KR200399984Y1 - Double filter for purification of DNA - Google Patents
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Abstract
본 고안은 DNA 분리 이중 필터에 관한 것으로, 보다 자세하게는 박테리아로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 신속하게 분리, 정제하는 2중 필터 및 그 정제방법에 관한 것이다.The present invention relates to a DNA separation double filter, and more particularly, to a double filter for rapidly separating and purifying plasmid DNA from bacteria and a purification method thereof.
본 고안의 DNA 분리 이중 필터는, 세포 잔해 입자를 필터링하기 위해 합성수지층과 셀룰로오스 층으로 구성된 이중층 필터; 및 상기 이중층 필터를 통과한 시료 중 DNA를 선택적으로 결합시키는 섬유막 필터를 포함하여 구성됨에 기술적 특징이 있다.DNA separation double filter of the present invention, a double layer filter composed of a synthetic resin layer and a cellulose layer to filter out cell debris particles; And a fiber membrane filter for selectively binding DNA in the sample passed through the double layer filter.
따라서, 본 고안의 DNA 분리 이중 필터 및 그 정제방법은 박테리아로부터 플라스미드 DNA 정제시 섬유막 필터와 이중층을 갖는 필터를 결합한 이중 필터를 사용함으로써, 시료 하나의 실험시 약 10분 가량의 시간을 단축할 수 있으므로 대량의 시료를 실험할 경우 총 소요 시간을 대폭적으로 단축할 수 있다.Therefore, the DNA separation double filter of the present invention and its purification method use a double filter that combines a fiber membrane filter and a filter having a double layer when purifying plasmid DNA from bacteria, thereby reducing the time of about 10 minutes in one sample experiment. Therefore, when experimenting with a large amount of samples, the total time required can be significantly shortened.
Description
본 고안은 DNA 분리 이중 필터에 관한 것으로, 보다 자세하게는 박테리아로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 신속하게 분리, 정제하는 2중 필터에 관한 것이다.The present invention relates to a DNA separation double filter, and more particularly, to a double filter for rapidly separating and purifying plasmid DNA from bacteria.
종래의 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법은 다양하게 발표되어 왔다. 현재 가장 널리 사용되는 방법은 알칼리성 용해(alkaline lysis) 후 유리섬유막으로 이루어진 실리카 필터(silica filter)를 통하여 정제하는 방법이다. 이 방법은 매우 간편하게 박테리아로부터 비교적 순수한 DNA를 정제할 수 있는 것으로서, 일반적으로 다음과 같은 순서로 이루어진다.Various methods of purifying plasmid DNA from conventional bacteria have been published. Currently, the most widely used method is a method of purifying through a silica filter composed of a glass fiber membrane after alkaline lysis. This method is very easy to purify relatively pure DNA from bacteria, generally in the following order.
단계 1. 먼저 1㎖ 내지 3㎖의 박테리아 배양액을 원심분리하여 그 펠렛을 얻는다.Step 1. First, centrifuge 1 ml to 3 ml of bacterial culture to obtain pellets.
단계 2. 박테리아 세포를 250㎕의 용액1로 현탁시킨다.Step 2. Suspend bacterial cells in 250 μl of Solution 1.
단계 3. 염기성의 250㎕의 용액2를 첨가하여 용해한다.Step 3. Dissolve by adding 250 μl of Basic Solution 2.
단계 4. 250㎕의 용액3을 첨가하여 용액을 중화시킨다.Step 4. Neutralize the solution by adding 250 μl of solution 3.
단계 5. 10분 가량 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 하부에 침전시킨다.Step 5. Settle cell debris on the bottom by centrifugation for 10 minutes.
단계 6. 세포 잔해를 제외한 상층액(Cleared lysate)만을 취하여 유리섬유막이 안착된 필터1에 옮긴다.Step 6. Take only the supernatant (Cleared lysate) excluding cell debris and transfer it to Filter 1 on which the glass fiber membrane is placed.
단계 7. 상기 필터를 원심분리하여 DNA만을 선택적으로 유리섬유막에 흡착시킨다.Step 7. Centrifuge the filter to selectively adsorb only DNA onto the glass fiber membrane.
단계 8. 적당량의 용액4를 필터1에 충진한 후 원심분리를 통해 유리섬유막에 흡착되어 있는 DNA를 세척한다.Step 8. Fill the filter 1 with the appropriate amount of solution 4, and wash the DNA adsorbed on the glass fiber membrane by centrifugation.
단계 9. 적당량의 용액5를 필터1에 충진한 뒤 원심분리를 통해 흡착되어 있던 DNA를 회수한다.Step 9. Fill the filter 1 with the appropriate amount of solution 5 and recover the adsorbed DNA by centrifugation.
도 1은 상기 단계 1 내지 단계 9를 간략하게 나타낸 것이다. 먼저, 상기 단계 1 내지 단계 5의 과정을 용기1(100)에서 진행한다. 이 후, 세포 잔해를 제외한 상층액 만을 취하여 유리섬유막이 안착된 필터1(200)로 옮긴다. 상기 필터1(200)을 통해 상기 단계 7 내지 단계 9의 과정을 진행한다.Figure 1 shows the steps 1 to 9 briefly. First, the process of steps 1 to 5 is performed in the container 1 (100). Thereafter, only the supernatant except the cell debris is taken and transferred to the filter 1 (200) on which the glass fiber membrane is placed. The process of steps 7 to 9 is performed through the filter 1 200.
그러나, 이러한 방법은 몇개 안되는 적은 수의 시료를 이용하여 실험할 경우 깨끗한 DNA를 비교적 신속하게 정제할 수 있었으나, 시료의 수가 많아지면 실험에 필요한 시간이 매우 길어지게 되어 비효율적인 단점이 발생한다. 즉, 상기 용기1에서 단계 1 내지 단계 4의 과정을 거친 후, 단계 5의 원심분리를 진행하는데 걸리는 시간 및 시료의 개수에 따른 추가적인 조작시간이 발생하여 전체적인 시간이 대폭 증가한다.However, this method was able to purify clean DNA relatively quickly when experimenting with a few small samples, but the larger the number of samples, the longer the time required for the experiment is inefficient disadvantage occurs. That is, after passing through the process of steps 1 to 4 in the container 1, an additional operation time occurs according to the time taken for the centrifugation of step 5 and the number of samples, thereby greatly increasing the overall time.
따라서, 본 고안은 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위한 것으로, 상기 단계 5 내지 단계 7의 과정을 동시에 수행할 수 있는 DNA 분리 이중 필터를 사용하여 개별 시료당 실험 시간을 단축함으로써 대량 시료의 실험시 전체적인 실험 시간을 대폭 단축시킬 수 있는 DNA 분리 이중 필터를 제공함에 본 고안의 목적이 있다.Therefore, the present invention is to solve the above disadvantages and problems of the prior art, by reducing the experiment time per individual sample using a DNA separation double filter that can perform the steps 5 to 7 at the same time It is an object of the present invention to provide a DNA separation double filter that can greatly reduce the overall experiment time when testing a large sample.
본 고안의 상기 목적은 박테리아 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 필터에 있어서, 세포용해 후 잔해 입자를 필터링하기 위한 이중층 필터; 및 상기 이중층 필터를 통과한 시료 중 DNA를 선택적으로 결합시키는 유리섬유막 필터를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 DNA 분리 이중 필터에 의해 달성된다.The above object of the present invention is a filter for separating plasmid DNA from a bacterial sample, comprising: a bilayer filter for filtering debris particles after cell lysis; And it is achieved by a DNA separation double filter comprising a glass fiber membrane filter for selectively binding the DNA in the sample passed through the double layer filter.
본 고안의 상기 목적과 기술적 구성 및 그에 따른 작용효과에 관한 자세한 사항은 본 고안의 바람직한 실시예를 도시하고 있는 도면을 참조한 이하 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다.Details of the above object and technical configuration of the present invention and the effects thereof according to the present invention will be more clearly understood by the following detailed description with reference to the drawings showing preferred embodiments of the present invention.
먼저, 도 2a는 본 고안에 따른 필터를 나타낸 것이다. 도 2a의 좌측에 나타낸 필터는 DNA의 선택적인 흡착을 위한 필터(10)로써, 상기 필터(10)는 실리카(silica)표면을 갖는 고체상의 유리섬유막 혹은 셀라이트입자(celite particle)로 이루어지는 필터층(11)을 갖는다.First, Figure 2a shows a filter according to the present invention. The filter shown on the left side of Figure 2a is a filter 10 for the selective adsorption of DNA, the filter 10 is a filter layer consisting of a solid glass fiber membrane or celite particles having a silica (silica) surface ( 11)
도 2a의 우측에 나타낸 필터는 본 고안의 특징적인 필터(20)로써, 상기 필터(20)는 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 필터링에 용이한 그물형상의 바닥면(23) 위에 이중층을 갖는 바, 합성수지 필터층(22)과 셀룰로오즈(cellulose) 필터층(21)을 갖는다.The filter shown on the right side of FIG. 2A is a characteristic filter 20 of the present invention, and the filter 20 has a double layer on the mesh bottom surface 23 that is easy to filter as shown in FIG. 2B. And a synthetic resin filter layer 22 and a cellulose filter layer 21.
상기 합성수지 필터층(22)은 폴리프로필렌(polypropylene) 혹은 폴리에틸렌(polyethylene)이나 이의 파생산물(derivatives) 재질로 이루어지며, 필터층의 두께는 0.5㎜ 내지 5㎜이고, 기공직경 1㎛ 내지 100㎛를 갖는다. 상기 셀룰로오즈 필터층(21)은 셀룰로오스(cellulose), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 혹은 이와 유사한 재질을 가지며, 층의 두께 0.1㎜ 내지 2㎜, 기공직경 0.1㎛ 내지 10㎛를 갖는다. 이러한 두 가지 필터층(21, 22)을 이용하여 염기성 용해 후 생성되는 세포용출물로부터 고형질을 제거하여 플라스미드 DNA가 섞여 있는 용액만을 분리시킬 수 있다.The synthetic resin filter layer 22 is made of polypropylene or polyethylene or derivatives thereof, and the filter layer has a thickness of 0.5 mm to 5 mm and a pore diameter of 1 μm to 100 μm. The cellulose filter layer 21 has cellulose, nitrocellulose, or the like, and has a thickness of 0.1 mm to 2 mm and a pore diameter of 0.1 μm to 10 μm. Using these two filter layers 21 and 22, the solids are removed from the cell eluate generated after basic lysis to separate only the solution containing the plasmid DNA.
도 3은 상기 도 2a의 필터(10, 20)를 결합한 이중 필터(30)를 나타낸 것이다. 도 3과 같이 섬유막 필터(10) 위에 이중층을 갖는 필터(20)가 얹혀지는 구조로 이루어짐으로써 상기 언급된 종래기술의 문제점인 실험 시간을 단축할 수 있는 것이다.FIG. 3 shows a double filter 30 combining the filters 10 and 20 of FIG. 2a. As shown in FIG. 3, the filter 20 having the double layer is placed on the fiber membrane filter 10, thereby reducing the experiment time, which is a problem of the above-mentioned prior art.
도 3과 같은 이중 필터(30)를 사용하여 박테리아로부터 순수한 DNA를 정제하는 순서는 다음과 같다.The procedure for purifying pure DNA from bacteria using the double filter 30 as shown in FIG. 3 is as follows.
단계 1. 먼저 1㎖ 내지 3㎖의 박테리아 배양액을 원심분리하여 그 펠렛을 얻는다.Step 1. First, centrifuge 1 ml to 3 ml of bacterial culture to obtain pellets.
단계 2. 박테리아 세포를 150㎕의 용액1로 현탁시킨다.Step 2. Suspend bacterial cells with 150 μl of Solution 1.
단계 3. 염기성의 150㎕의 용액2를 첨가하여 용해한다.Step 3. Add 150 μl of basic solution 2 to dissolve.
단계 4. 200㎕의 용액3을 첨가하여 용액을 중화시킨다.Step 4. Neutralize the solution by adding 200 μl of solution 3.
단계 5. 이중 필터(30)에 옮긴 후, 원심분리하여 DNA만을 필터(10)의 섬유막에 흡착시킨다.Step 5. After transferring to the double filter 30, centrifugation to adsorb only DNA to the fiber membrane of the filter (10).
단계 6. 적당량의 용액4를 필터(10)에 충진한 후 원심분리를 통해 유리섬유막에 흡착되어 있는 DNA를 세척한다.Step 6. Fill the filter 10 with the appropriate amount of solution 4, and wash the DNA adsorbed on the glass fiber membrane by centrifugation.
단계 7. 적당량의 용액5를 필터(10)에 충진한 뒤 원심분리를 통해 흡착되어 있던 DNA를 회수한다.Step 7. After filling the appropriate amount of solution 5 to the filter (10) to recover the adsorbed DNA through centrifugation.
상기 본 고안에 따른 단계 1 내지 단계 7을 수행함으로써, 종래기술의 단계 5의 세포 잔해(cell debris)를 하부에 침전시키기 위한 10분 가량의 원심분리와, 단계 7의 DNA만을 선택적으로 유리섬유막에 흡착시키기 위한 원심분리의 과정을, 본 고안의 단계 5의 단 한 번의 원심분리로 단축시킬 수 있는 것이다.By performing steps 1 to 7 according to the present invention, centrifugation for about 10 minutes to precipitate the cell debris of the step 5 of the prior art, and only the DNA of step 7 to the glass fiber membrane selectively The process of centrifugation for adsorption can be shortened to only one centrifugation in step 5 of the present invention.
상기 본 고안에 따른 단계 1 내지 단계 7을 수행하는데 있어 사용되는 용액1 내지 용액5에 대해 살펴 보면 다음과 같다.Looking at Solution 1 to Solution 5 used in performing steps 1 to 7 according to the present invention as follows.
먼저, 상기 단계 2의 용액1은 세포를 완충시키는 것으로, 세포를 골고루 현탁하고 DNA의 정제를 위한 안정된 조건으로 만드는 용액이다. 상기 용액1의 예로, 50mM TrisCl, pH7.5 및 10mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 사용한다.First, the solution 1 of step 2 is a solution that buffers the cells, which suspends the cells evenly and makes the conditions stable for the purification of DNA. As an example of Solution 1, 50 mM TrisCl, pH7.5, and 10 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) are used.
상기 단계 3의 용액2는 시료의 pH를 염기조건으로 만들어 주는 용액으로, pH가 염기조건이 되어 세포구성성분들의 특성이 변화됨으로써 세포의 구조가 이완되어 세포내의 내용물이 세포밖으로 빠져나온다. 상기 용액2의 예로, 1% SDS 및 0.2M NaOH를 사용한다.The solution 2 of the step 3 is a solution for making the pH of the sample to the basic condition, the pH is the basic condition, the characteristics of the cell components are changed, the structure of the cell is relaxed, the contents of the cell is released out of the cell. As an example of the solution 2, 1% SDS and 0.2M NaOH are used.
상기 단계 4의 용액3은 용액의 pH를 다시 중성으로 바꿔 주어, 이완된 세포구성성분들이 서로 엉겨 붙어 고형질의 침전물이 형성되도록 하는 것이다. 상기 용액3의 예로, 3M Potassium acetate 및 4M Guanidine hydrochloride를 사용한다. 이러한 상태에서 상기 단계 5에서 원심분리를 할 경우 엉겨붙은 고형질의 세포구성성분들은 이중층 필터에 필터링 되고, 수용성 분자들(단백질, 플라스미드 DNA, RNA)은 액상으로 그대로 존재하게 되어 섬유막 필터에서 필터링 된다. 상기 유리섬유막 필터는 높은 농도의 챠오트로피스(chaortopes)하, 혹은 특정 농도의 에틸알콜 혹은 이소프로필알콜(isopropanol)하의 조건에서 DNA와 선택적으로 결합하는 성질을 갖는다. 또한 상기 단계 5의 원심분리 시간은 30초 내지 1분 가량이면 족하다.Solution 3 of step 4 is to change the pH of the solution back to neutral, so that the loose cell components are entangled with each other to form a solid precipitate. As an example of the solution 3, 3M Potassium acetate and 4M Guanidine hydrochloride are used. In this state, when the centrifugation is performed in step 5, the entangled solid cell components are filtered in the bilayer filter, and the water-soluble molecules (protein, plasmid DNA, RNA) remain in the liquid phase and filtered in the fibrous membrane filter. The glass fiber membrane filter has a property of selectively binding to DNA under conditions of high concentration of chaortopes or under specific concentrations of ethyl alcohol or isopropyl alcohol (isopropanol). In addition, the centrifugation time of step 5 may be about 30 seconds to 1 minute.
상기 단계 6의 용액4는 플라스미드 DNA 외에, 유리섬유막에 불특정하게 붙을 수 있는 RNA, 수용성 단백질 또는 염(salt)을 제거하는 역할을 한다. 상기 용액4의 예로, 100mM Sodium chloride, 10mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 20mM TrisCl, pH7.5, 60% Ethanol을 사용한다.In addition to the plasmid DNA, the solution 4 of step 6 serves to remove RNA, water-soluble protein, or salt, which can be unspecifically attached to the glass fiber membrane. As an example of the solution 4, 100mM sodium chloride, 10mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 20mM TrisCl, pH7.5, 60% Ethanol is used.
상기 단계 7의 용액5는 플라스미드 DNA가 저농도의 염, 7.5이상의 pH 컨디션에서 유리섬유막에 대하여 부착능력을 상실하여 분리되는 특성을 활용하는 것이다. 즉, 상기의 조건에 부합되는 용액5를 흘려주면 용액에 플라스미드 DNA가 분리된다. 상기 용액5의 예로, 10mM TrisCl, pH8.5를 사용한다.The solution 5 of step 7 utilizes the property that the plasmid DNA is separated by the loss of adhesion to the glass fiber membrane in a low concentration of salt, pH condition of 7.5 or more. In other words, the plasmid DNA is separated from the solution by flowing solution 5 meeting the above conditions. As an example of the solution 5, 10 mM TrisCl, pH8.5 is used.
본 고안은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 고안의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 고안이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.The present invention has been shown and described with reference to the preferred embodiment as described above, but is not limited to the above embodiments and those skilled in the art to which the subject innovation belongs within the scope not departing from the spirit of the present invention. Various changes and modifications will be possible.
따라서, 본 고안의 DNA 분리 이중 필터 및 그 정제방법은 박테리아로부터 플라스미드 DNA 정제시 섬유막 필터와 이중층을 갖는 필터를 결합한 이중 필터를 사용함으로써, 시료 하나의 실험시 약 10분 가량의 시간을 단축할 수 있고, 대량의 시료를 실험할 경우 시료의 개수에 비례하여 시료에 대한 조작횟수가 줄어듬으로써 총 소요 시간을 대폭적으로 단축할 수 있다.Therefore, the DNA separation double filter of the present invention and its purification method use a double filter that combines a fiber membrane filter and a filter having a double layer when purifying plasmid DNA from bacteria, thereby reducing the time of about 10 minutes in one sample experiment. In the case of experimenting with a large amount of samples, the total required time can be drastically shortened by reducing the number of operations on the samples in proportion to the number of samples.
도 1은 종래기술에 따른 DNA 분리 순서도.1 is a flow chart of DNA separation according to the prior art.
도 2a 내지 도 2b는 본 고안에 따른 DNA 분리 개별 필터.Figure 2a to 2b is a DNA separation individual filter according to the present invention.
도 3은 본 고안에 따른 DNA 분리 이중 필터3 is a DNA separation double filter according to the present invention
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명><Description of the symbols for the main parts of the drawings>
10: 섬유막 필터 20: 이중층 필터10: fiber membrane filter 20: double layer filter
30: 이중 필터30: double filter
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