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KR20040081420A - 난소암의 검출 방법 - Google Patents

난소암의 검출 방법 Download PDF

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Publication number
KR20040081420A
KR20040081420A KR10-2004-7005644A KR20047005644A KR20040081420A KR 20040081420 A KR20040081420 A KR 20040081420A KR 20047005644 A KR20047005644 A KR 20047005644A KR 20040081420 A KR20040081420 A KR 20040081420A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ovarian cancer
nucleic acid
sample
klk9
kallikrein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR10-2004-7005644A
Other languages
English (en)
Inventor
엘레프테리오스 디아멘디스
조지 엠. 요셉
Original Assignee
마운트 시나이 하스피틀 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마운트 시나이 하스피틀 코포레이션 filed Critical 마운트 시나이 하스피틀 코포레이션
Publication of KR20040081420A publication Critical patent/KR20040081420A/ko
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Abstract

대상자의 샘플에서 KLK9 또는 hK9를 측정함을 포함하는, 상기 대상자의 난소암의 진단 및 감시 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 난소암의 위치 측정 또는 영상화 방법, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 hK9 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 상기 단백질에 대한 결합제를 사용하는, 난소암의 치료 용도를 고려한다.

Description

난소암의 검출 방법{METHODS FOR DETECTING OVARIAN CANCER}
난소암은 부인과 종양학에서 중대한 임상적 도전을 대표한다. 대부분의 환자들은 상기 질환이 전이될 때까지 자각 증상이 없으며, 2/3는 진행된 암으로 진단된다(1). 미국에서, 2000 년도에 대략 23,000 건의 새로운 난소 암 사례와 약 14,000 건의 상기 질환으로 인한 사망이 예상되었으며(2), 이는 모든 부인과 악성 질환들에서 가장 높은 사망률을 나타낸다.
현재, 난소암의 관리에서 뚜렷하고 인증된 역할을 갖는 유일한 종양 마커는 CA125이다. 혈청 CA125는 난소암의 선별, 양성과 악성 난소 덩어리간의 구별, 및 예후에서 평가되어 왔다(3-6). 그러나, 아직까지 진단, 예후 또는 치료 결정에 있어서 명확한 입장을 갖고 있지 못하다(7,8). 난소암 이외에, 정상 집단의 1%, 양성 질환 환자의 6%, 및 비-부인과 악성질환 환자의 28%에서 높은 수준의 CA125가 발견되었다(9).
다수의 잠재적인 새로운 혈청 마커들이 단독으로 또는 CA125, 예를 들어CA15-3, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA) 및 암배아 항원(CEA)과 함께 평가되어 왔다(7,10,11). 이들 새로운 마커는 요즘에는 뚜렷한 기여를 하고있지 않으며, 오직 CA125와 초음파 촬영술과의 조합만이 가장 유효한 감도와 특이성을 제공한다(8).
칼리레인은 다양한 생리학적 기능들을 갖는 세린 프로테아제이다. 인간 칼리크레인 유전자 군 중 12 개의 새로운 구성원들이 최근 염색체 19q13.3-q13.4 상에서 동정되었다(12-21). 여러 그룹들이 다수의 인간 칼리크레인 유전자가 각종 악성 질환들에서 차별적으로 발현됨을 입증하였다(참고문헌 22에 고찰되어 있음). PSA는 전립선암에 대한 최상의 마커이다(23). hK2(KLK2 유전자에 의해 암호화됨)는 몇몇 소그룹 환자들에 유용한 마커이다(24-27). KLK10(NES1)은 종양 억제 유전자인 것으로 밝혀졌다(28). 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE)가 난소암에서 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며(29), KLK5는 난소암의 불량한 예후 마커이다(30). 2 개의 새로운 칼리크레인 단백질인 hK6과 hK10은 난소 암종의 새로운 혈청학적 마커인 듯 하다(31,32).
KLK9(이전에는 KLK-L3으로서 공지됨)는 새로이 동정된 인간 칼리크레인 유전자 군의 일원(14,33)으로, 소뇌, 척수, 고환, 전립선, 난소 및 피부를 포함한 다수의 조직들에서 발현된다. KLK9는 또한 암 세포주에서 스테로이드 호르몬 조절 하에 있는 것으로 밝혀졌다(14). 흥미롭게도, KLK8(종양-관련하여 차별적으로 발현되는 유전자-14; TADG-14/뉴롭신) 및 KLK10, 상기 두 유전자와 접하고 있는 KLK9는 난소암에서 차별적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다(34-36). 또한, 매우 가깝게 배치된 유전자인 KLK6이 또한 1 차 난소 종양에서 차별적으로 발현된다(19,31).
발명의 요약
본 발명은 난소암의 새로운 생물마커에 관한 것이다. 본 발명은 난소암의 진단 및 치료를 위한 조성물과 방법을 제공한다.
KLK9, 및 KLK9에 의해 암호화되는 단백질은 난소암의 검출에서 특정한 용도를 갖는다. 따라서, KLK9는 난소암의 진단 및 감시(즉 진행 및 치료의 감시)를 위한 새로운 생물마커를 구성한다.
본 발명의 태양에 따라 KLK9를 초기 단계(예를 들어 I 기 또는 II 기), 낮은 등급(등급 1 또는 2), 최적으로 부피 감소된 난소암 환자의 진단, 감시 및 예후에 사용하며, 이를 수술 전이나 재발 후의 생물마커로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, KLK9를 비-혈청 난소 종양의 진단, 감시 및 예후에 사용한다.
KLK9 및 그의 단편인 hK9, 및 hK9에 결합하는 약제들을 사용하여 난소암을 검출할 수 있으며, 이들을 난소암의 진단적 평가, 및 상기와 같은 질환의 소질이 있는 대상자의 식별에 사용할 수 있다.
본 발명의 실시태양에서,
(a) 환자로부터 샘플을 채취하고,
(b) 상기 샘플에서 hK9 또는 KLK9 핵산을 검출 또는 동정하고;
(c) 상기 검출된 양을 표준에 대해 검출된 양과 비교함
을 포함하는, 난소암과 관련이 있는 hK9 또는 KLK9의 검출 방법을 제공한다.
"검출"이라는 용어는 표적 hK9, KLK9, 그의 서브유닛, 또는 시약 결합된 표적의 조합 등의 존재 또는 부재를 분석, 영상화 또는 달리 확립하거나, 또는 난소암, 전이, 단계 또는 유사한 상태의 하나 이상의 실제적인 특징들을 분석, 영상화, 확인, 확립 또는 달리 측정함을 포함한다. 상기 용어는 hK9 및 KLK9의 진단, 예후, 및 감시의 적용을 포함한다.
KLK9 및 hK9의 검출 방법을 사용하여 hK9 및 KLK9 핵산 분자를 검출함으로써 난소암을 감시할 수 있다.
본 발명의 방법은 hK9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 사용할 수 있다. 따라서, KLK9의 검출 방법을 사용하여 KLK9 핵산 분자를 검출함으로써 난소암을 감시할 수 있다. 본 발명의 태양에서, KLK9mRNA가 검출된다.
따라서, 본 발명은 대상자의 샘플로부터 핵산, 바람직하게는 mRNA를 단리하고; 상기 샘플 중의 KLK9 핵산을 검출함을 포함하는 상기 샘플에서 난소암을 진단 및 감시하는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 표준 또는 대조군에 대한 샘플 중의 KLK9 핵산의 증가된 수준의 존재는 초기 질병 단계, 최적의 부피 감소, 및/또는 긍정적인 예후, 즉 보다 긴 진행 부재 및 포괄 생존을 가리킨다. 상기 표준 또는 대조군은 진행된 단계의 난소암과 관련된 양일 수 있다.
본 발명은 또한 대상자 샘플 중의 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드의 수준을 검출하고, 상기 수준을 소정의 표준 또는 컷 오프 값과 비교하고, 이로부터 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정함을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, (a) 대상자로부터 수득된 샘플을 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고; (b) 표준 또는 컷 오프 값에 대해 상기 샘플 중의 소정의 핵산 분자에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드의 수준을 측정하고, 이로부터 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정함을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시태양들 내에서, mRNA인 폴리뉴클레오티드의 양을 예를 들어 hK9를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기와 같은 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 반응을 통해 검출한다(PCR 기법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 멀리스(Mullis)의 미국 특허 제 4,683,195 호 및 4,683,202 호를 참조하시오). 다른 실시태양들 내에서, mRNA의 양을 hK9, 또는 상기와 같은 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 하이브리드화 기법을 사용하여 검출한다.
mRNA 검출을 사용하는 경우, 단리된 mRNA를 표준 방법에 따라 cDNA로 전환시키는 시약과 배합하고; 상기 전환된 cDNA를 적합한 핵산 프라이머들의 혼합물과 함께 용기 중에서 증폭 반응 시약(예를 들어 cDNA PCR 반응 시약)으로 처리하고; 상기 용기의 내용물들을 반응시켜 증폭 산물을 생성시키고; 상기 증폭 산물을 분석하여 샘플 중의 KLK9의 존재를 검출함으로써 상기 방법을 수행할 수 있다. mRNA의 경우 분석 단계를 난소 KLK9 마커의 존재를 검출하는 노던 블럿 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석 단계를 증폭 산물 중의 KLK9 마커의 존재를 정량적으로 검출하고, 상기 검출된 마커의 양을 유사한 프라이머를 사용하여 얻은 정상 및 악성 조직 중의 공지된 존재 또는 부재에 대해 예상되는 값을 갖는 패널과 비교함으로써 또한 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) 샘플로부터 mRNA를 단리하고 상기 mRNA를 상기를 cDNA로 전환시키는 시약과 배합시키고; (b) 상기 전환된 cDNA를 증폭 반응 시약, 및 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 핵산 프라이머로 처리하여 증폭 산물을 제조하고; (d) 상기 증폭 산물을 분석하여 hK9를 암호화하는 mRNA의 양을 검출하고; (e) 상기 mRNA의 양을 유사한 핵산 프라이머를 사용하여 얻은 정상 및 악성 조직에 대해 예상되는 값을 갖는 패널에 대해 검출된 양과 비교함으로써 mRNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상자 샘플 중의 hK9를 측정함을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암종을 진단 및 감시하는 방법에 관한 것이다. hK9를 상기를 검출하거나 상기에 결합하는 시약, 바람직하게는 hK9 또는 그의 일부와 특이적으로 반응하는 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 태양에서, (a) 대상자로부터 생물학적 샘플을 수득하고; (b) 상기 샘플 중의 hK9의 양을 검출하고; (c) 소정의 표준에 대해 상기 검출된 hK9의 양을 비교(이때 상기 표준과 다른 hK9 수준의 검출은 질병을 가리킨다)함을 포함하는 난소암 대상자를 선별하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 검출된 hK9의 양은 표준의 양보다 크고 이는 초기 질병 단계, 최적의 부피 감소, 및/또는 긍정적인 예후, 즉 보다 긴 진행 부재 및 포괄 생존을 가리킨다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 hK9 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플 에서 상기 결합제와 결합하는 단백질의 양을 소정의 표준 또는 컷 오프 값에 대해 검출하고 이로부터 상기 환자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 대상자의 생물학적 샘플을 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접 표지한 hK9에 특이적인 항체와 반응시키고; (b) 상기 검출 가능한 물질을 검출함을 포함하는, 상기 샘플 중의 hK9의 정량 분석에 의한 상기 대상자에서 난소암을 진단 및 감시하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) hK9에 특이적인 항체를 상기 항체:단백질 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 샘플과 배합하고; 복합체 형성(이때 복합체 형성은 샘플 중의 상기 단백질의 발현을 가리킨다)을 검출함을 포함하는, 샘플 중의 hK9 단백질의 발현을 검출하기 위해 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 발현을 표준과 비교할 수 있으며, 이는 난소암의 진단 상 특징이다.
본 발명 방법의 실시태양은 (a) 대상자의 생물학적 샘플을 효소로 직접 또는 간접 표지한 hK9 특이 항체와 반응시키고; (b) 상기 효소에 대한 기질(이때 기질은 상기 기질 또는 효소와 기질의 반응 생성물이 형광 착체를 형성하도록 선택된다)을첨가하고; (c) 샘플 중의 hK9를 상기 형광 착체의 형광성을 측정함으로써 정량분석하고; (d) 상기 정량분석된 수준을 상기 대상 환자 또는 대조용 대상자의 다른 샘플에 대해 수득된 수준과 비교함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 정량분석된 수준을 말기 단계 난소암 환자에 대해 정량분석된 수준과 비교하며, 이때 대조용 대상자와 비교된 hK9 수준의 증가는 초기 단계 질병, 최적의 부피 감소, 및/또는 보다 긴 진행 부재 및 포괄 생존을 가리킨다.
본 발명의 특정 실시태양은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 생물학적 샘플을, 측정 가능한 물질로 직접 또는 간접 표지한 hK9 특이적인 제 1 항체 및 고정화시킨 hK9 특이적인 제 2 항체와 배양시키는 단계;
(b) 상기 제 1 항체를 상기 제 2 항체로부터 분리시켜 제 1 항체 상과 제 2 항체 상을 제공하는 단계;
(c) 상기 검출 가능한 물질을 상기 제 1 또는 제 2 항체 상 중에서 검출하여 상기 생물학적 샘플 중의 hK9를 정량분석하는 단계; 및
(d) 상기 정량분석된 hK9를 소정의 표준에 대한 수준과 비교하는 단계.
상기 표준은 말기 단계 질병을 갖는 대조용 대상자 또는 상기 대상자의 다른 샘플로부터의 샘플에 대해 정량분석된 수준에 상응할 수 있다. 상기 표준에 대해 증가된 hK9 수준은 초기 단계 질병, 최적의 부피 감소, 및/또는 보다 긴 진행 부재 및 포괄 생존을 가리킨다.
본 발명은 또한 난소암에 대해 다수의 마커들을 사용하는 본 원에 개시된 방법을 고려한다. 따라서, 본 발명은 hK9 및 난소암에 특이적인 지표인 다른 마커들의 존재에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 방법을 고려한다. 다른 마커들로는 칼리크레인에 대한 마커, 예를 들어 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE), 합토글로빈 알파, 오스테오폰틴, 칼리크레인 4(hk4), 칼리크레인 5(hK5), 칼리크레인 6(hK6), 칼리크레인 8(hK8), 칼리크레인 10, 칼리크레인 11, CA125, CA15-3, CA72-4, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA), 크레아틴-키나제 BB, 및 암배아 항원(CEA)이 있다. 바람직하게는 다른 마커는 칼리크레인들에 대한 마커들이다. 본 발명의 태양에서, 상기 마커들은 hK4, hK5, hK6, hK8, HSCCE 및 CA125 중 하나 이상, 또는 이들을 암호화하는 핵산들이다. 본 원에 개시된 방법을 상기 마커를 검출하는 시약, 또는 상기 마커에 대한 핵산을 포함하여 변경시킬 수 있다.
본 발명은 또한 hK9 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 단백질에 결합하거나 또는 상기 핵산 분자와 하이브리드 형성하거나 상기 분자를 증폭시키는 약제를 포함하는 진단 조성물을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 조성물은 KLK9 또는 그의 단편에 특이적으로 하이브리드화되는 탐침을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 폴리머라제 쇄 반응 방법을 사용하여 KLK9를 증폭시킬 수 있는 KLK9 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물을 제공한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 조성물은 hK9(예를 들어 항체) 또는 그의 단편에 결합하는 약제를 포함한다. 탐침, 프라이머 및 약제를 검출 가능한 물질로 표지할 수 있다.
본 발명의 태양에 따라, 대상자에게 하나 이상의 칼리크레인을 표적화하도록 제작된 약제를 투여함을 포함하는 생체 내 방법을 제공한다.
본 발명은 따라서 포유동물에게 칼리크레인, 바람직하게는 hK9에 결합하고 영상화 표지를 수반하는 하나 이상의 약제를 투여하고 이어서 상기 포유동물을 영상화함을 포함하는 생체 내 방법을 고려한다.
본 발명의 바람직한 태양에 따라,
(a) 환자에게 칼리크레인 9에 결합하는 약제(난소암을 영상화하는 표지를 수반한다)를 주입하고;
(b) 상기 약제를 생체 내에서 배양시켜 난소암과 관련된 칼리크레인 9에 결합되게 하고;
(c) 난소암에 위치한 표지의 존재를 검출함
을 포함하는 난소암의 생체 내 영상화 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 칼리크레인을 인식하는 항체이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서 상기 약제는 칼리크레인을 인식하는 화학적 존재이다.
상기 약제는 칼리크레인을 영상화하는 표지를 수반한다. 영상화에 유용한 표지의 예로는 방사성 표지, 형광 표지(예를 들어 플루오레세인 및 로다민), 핵 자기 공명 활성 표지, 양전자 방출 x선 단층 촬영("PET") 스캐너에 의해 검출 가능한 양전자 방출 동위원소, 화학 발광제, 예를 들어 루시페린, 및 효소 마커, 예를 들어 페록시다제 또는 포스파타제가 있다. 단 범위 방사선 방사체, 예를 들어 단 범위 검출기 탐침에 의해 검출 가능한 동위원소를 또한 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 난소암에 대한 다수의 마커를 사용하는 본 원에 개시된 위치측정 또는 영상화 방법을 고려한다. 예를 들어 난소암의 영상화 방법은 환자에게 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE), 합토글로빈 알파, 오스테오폰틴, 칼리크레인 4, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 8, 칼리크레인 10, 칼리크레인 11, CA125, CA15-3, CA72-4, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA), 크레아틴-키나제 BB, 또는 암배아 항원(CEA)에 결합하는 하나 이상의 약제를 주입함을 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
더욱 또한 본 발명은 hK9 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 단백질에 대한 결합제를 사용하는 난소암에 대한 치료 용도에 관한 것이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 hK9 단백질 또는 그의 일부, hK9에 특이적인 항체, 및 hK9 및 그의 단편을 암호화하는 핵산 분자 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 난소암의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 hK9 단백질 또는 그의 일부, hK9에 특이적인 항체, 또는 hK9 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산 분자, 또는 본 발명의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 난소암의 예방 및/또는 치료용 백신의 제조에 사용하기 위한, hK9 단백질, 이로부터 유도된 펩티드, 또는 화학적으로 생산된(합성) 펩티드, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 용도이다.
본 발명은 광범위하게 백신을 투여할 대상자에서 hK9 단백질에 대한 항체의 생산을 자극하거나 촉진시키기 위한 백신을 고려한다.
본 발명은 또한 대상자에서 hK9에 대한 항체의 생산을 자극하거나 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 대상자에게 상기 항체의 생산을 자극하거나 촉진시키는데 유효한 용량의 본 발명의 백신을 투여함을 포함한다.
본 발명은 또한 난소암의 치료, 예방 또는 재발 지연 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상자에게 본 발명의 백신을 암의 치료, 예방 또는 재발 지연에 유효한 용량으로 투여함을 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시태양들을 가리키는 이들 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시적인 것으로 제공될 뿐이므로, 본 발명의 진의 및 범위 내에서 이들 상세한 설명으로부터의 다양한 변화 및 변경들은 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다.
도면의 간단한 설명
이제 본 발명을 하기 도면에 대해서 설명할 것이다:
도 1은 실시간 PCR에 의한 KLK9 유전자 발현의 정량분석을 나타낸다. (A): 형광 신호(Y-축) 대 주기 수(X-축)에 대한 대수 플롯. 난소 조직으로부터 전체 RNA 제제에 대한 일련의 희석을 수행하였으며 희석 인자에 따라 임의적인 복사 수를 각 샘플에 대해 할당하였다. 각각의 샘플을 중복 분석하였다. (B): 표준cDNA의 일련의 희석물에 대한 용융 곡선의 전형적인 그래프. 특정한 생성물이 92 ℃에서 용융한다. 상기 생성물을 또한 아가로스 겔 상에서 실행시키고 서열화하여 증폭 특이성을 확인하였다.
도 2는 KLK9 발현에 대한 최적의 컷 오프 점 값의 측정을 나타내는 그래프이다.
도 3은 KLK9 양성 및 음성 난소 종양이 있는 환자들에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다. PFS, 진행 부재 생존; OS, 포괄 생존. n=샘플 수.
도 4는 종양 등급으로 분류된, KLK9 양성 및 음성 난소 종양이 있는 환자들에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. PFS, 진행 부재 생존; OS, 포괄 생존. n=샘플 수.
도 5는 종양 단계로 분류된, KLK9 양성 및 음성 난소 종양이 있는 환자들에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. PFS, 진행 부재 생존; OS, 포괄 생존. n=샘플 수.
도 6은 부피 감소 성공에 의해 분류된, KLK9 양성 및 음성 난소 종양이 있는 환자들에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. PFS, 진행 부재 생존; OS, 포괄 생존. n=샘플 수.
도 7은 혈청 CA125와 KLK9 종양 수준간의 상관성을 나타낸다. rs=스피어맨 상관 계수.
도 8은 혈청 난소 암종에서 hK9 단백질의 면역조직화학적 위치측정을 나타낸다. 핵 염색이 없고 기질 음성인 종양 세포에서 적합한 세포질 양성.
본 발명은 난소암의 발견 방법에 관한 것이다.
KLK9 및 hK9를 수반하는 난소암의 진단 및 예후 평가, 상기와 같은 질환의 소질이 있는 환자의 식별을 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 KLK9 핵산, 그의 단편, 및 펩티드 단편을 포함하여 hK9에 대한 결합제(예를 들어 항체)를 사용할 수 있다. 특히, 핵산 및 항체를 예를 들어 (1) KLK9 돌연변이의 존재에 대한 검출, 또는 비-질환 상태에 대한 KLK9mRNA의 과-발현 또는 미만-발현의 검출, 또는 특정 증상 또는 상기와 같은 증상에 대한 감수성과 관련이 있을 수 있는 KLK9 전사물의 달리 접목된 형태에 대한 정성적인 또는 정량적인 검출; 및 (2) 비 질환 상태 또는 질환 상태와 상관이 있는 변형된(예를 들어 전체 길이 미만) hK9의 존재, 또는 질환 상태로의 진행에 대한 hK9의 과잉 량 또는 미만 량의 검출에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 예를 들어 숙주로부터 새로 제거된 세포 그룹에서 악성 또는 전암 상태 세포의 존재 가능성을 평가할 수 있다. 상기와 같은 방법을 사용하여 종양을 검출하고, 그의 성장을 정량 분석하며, 질병의 진단과 예후를 도울 수 있다. 상기 방법을 사용하여 암 전이의 존재를 검출할뿐만 아니라 수술, 암 화학요법 및/또는 방사선 요법에 따른 모든 종양 조직의 부재 또는 제거를 확인할 수 있다. 상기를 또한 암 화학요법 및 종양 재발의 감시에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법을 대상자의 생물학적 샘플 중에서 hK9 또는 KLK9 핵산을 검출함으로써 난소암종의 진단 및 감시에 적용시킬 수 있다. 이러한 용도는 대상자 샘플에서 정량분석된 hK9 또는 KLK9 핵산의 양을 소정의 표준 또는 컷 오프 값에 대해 비교 시험할 것을 요한다. 상기 표준은 또 다른 샘플 또는 상기 대상자로부터의 초기 샘플에 의해 정량화된 수준, 또는 대조용 샘플에 대해 정량화된 수준에 상응할 수 있다. 건강한 대상자 또는 난소암 대상자로부터의 대조용 샘플에 대한 수준은 예상 및/또는 소급적인 통계학적 연구에 의해 설정될 수 있다. 임상적으로 명백한 질병이나 이상이 나타나지 않은 건강한 대상자를 통계학적 연구를 위해 선택할 수 있다. 진단은 대조용 샘플 또는 동일 대상자에 대해 정량화된 선행 수준에 대해 hK9의 통계학적으로 상이한 수준을 발견함으로써 수행될 수 있다.
"샘플", "생물학적 샘플" 등의 용어는 KLK9 또는 hK9를 발현하거나 함유하는 것으로 공지되거나 의심이 가는 물질을 의미한다. 시험 샘플을 출처로부터 수득된 대로 직접 사용하거나 또는 상기 샘플의 특성을 변경시키기 위해 전처리 한 후에 사용할 수 있다. 상기 샘플을 임의의 생물학적 출처, 예를 들어 조직, 추출물, 또는 세포 배양액, 예를 들어 세포(예를 들어 종양 세포), 세포 용해물 및 생리학적 유체, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등으로부터 얻을 수 있다. 상기 샘플을 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 얻을 수 있다. 상기 샘플을 사용 전에 처리할 수 있다, 예를 들어 혈액으로부터 혈장을 준비하고, 점성 유체를 희석할수 있다. 처리 방법은 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 핵산 및 단백질을 샘플로부터 단리시켜 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
"hK9" 또는 "hK9 단백질"이란 용어는 인간 칼리크레인 9를 지칭한다. 상기 용어는 GenBank 수탁 번호 AAD26427 및 AF135026(서열식별번호 2 및 3)의 인간 칼리크레인 9의 모든 동족체, 천연 대립 유전자 변체, 동형 및 전구체들을 포함한다. 일반적으로, 예를 들어 인간 칼리크레인 9의 천연 대립 유전자 변체는 GenBank 수탁 번호 AAD26427 및 AF135026(서열식별번호 2 및 3)에 나타난 서열과 상당한 상동성(70 내지 90%)을 공유할 것이다. 대립 유전자 변체는 본 원에 개시된 hK9 서열로부터 보존적인 아미노산 치환을 함유하거나 또는 예를 들어 쥐 hK9 상동물과 같은 hK9 상동물에서 상응하는 위치로부터 아미노산 치환을 함유할 것이다.
"KLK9" 또는 "KLK9 핵산(들)"은 바람직하게는 GenBank 수탁 번호 AF135026(서열식별번호 1)의 서열을 갖는 hK9 또는 그의 변체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 변체는 바람직하게는 고유 칼리크레인 9 또는 그의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 약 70% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상의 일치를 보인다. 몇몇 변체들은 고유 KLK9 유전자, 또는 그의 일부 또는 상보물에 실질적으로 일치한다. 예를 들어, 상기와 같은 변체들은 적당히 엄격한 조건 하에서 hK9 단백질을 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 상보 서열)에 하이브리드를 형성할 수 있다. 적합한 적당히 엄격한 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA 용액(pH 8.0)에 의한 예비 세척; 50 내지 56 ℃에서 20 분간 각각 0.1% SDS를 함유하는 2X,0.5X 및 0.2X SSC와의 하이브리드화를 포함한다.
"KLK9" 또는 "KLK9 핵산 분자(들)"란 용어는 DNA 및 RNA(예를 들어 mRNA)를 포함하고자 하며, 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 필요하지는 않지만 추가적인 암호화 또는 비 암호화 서열을 포함하거나, 필요하지는 않지만 다른 분자 및/또는 담체 또는 지지체 물질에 결합될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 분자는 특정 방법에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 특정한 용도에서 상기 용어는 안티센스 핵산 분자(예를 들어 센스 KLK9 분자에 대해 역 배향의 mRNA 또는 DNA 가닥)를 지칭한다.
"대상자" 또는 "환자"라는 용어는 난소암 또는 본 원에 개시된 증상으로 고생하거나, 상기 질병에 걸린 것으로 의심이 되거나, 또는 상기 질병으로 선별된 온혈 동물, 예를 들어 포유동물을 지칭한다.
핵산 방법
본 원에 나타낸 바와 같이 난소암은 샘플 중의 KLK9의 수준을 근거로 검출될 수 있다. 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 및 하이브리드화 분석과 같은 핵산 분자의 검출 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
KLK9 핵산을 검출하기 위해서 탐침을 하이브리드화 기법에 사용할 수 있다. 상기 기법은 일반적으로 환자 또는 다른 세포 출처로부터 수득된 핵산을 상기 핵산 중의 상보 서열에 대한 탐침의 특이적인 어닐링에 유리한 조건 하에서 상기 탐침과 접촉시키고 배양함을 포함한다. 배양 후에, 어닐링되지 않은 핵산들을 제거하고,존재하는 경우 상기 탐침에 하이브리드화된 핵산의 존재를 검출한다.
샘플 중의 KLK9 핵산 서열의 검출에 사용하기 위한 뉴클레오티드 탐침을 당해 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 적합한 탐침은 KLK9 핵산의 영역들로부터 5 개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 기본으로 한다, 바람직하게는 상기는 15 내지 30 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 탐침을 검출 가능한 물질, 예를 들어 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지, 예를 들어32P,3H,14C 등으로 표지할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 검출 가능한 물질로는 특정하게 표지된 항체, 형광 화합물, 효소, 표지된 항원에 특이적인 항체 및 발광 화합물에 의해 인식되는 항원이 있다. 적합한 표지를 검출하려는 뉴클레오티드에 대한 탐침의 하이브리드화 및 결합 속도 및 하이브리드화에 이용할 수 있는 뉴클레오티드의 양을 고려하여 선택할 수 있다. 표지된 탐침을 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed.)]에 일반적으로 개시된 바와 같이 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로즈 필터 또는 나일론 멤브레인 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다. 상기 핵산 탐침을 사용하여 바람직하게는 인간 세포에서 KLK9 핵산을 검출할 수 있다. 상기 뉴클레오티드 탐침은 또한 KLK9를 포함하는 난소암의 진단, 상기와 같은 질환의 진행 감시, 또는 치료 요법의 감시에 유용할 수 있다.
KLK9 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 유전자 서열을 증폭시킨 다음 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여 상기 증폭된 분자를 분석함을 포함할 수 있다. 적합한 프라이머를 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 구상할 수 있다.
예로서, 2 개 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR 기본 분석에 사용하여 샘플로부터 나온 hK9를 암호화하는 핵산 분자의 일부를 증폭시킬 수 있으며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들 중 하나 이상이 hK9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적이다(즉 이에 하이브리드화된다). 이어서 상기 증폭된 cDNA를 당해 분야에 널리 공지된 기법, 예를 들어 겔 전기영동을 사용하여 분리 및 검출한다.
분석 조건 하에서 하이브리드화를 극대화시키기 위해서, 본 발명의 방법에 사용되는 프라이머 및 탐침은 일반적으로 hK9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분에 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상 일치한다; 즉 이들은 길이가 10 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 20 뉴클레오티드 이상이다. 하나의 실시태양에서, 상기 프라이머 및 탐침은 길이가 약 10 내지 40 뉴클레오티드 이상이다.
본 원에 개시된 하이브리드화 및 증폭 기법을 사용하여 KLK9 핵산 발현에 대한 정성적 및 정량적 태양을 분석할 수 있다. 예를 들어 RNA를 KLK9를 발현하는 것으로 공지된 세포 유형 또는 조직으로부터 단리시키고 본 원에 언급된 하이브리드화(예를 들어 표준 노던 분석) 또는 PCR을 사용하여 시험할 수 있다.
상기 프라이머 및 탐침을 동일 반응계에서, 즉 생검법 또는 절제로부터 얻은 환자 조직의 조직 섹션(고정 및/또는 냉동된 것) 상에서 직접 상술한 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 태양에서, 역전사효소-폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR)을 사용하는 방법을 제공하며, 이때 PCR을 역 전사와 함께 적용시킨다. 일반적으로, RNA를 표준 기법(예를 들어 문헌[Chomcynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159, 1987]에 개시된 바와 같은 구아니딘 이소티오시아네이트 추출)을 사용하여 샘플 조직으로부터 추출하고 역 전사시켜 cDNA를 생성한다. 상기 cDNA를 폴리머라제 쇄 반응의 주형으로서 사용한다. 상기 cDNA를 프라이머 셋트에 하이브리드화시킬 수 있으며, 이들 중 하나 이상은 hK9 서열에 대해 특이적으로 구상된다. 일단 상기 프라이머와 주형이 어닐링되었으면, DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머로부터 연장시키고, 주형의 사본을 합성한다. 상기 DNA 가닥들을 변성시키고, 상기 과정을 충분한 DNA가 생성될 때까지 수회 반복하여 에티디움 브로마이드 염색 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화시킨다.
증폭을 난소암에 걸린 대상자 및 난소암에 걸리지 않았거나 진행된 질병 단계에 있는 개인으로부터 수득된 샘플 상에서 수행할 수 있다. 상기 반응을 2 차 이상의 크기에 걸친 cDNA의 수회 희석물 상에서 수행할 수 있다. 비-암 샘플 또는 말기 암 샘플의 동일한 희석물에 대한 상기 대상자의 수회 희석물의 통계학적으로 의미 있는 차이를 난소암의 존재에 대해 양성으로 간주할 수 있다.
KLK9 핵산으로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 또는 보다 긴 단편들을 미세 배열의 표적으로서 사용할 수 있다. 상기 미세 배열을 사용하여 많은 수의 유전자의 발현 수준들을 동시에 감시하고 유전자 변체, 돌연변이 및 다형성을 식별할수 있다. 상기 미세 배열로부터의 정보를 사용하여 유전자 기능을 측정하고, 질환에 대한 유전적 근거를 이해하며, 질환을 진단하고 치료제를 개발하며 그의 활성을 감시할 수 있다.
미세배열의 제조, 용도 및 분석은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다(예를 들어 하기 문헌 참조: Brennan, T.M. et al.(1995), 미국 특허 제 5,474,796 호; Schena, et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler et al.(1995), PCT 출원 WO95/251116; Shalon, D. et al.(1995) PCT 출원 WO95/35505; Heller, R.A. et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 및 Heller, M.J. et al.(1997) 미국 특허 제 5,605,662 호).
단백질 방법
결합제를 다양한 진단 및 분석 용도에 사용할 수 있다. 샘플 중의 표적 분자를 검출하기 위한 결합제의 사용에 대해 숙련가들에게 공지된 다양한 분석 포맷들이 존재한다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 일반적으로, 대상자에서 암의 존재 또는 부재를 (a) 대상자의 샘플을 결합제와 접촉시키고; (b) 상기 샘플 중의 상기 결합제와 결합하는 폴리펩티드의 수준을 검출하고; (c) 상기 폴리펩티드의 수준을 소정의 표준 또는 컷 오프 값과 비교함으로써 결정할 수 있다.
"결합제"는 hK9 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 항체와 같은 물질을 지칭한다. 상기 물질은 상기가 hK9와 검출 가능한 수준으로 반응하고 관련되지 않은 서열 또는 상이한 칼리크레인의 서열을 함유하는 펩티드와 검출 가능하게 반응하지 않는 경우 hK9 단백질에 "특이적으로 결합한다". 결합 성질을 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 수행될 수 있는 ELISA를 사용하여 평가할 수 있다(예를 들어 문헌[Newton et al, Develop. Dynamics 197:1-13, 1993] 참조).
결합제는 펩티드 성분, RNA 성분 또는 폴리펩티드가 있거나 또는 없는 리보솜일 수 있다. 결합제는 hK9 서열, 그의 펩티드 변체, 또는 상기와 같은 서열의 비-펩티드 유사물질을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 예로서, hK9 서열은 hK9에 의해 매개되는 기능을 조절할 수 있는 hK9의 펩티드 부분일 수 있다.
몇몇 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 결합제는 항체이다. hK9 단백질, 또는 유도체, 예를 들어 효소 결합체 또는 표지된 유도체와 특이적으로 반응성인 항체들을 사용하여 다양한 샘플(예를 들어 생물학적 샘플) 중의 hK9 단백질을 검출할 수 있다. 상기를 진단 또는 예후 시약으로서 사용할 수 있으며 hK9 발현 수준의 이상, 또는 hK9의 구조 및/또는 일시적인 조직, 세포 또는 세포 아래 위치의 이상을 검출하는데 사용할 수 있다. 항체를 또한 생체 외에서 잠재적인 치료 화합물을 선별하여 hK9 단백질을 수반하는 질환(예를 들어 난소암) 및 다른 증상들을 측정하는데 사용할 수 있다. 생체 외 면역분석을 또한 특정 요법의 효능을 평가하거나 감시하는데 사용할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 대상자의 생물학적 샘플을 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접 표지된 hK9 특이 항체와 반응시키고 상기 검출 가능한 물질을 검출함을 포함하는 상기 샘플 중의 hK9를 정량 분석함으로써 난소암종을 감시 또는 진단하기 위한 진단 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) hK9 단백질에 결합하는 항체의 양을 개인의 샘플과 접촉시켜 상기 샘플 중에 상기 항체와 hK9 단백질을 포함하는 2원 복합체를 형성시키고;
(b) 상기 샘플 중의 복합체 형성의 존재 또는 양을 측정 또는 검출하고;
(c) 나중의 시점에서 단계 (a) 및 (b)를 반복하고;
(d) 단계 (b)의 결과를 단계 (c)의 결과와 비교함(이때 복합체 형성 양의 차이는 상기 개인의 난소암의 단계 및/또는 진행의 지표이다)
을 포함하는, 개인에서 난소암의 진행을 감시하는 방법을 고려한다.
상기 복합체의 양을 또한 난소암의 위험이 없거나 또는 상이한 단계의 난소암에 걸린 개인으로부터의 복합체의 양을 나타내는 값과 비교할 수 있다.
항체를 hK9 단백질의 항원 결정소와 항체간의 결합 상호작용에 의존하는 임의의 공지된 면역분석에 사용할 수 있다. 상기와 같은 분석의 예로는 방사성면역분석, 효소 면역분석(예: ELISA), 면역형광, 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집 및 조직화학적 시험이 있다. 이러한 용어들은 당해 분야의 숙련가들에게 잘 이해된다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험 없이 다른 면역분석 포맷들을 알거나 또는 쉽게 식별할 수 있을 것이다.
상기 항체를 면역 조직화학적 분석에 예를 들어 세포 및 세포 이하 수준에서 hK9 단백질의 검출, 상기의 특정 난소 종양 세포 및 조직으로의 국소화, 및 특정한 세포 하 위치 측정, 및 발현 수준의 정량분석에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체에는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예: Fab 또는 (Fab)2단편), 항체 중 쇄, 인간화된 항체, 항체 경 쇄, 유전자 조작된 단일 쇄 Fv분자(Ladner et al, 미국 특허 제 4,946,778 호), 키메릭 항체, 예를 들어 쥐 항체에 대한 결합 특이성을 함유하지만, 나머지 부분은 인간 기원의 것인 항체, 또는 유도체, 예를 들어 효소 결합체 또는 표지된 유도체가 포함된다.
단클론 및 다클론 항체, 단편 및 키메라를 포함하는 항체들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 단리된 고유 hK9 또는 재조합 hK9를 사용하여 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어 단클론 항체의 제조에 대해서 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor et al.(1985) J. Immunol Methods 81:31-42; Cote et al.(1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030; 및 Cole et al.(1984) Mol Cell Biol 62:109-120]을; 단클론 Fab 단편의 제조에 대해서는 문헌[Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281]을; 항체를 동정하기 위한 파지미드 또는 B-림프구 면역글로불린 라이브러리의 제조에 대해서 문헌[Pound(1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, N.J]을 참조하시오. 본 발명의 방법에 사용되는 hK9에 특이적인 항체를 또한 과학적 또는 상업적 출처로부터 수득할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 항체들은 10-7M 이상의 Ka로 결합하는 한 hK9에 대해 반응성이다. 본 발명의 샌드위치 면역분석에서 마우스 다클론 항체 및 토끼 다클론 항체를 사용할 수 있다.
hK9에 결합하는 항체를 검출 가능한 물질로 표지하고 상기 검출 가능한 물질의 존재를 근거로 생물학적 샘플 중의 위치를 알아낸다. 검출 가능한 물질의 예로는 비 제한적으로 방사성 동위원소(예:3H,14C,35S,125I,131I), 형광 표지(예: FITC, 로다민, 란타나이드 인광물질); 발광 표지, 예를 들어 루미놀; 효소 표지(예를 들어 양고추냉이 페록시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제); 비오티닐 그룹(표시된 아비딘, 예를 들어 광학 또는 열량 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙트아비딘에 의해 검출될 수 있다); 및 2 차 정보제공인자(예를 들어 류신 지퍼 쌍 서열, 2 차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프가 있다. 일부 태양들에서, 표지를 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 이격자 팔을 통해 부착시킨다. 항체를 또한 전자 밀집 물질, 예를 들어 페리틴 또는 콜로이드성 금(이들은 전자 현미경에 의해 쉽게 가시화된다)에 커플링시킬 수 있다.
또한 1 차 항원-항체 반응이 hK9에 대해 반응성인 항체에 특이적인 2 차 항체의 도입에 의해 증폭되는 간접적인 방법을 사용할 수 있다. 예로서, hK9에 대한 특이성을 갖는 항체가 토끼 IgG 항체인 경우, 상기 2 차 항체는 본 원에 개시된 바와 같은 검출 가능한 물질로 표지된 염소 항-토끼 감마-글로불린일 수 있다.
상기 논의된 항체를 결합시키거나 또는 표지하는 방법은 당해 분야의 통상의숙련가에 의해 쉽게 수행될 수 있다(예를 들어 효소 또는 리간드 결합 짝으로 항체를 표지하거나 이들과 결합시키는 방법에 대해서 문헌[Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek(eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; 및 Wilchek and Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in bioanalytical Applications", Anal. Biochem. 171:1-32, 1988]을 참조하시오).
빛과 전자 현미경을 사용하여 항원의 위치를 알아내는 당해 분야에 공지된 세포화학 기법들을 사용하여 hK9 단백질을 검출할 수 있다. 일반적으로, 항체를 검출 가능한 물질로 표지하고 hK9 단백질을 상기 검출 가능한 물질의 존재를 근거로 조직과 세포 중에서의 위치를 알아낼 수 있다.
본 발명의 방법과 관련하여, 상기 샘플 또는 hK9에 대한 결합제(예를 들어 항체)를 담체 또는 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 자철광, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 견 등이다. 상기 지지체 물질은 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(예: 비드), 원통형(예: 시험관 또는 웰의 내면 또는 봉의 외면), 또는 평면형(예: 시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다. 따라서, 담체는 예를 들어 튜브, 시험 플레이트, 웰, 비드, 원반, 구 등의 모양일 수 있다. 고정화된 물질은 상기 물질을 공지된 화학적또는 물리적 방법, 예를 들어 시아노겐 브로마이드 커플링을 사용하여 적합한 불용성 담체와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 결합제(예: 항체)를 상기 항체에 특이적인 2 차 항체를 사용하여 간접적으로 고정화시킬 수 있다. 예를 들어, 마우스 항-hK9 항체를 담체 또는 지지체 상에 코팅된 양 항-마우스 IgG Fc 단편 특이 항체를 사용하여 고정화시킬 수 있다.
방사성 표지를 검출 가능한 물질로서 사용하는 경우, hK9 단백질을 방사선 사진술에 의해 위치 측정할 수 있다. 다양한 광학적 방법에 의해 또는 그레인을 카운트함으로써 상기 방사선 사진 중의 입자의 밀도를 측정함으로써 방사선 사진 촬영 결과를 정량화할 수 있다.
시간 분석식 형광 측정을 사용하여 신호를 검출할 수 있다. 예를 들어 문헌[Christopoulos TK and Diamandis EP Anal Chem 1992:64:342-346]에 개시된 방법을 통상적인 시간 분석식 형광계와 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시태양에 따라, hK9 항체를 효소로 표지하고, 기질 또는 효소와 기질의 반응 산물이 란타나이드 금속과 형광 착체를 형성하도록 선택된 상기 효소에 대한 기질을 첨가하는 방법을 제공한다. 란타나이드 금속을 가하고 hK9를 상기 형광 착체의 형광성을 측정함으로써 상기 샘플 중에서 정량 분석한다. hK9 특이 항체를 효소로 직접 또는 간접 표지할 수 있다. 효소를, 상기 효소의 기질 또는 효소와 기질의 반응 생성물이 유러퓸 및 테르븀과 같은 란타나이드 금속과 착체를 형성하는 능력을 기준으로 선택한다.
상기와 같은 형광 착체를 제공하는 효소 및 효소에 대한 기질의 예가 미국특허 제 5,312,922 호(Diamandis)에 개시되어 있다. 본 발명의 태양에서 상기 효소는 알칼리성 포스파타제 또는 β-갈락토시다제이다. 하나의 실시태양에서, 상기 효소는 알칼리성 포스파타제이다. 예로서, 항체를 알칼리성 포스파타제로 직접 또는 간접 표지하는 경우, 상기 방법에 사용되는 기질은 4-메틸룸벨리페릴 포스페이트, 5-플루오로살리실 포스페이트 또는 디플루니살 포스페이트일 수 있다. 상기 착체의 형광 강도를 전형적으로는 시간 분석식 형광계, 예를 들어 CyberFluor 615 면역분석기(Nordion International, Kanata, Ontario)를 사용하여 측정한다.
hK9 항체를 또한 효소로 간접적으로 표지할 수 있다. 예를 들어, 항체를 리간드 결합 쌍의 한 짝에 결합시키고, 상기 효소를 상기 리간드 결합 쌍의 다른 짝에 커플링시킬 수 있다. 전형적인 예로는 아비딘-비오틴 및 리보플라빈-리보플라빈 결합 단백질이 있다. 바람직하게는 항체를 비오티닐화시키고 효소를 스트렙트아비딘에 커플링시킨다. 또 다른 실시태양에서, 항-hK9 항체에 특이적인 항체를 효소로 표지한다.
하나의 실시태양에 따라, 본 발명은 hK9를 면역분석에 의해 측정함으로써 혈청 샘플 중의 hK9를 측정하는 수단을 제공한다. 다양한 면역분석 방법들을 사용하여 혈청 중의 hK9를 측정할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명하다. 일반적으로, hK9 면역분석 방법은 경쟁적이거나 비 경쟁적일 수 있다. 경쟁적인 방법은 전형적으로는 hK9에 고정화되거나 고정성인 항체와 hK9의 표지된 형태를 사용한다. 샘플 hK9 및 표지된 hK9는 항-hK9에 대한 결합을 경쟁한다. 결합되지 않고 남아있는 것(결합되지 않은 분획)으로부터 항-hK9에 결합되는 생성된 표지된 hK9(결합된 분획)를 분리시킨 후에, 상기 결합되거나 결합되지 않은 분획 중의 표지의 양을 측정하고 이를 임의의 통상적인 방식으로, 예를 들어 표준 곡선에 대한 비교에 의해 시험 샘플 중의 hK9의 양과 상관 지을 수 있다.
바람직하게는, 비 경쟁적 방법을 hK9의 측정에 사용하는데, 가장 통상적인 방법은 "샌드위치" 방법이다. 이 분석에서는 2 개의 항-hK9 항체를 사용한다. 항-hK9 항체들 중 하나를 직접 또는 간접 표지하고(때때로 "검출 항체"라 칭한다) 다른 것을 고정화시키거나 또는 고정화 가능하다(때때로 "포획 항체"라 칭한다). 상기 포획 및 검출 항체를 시험 샘플과 동시에 또는 순차적으로 접촉시킬 수 있다. 연속적인 방법은 포획 항체를 샘플과 배양하고 그 후에 검출 항체를 소정의 시간으로 가함으로써 수행하거나(때때로 "순방향" 방법이라 칭함); 또는 검출 항체를 먼저 샘플과 배양하고 이어서 포획 항체를 가할 수 있다(때때로 "역방향" 방법이라 칭함). 필요한 배양(들)이 일어난 후에, 분석을 완료하기 위해서 포획 항체를 액체 시험 혼합물로부터 분리시키고 표지를 분리된 포획 항체 상의 적어도 일부 또는 상기 액체 시험 혼합물 중의 나머지에서 측정한다. 일반적으로는 포획 항체 상이 상기 포획 및 검출 항체에 의해 결합된(이들 사이에 "샌드위치된") hK9를 포함하므로 상기 상 중에서 측정한다.
hK9에 대한 전형적인 2 부위 면역측정 분석에서, 포획 및 검출 항체 중 하나 또는 이들 모두는 다클론 항체이거나, 또는 포획 및 검출 항체 중 하나 또는 이들 모두 단클론 항체이다(즉 다클론/다클론, 단클론/단클론, 또는 단클론/다클론). 검출 항체에 사용되는 표지를 당해 분야에 통상적으로 공지된 것들 중에서 선택할수 있다. 상기 표지는 효소 또는 화학발광 잔기일 수 있으나, 또한 방사성 동위원소, 형광물질, 검출 가능한 리간드(예를 들어 상기 리간드에 대한 표지된 결합 짝에 의한 2 차 결합에 의해 검출 가능한 것) 등일 수도 있다. 바람직하게는, 상기 항체를 효소와 기질의 반응 생성물이 형광 착체를 형성하도록 선택된 기질을 가함으로써 검출되는 효소로 표지한다. 포획 항체를 상기가 시험 혼합물의 나머지로부터 분리되는 수단을 제공하는 것으로 선택한다. 따라서, 포획 항체를 이미 고정화되거나 또는 불용성인 형태로 분석에 도입시키거나 또는 고정화 가능한 형태, 즉 포획 항체를 분석에 도입시킨 다음에 고정화를 수행할 수 있는 형태일 수 있다. 고정화된 포획 항체는 고체 상, 예를 들어 자기 입자, 라텍스 입자, 미세적정 플레이트 웰, 비드, 큐벳, 또는 다른 반응 용기에 공유 또는 비공유적으로 부착된 항체를 포함할 수 있다. 고정화 가능한 포획 항체의 예는 리간드 잔기, 예를 들어 합텐, 비오틴 등에 의해 화학적으로 개질되고 리간드의 결합 짝, 예를 들어 항체, 아비딘 등의 고정화된 형태와의 접촉에 의해 후속적으로 고정화될 수 있는 항체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 포획 항체를 고체 상에 결합되는 포획 항체에 특이적인 항체 종들을 사용하여 고정화시킬 수 있다.
본 발명의 특정한 샌드위치 면역분석 방법은 hK9에 대해 반응성인 2 개의 항체, 효소 표지로 표지된 hK9에 대해 반응성인 항체에 특이적인 2 차 항체, 및 효소에 대한 형광원 기질을 사용한다. 하나의 실시태양에서, 상기 효소는 알칼리성 포스파타제(ALP)이고 기질은 5-플루오로살리실 포스페이트이다. ALP는 형광원 기질 5-플루오로살리실 포스페이트 중에서 포스페이트를 절단시켜 5-플루오로살리실산(FSA)을 생성시킨다. 이어서 5-플루오로살리실산은 FSA-Tb(3+)-EDTA 형태의 고도로 형광성인 3원 착체를 형성할 수 있으며, 이는 시간 분석적 방식으로 Tb3+ 형광성을 측정함으로써 정량화할 수 있다. 형광 강도를 본 원에 개시된 바와 같은 시간 분석식 형광계를 사용하여 측정한다.
상술한 면역분석 방법 및 포맷들은 예시적인 것이고 제한적이지 않으며, 따라서 일반적으로 임의의 면역분석 방법 또는 포맷들은 본 발명에 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
영상화 방법
hK9와 결합하는 결합제, 특히 항체를 난소암의 관리에서 영상화 방법에 사용할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 칼리크레인, 바람직하게는 난소암과 관련된 칼리크레인, 가장 바람직하게는 hK9와 관련된 종양의 영상화 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 난소암에 대한 다수의 마커들을 사용하는 본 원에 개시된 영상화 방법을 고려한다. 예를 들어, 난소암의 영상화 방법은 환자에게 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE), 합토글로빈 알파, 오스테오폰틴, 칼리크레인 4, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 8, 칼리크레인 10, 칼리크레인 11, CA125, CA15-3, CA72-4, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA), 크레아틴-키나제 BB, 및 암배아 항원(CEA) 중 하나 이상을 주입함을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는 각각의 약제를 상기가 영상화 도중 식별될 수 있도록 표지한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 생체 내 방법이며 대상자 또는 환자에게영상화 표지를 수반하고 칼리크레인을 표적화하거나 이에 결합될 수 있는 하나 이상의 약제를 투여한다. 상기 약제는 생체 내에서 배양되어 종양, 바람직하게는 난소 종양과 관련된 칼리크레인(들)에 결합한다. 상기 표지의 존재를 난소암에 국소화시켜 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 영상화 장치를 사용하여 상기 국소화된 표지를 검출한다.
결합제는 칼리크레인(들)을 인식하는 항체 또는 화학적 존재일 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에서, 상기 약제는 다클론 항체 또는 단클론 항체, 또는 그의 단편, 또는 그의 구조물, 예를 들어 비 제한적으로 단일 쇄 항체, 이작용성 항체, 분자 인식 유닛, 및 펩티드 또는 펩티드를 닮은 존재이다. 본 발명의 방법에 사용되는 칼리크레인에 특이적인 항체를 과학적 또는 상업적 출처로부터 수득하거나, 또는 단리된 고유 칼리크레인 또는 재조합 칼리크레인을 사용하여 본 원에 개시된 항체들을 제조할 수 있다.
약제는 칼리크레인 특이 항체에 대해 에피토프를 모방하고 상기 칼리크레인에 결합하는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드를 통상적인 고체 상 화학을 사용하여 상업적인 합성기 상에서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 티로신 리신 또는 페닐알라닌(N2S2킬레이트가 착화됨)을 포함한 펩티드를 제조할 수 있다(미국 특허 제 4,897,255 호 참조). 이어서 항-칼리크레인 펩티드 결합체를 방사성 표지(예: 나트륨99mTc 퍼테크네테이트 또는 나트륨188Re 퍼레네이트)와 결합시키고 이를 사용하여 칼리크레인 생성 종양의 위치를 알아낼 수 있다.
상기 약제는 칼리크레인을 영상화하는 표지를 수반한다. 상기 약제를 방사성핵종 영상화에 사용하기 위해 표지할 수 있다. 특히, 상기 약제를 방사성 동위원소로 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 방사성 동위원소의 예로는 하기의 것들이 있다:277Ac,211At,128Ba,131Ba,7Be,204Bi,205Bi,206Bi,76Br,77Br,82Br,109Cd,47Ca,11C,14C,36Cl,48Cr,51Cr,62Cu,64Cu,67Cu,165Dy,155Eu,18F,153Gd,66Ga,67Ga,68Ga,72Ga,198Au,3H,166Ho,111In,113mIn,115mIn,123I,125I,131I,189Ir,191mIr,192Ir,194Ir,52Fe,55Fe,59Fe,177Lu,15O,191m-191Os,109Pd,32P,33P,42K,226Ra,186Re,188Re,82mRb,153Sm,46Sc,47Sc,72Se,75Se,105Ag,22Na,24Na,89Sr,35S,38S,177Ta,96Tc,99mTc,201Tl,202Tl,113Sn,117mSn,121Sn,166Yb,169Yb,175Yb,88Y,90Y,62Zn 및65Zn. 바람직하게는 방사성 동위원소는123I,125I,131I,111I,99mTc,90Y,186Re,188Re,32P,153Sm,67Ga,201Tl,77Br 또는18F이고, 광주사 장치에 의해 영상화된다.
방사성 동위원소에 의한 생물약제의 표지 방법은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 미국 특허 제 4,302,438 호에는 트리튬 표지 방법이 개시되어 있다. 쥐 단클론 항체에 특히 적합한 요오드화, 트리튬 표지 및35S 표지화 방법이 문헌[Goding J.W.(상기 pp. 124-126)] 및 이 중에 인용된 참고문헌에 개시되어 있다. 생물약제, 예를 들어 항체, 그의 결합 부분, 탐침 또는 리간드의 다른 요오드화 방법들이 과학 문헌에 개시되어 있다(Hunter and Greenwood, Nature 144:945(1962), David et al., Biochemistry 13:1014-1021(1974), 및 미국 특허 제 3,867,517 호 및 4,376,110 호를 참조하시오). 약제에 대한 요오드화 방법이 문헌[Greenwood, F. et al., Biochem. J. 89:114-123(1963); Marchalonis, J., Biochem. J. 113:299-305(1969); 및 Morrison, M. et al., Immunochemistry, 289-297(1971)]에 개시되어 있다.99mTc-표지화 방법이 문헌[Rhodes, B. et al., Burchiel, S. et al.(eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunochemical detection of Cancer, New York: Masson 111-123(1982)] 및 이 중에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다. 테그네슘-99m에 의한 항체 또는 단편의 표지화가 또한 예를 들어 미국 특허 제 5,317,091; 4,478,815; 4,478,818; 4,472,371; Re 32,417; 및 4,311,688 호에 개시되어 있다. 생물약제의111In-표지화에 적합한 방법이 문헌[Hnatowich, D.J. et al., J. Immul. Methods, 65:147-157(1983), Hnatowich, D. et al., J. Applied Radiation, 35:554-557(1984) 및 Buckley, R. G. et al., F.E.B.S. 166:202-204(1984)]에 개시되어 있다.
약제를 또한 본 발명의 생체 내 방법의 목적을 위해 상자성 동위원소로 표지할 수도 있다. 자기 공명 영상화에 유용한 원소들의 예로는 가돌리늄, 테르븀, 주석, 철 또는 그의 동위원소들이 있다(생체 내 핵 자기 공명 영상화에 대한 논의에 대해서 예를 들어 문헌[Schaefer et al.,(1989) JACC 14, 472-480; Shreve etal.,(1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G.L.,(1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al.,(1984) Invest. Radiol. 19, 408-415]을 참조하시오).
방사성 표지된 약제의 경우에, 상기 약제를 환자에게 투여할 수 있으며, 상기 약제를 상기와 결합하고 예를 들어 감마 카메라 또는 방출 X선 단층 촬영을 사용하는 방사성 핵 주사와 같은 공지된 기법을 사용하여 생체 내에서 검출 또는 "영상화"되는 칼리크레인을 갖는 종양에 국소화시킨다(예를 들어 문헌[A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp. 65-85(Academic Press 1985)]을 참조하시오). 양전자 방출 축 관통 X선 단층 촬영 스캐너, 예를 들어 브룩해븐 내셔널 래보라토리(Brookhaven National Laboratory)에 위치한 지정된 Pet VI(방사성 표지가 양전자, 예를 들어11C,18F,15O 및13N을 방출한다)를 또한 사용할 수 있다.
방사성동위원소 표지된 약제를 사용하는 전신 영상화 기법을 1 차 종양 및 전이된 종양 모두의 위치를 알아내는데 사용할 수 있다. 동일한 에피토프 특이성을 갖는 칼리크레인 또는 그의 단편에 특이적인 항체를 적합한 방사성 동위원소 또는 그의 조합에 결합시키고 비 경구적으로 투여한다. 난소암의 경우에, 투여는 정맥 내 투여가 바람직하다. 표지의 생체 분포를 신티그램 촬영에 의해 감시할 수 있으며, 표지의 축적은 난소암 세포의 존재와 관련이 있다. 전신 영상화 기법이 미국 특허 제 4,036,945 호 및 4,311,688 호에 개시되어 있다. 항체 및 항체 단편에 커플링시킬 수 있는 진단 및 치료용으로 유용한 약제들의 다른 예로 메탈로티오네인 및 단편이 있다(미국 특허 제 4,732,864 호 참조). 상기 약제는 암, 특히 난소암의 진단 단계 및 가시화에 유용하며, 따라서 수술 및/또는 방사선 치료 프로토콜을 보다 효율적으로 사용할 수 있다.
상기 약제는 생물발광 또는 화학발광 표지를 수반할 수 있다. 상기와 같은 표지로는 형광성, 생물발광성 또는 화학발광성인 것으로 공지되거나, 특정 기질(시약) 상에서 효소로서 작용하거나 또는 형광성, 생물발광성 또는 화학발광성 분자를 생성시킬 수 있는 폴리펩티드가 있다. 생물발광성 또는 화학발광성 표지의 예로는 루시페라제, 에쿼린, 오벨린, 네미옵신, 베로빈, 페난트리디늄 에스테르 및 이들의 변체 및 이들의 조합이 있다. 생물발광성 또는 화학발광성 폴리펩티드용 기질을 또한 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어 화학발광 폴리펩티드는 루시페라제 및 루시페린 시약일 수 있다. 생물발광성 또는 화학발광성 표지용 기질을 시약의 투여 전, 투여와 동시(즉 동일한 제형으로)에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
약제는 상자성 화합물, 예를 들어 금속, 예를 들어 메탈로포르피린에 킬레이트된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 상자성 화합물은 또한 단결정성 나노입자, 예를 들어 란타나이드(예: Gd) 또는 산화 철을 포함하는 나노입자; 또는 란타나이드를 포함하는 금속 이온을 포함할 수 있다. "란타나이드"는 원자 번호 58 내지 70의 원소, 원자 번호 21 내지 29, 42 또는 44의 전이 금속, Gd(III),Mn(II), 또는 Fe 원소를 포함하는 원소를 지칭한다. 상자성 화합물은 또한 네오디뮴 산화 철(NdFeO.sub.3) 또는 디스프로슘 산화 철(DyFeO.sub.3)을 포함할 수 있다. 자기 공명 영상화에 유용한 원소들의 예로는 가돌리늄, 테르븀, 주석, 철 또는 이들의 동위원소가 있다(생체 내 핵 자기 공명 영상화에 대한 논의에 대해서 예를 들어 문헌[Schaefer et al.,(1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al.,(1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G.L.,(1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al.,(1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al.,(1984) Invest. Radiol. 19, 408-415]을 참조하시오).
상은 컴퓨터 지원 X선 단층 촬영(CAT), 자기 공명 분광학(MRS) 상, 자기 공명 영상화(MRI), 양전자 방출 X선 단층 촬영(PET), 단일-광자 방출 컴퓨터화된 X선 촬영(SPECT), 또는 생물발광성 영상화(BLI) 또는 등가물에 의해 본 발명의 방법에 발생시킬 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 컴퓨터 지원 X선 촬영(CAT) 및 컴퓨터화된 축 X선 촬영(CAT) 시스템 및 장치를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 6,151,377; 5,946,371; 5,446,799; 5,406,479; 5,208,581; 5,109,397 호를 참조하시오). 본 발명은 또한 동물 영상화 양식, 예를 들어 MicroCAT.TM.(ImTek, Inc.)을 이용할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 자기 공명 영상화(MRI) 시스템 및 장치를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 자기 공명 방법 및 장치에서 관심 영역에 자기 정렬 평행 축을 명확히 하기 위해서 공전 자기장을 인가시킨다. 이어서 무선 주파수장을 상기 영역에 자기 공명을 여기시키기 위해 상기 공전 자기장 방향에 직교하는 방향으로 상기 영역에 인가시킨다. 이어서 생성된 무선 주파수 신호를 검출하고 처리하고, 여기된 무선 주파수 장을 인가시킨다. 생성된 신호를 관심 신체 영역 또는 조직에 인접하게 놓인 무선 주파수 코일에 의해 검출한다(MRI 방법 및 장치에 대한 설명에 대해서 예를 들어 미국 특허 제 6,151,377; 6,144,202; 6,128,522; 6,127,825; 6,121,775; 6,119,032; 6,115,446; 6,111,410; 602,891; 5,555,251; 5,455,512; 5,450,010; 5,378,987; 5,214,382; 5,031,624; 5,207,222; 4,985,678; 4,906,931; 4,558,279 호를 참조하시오). MRI 및 지지 장치를 예를 들어 Bruker Medical GMBH; Caprius; Esaote Biomedica; Fonar; GE Medical Systems(GEMS); Hitachi Medical Systems America; Intermagnetics General Corporation; Lunar Corp.; Magne Vu; Marconi Medicals; Philips Medical Systems; Shimadzu; Siemens; Toshiba America Systems로부터 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들어 Silicon Graphics에 의해 영상화 시스템을 입수할 수 있다. 본 발명은 또한 마이크로-MRI와 같은 동물 영상화 양식을 이용할 수도 있다.
당해 분야에 널리 공지된 양전자 방출 X선 단층 촬영 영상화(PET) 시스템 및 장치를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 브록해븐 내셔널 래보라토리에 위치한 지정된 Pet VI 시스템을 사용할 수 있다. PET 시스템 및 장치에 대한 설명에 대해서 예를 들어 미국 특허 제 6,151,377; 6,072,177; 5,900,636; 5,608,221; 5,532,489; 5,272,343; 5,103,098을 참조하시오. 동물 영상화 양식, 예를 들어 마이크로-PET(Corcorde Microsystems, Inc.)를또한 본 발명에 사용할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 단일-광자 방출 컴퓨터화된 X선 촬영(SPECT) 시스템을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 6,115,446; 6,072,177; 5,608,221; 5,600,145; 5,210,421; 5,103,098 호를 참조하시오). 본 발명의 방법은 또한 동물 영상화 양식, 예를 들어 마이크로-SPECT를 이용할 수 있다.
생물발광 영상화는 생물발광, 형광 또는 화학발광을 검출할 수 있는 생물발광, 형광 또는 화학발광 또는 다른 광자 검출 시스템 및 장치를 포함한다. 민감성 광자 검출 시스템을 사용하여 생물발광성 및 형광성 단백질을 외부적으로 검출할 수 있다; 예를 들어 문헌[Contag(2000) Neoplasia 2:41-52; Zhang(1994) Clin. Exp. Metastasis 12:87-92]을 참조하시오. 본 발명의 방법을 임의의 상기와 같은 광자 검출 장치 또는 그의 변형 또는 등가 장치를 사용하거나, 또는 가시 영상화를 포함하여 임의의 공지된 광자 검출 방법과 함께 실시할 수 있다. 예로서, 상 처리 장치에 커플링된 강화된 전하-커플링된 장치(ICCD) 카메라를 본 발명에 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 5,650,135 호를 참조하시오). 광자 검출 장치를 또한 제노겐(Xenogen, Hamamatsue)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 고려한다. 상기와 같은 키트는 전형적으로 진단 분석의 수행에 필요한 2 개 이상의 요소들을 포함한다. 요소에는 비 제한적으로 화합물, 시약, 용기 및/또는 장치가 포함된다.
본 원에 개시된 방법을, 환자를 선별 및 진단하고 질병에 걸리기 쉬운 것으로 보이는 개인을 선별하고 확인하기 위해, 예를 들어 임상 설비에 통상적으로 사용될 수 있는, 본 원에 개시된 하나 이상의 특정한 KLK9 핵산 또는 항체를 포함하는 사전 패키징된 진단 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 키트를 갖는 용기는 본 원에 개시된 결합제를 포함한다. 예로서, 상기 키트는 hK9에 특이적인 항체, 효소로 표지된 항-hK9 항체에 대한 항체; 및 상기 효소에 대한 기질을 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 미세적정 플레이트 웰, 표준, 분석 희석제, 세척 완충제, 접착성 플레이트 커버, 및/또는 상기 키트를 사용하여 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에서, 상기 키트는 칼리크레인 9의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 및 사용 전에 추가로 희석할 수 있는 농축물(동결 건조된 조성물 포함)로서 또는 바이알이 하나 이상의 용량을 포함할 수 있는 경우 사용 농도의, 종양 세포와 결합된 에피토프에 대한 항체의 결합을 검출하는 수단을 포함한다. 상기 키트를 생체 내 용도로 사용하고자 하는 경우, 목적하는 양 및 농도의 약제를 갖는 단일 용량을 멸균된 용기 중에 제공할 수 있다. 직접 사용하기 위한 제형을 제공하는 용기는, 예를 들어 키트가 생체 내 영상화를 위한 방사성 표지된 항체 제제를 함유하는 경우 대개 다른 시약들을 필요로 하지 않는다.
키트를 샘플 중의 hK9를 암호화하는 핵산 분자의 수준을 검출하도록 고안할수 있다. 상기와 같은 키트는 일반적으로 본 원에 개시된 바와 같이 hK9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 포함한다. 상기와 같은 올리고뉴클레오티드를 예를 들어 PCR 또는 하이브리드화 방법에 사용할 수 있다. 상기 키트 내에 존재할 수 있는 추가의 성분들로는 hK9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 검출을 용이하게 하는 2 차 올리고뉴클레오티드 및/또는 진단 시약이 있다.
치료 용도
hK9는 난소암 면역요법의 표적이다. 상기와 같은 면역요법 방법은 항체 요법, 생체 내 백신 및 생체 외 면역요법 접근법의 용도를 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 난소암을 치료하기 위해 전신적으로 사용될 수 있는 hK9 항체를 제공한다. 바람직하게는 주변의 비 종양 세포와 조직이 아닌 종양 세포를 표적으로 하는 항체를 사용한다. 따라서, 본 발명은 hK9를 발현하는 암에 민감하거나 또는 상기 암에 걸린 환자에게 유효량의 hK9에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게 종양 세포의 성장을 억제하는데 유효한 양의 hK9에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, hK9를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. hK9 항체를 또한, hK9 항체 면역결합체 또는 면역독소를 세포의 성장을 억제하거나 세포를 죽이기에 충분한 양으로 상기 세포와 반응시킴을 포함하는, hK9를 발현하는 세포의 성장을 선택적으로 억제하거나 세포를 죽이는 방법에 사용할 수 있다.
예로서, 결합되지 않은 hK9 항체를 상기 항체가 hK9 발현 암세포에 결합하고 상보물-매개된 세포용해, 항체-의존적인 세포성 세포독성을 포함하여 hK9의 생리적 기능 및/또는 리간드 결합 또는 신호 전달 경로의 억제를 변경시킬 수 있는 기전에 의해 상기와 같은 세포와 종양의 성장 억제(파괴 포함)를 매개하도록 환자에게 도입시킬 수 있다. 결합되지 않은 hK9 항체 이외에, 치료제에 결합된 hK9 항체(예를 들어 면역결합체)를 또한 상기 치료제를 hK9 발현 종양 세포로 직접 전달하여 종양을 파괴하도록 치료학적으로 사용할 수 있다. 상기와 같은 치료제의 예로는 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자; 및 생물학적 반응 조절제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-6, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 또는 다른 성장 인자가 있다.
hK9 항체를 사용하는 암 면역요법은 암, 예를 들어 비 제한적으로 결장암(Arlen et al., 1998, Crit Rev Immunol 18:133-138), 다발성 골수종(Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186; Tsunenati et al., 1997, Blood 90:2437-2444), 위암(Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res 52:2771-2776), B-세포 림프종(Funakoshi et al., 1996, J Immunther Emphasis Tumor Immunol 19:93-101), 백혈병(Zhong et al., 1996, Leuk Res 20:581-589), 직장결장암(Moun et al., 1994, Cancer Res 54: 6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res 55:4398-4403), 및 유방암(Shepard et al., 1991, J Clin Immunol 11:117-127)에 성공적으로 사용된 다양한 접근법들을 사용할 수 있다.
본 발명 방법의 실시에서, hK9를 발현하는 암세포의 성장을 억제할 수 있는 항-hK9 항체를 종양이 hK9를 발현하거나 과발현하는 암 환자에게 치료 유효량으로 투여한다. 본 발명은 난소암에 특이적인 유효하고 장기적인 치료를 제공할 수 있다. 본 발명의 항체 요법을 화학요법 및 방사선을 포함한 다른 요법들과 겸할 수 있다.
환자를 바람직하게는 종양 조직의 면역 조직 화학적 평가, 본 원에 개시된 바와 같은 정량적인 hK9 영상화, 또는 hK9 발현의 존재 및 정도를 신뢰성 있게 가리킬 수 있는 다른 기법들을 사용하여 종양 중의 hK9 발현 및 과발현의 존재 및 수준에 대해서 평가할 수 있다. 종양 생검 또는 수술 시편에 대한 면역 조직화학적 분석을 상기 목적에 사용할 수 있다.
암의 치료에 유용한 항-hK9 항체는 종양에 대해 효능있는 면역 반응을 개시킬 수 있는 것들과 직접적인 세포독성이 가능한 것들을 포함한다. 이와 관련하여, 항-hK9 항체는 상보물-매개되거나 항체-의존적인 세포 세포독성(ADCC) 기전(이들 모두 효과기 세포 Fc 수용체 부위 또는 상보성 단백질과의 상호작용을 위해 면역글로불린 분자의 완전한 Fc 부분을 요한다)에 의해 종양 세포 용해를 유도해 낼 수 있다. 또한, 종양 성장에 직접적인 생물학적 효과를 발휘하는 항-hK9 항체가 본 발명의 실시에 유용하다. 상기와 같은 항체는 상기 효과를 발휘하기 위해 완전한 면역글로불린을 필요로 하지 않을 수도 있다. 상기와 같은 직접적인 세포독성 항체에 의해 작용될 수 있는 잠재적인 기전은 세포 성장의 억제, 세포 분화의 조절, 종양 혈관형성 인자 프로파일의 조절 및 세포사멸의 유도를 포함한다. 특정 항체가 항-종양 효과를 발휘하는 기전을 ADCC, 항체-의존성 대식세포-매개된 세포독성(ADMMC), 상보물-매개된 세포 용해 및 당해 분야에 공지된 다른 것들을 측정하기 위해 고안된 임의의 수의 생체 외 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
특정 항-hK9 항체, 또는 항-hK9 항체들의 조합의 항-종양 활성을 적합한 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 평가할 수 있다. 인간 암 외식편 또는 계대 배양된 이종 이식편 조직을 면역 타협된 동물, 예를 들어 누드 또는 SCID 마우스에 도입시킨, 이종 개체 암 모델을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 단일 항-hK9 항체뿐만 아니라 상이한 개별 항체들, 예를 들어 상이한 에피토프 또는 다른 칼리크레인을 인식하는 것들의 조합 또는 "칵테일"의 투여를 고려한다. 상기와 같은 칵테일은 상기가 상이한 에피토프 또는 칼리크레인에 결합하는 항체를 함유하고/하거나 상이한 효과기 기전을 이용하거나 세포독성 항체를 면역 효과기 기능에 의존하는 세포독성 항체와 직접 결합시키는 한 특정한 이점들을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체들은 함께 상승적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 항-hK9 항체의 투여를 다른 치료제, 예를 들어 비 제한적으로 화학요법제, 안드로겐-차단제 및 면역 조절제(예: IL2, GM-CSF)와 겸할 수 있다. 항-hK9 항체를 "그대로" 또는 결합되지 않은 형태로 투여하거나, 또는 상기 항체에 치료제가 결합될 수도 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 사용되는 항-hK9 항체를 목적하는 전달 방법에적합한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 적합한 담체는 항체와 결합 시 상기 항체의 항-종양 기능을 유지하고 대상자의 면역 체계와 비 반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로서 임의의 다수의 표준 약학 담체, 예를 들어 멸균 인산염 완충된 염수 용액, 세균발육 저지 수 등이 있다(일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16.sup.th Edition, A. Osal., Ed., 1980)]을 참조하시오).
항-hK9 항체 제형을 항체를 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 종양 부위로 투여할 수 있다. 투여 경로에는 비 제한적으로 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 종양 내, 피 내 등이 포함된다. 바람직하게는, 상기 투여 경로는 정맥 내 주입이다. 항-hK9 항체 제제를 동결 건조시키고 멸균 분말로서 바람직하게는 진공 하에서 보관하고 이어서 주입 전에 예를 들어 벤질 알콜 보존제를 함유하는 세균발육 저지 수 또는 멸균 수로 재 조성할 수 있다.
치료는 일반적으로 정맥 내 주입(IV)과 같은 허용 가능한 투여 경로를 통해 항체 제제를 유효 용량으로 반복 투여함을 포함할 것이다. 용량은 일반적으로 당해 분야의 숙련가들이 인지하는 다양한 인자들, 예를 들어 암의 유형과 중증도, 암의 등급 또는 단계, 사용되는 항체의 결합 친화도와 반감기, 환자에서의 hK9의 발현 정도, hK9 항원의 순환 정도, 목적하는 정상상태 항체 농도 수준, 치료 회수, 및 본 발명의 치료 방법과 함께 사용되는 임의의 화학요법제의 영향에 따라 변할 것이다. 1 일 용량 범위는 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 주 당 10 내지 500 ㎎ 항체 범위의 용량이 유효하고 잘 허용될 수 있지만, 매주 훨씬 더 높은 용량도 적합하고/하거나 잘 허용될 수 있다. 적합한 용량의 규정에 결정 인자는 특정 상황에 치료학적으로 효과적이기에 필요한 특정 항체의 양이다. 종양 억제 또는 퇴행의 수행에 반복 투여가 필요할 수 있다. hK9 항체의 직접적인 투여가 또한 가능하며 특정한 상황에 유리할 수도 있다.
환자를 가장 효과적인 투여 섭생 및 관련 인자의 결정을 돕기 위해 혈청 hK9에 대해 평가할 수 있다. 본 원에 개시된 hK9 분석 방법 또는 유사한 분석을 치료 전에 환자 중의 순환하는 hK9 수준을 정량 분석하는데 사용할 수 있다. 상기와 같은 분석을 또한 전체 요법을 감시하는데 사용할 수 있으며 이는 혈청 hK9 수준과 같은 다른 변수들의 평가와 함께 치료 성공을 평가하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 hK9 단백질 또는 그의 단편을 함유하도록 제형화된 백신을 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 개인을 활성이 부족한 hK9 단백질 또는 단편으로 접종(여기에서 상기 접종은 상기 개인에 면역 반응을 유도한다)하고 이에 의해 상기 개인을 hK9에 대해 백신화시키는 단계를 포함하는 hK9에 대해 개인을 백신화시키는 방법을 제공한다.
항암 요법에서 체액 및 세포-매개된 면역을 발생시키기 위해 백신에 종양 항원을 사용하는 것은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 전립선암에 인간 PSMA 및 설치류 PAP 면역원이 사용되었다(Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117). 이러한 방법은 hK9 단백질 또는 그의 단편, 또는 hK9 면역원을 발현하고 적합하게 제공할 수 있는 hK9 암호화 핵산 분자 및 재조합 벡터를 사용함으로써 수행될 수 있다.
예로서, 바이러스 유전자 전달 시스템을 사용하여 hK9 암호화 핵산 분자를 전달할 수 있다. 본 발명의 상기 태양의 실시에 사용할 수 있는 다양한 바이러스 유전자 전달 시스템으로는 비 제한적으로 우두, 계두, 카나리폭스, 아데노바이러스, 인플루엔자, 폴리오바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 및 신드버스 바이러스가 있다(Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663). 비 바이러스 전달 시스템을 또한 환자에게 도입된(예를 들어 근육 내로) hK9 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 고유 DNA를 사용하여 항-종양 반응을 유도시킴으로써 사용할 수 있다.
다양한 생체 외 전략들을 또한 사용할 수 있다. 한 가지 접근법은 환자의 면역 체계에 hK9 항원을 제공하기 위한 세포의 용도를 포함한다. 예를 들어 I 및 II 급 MHC를 발현하는 자가이식성 수지상 세포를 MHC 분자에 결합할 수 있는 hK9 또는 그의 펩티드로 파동시켜 암(예를 들어 난소암) 환자의 면역 체계를 자극할 수 있다(예를 들어 문헌[Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380]을 참조하시오).
항-개별특이형 항-hK9 항체를 또한 hK9 단백질을 발현하는 세포에 면역 반응을 유도하기 위한 백신으로서 항암 요법에 사용할 수 있다. 항-개별특이형 항체의 생성은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 hK9 단백질 상에 에피토프를 모방하는 항-개별특이형 항-hK9 항체를 생성시키는데 쉽게 적용시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Wagner et al., 1997, Hybridoma 16:33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96:334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43:65-76]을참조하시오). 상기와 같은 항체를 종양 항원에 대해 지시된 다른 항-개별특이형 항체를 사용하여 현재 실시되는 항-개별특이성 요법에 사용할 수 있다.
유전자 면역 방법을 사용하여 hK9를 발현하는 암세포에 대한 예방학적 또는 치료학적 체액 및 세포 면역 반응을 발생시킬 수 있다. hK9 암호화 DNA 분자를 사용하여, hK9 단백질/면역원을 암호화하는 DNA 및 적합한 조절 서열을 포함하는 구조물을 개인의 근육 또는 피부에 직접 주입하여 상기 근육 또는 피부의 세포가 상기 구조물을 흡수하여 암호화된 hK9 단백질/면역원을 발현하도록 할 수 있다. 상기 hK9 단백질/면역원은 세포 표면 단백질로서 발현되거나 또는 분비될 수 있다. 상기 hK9 단백질/면역원의 발현 결과 암에 대한 예방학적 또는 치료학적 체액 및 세포 면역성이 생성된다. 당해 분야에 공지된 다양한 예방학적 및 치료학적 유전자 면역 기법들을 사용할 수 있다.
본 발명은 hK9를 발현하는 세포의 세포 활성(예를 들어 세포 증식, 활성화 또는 증식)의 억제 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 면역결합체(예를 들어 이종 또는 동종 혼합물)를 hK9 단백질이 상기 면역결합체와 복합체를 형성하도록 세포와 반응시킴을 포함한다. 종양 또는 전-종양 증상이 있는 대상자는 세포 활성의 억제로 세포사가 발생하는 경우 치료될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 면역결합체들 중 임의의 하나 또는 조합을 세포를 억제시키기에 충분한 양으로 세포와 반응시킴으로써 hK9를 발현하는 세포를 선택적으로 억제하는 방법을 제공한다. 양은 세포 성장 또는 증식을 억제하기에 충분하거나 세포를 죽이기에 충분한 양을 포함한다.
레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 우두 바이러스, 또는 다양한 세균 플라스미드로부터 유도된 벡터들을 사용하여 hK9를 암호화하는 핵산 분자를 표적 기관, 조직 또는 세포 집단으로 전달할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 hK9에 대한 안티센스 핵산 분자를 발현하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다(예를 들어 상기 문헌[Sambrook et al]과 [Ausubel et al]에 개시된 기법들을 참조하시오).
벡터를 세포 또는 조직 내로 도입시키는 방법은 본 원에서 논의되고 생체 내, 생체 외 요법에 적합한 방법들을 포함한다. 생체 외 요법의 경우, 벡터를 환자로부터 수득된 줄기 세포 내로 도입시키고 자가 이식을 위해 클론에 의해 동일 환자 내로 번식시킬 수 있다(미국 특허 제 5,399,493 호 및 5,437,994 호 참조). 형질감염 및 리포솜에 의한 전달이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
hK9 단백질을 암호화하는 유전자를, 세포 또는 조직을 목적하는 hK9 암호화 단편을 높은 수준으로 발현하는 벡터로 형질감염시켜 불활성화시킬 수 있다. 상기와 같은 구조물은 세포를 번역할 수 없는 센스 또는 안티센스 서열로 충만시킬 수 있다. DNA 내로의 통합의 부재 하에서조차도, 상기와 같은 벡터는 모든 사본들이 내생 뉴클레아제들에 의해 무력해질 때까지 계속해서 RNA 분자를 전사할 수 있다.
유전자 발현의 변경은 안티센스 분자, DNA, RNA 또는 PNA를 hK9를 암호화하는 유전자의 조절 영역, 즉 프로모터, 인헨서 및 인트론으로 디자인함으로써 이룰 수 있다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 전사 개시 부위, 예를 들어 선두서열의 -10 내지 +10 영역으로부터 나온다. 안티센스 분자를 또한 상기 분자가 전사물이 리보솜에 결합하는 것을 방지함으로써 mRNA의 번역을 차단하도록 디자인할 수도 있다. 억제는 또한 "3 중 나선" 염기 대합 방법을 사용하여 성취할 수 있다. 3 중 나선 대합은 2 중 나선이 폴리머라제의 결합에 충분하게 전사 인자 또는 조절 분자를 개방시키는 능력을 손상시킨다. 3 중 DNA를 사용하는 치료학적 진보가 문헌[Gee JE et al(In: Huber B E and B I Carr(1994) Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco N.Y.]에 고찰되어 있다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉진시키는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상기 리보자임 분자의 상보적 표적 RNA에 대한 서열 특이적 하이브리드화에 이은 엔도뉴클레오 분해 절단에 의해 작용한다. 따라서 본 발명은 hK9 단백질을 암호화하는 서열의 엔도뉴클레오 분해 절단을 특이적이고 효율적으로 촉진시킬 수 있는 조작된 망치머리형 동기 리보자임 분자를 고려한다.
임의의 잠재적인 RNA 표적 내의 특정한 리보자임 절단 부위를 처음에 하기 서열 GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 표적 분자를 주사함으로써 확인할 수 있다. 일단 상기 부위가 확인되면, 상기 절단 부위를 함유하는 표적 유전자 영역에 상응하는 15 내지 20 뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열을 올리고뉴클레오티드를 작동 불능으로 만들 수 있는 2 차 구조 특징에 대해 평가할 수 있다. 후보 표적의 적합성을 또한 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화에 대한 접근성을 시험함으로써 결정할 수 있다.
hK9 단백질 및 상기 단백질과 그의 단편을 암호화하는 핵산을 대상자에서 난소암을 치료하는데 사용할 수 있다. 상기 단백질 또는 핵산을 난소암을 앓고 있는 대상자에게 투여하기 위한 조성물로 제형화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 hK9 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 그의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 난소암의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 hK9 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 본 발명의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.
유효 물질을 예를 들어 주입(피하, 정맥 내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 적용, 또는 직장 투여에 의해 편리한 방식으로 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라, 상기 유효 물질을, 상기 물질을 효소, 산, 및 상기 물질을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 보호하기 위한 물질로 코팅시킬 수도 있다.
본 원에 개시된 조성물을 유효량의 유효 물질이 약학적으로 허용 가능한 비히클과 혼합물로 혼합되도록, 대상자에게 투여될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 조성물의 제조에 대해 그 자체가 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 적합한 비히클들이 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA 1985]에 개시되어 있다. 이를 근거로, 상기 조성물은 비 제한적으로, 유효 물질이 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 희석제와 함께 포함된 용액, 및 적합한 pH 및 생리 유체와 같은 삼투압의 완충 용액 중에 함유된 용액을 포함한다.
상기 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제 또는 다른 형태의 치료(예를 들어 화학요법 또는 방사선 요법)와 함께 치료제로서 지시된다. 본 발명의 조성물을 다른 치료제 또는 요법들과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
하기의 비 제한적인 실시예들은 본 발명을 예시한다.
실시예 1
물질 및 방법
연구 집단
본 연구에 튜린 대학(the University of Turin, Turin Italy) 부인과 종양학과에서 상피성 난소 암종에 대해 수술 치료 중인 168 명의 일련의 환자들로부터의 종양 시편을 포함시켰다. 선택 기준은 조직병리학에 의한 진단 확인을 포함하였다. 어떠한 환자도 수술 전에 어떠한 치료도 받지 않았다.
환자의 연령은 25 내지 82 세로, 중간 값은 59 세였다. 수술 후 잔류 종양의 크기 범위는 0 내지 9 ㎝이었으며, 중간 값이 2 ㎝이었다. 추적 조사 정보(중간 추적 조사 기간 62 개월)를 166 명의 환자들로부터 얻을 수 있었으며, 이들 중 91 명(55%)에서 병이 재발하였고 56 명(34%)은 사망하였다. 조직 유형에 대해서, 82 개의 종양이 심각한 유두암종이었고, 31 개는 자궁내막성이었으며, 27 개는 분화되지 않았고, 13 개는 점액성이었으며, 14 개는 깨끗한 세포였다. 잔류 종양의 크기 범위는 0 내지 9 ㎝이었고 중간 값은 1.0 ㎝이었다.
조직 유형의 분류는 세계 보건 기구 기준(37)에 따랐다. 모든 환자들을 산부인과 등급화 시스템의 국제 연맹에 따라 등급화 하였다(38). 등급화 정보를 167 명의 환자로부터 얻을 수 있었으며; 59 명(35%)은 등급 1 또는 2였고 108 명(65%)은 등급 3의 난소 암종을 가졌다. 등급화를 데이(Day) 등의 기준(39)에 따라 각각 난소 종양에 대해 확립시켰다. 모든 환자를 수술 후 백금 화학요법으로 치료하였다. 제 1 선 화학요법 섭생은 94 명(56%) 환자에서 시스플라틴, 50 명(30%)에서 카르보플라틴, 69 명(41%)에서 사이클로포스파미드, 12 명(7%)에서 독소루비신, 20 명(12%)에서 에피루비신, 27 명(16%)에서 패클리탁셀, 및 2 명(1%)에서 메토트렉세이트를 포함하였다. 등급 1 및 I 기 환자에게는 추가의 치료를 제공하지 않았다. 화학요법에 대한 반응을 하기와 같이 평가하였다: 완전한 반응은 1 개월 이상 동안 질병에 대한 모든 증거의 소산으로서 규정하였고; 새로운 병변의 발생 없이 모든 측정 가능한 병변 직경이 50% 이상 감소(1 개월 이상 지속됨)한 것을 부분 반응이라 칭하였다. 안정한 질병은 모든 측정 가능한 병변의 직경이 25% 미만으로 감소한 것으로서 규정하였고, 25% 이상의 증가는 진행성 질병으로서 칭하였다. 헬싱키 선언에 따라 조사를 수행하였으며 이는 이탈리아 튜린의 산부인과 연구소에 의해 승인되었다. 종양 시편을 수술 직후 액체 질소 중에서 급속-냉동시켰다. 조직 검사를 수술 중 냉동된 섹션 분석 중에 수행하였으며, >80%의 종양 세포를 함유하는 각 종양의 전형적인 부분을 분석 시까지 보관하기 위해 선택하였다.
전체 RNA 추출 및 cDNA 합성
샘플을 선적하고 -80 ℃에서 보관하였다. 이어서 상기를 드라이 아이스 상에서 외과용 메스로 잘게 썰고 바로 2 ㎖ 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 이어서 상기를 균질화시키고 전체 RNA를 트리졸(Trizol)TM시약(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. RNA의 농도 및 순도를 분광 광도 측정에 의해 측정하였다. 전체 RNA 2 ㎍을 수퍼스크립트(Superscript)TM전치증폭 시스템(Gibco BRL)을 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA로 역-전사시켰다. 최종 부피는 20 ㎕였다.
정량적인 실시간 RT-PCR 분석
공개된 KLK9에 대한 게놈 서열(GenBank 수탁 번호 AF135026)을 근거로, 2 개의 유전자 특이적인 프라이머들을 구상하였다(L2-3: 5' CAA GAC CCC CCT GGA TGT GG 3'[서열식별번호 4] 및 5L2: 5' AGT TTT CAG AGT CCG TCT CGG 3'[서열식별번호 5]). 이들 프라이머는 2 엑손 이상 걸쳐 있어 게놈 DNA에 의한 오염을 피한다.
PCR 반응에 대한 실시간 감시를 LightCyclerTM시스템(Roche Molecular Systems, Indianapolis, IN, USA) 및 SYBR 그린 I 염료(이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합한다)를 사용하여 수행하였다. 형광 신호(PCR 산물의 농도에 비례한다)를 각 주기의 끝에서 측정하였으며 이는 컴퓨터 스크린 상에 바로 나타나 PCR 반응에 대한 실시간 감시가 허용된다(40). 상기 반응은 고정된 수의 주기 후에 축적된PCR 산물의 양보다는, PCR 산물의 증폭이 처음 검출된 주기 중의 시점을 특징으로 한다. 주형의 출발 량이 높을수록, 현저한 형광 증가가 빨리 관찰된다(41). 한계 주기는 형광이 기준선 이상의 고정된 한계를 통과한 부분 주기 수로서 정의된다(42).
내생적인 대조군
각 샘플에 대해서, 표적 및 내생 대조군(β 액틴, 살림살이 유전자)의 양을 눈금 곡선을 사용하여 측정하였다(하기 참조). 이어서 표적 분자의 양을 내생 기준의 양으로 나누어 표준화된 표적 값을 얻었다(41).
눈금 곡선
액틴과 KLK9에 대한 별도의 눈금(표준) 곡선을 앞서 개시된 바와 같이 클론테크(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 구입한, 건강한 인간 난소 조직으로부터의 일련의 전체 cDNA 희석물을 사용하여 작성하였다. 상기 표준 곡선 눈금자를 각 실시에 포함시켰다. LightCyclerTM소프트웨어는 한계 주기에 대한 각 표준 샘플의 출발 희석비를 플롯팅하여 표준 곡선을 산출하고 이어서 샘플 농도를 상응하게 산출하였다(도 1). KLK9 및 액틴 RNA 모두에 대한 표준을 임의적인 출발 농도를 포함하도록 한정하였고, 일련의 희석물(희석 인자에 따라 한정된 농도를 가짐)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다.
PCR 증폭
PCR 반응을 LightCyclearTM상에서 수행하였다. 각각의 실시에 대해서, cDNA 1 ㎕, LC DNA 마스터 SYBR 그린 I 혼합물 2 ㎕, 프라이머 50 ng 및 25 mM MgCl21.2 ㎕를 함유하는 마스터 혼합물을 얼음 상에서 제조하였다. 최종 부피를 H2O로 20 ㎕로 조절하였다. 반응 혼합물을 유리 모세관에 담은 후에, 순환 조건을 하기와 같이 실행하였다: 94 ℃에서 10 분 간 초기 변성, 이어서 94 ℃에서 0 초간 45 주기의 변성, 55 ℃에서 10 초간 어닐링 및 72 ℃에서 30 초간 연장. 온도 변화 속도는 초 당 20 ℃로 고정시켰다. 형광 생성물을 각 주기 후에 86 ℃에서 단일 포착 방식으로 측정하였다.
용융 곡선
특이적이지 않은 생성물과 프라이머 이량체로부터 특이적인 것을 구분하기 위해서, 온도를 70 ℃에서 30 초간 유지시키고, 이어서 0.1 ℃/s의 속도로 99 ℃까지 온도를 점진적으로 증가시킴으로써 증폭 후에 용융 곡선을 수득하였으며, 이때 단일 포착 방식을 개시된 바와 같이(44) 단계적으로 고정시켰다(도 1). 상기 용융 곡선의 결과를 확인하기 위해서, 전형적인 PCR 산물의 샘플을 1.5% 아가로스 겔 상에서 실행시키고, 정제하고 제조자의 지시에 따라 pCR 2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, Garlsbad, CA, USA) 내로 클로닝시켰다. 삽입물을 자동화된 DNA 서열화기로 벡터-특이적인 프라이머를 사용하여 서열화하였다.
통계학적 분석
임상병리학적 변수들, 예를 들어 단계, 등급, 조직유형 및 잔류 종양과 KLK9 발현간의 관계를 경우에 따라 카이-제곱 시험 또는 피셔의 정밀 시험에 의해 분석하였다. 생존 분석을 위해서, 2 개의 상이한 종점, 암 재발(국소적 재발 또는 원격 전이) 및 사망을 사용하여 진행 부재 및 포괄 생존을 각각 산출하였다. 진행이 없는 생존은 수술일과 재발 또는 전이성 질병을 확인한 날간의 시간 간격으로서 정의되었다. 포괄 생존은 수술일과 사망일간의 시간 간격으로서 정의되었다.
콕스 단일변량 및 다 변량 비례 위험 회귀 모델(45)을 사용하여 위험 비율(KLK9-양성 그룹에서 상대적인 재발 또는 사망 위험성)을 평가하였다. 다 변량 분석에서, 상기 모델을 KLK9 발현, 임상적 단계, 조직학적 등급, 잔류 종양과 연령에 대해 조절하였다.
카플란-마이어 생존 곡선(46)을 KLK9-양성 및 KLK9-음성 환자에 대해 작성하였다. 추가의 분석을 위해서, 환자들을 종양 등급(등급 1-2 대 등급 3), 종양 단계(I-II 기 대 III-IV 기), 또는 부피 감소의 성공(최적 대 최적 이하 부피 감소 그룹)에 의해 2 개의 그룹으로 분할하였다. 각각의 범주에서, 생존율(무 질병 생존 및 포괄 생존)을 KLK9-양성 그룹과 KLK9-음성 그룹간에 비교하였다. 두 그룹간의 생존 곡선간의 차이를 로그 등급 시험(47)에 의해 통계학적 유의수준에 대해 시험하였다.
면역조직화학
토끼 다클론 항체를 표준 절차에 따라 hK9 펩티드 서열: N2H-CPHPGFNKDLSANDHN-CONH2[서열식별번호: 6]에 대해 발생시켰다. hK9에 대한 면역조직화학적 염색을 표준 면역페록시다제 방법에 따라 수행하였다. 간단히, 파라핀-매몰된 조직 섹션(4 ㎛)을 고정시키고 왁스제거하였다. 내생적인 페록시다제 활성을 3% 수성 과산화 수소로 15 분간 차단시켰다. 이어서 섹션들을 42 ℃에서 5 분간 pH 2.0에서 0.4% 펩신으로 처리하고 20% 단백질 차단제(Signet Labs)로 10 분간 차단시켰다. 이어서 1 차 항체를 실온에서 1 시간 동안 1:6000으로 가하였다. 세척 후에, 비오티닐화된 항-토끼 항체(Signet Labs)를 가하고, 항체 희석 완충액(Dako)으로 4 배 희석한 다음, 배양 및 세척한 후에, 스트렙트아비딘-표지된 양고추냉이 페록시다제를 실온에서 30 분간 가하였다. 세척 후에, 5 내지 10 분간 아미노 에틸 카르바졸(AEC)로 검출을 수행하였다. 이어서 슬라이드를 헤마톡실린으로 반대 염색하고 이어서 커버 슬립을 올려놓았다.
세포 주 및 호르몬 자극 실험
상피 난소암 세포주 BG-1 및 유방암 세포주 BT-474 및 T-47D 및 MCF-7 주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Rockville, MD.)으로부터 구입하였다. 세포를 글루타민(200 밀리몰/L), 소 인슐린(10 ㎎/L), 송아지 태아 혈청(10%), 항생제 및 항진균제가 보충된 플라스틱 플라스크 중의 RPMI 배지(Gibco BRL, Gaithersburg,MD)에서 거의 융합점으로 배양시켰다. 이어서 상기 세포들을 24-웰 조직 배양 플레이트에 분액하고 50% 융합률로 배양시켰다. 실험 24 시간 전에, 상기 배양 배지를 10% 목탄-스트립핑시킨 송아지 태아 혈청을 함유하는 페놀 레드-비 함유 배지로 교환하였다. 자극 실험을 위해서, 100% 에탄올에 용해된 다양한 스테로이드 호르몬을 상기 배양 배지에 10-8M의 최종 농도로 가하였다. 100% 에탄올로 자극한 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 상기 세포를 24 시간 동안 배양시키고 이어서 mRNA 추출을 위해 수확하였다.
결과
KLK9 발현 및 다른 변수들과의 관계
먼저, 최적 컷오프 값을 연구 집단의 OS를 예견하는 KLK9 값의 능력을 근거로 χ2분석에 의해 한정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 1.84(이는 단위가 없는 비이다)의 값은 최적의 컷오프(χ2=8.54, p=0.003)인 것으로 나타났다. 상기 컷오프(54번째 백분위수)는 환자의 46%가 KLK9 양성임을 입증한다.
표 1은 임상 단계, 등급, 조직 유형, 잔류 종양의 크기, 폐경 상태 및 화학요법 반응과 관련된, 난소 종양 조직 중의 KLK9 발현(양성 또는 음성)의 분포를 나타낸다. KLK9 발현은 진행된 단계(III 또는 IV)(P=0.044)에 비해 초기 단계(I 또는 II) 환자에서, 및 최적의 부피 감소 환자(p=0.019)에서 현저하게 더 높았다. 또한, 양성 KLK9 발현을 갖는 환자의 약간 더 높은 퍼센트는 등급 3(44%)에 비해등급 1 또는 2(46%)를 갖는 것으로 밝혀졌으나, 이 차이는 통계학적으로 중요하지 않다(p=0.49). 또한, KLK9 발현은 질병의 반응이 없거나 진행이 없는 환자에 비해, 화학요법에 완전한 또는 부분적인 반응이 있는 환자에서 보다 높았고(각각 46% 대 37%, 통계학적으로 중요하지 않음), 잔류 종양이 있는 환자(38%)에 비해 잔류 종양이 없는 환자(56%)에서 더 높았다. 다른 한편으로, KLK9 발현과 상이한 조직 유형 또는 폐경 상태간에는 현저한 관계가 없는 것으로 밝혀졌다.
생존 분석
각각의 개별적인 예보자와 진행 부재 또는 포괄 생존간의 관련 강도를 표 2의 단일 변량 분석에 나타낸다. 질병의 단계, 조직 등급 및 잔류 종양 크기는 암 재발 및 사망과 큰 관련을 보였다(p<0.001). KLK9 발현은 또한 진행 부재(PFS) 및 포괄(OS) 생존의 중요한 예보자인 것으로 밝혀졌다(각각 0.45 및 0.49의 위험 비율 및 <0.001 및 0.019의 p 값). 카플란-마이어 생존 곡선(도 3)은 또한 KLK9-양성 종양 환자가 KLK9-음성인 환자에 비해 실질적으로 보다 긴 PFS 및 OS(각각 p<0.001, p=0.016)를 가짐을 입증한다.
모든 예보자들이 콕스 모델(다변량 분석, 표 2)에 포함되는 경우, 질병의 단계 및 잔류 종양 크기는 예후의 중요성을 유지하였다. KLK9 발현은 PFS의 경우 그의 예후적 중요성을 유지하였으나, OS의 경우는 아니었다(PFS 및 OS에 대해서 각각 0.58 및 0.71의 위험 비율 및 0.025 및 0.28의 p 값).
콕스 비례 위험 회귀 분석을 소그룹의 환자에게 적용하는 경우(표 3), KLK9발현은 등급 1 또는 2(HR=0.13, p=0.0015)(표 3), I 또는 II 기(HR=0.099, p=0.045) 및 최적의 부피 감소가 성공한(HR=0.26, p=0.012) 환자들의 소그룹에서 진행 부재 생존에 중대한 예보자인 것으로 밝혀졌다. 다른 공지된 예후 변수들을 조절한 후에, KLK9는 상기 모든 소그룹 환자에서 독립적인 예후 값을 유지하였다. 포괄 생존에 관하여, KLK9 발현은 등급 1 또는 2 종양 환자의 소그룹에 유리한 예후 마커였으며, 다른 공지된 예후 변수의 조절 후에(HR=0.20, p=0.038 로 조절) 독립적인 예후 값을 유지하였다(표 3).
동일한 결과가 또한 카플란-마이어 곡선에 의해 입증되었으며, 이때 KLK9는 PFS 및 OS(각각 p<0.001 및 0.016)에 유리한 독립적인 예후 마커인 것으로 밝혀졌다. 도 4에 조직 등급 1-2 또는 3의 암 환자에 대한 진행 부재 및 포괄 생존 곡선을 나타내었다. KLK9-양성 종양 환자는 KLK9-음성 종양 환자보다 실질적으로 더 긴 진행 부재 및 포괄 생존을 가졌다(각각 P<0.001 및 0.021). 이러한 차이는 등급 3의 종양을 갖는 환자에서는 보이지 않았다. 질병의 단계에 관하여, I 또는 II 기의 KLK9-양성 환자는 현저하게 보다 양호한 PFS(P=0.007)를 가지나 OS의 경우는 아니다(도 5). 유사하게, 최적의 부피 감소를 겪은 KLK9-양성 종양 환자는 KLK9-음성 종양 환자(p=0.013)보다 더 높은 PFS(OS는 아님) 확률을 가졌다. 외과적 부피 감소가 최적 이하인 경우 진행 부재 또는 포괄 생존의 차이는 없었다(도 6).
혈청 CA125의 발현 수준과 KLK9 mRNA 수준간에 약한 음성 상관성이밝혀졌다(rs=0.350, p=0.002)(도 7).
hK9의 면역조직화학적 위치 측정
도 8에 나타낸 바와 같이 hK9는 세포질 중에는 있으나 정상 난소 및 난소암 조직의 상피 세포의 핵에서는 보이지 않았고, 이는 상기 단백질이 분비된 단백질임을 가리키는 선행 보고 및 상기 단백질의 상피 기원을 입증한다. 상기 결과는 상피 세포의 세포질 중에 또한 위치한 다른 칼리크레인 단백질들에 대한 선행 결과와 일치한다.
hK9의 호르몬 조절
KLK9 발현을 BG-1 상피 난소 세포 주 및 BT-474, T47-D 및 MCF-7 유방암 세포 주에서 연구하였다. KLK9는 스테로이드 호르몬, 특히 에스트로겐과 프로제스틴에 의해 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 보다 높은 발현 수준이 호르몬 자극 후 48 시간째에 얻어졌다. 수용체-음성 BT-20 세포 주에서는 KLK9 수준에 현저한 변화가 없었다.
논의
집단 선별은 난소암 예후를 개선시키기 위한 시금석이다. CA125는 단일 마커로서 한계를 갖는데, 그 이유는 그의 수준이 단지 I 기 난소암 여성의 약 1/2에서만 상승되기 때문이다. 난소암에 대한 새로운 생물마커의 개발은 CA125의 진단/예후 능력을 개선시키는데 일조할 수 있다(10-11). 새로 동정된 난소암 마커도 또한 단독으로는 충분하지 않을 수 있지만, 다중 변수 전략으로 함께 사용될 수 있는 마커들의 패널에 대한 개발이 하나의 해법일 수 있다(48). 제이콥스(Jacobs) 등(49)은 최근에 3 년 동안 매일 다중 양식 선별을 이용하는 최초의 연구를 보고하였다. KLK9는 몇몇 다른 새로 동정된 칼리크레인들과 함께 상기 용도에 우수한 후보일 수 있다(31,32).
최근의 연구는 CA125를 최적의 1 차 종양 세포감소의 예견에(그러나 오직 III 기 종양에만) 사용할 수 있음을 시사하였다(8). KLK9 발현 수준은 최적 및 최적 이하 세포감소 환자, 및 질병의 초기 및 말기 환자에서 크게 상이하기 때문에(표 3 및 도 5,6), 이를 또한 상기와 같은 용도를 위해 시험할 수도 있다. 또한, 예후의 추적 조사 및 예견에서 CA125의 역할은 불명확하다(7). 유리한 예후 인자인 KLK9(도 3)는 이와 관련하여 용도를 발견할 수 있다.
KLK9는 난소암에서 유리한 예후 인자이다. hK9의 효소 활성은 특정의 생물학적 사건들, 예를 들어 혈관형성의 개시, 성장 인자, 수용체, 사이토카인 등의 활성화 또는 불활성화를 개시시키거나 종결시킬 수도 있다. 또 다른 밀접하게 관련된 칼리크레인인 hK3(PSA)는 혈관형성 억제 활성을 가지며, 이 활성은 세린 프로테아제로서 그의 작용과 관련이 있을 수 있다(51). 상기 연구는 또한 칼리크레인 다중 유전자 계열의 다른 일원들을 잠재적인 혈관형성 억제 작용에 대해 평가할 것을 제안하였다. 다른 연구들은 PSA가 MCF-7 유방암 세포 주의 성장을 억제하고PC-3 전립선 암 세포주의 배가 시간을 연장시킴을 제시하였다(52,53).
KLK9는 스테로이드 호르몬, 주로 프로제스테론 및 에스트로겐에 의해 상향 조절된다. 이 연구에서, KLK9는 난소암에 유리한 예후 인자인 것으로 밝혀졌다. 난소암은 내분비 관련 악성 종양들 중 하나이며(54), 경구 피임약의 투여는 난소암의 위험성을 감소시킨다(1). 더욱 또한, 난소 암종 세포 주의 성장은 에스트로겐에 민감하다(55). 프로제스테론은 세포 분화와 세포사멸을 촉진시키며, DNA 합성과 세포 분할을 억제하는 것으로 나타났다(56). 최근의 연구는 프로제스테론 수용체(PR)의 유리한 예후 가치와 난소암에서 그의 발현 수준을 지지하였고, PR-음성 상태가 등급 3 난소 종양에 보다 풍부함을 지적하였다(54,57). 이와 함께 이들 데이터는 KLK9가 프로제스틴과 에스트로겐이 난소암의 발병과 관련이 있음을 통해 하류 부문 표적 후보일 수 있음을 시사한다.
KLK9 발현 수준은 보다 높은 CA125 수준이 난소암에서 불량한 예후와 관련이 있음을 보이는 선행 연구들과 일치되게, 혈청 CA125 농도와 부정적으로 상관된다(도 7). 높은 CA125 발현 수준은 심각하고 혈청 및 자궁내막성 종양과 관련이 있었다(58). 여기에서, 같은 수준의 KLK9 발현이 혈청 및 비 혈청 종양에서 발견되었다(45% 대 42%, p=0.39)(표 1). 이를 비 혈청 난소암(이때 CA125는 대개 정보를 제공하지 못한다) 환자의 소그룹에서 예후를 평가하는데 사용할 수 있다.
결론적으로, 보다 높은 KLK9 발현은 난소암에서 유리한 예후 가치와 관련이 있다.
본 발명을 현재 바람직한 실시예로 간주되는 것을 참고로 개시하였지만, 본발명이 개시된 실시예로 제한되지 않음은 물론이다. 반대로, 본 발명은 첨부된 청구 범위의 진의 및 범위 내에 포함된 다양한 변경 및 동등한 배열을 포함하고자 한다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 본 발명에 참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 바와 같은 정도로 본 발명에 참고로 인용된다.
하기의 전체 인용문들은 명세서 중에 인용된 참고문헌들을 나열한다.
182 명의 난소암 환자에서 KLK9 상태와 다른 변수간의 관계
변수 환자 환자의 수(%)
KLK9 음성 KLK9 양성 P 값
단계
I/II 53 24(45.3) 29(54.7)
III/IV 126 77(61.1) 49(38.8) 0.037b
x 3
등급
G1/G2 61 33(54.1) 28(45.9)
G3 115 66(57.4) 49(42.6) 0.39a
x 5
조직유형
혈청 82 45(54.9) 37(45.1) 0.39b
기타 100 58(58.0) 42(42.0)
잔류 종양(㎝)
0 75 35(46.7) 40(53.3)
1-2 32 19(59.4) 13(40.6) 0.075a
>2 69 45(65.2) 24(34.8)
x 8
부피감소 성공c
OD 82 42(47.2) 47(52.8) 0.011b
SO 87 57(65.5) 30(34.5)
x 6
폐경
전/부근 59 37(62.7) 22(37.3) 0.16b
후 123 66(53.6) 57(46.4)
CTX에 대한 반응d
CR/PR 151 83(55.0) 68(45.0) 0.19b
NC/PD 19 13(68.4) 6(31.6)
NE 12
aχ2시험b피셔의 정밀 시험cOD; 최적의 부피 감소(0-1 ㎝), SO; 최적 이하 부피 감소(>1 ㎝)dCTX; 화학요법, NC; 변화 없음, PD; 진행성 질병, CR; 완전한 반응, PR; 부분 반응, NE; 평가 안됨x. 상태 알려지지 않음
KLK9 발현과, 진행 부재 및 포괄 생존에 대한 단일변량 및 다변량 분석
변수 진행 부재 생존 포괄 생존
HRa 95% CIb P 값 HRa 95% CIb P 값
KLK9 단일변량 분석
음성 1.00 1.00
양성 0.46 0.29-0.72 <0.001 0.51 0.29-0.90 0.021
연속변수로서 0.99 0.98-1.00 0.13 0.97 0.95-1.00 0.065
질병 단계(서수) 2.79 2.06-3.79 <0.001 3.07 2.05-4.60 <0.001
등급(서수) 2.23 1.63-3.07 <0.001 2.34 1.53-3.58 <0.001
잔류 종양(서수) 1.27 1.21-1.34 <0.001 1.31 1.21-1.41 <0.001
조직 유형c 0.68 0.46-1.00 0.055 0.78 0.48-1.29 0.34
연령 1.01 0.99-1.03 0.14 1.01 0.99-1.03 0.15
KLK9 다 변량 분석
음성 1.00 1.00
양성 0.63 0.40-0.98 0.037 0.69 0.38-1.26 0.23
연속변수로서 0.99 0.98-1.00 0.12 0.98 0.95-1.00 0.071
질병 단계(서수) 1.67 1.17-2.38 0.004 1.88 1.16-3.03 0.009
등급(서수) 1.38 0.96-1.98 0.074 1.39 0.84-2.29 0.19
잔류 종양(서수) 1.15 1.06-1.23 <0.001 1.21 1.11-1.32 <0.001
조직 유형c 0.99 0.64-1.52 0.96 0.72 0.42-1.22 0.22
연령 1.02 0.99-1.04 0.06 1.02 0.99-1.05 0.074
a콕스 비례 위험 회귀 모델로부터 추정된 위험 비율(HR)b추정된 HR의 신뢰 구간c혈청 대 기타
소그룹 환자에 대한 콕스 비례 위험 회귀 분석
변수 진행 부재 생존 포괄 생존
HRa 95% CIb P 값 HRa 95% CIb P 값
종양 등급 1-2
KLK9(비 조절) 0.12 0.036-0.42 <0.001 0.17 0.039-0.79 0.023
KLK9(조절)c 0.17 0.045-0.64 0.009 0.20 0.042-0.87 0.034
종양 등급 3
KLK9(비 조절) 0.73 0.45-1.18 0.21 0.84 0.43-1.63 0.61
KLK9(조절)c 0.75 0.46-1.25 0.27 0.81 0.44-1.52 0.52
I-II 기
KLK9(비 조절) 0.097 0.012-0.77 0.028 0.20 0.63-2.06 0.61
KLK9(조절)d 0.10 0.011-0.89 0.039 0.90 0.17-4.35 0.88
III 기
KLK9(비 조절) 0.65 0.41-1.032 0.068 0.71 0.40-1.26 0.24
KLK9(조절)d 0.75 0.46-1.21 0.23 0.81 0.44-1.49 0.51
최적 부피감소 성공
KLK9(비 조절) 0.32 0.12-0.83 0.018 0.80 0.21-2.98 0.74
KLK9(조절)e 0.31 0.12-0.86 0.025 0.68 0.16-2.91 0.61
최적 이하 부피감소 성공
KLK9(비 조절) 0.83 0.50-1.38 0.48 0.82 0.43-1.56 0.55
KLK9(조절)e 0.69 0.40-1.19 0.18 0.67 0.34-1.31 0.24
a콕스 비례 위험 회귀 모델로부터 추정된 위험 비율(HR)b추정된 HR의 신뢰 구간c다변량 모델을 질병 단계, 잔류 종양, 조직 유형 및 연령에 대해 조절하였다.d다변량 모델을 종양 등급, 잔류 종양, 조직 유형 및 연령에 대해 조절하였다.e다변량 모델을 질병 단계, 종양 등급, 조직 유형 및 연령에 대해 조절하였다.
명세서에 언급된 참고문헌에 대한 전체 인용문
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gcatgcccag ctgatttttt gtattttcag 6600 tagagacgga gtttcaccat gttggccagg atggtctcaa tctcttgacc ttgtgatccg 6660 cccgcctcag cctcccaaag tgctagggag ttatatatgc atctcctctt atctcttggc 6720 tctctgcatg catctttctg tttctcttcc ttcctttctt tttttttttt tttttttttt 6780 tttttttttt ttttttgaga cggagtcttg ctctgtctcc caggctggag tgcagtgacc 6840 agtctcggct cactgcaacc tccacctccc aggttcaagt gattctcgtg cctcagcctc 6900 ccgagtagct gggattacag gcgcctgcca ccatgcctgg ctaatttttg tatatttagc 6960 agagatgggg tttcaccatg ttggctgggc tggtctcaaa ctcctgacct caagcgatcc 7020 gccggcctcg gcctccaaaa cactgggatt acaggcatga gccacggtgc ccggccagcc 7080 tctctctcta cttggccctc ttcctccttg tctccatttg tttctcttgt gtgctatgac 7140 tgtctgtctg tcactgtctc ttgtctctat ctttgagagt cctaaatgtg gctccattgg 7200 tcctttggaa aagctgcagg gaggactcag ggcagtgggg tgctgagtgt gttggagaca 7260 gttgcagatc cttgacagtt ctcttccctg acagcgctgt ttccagtcac actgcagtgt 7320 gccaacatca gcatcctgga gaacaaactc tgtcactggg cataccctgg acacatctcg 7380 gacagcatgc tctgtgcggg cctgtgggag 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ccgtctctat gacgtcaccg acagccatca 8280 cctccttctt ggaacagcac agcctgtggc tccgccccaa ggaaccactt acacaaaata 8340 gctccgcccc tcggaacttt gcccagtggg acttcccctc gggactccac cccttgtggc 8400 cccgcctcct tcaccagaga tctcgcccct cgtgatgtca ggggcgcagt agctccgccc 8460 acgtggagct cgggcggtgt agagctcagc cccttgtggc cccgtcctgg gcgtgtgctg 8520 ggtttgaatc ctggcggaga cctgggggga aattgaggga gggtctggat acctttagag 8580 ccaatgcaac ggatgatttt tcagtaaacg cgggaaacct ca 8622 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Leu Gly Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser Leu Leu Ala Gly His 1 5 10 15 Gly Trp Ala Asp Thr Arg Ala Ile Gly Ala Glu Glu Cys Arg Pro Asn 20 25 30 Ser Gln Pro Trp Gln Ala Gly Leu Phe His Leu Thr Arg Leu Phe Cys 35 40 45 Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asp Arg Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys 50 55 60 Arg Lys Pro Tyr Leu Trp Val Arg Leu Gly Glu His His Leu Trp Lys 65 70 75 80 Trp Glu Gly Pro Glu Gln Leu Phe Arg Val Thr Asp Phe Phe Pro His 85 90 95 Pro Gly Phe Asn Lys Asp Leu Ser Ala Asn Asp His Asn Asp Asp Ile 100 105 110 Met Leu Ile Arg Leu Pro Arg Gln Arg Cys Phe Gln Ser His Cys Ser 115 120 125 Val Pro Thr Ser Ala Ser Trp Arg Thr Asn Ser Val Thr Gly His Thr 130 135 140 Leu Asp Thr Ser Arg Thr Ala Cys Ser Val Arg Ala Cys Gly Arg Gly 145 150 155 160 Ala Glu Val Pro Ala Arg Val Thr Leu Gly Ala Pro Trp Phe Ala Met 165 170 175 Glu Pro Trp Gln Ala Trp Cys Leu Gly Val Leu Ser Pro Ala Pro Asp 180 185 190 Pro Gly Ala Pro Gln Ser Thr Pro Ala Tyr Ala Thr Thr Leu Thr Gly 195 200 205 Ser Lys Lys Ser Trp Arg Thr Glu Pro Ala Arg His Gly Gly Thr Leu 210 215 220 Glu Asp Gln Glu Arg Pro Lys Gly Thr Gly 225 230 <210> 3 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Lys Leu Gly Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser Leu Leu Ala Gly His 1 5 10 15 Gly Trp Ala Asp Thr Arg Ala Ile Gly Ala Glu Glu Cys Arg Pro Asn 20 25 30 Ser Gln Pro Trp Gln Ala Gly Leu Phe His Leu Thr Arg Leu Phe Cys 35 40 45 Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asp Arg Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys 50 55 60 Arg Lys Pro Tyr Leu Trp Val Arg Leu Gly Glu His His Leu Trp Lys 65 70 75 80 Trp Glu Gly Pro Glu Gln Leu Phe Arg Val Thr Asp Phe Phe Pro His 85 90 95 Pro Gly Phe Asn Lys Asp Leu Ser Ala Asn Asp His Asn Asp Asp Ile 100 105 110 Met Leu Ile Arg Leu Pro Arg Gln Ala Arg Leu Ser Pro Ala Val Gln 115 120 125 Pro Leu Asn Leu Ser Gln Thr Cys Val Ser Pro Gly Met Gln Cys Leu 130 135 140 Ile Ser Gly Trp Gly Ala Val Ser Ser Pro Lys Ala Leu Phe Pro Val 145 150 155 160 Thr Leu Gln Cys Ala Asn Ile Ser Ile Leu Glu Asn Lys Leu Cys His 165 170 175 Trp Ala Tyr Pro Gly His Ile Ser Asp Ser Met Leu Cys Ala Gly Leu 180 185 190 Trp Glu Gly Gly Arg Gly Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 195 200 205 Val Cys Asn Gly Thr Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Gly Ala Glu Pro 210 215 220 Cys Ser Arg Pro Arg Arg Pro Ala Val Tyr Thr Ser Val Cys His Tyr 225 230 235 240 Leu Asp Trp Ile Gln Glu Ile Met Glu Asn 245 250 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 caagaccccc ctggatgtgg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agttttcaga gtccgtctcg g 21 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Pro His Pro Gly Phe Asn Lys Asp Leu Ser Ala Asn Asp 1 5 10

Claims (23)

  1. (a) 환자로부터 샘플을 취하고;
    (b) 상기 샘플에서 hK9 또는 hK9를 암호화하는 핵산 분자를 검출 또는 동정하고;
    (c) 상기 검출된 양을 표준에 대해 검출된 양과 비교함
    을 포함하는, 환자에서 난소암과 관련된 hK9 또는 KLK9를 검출하는 방법.
  2. 대상자의 샘플에서 hK9를 암호화하는 핵산 분자를 검출하고 상기 검출된 양을 난소암의 존재와 관련시킴을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재, 또는 난소암의 치료를 결정하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 검출되는 핵산 분자가 mRNA인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 핵산 분자를
    (a) 샘플을 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고;
    (b) 상기 샘플에서 소정의 표준 또는 컷오프 값에 대해 상기 핵산 분자에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드의 수준을 검출하고, 이로부터 대상자 중의 난소암의 존재 또는 부재를 결정함으로써 검출하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, mRNA를 증폭 반응을 사용하여 검출하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 증폭 반응이 hK9를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기와 같은 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응인 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, mRNA를 hK9를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기와 같은 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 하이브리드화 기법을 사용하여 검출하는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, mRNA를
    (a) mRNA를 샘플로부터 단리시키고 상기 mRNA를 시약과 결합시켜 cDNA로 전환시키고;
    (b) 상기 전환된 cDNA를 증폭 반응 시약 및 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 핵산 프라이머로 처리하여 증폭 산물을 제조하고;
    (d) 상기 증폭 산물을 분석하여 hK9를 암호화하는 mRNA의 양을 검출하고;
    (e) 상기 mRNA의 양을 유사한 핵산 프라이머를 사용하여 얻은 정상 및 악성 조직에 대해 예상되는 값을 갖는 패널에 대해 비교함으로써 검출하는 방법.
  9. 대상자의 샘플로부터 핵산, 바람직하게는 mRNA를 단리시키고; 상기 샘플 중의 KLK9 핵산을 검출함을 포함하며, 이때 표준 또는 대조군에 비해 샘플 중의 증가된 수준의 KLK9 핵산의 존재가 초기 질병 단계, 최적의 부피 감소 및/또는 긍정적인 예후를 가리키는, 상기 대상자에서 난소암을 진단 및 감시하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 표준 또는 대조군이 진행된 단계의 난소암을 갖는 대상자에 대해 측정된 양인 방법.
  11. 대상자의 샘플에서 hK9를 검출하고 상기 검출된 양을 난소암의 존재와 관련시킴을 포함하는, 상기 대상자에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    (a) 대상자로부터 수득된 생물학적 샘플을 hK9 또는 그의 일부와 특이적으로 결합하는 결합제와 접촉시키고;
    (b) 상기 샘플에서 소정의 표준 또는 컷오프 값에 비해 상기 결합제에 결합하는 hK9의 양을 검출하고, 이로부터 상기 대상자 중의 난소암의 존재 또는 부재를 결정함을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 결합제가 항체인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 조직, 추출물, 세포 배양물, 세포 용해물, 및 생리 유체 중에서 선택하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 샘플을 종양 조직으로부터 수득하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE), 합토글로빈 알파, 오스테오폰틴, 칼리크레인 4, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 8, 칼리크레인 10, 칼리크레인 11, CA125, CA15-3, CA72-4, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA), 크레아틴-키나제 BB, 및 암배아 항원(CEA) 중 하나 이상을 검출함을 또한 포함하는 방법.
  17. hK9에 결합하거나 hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 약제를 포함하는 진단 조성물.
  18. (a) 환자에게, hK9에 결합하고 난소암을 영상화하는 표지를 수반하는 약제를 주입하고;
    (b) 상기 약제를 생체 내에서 배양시켜 난소암과 관련된 칼리크레인 9에 결합되게 하고;
    (c) 난소암에 위치한 표지의 존재를 검출함
    을 포함하는 난소암의 생체 내 영상화 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 약제가 hK9와 특이적으로 반응하는 항체인 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 표지가 방사성 표지, 형광 표지, 핵 자기 공명 활성 표지, 양전자 방출 X선 단층 촬영("PET") 스캐너에 의해 검출 가능한 양전자 방출 동위원소, 화학발광제 또는 효소 마커인 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 청구된 방법을 수행하기 위한 키트.
  22. 칼리크레인 9에 특이적으로 결합하는 기지 량의 결합제를 포함하고, 이때 상기 결합제가 검출 가능한 물질을 포함하거나 또는 검출 가능한 물질에 직접 또는 간접적으로 결합하는, 대상자에서 난소암의 존재를 측정하는 키트.
  23. hK9를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 기지 량의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 상기 올리고뉴클레오티드가 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접 표지된, 대상자에서 난소암의 존재를 측정하는 키트.
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