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KR20040072635A - 각막 상피형 시트, 및 그의 제조 방법 - Google Patents

각막 상피형 시트, 및 그의 제조 방법 Download PDF

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KR20040072635A
KR20040072635A KR10-2004-7007655A KR20047007655A KR20040072635A KR 20040072635 A KR20040072635 A KR 20040072635A KR 20047007655 A KR20047007655 A KR 20047007655A KR 20040072635 A KR20040072635 A KR 20040072635A
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sheet
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corneal
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나카무라다카히로
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가부시키가이샤 아무니오테크
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Abstract

본 발명은 각막 상피의 이식이 필요한 안구 표면 질환에 적용 가능한 이식용 재료(각막 상피형 시트)를 제공한다.
양막 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하고, 지지 세포의 공존 하에 배양한다. 구강 점막 상피 세포가 중층화된 후, 그 최표층을 공기에 접촉시키고, 분화를 유도한다. 그리고, 양막 상에 구강 점막 상피 세포의 층이 형성된 각막 상피형의 시트를 얻는다.

Description

각막 상피형 시트, 및 그의 제조 방법 {ECTOCORNEA-LIKE SHEET AND METHOD OF CONSTRUCTING THE SAME}
각막이 결막 상피로 덮여 혼탁이 발생하는 안구 표면 질환에 대한 외과적 치료로는, 현재는 각막 상피 이식술이 행해지고 있지만, 심한 염증을 수반한 난치성 각결막 질환(Stevens-Johnson 증후군이나 안류천포창, 각막 부식 등)에서는, 그 예후가 매우 불량하다. 그의 가장 큰 이유로서, 강한 항원성을 가지는 이질계(타가; allo) 각막 상피가 숙주의 면역계에 인식되어 거부되는 것을 들 수 있다. 또한, 거부 반응을 예방하기 위해, 수술 후에 다량의 면역 억제제를 전신 및 국소 투여하는 것에 따른 합병증도 그 예후 불량의 큰 요인이 되고 있다. 한편, 타가 각막 상피를 이용하는 경우에는, 도너(donor) 부족의 문제가 있다. 따라서, 타가 각막 상피가 아닌 자기 각막 상피조직을 이용해 이식을 행하는 것이 이상적인 것으로 생각된다. 편안성(片眼性) 질환(각막 부식 등)에서는, 과거에도, 건강한 안구의 각막상피를 환자의 안구에 이식함으로써 양호한 성과를 거두었다는 보고가 있으나, 난치성 각막 질환의 대부분은 양안성으로서, 이러한 방법을 이용할 수 없는 것이 현실이다.
본 발명은 각막 상피형 시트 및 각막 상피 이식용 시트, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 각막 상피의 이식이 필요한 질환(안구 표면 질환)의 치료에 이용할 수 있다. 특히, 양안성 각막 질환에 대하여 유효한 치료 수단을 제공한다.
도 1은 주사형 전자 현미경에 의하여 관찰한 양막상을 도시한 도면이다. A는 정상적인 상태(상피 처리를 행하지 않은 상태)의 양막 표면의 상, B는 상피 소파 처리(0.02% EDTA 용액) 후의 양막 표면의 상이다. A에서는 다각형의 양막 상피가 관찰된다. 한편, B에서는 양막 상피가 관찰되지 않으며, 상피가 완전히 제거된 것이 확인된다.
도 2는 양막 상에 구강 점막 상피 세포를 배양할 경우의 기구 등의 상태를 모식적으로 나타낸 단면도이다. 배양 접시(배양 접시)(1) 내에 배양 삽입기(culture insert)(2)가 정치되고, 배양 접시(1) 바닥면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입기(2) 바닥면 상에 양막(3)이 정치되고, 그 위에 구강 점막 상피 세포(4)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 (6)은 배지이다.
도 3은 융합 상태의 구강 점막 상피층의 광학 현미경상을 도시한 도면이다.
도 4는 양막 상에 형성된 구강 점막 상피 세포층의 HE(헤마톡실린-에오신) 염색상을 도시한 도면이다. 각막 상피와 유사한 5∼6층의 세포로 이루어지는 층이 형성된 것이 관찰된다.
도 5는 케라틴 3(K3) 및 케라틴 12(K12)에 대한 항체를 이용하여 양막 상의 구강 점막 상피 세포층(구강 점막 상피 시트)을 염색한 상을 도시한 도면이다. 케라틴 3에 대해서는 염색성이 확인되었고, 케라틴 12에 대해서는 염색성이 관찰되지 않는다. 또한, 염색된 부분은 백색 스폿으로 나타낸다.
도 6은 케라틴 4(K4) 및 케라틴 13(K13)에 대한 항체를 이용하여 양막 상의 구강 점막 상피 세포층(구강 점막 상피 시트)을 염색한 상을 도시한 도면이다. 케라틴 4 및 13에 대하여 염색성이 확인된다. 또한, 염색된 부분은 백색 스폿으로 나타나 있다.
도 7은 케라틴 1 및 케라틴 10에 대한 항체를 이용하여 양막 상의 구강 점막 상피 세포층(구강 점막 상피 시트)을 염색한 상을 도시한 도면이다. 케라틴 1 및 케라틴 10 어느 것에 대해서도 염색성이 관찰되지 않는다.
도 8은 각막 및 결막 상피를 제거한 집토끼의 안구 표면을 플루오레세인으로 염색한 상을 도시한 도면이다. 플루오레세인으로 염색된 부분은 백색 스폿으로 나타나 있다. 안구 표면 전체가 플루오레세인에 의해 염색된 것으로 관찰되었고, 상피가 완전히 제거된 것을 알 수 있다.
도 9는 각막 및 결막 상피를 제거한 집토끼의 4주 후의 안구 표면을 도시한 도면이다. 안구 표면이 주위보다 반흔 조직을 수반하는 결막 침입으로 인하여 투명성을 상실한 것이 관찰된다.
도 10은 각막 상피 이식용 시트를 이식한 후의 안구 표면의 상태를 도시한 도면이다. 안구 표면(이식부)이 투명성을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 11은 각막 상피 이식용 시트를 이식한 후 48시간 경과한 시점의 플루오레세인 염색상을 도시한 도면이다. 플루오레세인으로 염색된 부분은 백색 스폿으로 나타나 있다. 안구 표면(이식부)은 플루오레세인에 염색되지 않았으며, 이식편이 안구 표면에 생존하는 것을 알 수 있다. 또한, 이식편의 주위에서는 전반에 걸쳐 플루오레세인 염색성이 확인된다.
도 12는 각막 상피 이식용 시트를 이식한 후 10일 경과한 시점의 플루오레세인 염색상을 도시한 도면이다. 플루오레세인으로 염색된 부분은 백색 스폿으로 나타나 있다. 염색성을 나타내지 않는 영역이 확대된 것이 관찰되며, 이식편이 안구 표면에 잔존하고 있고, 또한 이식 후 48시간이 경과한 시점에 비하여 주위로 신장한 것으로 나타나 있다.
도 13은 화학적 외상 급성기의 천연성 상피 결손 환자의 수술 전(좌측 란)및 수술 후 5개월(우측 란) 시점의 안구 표면의 상태를 도시한 도면이다.
도 14는 화학적 외상 만성기의 환자의 수술 전(좌측 란)(반흔성 각결막 상피증) 및 수술 후 2개월(우측 란) 시점의 안구 표면의 상태를 도시한 도면이다.
도 15는 안류천포창 환자의 수술 전(좌측 란) 및 수술 후 1개월(우측 란) 시점의 안구 표면의 상태를 도시한 도면이다.
본 발명은 이상과 같은 배경 하에서, 안구 표면 질환에 적용 가능한 이식용 재료인 각막 상피형 시트 및 각막 상피 이식용 시트, 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 특히, 자기 각막 줄기 세포의 취득이 곤란한 환자의 치료에 사용할 수 있는 이식 재료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 이상의 과제를 감안하여 예의 검토를 실시하였다. 먼저, 양안성 질환의 환자에 있어서는 자기의 각막 세포를 취득할 수 없다는 점에서, 다른 건강한 부위의 자기 점막 조직을 이용하는 것이 이상적일 것으로 생각하여, 세포원으로서 구강 점막 상피 조직을 선택하였다. 이는, 구강 점막 상피에는 국소 점막 조직 유래의 줄기 세포의 존재가 시사된 바 있고, 또한 다른 상피 조직인 피부 표피에 비하여 분화 정도가 낮아 분열능이 높고, 비교적 입수가 용이하기 때문이다. 한편, 구강 점막 상피 세포를 배양하는 기질로서 양막을 채용하였다.
먼저, 집토끼의 구강 점막 상피를 수득하고, 효소적 처리에 의하여 상피 하조직을 제거하고, 줄기 세포를 포함하는 세포 부유액을 조제하였다. 그런 다음, 효소적 처리에 의하여 상피를 소파한 양막 상에 세포 부유액을 접종하고, 지지 세포(feeder cell)를 공배양하여, 상피 세포로의 분화를 유도하는 처리를 행하였다. 그 결과, 구강 점막 상피 세포가 중층화한 각막 상피형 세포층(각막 상피형 시트)을 얻는 데 성공하였다. 얻어진 세포층의 형태를 관찰한 바, 양막 상에 5∼6층의 세포가 적층하여 있고, 또한 최상층에는 편평 형상의 세포가 존재하며, 나아가 고도의 투명성을 구비하며, 각막 상피에 매우 유사한 구조를 가지고 있었다. 한편, 각막 상피형 세포층을 배양하는 기질로서 양막을 이용하는 동시에, 집토끼의 눈에 자가 이식하여 그의 생존을 관찰하였다. 그 결과, 이식편이 안구 표면에 생존해 신장하여, 수술 후 투명성을 유지하는 것이 확인되었다. 이러한 점에서, 구강 점막 상피를 세포원으로서 이용하고, 더불어 기질로서 양막을 이용함으로써, 구강 점막 상피 세포가 중층화한 각막 상피형 세포층(각막 상피형 시트)을 형성할 수 있는 것으로 나타났고, 또한 이 각막 상피형 층은 각막 상피의 대체로서 적합하게 이용할 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성된 것으로, 하기의 구성으로 이루어진다.
[1] 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층으로 이루어지는 각막 상피형 시트.
[2] 상기 [1]에 있어서,
최표층의 세포가 각화되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서,
최표층의 세포가 편평 형상인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서,
배리어 기능을 구비하는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
[5] 콜라겐층 상에, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층이형성된 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[6] 상기 [5]에 있어서,
상기 세포층의 최표층의 세포가 각화되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[7] 상기 [5] 또는 [6]에 있어서,
상기 세포층의 최표층의 세포가 편평 형상인 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[8] 상기 [5] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 양막(羊膜) 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[9] 상기 [5] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[10] [5] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서,
배리어 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
[11] a) 콜라겐층 상에서 구강 점막 상피 세포를 배양하는 단계; 및
b) 구강 점막 상피 세포를 증식시켜 중층화한 후, 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[12] 상기 [11]에 있어서,
상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[13] 상기 [11]에 있어서,
상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에, 상기 지지 세포와 상기 콜라겐층 사이에, 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막이 존재하는 상태에서 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[14] 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[15] 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[16] 제1 용기 내에 지지 세포를 접종하여, 지지 세포의 층을 형성시키는 단계;
상기 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막으로 이루어지는 바닥면을 가지는 제2 용기를, 상기 바닥면이 배양액 중에 잠기도록 상기 제1 용기 내에 배치하는 단계;
상기 제2 용기의 바닥면 상에 콜라겐층을 형성시키는 단계;
상기 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하는 단계;
상기 구강 점막 상피 세포를 배양하여 중층화시키는 단계; 및
중층화한 구강 점막 상피 세포의 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[17] 상기 [16]에 있어서,
상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[18] 상기 [16]에 있어서,
상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
또한, 본 명세서에 있어서「각막 상피형 시트」란, 각막 상피와 유사한 특징을 가지며, 각막 상피의 대체로서 이식에 제공되는 세포층을 의미하는 용어로서 사용된다.
마찬가지로, 「각막 상피 이식용 시트」란, 각막 상피와 유사한 특징을 가지는 세포층을 구비하며, 각막 상피의 재건을 위해 이식에 제공되는 조성물을 의미하는 용어로서 사용된다.
본 발명의 일면은 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층으로 이루어지는 각막 상피형 시트에 관한 것이다.
여기서, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층이란, 구강 점막 상피부의 세포를 출발원료로 하여, 이것을 배양해 증식시켜, 적어도 일부가 분화 및 중층화하여 형성된 세포층을 일컫는다. 이러한 세포층을 형성하는 세포는, 구강내연점막 상피부의 세포, 입술부의 세포, 구개부의 세포, 볼부의 세포 등의 구강 점막 상피 세포로부터 유래된다. 이들 세포로부터 유래된 것은, 세포층을 형성하는 세포에 있어서 구강 점막 상피 세포 특이성 케라틴 4 또는 케라틴 13이 발현된 것을 지표로 하여 확인할 수 있다. 또는, 케라틴 3이 발현된 것을 지표로 하여 확인할 수도 있다. 이 케라틴 3은 각막 특이성 케라틴의 일종으로 알려져 있으나, 구강 점막 상피 세포에서도 발현되는 것으로 확인되어 있다. 또한, 이러한 각막 특이성 케라틴인 케라틴 3을 발현한다는 점에서, 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 이식용 조성물을 제조하기 위한 재료로서 이용하는 것이 바람직하다고 할 수 있다.
한편, 구강 점막 상피 세포 특이성 유전자의 발현을 조사함으로써, 세포층을형성하는 세포가 구강 점막 상피 세포 유래인 것인 지의 여부를 확인할 수도 있다.
본 발명의 각막 상피형 시트는, 바람직하게는 이하의 성상 내지는 특성 중 일부를 구비하는 것이다. 특히 바람직하게는, 이하의 모든 성상 내지는 특성을 구비하는 것이다.
(1) 최상층의 세포가 각화하지 않는다. 이는 각막 상피가 구비하는 특징 중 하나이다. 이러한 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피형 시트는 각막 상피와 유사하며, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘할 것으로 기대된다. 또한, 각화란, 달리 각질화라고도 불리며, 세포내에 케라틴이 생성되고, 핵 등의 세포내 소기관이 소실되는 현상을 말한다. 세포가 각화되어 있는지 여부는, 예를 들면 세포의 편평화나 핵의 유무를 지표로 하여 확인할 수 있다.
(2) 최상층의 세포가 편평 형상이다. 즉, 구강 점막 상피 세포층이 대략 원주 형상의 세포로 이루어지는 층 상에 편평 형상의 세포로 이루어지는 층이 형성되어 구성된다. 편평 형상의 세포가 최상층을 피복하는 경우, 세포간 기밀성이 높아져 이하의 배리어(barrier) 기능이 발휘될 것으로 생각된다. 각막 상피에 있어서도 최상층의 세포는 편평 형상이다. 이러한 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피형 시트는 각막 상피와 유사하며, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘할 것으로 기대된다.
(3) 배리어 기능을 구비한다. 배리어 기능이란, 표층으로부터의 액체, 기체 등의 침윤이나, 표층을 통한 액체의 방산 등을 방지하는 기능을 말한다. 이러한 배리어 기능을 가짐으로써, 이식 후 그 표면에 수분(눈물)을 유지할 수 있고,나아가 필요 이상의 수분이 방산하는 것을 방지할 수 있다. 각막은 배리어 기능을 구비함으로써 그 표면에 수분을 유지할 수 있고, 이에 따라 깜박거림에 견딜 수 있는 기능을 발휘한다. 따라서, 배리어 기능을 구비하는 것은, 각막용 이식 재료에 요구되는 중요한 하나의 특성이다. 이 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피형 시트는 각막 상피와 유사하여, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘할 것으로 기대된다. 배리어 기능을 구비하는 지의 여부는, 예를 들면 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase) 등의 표식 물질을 포함하는 용액의 침윤 정도에 의해 조사할 수 있다.
이러한 각막 상피형 시트는, 각막이 손상, 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용될 수 있다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후에는, 치료용 콘택트렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일면은, 하기의 구성으로 이루어지는 각막 상피 이식용 시트를 제공한다. 즉, 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층이 형성된 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트이다. 바꾸어 말하면, 콜라겐층 상에, 상술한 각막 상피형 시트가 형성된 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트이다. 여기서, 콜라겐층은 양막 유래인 것이 바람직하고, 양막으로부터 소파 처리 등에 의해 상피를 제거한 것이 보다 바람직하다. 콜라겐층이 이러한 상피를 제거한 양막을 원재료로 이용하였는지의 여부는, 콜라겐층에 양막 상피층의세포가 포함되어 있는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다. 또한, 양막으로서 인간 양막을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
이 각막 상피 이식용 시트는, 각막 손상, 결손 등의 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용할 수 있다. 이 경우, 콜라겐층이 안구측이 되도록 각막 상피 결손부에 이식된다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후에는, 치료용 콘택트렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.
이상의 각막 상피형 시트 및 각막 상피 이식용 시트는 이하의 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은, 각막 상피형 시트의 제조 방법에 관한 것으로, 하기의 단계를 포함한다.
a) 콜라겐층 상에서 구강 점막 상피 세포를 배양하는 단계; 및
b) 구강 점막 상피 세포를 증식시켜 중층화한 후, 최표층을 공기에 접촉시키는 단계.
여기서, 콜라겐층의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 이용할 수 있다. 복수 종류의 콜라겐이 혼재하는 것을 이용하는 것도 가능하다. 이들 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산가용화법, 알칼리가용화법, 효소가용화법 등에 의해 추출, 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 저하시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소를 처리하여 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거함으로써 얻어지는, 이른바 아테로콜라겐(atherocollagen)을 이용하는 것이 바람직하다.
콜라겐층으로서, 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 것을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 양막 유래란, 넓게 양막을 출발원료로 하여 얻어진 것을 의미한다. 인간 양막은 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막으로서, 콜라겐이 풍부한 실질 조직 상에 기저막, 상피층이 형성되어 구성된다. 인간 양막은, 예를 들면 분만 시 산후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 수득할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대로 이루어지는 일체물을 처리하여, 정제함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다. 처리 및 정제 방법은, 일본 특개 평5-5698호에 개시된 방법 등의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만 시에 얻어지는 태아막으로부터 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등에 의해 잔존 조직을 제거하고, 적절하게 세정함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다.
이와 같이 조제한 인간 양막은, 사용 시까지 동결하여 보존할 수 있다. 인간 양막의 동결은, 예를 들면 -80℃, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 글리세롤을 체적비로 등량 혼합한 용액 중에서 행할 수 있다. 동결 보존하는 경우, 조작성이 향상되는 것은 물론이고, 항원성이 저하되는 것도 기대할 수 있다.
양막을 그대로 콜라겐층으로서 이용할 수도 있지만, 양막으로부터 소파 처리 등에 의하여 상피를 제거한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기와 같이 동결 저장한 인간 양막을 해동시킨 후, EDTA나 단백질 분해 효소로 처리하여세포간 접착을 이완시키고, 셀 스크레이퍼(cell scraper) 등을 이용하여 상피를 소파 처리함으로써, 상피가 제거된 인간 양막을 조제할 수 있다.
콜라겐층 상에는 구강 점막 상피 세포가 배양된다. 구강 점막 상피에는 줄기 세포의 존재가 시사된 바 있고, 상피형 세포층을 형성하는 세포로 분화를 유도하기 용이한 것으로 여겨진다. 또한, 구강 점막 상피 세포를 이용하는 경우에는, 수득이 용이하고, 다량의 세포를 수득 가능하며, 나아가 양안성 환자를 처치하는 경우에도 자기 세포를 이용하여 이식 재료를 조제할 수 있다는 등의 이점을 가진다. 특히, 각막 상피 세포를 수득할 수 없는 환자에 대하여, 자기 세포 유래의 이식 재료를 적용할 수 있다는 이점은, 임상적으로 매우 중요한 거부 반응의 문제를 대폭 해소할 것으로 기대된다.
구강 점막 상피 세포로는, 치근부에 존재하는 세포(구강내연점막 상피 세포), 입술부의 세포, 구개부의 세포, 볼부의 세포 등이 이용된다. 그 중에서도 구강내연점막 상피 세포는 증식능이 높고, 또한 항원성이 낮으므로, 이를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는, 목적하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 소파 처리하거나 함으로써 수득할 수 있다. 구강내연점막 상피 세포에서는, @발치에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 이행부로부터 분리하여 수득할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 제조되는 각막 상피형 시트가 이식될 환자 이외의 구강으로부터 수득한 구강 점막 상피 세포를 이용하는 것도 가능하지만, 면역 거부 반응을 고려하면, 환자 자체의 구강으로부터 구강 점막 상피 세포를 수득하여, 배양하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 수득된 구강 점막 상피 세포는 콜라겐층 상에서 배양된다. 예를 들면, 상기의 방법에 따라 구강 점막 상피 세포 부유액을 조제하고, 이것을 콜라겐층 상에 접종하고, 적당한 배양 조건 하에서 배양한다. 콜라겐층으로서 상피를 제거한 인간 양막을 이용하는 경우에는, 상피를 제거하고 표출된 면측(즉, 기저막측)에 구강 점막 상피 세포를 접종하는 것이 바람직하다. 이는, 이 면측에는 IV형 콜라겐이 풍부하게 포함되어 있어, 접종된 구강 점막 상피 세포의 증식 및 중층화가 양호하게 행해지는 것으로 생각되기 때문이다.
구강 점막 상피 세포는, 예를 들면 세포 밀도가 약 1×103개/cm2이상, 바람직하게는 약 1×103개/cm2∼약 1×107/cm2, 더욱 바람직하게는 약 1×104개/cm2∼약 1×106개/cm2가 되도록 콜라겐층 상에 접종할 수 있다.
구강 점막 상피 세포의 배양은 지지 세포의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 지지 세포란, 공급 세포(feeder cell)라고도 불리며, 배양액 중에 성장 인자 등을 공급한다. 지지 세포의 공존 하에 배양하는 경우, 구강 점막 상피 세포의 증식 효율이 향상된다. 지지 세포에는, 예를 들면 3T3 세포(스위스마우스 3T3 세포, 마우스 NIH 3T3 세포, 3T3J2 세포 등) 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 증식 효율, 취급 용이성 등의 관점에서 마우스 NIH 3T3 세포를 지지 세포로서 이용하는 것이 바람직하다.
지지 세포를 미리 마이토마이신 C 등을 이용하여 불활성화하는 것이 바람직하다. 이는 지지 세포 자체가 증식하여 구강 점막 상피 세포의 증식을 저해하는 것을 방지하고, 구강 점막 상피 세포의 증식 효율을 상승시키기 위해서이다. 이러한 불활성화는 방사선 처리 등에 의해서도 행할 수 있다.
구강 점막 상피 세포의 배양을 지지 세포의 공존 하에 행하는 경우에는, 지지 세포와 콜라겐층 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기의 격리막을 존재시키는 것이 바람직하다. 이러한 격리막을 이용함으로써, 배양 시에 콜라겐층측(즉, 구강 점막 상피 세포측)에 지지 세포가 침입하는 것을 방지할 수 있다. 그 결과, 최종적으로 얻어지는 각막 상피형 시트 내에 지지 세포가 혼재할 우려가 없어진다. 이는 지지 세포에 의한 면역 거부 반응의 문제가 없는 각막 상피형 시트의 제조가 가능하다는 것을 의미하고, 임상적으로 매우 의의가 있다.
격리막으로는, 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기를 가지는 공지된 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리카보네이트로 이루어진, 세공 크기가 약 0.4㎛∼3.0㎛인 막을 이용할 수 있다. 격리막의 재질은 특별히 한정되지 않으며, 폴리카보네이트 외에 폴리에스테르 등으로 이루어질 수도 있다. 이러한 격리막은 시판되고 있으며, 용이하게 입수할 수 있다.
격리막을 이용하는 경우의 배양 방법의 예로서 이하의 방법을 들 수 있다. 먼저, 샬레 등의 용기(제1 용기)에, 불활성화한 지지 세포를 접종하고 배양함으로써, 용기 표면에 지지 세포층을 형성시킨다. 그런 다음, 격리막으로 바닥면을 형성한 제2 용기를 제1 용기 내에 배치한다. 이때, 제2 용기의 바닥면이 배양액 중에 잠기도록 제2 용기의 위치를 조정한다. 이어서, 제2 용기의 바닥면, 즉 격리막 상에 콜라겐층을 형성시킨다. 그리고, 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하여 배양한다.
제2 용기의 바닥면에 미리 콜라겐층을 형성시킨(예를 들면, 제2 용기의 바닥면에 상피를 제거한) 양막을 적재한다. 이 상태로 일단 건조 처리를 행할 수도 있고, 제2 용기를 지지 세포가 접종된 제1 용기 내에 배치한 뒤, 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하여 배양할 수도 있다.
지지 세포의 세포 밀도는, 예를 들면 약 1×102개/cm2이상, 바람직하게는 약 1×102개/cm2∼약 1×107/cm2, 더욱 바람직하게는 약 1×102개/cm2∼약 1×105개/cm2로 할 수 있다. 구강 점막 상피 세포수에 대한 비로 말하면, 사용하는 지지 세포수를, 예를 들면 구강 점막 상피 세포수에 대하여 1/103배∼1×102배, 바람직하게는 1/102∼1배로 배양을 행할 수 있다. 지지 세포수가 적으면 구강 점막 상피 세포의 증식율이 저하되며, 지나치게 적은 경우에는 양호한 구강 점막 상피 세포의 중층화가 얻어지지 않는다. 한편, 지지 세포수가 지나치게 많은 경우에는, 오히려 구강 점막 상피 세포의 증식율을 저하시키므로 바람직하지 않다.
구강 점막 상피 세포의 배양에 이용되는 배양액은, 상기 세포를 증식시키고, 중층화할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상피 세포의 성장에 통상 이용되는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정의 비율로 혼합하고, FBS, 성장 인자, 항생 물질 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, FBS(10%), 인슐린(5mg/㎖), 콜레라 톡신(0.1nM), 상피 세포 증식 인자(EGF)(10ng/㎖), 및 페니실린-스트렙토마이신(50IU/㎖)을 첨가한 DMEM과 햄 F12 배지의 혼합 배지(혼합 체적비 1:1)를 들 수 있다. 또한, 트리요오도티로닌(triiodothyrinine)(예를 들면, 2nM), 글루타민(예를 들면, 4mM), 트렌스페린(예를 들면, 5mg/㎖), 아데닌(예를 들면, 0.18mM), 및/또는 하이드로코르티손(예를 들면, 0.4mg/㎖)을 추가로 첨가한 DMEM/햄 F12 혼합 배지를 이용하는 것도 가능하다.
단계 a)에 따라 콜라겐층 상에서 구강 점막 상피 세포를 증식시켜 중층화한다. 그리고, 중층화한 세포층의 표층을 공기에 접촉시키는 단계(단계(b))를 실시한다. 또한, 이 단계를 본 명세서에서는 에어 리프팅(Air-lifting)이라고도 부른다. 이 단계(b)는 세포층을 형성하는 세포의 분화 및 배리어 기능을 유도하기 위해 실시된다.
이 단계는 배양액의 일부를 스포이트, 피펫 등을 이용하여 일시적으로 제거함으로써 배양액 표면을 저하시키고, 이를 통해 구강 점막 상피 세포층의 최표층을 일시적으로 배양액 밖으로 노출시킴으로써 실시할 수 있다. 또는, 구강 점막 상피 세포층을 콜라겐층과 함께 들어올려, 최표층을 배양액 표면으로부터 일시적으로 노출시킴으로써 실시할 수도 있다. 나아가, 튜브 등을 이용하여 공기를 배양액 중에 공급하여, 구강 점막 상피 세포층의 최상층에 공기를 접촉시킬 수도 있다. 조작용이성의 관점에서, 배양액 표면을 저하시켜 구강 점막 상피 세포의 최표층을 노출시키는 방법에 따라 실시하는 것이 바람직하다.
이 단계(b)를 실시하는 시간, 즉 중층화한 세포층의 최표층을 공기에 접촉시키는 시간은, 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 가변적이지만, 예를 들면 3일∼3주간 정도이며, 바람직하게는 5일∼2주간, 더욱 바람직하게는 약 1주일이다.
이상에서 설명한 본 발명의 방법에 따라, 콜라겐층 상에, 구강 점막 상피 세포가 중층화한 각막 상피형 세포층(각막 상피형 시트)이 형성된다. 이 각막 상피형 시트는, 구강 점막 상피 세포의 배양 기질로서 이용되는 콜라겐층과 함께, 각막 손상, 결손 등의 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용할 수 있다. 이 경우, 콜라겐층이 안구측이 되도록 각막 상피 결손부에 이식된다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용하여 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후에는, 치료용 콘택트렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.
또한, 콜라겐층의 일부를 제거한 것 또는 전부를 제거한 것(즉, 각막 상피형 시트만)을 이식편으로서 이용하는 것도 가능하다. 이러한 콜라겐층의 제거는, EDTA 등에 의한 화학적 처리, 단백질 분해 효소 등에 의한 효소적 처리, 핀세트 등에 의한 소파 처리 등의 물리적 처리를 적절하게 조합하여 행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면에 있어서, 구강 점막 상피 세포가 중층화한 각막 상피형 세포층(각막 상피형 시트)이 제조되지만, 본 발명의 방법을 상기 세포층이 콜라겐층 상에 형성되어 이루어지는 각막 이식용 이식 재료(각막 상피 이식용 시트)를 제공하는 방법으로 보는 것도 가능하다. 즉, 본 발명의 방법은 이러한 구조를 가지는 각막 상피 이식용 시트의 제조 방법으로서 이용할 수도 있다.
<실시예 1> 집토끼를 이용한 각막 상피형 시트의 평가
[양막의 수득]
양막은 전신적 합병증이 없는 제왕 절개술 예정의 임부에 대하여 사전에 산부인과의와 함께 충분한 정보에 입각하여 동의를 얻은 후, 수술실에서 제왕 절개 시에 수득하였다. 조작은 청결하게 주의하여, 수술 조작에 준하여 수세 후에 전용 가운을 착용하고 실시하였다. 분만 전에 청결한 양막 수득용 배트와 세정용 생리 식염수를 준비하였다. 분만 후에 태반 조직을 배트(vat)로 옮기고, 양막 조직을 태반으로부터 수동으로 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.
[양막의 처리]
양막 처리의 과정은 (1) 세정, (2) 트리밍, (3) 보존의 순으로 실시하였다. 모든 과정에서, 조작은 청결한 드래프트 내에서 실시하는 것이 바람직하고, 사용하는 용기나 기구도 모두 멸균된 것을 사용하고, 샬레 등은 멸균된 1회용(폐기 가능한) 타입을 사용하였다. 수득한 양막에 부착된 혈액 성분을 생리 식염수로 세정하하여 제거하고, 충분한 양의 생리 식염수(0.005% ofloxacin 첨가)로 추가 세정하였다. 그런 다음, 양막을 샬레 내의 인산 완충액(PBS)으로 옮기고, 가위를 이용하여 약 4×3cm 정도의 크기로 분할하였다. 분할 후 수개의 샬레에 보존액을 침지시키고, 그 중에서 상태가 좋은 양막을 선별하였다.
[양막의 보존]
2cc의 멸균 크라이오튜브(cryotube)에 1cc씩 보존액을 첨가하고, 거기에 수득, 세정하여 선별된 양막을 1매씩 넣고 라벨링한 후, -80℃의 냉장고에 저장하였다. 보존액으로는 50%의 멸균 완료된 글리세롤이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL사)를 사용하였다. 보존된 양막의 사용 기한은 3개월로 하고, 기한이 지나가면 소각 처분하였다.
[양막 상피의 처리]
양막은 그 상피를 처리한 후, 배양에 사용하였다. 먼저, -80℃에 저장되어 있던 양막을 실온에서 해동시킨 후, 샬레 내의 멸균 완료된 인산 완충액(PBS)으로 충분히 세정하였다. 세정 후 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque사)에 2시간 동안 37℃ 하에 저장한 후, 셀 스크레이퍼(Nunc사, USA)를 이용하여 기계적으로 상피를 소파 처리하여, 배양 기질로서 사용하였다. 또한, 이 처리 방법에 따라 1층의 양막 상피가 완전히 소파 처리된 것을 광학 및 전자 현미경 조작(주사형 전자 현미경)으로 확인하였다(도 1). 또한, 도 1은 주사형 전자 현미경에 의해 관찰한 양막상이다. A는 정상적인 상태(상피 처리를 행하지 않은 상태)의 양막 표면의 상, B는 상피 소파 처리(0.02% EDTA 용액) 후의 양막 표면의 상이다.
[구강 점막 상피 세포의 회수]
6주령의 일본 백색 집토끼를 발치 후, 그에 부착된 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 이행부로부터 신중하게 분리하였다. 또한, 일련의 조작은 멸균이 완료된 기구를 사용하여 가능한 한 멸균적으로 실시하였다.
수득한 구강 점막 상피를 50IU/㎖의 페니실린스트렙토마이신, 젠타마이신을 함유하는 인산 완충액(PBS)에 30분간 실온 조건 하에서 2회 침지하였다. 그 후, 조직을 1.2U 디스파제(Nacalai tesque사)를 함유하는 인산 완충액(PBS)에 1시간 동안 37℃ 조건 하에 침지하고, 이어서 0.05% 트립신-EDTA 용액(GIBCOBRL사)으로 30분간 침지 처리하여 세포를 분리하였다. 효소 활성은 10%의 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM에 침지시킴으로써 정지시켰다. 그 후, 60㎛의 셀 필터(cell filter)를 통해 여분의 조직을 제거하고, 구강 점막 상피 세포(구강내연점막 상피 세포)를 단리하였다.
[공배양 세포의 조제]
공배양 세포(지지 세포)로서 NIH-3T3 세포(이하, 「3T3 세포」라고 약칭한다)를 사용하였다. 사전 배양하여 75F 플라스크(BD Falcon사)에 융합된 3T3 세포를 0.05% 마이토마이신 C 용액에 2시간 침지시켜, 3T3의 증식 활성을 억제하였다. 계속해서, 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정하여 마이토마이신 C를 제거한 후, 0.05% 트립신-EDTA 용액으로 처리함으로써, 3T3 세포 현탁액을 조제하였다.
[양막 상 구강 점막 상피 시트의 형성]
상피를 소파한 인간 양막을 기질로 하여, 구강 점막 상피 세포를 상기와 같이 처리한 3T3 세포와 이하의 순서로 공배양하였다. 배양 기구로는 6웰의 배양 접시(Corning사, NY)와 배양 삽입기(배양 삽입 용기)(폴리카보네이트제, 평균 세공 크기 3.0㎛, Corning사, NY)를 이용하였다.
먼저, 배양 접시 상에 약 1×104개/cm2의 세포 밀도가 되도록 3T3 세포 현탁액을 접종하고, 37℃ 하에 5% CO2의 조건 하에서 배양하였다. 또한, 배양 삽입기 상에 소파 처리한 상피측를 위로 하여 양막 기질을 정치하여 접착시키고, 실온에서 10분 건조시켰다. 그 후, 양막을 접착시킨 배양 삽입기 상에 약 1×105개/cm2의 세포 밀도가 되도록 구강 점막 상피 세포를 포함하는 세포 현탁액을 접종하였다.
이상의 조작 후, 도 2에 도시한 바와 같이, 배양 삽입기를 배양 접시 내에 설치하고, 3T3 세포와 구강 점막 상피 세포를 동일 배지 중에서 배양하였다. 또한, 도 2는 배양 중의 상태를 나타낸 모식 단면도이다. 배양 접시(1) 내에 배양 삽입기(2)가 정치되고, 배양 접시(1) 바닥면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입기(2)의 바닥면 상에 양막(3)이 정치되고, 그 위에 구강 점막 상피 세포(4)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 6은 배지이다.
배지에는 DMEM/햄 F12 혼합 배지(혼합 체적비 1:1)에, 10% FBS, 인슐린(5mg/㎖), 콜레라 톡신(0.1nM), 페니실린스트렙토마이신(50IU/㎖), 인간 재조합 상피 세포 증식 인자(EGF)(10ng/㎖)를 첨가한 것을 사용하였다.
상기 배지 내에서 2주간 배양하였다(잠수기간(Submerge)). 그 후, 점막 상피의 분화를 유도하기 위하여, 이른바 에어 리프팅법을 이용하여 일주일 배양하였다. 에어 리프팅법이란, 배지의 액면을 양막 상에 형성된 구강 점막 상피 세포층면까지로 하여, 상기 세포층의 표면을 공기 중에 노출시키는 방법이다. 잠수기간 중에는 격일로 배지를 교환하고, 에어 리프팅 후는 배지를 매일 교환하여 배양을실시하였다.
[양막 상의 구강 점막 상피 시트의 조직학적 특성의 검증]
상기한 바와 같이 배양된 구강 점막 상피 세포층은 약 20일간의 배양에 의하여, 각막 상피와 유사한 5∼6층에 다분화, 중층화한 상피층(이하, 「각막 상피형 시트)라고도 한다)을 형성시켰다(도 3, 도 4). 이 상피층의 기저측(양막측)에는 비교적 원주 모양을 한 기저 세포 유사의 세포군이 존재하고 있었다. 또한, 최표층의 세포는 편평형을 나타내었지만 핵을 가지고 있으며, 피부와는 달리 그 표면은 각화되지 않은 것이 확인되었다. 이상으로부터, 광학 현미경 관찰에서는 양막 상에 각막 유사 상피층(각막 상피형 시트)이 형성된 것으로 나타났다.
이어서, 이 각막 상피형 시트의 조직학적 특성을 검토하기 위하여 면역염색을 실시하였다. 각막 상피형 시트를 제작 후, 적절한 크기로 절제하여 OCT 화합물로 동결 포매하였다. 그 후, 크라이오스태트를 이용해 얇게 잘라, 슬라이드 절편을 제작하였다. 면역 염색에 대해서는, 대표적인 세포 골격 단백질인 케라틴과 관련하여 검토를 행하였다. 즉, 각막 특이성 케라틴 3/12, 점막 특이성 케라틴 4/13, 표피 특이성 케라틴 1/10을 검토하였다. 방법은 이하와 같다. 슬라이드 절편을 인산 완충액(PBS)으로 세정한 후, 1%의 소 태아 혈청(FBS)으로 차단하여 비특이적인 항체 반응을 억제하였다. 그 후, 각 케라틴에 대한 항체(일차 항체)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 트리톤-X(triton-X) 함유의 PBS에서 15분간 3회의 조건으로 세정하고, 계속해서 형광 표식화 항체(2차 항체)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 인산 완충액(PBS)을 이용해 15분간 3회의 조건으로 세정하고, 봉입한 후 다중 초점 현미경을 이용해 조직을 관찰하였다.
각막 상피형 시트에 대한 각종 케라틴의 항체 반응은 이하와 같다. 먼저, 각막 특이성 케라틴 3에 대한 염색성이 확인되었다(도 5의 좌측란). 생체내 구강 점막에서는 케라틴 3에 대하여 염색성이 확인되었기 때문에, 배양 조건 하에서도 그 성질이 유지된다고 생각되었다. 한편, 케라틴 12에 대해서는 염색성이 확인되지 않았다(도 5의 우측란). 점막 특이성 케라틴 4 및 13에 대해서는, 그 염색성이 동일하게 확인되었다(도 6). 그런데 표피 각화형 케라틴인 케라틴 1/10에 대해서는, 그 염색성이 확인되지 않았다(도 7). 이상으로부터, 각막 상피형 시트의 조직학적 성질로는, 세포 골격의 측면으로부터는 표피와 같이 각화되는 방향으로 분화되는 것이 아니라, 비각화형 점막 상피로서의 성질을 유지하면서, 각막 특이성 케라틴의 일부(케라틴 3)도 동시에 유지하는 것을 알았다.
[구강 점막 상피 시트의 자기 이식]
다음에, 각막 상피형 시트를 이용한 자기 이식 실험을 실시하였다. 전술한 방법에 따라, 6주령 일본 백색 집토끼로부터 구강 점막 상피 세포를 수득하여, 양막 상에 각막 상피형 시트가 형성된 이식용 시트(이하, 「각막 상피 이식용 시트」라고도 한다)를 제조하였다. 한편, 구강 점막 상피 세포의 수득을 행한 백색 집토끼에 대하여, 고리부로부터 4mm 외측으로부터 크레센트 나이프를 이용하여 각막 및 결막 상피를 100㎛ 두께로 전부 제거하였다. 이 조작에 의해 각막 상피줄기 세포를 포함하는 상피 세포가 제거되기 때문에, 인위적인 안구 표면 줄기 세포 피폐증이 재현된 것으로 생각할 수 있다. 이러한 조작 후, 각막 상피 세포를 포함하는상피가 잔존하지 않는 것을 플루오레세인 염색으로 확인하였다(도 8). 또한, 플루오레세인 염색 시험은, 플루오레세인 시험지에 항생제의 점안 등의 수분을 포함하여 안구 표면에 직접 도포하고, 2~3회 깜박거림을 행하게 한 후, 안구 표면의 플루오레세인 염색성을 관찰함으로써 실시하였다. 각막 상피가 잔존하면, 타이트한 세포간 접착 구조에 의해 플루오레세인 색소가 침윤하지 않아, 플루오레세인에 의한 염색이 확인되지 않는다. 4주 후, 이 집토끼의 안구 표면은 주변의 잔존 결막 상피로 피복되어 투명성을 상실한 것으로 나타났다(도 9).
다음에, 결막 상피로 피복되어 투명성을 상실한 동일 안구에 대하여, 안구 표면의 결막 조직을 제거한 후, 전술한 각막 상피 이식용 시트를 고리부로부터 약간 내측의 영역에 이식하였다. 이식 시에는 10-0 나일론사를 이용하여 주위의 조직에 봉합하였다. 이식 후, 이식편 상에 치료용 소프트 콘택트 렌즈를 봉합하였다. 수술 후, 항생제 및 스테로이드 안연고를 2회/일 도포하였다. 이식 후의 시점에서, 안구 표면은 이식 전의 각막 상피 이식용 시트와 동일한 투명성을 나타내고 있었다(도 10).
이식 후 48시간 및 10일 경과한 시점에, 이식술을 실시한 안구 표면을 관찰하였다. 이식 후 48시간 경과한 시점에, 이식된 각막 상피 이식용 시트는 투명성을 유지하고 있으며, 또한 플루오레세인 염색을 통해 안구 표면에 결손 없이 잔존하는 것이 확인되었다(도 11). 또한, 이식편(각막 상피 이식용 시트)이 플루오레세인 염색성을 나타내지 않는 것으로부터, 본 발명의 각막 상피 이식용 시트(각막 상피형 시트)는 각막 상피와 동일한 배리어 기능을 구비하는 것이 확인되었다. 또한, 플루오레세인 염색에서, 이식편의 주위는 전반에 걸쳐 플루오레세인의 염색성이 인지되었으므로, 이식부에 존재하는 조직은 주위의 잔존 결막 상피는 오염되지않은 것이 확인되었다.
또한, 각막 상피는 세포간에 타이트한 접착 구조로 결합하고 있기 때문에, 그 표면보다 플루오레세인의 색소가 침윤하지 않아, 플루오레세인 염색에 있어서 염색성을 나타내지 않는다. 한편, 세포간 접착이 느슨해지거나, 세포 자체가 박리하여 배리어 기능이 장해되었을 시에는, 플루오레세인 색소의 침윤이 발생해 조직이 염색된다. 따라서, 플루오레세인 염색에 의한 염색성을 조사함으로써, 이식한 각막 상피형 시트가 각막 상피와 동일한 배리어 기능을 구비하는 지의 여부를 확인할 수 있다.
이식 후 10일이 경과한 시점에서, 상기와 같이 안구 표면을 관찰하였다. 이식된 각막 상피 이식용 시트는 안구 표면에 잔존하며, 또한 이식 후 48시간 경과한 시점의 상태와 비교하여 주위로 신장하여 있는 것이, 플루오레세인 염색을 통해 관찰되었다(도 12). 이식편은 플루오레세인 염색성을 나타내지 않고, 각막 상피에 필요한 배리어 기능을 유지하는 것이 확인되었다. 또한, 투명성도 유지되었다.
이상으로부터, 양막 상에서 배양하여 얻어지는 각막 상피형 시트가 안구 표면에 생존하여, 신장하고, 수술 후 장기간에 걸쳐 투명성을 유지하는 것이 확인되었다. 즉, 전술한 방법에 따라 제작되는 각막 상피형 시트는 각막 상피의 대체로서 양호하게 기능하며, 또한 양막과 그 위에 형성된 각막 상피형 시트로 이루어지는 시트상의 조성물(각막 상피 이식용 시트)은, 각막의 손상, 결손 등의 경우에 안구 표면을 재건하기 위한 이식 재료로서 적합하게 이용할 수 있는 것이 확인되었다.
<실시예 2> 인간에서의 각막 상피형 시트의 평가
다음에, 각막 상피형 시트를 인간에게 적용한 경우의 효과를 확인하였다. (1) 화학적 외상 급성기의 천연성 상피 결손을 가지는 환자, (2) 화학적 외상 만성기의 반흔 조직 침입에 의한 혼탁을 가지는 환자, (3) 안류천포창 환자를 이식 대상자로 하여, 상기 실시예 1과 동일의 방법으로 각 환자로부터 각각 구강 점막 상피 세포를 수득하였다. 이어서, 상피를 소파 처리한 인간 양막을 기질로 하여 구강 점막 상피 세포를 3T3 세포와 공배양하고, 인간 양막 상에 구강 점막 상피 세포층이 형성된 각막 상피 이식용 시트를 얻었다. 또한, 상피를 소파 처리한 인간 양막의 조제 방법 및 3T3과의 공배양 조건은 실시예 1의 경우와 동일하다. 이렇게 하여 조제한 각각의 각막 상피 이식용 시트를, 그의 조제에 사용한 세포를 수득한 환자에게 각각 이식하고(자기이식), 그 효과를 평가하였다. 이식 방법은 실시예 1에 기재한 방법과 동일하게 실시하였다. 단, 안류천포창 환자에 대해서는 상방의 반흔 조직을 절제하여 유착을 해제시킨 후, 각막 상피형 이식 시트의 이식을 상방 1/3에 실시하고, 동시에 백내장 수술을 실시해 안내 렌즈를 삽입하였다.
수술 전(좌측란) 및 수술 후 5개월(우측란) 시점의 화학적 외상 급성기의 천연성 상피 결손 환자의 안구 표면의 상태를 도 13에 나타낸다. 수술 후 5개월 시점에는 안구 표면이 훌륭히 재건되어 있는 것이 발견된다. 이식 수술을 행하지 않는 경우에는, 본 환자의 시력은 반흔 조직의 침입으로 인해 수동 수준 정도일 것이예상되는 상태였다. 현재, 시력은 0.5까지 회복되었고, 상피의 상태도 안정되었다. 또한, 자가이식이므로, 거부 반응의 걱정도 없고, 수술 후 관리는 종래의 이식술에 비교하여 현저하게 용이하다.
도 14에 수술 전(좌측란) 및 수술 후 2개월(우측란) 시점의 화학적 외상 만성기의 반흔성 각결막 상피증 환자의 안구 표면의 상태를 나타내었다. 이 환자는, 수술 전에는 안내 소견이 얻어지지 않을 정도의 중증이지만, 이식 수술에 의해서 유착을 해제할 수 있어, 수정체까지 투시 가능하게 되었다. 시력은 광각으로부터 지수 수준으로 개선하였다. 다음 수술 방침을 결정하기 위한 예비적인 수술로서 행하였지만, 안내를 관찰하고자 하는 당초의 목적을 달성한 것 외에, 미용적으로도 현저한 개선이 인지되었다.
도 15에, 수술 전(좌측란) 및 수술 후 1개월(우측란) 시점의 안류천포창 환자의 안구 표면의 상태를 나타낸다. 안류천포창 환자에 대하여 통상의 백내장 수술을 실시하면, 이것을 계기로 결막이 침습되어 반흔이 형성되고, 그것에 의하여 현저한 각막 혼탁이 초래되는 것으로 알려져 있다. 이러한 증세의 예로는, 수술 전에 안류천포창에 의한 검구 유착이 상방으로 인지되었지만, 수술 후 1개월 경과한 시점에 안구 표면의 상태는 안정되어 있다. 시력에 관해서는, 수술 전 0.06에 지나지 않던 것이, 현재는 0.6까지 회복되었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 각막 상피형 시트(각막 상피 이식용 시트)의 인간에 대한 유효성이 실증되었다.
본 발명은 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다.특허 청구의 범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 도달할 수 있는 범위에서 여러 가지 변형 양태도 본 발명에 포함된다.
이하, 다음 사항을 개시한다.
[11] a) 콜라겐층 상에서 구강 점막 상피 세포를 배양하는 단계; 및
b) 구강 점막 상피 세포를 증식시켜 중층화한 후, 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[12] 상기 [11]에 있어서,
상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[13] 상기 [11]에 있어서,
상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에, 상기 지지 세포와 상기 콜라겐층 사이에, 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막이 존재하는 상태에서 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[14] 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[15] 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서,
상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[16] 제1 용기 내에 지지 세포를 접종하여, 지지 세포의 층을 형성시키는 단계;
상기 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막으로 이루어지는 바닥면을 가지는 제2 용기를, 상기 바닥면이 배양액 중에 잠기도록 상기 제1 용기 내에 배치하는 단계;
상기 제2 용기의 바닥면 상에 콜라겐층을 형성시키는 단계;
상기 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하는 단계;
상기 구강 점막 상피 세포를 배양하여 중층화시키는 단계; 및
중층화한 구강 점막 상피 세포의 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[17] 상기 [16]에 있어서,
상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
[18] 상기 [16]에 있어서,
상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
지금까지의 안구 표면 재건술은, 자기(자가) 또는 타인(타가)으로부터 각막 상피 줄기 세포를 수득하여, 이것을 환자에게 이식하는 것이었다. 그러나, 자기의 건강한 안구로부터의 줄기 세포의 수득은 장래적으로 건강한 안구의 줄기 세포 피폐증이 우려된다. 또한, 타인으로부터의 줄기 세포 이식에서는 항상 거부 반응의 위험이 수반될 뿐 아니라, 도너 부족의 문제가 있다. 본 발명에 따라 제공되는 각막 상피형 시트 및 각막 상피 이식용 시트에 의하면, 이식 재료용 세포원으로서 자기의 구강 점막 상피를 이용할 수 있기 때문에, 줄기 세포 피폐증이 초래될 우려가 없고, 거부 반응의 위험도 매우 적고, 나아가 도너에 대한 걱정 없이 이식술을 행하는 것이 가능하게 된다. 특히, 자기의 각막 상피 줄기 세포의 수득이 곤란하거나 또는 불가능한 환자, 즉 양안성 각막 질환 환자에 있어서도, 자기 세포를 이용하여 제작한 이식 재료를 이용한 이식술이 가능하다는 점에서 의의가 있다.
본 발명의 각막 상피형 시트(각막 상피 이식용 시트)는 이식 후의 생존이 양호하며, 또한 깜박거림에 견딜 수 있는 정도의 접착성을 갖는다. 또한, 기저 세포층에서 일정한 증식능을 유지하면서, 수직 방향으로 중층화한 분화된 상피형 세포층이 형성되고, 각막 상피에 매우 유사한 구조를 구비한다. 또한, 각막 상피가 그 기능을 발휘하는 데 필요한 배리어 기능도 구비하며, 투명성도 높다. 이와 같이 본 발명에 따라 제공되는 각막 상피형 시트 및 각막 상피 이식용 시트는 각막 상피를 재건하기 위한 이식 재료로서 매우 우수한 것이다.

Claims (18)

  1. 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층으로 이루어지는 각막 상피형 시트.
  2. 제1항에 있어서,
    최표층(最表層)의 세포가 각화되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    최표층의 세포가 편평 형상인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    배리어 기능을 구비하는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트.
  5. 콜라겐층 상에, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포가 중층화한 세포층이 형성된 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포층의 최표층의 세포가 각화되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 세포층의 최표층의 세포가 편평 형상인 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 양막(羊膜) 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    배리어 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 각막 상피 이식용 시트.
  11. a) 콜라겐층 상에서 구강 점막 상피 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 구강 점막 상피 세포를 증식시켜 중층화한 후, 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
    를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 단계 a)가 지지 세포의 공존 하에, 상기 지지 세포와 상기 콜라겐층 사이에, 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막이 존재하는 상태에서 실시되는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  16. 제1 용기 내에 지지 세포를 접종하여, 지지 세포의 층을 형성시키는 단계;
    상기 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기(pore size)의 격리막으로 이루어지는 바닥면을 가지는 제2 용기를, 상기 바닥면이 배양액 중에 잠기도록 상기 제1 용기 내에 배치하는 단계;
    상기 제2 용기의 바닥면 상에 콜라겐층을 형성시키는 단계;
    상기 콜라겐층 상에 구강 점막 상피 세포를 접종하는 단계;
    상기 구강 점막 상피 세포를 배양하여 중층화시키는 단계; 및
    중층화한 구강 점막 상피 세포의 최표층을 공기에 접촉시키는 단계
    를 포함하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 양막 유래인 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 콜라겐층이 상피를 제거한 양막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 각막 상피형 시트의 제조 방법.
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