하는 장시간 프로그램을 자극하여, 발생 처음 14일 동안에 이들의 효과를 제공할 수 있다.

당업자는 본 발명의 개념 또는 첨부된 특허청구범위의 범위로부터 벗어남 없이, 통상적인 최적화의 문제로서 본 발명이 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

다중 종속 청구범위가 가능한 범위내에서 청구되는 본 발명의 구현예는 하기를 포함한다.

청구항 1. 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는, 배양 중에서 증식하는 분화세포 집단:

ㆍ 1% 이상의 세포가 CD45 양성임;

ㆍ 20% 이상이 CD34 양성임;

ㆍ 70% 이상이 CD13 양성임;

ㆍ 10% 이상이 AC133 양성임.

청구항 2. 제 1 항에 있어서, 영장류 분화다능성 줄기 (pPS) 세포를 분화시키는 것에 의해 수득되는 세포 집단.

청구항 3. 제 2 항의 세포집단, 및 그로 분화되는 미분화 pPS 세포주로 이루어진 두 개의 세포 집단(들).

청구항 4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 5% 이상의 세포가 CD34 양성 및 CD45 양성인 세포 집단(들).

청구항 5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 1% 미만의 미분화 pPS 세포를 함유하는 세포 집단.

청구항 6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 대한 검사에서 약 1000 분의 1 이상의 치상 효율성(plating efficiency) 으로 콜로니를 형성하는 세포 집단(들).

청구항 7. 제 6 항에 있어서, CFU 검사로부터 회수된 콜로니가, 2차 CFU 검사에 재치상되는 경우 2차 콜로니를 형성하는 세포 집단(들).

청구항 8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, NOD-SCID 마우스로 주사되는 경우, 순환 적혈구계 세포, 과립구 세포 및 단구를 형성하는 세포 집단(들).

청구항 9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, NOD-SCID 마우스로 주사되는 경우 순환 림프구 세포를 형성하는 세포 집단(들).

청구항 10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변경된 세포 집단(들).

청구항 11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 단리된 세포의 자손 세포인 세포 집단(들).

청구항 12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아줄기세포인 세포 집단(들).

청구항 13. pPS 세포를 조혈능을 갖는 세포 집단으로 분화시키는 방법에 있어서, 상이한 유전자형을 갖는 세포가 본질적으로는 없지만 조혈 성장인자의 혼합물을 함유하는 배양 환경 중에서 미분화 pPS 세포를 배양한 다음, 1% 이상이 CD45 양성이거나 조혈 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 대한 검사에서 약 1000 분의 1 이상의 치상 효율성으로 콜로니를 형성하는 세포집단을 배양 환경으로부터 회수하는 것을 포함하는 방법.

청구항 14. 제 13 항에 있어서, 분화가 배양체 또는 세포 응집체의 형성을 포함하는 방법.

청구항 15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 분화가 저밀도 조건화 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 방법.

청구항 16. 제 13 항 내지 제 15 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 성장인자의 혼합물이 하기 중 둘 이상을 포함하는 방법: 줄기세포 인자 (SCF), FLT-3 리간드, IL-3, IL-6 및 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF).

청구항 17. 제 16 항에 있어서, 상기 세포가 분화 개시 12 일내에서 상기 조혈 성장인자와 함께 배양되는 방법.

청구항 18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 성장인자와 함께 배양하는 것과 동시에 또는 순차적으로 골형태형성 단백질과 함께 분화 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.

청구항 19. 제 18 항에 있어서, 상기 세포가 상기 조혈 성장 인자와 함께 배양하는 것에 이어서 골형태형성 단백질 4 와 함께 배양되는 방법.

청구항 20. 제 13 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법에 따른 수득되는 세포가 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화세포의 특성을 갖는 방법.

청구항 21. 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 선조세포, 적혈구계 세포, 과립구 세포, 단구 세포, 거핵구 또는 림프구 세포의 제조 방법인 방법.

청구항 22. pPS 세포를 분화시키는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화 세포 집단을 수득하는 방법.

청구항 23. 제 13 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 단리된 세포의 자손세포인 방법.

청구항 24. 제 13 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기세포인 방법.

청구항 25. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화 세포집단을 더 분화시켜 제조되는, 적혈구, 적혈구모세포, 호중구, 호산구, 호염기성구, 단구, 대식세포, 거핵구, 혈소판 또는 림프구.

청구항 26. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 분화 세포 집단과 화합물과 결합시키고, 상기 화합물과 결합시켜 생성되는 세포 집단의 임의의 표현형적 및 대사적 변화를 결정하고, 이 변화를 조혈 세포 기능을 변형시키는 화합물의 능력과 상관짓는 것을 포함하는, 조혈 세포 기능을 변화하는 능력에 대해서 화합물을 스크리닝 하는 방법.

청구항 27. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단을 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 치료를 위한 약학 조성물.

청구항 28. 인간에게서 조혈 기능을 재구성하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단의 용도.

청구항 29. 인간의 유전자 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단의 용도.

청구항 30. 의약 중의 세포에 대해 MHC 적합성을 갖는 세포에 대한 인간의 관용화를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 13 항의 분화 세포 집단, 또는 pPS 세포의 미분화된 불활성화 집단의 용도.

청구항 31. 제 13 항의 분화 세포 집단, 또는 불활성화된 미분화 pPS 세포를 포함하고, 인간 투여를 위해 적합하게 제형화된 1차 세포 집단; 및 1차 세포 집단에 대해 MHC 적합성을 갖는 분화 세포를 포함하는 2차 세포 집단을, 함께 또는 개별 용기중에 포함하는 약학 조합물.

청구항 32. 제 31 항에 있어서, 개체로의 상기 조합물의 투여시에, 1차 세포 집단이 2차 세포 집단에 대한 대상체에 의한 염증 반응을 억제하는 약학 조합물.

청구항 33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 개체로의 1차 세포 집단의 투여가 2차 세포 집단에 대한 개체의 면역관용을 제공하는 약학 조합물.

청구항 34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화 pPS 세포가 조사 또는 마이토마이신 c 를 이용한 처리에 의해서 불활성화된 인간 배아 줄기세포인 약학 조합물.

청구항 35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 및 2차 세포 집단이 인간 배아 줄기세포의 동일한 세포주로부터 유도되는 약학 조합물.

청구항 36. 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 세포 집단이 간세포, 뉴론, 희돌기세포, 심근세포, 골생성 세포, 간엽 세포, 조혈세포, 섬 세포, 연골세포, 또는 이러한 세포 형태 중 임의의 것의 계통제한 전구체인 약학 조합물.

Claims

하기의 특성 중 하나 이상을 갖는, 배양 중에서 증식하는 분화세포 집단:

ㆍ 1% 이상의 세포가 CD45 양성임;

ㆍ 20% 이상이 CD34 양성임;

ㆍ 70% 이상이 CD13 양성임;

ㆍ 10% 이상이 AC133 양성임.
제 1 항에 있어서, 영장류 분화다능성 줄기 (pPS) 세포를 분화시키는 것에 의해 수득되는 세포 집단.
제 2 항의 세포집단, 및 그로 분화되는 미분화 pPS 세포주로 이루어진 두 개의 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, 5% 이상의 세포가 CD34 양성 및 CD45 양성인 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, 1% 미만의 미분화 pPS 세포를 함유하는 세포 집단.
제 1 항에 있어서, 조혈 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 대한 검사에서 약 1000분의 1 이상의 치상 효율성(plating efficiency) 으로 콜로니를 형성하는 세포 집단(들).
제 6 항에 있어서, CFU 검사로부터 회수된 콜로니가, 2차 CFU 검사에 재치상되는 경우 2차 콜로니를 형성하는 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, NOD-SCID 마우스로 주사되는 경우, 순환 적혈구계 세포, 과립구 세포 및 단구를 형성하는 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, NOD-SCID 마우스로 주사되는 경우 순환 림프구 세포를 형성하는 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, 이종성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변경된 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 단리된 세포의 자손 세포인 세포 집단(들).
제 1 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아줄기세포인 세포 집단(들).
pPS 세포를 조혈능을 갖는 세포 집단으로 분화시키는 방법에 있어서, 상이한 유전자형을 갖는 세포가 본질적으로는 없지만 조혈 성장인자의 혼합물을 함유하는 배양 환경 중에서 미분화 pPS 세포를 배양한 다음, 1% 이상이 CD45 양성이거나 조혈 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 대한 검사에서 약 1000 분의 1 이상의 치상 효율성으로 콜로니를 형성하는 세포집단을 배양 환경으로부터 회수하는 것을 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서, 분화가 배양체 또는 세포 응집체의 형성을 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서, 분화가 저밀도 조건화 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서, 조혈 성장인자의 혼합물이 하기 중 둘 이상을 포함하는 방법: 줄기세포 인자 (SCF), FLT-3 리간드, IL-3, IL-6 및 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF).
제 16 항에 있어서, 상기 세포가 분화 개시 12 일내에서 상기 조혈 성장인자와 함께 배양되는 방법.
제 13 항에 있어서, 조혈 성장인자와 함께 배양하는 것과 동시에 또는 순차적으로 골형태형성 단백질과 함께 분화 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 세포가 상기 조혈 성장 인자와 함께 배양하는 것에 이어서 골형태형성 단백질 4 와 함께 배양되는 방법.
제 13 항에 있어서, 본 방법에 따른 수득되는 세포가 제 1 항의 분화세포의 특성을 갖는 방법.
제 13 항에 있어서, 조혈 선조세포, 적혈구계 세포, 과립구 세포, 단구 세포, 거핵구 또는 림프구 세포의 제조 방법인 방법.
pPS 세포를 분화시키는 것을 포함하는, 제 1 항의 분화 세포 집단을 수득하는 방법.
제 13 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 단리된 세포의 자손세포인 방법.
제 13 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기세포인 방법.
제 1 항의 분화 세포집단을 더 분화시켜 제조되는, 적혈구, 적혈구모세포, 호중구, 호산구, 호염기성구, 단구, 대식세포, 거핵구, 혈소판 또는 림프구.
제 1 항에 따른 분화 세포 집단과 화합물과 결합시키고, 상기 화합물과 결합시켜 생성되는 세포 집단의 임의의 표현형적 및 대사적 변화를 결정하고, 이 변화를 조혈 세포 기능을 변형시키는 화합물의 능력과 상관짓는 것을 포함하는, 조혈 세포 기능을 변화하는 능력에 대해서 화합물을 스크리닝 하는 방법.
제 1 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단을 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 치료를 위한 약학 조성물.
인간에게서 조혈 기능을 재구성하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 1 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단의 용도.
인간의 유전자 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 1 항의 분화 세포 집단 또는 제 13 항의 방법에 따라 수득되는 분화 세포집단의 용도.
의약 중의 세포에 대해 MHC 적합성을 갖는 세포에 대한 인간의 관용화를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제 13 항의 분화 세포 집단, 또는 pPS 세포의 미분화된 불활성화 집단의 용도.
제 13 항의 분화 세포 집단, 또는 불활성화된 미분화 pPS 세포를 포함하고, 인간 투여를 위해 적합하게 제형화된 1차 세포 집단; 및 1차 세포 집단에 대해 MHC 적합성을 갖는 분화 세포를 포함하는 2차 세포 집단을, 함께 또는 개별 용기중에 포함하는 약학 조합물.
제 31 항에 있어서, 개체로의 상기 조합물의 투여시에, 1차 세포 집단이 2차 세포 집단에 대한 대상체에 의한 염증 반응을 억제하는 약학 조합물.
제 31 항에 있어서, 개체로의 1차 세포 집단의 투여가 2차 세포 집단에 대한 개체의 면역관용을 제공하는 약학 조합물.
제 31 항에 있어서, 미분화 pPS 세포가 조사 또는 마이토마이신 c 를 이용한 처리에 의해서 불활성화된 인간 배아 줄기세포인 약학 조합물.
제 31 항에 있어서, 1차 및 2차 세포 집단이 인간 배아 줄기세포의 동일한 세포주로부터 유도되는 약학 조합물.
제 31 항에 있어서, 2차 세포 집단이 간세포, 뉴론, 희돌기세포, 심근세포, 골생성 세포, 간엽 세포, 조혈세포, 섬 세포, 연골세포, 또는 이러한 세포 형태 중임의의 것의 계통제한 전구체인 약학 조합물.