KR20030087001A

KR20030087001A - Ｄｋｋ－１ 또는 그의 길항제가 관련된 치료법

Info

Publication number: KR20030087001A
Application number: KR10-2003-7010720A
Authority: KR
Inventors: 베니타 아이 드알메이다; 티모시 에이 스튜어트
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2001-02-16
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2003-11-12
Also published as: PL374006A1; JP2005509402A; MXPA03007327A; HUP0303194A2; IL157328A0; EP1360199A2; WO2002066509A3; WO2002066509A2; CA2438245A1; AU2002306505B2; ZA200306232B; US20030165501A1

Abstract

Dickkopf-1 (Dkk-1)에 대한 길항제는 유효량으로 투여되어 인슐린 내성과 관련된 장애, 예를 들어 인슐린-비의존성 진성 당뇨병 (NIDDM), 저인슐린혈증, 및 근육 이상과 관련된 장애, 외상, 또는 퇴행을 치료한다. 바람직하게는, 상기 길항제가, Dkk-1의 효과를 차단하는 데 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체 중에 Dkk-1에 대해 유도된 항체를 포함하는 조성물을 구성한다. 또한, 포유동물에게 유효량의 Dkk-1을 투여하여, 상기 포유동물에서 비만 또는 고인슐린혈증을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, Dkk-1을 표적으로 사용하여 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증, 비만, 및 관련 장애들을 진단하는 방법, 및dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물도 제공된다.

Description

Ｄｋｋ－１ 또는 그의 길항제가 관련된 치료법 {Treatment Involving Dkk-1 or Antagonists Thereof}

Dickkopf (dkk) 단백질은 Wnt 활성을 조절하는 분비 단백질 군이다 (Krupnik et al., Gene, 238:301-313 (1999); Monaghan et al., Mech. Dev., 87:45-56 (1999); Roessler et al., Cell Genet., 89:220-224 (2000)). 이 단백질 군은 고도로 관련이 있으며 2개의 보존된 시스테인-풍부 도메인을 함유하는 4개의 구성원으로 구성된다 (2000년 9월 8일자로 공개된 WO 00/52047).

Dkk-1 (1999년 9월 16일자로 공개된 WO 99/46281, 이 문헌에서는 Dkk-1을 PRO1008로 명명하였고, DNA57530에 의해 코딩됨; 2000년 4월 6일자로 공개된 WO 00/18914; 2000년 9월 8일자로 공개된 WO 00/52047; 1998년 10월 22일자로 공개된 WO 98/46755)은 Wnt 신호전달을 억제하여 작용하는, 제노푸스 (Xenopus)의 머리 형성에 대한 유도인자로서 최초로 확인되었고 (Glinka et al., Nature, 391:357-362 (1998)), 이후에는 사지 발생에 관여 (Grotewold et al., Mech. Dev., 89:151-153 (1999))하며, Wnt-유도된 형태 변형을 억제 (Fedi et al., J. Biol. Chem., 274:19465-19472 (1999))하는 것으로 밝혀졌다.

최근의 연구는 Dkk가 Wnt 신호전달의 보조수용체로서 작용하는 저밀도 지질단백질-관련 단백질인 LRP6과의 결합을 통해 작용함을 알아냈다 (Mao et al., Mol. Cell., 7:801-809 (2001); Pinson et al., Nature. 407:535-538 (2000); Tamai et al., Nature, 407:530-535 (2000); Wehrli et al., Nature, 407:527-530 (2000)). Dkk-1은 Wnt 및 Frizzled와의 상호작용에 관여하는 도메인과는 별개인 도메인에서 LRP6에 결합함으로써 LRP6-매개 Wnt/β-카테닌 신호전달을 억제하여, Wnt 신호전달에 대한 길항작용을 한다 (Bafico et al., Nat. Cell. Biol., 3:683-686 (2001); Mao et al., Nature, 411:321-325 (2001); Semenov et al., Current Biology, 11:951-961 (2001)).

Wnt 족 단백질들은 배아 발생 및 다양한 세포 유형의 분화에서 핵심적인 역할을 한다 (Peifer and Polakis, Science, 287:1606-1609 (2000)). Wnt 신호전달 경로는 분비된 Wnt와 이들의 수용체인 Frizzled 단백질 사이의 상호작용에 의해 활성화되며 (Hlsken and Behrens, J. Cell. Sci., 113:3545-3546 (2000)), 이때 LDL 수용체-관련 단백질인 LRP5 및 LRP6가 보조수용체로서 작용한다 (Mao et al., Mol. Cell., 상기 문헌; Pinson et al., 상기 문헌; Tamai et al., 상기 문헌; Wehrli et al., 상기 문헌). Wnt 신호전달의 하류 영향은 Disheveled (Dvl1) 단백질의 활성화를 포함하여, Akt를 활성화시킨 후에 Axin-β-카테닌-GSK3β-APC 복합체로 동원(動員)시킨다 (Fukumoto et al., J. Biol. Chem., 276:17479-17483 (2001)). 이후에는 GSK3β가 인산화 및 불활성화되어, β-카테닌의 인산화 및 분해가 억제된다. 축적된 β-카테닌은 핵으로 전위하여, 림프양 인핸서 인자-T 세포 인자 (LEF/TCF) 족의 전사 인자와 상호작용하여 표적 유전자의 전사를 유도한다.

Wnt 신호전달의 하류 이펙터 (effector) 중 2가지인 Akt과 GSK3β는 인슐린 신호전달 경로/글루코스 대사에서 핵심적인 중간체이다. Wnt 신호전달은 근육 분화의 조절 (Borello et al., Development. 126:4247-4255 (1999); Cook et al., Embo. J., 15:4526-4536 (1996); Cossu and Borello, Embo. J., 18:6867-6872 (1999); Ridgeway et al., J. Biol. Chem., 275:32398-32405 (2000); Tian et al., Development, 126:3371-3380 (1999); Toyofuku et al., J. Cell. Biol., 150:225-241 (2000)) 및 지방생성 (Ross et al., Science. 289:950-953 (2000))에 관여하고, Wnt 신호전달의 억제는 근세포의 지방세포로의 트랜스-분화 (trans-differentiation)를 자극할 수 있다 (Ross et al., 상기 문헌).

Wnt/Wg-조건화 배지의 단기간 처리는 Ser9에서의 Akt 활성화 및 GSK3β 인산화를 초래하지 않았지만, 유리 β-카테닌은 세포질에 축적되었다 (Ding et al., J. Biol. Chem., 275:32475-32481 (2000)). 반대로, 지속적이거나 구성적인 (constitutive) Wnt 자극은 Akt를 활성화시켜 Wnt 신호전달에 관여하게 한다 (Fukumoto et al., 상기 문헌). HepG2 세포에서, 인슐린 신호전달은 GSK3β의 억제를 초래하는, PI3-키나아제 및 Akt의 활성화라는 2가지 신호전달 경로 및 Ras 활성화를 통해 Wnt 신호전달의 중간체인 β-카테닌을 자극시킨다 (Desbois-Mouthon et al., Oncogene, 20:252-259 (2001)). 그러나, 293, C57 및 CHOIR 세포에서, 인슐린은 β-카테닌의 세포질 수준에 영향을 미치지 않았으며, 더욱 중요하게는 GSK3β Ser9의 인산화 상태 및 단백질 키나아제 B의 활성 어느 것도 Wnt에 의해 조절되지 않았다 (Ding et al., 상기 문헌).

인슐린-내성은 인슐린의 존재가 정상에 미치지 못하는 생물학적 반응을 초래하는 상태이다. 임상적 측면에서, 인슐린-내성은 인슐린 수준이 정상이거나 상승되어도 혈중 글루코스가 정상이거나 상승된 수준으로 지속되는 경우에 일어난다. 본질적으로, 이는 기본적인 글리코겐 합성이나 인슐린-자극된 글리코겐 합성 또는 둘 다에 의한 글리코겐 합성 억제가 정상 수준 미만으로 저하된다는 것을 의미한다. 제2형 당뇨병에 존재하는 고혈당증이 때때로 식이요법이나 충분한 체중 감량에 의해 역전되어, 인슐린에 대한 말초 조직의 민감성을 뚜렷하게 회복시킬 수 있다는 사실로 입증되는 바와 같이, 인슐린-내성은 제2형 당뇨병에서 중요한 역할을 한다.

최근, 인슐린-내성은 통상적으로 인슐린이 수용체에 결합된 후에 그 부위에서의 인슐린 수용체 신호전달 시스템이 결핍되어 발생한다는 것이 밝혀졌다. 인슐린에 반응하는 주요 조직 (근육, 간, 지방조직)에서의 인슐린-내성을 입증하는 과학적 증거들이 축적되어, 인슐린 신호 전달의 결핍이 상기 캐스케이드의 초기 단계에서 발생하며, 구체적으로는 인슐린 수용체 키나아제 활성이 감쇠된 것으로 나타남을 강하게 시사한다 (Haring, Diabetalogia, 34:848 (1991)).

이러한 후-수용체 (post-receptor)의 결핍에 관한 잠재적인 부위로서의 글루코스 수송 시스템에 관한 여러 연구를 통해, 설치류 및 인간의 인슐린-내성 상태에서는 인슐린-민감성 글루코스 트랜스포터 (GLUT4)의 양과 기능 모두가 결핍되어 있음이 입증되었다 (Garvey et al., Science, 245:60 (1989); Sivitz et al., Nature, 340:72 (1989); Berger et al., Nature, 340:70 (1989); Kahn et al., J. Clin. Invest., 84:404 (1989); Charron et al., J. Biol. Chem., 265:7994 (1990); Dohm et al., Am. J. Physiol., 260:E459 (1991); Sinha et al., Diabetes, 40:472 (1991); Friedman et al., J. Clin. Invest., 89:701 (1992)). 이론적으로, 정상적인 인슐린-민감성 글루코스 트랜스포터 풀의 결여는 개체에서 인슐린-내성을 부여할 수 있다 (Olefsky et al., in Diabetes Mellitus, Rifkin and Porte, Jr., Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 121-153). 그러나, 몇몇 연구들은 인간 NIDDM에서, 특히, 주요한 글루코스 활용 부위인 근육에서 GLUT4가 하향조절됨을 밝혀내지 못했다 (Bell, Diabetes, 40:413 (1990); Pederson et al., Diabetes, 39:865 (1990); Handberg et al., Diabetologia, 33:625 (1990); Garvey et al., Diabetes, 41:465 (1992)).

동물 모델에서의 생체내 연구 및 임상적 연구로부터 얻은 증거는 제2형 당뇨병에서의 인슐린-내성이 인슐린 신호 전달 경로에서 중간체의 발현 및 활성 변화, 인슐린-자극된 글루코스 수송 속도의 변화, 또는 원형질막으로의 GLUT4의 전위 변화에 의한 것일 수 있음을 시사한다 (Zierath et al., Diabetologia, 43:821-835 (2000)). 동물 연구로부터의 증거는 근육에서 인슐린-신호전달이 결핍되면 전신의글루코스 항상성이 변화됨을 시사하였고 (Saad et al., J. Clin. Invest., 90:1839-1849 (1992); Folli et al., J. Clin. Invest., 92:1787-1794 (1993); Heydrick et al., J. Clin. Invest., 91:1358-1366 (1993); Saad et al., J. Clin. Invest., 92:2065-2072 (1993); Heydrick et al., Am. J. Physiol., 268:E604-612 (1995)), IR, IRS-1 및 PI3-키나아제 등을 비롯한 인슐린 신호전달 캐스케이드에서의 중간체 결핍이 인슐린-내성 및 제2형 당뇨병 대상체의 골격근에서 글루코스 수송을 저하시키고 인슐린-자극된 GLUT4 전위를 감소시킬 수 있음을 시사한다.

몇몇 예에서, IRS-1의 발현 변화 (Saad et al., 1992, 상기 문헌; Saad et al., 1993, 상기 문헌; Goodyear et al., J. Clin. Invest., 95:2195-2204 (1995)), PI3-키나아제 (Anai et al., Diabetes, 47:13-23 (1998)) 및 GSK-3의 발현 변화 (Nikoulina et al., Diabetes, 49:263-271 (2000)) 및 PKCθ의 수준 감소 (Chalfant et al., Endocrinology, 141:2773-2778 (2000)) 및 PTP1B의 수준 감소 (Dadke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 274:583-589 (2000))가 관찰되었다. 몇몇 제2형 당뇨병 대상체의 골격근에서는 IR의 인산화 감소 (Arner et al., Diabetologia, 30:437-440 (1987); Maegawa et al., Diabetes, 44:815-819 (1991); Saad et al., 1992, 상기 문헌; Saad et al., 1993, 상기 문헌; Goodyear et al., 상기 문헌), IRS-1 (Saad et al., 1992, 상기 문헌; Saad et al., 1993, 상기 문헌; Goodyear et al., 상기 문헌) 및 Akt의 인산화 감소 (Krook et al., Diabetes, 47:1281-1286 (1998))도 관찰되었다.

또한, PI3-키나아제의 활성 감소 (Saad et al., 1992, 상기 문헌; Heydricket al., 1995, 상기 문헌; Saad et al., 1993, 상기 문헌; Goodyear et al., 상기 문헌; Heydrick et al., 1993, 상기 문헌; Folli et al., Acta Diabetol., 33:185-192 (1996); Bjornholm et al., Diabetes, 46:524-527 (1997); Andreelli et al., Diabetologia, 42:358-364 (1999); Kim et al., J. Clin. Invest., 104:733-741 (1999); Andreelli F, et al., Diabetologia, 43:356-363 (2000); Krook et al., Diabetes, 49:284-292 (2000)) 및 GSK-3의 활성 증가 (Eldar-Finkelman et al., Diabetes, 48:1662-1666 (1999)), PKC의 활성 증가 (Avignon et al., Diabetes, 45:1396-1404 (1996)) 및 PTP1B의 활성 증가 (Dadke et al., 상기 문헌)도 제2형 당뇨병과 관련이 있는 것으로 나타난 바 있다. 마우스에서 PI3-키나아제의 p85 서브유닛이 파괴되면 인슐린 민감성이 증가한다 (Terauchi et al., Nature Genetics, 21:230-235 (1999)).

또한, 당뇨병 동물의 골격근에서는 PKC 이소형 분포가 변화되고 (Schmitz-Peiffer et al., Diabetes, 46:169-178 (1997)), 비만이 아닌 고또-가끼자끼 (Goto-Kakizaki) (GK) 당뇨병 래트에서는 PKCα, PKCβ, PKCε 및 PKCδ의 함량이 가자미근의 막 분획물에서는 증가하며, 세포질 분획물에서는 감소한다 (Avignon et al., 상기 문헌).

제2형 당뇨병에 걸려 있거나 걸려 있지 않은 인슐린-내성 대상체의 골격근에서는 GLUT4의 세포내 위치가 비정상적인 것으로 관찰되어 (Vogt et al., Diabetologia, 35:456-463 (1992); Garvey et al., J. Clin. Invest., 101:2377-2386 (1998)), GLUT4 교통 (trafficking) 및 전위의 결핍이 골격근에서의 인슐린-내성을 초래할 수 있음을 시사한다. 생체내 및 시험관내 연구를 통해, 몇몇 제2형 당뇨병 대상체의 골격근에서 인슐린-자극된 글루코스 수송 속도가 저하됨이 입증된 바 있다 (Andreasson et al., Acta Physiol. Scand., 142:255-260 (1991); Zierath et al., Diabetologia, 37:270-277 (1994); Bonadonna et al., Diabetes, 45:915-925 (1996)).

다른 치료법이 있음에도 불구하고, 인슐린 요법이 제2형 당뇨병에 걸린 많은 환자들, 특히, 1차 식이요법에 실패하였고 비만이 아닌 환자 또는 1차 식이요법에도 실패하고 2차 경구 혈당저하에도 실패한 환자의 치료를 위해 여전히 선택되고 있다는 것은 주목할 만하다. 그러나, 인슐린 요법과 병행하여 식사 조절 및 생활양식을 바꾸기 위해 꾸준히 노력해야 하며, 이를 대신할 수 있는 방법은 없다는 것도 역시 분명하다. 최적의 결과를 얻기 위해서는 인슐린 요법 후에 혈중 글루코스를 스스로 모니터링하고 글리코실화된 혈액 단백질을 적절하게 추정해야 한다. 인슐린은 다양한 투여 방법으로 단독으로 투여되거나, 단기간, 적당한 기간 또는 장기간 작용하는 인슐린 또는 그 중 1종 초과 유형들의 혼합물을 2회 이상 주사하여 투여될 수 있다. 임의의 환자에 있어서, 개별 환자에서 모니터링된 반응에 인슐린 요법을 맞추는 방법을 통해 가장 좋은 투여 방법이 결정되어야 한다.

제2형 당뇨병 요법에 관한 지식과 실행의 현상태는 만족스러운 수단이 없다는 것이다. 대다수의 환자가 시간이 지남에 따라 1차 식이요법에 실패한다. 1차 식이요법의 실패 사건에 있어서 경구 혈당저하제는 혈당증의 정도 저하에 종종 성공적이긴 하지만, 많은 전문가들은 달성된 혈당 제어 정도가 아테롬성 질환, 신경병증, 신병증, 망막증의 장기간 합병증 및 장기간 지속된 제2형 당뇨병과 관련이 있는 말초 혈관 질환의 발병을 피하는데 충분한 지 여부에 의구심을 갖고 있다. 이러한 이유는, 5.5 내지 6.0 mmol/L의 공복시 혈장 글루코스에 대략적으로 상응하는 최소의 글루코스 불내성일지라도 심혈관계 사망률의 위험 증가와 관련이 있다는 사실에 비추어 설명될 수 있다 (Fuller et al., Lancet, 1:1373-1378 (1980)). 또한, 인슐린 요법이 장기간의 치료 결과 (outcome)에 있어서 경구 혈당저하제를 사용한 치료법에 비해 어떠한 개선이 있는지도 명백하지 않다.

고인슐린혈증은 체내에서 정상 초과 수준의 인슐린이 순환하는 상태인 반면, 저인슐린혈증은 반대로 체내에서 정상 미만 수준의 인슐린이 순환하는 상태이다. 고인슐린혈증은 관상 기구 혈관성형술 (coronary balloon angioplasty) 후의 재발협착증에 대한 위험 인자이다 (Imazu et al., Jpn Circ J., 65:947-952 (2001)). 추가로, 고인슐린혈증은 고혈압과도 연관이 있다 (Imazu et al., Hypertens Res., 24:531-536 (2001)). 예를 들어, 고인슐린혈증 및 지혈 이상은 성인 고혈압 대상체에서의 침묵 소와(小窩) (silent lacunar) 뇌경색과 관련이 있고, 고인슐린혈증은 본태성 고혈압에서 적혈구의 막 유동성에 대한 결정자이다 (Kario et al., J. Am. Coll. Cardiol., 37:871-877 (2001); Tsuda et al., Am. J. Hypertens., 14:419-423 (2001)).

비만은 현대 사회에 고도로 만연되어 있는 만성 질환으로서, 사회적 징후 뿐 아니라 수명 감소 및 유해한 정서 발달, 생식 장애, 예를 들어 다낭 난소 질환, 피부학적 장애, 예를 들어 감염, 정맥류성 정맥, 흑색 가시세포증 및 습진, 운동 불내성, 인슐린-내성, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 담석증, 골관절염, 정형외과학적 상해, 혈전색전성 질환, 암 및 관상 심장 질환 등을 비롯한 수많은 의학적 문제와도 관련이 있다 (Rissanen et al., British Medical Journal, 301:835-837 (1990)). 비만의 치료는 식욕 억제제 및 기타의 체중 감량 유도제, 식사 제한 등을 포함하지만, 인슐린-내성 환자와 유사하게 대다수의 비만 환자가 시간이 지남에 따라 1차 식이요법에 실패하기 때문에 이상적인 체중 달성에 실패한다.

따라서, 인슐린-내성 및 비만 둘 다를 치료하기 위한 우수한 방법은 매우 유용할 것임을 알 수 있다. 구체적으로, NIDDM 등을 비롯한 인슐린-내성 개체의 진단 및 요법에 사용할 수 있는 효과적인 작용제가 요구된다. 또한, 현대 사회에 비만이 널리 만연되어 있다는 사실과, 상기에서 논의한 바와 같이 이와 관련된 심각한 결과를 고려할 때, 비만인 사람의 체중을 저하시키는데 잠재적으로 유용한 임의의 치료 약물은 비만인 사람의 건강에 매우 유익할 수 있다. 마지막으로, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 및 근육 복구 및 재생을 치료하기 위한 약물도 요구된다.

<발명의 개요>

따라서, 본원에서는 Dkk-1에 대한 항체 등을 비롯한 Dkk-1에 대한 길항제를 글루코스 불내성, 진성 당뇨병, 고혈압, 및 대혈관 및 소혈관의 허혈성 질환 등과 관련이 있는 인슐린-내성의 치료 및 저인슐린혈증의 치료에 유용한 것으로 개시한다. 추가로, 본원에서는 Dkk-1 자체도 지방 수준 저하 및 고인슐린혈증의 치료에 유용한 것으로 개시한다.

구체적으로, 청구의 범위를 구성하는 것이 본원 발명이다. 본원 발명은 인슐린-내성 또는 저인슐린혈증의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 Dkk-1에 대한 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 인슐린-내성 또는 저인슐린혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간이고, Dkk-1은 인간 Dkk-1이고(이거나) 상기 인간은 NIDDM에 걸린 것이 바람직하다. 또한, 전신 투여가 바람직하다. 길항제는 바람직하게는 Dkk-1에 결합하는 항체이고, 더욱 바람직하게는 Dkk-1에 결합하는 모노클로날 항체이며, 더욱 더 바람직하게는 Dkk-1의 인슐린-내성 또는 인슐린저하 (hypoinsulinemic) 활성을 중화시키는 모노클로날 항체이다. 가장 바람직한 것은, ATCC 기탁번호 PTA-3086의 하이브리도마로부터 생산된 모노클로날 항체로서, 이는 중화 항체이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 길항제와 다른 인슐린-내성 치료제를 함께 투여하여 인슐린-내성 장애를 치료하거나, 상기 길항제와 인슐린을 함께 투여하여 저인슐린혈증을 치료한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

(a) 포유동물로부터의 샘플 중에서 Dkk-1의 양을 측정하는 단계, 및

(b) 단계 (a)에서 측정된 양을 표준 샘플에 존재하는 Dkk-1의 양과 비교하여, 단계 (a)에서 측정된 Dkk-1의 양 증가 수준이 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증의 지표가 되는 단계

를 포함하는, 포유동물에서 인슐린-내성 또는 저인슐린혈증의 존재 또는 징후를 검출하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 측정 단계는 항-Dkk-1 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 면역분석법으로 수행한다. 또한, 상기 항-Dkk-1 항체는 바람직하게는표지 (label), 더욱 바람직하게는 형광 표지, 방사성 표지 또는 효소 표지, 예를 들어 생물발광 표지 또는 화학발광 표지를 포함한다. 또한, 상기 면역분석법은 바람직하게는 방사성면역분석법, 효소 면역분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법, 샌드위치 면역분석법, 침전 분석법, 면역방사성 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 또는 면역전기영동 분석법이다. 또한, 포유동물이 인간이고, 인간 Dkk-1을 측정하는 것인 방법이 바람직하다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 인슐린-내성은 NIDDM이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은

(a) Dkk-1에 대한 길항제, 바람직하게는 Dkk-1에 결합하는 항체를 포함하는 용기, 및

(b) 길항제를 사용하여 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증을 치료하기 위한 지침

을 포함하는, 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증 치료용 킷트를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이고, 더욱 바람직하게는 Dkk-1의 인슐린-내성 또는 인슐린저하 활성을 중화시키는 항체이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 킷트는 증세에 따라 인슐린-내성 치료제 또는 인슐린을 포함하는 용기를 추가로 포함한다.

또한, 면역보강제 중에 희석된 태그 부착 (tagged) Dkk-1 (바람직하게는, 정제된 재조합 폴리히스티딘-태그가 부착된 인간 Dkk-1)로 마우스를 과면역화시키고; 항-Dkk-1 항체 역가 (바람직하게는, 고역가)를 갖는 상기 마우스로부터의 B-세포를마우스 골수종 세포와 융합시켜 얻은 상층액을 수거하고; 수거된 상층액을 항체 생산에 대해 (바람직하게는, 직접적인 효소-결합 면역흡착 분석법을 통해) 스크리닝하고; 제2회 서브클로닝 후에 가장 높은 면역결합을 나타내는 양성 클론을, 생체내 모노클로날 항체 생산을 위해 프라이밍된 (primed) 마우스에 (바람직하게는, 제한 희석을 통해) 주사하고; 상기 마우스로부터 복수액을 수집하고; 복수액 수집물을 (바람직하게는, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통해) 정제하여 제조한 모노클로날 항체 제제를 제공한다.

본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-3084, PTA-3085, PTA-3086, PTA-3087, PTA-3088, PTA-3089 및 PTA-3097로 이루어진 군으로부터 선택된 하이브리도마를 추가로 제공한다. 바람직한 하이브리도마는 ATCC 기탁 번호 PTA-3086이다. 또한, 상기 하이브리도마 중 하나, 바람직하게는 PTA-3086로부터 생산된 항체도 제공한다.

본 발명은 인슐린-내성, 저인슐린혈증 또는 근육 복구에 대한 후보 약물을dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물 (transgenic animal)에게 투여하는 단계; 및 상기 동물의 혈액으로부터의 글루코스 제거율 (clearance), 상기 동물에서 순환중인 인슐린의 양, 또는 근육 분화 각각에 대한 상기 약물의 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 인슐린-내성, 저인슐린혈증 또는 근육 복구에 대한 후보 약물의 효과를 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 동물은 바람직하게는 설치류이고, 더욱 바람직하게는 마우스 또는 래트이며, 가장 바람직하게는 마우스이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 동물에 의해 과다발현된dkk-1핵산은 근육-특이적 프로모터의 제어하에 있으며, 상기 cDNA는 근육 조직에서 과다발현된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

(a) Dkk-1에 결합하는 항체를 포함하는 용기,

(b) Dkk-1을 함유하는 표준 샘플을 포함하는 용기, 및

(c) 상기 항체 및 표준 샘플을 사용하여 인슐린-내성, 저인슐린혈증, 고인슐린혈증 또는 비만을 검출하기 위한 지침

을 포함하는 킷트이며, 여기서 Dkk-1에 결합하는 항체가 검출가능하게 표지된 것이거나, 또는 이 킷트가 검출가능하게 표지되어 Dkk-1에 결합하거나 Dkk-1에 결합하는 항체에 결합하는 제2 항체를 포함하는 다른 용기를 추가로 포함하는, 인슐린-내성, 저인슐린혈증, 고인슐린혈증 또는 비만의 존재 또는 징후 검출용 진단 킷트를 제공한다. 상기 킷트의 항-Dkk-1 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이고, 더욱 바람직하게는 Dkk-1의 인슐린-내성, 인슐린상승 (hyperinsulinemic), 인슐린저하 또는 비만 활성을 중화시키는 항체이다

다른 실시양태에서, 본 발명은 비만 또는 고인슐린혈증의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 Dkk-1을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 비만 또는 고인슐린혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간이고, Dkk-1은 인간 Dkk-1인 것이 바람직하다. 또한, 상기 투여는 전신 투여인 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 체중 감량제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은

(b) 단계 (a)에서 측정된 양을 표준 샘플에 존재하는 Dkk-1의 양과 비교하여, 단계 (a)에서 측정된 Dkk-1의 양 감소 수준이 비만 또는 고인슐린혈증의 지표가 되는 단계

를 포함하는, 상기 포유동물에서 비만 또는 고인슐린혈증의 존재 또는 징후를 검출하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 측정 단계는 항-Dkk-1 항체를 사용하여 면역분석법으로 수행한다. 또한, 상기 항-Dkk-1 항체는 표지를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 표지 및 바람직한 면역분석법은 상기에서 인슐린-내성 또는 저인슐린혈증의 존재 또는 징후에 관해 기재한 바와 같다. 또한, 상기한 비만 또는 고인슐린혈증의 검출 방법에서 포유동물은 인간이고, 인간 Dkk-1을 측정하는 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

(a) Dkk-1을 포함하는 용기, 및

(b) Dkk-1을 사용하여 비만 또는 고인슐린혈증을 치료하기 위한 지침

을 포함하는, 비만 또는 고인슐린혈증 치료용 킷트를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 킷트의 Dkk-1는 인간 Dkk-1이고, 상기 킷트는 체중 감량제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다

본 발명은 비만 또는 고인슐린혈증에 대한 후보 약물을dkk-1핵산을 발현하는 인간 이외의 2원 형질전환 동물에게 투여하는 단계; 및 상기 동물에서 비만의 주요 특성 (obesity-determining property) 또는 인슐린의 양에 대한 상기 약물의효과를 측정하는 단계를 포함하는, 비만 또는 고인슐린혈증에 대한 후보 약물의 효과를 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 동물은 바람직하게는 설치류이고, 더욱 바람직하게는 마우스 또는 래트이며, 가장 바람직하게는 마우스이다.

또한, 본 발명은dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물을 제공한다. 상기 동물은 바람직하게는 설치류이고, 가장 바람직하게는 마우스이다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 Dkk-1에 대한 유효량의 길항제, 바람직하게는 Dkk-1에 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 근육을 복구하거나 재생시키는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간이고(이거나) 상기 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명은

(b) 길항제를 사용하여 포유동물에서의 근육을 복구 또는 재생시키기 위한 지침

을 포함하는, 근육의 복구 또는 재생용 킷트를 제공한다.

따라서, 본 발명은 인슐린-내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 및 비만 및 근육 복구 또는 근육 재생의 치료 및 진단을 위한 것이다. Dkk-1을 사용한 비만의 치료 방법은 감량된 체중을 오랜 기간 동안 유지할 것이라 기대되는 비만 요법 및(또는) 비만의 예방책으로서, 비만인 대상체의 체중을 정상적이고 이상적인 체중으로 복귀시키는데 유용할 것이라 기대된다.

본 발명은 포유동물에서 비만, 인슐린-내성, 저인슐린혈증 및 고인슐린혈증을 포함하는 장애의 진단 및 치료, 및 근육의 복구 및 재생에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 비만 및 고인슐린혈증의 치료에 있어서 Dickkopf-1 (Dkk-1) 단백질의 용도, 및 인슐린-내성 및 저인슐린혈증의 치료 및 근육 복구에 있어서 Dkk-1에 결합하고(하거나) 그의 활성을 중화시키는 길항제의 용도에 관한 것이다.

도 1은 다양한 성인 조직에서 Dkk-1의 상대적 발현 수준을 나타낸다.

도 2는 배큘로바이러스에서 발현된 인간 Dkk-1 및 그의 절단물의 겔을 나타낸다.

도 3A는 L6 근육 세포에서 2시간, 6시간 및 26시간 동안 기본적인 글루코스 흡수에 대한 인간 Dkk-1의 효과 (흑색 막대)를 나타낸다. 도 3B 및 도 3C는 L6 근육 세포에서 각각 기본적인 글루코스 흡수 (백색 막대) 및 30 nM의 인슐린으로 자극된 글루코스 흡수 (흑색 막대)에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다.

도 4A는 여러 분화 단계에서 기본적인 글루코스 흡수 및 인슐린-의존성 글루코스 흡수에 대한 인간 Dkk-1의 효과 (흑색 막대)를 나타낸다. 도 4B는 인간 Dkk-1을 48시간 동안 처리한 후에 기본적인 글루코스 흡수 및 인슐린-의존성 글루코스 흡수에 대한 인간 Dkk-1의 효과 (대조군에 대한 비율(％)로서 표현함)를 인간 Dkk-1의 농도 (nM)에 대한 함수로서 나타낸 것이다.

도 5A 및 5B는 L6 근육 세포에서 인슐린을 각각 48시간 (도 5A) 및 96시간 (도 5B) 동안 처리 (흑색 막대)하거나 처리하지 않은 (백색 막대) 경우에, 글리코겐으로의 글루코스 혼입에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다.

도 6A 내지 도 6E는 L6 근육 세포에서 MyoD (도 6A), MLC2 (도 6B), 미오신 중쇄 (도 6C), 미오제닌 (도 6D) 및 Pax3 (도 6E)의 발현 수준에 대한 40 nM 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다. 마름모는 대조군이고, 정사각형은 Dkk-1이다. 별표 1개 (*)는 p < 0.01이고, 별표 2개 (**)는 p < 0.005, n=3이다.

도 7은 L6 근육 세포에서 인간 Dkk-1을 처리한 후 제5일 (백색 막대) 및 제7일 (흑색 막대)에 인슐린-신호전달 경로에 관여하는 다양한 유전자의 발현에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다.

도 8A 내지 도 8D는 L6 근육 세포에서 인슐린으로 자극하거나 1 nM 인슐린으로 자극하여 처리하고 48시간 후에 PDK-1 (도 8A), GSK3β (도 8B), S6 키나아제 (도 8C) 및 Akt (도 8D)의 키나아제 활성에 대한 40 nM 인간 Dkk-1의 효과 (흑색 막대)를 나타낸다.

도 9A 및 도 9B는 3T3 L1 세포 (지방세포)에서 인간 Dkk-1을 각각 48시간 및 96시간 처리한 후에 기본적인 글루코스 흡수 수준 (백색 막대) 및 30 nM의 인슐린으로 자극된 글루코스 흡수 수준 (흑색 막대)에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타내고, 도 9C 및 도 9D는 각각 48시간 및 96시간 동안 인슐린으로 자극하여 처리한 후에 지질로의 글루코스 혼입에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다.

도 10A 내지 10D는 지방세포 분화 동안 인간 Dkk-1을 처리한 3T3 L1 세포에서 PPARγ, C/EBPα, AP2 및 지방산 신타아제 (FAS) 전사체 각각의 상대적 수준을 나타내며, 흑색 마름모는 대조군이고, 백색 정사각형은 Dkk-1이다.

도 11A는 암컷 FVB 마우스에 글루코스 볼루스 (blous)를 염수 (마름모) 및 0.2 mg/kg 인간 Dkk-1 (삼각형)과 함께 정맥내 주사한 후에 혈중 글루코스 수준을 시간에 대한 함수로서 나타낸 것이다. 도 11B는 염수 (대조군), 0.05 mg/kg/일의 인간 Dkk-1 및 0.2 mg/kg/일의 인간 Dkk-1을 정맥내 주사한 암컷 FVB 마우스에서의 인슐린 수준을 나타낸다.

도 12A는 다양한 근육 분화 마커를 대조군 (백색 막대) 및 0.2 mg/kg/일의 인간 Dkk-1 (흑색 막대)과 함께 주사한 마우스에서 상기 마커들의 발현에 대한 인간 Dkk-1의 효과를 나타낸다. 도 12B는 인슐린을 주사하지 않은 마우스, 33 nM 인슐린 및 100 nM 인슐린을 정맥내 주사한 마우스에서 인산화된 펩티드의 양을 나타낸 것이며, 대조군은 백색 막대 (n=4)이고, 인간 Dkk-1는 흑색 막대 (n=5)이다.

도 13A는 신생/어린 수컷 및 암컷 대조군 마우스 (백색 막대) 및 Dkk-1 형질전환 마우스 (흑색 막대)의 체중을 나타낸다. 도 13B는 규정식을 섭취한 대조군 (C) 및 형질전환 (TG) 마우스의 암컷 및 수컷의 성장 곡선을 나타내며, 암컷 (C)는 마름모이고, 암컷 (TG)는 정사각형이고, 수컷 (C)는 삼각형이며, 수컷 (TG)은 원형이다.

도 14A 및 도 14B는 각각 수컷 및 암컷 대조군 (백색 막대) 및 형질전환 (흑색 막대) 마우스의 지방 패드 중량을 나타낸다. 도 14C 및 도 14D는 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 수컷 및 암컷에서 렙틴의 기본적인 혈청 수준 및 공복시의 혈청 수준을 나타낸다.

도 15A는 암컷 대조군 마우스 (마름모), 수컷 대조군 마우스 (삼각형), 암컷 형질전환 마우스 (정사각형) 및 수컷 형질전환 마우스 (원형)의 성장 곡선을 나타낸다. 도 15B 및 도 15C는 각각 수컷 및 암컷 대조군 (백색 막대) 및 형질전환 (흑색 막대) 마우스의 지방 패드 중량을 나타낸다. 도 15D는 대조군 (백색 막대) 마우스 및 Dkk-1을 처리한 (흑색 막대) 마우스의 암컷 및 수컷에서 비-공복시의 렙틴 수준을 나타낸다.

도 16A 및 도 16B는 각각 수컷 및 암컷 마우스에 글루코스 볼루스를 처리한 후에 혈중 글루코스 수준을 시간에 대한 함수로서 나타낸 것이며, 도 16A에서 마름모는 MDKK-1 마우스이고 삼각형은 대조군 마우스이며, 도 16B에서는 정사각형이 대조군 마우스이다. 도 16C 및 도 16D는 대조군 및 Dkk-1 형질전환 마우스의 암컷 및 수컷 각각에서 인슐린 허용성을 나타낸 것이며, 마름모는 암컷 대조군 마우스이고, 정사각형은 암컷 형질전환 마우스이고, 삼각형은 수컷 대조군 마우스이며, 원형은 수컷 형질전환 마우스이다. 도 16E는 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에서 글루코스로 유도된 혈청 인슐린 수준을 나타낸 것이며, 백색 막대는 암컷 마우스이고, 흑색 막대는 수컷 마우스이다.

도 17은 L6 세포에서 인슐린의 부재 및 존재하에 Dkk-1-매개된 글루코스 흡수 감소에 대한 항-인간 Dkk-1 모노클로날 항체의 효과를 나타내며, 좌측부터 대조군 L6 세포는 백색 막대이고, 40 nM Dkk-1을 처리한 L6 세포는 흑색 막대이고, 40 nM Dkk-1 및 0.5 ㎍/mL 항-Dkk-1 항체를 처리한 L6 세포는 어두운 회색 막대이다.

정의

"인슐린-내성" 또는 "인슐린-내성 장애" 또는 "인슐린-내성 활성"은 외생성 인슐린의 작용에 대한 말초 조직의 정상적인 대사 반응 실패 (불감성)로 인한 질환, 상태 또는 장애로서, 즉, 인슐린의 존재가 정상에 미치지 못하는 생물학적 반응을 유발하는 상태이다. 임상적 측면에서, 인슐린-내성은 인슐린 수준이 정상이거나 상승되어도 혈중 글루코스가 정상이거나 상승된 수준으로 지속되는 경우에 일어난다. 이는 본질적으로 글리코겐 합성 억제를 의미하며, 이로 인해 기본적인 글리코겐 합성 또는 인슐린-자극된 글리코겐 합성 또는 이들 모두가 정상적인 수준 미만으로 저하된다. 인슐린-내성은 본원에서 사용된 바와 같이 비정상적인 글루코스 허용성, A형 당뇨병 및 제2형 당뇨병 등을 포함하나, 인슐린-내성과 무관한 비만은 포함하지 않는다.

"저인슐린혈증"은 정상량 미만의 인슐린이 체내에 순환되는 상태로서, 통상적으로 비만은 포함되지 않는다. 이러한 상태는 제1형 당뇨병을 포함한다.

"진성 당뇨병"은 인슐린-내성 및 저인슐린혈증에 포함되고, 만성 고혈당증 상태를 지칭하며, 즉, 인슐린 작용의 상대적이거나 절대적인 결여에 의해 혈액 중에 과잉의 당이 존재하는 상태이다. 진성 당뇨병에는 제1형 또는 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM), 제2형 또는 인슐린-비의존성 진성 당뇨병 (NIDDM) 및 A형 인슐린-내성의 3가지 기본 유형이 있으나, A형은 상대적으로 드물다. 제1형 또는 제2형 당뇨병 환자는 다양한 메카니즘을 통해 외생성 인슐린의 효과에 대해 불감성화될 수 있다. A형 인슐린-내성은 인슐린 수용체 유전자의 돌연변이 또는 글루코스 대사에 중대한 작용을 하는 후-수용체 부위의 결핍에 의한 것이다. 당뇨병 대상체는 의사가 쉽게 인식할 수 있으며, 공복시의 고혈당증, 글루코스 허용성 손상, 글리코실화된 헤모글로빈 및 몇몇 예에서는 외상(外傷) 또는 질병과 관련이 있는 케토산혈증을 특징으로 한다.

"인슐린-비의존성 진성 당뇨병" 또는 "NIDDM"은 제2형 당뇨병을 지칭한다. NIDDM 환자는 공복시의 혈중 글루코스 농도가 비정상적으로 높고, 식사 후 또는 글루코스 허용성 시험으로 공지된 진단 시험 후에 글루코스의 세포내 흡수가 지연된다. NIDDM은 승인된 기준을 바탕으로 진단된다 (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).

본원에서 사용된 바와 같이, "고인슐린혈증"은 정상량 초과의 인슐린이 체내에 순환되는 상태를 지칭하고, 인슐린-내성을 포함하지도 않으며 인슐린-내성에 의해 유발되지도 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비만"은 키 (미터)²당 체중 (kg)으로 계산되는 신체 질량 지수 (Body Mass Index, BMI)가 25.9 이상인 포유동물의 상태를 지칭한다. 통상적으로, 정상 체중의 사람은 BMI가 19.9 내지 25.9 미만이다. 본원에서, 비만은 유전적 또는 환경적인 임의의 원인에 의한 것일 수 있다. 비만을 초래하거나 비만의 원인일 수 있는 장애의 예로는 과식 및 대식(大食), 다낭 난소 질환, 두개인두종, 프라더-윌리 증후군, 프뢸리히 증후군, GH-결핍 대상체, 통상적으로 변형된 저신장증, 터너 증후군 및 대사 활성 저하 또는 총 무지방 질량의 비율(％)로서 휴식 동안의 에너지 소모량 감소를 나타내는 기타의 병리적 상태 (예를 들어, 급성 림프모세포성 백혈병을 앓는 어린이) 등이 있다. "비만의 주요 특성"은 지방 세포 및 조직, 예를 들어 지방 패드, 총 체중, 근육, 간 및 지방에서의 트리글리세리드 수준 및 공복시와 비-공복시의 렙틴, 유리 지방산 및 트리글리세리드의혈중 수준 등을 포함한다.

근육의 "복구" 또는 "재생"은, 근육 조직이 임의의 원인에 의한 임의의 외상, 퇴행 및(또는) 소모 후에 이전의 더욱 건강한 상태 및(또는) 기능으로 적어도 부분적으로 치유되거나 복구됨을 지칭한다.

치료 목적상, "포유동물"이라는 용어는 인간, 스포츠 동물, 동물원의 동물, 애완용 동물 및 가축 또는 축산용 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 양, 돼지, 말 및 인간 이외의 영장류, 예를 들어 원숭이 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이며, 본원에서는 환자라고 부르기도 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 인슐린-내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만에 대항하기 위한 목적으로 포유동물을 관리하고 보살피는 것을 나타내며, 인슐린-내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만의 증상 또는 합병증 발병의 예방을 위한 투여, 인슐린-내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만의 증상 또는 합병증의 경감을 위한 투여 또는 인슐린-내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만의 제거를 위한 투여 또는 근육의 복구 및(또는) 재생을 위한 투여 등을 포함한다.

본 발명의 목적상, 인슐린-내성 저하에 유익하거나 원하는 임상적 "치료" 결과는 인슐린-내성과 관련이 있는 증상의 경감, 인슐린-내성의 증상 정도의 감쇠, 인슐린-내성 증상의 안정화 (즉, 악화시키지 않음) (예를 들어, 인슐린에 대한 요구치 저하), 섬세포 (islet cell) 기능부전의 예방을 위한 인슐린 민감성 및(또는)인슐린 분비 증가 및 인슐린-내성의 진행, 예를 들어 당뇨병 진행의 지연 또는 감속 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

"치료"될 당뇨병의 증상 및 합병증으로는 고혈당증, 불만족스러운 혈당 제어, 케토산혈증, 인슐린-내성, 성장 호르몬의 수준 상승, 글리코실화된 헤모글로빈의 수준 상승 및 글리코실화 최종 생성물 (AGE)의 증가, 새벽 현상 (dawn phenomenon), 불만족스러운 지질 프로필, 혈관 질환 (예를 들어, 아테롬성경화증), 미세혈관 질환, 망막 장애 (예를 들어 증식성 당뇨병 망막증), 신장애, 신경병증, 임신의 합병증 (예를 들어, 조산 (premature termination) 및 선천성 결손) 등이 있다. 치료의 정의에는 예를 들어 인슐린 민감성 증가, 혈당 제어를 유지하는 동시에 인슐린의 투여량 저하, HbA1c 감소, 혈당 제어 개선, 혈관, 신장, 신경, 망막 및 기타 당뇨병 합병증의 저하, "새벽 현상"의 예방 또는 저하, 지질 프로필 개선, 임신의 합병증 저하 및 케토산혈증 저하 등과 같은 최종 목적이 포함된다. 당업자라면 이해하는 바와 같이, 본 발명에 따라 치료될 특정 증상은 치료될 인슐린-내성의 유형에 따라 달라질 것이다.

근육 복구 및 재생과 관련하여, "치료"는 근위축증 또는 외상 또는 퇴행의 경감 및 근육 조직의 복구 및(또는) 기능 개선을 지칭한다.

고인슐린혈증 또는 저인슐린혈증과 관련하여, "치료"는 체내에서 순환하고 있는 인슐린의 수준을 허용가능하거나 정상적인 수준 (포유동물이 고인슐린혈증 또는 저인슐린혈증 상태가 되기 이전에, 그의 체내에서의 일반적인 인슐린 수준으로서 정의됨)으로 저하시키거나 상승시킴을 지칭한다.

비만과 관련하여, "치료"는 통상적으로 포유동물의 BMI가 약 25.9 미만으로 저하되고, 6개월 이상 체중이 유지되는 것을 지칭한다. 적합하게는, 치료함으로써 포유동물에 의한 음식물 또는 열량 섭취량이 저하된다. 또한, 이러한 맥락에서, 비만 상태의 발병 이전에 이루어지는 경우의 치료는 비만 발생의 예방을 지칭한다. 치료는 비만인 포유동물에서 지방생성, 즉, 인간 및 동물 비만의 주요 특징 중 하나인 지방 세포 내 지질의 과잉 축적의 억제 및(또는) 완전한 억제를 포함할 뿐 아니라 총 체중의 감량을 포함한다.

"~의 치료가 필요한" 포유동물은 그러한 장애를 이미 앓고 있는 포유동물 뿐 아니라 그러한 장애를 앓기 쉬운 포유동물도 포함하며, 장애를 예방할 포유동물을 포함한다.

"인슐린-내성 치료제"는 인슐린-내성 치료에 사용되는, Dkk-1에 대한 길항제가 아닌 작용제로서, 예를 들어 혈당저하제이다. 이러한 치료제의 예로는 인슐린 (1종 이상의 여러가지 인슐린); 인슐린 모방체, 예를 들어 소분자 인슐린, 예를 들어 L-783,281; 인슐린 유사체 (예를 들어, HUMALOG (등록상표) 인슐린 (일라이 릴리 컴파니 (Eli Lilly Co.) 제품), Lys^B28.인슐린, Pro^B29.인슐린 또는 Asp^B28.인슐린 또는 미국 특허 제5,149,777호 및 제5,514,646호 등에 기재된 인슐린) 또는 그의 생리적 활성 단편; 인슐린-관련 펩티드 (C-펩티드, GLP-1, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-1) 또는 IGF-1/IGFBP-3 복합체) 또는 그의 유사체 또는 단편; 에르고세트; 프람린타이드; 렙틴; BAY-27-9955; T-1095; 인슐린 수용체 티로신 키나아제 억제제에 대한 길항제; TNF-알파 기능에 대한 길항제; 성장 호르몬 방출제; 아밀린 또는 아밀린에 대한 항체; 인슐린 증감제, 예를 들어 미국 특허 제5,753,681호에 기재된 화합물, 예를 들어 트로글리타존, 피오글리타존, 엔글리타존 등을 비롯한 글리타존 족의 화합물 및 관련 화합물; 리날롤 (Linalol) 단독 또는 리날롤과 비타민 E (미국 특허 제6,187,333호); 인슐린-분비 인핸서, 예를 들어 나테글리나이드 (AY-4166), 칼슘 (2S)-2-벤질-3-(시스-헥사히드로-2-이소인돌리닐카르보닐)프로피오네이트 이수화물 (미티글리나이드, KAD-1229) 및 레파글리나이드; 술포닐우레아 약물, 예를 들어 아세토헥사미드, 클로르프로파미드, 톨라자미드, 톨부타미드, 글리클로피라미드 및 그의 암모늄염, 글리벤클라미드, 글리보르누라이드, 글리클라지드, 1-부틸-3-메타닐릴우레아, 카르부타미드, 글리피지드, 글리퀴돈, 글리속세피드, 글리부티아졸, 글리부졸, 글리헥사미드, 글리미딘, 글리피나드, 펜부타미드, 톨사이클라미드, 글리메피리드 등; 비구아니드계 화합물 (예를 들어, 펜포르민, 메트포르민, 부포르민 등); α-글루코시다제 억제제 (예를 들어, 아카르보스, 보글리보스, 미글리톨, 에미글리테이트 등) 및 췌장 이식물 또는 자가면역 시약 등과 같은 비전형적인 치료물질 등이 있다.

"체중 감량제"는 비만의 치료 또는 예방에 유용한 분자를 지칭한다. 이러한 분자의 예로는 호르몬 (카테콜아민, 글루카곤, ACTH 및 성장 호르몬과 IGF-1의 병용); Ob 단백질; 클로피브레이트; 할로겐화물; 신코카인; 클로르프로마진; 노르아드레날린성 신경전달물질에 작용하는 식욕-억제 약물, 예를 들어 마진돌 및 페네틸아민의 유도체, 예를 들어 페닐프로판올아민, 디에틸프로피온, 펜테르민, 펜디메트라진, 벤즈페타민, 암페타민, 메탐페타민 및 펜메트라진; 세로토닌 신경전달물질에 작용하는 약물, 예를 들어 펜플루라민, 트립토판, 5-히드록시트립토판, 플루옥세틴 및 세르트랄린; 중추 활성 약물, 예를 들어 날록손, 신경펩티드-Y, 갈라닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬 및 콜레시스토키닌; 콜린성 효능제, 예를 들어 피리도스티그민; 스핑고리피드, 예를 들어 리소스핑고리피드 또는 그의 유도체; 발열 약물, 예를 들어 갑상선 호르몬; 에페드린; 베타-아드레날린성 효능제; 위장관에 영향을 주는 약물, 예를 들어 효소 억제제, 예를 들어 테트라히드로리포스타틴, 소화되기 어려운 음식물, 예를 들어 수크로스 폴리에스테르 및 위의 공복 억제제, 예를 들어 트레오-클로로시트르산 또는 그의 유도체; β-아드레날린성 효능제, 예를 들어 이소프로테레놀 및 요힘빈; 요힘빈의 β-아드레날린성-유사 효과를 증가시키는 아미노필린, α₂-아드레날린성 차단 약물, 예를 들어 클로니딘 단독 또는 클로니딘과 성장 호르몬 방출 펩티드의 병용; 장 흡수를 방해하는 약물, 예를 들어 비구아니드, 예를 들어 메트포르민 및 펜포르민; 벌크 (bulk) 충전제, 예를 들어 메틸셀룰로스; 대사 차단 약물, 예를 들어 히드록시시트레이트; 프로게스테론; 콜레시스토키닌 효능제; 케토산을 모방하는 소분자; 코르티코트로핀-방출 호르몬에 대한 효능제; 신체 지방 저장물을 저하시키기 위한 맥각-관련 프로락틴-억제 화합물 (1998년 11월 8일자로 허여된 미국 특허 제4,783,469호); 베타-3-효능제; 브로모크립틴; 아편양제제 펩티드에 대한 길항제; 신경펩티드-Y에 대한 길항제; 글루코코르티코이드 수용체 길항제; 성장 호르몬 효능제; 이들의 조합물 등이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인슐린"은 인슐린 작용을 갖는 임의의 모든 물질을 지칭하며, 소 또는 돼지 등의 췌장에서 추출한 동물 인슐린, 돼지 췌장에서 추출한 인슐린으로부터 효소적으로 합성한 반-합성 인간 인슐린 및 전형적으로는 이. 콜라이 (E. coli) 또는 효모를 사용한 유전공학 기술을 통해 합성한 인간 인슐린 등이 있다. 추가로, 인슐린은 약 0.45 내지 0.9％ (w/w)의 아연을 함유하는 인슐린-아연 복합체, 염화아연으로부터 제조한 프로타민-인슐린-아연, 황산프로타민 및 인슐린 등을 포함할 수 있다. 인슐린은 그의 단편 또는 INS-1 등과 같은 그의 유도체 형태일 수 있다. 또한, 인슐린은 인슐린-유사 물질, 예를 들어 L83281 및 인슐린 효능제를 포함할 수도 있다. 인슐린은 매우 급속하게 작용하는 형, 급속하게 작용하는 형, 이양식성 (bimodal)-작용형, 중간-작용형, 장기간-작용형 등의 다양한 유형으로 이용가능하며, 이러한 유형은 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "Dkk-1" 또는 "Dickkopf-1"은 1999년 9월 16일자로 공개된 WO 99/46281 및 문헌 [Glinka et al., Nature, 391:357-62 (1998)]에 기재된 성질과 특징을 보유하는 Wnt 억제제를 지칭한다. WO 99/46281에서, 인간 Dkk-1는 PRO1008로 명명되며, 그를 코딩하는 DNA는 DNA57530으로 명명된다. 본 발명은 설치류, 양, 소, 돼지, 말, 개, 고양이, 인간 이외의 영장류 등을 비롯한 임의의 포유동물 종의 천연 서열 Dkk-1 및 인간 Dkk-1을 고려하며, 특히 인간 Dkk-1을 고려한다. 또한, 임의의 포유동물 종의 천연 서열 Dkk-1에 대한 길항제도 고려하지만, 바람직하게는 설치류, 양, 소, 돼지, 개, 고양이, 말, 인간 이외의 영장류또는 인간의 Dkk-1에 대한 길항제를 고려하며, 가장 바람직하게는 인간 Dkk-1에 대한 길항제를 고려한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료용 조성물"은 Dkk-1 또는 Dkk-1 길항제 및 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 물, 광물, 단백질 및 당업자에게 공지된 기타의 부형제를 포함하는 것으로서 정의된다.

본 발명의 범위에서, "길항제", "Dkk-1에 대한 길항제" 등의 표현은 치료할 증세에 따라 Dkk-1과 상호작용하여 그의 기능을 방해하거나 임의의 수단에 의해 Dkk-1의 관련 활성을 차단 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함하는 의미이다. Dkk-1과 하나 이상의 그의 수용체 사이의 상호작용은 방지할 수 있다. 이러한 작용제는 그의 효과를 다양한 방법으로 달성한다. 예를 들어, Dkk-1 활성을 "중화"시키는 클래스의 길항제는 하기에 정의한 바와 같이 Dkk-1을 방해하기에 충분한 친화도 및 특이성으로 Dkk-1에 결합할 것이다. Dkk-1에 "결합"하는 항체는 충분한 친화도로 항원과 결합할 수 있어서, Dkk-1을 발현하는 세포의 표적화에 있어서의 치료제로서 유용하다.

이러한 군의 길항제에는, 예를 들어 Dkk-1에 대해 지시된 항체 또는 Dkk-1에 반응성인 그의 일부, Dkk-1에 반응성인 Dkk-1 수용체 또는 그의 일부 또는 Dkk-1에 결합하는 임의의 기타 리간드가 포함된다. 또한, 상기 용어는dkk-1mRNA 또는 Dkk-1 단백질의 과생산을 방해하거나 하나 이상의 Dkk-1 수용체에 대해 길항작용을 할 임의의 작용제를 포함한다. 이러한 길항제는 작용제와 수송 단백질의 기능을 조합하여 치료제의 혈청 반감기를 증가시키거나 교차-종의 허용성을 부여하는데 유용한 키메라 하이브리드 형태일 수 있다. 따라서, 이러한 길항제의 예로는 생체유기 분자 (예를 들어, 펩티드모방체), 항체, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 다당류, 올리고당류, 핵산, 약리 작용제 및 그들의 대사물질, 전사 및 번역 제어 서열 등이 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 길항제는 Dkk-1에 결합하여 Dkk-1과 그의 수용체의 상호작용을 방지하는 바람직한 성질을 보유한 항체이다.

본원에서, "중화시키다" 및 "~의 활성을 중화시키다"라는 용어는 Dkk-1의 활성을 차단하거나 방지하거나 저하시키거나 거스르거나, 또는 임의의 메카니즘을 통해 Dkk-1을 비효과적으로 만드는 것을 의미한다. 따라서, 길항제는 Dkk-1의 활성화에 필요한 결합 사건을 방지할 수 있다. 본원에서 정의한 바와 같이, "중화 항체"는 Dkk-1의 이펙터 기능을 차단하거나 유의하게 저하시킬 수 있는 항체 분자를 의미한다. 예를 들어, 중화 항체는 Dkk-1이 Dkk-1 수용체와 상호작용할하는 능력을 억제하거나 저하시킬 수 있다. 별법으로, 중화 항체는 Dkk-1이 Dkk-1 수용체의 신호전달 경로를 차단하는 능력을 억제하거나 저하시킬 수 있다. 또한, 중화 항체는 본원에서 기재한 바와 같은 Dkk-1 활성에 관한 면역분석법에서 Dkk-1에 면역특이적으로 결합할 수도 있다. 본 발명의 "중화 항체"는 시험관내 및 생체내 상황 모두에서 그의 기능적 활성을 보유함을 특징으로 한다.

"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다 (단, 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내야 함).

본원에서 사용된 바와 같이, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉, 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적으로 지시된다. 추가로, 여러 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 여러가지 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다.

이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 상기 항체가 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되었다는 특징을 나타내는데, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 생산하거나 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)으로 생산할 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

구체적으로, 본원의 모노클로날 항체는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐 아니라, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체가 포함된다 (단, 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내야 함) (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 관심을 갖는 키메라 항체로는 인간 이외의 영장류 (예를 들어, 구세계원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체 등이 있다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂및 Fv 단편, 디아바디 (diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다중 특이적 항체 등이 있다.

"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역 뿐 아니라 경쇄 불변 도메인 (C_L) 및 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 항체이다. 이러한 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.

항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열이 변이된 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합, 보체-의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향조절 등이 있다.

무손상 항체는 그의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 여러가지 "클래스"로 분류될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, 이들 중 여러개는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2 등과 같은 "서브클래스" (이소타입 (isotype))으로 더욱 세분화될 수 있다. 항체의 여러가지 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 배열은 공지되어 있다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황 공유결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 이황화 연결기의 수는 여러가지 면역글로불린 이소타입의 중쇄마다 달라질 수 있다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄에는 일정한 간격으로 이격된 쇄내 이황 가교도 존재한다. 각각의 중쇄의 한쪽 말단에는 가변 도메인 (V_H)가 있고, 이 도메인 다음에는 많은 수의 불변 도메인이 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)이 있고, 다른 쪽 말단에는 불변 도메인이 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 경계부를 형성하는 것으로 여겨진다.

"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하며, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다. 그러나, 이러한 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (framework region, FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 주로 β-쉬이트 배열을 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-쉬이트 배열을 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-쉬이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 서로 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

본원에서 사용된 "초가변 영역"이라는 용어는 항원-결합을 담당하는, 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, 이러한 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 가변 도메인의 잔기 중 본원에서 정의한 바와 같은 초가변 영역 잔기가 아닌 잔기이다.

항체를 파파인으로 소화시키면, 각각 단일 항원-결합 부위를 보유하며 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원-결합 부위를 보유하며 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 F(ab')₂단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비-공유결합으로 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이 배열에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역들이 상호작용하여 V_H-V_L이량체의 표면에서 항원-결합 부위를 한정한다. 전체적으로, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는, Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.

또한, Fab 단편은 경쇄 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 수개의 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂항체 단편은 본래, Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인이 있는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편들의 기타 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종의 항체 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 명백히 다른 2가지 유형 중 하나일 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재하는, 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H도메인과 V_L도메인 사이의 폴리펩티드 링커 (linker)를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. sFv의 고찰을 위해서는 문헌 [Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.

"디아바디"라는 용어는 동일 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L)에서 중쇄 가변 도메인 (V_H)이 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된, 2개의 항원-결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄에서 상기 2개의 도메인 사이에 쌍형성 (pairing)을 이루기엔 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들은 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 되어 2개의 항원-결합 부위가 생성된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO 93/11161 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 등에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

인간 이외의 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 인간 면역글로불린이 아닌 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 인간 이외의 영장류 등의 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 인간 잔기가 아닌 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 증진시킨다. 통상적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 인간 면역글로불린이 아닌 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 면역글로불린, 전형적으로는 인간 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "샘플"이라는 용어는 Dkk-1을 함유하거나 Dkk-1을 함유할 것이라고 의심되는 생물학적 샘플을 지칭한다. 샘플은 임의의 공급원, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 얻을 수 있다. 이러한 샘플은 혈청, 혈장, 림프액, 활액, 난포액, 정액, 유(乳), 전혈, 뇨, 뇌척수액, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 조직 배양 배지, 조직 추출물 및 세포 추출물 등과 같은 수성 액체를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "도입유전자 (transgene)"이라는 용어는 그것이 도입된 형질전환 동물에게 있어서 부분적으로 또는 전체적으로 이종인, 즉 외래인 핵산 서열을 지칭하거나, 그것이 도입된 형질전환 동물의 내생성 유전자에 동종인 핵산 서열을 지칭하며, 동물의 게놈으로 삽입되도록 고안되거나 삽입되지만 그것이 삽입된 세포의 게놈이 변화되지 않도록 한다 (예를 들어, 천연 유전자와는 상이한 위치에 삽입됨). 도입유전자는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 선택된 핵산의 최적의 발현에 필요할 수 있는 임의의 다른 핵산, 예를 들어 인트론에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 도입유전자는 Dkk-1을 코딩한다.

본원에서, "dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물"이라는 용어는 복수개의 세포 내에 Dkk-1을 코딩하는 도입유전자가 포함되어 있어서 혈액에서의 글루코스 제거율, 혈액 중의 순환 인슐린, 근육 재생과 관련되거나 또는 인슐린-내성, 저인슐린혈증 및(또는) 근육 복구와 관련된 다른 성질에 관하여 숙주 세포의 표현형을 변화시키는 인간 이외의 동물, 예를 들어 설치류를 지칭한다.

본원에서, "dkk-1핵산을 발현하는 인간 이외의 2원 형질전환 동물"이라는용어는 유전자 발현이 표적 도입유전자에 대한 Dkk-1의 상호작용에 의해 제어되는 인간 이외의 동물, 예를 들어 설치류를 지칭한다. 이러한 상호작용은 동물 계통 (예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스 계통)을 교배시키거나 외생성 유도인자를 첨가 또는 제거함으로써 제어된다. 이러한 제어된 유전자 발현은 체중 및 지방 지시자 및 혈액 중 순환하고 있는 인슐린 또는 비만 및 고인슐린혈증과 관련된 다른 성질에 관하여 숙주 세포의 표현형을 변화시킨다.

본 발명의 실시양태

Dkk-1에 결합하며, 바람직하게는 Dkk-1의 활성을 중화시키는 길항제에 기초하여 인슐린 내성 및 저인슐린혈증을 진단 및 치료하는 신규 방법이 개시되어 있다.

또한, Dkk-1 그 자체는 비만 및 고인슐린혈증의 치료에 유용하다.

부가적으로, Dkk-1에 대한 길항제는 근육의 복구 및 재생을 위한 본원의 방법에 제시된다.

따라서, 본 발명은 다수의 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 상황에 유용한 방법을 제공한다.

Dkk-1은 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 상기 인용한 문헌에 기재된 방법, 예를 들어 재조합 제조법 또는 아미노산 합성을 비롯한 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다 (단, 제조된 서열이 비만 또는 고인슐린혈증의 치료에 효과적이어야 함).

길항제의 사용이 지적되면, 이는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수도 있고, Dkk-1의 생성 또는dkk-1mRNA의 생성을 억제할 수 있는 분자일 수도 있다. 후보 길항제의 효과는, 예를 들어 후보 길항제가 순환중인 Dkk-1의 양을 감소시키는 효과 (ELISA 분석법으로 측정할 수 있음)를 시험하는 것을 비롯하여 본원에 기재된 분석 기술을 통해 분석할 수 있다. 하기 설명은 본 발명에 따라 사용되는 대표적인 항체 생산 기술에 관한 것이다.

폴리클로날 항체는, 바람직하게는 관련 항원 및 면역보강제를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 다수회 주사함으로써 동물에서 생겨난다. 이작용성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂또는 R¹N=C=NR (식 중, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)를 사용하여, 관련 항원을 폴리히스티딘 태그 또는 면역화되는 종에 면역원성인 특정 단백질 (예를 들어, 키홀 림페트 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제)에 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

(각각 토끼 또는 생쥐에 대해) 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체를 3배 부피의 프로인트 (Freund) 완전 면역보강제와 조합하여, 이 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킬 수 있다. 1개월 후에, 동물을 다수 부위에서의 피하 주사에 의해 프로인트 불완전 면역보강제 중의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 추가면역화시킨다. 7일 내지 14일 후, 동물에서 혈액을 채취하여 혈청의 항체 역가를 분석할 수 있다. 역가가 정체기에 들어갈 때까지 동물을 추가면역화시킨다. 한 실시양태에서, 동물을 동일한 항원의 접합체이지만, 상이한 단백질에 접합되고(되거나) 상이한 가교결합제를 통해 접합된 접합체로 추가면역화시킨다. 또한, 접합체는 단백질 융합체로서 재조합 세포 배약액 중에서 만들어질 수 있다. 또한, 알룸 (alum)과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체들의 군집으로부터 수득된다. 즉, 상기 군집을 형성하는 각각의 항체들은 매우 극미하게 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타내는 것이다.

예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)에 의해 모노클로날 항체를 생산할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물 (예를 들어, 햄스터)을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수도 있다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이렇게 제조한 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하여 배양한다. 예를 들어, 골수종 모세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의해 항체가 높은 수준으로 안정하게 생성되도록 하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, California, USA)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다 (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해측정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐쳐드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 한계 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배지로는, 예를 들어 DMEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 증식할 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 용이하게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 보통은 항체 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 상기 벡터를 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체를 합성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내에서의 재조합 발현에 대한 고찰 문헌으로는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]이 있다.

추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty at al, Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수도 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리하는 것에 대해 기재되어 있다. 그 이후의 문헌에는 체인 셔플링 (chain shuffling; Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992))에 의해 인간 항체를 고친화도 (nM 범위)로 정제하는 것에 대해 기재되어 있으며, 복합 감염 및 생체내 재조합을 매우 거대한 파지 라이브러리 제조용 전략 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))으로 이용한 경우도 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 생산용 하이브리도마 기술의 가능한 대안이다.

또한, DNA는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 상동성 뮤린 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)] 참조), 또는 면역글로불린이 아닌 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합으로 연결시킴으로써 변형될 수 있다.

통상적으로, 면역글로불린이 아닌 그러한 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 또는 항체의 항원-결합 부위 중 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 지닌 한 항원-결합 부위와 다른 항원에 대한 특이성을 지닌 다른 항원-결합 부위를 갖는 키메라 2가 항체를 생성한다.

인간 항체가 아닌 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체에는 인간 이외의 공급원으로부터 유래한 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 인간 이외의 공급원으로부터 유래한 이들 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써, 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인이 인간 이외의 종으로부터 유래한 상응 서열에 의해 치환된 것보다 덜 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터 유래한 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체를 제조하는 데 사용되는 인간 가변 도메인의 경쇄 및 중쇄의 선택은 항원성을 감소시키는 것이 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열과 가장 유사한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로 채택한다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 아군에 속하는 모든 인간 항체들에 대한 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

또한, 항체가 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화시키는 것이 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모서열 및 다양한 개념상의 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 도시하여 나타내는 컴퓨터 프로그램이 입수가능하다. 결과로 나타난 자료들을 검사하면, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있다 (즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석이 가능함). 이러한 방법으로, FR 잔기는 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 임포트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 직접적이고 가장 실질적인 요인이다.

다양한 형태의 인간화 항체 또는 친화도-성숙 (affinity-matured) 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 친화도-성숙 항체는, 면역접합체를 생성하기 위해 1종 이상의 표적 항원(들)과 임의로 접합될 수 있는 Fab와 같은 항체 단편일 수 있다. 또는, 인간화 항체 또는 친화도-성숙 항체는 무손상 IgG1 항체와 같은 무손상 항체일 수도 있다.

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체도 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내생성 면역글로불린의 생성없이 인간 항체의 모든 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스 내의 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동형접합성 결실의 결과, 내생성 항체 생산이 완전히 억제된다고 알려져 있다. 그러한 생식세포주 돌연변이 마우스 내에 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 어레이 (array)를 이식하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다 (Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호).

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty at al, Nature 348:552-553 (1990))은 인간 항체 및 항체 단편을, 비면역화된 공여자로부터 유래한 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 제조하는 데 이용될 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 프레임에 맞게 클로닝되어, 파지 입자의 표면 상의 기능성 항체 단편으로서 나타난다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성에 기초한 선별은 또한 그의 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별하게 한다. 따라서, 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있는데, 그의 고찰은 문헌 [Johnson and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원은 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 어레이를 단리하는 것에 대해 기재되어 있다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 제조될 수 있고, 다양한 항원 (자가-항원을 포함함) 어레이에 대한 항체가 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol 222:581-597 (1991)], [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)], 또는 미국 특허 제5,565,332호 또는 제5,573,905호에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다.

또한, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호).

다양한 기술이 항체 단편의 생성을 위해 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해를 통해 유도된 것이었다 (Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); Brennan etal., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수도 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수할 수도 있고, F(ab')₂단편을 형성하도록 화학적으로 커플링시킬 수도 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')₂단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 제조하는 다른 기술들이 당업자에게는 분명할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185호; 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호). 또한, 항체 단편은 "선형 항체 (linear antibody)"(예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 것)일 수도 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 대표적인 이중특이적 항체는 Dkk-1 단백질의 상이한 에피토프 2개에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체로서 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 전장 이중특이적 항체의 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마; quardroma)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고 제조 수율이 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829호 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

다른 방법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합을 위해 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 생물체에 동시 형질감염시킨다. 이것은 항체 생성에 사용되는 3종의 폴리펩티드쇄의 동일하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는 데 있어서 보다 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 비율이 같은 2종 이상의 폴리펩티드쇄가 고수율로 발현되거나 상기 비율이 특별히 중요하지 않을 때, 2종 또는 3종 모두의 폴리펩티드쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입할 수도 있다.

이 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 암 (arm)에 있는 제1 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 암에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이하게 분리되도록 하기 때문에, 이러한 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 용이하게 분리할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 방법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작함으로써 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 일부분 이상을 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 경계면으로부터 유래한 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 상기 더 큰 아미노산 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공간 (cavity)"이, 더 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 원치않는 최종 생성물 (예를 들어, 동종이량체)에 비해 이종이량체에 대한 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체에는 가교결합 항체 또는 "이종접합" 항체이다. 예를 들어, 이종접합된 이 항체들 중 하나는 아비딘에 결합하고, 다른 하나는 바이오틴에 결합할 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/200360호 및 EP 03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술도 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학 결합을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는, 무손상 항체를 단백질 분해로 절단하여 F(ab')₂단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세나이트의 존재하에 환원되어, 주변의 디티올을 안정화시키고 분자간 이황결합 형성을 방지한다. 그 후, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체들 중 하나는 그 후에 메르캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 전환되어, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합됨으로써 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.

또한, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수되어, 화학적으로 커플링됨으로써 이중특이적 항체가 형성될 수 있다 (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)).

또한, 재조합 세포 배양액으로부터 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하는 다양한 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 제조되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터 유래한 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 상이한 항체 2개의 Fab' 부분에 연결된다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 또한, 이 방법은 항체 동종이량체를 생성하기 위해 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-4668 (1993)]에 기재된 "디아바이" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는데, 상기 링커는 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개 도메인 사이에서 페어링하지 못한다. 따라서, 한 단편의 V_H및 V_L도메인은 다른 단편의 상보적인 V_H및 V_L도메인과 페어링됨으로써, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 또한, 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).

2개가 넘는 결합가를 지닌 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)).

본원에 기재된 항-Dkk-1 항체의 아미노산 서열 변이체(들)도 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및(또는) 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-Dkk-1 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-Dkk-1 항체의 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수있다. 그러한 변이체에는, 예를 들어 항-Dkk-1 항체의 아미노산 서열의 결실, 상기 서열로의 삽입 및(또는) 상기 서열의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합을 수행하여 최종 작제물을 제조할 수 있는데, 단 최종 작제물은 원하는 특성을 지니고 있어야 한다. 또한, 아미노산 서열 변화는 항-Dkk-1 항체의 번역 후 프로세싱을 변화, 예를 들어 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

항-Dkk-1 항체 중에서 돌연변이 유발을 위한 바람직한 위치에 있는 특정 잔기 또는 특정 영역을 동정하기에 유용한 방법으로는 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법" (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989))이 있다. 여기서, 표적 잔기 또는 표적 잔기의 군을 동정 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전 잔기들)하고, 이들을 중성 또는 (-) 하전 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환하여, Dkk-1 항원과의 아미노산 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 대해 기능적인 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치를, 치환 부위에 또는 치환 부위를 위해 추가의 변이체 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 부위는 미리 결정되어 있지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정되지 않는다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이 성능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 표적 영역에서 수행하여, 발현된 항-Dkk-1 항체 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입체에는, 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는폴리펩티드 길이의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합체 뿐만 아니라, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 서열내 삽입체도 포함된다. 말단 삽입체의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-Dkk-1 항체, 또는 혈당저하 폴리펩티드에 융합된 항체가 있다. 항-Dkk-1 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는, 항-Dkk-1 항체의 N- 또는 C-말단이 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드에 융합된 융합체가 포함된다.

다른 유형의 변이체로는 아미노산 치환 변이체가 있다. 이들 변이체는 항-Dkk-1 항체 분자의 아미노산 잔기 1개 이상이 다른 잔기로 치환된 것이다. 가장 흥미로운 치환 돌연변이 유발의 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변형도 고려된다. 보존적 치환체는 하기 표 1에 "바람직한 치환체"의 제목으로 기재되어 있다. 그러한 치환체가 생물학적 활성의 변화를 초래한다면, 표 1에서 "예시적 치환체"로 명명된 보다 실질적인 변화, 또는 아미노산 군과 관련하여 하기 추가로 설명되는 변화를 도입하여 생성물을 스크리닝한다.

본래 잔기	예시적 치환체	바람직한 치환체
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp; lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르류신	leu
Leu (L)	노르류신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	leu

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조가, 예를 들어 쉬이트 또는 나선 형태로서 유지되거나, (b) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성이 유지되거나, 또는 (c) 측쇄의 용적이 유지되는 효과가 상당히 다른 치환체를 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 군의 구성원을 다른 군의 것으로 교환시키는 것이다.

항-Dkk-1 항체의 적당한 구조를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기도, 일반적으로는 세린으로 치환될 수 있으며, 이에 의해 분자의 산화 안정성이 향상되고 부적절한 가교결합을 방지한다. 이와는 반대로, (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편일 때) 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 더 개발시키기 위해 선택한 결과의 변이체(들)은 이들을 생성시킨 모항체에 비해 향상된 생물학적 특성을 나타낼 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화 성숙화과정 (affinity maturation)을 포함한다. 요컨대, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)를 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환체가 생성되도록 돌연변이화시킨다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는, 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 본원에 기재된 바와 같이 파지-디스플레이 변이체의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)을 나타내는 파지-디스플레이 변이체를 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법을 수행하여, 항원 결합성에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 결합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 Dkk-1 사이의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수도 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이와 이웃하는 잔기가 본원에서 고찰된 기술에 따라서 치환하기 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 우수한 성질을 나타내는 항체를 선별하여 더 개발할 수 있다.

항체의 아미노산에 대한 다른 유형의 변이체로는 항체가 지닌 본래의 글리코실화 패턴을 변화시키는 것이 있다. 여기서, "변화"란 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고(시키거나) 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.

항체의 글리코실화는 통상적으로 N-연결된 것이거나 O-연결된 것이다. N-연결된 것이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 의미한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 효소를 사용하여 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당의 일종인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 상기 기재된 트리펩티드 서열들을 하나 이상 포함하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 용이하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 또한, 상기 변화는 본래의 항체 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시킴으로써 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).

항-Dkk-1 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생의 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 최초 제조된 변이체 또는 항-Dkk-1 항체의 변이체가 아닌 형태의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 또는 카세트 돌연변이 유발이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하는 것, 예를 들어 Fc 수용체 결합을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 이황결합을 형성시킬 수 있다.

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 항체 (특히, 항체 단편)에 도입시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예, IgG₁, IgG₂, IgG₃또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.

항체의 다른 변형들도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백질성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다.

근육, 인슐린-내성 및 저인슐린혈증 증상에 대한 치료 용도

근육, 인슐린-내성 및 저인슐린혈증에 있어서, Dkk-1 길항제는 비경구 투여 경로 (예를 들어, 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피하 (SC) 및 복막내 (IP) 등을 포함함) 뿐만 아니라, 경피, 구강, 설하, 경막내, 비강내 및 흡입 경로 등을 비롯한 임의의 적합한 경로로 투여된다. IV, IM, SC 및 IP 투여는 볼루스 또는 주입에 의해 이루어질 수 있으며, SC의 경우에는 펌프, 서방형 제제 및 기계 장치 등을 비롯한 서방형 이식 장치에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여가 전신 투여이다.

Dkk-1 길항제의 바람직한 투여 방법으로 언급할 수 있는 예로는 피하 주입, 특히 펌프와 같은 계량 주입 장치를 이용하는 것이 있다. 이러한 펌프는 재사용가능한 것이거나 1회용일 수 있으며, 이식가능하거나 외부 탑재용일 수 있다. 이러한 목적에 사용하기 유용한 의약 주입 펌프로는, 예를 들어 미국 특허 제5,637,095호, 제5,569,186호 및 5,527,307호에 개시된 펌프가 있다. 이 조성물은 그러한 장치로부터 지속적으로 투여될 수도, 또는 단속적으로 투여될 수도 있다.

저장에 적합한 Dkk-1 길항제 치료 제제는, 원하는 순도의 길항제와, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16thedition, Osol, A. Ed. (1980))와의 혼합물을 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 포함한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 그 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 카운터이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 트윈 (상표명 TWEEN), 플루로닉스 (상표명 PLURONICS) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 있다. 바람직한 동결건조 항-Dkk-1 항체 제제는 WO 97/04801호에 기재되어 있다. 이들 조성물은 Dkk-1에 대한 길항제를, 활성 길항제의 약 0.1 내지 90 중량％로, 바람직하게는 가용성 형태로, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30％로 포함한다.

또한, 활성 성분은 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 반응 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐)에 의해 제조된 미소캡슐 내에 넣어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼의 형태로 만들 수 있다. 이러한 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌]에 기재되어 있다.

본 명세서에 개시된 항-Dkk-1 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)] 및 [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)], 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호, 및 WO 97/38731호 (1997년 10월 23일 공개)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 이황화 상호교환 반응을 통해 본 발명 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다.

또한, 서방형 제제를 제조할 수도 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 당해 항체를 함유하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 루프론 데포 (상표명 LUPRON DEPOT; 락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다.

임의의 특정 길항제를 담체 단백질과 연결하여, 치료용 길항제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 가용성 면역글로불린 키메라를, 미국 특허 제5,116,964호에 기재된 바와 같이 각각의 특정한 Dkk-1 길항제 또는 그의 길항성 부분에 대해 수득할 수 있다. 이 면역글로불린 키메라는 IgG-결합 단백질 A-세파로스 크로마토그래피를 통해 용이하게 정제할 수 있다. 이 키메라는 보다 높은 결합력 및 혈청 반감기를 수반하는 면역글로불린-유사 이량체 형성능을 갖는다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.

또한, 본 발명의 제제는 치료할 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 함유할 수 있다. 또한, 그러한 활성 화합물은 치료할 포유동물에 개별적으로 투여될 수도 있다.

예를 들어, 그러한 용도로 인슐린-내성 치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 식이요법 및 체중 감량에 반응하지 않는 제2형 당뇨병은Dkk-1 길항제와 함께 술포닐우레아를 사용한 치료법에 반응할 수 있다. 술포닐 우레아 약물의 군에는 아세토헥사미드, 클로로프로파미드, 톨라자미드, 톨부타미드, 글리벤클라미드, 글리보르누리드, 글리클라지드, 글리피지드, 글리퀴돈 및 글리미딘이 포함된다. 이러한 목적의 다른 약제에는 자가면역성 시약, 인슐린 증감제 (예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 엔글리타존 및 관련 화합물들과 같이 미국 특허 제5,753,681호에 기재된 것들을 비롯한 글리타존 족의 화합물들), 인슐린 수용체 티로신 키나아제 억제제에 대한 길항제 (미국 특허 제5,939,269호 및 5,939,269호), IGF-1/IGFBP-3 복합체 (미국 특허 제6,040,292호), TNF-알파 기능에 대한 길항제 (미국 특허 제6,015,558호), 성장 호르몬 방출제 (미국 특허 제5,939,387호), 및 아밀린에 대한 항체 (미국 특허 제5,942,227호)가 포함된다. 사용가능한 다른 화합물로는 인슐린 (1종 이상의 상이한 인슐린), 인슐린 모방체 (소분자 인슐린, 상기 언급한 인슐린 유사체, 또는 이들의 생리적 활성 단편), 상기 언급한 인슐린-관련 펩티드, 또는 이들의 유사체 또는 단편이 있다. 이들 약제는 하기 정의에서 추가로 특정된다.

저인슐린혈증을 치료하기 위해, 예를 들어 인슐린을 Dkk-1 길항제와 함께 또는 개별적으로 투여할 수 있다.

그러한 부가 분자는 의도된 치료에 효과적인 양으로 (통상적으로, Dkk-1에 대한 길항제 없이 단독으로 투여되는 것보다 적은 양으로) 조합 제제 중에 존재하거나 투여되는 것이 적합하다. 이들이 함께 제제화되는 경우, 이들은 증상의 유형, 대상체, 대상체의 연령과 체중, 현재 임상 상태, 투여 시간, 투여 형태, 투여방법 등에 따라 결정된 양으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 동반 투여 약물은 본원의 Dkk-1 길항제 1 중량부에 대해 약 0.0001 내지 10,000 중량부의 비율로 사용되는 것이 바람직하다.

인슐린과의 조합 제제 중 Dkk-1에 대한 길항제를 사용하면, 인슐린을 단독으로 투여하는 경우의 투여량에 비해 인슐린 투여량을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 인슐린을 다량 투여하는 경우에 생길 수 있는 문제점인 혈관 합병증 및 저혈당 증상 둘 다의 위험성을 낮출 수 있다. 성인 당뇨병 환자 (체중 약 50 kg)에게 인슐린을 투여하는 경우, 예를 들어 일일 투여량은 대체로 10 내지 100 U (단위), 바람직하게는 10 내지 80 U이지만, 이는 의사의 결정에 따라 감소될 수 있다. 동일한 유형의 환자에게 인슐린 분비 증가제를 투여하는 경우, 예를 들어 일일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 내지 1000 mg, 보다 바람직하게는 약 1 내지 100 mg이다. 동일한 유형의 환자에게 비구아니드계 화합물 (biguanide)을 투여하는 경우, 예를 들어 일일 투여량은 바람직하게는 약 10 내지 2500 mg, 보다 바람직하게는 약 100 내지 1000 mg이다. 동일한 유형의 환자에게 α-글루코시다제 억제제를 투여하는 경우, 예를 들어 일일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 내지 400 mg, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 300 mg이다. 그러한 환자에게 에르고셋, 프람린티드, 렙틴, BAY-27-9955 또는 T-1095를 투여하는 것은, 바람직하게는 약 0.1 내지 2500 mg, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 1000 mg의 투여량으로 수행될 수 있다. 상기 모든 투여량은 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다.

Dkk-1 길항제는 또한 췌장 이식과 같이 인슐린 내성에 대한 적합한 비 약물적 처치와 함께 투여될 수도 있다.

인슐린 내성 또는 저인슐린혈증 포유동물에 대해 투여되는 길항제의 투여량은 포유동물의 상태, 길항제 유형, 증상의 유형 및 선택된 투여 경로를 비롯한 관련 상황에 비추어 담당의사에 의해 결정될 것이다. 투여량은 바람직하게는 체중을 어떤 유의한 정도로 증가시키지 않는 충분히 낮은 수준이며, 담당의사는 이 수준을 결정할 수 있다. 인간 제2형 당뇨병의 치료에 승인된 글리타존 (로시글리타존/아반디아 (Avandia) 및 피오글리타존/악토스 (Actos))은 체중을 약간 증가시키지만, 이러한 부작용에도 불구하고 이들의 치료 지수에 의해 이로운 것으로 입증되었기 때문에 아직 사용되고 있다. 본원에 제시된 투여량 범위는 어떤 식으로든지 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 본원의 목적에 있어서 저인슐린혈증 및 인슐린 내성을 위한 "치료 유효"량은 상기 인자들에 의해 결정되지만 일반적으로는 약 0.01 내지 100 mg/체중 kg/일이다. 바람직한 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 25 mg/kg/일이다. 훨씬 더 바람직한 것으로, Dkk-1 길항제를 매일 투여하는 경우 인간에 대한 정맥내 또는 근육내 투여량은 하루에 약 0.3 내지 10 mg/체중 kg, 보다 바람직하게는, 약 0.5 내지 5 mg/kg이다. 피하 투여의 경우, 투여량은 정맥내 또는 근육내로 제공받는 치료적으로 동등한 투여량보다 더 많은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 두 경로에 대하여 인간에 대한 일일 피하 투여량은 약 0.3 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 5 mg/kg이다.

본 발명은 다양한 투여 스케쥴을 고려한다. 본 발명은 연속적인 투여 스케쥴을 포함하며, 여기서 Dkk-1 길항제는 실질적인 중단 없이 일정한 (투여량 및 투여 형태에 따라 매일, 매주 또는 매달) 기준에 따라 투여된다. 바람직한 연속적인 투여 스케쥴은 Dkk-1 길항제를 매일 주입하는 일일 연속 주입, 및 Dkk-1 길항제를 1일 1회 이상 볼루스 주사 또는 흡입 또는 비내 경로에 의해 투여하는 연속적인 볼루스 투여 스케쥴을 포함한다. 본 발명은 또한 비연속적 투여 스케쥴을 포함한다. 비연속적인 투여 스케쥴의 정확한 파라미터는 제제, 전달 방법 및 치료받을 포유동물의 임상적 필요에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, Dkk-1 길항제를 주입에 의해 투여하는 경우, 투여 스케쥴은 제1 투여 기간에 이어서, 제1 투여 기간보다 길거나 그와 동등하거나 또는 그보다 짧으며, Dkk-1 길항제가 투여되지 않는 제2 투여 기간을 포함할 수 있다.

볼루스 주사에 의해, 특히 서방형 제제를 볼루스 주사에 의해 투여하는 경우, 투여 스케쥴은 Dkk-1 길항제가 매일 투여된다는 점에서 연속적이거나, 상기 기술된 제1 및 제2 기간에 따라 비연속적일 수 있다.

또한 임의의 방법에 의한 연속적 및 비연속적 투여 스케쥴은 투여량이 제1 기간에 걸쳐 조절되는 투여 스케쥴, 예를 들어 투여량이 제1 기간의 시작에서는 적었다가 제1 기간의 말기까지 계속 증가하는 투여 스케쥴, 투여량이 처음에는 많았다가 제1 기간 동안 감소되는 투여 스케쥴, 투여량이 처음에는 적었다가 피크 수준으로 증가한 다음, 제1 기간의 말기에 이르러 감소하는 투여 스케쥴, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

인슐린 내성에 대한 Dkk-1 길항제의 투여 효과는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 측정할 수 있다. 가장 일반적으로, 당뇨병 영향의 완화는 혈당 조절의 개선 (혈중 글루코스에 대한 일련의 시험에 의해 측정함), 양호한 혈당 조절을 유지하는 인슐린에 대한 요구량 감소, 글리코실화된 헤모글로빈의 감소, 경과된 글리코실화 최종생성물 (AGE)의 혈중 수준 감소, "새벽 현상"의 감소, 케토산혈증 감소 및 개선된 지질 프로필을 나타낼 것이다. 또는, Dkk-1 길항제의 투여는 혈중 글루코스 수준 감소, 인슐린 요구량 감소, 글리코실화 헤모글로빈 감소 및 혈중 AGE 감소, 혈관, 신장, 신경 및 망막 합병증 감소, 임신 합병증 감소 및 개선된 지질 프로필에 의해 나타낸 바와 같이 당뇨병의 증상을 안정화시킬 수 있다.

Dkk-1 길항제의 혈당 저하 효과는 투여 이전 및 투여 이후에 대상체에서 정맥혈 혈장 중 글루코스 또는 Hb (헤모글로빈)A_1c의 농도를 결정하고, 이어서 투여 이전 및 투여 이후에 얻어진 농도를 비교하여 평가할 수 있다. HbA_1c는 글리코실화된 헤모글로빈을 의미하며, 혈중 글루코스 농도에 반응하여 점차적으로 생산된다. 따라서, HbA_1c는 당뇨병 환자에서 혈당의 급속한 변화에 의해 쉽게 영향받지 않는 혈당 조절의 지표로서 중요한 것으로 생각된다.

저인슐린혈증의 치료에 대한 증거는, 예를 들어 환자에서 순환중인 인슐린의 수준 증가에 의해 나타낸다.

근육 복구 및 재생을 위한 투여량은 환자의 상태, 요구되는 특정 유형의 근육 복구 등에 따라 통상적으로 약 0.01 내지 100 mg/체중 kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg이다. 투여 스케쥴은 당 분야에서 임상의에 의해 사용되는 표준 스케쥴에 따른다. 근육 복구 또는 재생의 증거는 근육 세포의 증식 및 분화에 대한 분석법 및 중합효소 연쇄 반응 시험 (예를 들어, 문헌 [Best et al., J. Orthop. Res., 19: 565-572 (2001)] 참조; 이 문헌은 정량적인 역전사 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 토끼 골격근을 치료하는데 있어서 근육세포 및 섬유아세포에서 유도된 유전자 산물의 mRNA 수준 변화에 대한 분석법을 제공함)을 비롯하여 당업계에 잘 알려진 다양한 측정 시험에 의해 나타난다 .

본 발명은 또한 인슐린 내성 및 저인슐린혈증의 치료 및 근육의 복구 및 재생을 위한 킷트를 제공한다. 본 발명의 킷트는 Dkk-1 길항제, 바람직하게는 항체의 하나 이상의 용기를, 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증의 치료 또는 근육 복구 또는 재생을 위한 Dkk-1 길항제의 사용 및 투여량과 관련된 지침 세트, 일반적으로 수기 지침과 함께 포함한다. 킷트에 포함된 지침은 일반적으로 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증 질환 또는 근육 증상의 치료를 위한 투여량, 투여 스케쥴 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. Dkk-1 길항제의 용기는 단위 투여물, 벌크 포장물 (다중-투여 포장물) 또는 소단위 투여물일 수 있다.

Dkk-1 길항제는 편리하고 적절한 임의의 포장형태로 포장될 수 있다. 예를 들어, Dkk-1 길항제가 동결건조 제형인 경우 탄력성 마개를 갖는 앰플이 일반적으로 사용되는데, 이 탄력성 마개를 통해 유체를 주입함으로써 약물을 쉽게 재구성할 수 있다. 비탄력성의 제거가능한 덮개 (예, 밀폐 유리) 또는 탄력성 마개를 갖는 앰플은 가장 편리하게는 주입가능한 형태의 Dkk-1 길항제를 위해 사용된다. 또한 흡입기, 비강 투여 장치 (예, 분무기)와 같은 특정 장치 또는 미니 펌프와 같은 주입 장치를 함께 사용하여 포장하는 것이 고려된다.

비만 및 고인슐린혈증 증상을 위한 치료적 용도

비만 및 고인슐린혈증 증상의 경우, Dkk-1은 비경구 투여 경로 (예를 들어, 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피하 (SC) 및 복막내 (IP) 등을 포함함) 뿐만 아니라, 경피, 구강, 설하, 경막내, 비강내 및 흡입 경로 등을 비롯한 임의의 적합한 경로로 투여된다. IV, IM, SC 및 IP 투여는 볼루스 또는 주입에 의해 이루어질 수 있으며, SC의 경우에는 펌프, 서방형 제제 및 기계 장치 등을 비롯한 서방형 이식 장치에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여가 전신 투여이다.

Dkk-1의 바람직한 투여 방법으로 언급할 수 있는 예로는 피하 주입, 특히 펌프와 같은 계량 주입 장치를 이용하는 것이 있다. 이러한 펌프는 재사용가능한 것이거나 1회용일 수 있으며, 이식가능하거나 외부 탑재용일 수 있다. 이러한 목적에 사용하기 유용한 의약 주입 펌프로는, 예를 들어 미국 특허 제5,637,095호, 제5,569,186호 및 5,527,307호에 개시된 펌프가 있다. 이 조성물은 그러한 장치로부터 지속적으로 투여될 수도, 또는 단속적으로 투여될 수도 있다.

저장에 적합한 Dkk-1 치료 제제는, 원하는 순도의 Dkk-1과, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와의 혼합물을 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 포함한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 그 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 카운터이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 트윈 (상표명 TWEEN), 플루로닉스 (상표명 PLURONICS) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 있다. 바람직한 동결건조 Dkk-1 제제는 WO 97/04801호에 기재되어 있다. 이들 조성물은 활성 Dkk-1 약 0.1 내지 90 중량％를, 바람직하게는 가용성 형태로, 보다 일반적으로는 약 10 내지 30％를 포함하는 Dkk-1을 포함한다.

또한, Dkk-1의 리포좀 제제는 통상의 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 Dkk-1을 함유하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 루프론 데포 (상표명 LUPRON DEPOT; 락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다.

Dkk-1을 담체 단백질 또는 PEG 또는 POG 또는 이러한 특성의 다른 분자에 연결하여 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 그의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.

고인슐린혈증의 치료를 위해, Dkk-1의 투여를 예를 들어 디아족시드와 함께 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shaer, Nephron, 89: 337-339 (2001)] 참조).

비만의 치료를 위해, Dkk-1의 투여는 개별 환자에 대하여 요구되는 바와 같이 일상 식품 또는 칼로리 섭취의 제한과 같은 음식물 제한 없이 수행하거나 이러한 제한을 두고 수행할 수 있다. 또한, Dkk-1은 본원에서 체중 감량제로 알려진, 비만의 치료 또는 방지를 위한 다른 치료제와 조합하여 투여하는 것이 적절하다. 이러한 목적에 유용한 물질로는, 예를 들어 호르몬 (카테콜아민, 글루카곤, ACTH 및 성장 호르몬과 IGF-1의 병용); Ob 단백질; 클로피브레이트; 할로겐화물; 신코카인; 클로르프로마진; 노르아드레날린성 신경전달물질에 작용하는 식욕-억제 약물, 예를 들어 마진돌 및 페네틸아민의 유도체, 예를 들어 페닐프로판올아민, 디에틸프로피온, 펜테르민, 펜디메트라진, 벤즈페타민, 암페타민, 메탐페타민 및 펜메트라진; 세로토닌 신경전달물질에 작용하는 약물, 예를 들어 펜플루라민, 트립토판, 5-히드록시트립토판, 플루옥세틴 및 세르트랄린; 중추 활성 약물, 예를 들어 날록손, 신경펩티드-Y, 갈라닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬 및 콜레시스토키닌; 콜린성 효능제, 예를 들어 피리도스티그민; 스핑고리피드, 예를 들어 리소스핑고리피드 또는 그의 유도체; 발열 약물, 예를 들어 갑상선 호르몬; 에페드린; 베타-아드레날린성 효능제; 위장관에 영향을 주는 약물, 예를 들어 효소 억제제, 예를 들어 테트라히드로리포스타틴, 소화되기 어려운 음식물, 예를 들어 수크로스 폴리에스테르 및 위의 공복 억제제, 예를 들어 트레오-클로로시트르산 또는 그의 유도체; β-아드레날린성 효능제, 예를 들어 이소프로테레놀 및 요힘빈; 요힘빈의 β-아드레날린성-유사 효과를 증가시키는 아미노필린, α₂-아드레날린성 차단 약물, 예를 들어 클로니딘 단독 또는 클로니딘과 성장 호르몬 방출 펩티드의 병용 (1992년 6월 9일 허여된 미국 특허 제5,120,713호); 장 흡수를 방해하는 약물, 예를 들어 비구아니드, 예를 들어 메트포르민 및 펜포르민; 벌크 (bulk) 충전제, 예를 들어 메틸셀룰로스; 대사 차단 약물, 예를 들어 히드록시시트레이트; 프로게스테론; 콜레시스토키닌 효능제; 케토산을 모방하는 소분자; 코르티코트로핀-방출 호르몬에 대한 효능제; 신체 지방 저장물을 저하시키기 위한 맥각-관련 프로락틴-억제 화합물 (1998년 11월 8일자로허여된 미국 특허 제4,783,469호); 베타-3-효능제; 브로모크립틴; 아편양제제 펩티드에 대한 길항제; 신경펩티드-Y에 대한 길항제; 글루코코르티코이드 수용체 길항제; 성장 호르몬 효능제; 이들의 조합물 등이 있다. 이들은 문헌 [Bray and Greenway, Clinics in Endocrinol. and Metabol., 5: 455 (1976)]에 기재된 모든 약물을 포함한다.

이러한 체중 감량용 보조제 및 디아족시드는 Dkk-1의 투여와 동시에, Dkk-1의 투여 이전에 또는 그 이후에 투여할 수 있으며, Dkk-1이 투여되는 경로와 동일한 경로 또는 다른 경로에 의해 투여할 수 있다.

비만 또는 고인슐린혈증 포유동물에 투여되는 Dkk-1의 투여량은 포유동물의 상태, 길항제 유형, 증상의 유형 및 선택된 투여 경로를 비롯한 관련 상황에 비추어 담당의사에 의해 결정될 것이다. 투여량은 바람직하게는 인슐린 내성을 유발하지 않는 충분히 낮은 수준이며, 담당의사는 이 수준을 결정할 수 있다. 인간 제2형 당뇨병의 치료에 승인된 글리타존 (로시글리타존/아반디아 및 피오글리타존/악토스)은 체중을 약간 증가시키지만, 이러한 부작용에도 불구하고 이들의 치료 지수는 전체적으로 이로운 것으로 나타났기 때문에 아직 사용되고 있다. 본원에 제시된 투여량 범위는 어떤 식으로든지 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 본원의 목적에 있어서 Dkk-1의 "치료 유효"량은 상기 인자들에 의해 결정되지만, 상기 두 경로에 대하여 일반적으로 약 0.01 내지 100 mg/체중 kg/일이다. 바람직한 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 25 mg/kg/일이다. 훨씬 더 바람직한 것으로, Dkk-1을 매일 투여하는 경우 인간에 대한 정맥내 또는 근육내 투여량은 하루에 약 0.3 내지 10 mg/체중 kg, 보다 바람직하게는, 약 0.5 내지 5 mg/kg이다. 피하 투여의 경우, 투여량은 정맥내 또는 근육내로 제공받는 치료적으로 동등한 투여량보다 더 많은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 두 경로에 대하여 인간에 대한 일일 피하 투여량은 약 0.3 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 5 mg/kg이다.

본 발명은 다양한 투여 스케쥴을 고려한다. 본 발명은 연속적인 투여 스케쥴을 포함하며, 여기서 Dkk-1은 실질적인 중단 없이 일정한 (투여량 및 투여 형태에 따라 매일, 매주 또는 매달) 기준에 따라 투여된다. 바람직한 연속적인 투여 스케쥴은 Dkk-1을 매일 주입하는 일일 연속 주입, 및 Dkk-1을 1일 1회 이상 볼루스 주사 또는 흡입 또는 비내 경로에 의해 투여하는 연속적인 볼루스 투여 스케쥴을 포함한다. 본 발명은 또한 비연속적 투여 스케쥴을 포함한다. 비연속적인 투여 스케쥴의 정확한 파라미터는 제제, 전달 방법 및 치료받을 포유동물의 임상적 필요에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, Dkk-1을 주입에 의해 투여하는 경우, 투여 스케쥴은 제1 투여 기간에 이어서, 제1 투여 기간보다 길거나 그와 동등하거나 또는 그보다 짧으며, Dkk-1이 투여되지 않는 제2 투여 기간을 포함할 수 있다.

볼루스 주사에 의해, 특히 서방형 제제를 볼루스 주사에 의해 투여하는 경우, 투여 스케쥴은 Dkk-1이 매일 투여된다는 점에서 연속적이거나, 상기 기술된 제1 및 제2 기간에 따라 비연속적일 수 있다.

또한 임의의 방법에 의한 연속적 및 비연속적 투여 스케쥴은 투여량이 제1 기간에 걸쳐 조절되는 투여 스케쥴, 예를 들어 제1 기간의 시작에서는 투여량이 적었다가 제1 기간의 말기까지 증가하는 투여 스케쥴, 투여량이 처음에는 많았다가 제1 기간 동안 감소되는 투여 스케쥴, 투여량이 처음에는 적었다가 피크 수준으로 증가한 다음, 제1 기간의 말기에 이르러 감소하는 투여 스케쥴, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

비만에 대한 Dkk-1의 투여 효과는 지방 세포 및 조직, 예를 들어 지방 패드, 총 체중, 근육, 간 및 지방내 트리글리세리드 수준, 공복시와 비-공복시의 렙틴 수준, 및 혈중 유리 지방산 및 트리글리세리드의 수준에 대한 분석을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 유사하게 측정할 수 있다. 고인슐린혈증에 대한 Dkk-1의 투여 효과는 또한 다양한 분석법에 의해 측정할 수 있으며, 가장 널리 이용되는 것은 체내의 순환중인 인슐린의 수준을 측정하는 방법이다.

본 발명은 또한 비만 및 고인슐린혈증의 치료를 위한 킷트를 제공한다. 본 발명의 킷트는 Dkk-1, 바람직하게는 인간 Dkk-1의 하나 이상의 용기를, 비만 또는 고인슐린혈증의 치료를 위한 Dkk-1의 사용 및 투여량과 관련된 지침 세트, 일반적으로 수기 지침과 함께 포함한다. 킷트에 포함된 지침은 일반적으로 비만 또는 고인슐린혈증의 치료를 위한 투여량, 투여 스케쥴 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. Dkk-1의 용기는 단위 투여물, 벌크 포장물 (예, 다중-투여 포장물) 또는 소단위 투여물일 수 있다.

Dkk-1은 편리하고 적절한 임의의 포장형태로 포장될 수 있다. 예를 들어, Dkk-1이 동결건조 제형인 경우 탄력성 마개를 갖는 앰플이 일반적으로 사용되는데, 이 탄력성 마개를 통해 유체를 주입함으로써 약물을 쉽게 재구성할 수 있다. 비탄력성의 제거가능한 덮개 (예, 밀폐 유리) 또는 탄력성 마개를 갖는 앰플은 가장 편리하게는 주입가능한 형태의 Dkk-1을 위해 사용된다. 또한 흡입기, 비강 투여 장치 (예, 분무기)와 같은 특정 장치 또는 미니 펌프와 같은 주입 장치를 함께 사용하여 포장하는 것이 고려된다.

진단 용도

많은 다른 분석법 및 분석 포맷을 이용하여 대조군 샘플에 대해 상대적으로 샘플 중 Dkk-1의 양을 검출할 수 있다. 따라서, 이러한 포맷은 포유동물에서 인슐린 내성, 고- 또는 저-인슐린혈증, 또는 비만의 존재 또는 징후를 검출하는데 이용되는, 본 발명의 진단 분석법에서 유용하다.

본 발명을 실시하는데 있어서, 당업계에 공지된, 가용성 분석물의 측정을 위한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는 방사성면역분석법, 효소 면역분석법 (EIA), 바람직하게는 ELISA, "샌드위치" 면역분석법, 침강소 (precipitin) 반응, 겔 확산 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법, 및 면역전기영동 분석법과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 바람직한 면역분석법에 대하여는 미국 특허 제4,845,026호 및 제5,006,459호를 참조한다.

한 실시양태에서, 분석에 사용된 항-Dkk-1 항체들 중 하나 이상이 표지되며; 다른 실시양태에서 제1 항체는 표지되지 않고, 표지된 제2 항체를 사용하여 제1 항체에 결합된 Dkk-1을 검출하거나 제1 항체를 검출한다.

진단 용도에 있어서, 항체는 통상적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 다수의 표지들을 이용할 수 있으며, 일반적으로는 다음과 같은 카테고리로 분류할 수 있다:

(a) 방사성 동위원소, 예를 들어³⁵S,¹⁴C,¹²⁵I,³H 및¹³¹I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. (Wiley-Interscience: New York, 1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소 또는 방사성핵종으로 표지할 수 있으며, 방사활성은 섬광계수법을 이용하여 측정할 수 있다.

(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유러퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체 (예, 플루오레세인 이소티오시아네이트), 로다민 및 그의 유도체, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드, 플루오레스카민, 단실, 리사민, 및 텍사스 레드 (Texas Red)를 이용할 수 있다. 형광성 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 연결시킬 수 있다. 형광은 형광측정기를 사용하여 정량할 수 있다. 또한 검출용 항체는¹⁵²Eu와 같은 형광-방출성 금속 또는 다른 란탄계열의 원소를 사용하여 검출가능하게 표지할 수도 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 금속-킬레이트기를 사용하여 항체에 부착시킬 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지를 EIA에서 이용할 수 있으며, 미국 특허제4,275,149호는 이들 중 몇몇에 대한 고찰을 제공한다. 이러한 효소는, 일반적으로 각종 기술을 이용하여 측정할 수 있는 발색성 기질의 화학적 변형을 촉매한다. 예를 들어, 상기 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광광도계로 측정할 수 있다. 별법으로, 이 효소는 기질의 형광성, 화학발광성 또는 생체발광성을 변화시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, (예를 들어, 화학발광측정기를 사용하여) 측정가능한 빛을 방출시키거나, 에너지를 형광 수용체에 제공한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예, 반딧불이 및 박테리아 루시퍼라제, 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 에쿠오린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 효모 알콜 데히드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데히드로게나제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 스타필로코커스의 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스파라기나제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 아세틸콜린에스테라제, 헤테로시클릭 옥시다제 (예, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제 및 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 연결하는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods in Enzym., ed. Langone and Van Vunakis (Academic Press: New York) 73: 147-166 (1981)]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음과 같은 것들을 포함한다:

(i) 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서 히드로겐 퍼옥시다제, 여기서 히드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴;

(ii) 알칼리 포스파타제 (AP)와 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및

(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색성 기질 (예, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.

당업자라면 많은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이러한 사항에 대한 전체적인 고찰을 위해서는 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다.

때로는, 표지를 항체와 간접적으로 연결한다. 당업자라면 이를 달성하기 위한 다양한 기술들을 알 것이다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 연결할 수 있고, 상기 언급한 표지들의 3가지 넓은 카테고리들 중 어떤 것을 아비딘과 연결할 수 있으며, 또는 그 반대로도 할 수 있다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하며, 따라서 이와 같은 간접적인 방식으로 표지를 항체와 연결할 수 있다. 별법으로, 표지를 항체와 간접적으로 연결시키기 위해, 항체를 작은 합텐 (예, 디옥신)과 연결하고, 상기 언급한 여러 유형의 표지들 중 하나를 항-합텐 항체 (예, 항-디곡신 항체)와 연결한다. 이와 같이, 표지를 항체와 간접적으로 연결할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 항-Dkk-1 항체는 표지될 필요가 없으며, 그의 존재는 Dkk-1 항체와 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 항체는 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침강 분석법과 같은 임의의 공지된 분석법에서 사용할 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

본 발명의 분석에서, 항원, 예를 들어 Dkk-1, 또는 항체는 고상 지지체 또는 담지체에 연결하는 것이 바람직하다. "고상 지지체 또는 담지체"는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 임의의 지지체를 의미한다. 잘 알려진 지지체 또는 담지체로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철광이 포함된다. 담지체의 특성은 본 발명의 목적에 있어서 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 연결된 분자가 항원 또는 항체와 결합할 수 있다면 실제로 임의의 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같은 구형이거나, 시험관의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면에서와 같은 실린더형일 수 있다. 또는, 표면은 쉬이트, 검사대 등과 같이 평평할 수 있다. 바람직한 지지체로는 폴리스티렌 비드를 들 수 있다. 당업자라면 항체 또는 항원과 결합하는 많은 다른 적합한 담지체를 알거나, 통상의 실험에 의해 이를 확인할 수 있을 것이다.

바람직한 실시양태에서, 항체-항원-항체 샌드위치 면역분석법을 수행하는데, 즉 항원은 제1 항체를 항원에 결합시키는 단계, 제2 항체를 항원에 결합시키는 단계, 및 상기 제1 및 제2 항체 둘 다와 면역특이적으로 결합한 항원을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출 또는 측정된다. 특정 실시양태에서,제1 및 제2 항체는 모노클로날 항체이다. 이 실시양태에서, 항원이 모노클로날 항체에 의해 인식되는 반복적인 에피토프를 포함하지 않는다면, 제2 모노클로날 항체는 제1 항체와는 다른 부위에 결합해야 한다 (예를 들어, 항원에 결합하는 두 항체들 사이에서 경쟁적 억제의 결여에 의해 반영된 바와 같음). 다른 특정 실시양태에서, 제1 또는 제2 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 항체는 둘 다 폴리클로날 항체이다.

바람직한 실시양태에서, "정방향 (forward)" 샌드위치 효소 면역분석법이 하기에 개략적으로 기술한 바와 같이 이용된다. Dkk-1에 대한 항체 (포획 항체, Ab1)는 고상 매트릭스, 바람직하게는 마이크로플레이트에 부착된다. 샘플을 Ab1-코팅된 매트릭스와 접촉시키면 샘플 중에서 Ab1에 특이적인 임의의 Dkk-1은 고상 Ab1에 결합한다. 결합되지 않은 샘플 성분들을 세척하여 제거한다. 항원의 제2 에피토프에 한 효소-연결된 제2 항체 (검출 항체, A2)는 Ab1에 의해 포획된 항원과 결합하며, 샌드위치와 경쟁한다. 결합되지 않은 Ab2를 세척하여 제거한 다음, 효소에 대한 발색성 기질을 첨가하는데, 착색된 생성물은 샌드위치에 존재하는 효소의 양과 비례하여 형성되며, 이는 샘플 중 항원의 양을 반영한다. 중단 용액 (stop solution)을 가하여 반응을 종결시킨다. 분광광도계를 사용하여 적절한 파장에서의 흡광도로 색을 측정한다. 공지된 농도의 항원으로부터 표준 곡선을 생성시키고, 이로부터 미지의 샘플의 값을 결정할 수 있다.

다른 유형의 "샌드위치" 분석법은 이른바 "동시적 (simultaneous)" 및 "역방향 (reverse)" 분석법이다. 동시적 분석법은 고상 지지체에 결합된 항체 및 표지된 항체 둘 다를 시험되는 샘플에 동시에 첨가했기 때문에 하나의 인큐베이션 단계를 포함한다. 인큐베이션을 완료한 다음, 고상 지지체를 세척하여 남은 유체 샘플 및 결합되지 않은 표지된 항체를 제거한다. 이후, 고상 지지체와 결합된 표지된 항체의 존재를 통상의 "정방향" 샌드위치 분석에서와 같이 결정하였다.

"역방향" 분석법에서, 먼저 표지된 항체의 용액을 유체 샘플에 가하고, 이어서 적절한 기간 동안 인큐베이션한 다음 결합된 비표지 항체를 고상 지지체에 단계적으로 가한다. 제2 인큐베이션 후, 고상을 통상의 방식으로 세척하여 시험 샘플의 잔류물 및 표지된 비반응 항체의 용액을 유리시킨다. 이후, 고상 지지체와 결합된 표지된 항체를 "동시적" 및 "정방향" 분석법에서와 같이 측정한다.

본 발명의 분석을 수행하기 위한 성분을 포함하는 하나 이상의 용기 또는 바이알을 포함하는 킷트도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 킷트는 소정량의 시약과 진단 분석의 수행을 위한 지침을 하나의 포장으로 포함한다. 예를 들어, 상기 킷트는 항체 또는 항체들, 바람직하게는 Dkk-1 항원상의 동일한 결합 부위와 경쟁하지 않는, 상기 항원에 대한 한쌍의 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, Dkk-1을 고상 매트릭스에 미리 흡착시킬 수 있다. 바람직하게는 킷트는 당업계에 잘 알려진 필요한 다른 세척 시약을 포함한다. EIA의 경우, 킷트는 발색성 기질뿐 아니라, 발색이 일어났을 때 효소 반응을 중단시키기 위한 시약을 포함한다. 이 킷트에 포함된 기질은 항체 제제들 중 하나에 연결된 효소에 대해 적절한 것이다. 이들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일부는 하기에 예시되어 있다. 또한 킷트는 임의로는 Dkk-1 표준물을 포함하며, 즉 정제된 Dkk-1의 양은 표준 샘플 중의 Dkk-1의 통상적인 양에 상응한다.

항체를 효소로 표지하는 경우, 킷트는 기질 및 효소에 의해 요구되는 보조인자 (예, 검출가능한 크로모포어 또는 플루오로포어를 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제로는 예를 들어 안정화제 및 완충제 (예, 블록 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함시킬 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양을 다양하게 변화시켜 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공할 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하여 일반적으로는 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.

한 측면에서, 킷트는 하나 이상의 용기내에, Dkk-1에 결합하고 예를 들어 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상 담지체상에 코팅될 수 있는 항체, Dkk-1을 포함하는 표준 샘플, 및 검출에 이용되는 지침을 포함하거나 (여기서 Dkk-1과 결합하는 항체는 검출가능하게 표지됨), Dkk-1과 결합하며 검출가능하게 표지되거나 제1 항체에 결합하는 항체를 추가로 포함한다.

형질전환 및 낙아웃 (knockout) 동물, 및 스크리닝에 있어서 이들의 용도

인간 이외의 동물 종, 예를 들어 설치류, 보다 바람직하게는 뮤린 유래의 Dkk-1 코딩 핵산을 사용하여, 치료적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 인간 이외의 형질전환 또는 2원 형질전환 동물을 생성시킬 수 있다. Dkk-1 낙아웃 마우스는 배아 치사작용이 있다 (Mukhopadhyay et al., Dev. Cell., 1: 423-434 (2001)).

형질전환 동물은 태아기, 예를 들어 배아 단계에서 동물 또는 동물의 조상에게 도입된 도입유전자를 포함하는 세포를 갖는 동물이다. 도입유전자는 형질전환 동물을 발생시킬 세포의 게놈내에 통합되는 DNA이다.

한 실시양태에서, Dkk-1 도입유전자를 인간 이외의 동물에서 유래한 생식세포에 도입하여 형질전환 동물을 생성시킨다. 형질전환 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당업계에서는 통상적인 것이며 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기재되어 있다. Dkk-1 또는 그의 적절한 서열을 코딩하는 뮤린의 cDNA와 같은 동물의 cDNA를 사용하여, 확립된 기술에 따라, Dkk-1을 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있으며, 이 게놈 서열을 사용하여 Dkk-1을 코딩하는 DNA를 발현시키는 세포를 포함하는 형질전환 동물을 생성시킨다. 통상적으로, 특정 세포를 도입유전자와 조직-특이적 인핸서의 혼입에 대하여 표적화하여, Dkk-1의 표적화된 과다발현을 일으킨다. 배아 단계 동물의 생식세포로 도입된, Dkk-1을 코딩하는 도입유전자의 카피를 포함하는 형질전환 동물을 사용하여 Dkk-1을 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다.

다양한 발생 단계의 배아 표적 세포를 사용하여 도입유전자를 도입할 수 있다. 배아 표적 세포의 발생 단계에 따라 다른 방법을 사용한다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 임의의 동물의 특정 계통(들)은, 건강상태가 대체적으로 양호한 것들, 배아 생산성이 양호한 것들, 배아에서 전핵 (pronucleus)이 양호하게 나타나는 것들 및 재생 적합성이 양호한 것들을 선택한다. 또한, 반수체 (haplotype)도 중요한 요소이다. 예를 들어, 형질전환 마우스를 생산하려는 경우, C57BL/6 또는 FVB 계통과 같은 종들이 흔히 사용된다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 계통(들)은 그 자체로 형질전환 동물이고(이거나) 낙아웃 동물일 수 있다 (즉, 부분적으로 또는 완전히 억제된 하나 이상의 유전자를 갖는 동물로부터 얻어짐).

도입유전자 작제물을 1-단계 배아에 도입할 수 있다. 이 접합체 (zygote)는 미세주입을 위한 최적의 표적이다. 접합체를 유전자 전달 표적으로 사용하는 것은 대부분의 경우 주입된 DNA가 첫번째 난할 이전에 숙주 유전자내로 혼입될 것이라는 점에서 주요한 이점을 갖는다 (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4438-4442 (1985)). 그 결과, 형질전환 동물의 모든 세포는 도입된 도입유전자를 포함할 것이다. 또한 이러한 것은 일반적으로는, 생식 세포의 50％가 도입유전자를 보유할 것이기 때문에, 도입유전자를 파운더 (founder)의 자손에게로 효과적으로 전달하는데에도 반영된다.

일반적으로, 수정된 배아를 전핵이 나타날 때까지 적합한 배지에서 인큐베이션한다. 대략 이 정도의 시기에, 도입유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 암컷 또는 수컷의 전핵내에 도입한다. 마우스와 같은 어떤 종들에서는, 수컷 전핵이 바람직하다. 외생성 유전 물질을 접합체의 수컷 DNA 상보체에 부가하여, 이후 난자 핵 또는 접합체 암컷 전핵에 의해 프로세싱되도록 할 수 있다.

이와 같이, 외생성 유전 물질을 수컷 DNA 상보체 또는 임의의 다른 DNA 상보체에 부가하여, 이후 암컷 전핵에 의해 영향받도록 할 수 있는데, 이 때는 수컷 및 암컷 전핵이 잘 분리되고 이들 모두가 세포막 가까이에 위치했을 경우이다. 또는, 외생성 유전 물질의 탈응축 (decondensation)을 유도한 다음 이를 정자의 핵으로 부가할 수 있다. 이후, 외생성 유전 물질을 포함하는 정자를 난자에 부가하거나탈응축된 유전 물질을 갖는 정자를 난자에 부가할 수 있으며, 이후 도입유전자 작제물을 되도록 빨리 부가한다.

외생성 유전 물질을 핵의 유전 물질로 부가할 수 있는 기술은 이 기술이 세포, 핵막, 또는 기타 존재하는 세포 또는 유전자 작제물에 대해 해롭지 않다면 어떤 것이라도 이용할 수 있다. 도입유전자 뉴클레오티드 서열의 배아로의 도입은 예를 들어 미세주입법, 전기천공법 또는 리포펙션법과 같이 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성할 수 있다. 외생성 유전 물질은 주로 미세주입법에 의해 핵의 유전 물질로 삽입한다. 세포 및 세포 구조물에 대한 미세주입법은 공지되어 있으며, 당업계에서 이용된다. 마우스에서, 수컷 전핵은 직경이 약 20 마이크로미터의 크기에 도달하는데, 이는 1 내지 2 pL의 DNA 용액의 반복가능한 주입을 허용한다. 도입유전자 뉴클레오티드 서열을 배아로 도입한 후, 배아를 시험관내에서 다양한 시간 동안 인큐베이션하거나 대리 숙주내에 재이식할 수 있으며, 이들 둘 다를 수행할 수도 있다. 시험관내 인큐베이션에 의한 성숙은 본 발명의 범위내이다. 한가지 통상적인 방법은 배아를 종에 따라 시험관내에서 약 1 내지 7일 동안 인큐베이션한 다음, 이를 대리 숙주내에 재이식하는 것이다.

접합체에 부가되는 도입유전자 작제물의 카피수는 부가되는 외생성 유전 물질의 총량에 따라 다르며, 유전적 형질전환이 일어날 수 있도록 하는 양일 것이다. 하나의 카피가 기능성이 되도록 하기 위해서는, 이론적으로는 1 카피만이 필요하지만, 일반적으로는 다수의 카피, 예를 들어 1,000 내지 20,000 카피수의 도입유전자 작제물이 이용된다. 본 발명에 있어서, 삽입된 외생성 DNA 서열의 표현형 발현을증가시키기 위해서는 이 서열의 기능성 카피를 하나 이상 포함하는 것이 유리할 수 있다.

대리 숙주의 형질전환 자손을 임의의 적합한 방법에 의해 도입유전자의 존재 및(또는) 발현에 대하여 스크리닝 할 수 있다. 스크리닝은 흔히 도입유전자의 적어도 일부에 상보적인 프로브를 사용하여 서던 블롯 또는 노던 블롯에 의해 수행한다. 도입유전자 산물의 존재를 스크리닝하기 위한 대안적인 방법 또는 다른 방법으로는 도입유전자에 의해 코딩되는 Dkk-1에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 이용할 수 있다. 통상적으로, DNA는 꼬리 조직으로부터 제조하여 도입유전자에 대하여 서던 분석 또는 PCR에 의해 분석한다. 또는, 도입유전자를 가장 높은 수준으로 발현시키는 것으로 믿어지는 조직 또는 세포를 서던 분석 또는 PCR에 의해 도입유전자의 존재 및 발현에 대하여 시험하지만, 이러한 분석에는 임의의 조직 또는 세포 유형을 사용할 수 있다.

도입유전자의 존재를 평가하기 위한 다른 방법 또는 추가의 방법으로는 효소 및(또는) 면역학적 분석법, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직 염색법 및 유동세포계수 분석법 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 혈액 분석법은 또한 혈중 도입유전자 산물의 존재를 검출하는데 있어서 뿐만 아니라, 글루코스 등의 혈액 성분의 수준에 대한 도입유전자의 효과를 평가하는데 있어서도 유용할 수 있다.

형질전환 동물의 자손은 형질전환 동물을 적합한 대상과 교배시키거나, 형질전환 동물로부터 얻은 난자 및(또는) 정자를 시험관내에서 수정시켜 얻을 수 있다. 대상과 교배시키는 경우, 대상은 형질전환 동물 및(또는) 낙아웃 동물이거나 그렇지 않을 수 있으며, 대상이 형질전환 동물이라면, 그는 동일한 도입유전자 또는 다른 도입유전자를 포함할 수 있으며 이러한 유전자 둘 다를 포함할 수도 있다. 또는, 대상은 부모 계통일 수 있다. 시험관내 수정을 이용하는 경우, 수정된 배아를 대리 숙주내에 이식하거나 시험관내에서 인큐베이션할 수 있으며, 이들 모두를 수행할 수도 있다. 각 방법에서는 자손을 상기 기술된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 도입유전자의 존재에 대하여 평가할 수 있다.

본 발명에 따라 생성되는 형질전환 동물은 외생성 유전 물질, 즉 Dkk-1을 생산하는 DNA 서열을 포함할 것이다. 이 서열은 전사 조절 요소, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결될 것이며, 이로써 바람직하게는 특정 유형의 세포에서 도입유전자를 발현시킬 수 있다. 본원에서 이러한 조절 요소로서 가장 바람직한 것은 근육 조직에서dkk-1핵산 (예, cDNA)을 과다발현시킬 수 있는 근육 특이적 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예로는 하기 실시예 1에 기재된 것 또는 스무텔린 (smoothelin) A 또는 B의 발현을 유도하는 것, 또는 예를 들어 2001년 3월 15일 공개된 WO 01/18048에 기재된 유사한 프로모터들이 있다.

또한 레트로바이러스 감염을 이용하여 도입유전자를 인간 이외의 동물에 도입할 수도 있다. 발생중인 인간 배아가 아닌 배아를 시험관내에서 포배 상태로 배양할 수 있다. 이 시간 동안, 할구 (blastomere)는 레트로바이러스 감염에 대한 표적이 될 수 있다 (Jaenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 1260-1264 (1976)). 효소적 처리에 의해 투명대 (zona pellucida)를 제거하여 할구를 효과적으로 감염시킨다 (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan, ed. (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986)). 도입유전자를 도입하는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 통상적으로 해당 도입유전자를 포함하는 복제-결함 레트로바이러스이다 (Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6972-6931 (1985); Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-6152 (1985)). 형질감염은 할구를 바이러스-생산 세포의 단층에서 배양함으로써 쉽고 효과적으로 달성한다 (Van der Putten et al., 상기 문헌; Stewart et al., EMBO J., 6: 383-388 (1987)). 별법으로, 감염은 이후 단계에서 수행할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포를 포배강 (blastocoele)에 주입할 수 있다 (Jahner et al., Nature, 298: 623-628 (1982)). 대부분의 파운더는 혼입이 인간 이외의 형질전환 동물을 형성시킨 세포의 서브세트에서만 일어나기 때문에 도입유전자에 대하여 모자이크성일 것이다. 추가로, 파운더는 일반적으로 자손대에서 분리될 게놈내의 여러 위치들에서 도입유전자의 다양한 레트로바이러스 삽입체를 포함할 수 있다. 또한, 임신 중기 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 도입유전자를 생식세포내로 도입할 수도 있다 (Jahner et al. (1982), 상기 문헌).

도입유전자 도입을 위한 세번째 유형의 표적 세포는 배아 간세포 (ES)이다. ES 세포를 시험관내에서 배양된 이식전 배아로부터 얻고, 배아와 융합시킨다 (Evans et al., Nature, 292: 154-156 (1981); Bradley et al., Nature, 309: 255-258 (1984); Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9065-9069 (1986)); Robertson et al., Nature, 322: 445-448 (1986)). 도입유전자는 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포내로 효과적으로 도입할수 있다. 이어서, 이와 같이 형질전환된 ES 세포를 인간 이외의 동물로에서 유래한 포배와 합할 수 있다. 이후, ES 세포는 배아를 콜로니화하여, 생성된 키메라 동물의 생식세포주를 구성한다. 고찰을 위해서는 문헌 [Jaenisch, Science, 240: 1468-1474 (1988)]을 참고한다.

동물에서 유전자 발현에 대한 조건에 따른 조절, 즉 시간 및 공간적 조절은 2원 도입유전자 시스템을 이용하여 달성할 수 있으며, 여기서 유전자 발현은 표적 도입유전자에 대한 이펙터 단백질 생성물의 상호작용에 의해 조절된다. 이러한 상호작용은 동물 계통 (예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 계통)을 교배하거나 또는 문헌 [Lewandoski, Nature Reviews Genetics, 2: 743-755 (2001)]에 기재된 바와 같이 외생성 유도인자를 부가 또는 제거하여 조절한다.

2원 도입유전자 시스템은 2가지 카테고리로 분류된다. 하나는 전사 트랜스활성화를 기초로 한 것으로, 기능 획득 (gain-of-function) 실험에서 도입유전자를 활성화하는데 충분히 적합하다. 다른 것은 부위-특이적 DNA 재조합을 기초로 한 것으로, 이를 이용하여 도입유전자를 활성화하거나 조직-특이적 유전자 낙아웃 및 세포-계통 마커를 생성시킬 수 있다.

가장 일반적으로 사용되는 전사 시스템은 이. 콜라이 (E. coli)의 테트라사이클린 내성 오페론을 기초로 한다. 이러한 시스템의 이펙터는 전사 활성화가 테트라사이클린 화합물 (일반적으로 독시사이클린)의 투여 또는 결핍시 일어났는지에 의해 정의되는 2가지 카테고리로 분류된다. Gal4-기초 시스템은 유도인자를 필요로 하지 않는 트랜스활성화 시스템이지만, Gal4 전사 활성화는 돌연변이화된 리간드-결합 도메인이 Gal4 키메라 트랜스활성인자로 도입되는 경우 합성 스테로이드에 의해 조절될 수 있다.

가장 널리 사용되는 부위-특이적 DNA 재조합 시스템은 박테리오파지 P1으로부터의 Cre 리컴비나제를 사용하지만, 에스. 세레비지에 (S. cerevisiae)로부터의 재조합 Flp 리컴비나제를 변형하여 마우스와 같은 동물에 사용하기도 한다.

조직 특이적 프로모터의 조절하에 발현되는 Cre 또는 Flp 리컴비나제에 의해 작동될 수 있는 변형된 내생성 유전자를 갖는 2원 형질전환 동물을 생산하는 유전자-표적화 기술을 이용함으로써, 부위-특이적 재조합을 이용하여 공간적으로 조절된 방식으로 내생성 유전자를 불활성화시킬 수 있다.

Cre/Flp 활성은,cre/FLP-코딩 도입유전자를 바이러스 벡터내에 전달하거나, 외생성 스테로이드를 돌연변이화된 리간드-결합 도메인에 융합된cre유전자로 이루어진 키메라 도입유전자를 지닌 동물에게 투여하거나, 또는 전사 트랜스활성화를 이용하여cre/FLP 발현을 조절함으로써 일시적으로 조절할 수 있다. 부위-특이적 재조합의 비가역성은 이러한 기술을,cre/FLP의 일시적인 조직 특이적 발현을 이용하여 세포-계통 연구에서 리포터 표적 유전자를 영구적으로 활성화시키는 새로운 유형의 분석법에 특별히 적합하게끔 만든다.

2원 도입유전자를 함유하는 인간 이외의 형질전환 동물은 인슐린 내성, 고인슐린혈증 또는 저인슐린혈증, 비만, 또는 근육 퇴행으로부터 보호하는 작용을 하는 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로 사용할 수 있다. 이러한 측면 중 하나에 따라, 예를 들어 세포 (예, 근육 세포)에서dkk-1핵산 (예, cDNA)을 과다발현시키는 비인간 형질전환 동물을 사용하여 후보 약물 (단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 소분자 등)을 예를 들어 혈액으로부터의 글루코스 제거율을 증가시키는 효능 (인슐린 내성에 대한 치료를 암시함), 인슐린 수준을 증가시키는 효능 (저인슐린혈증에 대한 치료를 암시함) 또는 근육 세포를 분화시키는 효능 (근육 재생을 위한 치료를 암시함)에 대하여 스크리닝할 수 있다.

다른 측면에서, 변화된dkk-1핵산 발현을 나타내는 2원 도입유전자를 함유하는 인간 이외의 동물을 사용하여 후보 약물을, 상기 설명한 바와 같이, 예를 들어 고-지방 음식물에 노출되었을 때 체중 또는 지방세포를 감소시키는 능력 (비만에 대한 치료를 암시함) 또는 인슐린 수준을 감소시키는 능력 (고인슐린혈증에 대한 치료를 암시함)에 대하여 스크리닝 할 수 있다.

상기 시약/약물로 처리되어, 2원 또는 통상의 도입유전자를 보유하는 미처리 동물에 비해 질병의 징후가 감소된 동물은 질병에 대한 잠재적인 치료적 개입을 암시한다. 이러한 감소된 징후를 위한 분석법은 상기 설명 및 하기 실시예에 언급되어 있다.

하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕고자 기재한 것이며, 물론 본원에 기재 및 청구된 본 발명을 구체적으로 한정하려는 것으로 이해해서는 안된다. 선행 기술의 범위내에 있는 본 발명의 변형은 현재 알려져 있거나 향후 개발될 모든 등가물의 치환을 포함하여 하기 청구된 본 발명의 범위내에 해당하는 것으로 고려된다. 본원에 언급된 모든 인용문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

<실시예 1>

Dkk-1의 생체내 및 시험관내 효과

재료 및 방법

L6 세포 배양

L6 근모세포를 10％ 송아지 태아 혈청을 포함하는 MEM 알파 (Gibco-BRL)로 이루어진 배양 배지에서 증식시켰다. 전면배양 (confluence)에 도달하기 전에, 세포를 트립신으로 분산시켜 새로운 배양 배지에 다시 시딩 (seeding)하였다. 배지를 전면배양에서의 분화 배지 (2％ 송아지 태아 혈청을 포함하는 MEM 알파)로 교환하여 근모세포의 융합을 유도하였다. 세포를 이 배지에서 3 내지 9일 동안 배양하고, Dkk-1 처리를 위해 28시간 초과의 시간 동안dkk-1(Krupnik et al., 상기 문헌; WO 99/46281; PRO1008을 코딩하는 DNA)을 이 배지에 가하였다. 28시간보다 짧은 처리는 0.5％ FBS를 포함하는 MEM 알파에서 수행하였다.

재조합 Dkk-1의 발현

Dkk-1의 인간 상동체 (hDkk-1)를 배큘로바이러스에서 C-말단의 8X His 태그 융합체로서 발현시켰으며 (문헌 [Krupnik et al., 상기 문헌]; 및 WO 99/46281 참조, 여기서 PRO1008은 Dkk-1임), 니켈 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 단백질의 동일성을 N-말단 서열 분석에 의해 확인하였다. 정제된 단백질은 내독소 수준이 0.3 EU/ml 미만이었다.

2-DOG 흡수

대조군 세포 및dkk-1으로 처리된 세포를 2-데옥시[¹⁴C] 글루코스 0.5 μCi를 함유하는 크렙스-링거 (Krebs-Ringer) 포스페이트-HEPES 완충액 (KRHB)(130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 및 25 mM HEPES, pH 7.4) 중에서 37℃에서 20분 동안 0.5 M 인슐린의 존재 또는 부재하에 인큐베이션하였다. 세포를 KRHB로 2회 세척하고, 100 mM NaOH 중에서 용해시켰으며, 세포 용해물 중 세포내 2-데옥시[¹⁴C]글루코스를 액체 섬광계수법 (LSC)에 의해 측정하였다.

유전자 발현의 정량화

RNeasy 미니 킷트 (Qiagen)(배양된 세포의 경우) 또는 트리졸 (Trizol) 시약 (Gibco)(근육의 경우)를 사용하고, 이어서 DNaseI (Amplification Grade, GibcoBRL)으로 처리하여 전체 RNA를 단리하였다. 유전자 발현 분석은 문헌 [Gibson et al., Genome Res., 6: 995-1001 (1996)] 및 [Heid et al., Genome Res., 6: 986-994 (1996)]에 기재된 바와 같은 ABI PRISM (등록상표) 7700 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)사에 의해 제공된 기기 및 소프트웨어)을 사용하는 실시간 정량적-PCR (RTQ-PCR)에 의해 수행하였다.

글리코겐 합성

글리코겐 합성은 [¹⁴C]글루코스가 글리코겐으로 혼입되는 것으로 측정하였다. 대조군 L6 세포 및dkk-1으로 처리된 세포를 0.5 μM 인슐린의 존재 또는 부재하에 [U-¹⁴C]글루코스 (5 mM 글루코스; 1.25 μCi/ml)를 포함하는 혈청-무함유 MEM 알파에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하여 실험을 종결시키고, 세포를 빙냉 PBS로 3회 세척하고, 이를 20％ (w/v) KOH로 용해시켰으며, 1시간 후 1 M HCl을 가하여 중화시켰다. 용해물을 5분 동안 비등시키고, 원심분리에 의해 맑은 상태로 만들었으며, 상층액 중 세포 글리코겐을 0℃에서 2시간 동안, 캐리어로서 1 mg/ml의 냉각 글리코겐을 사용하여 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 글리코겐을 원심분리에 의해 분리하고, 70％ 에탄올로 세척하고, 물에 재용해시키고, [¹⁴C] 글루코스의 글리코겐으로의 혼입을 LSC에 의해 측정하였다.

키나아제 활성에 대한 분석

키나아제를 업스테이트 바이오테크놀러지, 인크. (Upstate Biotechnologies, Inc. (Lake Placid, NY))사로부터 구입한 시약을 사용하여 면역침전시켜 분석하였으며, 특정 펩티드 기질로 혼입된³²P의 순수한 수준을 측정하였다. 특히, 세포를 혈청-무함유 배지로 세척하고, 분석에 앞서 3 내지 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 30 nM 인슐린으로 30분 동안 자극하고, 빙냉 PBS로 세척한 다음, 빙냉 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.7/0.5％ NONIDET P-40 (등록상표) 4-노닐페놀폴리에틸렌글리콜 저-포말성 계면활성제 (Roche Diagnostics GmbH)/2.5 mM EDTA/10 mM NaF/0.2 mM Na₃V0₄/1 mM Na₃Mo0₄/1 ㎍/ml 마이크로시스틴-LR/0.25 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드/1 μM 펩스타틴/0.5 ㎍/ml 루펩틴/10 ㎍/ml 대두 트립신 억제제) 중에서 용해시켰다. 각 펩티드에 대한 항체 (2 ㎍)를 단백질-G 세파로스 비드 40 ㎕로 4℃에서 밤새 포획한 다음, 비드를 새 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 용해물을 원심분리 (20,000 ×g, 1 분)하여 맑게 만들고, 상층액을 4℃에서 2시간 동안 지속적으로 혼합하면서 단백질 G-결합된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 비드를 새 용해 완충액으로 3회 세척하고, 키나아제 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.2/1 mM MgCl₂/1 mM EGTA/1 mM DTT/0.25 mM PMSF/1 mM Na₃VO₄/0.5 ㎍/ml 루펩틴)으로 1회 세척하였다. 비드를 특정 펩티드 기질을 포함하는 키나아제 완충액 중 30 ㎕로 재현탁시켰다. ATP 용액 (5 ㎕)(키나아제 완충액 중 200 μM ATP/10 μCi³²P-ATP)을 가한 다음, 30℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 20 ㎕ 부피의 반응물을 P81 여과지상에 스폿팅하여 반응을 중단시킨 다음, 1％ (부피/부피) 인산으로 전체적으로 세척하였으며, 결합된 방사활성을 LSC에 의해 측정하였다.

근육 조각에서 Akt 활성을 측정하기 위해, 새로 단리한 근육 조각을 8 mM 글루코스, 32 mM 만니톨 및 0.1％ BSA를 포함하는 KRHB (0₂/CO₂(95％/5％)로 포화됨) 중에서 35℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 회수하였다. 근육 조각을 인슐린 (33 nM 및 100 nM)으로 10분 동안 자극한 다음, 근육을 플래쉬 (flash) 동결시키고, 용해 완충액 중에 균질화하고, 원심분리에 의해 맑은 상태로 만들었다. 동량의 단백질 용해물을 상기 기술된 바와 같이 Akt 면역침전 및 Akt 활성 측정을 위해 사용하였다.

3T3/L1 지방세포 배양

3T3/L1 섬유아세포를 전면배양시켜 지방세포로 분화시켰다 (Rubin et al., J. Biol. Chem., 253: 7570-7578 (1978)). 분화된 세포를 분화 유도 후 Dkk-1으로 72시간 동안 처리하였다. 3T3L1 세포 분화에 대한 Dkk-1의 효과에 관하여, Dkk-1을 분화 시작 동안 배지에 40 nM의 농도로 첨가하고 실험 진행 동안 유지하였다.

글루코스의 지질로의 혼입

대조군 및 처리군 3T3 L1 지방세포를 혈청-무함유 MEM 알파 중에서 D-[U-¹⁴C]글루코스 (0.2 μCi/ml)와 함께 37℃에서 2시간 동안 0.5 μM 인슐린의 존재 또는 부재하에 인큐베이션하였다. 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 100 mM NaOH 중에 용해시켰다. 용해물을 100 mM 염산으로 중화시키고, 용해물 중 세포 지질을 n-헵탄으로 추출하고, [¹⁴C]글루코스의 추출된 지질로의 혼입을 LSC에 의해 측정하였다.

동물 및 음식물

모든 프로토콜은 인터내셔널 유즈 및 케어 커미티 (Institutional Use and Care Committee)에 의해 승인된 것이다. 달리 언급하지 않는다면, 마우스는 온도- 및 습도-조절된 환경에서 표준 실험실 사료를 주어 유지시켰다. 12시간 (오후 6.00/오전 6.00)의 광조건 주기를 이용하였다.

표준 마우스 사료는 PURINA 5010 (등록상표) 브랜드 식품 (Harlen Teklab, Madison WI)이었다. 고-지방 (58％ kJ 지방) 및 저-지방 (10.5％ kJ 지방) 등열량 (isocaloric) 음식물은 문헌 [Surwit et al., Metabolism 44: 645-651 (1995)]에기재된 음식물을 기초로 한 것이며, 리써치 다이어츠 (Research Diets)(New Brunswick, NJ)사로부터 구입하였다.

인간dkk-1cDNA (Krupnik et al., 상기 문헌)를 미오신 경쇄 프로모터 뒤쪽의 pRK 스플라이스 공여체/수용체 부위에 3'으로 라이게이션하였다 (Shani, Nature, 314: 283-286 (1985)).dkk-1cDNA는 인간 성장 호르몬 유전자의 4번째와 5번째 엑손 사이에 존재하는 스플라이스 공여체/수용체 부위의 앞쪽에 있다 (Stewart et al., Endocrinology, 130: 405-414 (1992)). 전체 발현 단편을 오염성 벡터 서열이 없도록 정제하여 FVB x FVB 교배로부터 유도된 1-세포 마우스 난자로 주입하였다. 꼬리 생검체로부터 추출된 DNA를 PCR 분석하여 형질전환 마우스를 확인하였다.

생체내 대사 측정 및 혈청 분석

각 마우스에 체중 1 g 당 글루코스 1.5 mg을 복강내 주입하여 글루코스 허용성 시험 (GTT)을 수행하였다. 인슐린 허용성 시험 (ITT)은 각 마우스에 체중 1 kg 당 인슐린 0.6 U를 정맥내 주입하여 수행하였다. 두 시험 모두에서, 지시된 시기에 LIFESCAN 패스트 테이크 (Fast Take)(등록상표) 글루코스 측정기를 이용하여 전혈의 글루코스를 측정하였다. 인슐린 및 렙틴의 혈청 수준을 ELISA 킷트 (Crystal Chem, Chicago, IL)에 의해 분석하였다. 지방산 및 트리글리세리드의 혈청 수준을 각각 NEFA C (등록상표) 비-에스테르화 지방산 (Wako Chemicals USB, Inc.) 및 시그마 트리글리세라이드 (Sigma Triglyceride), INT (등록상표)(Sigma) 분석 킷트에 의해 분석하였다.

데이타 분석

달리 언급되지 않는다면, 모든 데이타는 평균 ±표준편차로서 나타낸다. 대조군 세포와 처리군 세포 사이의 비교, 및 형질전환 마우스와 야생형 마우스 사이의 비교는 단측 스튜던트 (student's) 시험을 이용하여 수행하였다.

결과

다양한 성인 조직에서의dkk-1의 상대적인 발현 수준을 실시간 정량적 PCR (Gibson et al., 상기 문헌; Heid et al., 상기 문헌)에 의해 측정하였다. 도 1에 나타낸 결과는dkk-1이 성인 조직, 특히 비장, 고환 및 자궁, 가장 특히는 자궁에서 폭넓게 발현된다는 것을 암시한다.

배큘로바이러스에서 발현되는 경우, 인간 Dkk-1 단백질을 내부적으로 절단하여 16-kDa 크기의 절단 생성물을 얻었다. 도 2에 나타낸 겔에서, 밴드 (a)는 N-말단의 서열 TLNSVLNSNAI (서열 1)을 갖는 전장 단백질에 상응하며, SVLNSNAIKNL (서열 2)는 신호 펩티드 절단 부위에 상응하고, 밴드 (b)는 N-말단의 서열 SKMYHTKGQE (서열 3)을 갖는 절단된 단백질에 상응한다.

L6 근육 세포를 Dkk-1로 처리하여 세포에서 기초 글루코스 흡수 및 인슐린-자극에 의한 글루코스 흡수를 감소시켰다. Dkk-1의 효과는 2시간 만큼 짧은 것으로 보일 수 있다 (도 3A). 단기간 처리의 효과는 처리 후 2시간 내지 6시간 사이에서 가장 유의했다. 장기간 처리 (도 3B 및 3C)에서, 인슐린 의존성 글루코스 흡수의 감소는 96시간 후의 시점에서 보다 유의했지만 (p = 0.001), 이러한 효과는 48시간 후의 시점에서도 나타났다 (p = 0.05).

글루코스 흡수에 대한 Dkk-1의 효과는 세포의 분화 상태와는 독립적이며 근세포로 분화하기 시작하는 세포에서도 관찰될 수 있다 (도 4A). 글루코스 흡수에 대한 Dkk-1의 효과는 투여량 의존적이다. 도 4B는 기초 글루코스 흡수 및 인슐린 의존성 글루코스 흡수의 감소가 Dkk-1을 10 nM 만큼 낮은 농도로 48시간 처리하는 경우에 관찰된다는 것을 보여준다.

L6 근육 세포를 Dkk-1으로 처리하자 글루코스가 글리코겐으로 혼입되는 양이 증가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Dkk-1의 자극 효과는 48시간 후의 시점에서 관찰될 수 있었다 (p = 0.003).

이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, Dkk-1의 효과는 장기간의 처리 이후에 관찰되기 때문에, 이 단백질은 L6 세포의 분화에 영향을 주는 방식으로 작용할 수 있다. TAQMAN (등록상표) 프라이머 및 프로브 (Probe) 디자인 (Applied Biosystems)을 사용하는 RT-PCR 분석을 수행하여, Dkk-1으로 처리된 L6 세포에서 미오신 중쇄 (MHC), 미오신 경쇄 (MLC), 미오제닌, Pax3, Myf5 및 MyoD와 같은, 근육발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 도 6A는 Dkk-1 처리에 의해 분화 4 내지 6일 사이에 MyoD의 수준이 증가하였음을 보여주고, 도 6B, 6C 및 6D는 분화 4 내지 6일째 각각 MLC2, MHC 및 미오제닌의 발현 감소를 보여주지만, 도 6E는 Pax3의 발현에 대한 유의한 효과가 없음을 보여준다. 따라서, Dkk-1은 L6 세포에서 근육발생을 조절한다.

Dkk-1은 L6 세포의 분화에 유의하게 영향을 주지 않기 때문에, RT-PCR 분석 (TAQMAN (등록상표) 프라이머 및 프로브 디자인)을 수행하여 Dkk-1이 글루코스 대사에 관여하는 유전자의 발현 수준에 영향을 주었는지를 결정하였다. Dkk-1은 L6 근육 세포의 인슐린 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 도 7에 나타낸 바와 같이, Dkk-1 처리는 48시간 처리 후 포스포이노시티드 3-키나아제의 p85 서브유닛의 발현을 유의하게 증가시켰지만 (8.3배), 시험된 다른 유전자의 발현에는 유의한 영향을 주지 않았다.

L6 근육 세포의 Dkk-1 처리는 PDK-1 (도 8A), GSK3p (도 8B) 또는 S6 키나아제 (도 8C)의 활성에는 영향을 주지 않았지만, 처리 48시간 후 Akt 활성의 수준을 유의하게 감소시켰다. 구체적으로, Dkk-1-처리된 L6 세포는 인슐린 처리된 Akt 활성에서 49％의 감소를 나타냈으며 (도 8D), 이는 글루코스 흡수에서의 감소와 일치한다.

Dkk-1은 지방세포에서 글루코스 대사에 영향을 주었다. 구체적으로, Dkk-1-처리된 3T3 L1 세포는 기초 글루코스 흡수 및 인슐린 자극에 의한 글루코스 흡수에서의 증가 (도 9A 및 9B)를 나타낼 뿐만 아니라, 인슐린 자극 후 글루코스의 지질로의 혼입율의 증가를 나타냈다 (도 9C 및 9D). 48시간 처리의 시점에서 나타난 인슐린 의존성 글루코스 흡수의 증가는 96시간 처리 이후에 보다 분명하였으며 (p = 0.04), 이와 유사한 결과가 글루코스의 지질로의 인슐린 의존성 혼입에서 관찰되었다 (96시간 처리 후 p= 0.003).

Dkk-1은 지방세포의 분화에 영향을 미쳤다. 구체적으로, Dkk-1을 처리한 3T3 L1 세포는 분화하는 동안 PPARγ 및 C/EBPα 전사체 수준의 감소를 보였지만 (도 10A 및 10B), 지방세포 분화의 다른 마커, 예컨대 AP2 및 지방산 신타아제(FAS)의 발현은 영향을 받지 않았다 (도 10C 및 10D).

마우스에서 재조합 Dkk-1을 정맥내 주사한 결과, 글루코스 허용성이 손상되고 인슐린 생산이 저하되었다. 구체적으로, 형질전환 마우스에서 보인 Dkk-1의 생체내 효과를 확증하기 위해, 암컷 FVB 마우스에게 8일 동안 Dkk-1을 정맥내 주사하였다 (매일 1회 주사 0.05 및 0.2 mg/kg/일). 글루코스 허용성에 대한 Dkk-1의 효과를 주사를 시작한 지 48시간 및 8일째에 측정하였다. 정맥내 주사 48시간째에는 글루코스 허용성이 영향을 받지 않았으나, 주사한지 8일 후에는 염수를 주사한 동물에서 보인 것과 비교할 때 Dkk-1 0.05 또는 0.2 mg/kg/일을 주사한 동물에서 글루코스 제거율의 저하가 나타났다 (도 11A). 글루코스 유도된 혈청 인슐린의 수준은 GTT 동안 글루코스를 복막내 주사한지 30분 후에 수집한 혈청에서 측정하였다. Dkk-1을 주사한 동물은 대조군 동물에 비해 혈청 인슐린 수준이 상당히 저하되었고, 이러한 저하는 Dkk-1의 투여량에 의존적이었다 (도 11B). Dkk-1을 주사한 동물에서 인슐린 허용성, 및 트리글리세리드, FFA 및 렙틴의 혈청 수준은 영향을 받지 않았다.

마우스에서 재조합 Dkk-1의 정맥내 주사는 근육 특이적 유전자의 발현을 변화시키고, 생체내 근육에서 인슐린 자극된 Akt 활성을 저하시켰다. 구체적으로, 대조군 및 Dkk-1을 주사한 동물을 12 내지 16시간 동안 공복시키고, 정맥내 주사한지 8일 후에 치사시켰다. 사두근을 이용하여 전체 RNA를 추출하였고, RTQ-PCR을 이용하여 다양한 근육 분화 마커, 예컨대 MyoD, 미오제닌, MLC2, MLC1/3, myf5, pax3, 데스민 및 미오신 중쇄의 발현에 대한 Dkk-1의 효과를 측정하였다. Dkk-1을주사한 동물에서 MLC2, MLC1/3, 미오제닌, myf5, Pax3 및 근육 크레아틴 키나제 (MuCK)의 발현은 감소되나 MyoD의 발현은 증가되는 것이 관찰되었고 (도 12A), 이는 L6 세포에서의 효과와 일치하는 것이며, 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고 Dkk-1이 생체내 근육 분화에도 영향을 미친다는 것을 제시한다. Dkk-1을 주사한 동물에서 인슐린 신호전달에 관여하는 유전자의 발현 수준이 약간 영향을 받았으며, 이는 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고 이러한 효과가 근육 분화에 대한 효과에 부차적인 것임을 제시한다.

대조군 및 Dkk-1을 주사한 동물의 가자미근을 상기 기재한 바와 같이 단리하고, 문헌 [Oku et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 280:E816-24 (2001)]에 기재된 바와 같이 Akt 활성을 인슐린을 미처리한 및 처리한 가자미근 조각에서 측정하였다. 도 12B에 도시된 바와 같이, Dkk-1 처리 결과 인슐린에 의해 Akt의 활성이 감소되었으며, 이는 배양된 L6 세포에서 보인 효과와 일치하였다.

마우스에서 Dkk-1의 과다발현은 성장, 신체 구성 및 대사에 영향을 미쳤다. MLC 프로모터의 조절하에 dkk-1 도입유전자를 과다발현하는 형질전환 FVB 마우스를 생성하였다 [Shani, 상기 문헌]. 대조군 및 형질전환 동물의 체중은 수주에 걸쳐 관찰하였다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 규정식을 섭취한 형질전환 동물은 그의 대조군인 한배 자손에 비해 체중이 저하되었다. 이러한 효과는 10일된 동물에서 명백하였으며 (도 13A), 22주된 동물에서까지 관찰할 수 있었다 (도 13B).

생리학적 인자	대조군규정식(수컷, n=8)	대조군규정식(암컷, n=4)	Dkk-1 형질전환규정식(수컷, n=4)	Dkk-1 형질전환규정식(암컷, n=8)
16주된 동물의 체중(g)	30.6 ±2.2	24.1 ±3.2	28.9 ±0.9	22.7 ±1.5
공복시 FFA 수준(nMol/5 ㎕)	20.84 ±3.93	15.71 ±3.11	18.26 ±3.28	16.32 ±4.19
식사시 FFA 수준(nMol/5 ㎕)	10.54 ±1.85	10.93 ±1.83	9.95 ±0.66	10.42 ±1.86
기본 트리글리세리드수준(mg/ml)	1.17 ±0.14	1.21 ±0.07	1.15 ±0.08	1.13 ±0.13
트리글리세리드 수준(18시간 공복)(mg/ml)	1.96 ±0.6	1.56 ±0.41	1.62 ±0.36	1.57 ±0.49
혈청 인슐린 (ng/ml)(복막내 글루코스주사 30분 후)	2.55 ±1.25	2.22 ±9.6	1.89 ±1.56	1.47 ±8.5
혈청 인슐린(기본)(ng/ml)	8.7 ±2.1	4.97 ±2.9	6.4 ±2.1	4.7 ±2.5
혈청 인슐린(18시간 공복)(ng/ml)	1.3 ±0.3	1.68 ±0.1	1.6 ±0.3	1.48 ±0.3
혈청 렙틴 수준(ng/ml)(식사)	16.15 ±5.0	22.0 ±2.7	9.89 ±5.1	11.77 ±5.7
혈청 렙틴 수준(ng/ml)(20시간 공복)	4.84 ±3.2	10.07 ±2.4	2.55 ±2.5	4.30 ±2.6

형질전환 동물에서 다양한 기관 (간, 신장, 비장) 및 지방 패드 (갈색 지방조직, 후복막 지방 및 신장 주변 지방)의 중량을 측정한 결과, 생체 기관의 크기에 비례하여 저하된 것으로 밝혀졌다. 그러나, 규정식 또는 고지방 식사를 섭취한 형질전환 동물에서는 지방 패드의 중량이 대조군인 한배 자손에서 보다 상당히 (40 내지 50％) 줄어들었다 (도 14A 및 14B). 공복시 및 식사시의 조건하에 트리글리세리드, 유리 지방산 (FFA) 및 렙틴의 혈청 수준을 측정하였다. 트리글리세리드및 유리 지방산의 수준은 형질전환 동물 및 대조군 동물에서 유사하였으나, 순환중인 렙틴의 수준은 형질전환 동물이 거의 50％ 더 낮았다 (도 14C, 14D, 표 2).

Wnt 신호전달은 지방생성을 억제한다. Dkk-1이 신체 구성에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 일부 동물에게 24주 동안 고지방 식사를 섭취하게 하였다. 고지방 식사를 섭취한 Dkk-1 형질전환 동물도 그들의 야생형 한배 자손에 비해 체중이 상당히 저하되는 것을 보였으며 (도 15A), 이는 생체 기관 중량의 저하에 필적하는 것이었다. 규정식을 섭취한 동물에서 관찰된 것과 유사하게, 지방 패드는 형질전환 동물에서 40 내지 50％ 더 적었으며 (도 15B), 이는 순환중인 렙틴의 수준 저하에 필적하는 것이었다 (도 15C). 트리글리세리드 및 유리 지방산의 수준은 형질전환 동물 및 대조군 동물에서 유사하였다 (표 3).

생리학적 인자	대조군고지방 식사(m=12)	대조군고지방 식사(f=8)	Dkk-1 형질전환고지방 식사(m=6)	Dkk-1 형질전환고지방 식사(f=5)
16주된 동물의 체중(g)	40.3 ±6.6	34.7 ±7.1	36.7 ±4.8	29.2 ±5.1
식사시 FFA 수준(nMol/5 ㎕)	9.06 ±3.3	10.92 ±2.4	9.13 ±2.4	10.13 ±0.68
식사시 트리글리세리드 수준(mg/ml)	1.08 ±0.16	1.14 ±0.1	1.12 ±0.12	1.19 ±0.15
혈청 인슐린 (복막내글루코스 볼루스 주사 30분 후) (pg/ml)	907.0 ±645.1	327.6 ±181.2	623.0 ±490.1	243.8 ±103.3
혈청 인슐린(20시간 공복)(pg/ml)	917.5 ±726.0	714.8 ±228.4	938.0 ±427.3	845.8 ±606.1
혈청 렙틴 수준(ng/ml)(기본)	33.5 ±10.1	36.8 ±0.6	23.6 ±18.2	24.7 ±10.3

생체내 글루코스 대사에 대한 Dkk-1의 효과를 측정하기 위해, 파운더 형질전환 마우스로부터 생생된 2가지 독립적인 계통의 글루코스 및 인슐린 허용성을 측정하였다. 형질전환 마우스에서 글루코스 복막내 주사 (GTT) 후 글루코스 제거율은 고지방 식사를 섭취한 암컷 및 수컷에서 뿐만 아니라 규정식을 섭취한 암컷 및 수컷 모두에서 야생형 한배 자손에 비해 현저히 저하되었다 (도 16A 및 16B). 인슐린 허용성은 규정식을 섭취한 동물에서 측정한 결과, 영향을 받지 않은 것으로 확인되었다 (도 16C 및 16D). 복막내 글루코스 볼루스 주입 30분 후 형질전환 동물에서 글루코스 유도된 혈청 인슐린의 수준을 ELISA에 의해 측정한 결과, 대조군 동물에서의 수준에 비해 형질전환 동물에서 상당히 저하되었다 (도 16E).

논의

Dkk-1은 시험관내 근육 세포에서 글루코스 흡수에 대해 별개의 효과를 갖는다. Dkk-1을 처리한 근육 세포는 인슐린 치료에 대해 내성을 가졌으며, 이러한 효과는 18시간 정도 나타날 수 있다. 제2형 당뇨병의 특징인 인슐린 내성은 인슐린 신호전달 경로에서 단백질의 발현 수준, 인산화 및 활성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 생체내 및 시험관내 근육 둘 다에서 Dkk-1의 효과를 조사하였다.

L6 근육 세포에서 Dkk-1의 가장 극적인 효과는 인슐린 신호전달 경로에서 핵심적인 키나제인 Akt의 인슐린 자극된 활성화가 50％ 저하된 것이었다. 근육에서 Dkk-1을 과다발현하는 형질전환 동물은 혈청으로부터의 글루코스 제거율이 저하되었으나, 그들의 인슐린 허용성은 변화되지 않았다. 이들 동물은 또한 성장 지연을 나타내었고, 그들의 야생형 한배 자손에 비해 생체 기관의 제(除)지방 및 지방 질량이 비례적으로 적었다. 근육에서 글루코스 제거율 및 Akt의 인슐린 자극된 활성화에 대한 Dkk-1의 효과는 8일 동안 Dkk-1을 정맥내 주사한 동물에서 관찰될 수 있었다. 이들 동물에서는 혈청 인슐린 수준이 저하되었지만, 형질전환 마우스에서는 혈청 인슐린 수준에서 효과가 보이지 않았다. Dkk-1은 인슐린 신호전달 경로에서 핵심적인 중간체인 Akt의 억제를 통해 L6 세포에서 기본적인 글루코스 흡수 및 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 저하시켰다. 이러한 Dkk-1의 효과는 Dkk-1에 노출시킨 지 18시간 후에만 보였다.

Dkk-1은 시험관내 및 생체내 근육 세포 분화에 상당한 영향을 미쳤으며, 이는 그들의 길항제가 근육 재생 및 복구에 유용할 것임을 제시한다

dkk-1 도입유전자를 발현하는 동물은 다양한 기관의 중량에 비례하여 감소된 신체 크기를 가졌다. 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고, 이러한 Dkk-1의 효과는 인슐린 (또한 IGF-1) 자극된 Akt 활성의 저하를 통해 매개되는 경향이 있다. 이의 직접적인 증거는 Akt1에 대한 유전자가 불활성화된 마우스에서의 연구로부터 도출된다 (문헌 [Chen et al., Genes and Development, 15:2203-2208 (2001)]). 이들 동물은 출생시 크기가 보다 작고 저하된 체중을 보이며 성장률도 낮았으나, 그들의 글루코스 대사는 영향을 받지 않았다. 또한, Akt는 성장 호르몬 수용체와 핵 사이의 신호전달을 매개한다 (문헌 [Piwien-Pilipuk et al., J. Biol. Chem., 276:19664-19671 (2001)]). 또한, 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고, dkk-1 형질전환 동물에서의 저하된 성장률은 저하된 글루코스 흡수 및 그로 인한 영양 이용률 및 대사율의 변화의 부차적인 효과일 수 있다. Akt는 근육 비대증을 조절하고위축증을 예방하며 (문헌 [Bodine et al., Nature Cell Biology, 3:1014-1019 (2001)]; [Rommel et aL, Nature Cell Biology, 3:1009-1013 (2001)]), 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고, 신체 크기에 대한 Dkk-1 효과가 Akt에 의해 조절된 근육 분화 및(또는) 재생을 통해 매개되는 것이 가능하다.

Dkk-1 형질전환 마우스는 지방 패드가 저하되었으며, 이는 Dkk-1이 지방세포 분화에 영향을 미친다는 것을 제시한다. 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고, 이는 지방생성의 공지된 조절인자인 Akt의 억제를 통해 부분적으로 매개될 수 있다 (문헌 [Magun et al., Endocrinology, 137:3590-3593 (1996)]).

1차 3T3L1 전구지방세포를 Dkk-1의 존재 또는 부재하에 자극하여 분화시켰고, 분화가 시작된 후 상이한 날에 세포를 수집하고, 지방세포 분화의 마커, 예컨대 AP2, PPARγ, CEBPα 및 FAS의 발현 수준에 대해 전사체를 분석하였다. Dkk-1 처리는 FAS 및 AP2의 수준은 변화시키지 않았으나, 분화한지 5 내지 8일에 PPARγ수준은 Dkk-1을 처리한 세포에서 약 2배 저하되었고, C/EBPα 수준은 Dkk-1을 처리한 세포에서 약 1배 저하되었다.

PPARγ은 지방세포 형성의 핵심적인 조절인자이고 (문헌 [Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9856-9860 (1995)]; [Hallakou et al., Diabetes, 46:1393-99 (1997)]), 전사 활성이 증가된 수용체를 제공하는 돌연변이가 심각한 비만 환자에서 확인되었다 (문헌 [Ristow et al., N. Engl. J. Med., 339:953-959 (1998)]). 또한, PPARγ은 근육에서 인슐린 민감성의 조절에 핵심적인 역할을 할 수 있다. PPARγ의 발현은 제2형 당뇨병의 골격근에서 변화되고 (문헌[Lovisacach et al., Diabetologia, 43:304-311 (2000)]), 그의 전사 활성을 손상시키는 돌연변이는 심각한 인슐린 내성 및 제2형 당뇨병을 가진 개체에서 확인되었다 (문헌 [Barroso et al., Nature, 402:880-883 (1999)]). 그러나, 제2형 당뇨병에서 PPARγ의 역할에 대한 가장 강력한 증거는 인간 제2형 당뇨병의 치료용으로 승인된 티아졸리딘디온 (TZD) 부류의 약물 (글리타존; 로시글리타존/아반디아 및 피오글리타존/악토스)의 사용으로부터 도출된다. 이들 약물은 다양한 메카니즘을 통해 골격근에서 글루코스 이용을 증가시킴으로써 인슐린 분비를 자극하지 않고도 인슐린 내성을 경감시키고 글루코스 수준을 낮추는 선택적 PPARγ 효능제 (문헌 [Forman et al., Cell, 83:803-812 (1995)])이다 (문헌 [Olefsky and Saltiel, Trends Endo. and Metobolism, 11:362-367 (2000)]; [Willson et al., Annu. Rev. Biochem. 70:341-67 (2001)]에서 고찰되었음).

지방세포 분화는 구성적으로 활성 Akt에 의해 자극된다 (문헌 [Magun et al., Endocrinology 137:3590-3593 (1996)]). 혈청 렙틴 수준은 지방조직의 질량에 의존하고, Akt에 의해 상향조절된다 (문헌 [Barthel et al., Endocrinology, 138:3559-3562 (1997)]). dkk-1 형질전환 동물에서 순환중인 렙틴 수준의 저하는 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고 지방조직에서 지방조직 질량의 감소 및(또는) Akt 활성의 감소의 직접적인 효과일 수 있다.

Akt의 가장 잘 연구된 기능은 글루코스 대사에서 그의 역할이다. 인슐린에 대한 반응으로, Akt는 IRS-1 기능을 조절하고 (문헌 [Paz et al., J. Biol. Chem., 274:28816-28822 (1999)]), GSK3β의 인산화 및 활성을 조절하며 (문헌 [Ross etal., Mol. Cell. Biol., 19:8433-8441 (1999)]; [Summers et al., J. Biol. Chem., 274:17934-17940 (1999)]), GLUT-4 소포 (vesicle)의 성분을 인산화시키고, 세포 표면으로의 GLUT4 전위를 조절한다 (문헌 [Kupriyanova 및 Kandror, J. Biol. Chem., 274:1458-1464 (1999)]; [Wang et al., Mol. Cell. Biol., 19:4008-4018 (1999)]). Akt의 인산화 감소 [Krook et al., 1998, 상기 문헌]는 일부 제2형 당뇨병 대상체의 골격근 및 비만 동물에서 관찰되었다 (문헌 [Carvalho et al., Diabetologia, 43:1107-1115 (2000)]; [Kim et al., 상기 문헌]; [Shao et al., J. Endocrinol., 167:107-115 (2000)]). 또한, Akt2 유전자가 불활성화된 마우스는 제2형 당뇨병 표현형을 가졌다 (문헌 [Cho et al., Science, 292:1728-1731 (2000)]). 추가로, 생체내 Akt 활성은 변화된 글루코스 대사, 예컨대 고혈당증 (문헌 [Kurowski et al., Diabetes, 48:658-663 (1999)]; [Nawano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:252-256 (1999)]; [Oku et al., 상기 문헌]), 근육 손상 (문헌 [Del Aguila et al., Am. J. Physio. Endocrinol. Metab., 279:E206-212 (2000)]), 글리코겐 함량 (문헌 [Derave et al., Am. J. Physio. Endocrinol. Metab., 279:E947-955 (2000)]), 및 고지방 식사 (문헌 [Tremblay et al., Diabetes, 50:19011910 (2001)])을 야기시키는 여러 상태에 의해 영향을 받는다.

분화 및 글루코스 대사에 있어서의 역할 뿐만 아니라, Akt는 인슐린 분비 췌장 β-세포의 증식 (문헌 [Holst et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 250:181-186 (1998)]; [Trumper et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 921:242-250 (2000)]; [Tuttle et al., Nat. Med., 7:1133-1137 (2001)]; [Bernal-Mizrachi etal., J. Clin. Invest., 108:1631-1638 (2001)]) 및 생존 (문헌 [Aikin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 277:455-461 (2000)])에도 핵심적인 역할을 하는 것으로 믿어진다. 추가로, 인슐린 신호전달에서 초기 단계의 손상은 β-세포 생존을 감소시킬 수 있고, PI3-키나제/Akt 생존 경로에 영향을 미침으로써 인슐린의 항아팝토시스 (antiapoptosis) 효과에 대한 내성을 야기시킨다 (문헌 [Federici et al., Faseb J., 15:22-24 (2001)]). β-세포에서 Akt1의 과다발현 결과, β-세포 크기 및 전체 섬 (islet) 질량 둘 다 상당히 증가되고, 이는 혈청 인슐린 수준의 증가, 글루코스 허용성의 개선, 및 스트렙토조톡신 유도된 당뇨병에 대한 내성을 수반한다 ([Tuttle et al., 상기 문헌]; [Bernal-Mizrachi et al., 상기 문헌]).

여기서, 분비된 인슐린 수준의 상당한 저하는 Dkk-1을 주사한지 8일 후에 관찰되었고, 근육에서 dkk-1을 과다발현하는 형질전환 동물에서는 효과가 보다 적었다. 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고, 주사한 동물에서 보다 강한 효과는 Akt의 억제를 통한 췌장 β-세포 생존에 대한 직접적인 효과의 결과일 수 있는 반면, 형질전환 동물에서는 보상성 메카니즘으로 인해 또는 근육에서 Dkk-1의 보다 국소화된 효과에 의해 인슐린 수준에서 차이가 보다 적을 수 있다. Akt가 섬 세포 증식 및 인슐린 생성을 자극하는 것으로 알려져 있고, 본원의 데이타는 Dkk-1을 주사한 형질전환 마우스가 보다 낮은 인슐린 수준을 나타낸다는 것을 최초로 보였기 때문에, 이제 Dkk-1에 대한 길항제는 저인슐린혈증의 치료에 유용한 것으로 밝혀지고, 반대로 Dkk-1 자체는 고인슐린혈증의 치료에 유용한 것으로 밝혀진 것이다.

결론

Dkk-1은 근육에서 단백질을 과다발현하는 형질전환 마우스에서 뿐만 아니라 L6 근육 세포에서 글루코스 대사에 영향을 미친다. Dkk-1을 사용한 근육 세포의 처리 결과, 기본적인 글루코스 흡수 및 인슐린 자극된 글루코스 흡수가 감소되었다. 이러한 효과는 단기간 및 장기간 처리 둘 다에서 관찰되었으며, 이는 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않고 Dkk-1이 인슐린 신호전달 경로에서 단백질의 발현 수준 뿐만 아니라 활성에도 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. 이러한 관찰과 일치하게, 단백질을 과다발현하는 형질전환 마우스는 글루코스 허용성이 저하되었으나, 혈청 인슐린 수준은 영향을 받지 않았다. 추가로, Dkk-1을 주사한 형질전환 동물은 보다 낮은 인슐린 수준을 나타내었다. Dkk-1은 또한 근육 세포 분화를 촉진시켰다. 마지막으로, Dkk-1은 체중 및 지방 패드를 감소시키는 것으로 보인다. 상기 관찰은 Dkk-1이 근육 퇴행, 인슐린 내성 (NIDDM의 대부분의 형태의 핵심적인 특징임) 및 저인슐린혈증을 유도하고, 지방 조직 및 세포에서 체중 감량 또는 저하를 촉진시킨다는 것을 입증한다. 따라서, Dkk-1에 대한 길항제는 인슐린 내성, 저인슐린혈증 및 근육 퇴행의 치료에 유용할 것이고, Dkk-1은 비만 및 고인슐린혈증의 치료에 유용할 뿐만 아니라, 이러한 상태에 대한 분석에서 진단 마커로서도 유용하다. 또한, Dkk-1에 대한 길항제는 미국 특허 제6,187,991호에 개시된 형질전환 동물 모델에서 당뇨병 표현형의 진행을 억제할 것으로 기대된다.

<실시예 2>

항-Dkk-1 모노클로날 항체의 개발

5마리의 암컷 Balb/c 마우스 (챨스 리버 래버러토리즈 (Charles RiverLaboratories), 델라웨어주 윌밍톤 소재)를 배큘로바이러스에서 과다발현된 정제된 재조합 폴리히스티딘-태그 부착 (HIS8) 인간 Dkk-1으로 과면역화시키고 (WO 99/46281), 리비 (Ribi) 면역보강제 (리비 이뮤노켐 리써치 인크. (Ribi Immunochem Research, Inc.), 미주리주 해밀톤 소재)로 희석하였다. 각 동물에 대해 50 ㎕를 사용하여 발바닥을 통해 투여함으로써 주 2회 면역화시켰다. 5회 주사 후, 높은 항-Dkk-1 항체 역가를 나타내는 5마리 마우스의 림프절로부터의 B-세포를 문헌 [Kohler and Milstein, 상기 문헌] 및 [Hongo et al., Hybridoma, 14:253-260 (1995)]에 기재된 프로토콜을 이용하여 마우스 골수종 세포 (X63.Ag8.653; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection), 버지니아주 매나서스 소재)와 융합시켰다. 10 내지 14일 후, 상층액을 수거하고, 직접 ELISA에 의해 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 제한 희석에 의한 제2 서브클로닝 후 최대의 면역결합을 나타내는 7개의 양성 클론 (하기 언급된 바와 같이 ATCC에 기탁되었음)을 MAb의 생체내 생성을 위해 PRISTANE^TM2,6,10,14-테트라메틸펜타칸 (알드리치 케미컬 캄파니 (Aldrich Chemical Co.)) 프라이밍된 마우스 (문헌 [Freund and Blair, J. Immunol., 129:2826-2830 (1982)])에 주사하였다. 복수액을 모아서 [Hongo et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 단백질 A 친화도 크로마토그래피 (PHARMACIA^TM고속 단백질 액체 크로마토그래피 [FPLC]; 파마시아 앤드 업존 (Pharmacia and Upjohn))에 의해 정제하였다. 정제된 항체 제제를 멸균 여과하고 (0.2 ㎛ 공극; 날젠 (Nalgene), 뉴욕주 로체스터 소재), 4℃에서 인산염 완충된 염수 (PBS)에 저장하였다.

7개의 모든 항체 제제는 웨스턴 면역블롯에서 Dkk-1에 결합되었다.

L6 세포를 분화시켜, 48시간 동안 Dkk-1의 부재하에 (대조군) 또는 40 nM Dkk-1의 존재하에 (항-Dkk-1 항체 1G1.2D12.2D11 (ATCC 번호 PTA-3086) 0.5 ㎍/mL을 첨가 또는 무첨가) 처리하였다. L6 세포에서 기본적인 글루코스 흡수 및 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 도 17은 인슐린 부재하 및 존재하에서 모노클로날 항체가 L6 세포에서 Dkk-1 매개된 글루코스 흡수의 감소를 중화시켰음을 보여준다.

물질의 기탁

다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 매나서스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.

명칭 ATCC 기탁 번호 기탁일

DKK1.MAB3139.8C11.2G11.1D1 PTA-30842001년 2월 21일

DKK1.MAB3143.4C7.2H10.2G1 PTA-30852001년 2월 21일

DKK1.MAB3142.1G1.2D12.2D11 PTA-30862001년 2월 21일

DKK1.MAB3141.5B12.2C5.2A5 PTA-30872001년 2월 21일

DKK1.MAB3138.7C11.2H6.2A8 PTA-30882001년 2월 21일

DKK1.MAB3140.7B2.2A6.2H4 PTA-30892001년 2월 21일

DKK1.MAB3144.5A2.2A8.1C3 PTA-30972001년 2월 21일

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물이 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

본 발명의 원칙적이고 바람직한 실시양태 및 작업 방식은 상기 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 본원에서 보호받고자 하는 발명은 제한하기 위해서가 아니라 설명을 위한 것이기 때문에 개시된 특정 형태만으로 한정되는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 발명의 개념을 벗어나지 않고 당업자에 의해 변형 및 변화가 행해질 수 있다.

Claims

인슐린 내성 또는 저인슐린혈증의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 Dickkopf-1 (Dkk-1)에 대한 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 포유동물이 인슐린-비의존성 진성 당뇨병 (NIDDM)에 걸린 것인 방법.
제1항에 있어서, 포유동물이 인간이고, 길항제가 인간 Dkk-1에 대한 길항제인 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 Dkk-1에 결합하는 항체인 방법.
제4항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제5항에 있어서, 항체가 ATCC 기탁번호 PTA-3086의 하이브리도마로부터 생산된 것인 방법.
제1항에 있어서, 투여가 전신 투여인 방법.
제1항에 있어서, 포유동물에게 유효량의 인슐린-내성 치료제를 투여하는 것을 더 포함하여 인슐린 내성을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 포유동물에게 유효량의 인슐린을 투여하는 것을 더 포함하여 저인슐린혈증을 치료하는 방법.
(a) 포유동물로부터의 샘플 중에서 Dickkopf-1 (Dkk-1)의 양을 측정하는 단계, 및

(b) 단계 (a)에서 측정된 양을 표준 샘플에 존재하는 Dkk-1의 양과 비교하여, 단계 (a)에서 측정된 Dkk-1의 양 증가 수준이 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증의 지표가 되는 단계

를 포함하는, 상기 포유동물에서 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증의 존재 또는 징후를 검출하는 방법.
제10항에 있어서, 측정이 항-Dkk-1 항체를 사용하여 면역분석법으로 수행되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 항-Dkk-1 항체가 표지 (label)를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 표지가 형광 표지, 방사성 표지 및 효소 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제11항에 있어서, 면역분석법이 방사성면역분석법, 효소 면역분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법, 샌드위치 면역분석법, 침전 분석법, 면역방사성 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 면역전기영동 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제10항에 있어서, 인슐린 내성이 인슐린-비의존성 진성 당뇨병인 방법.
제10항에 있어서, 포유동물이 인간이고, 인간 Dkk-1을 측정하는 것인 방법.
(a) Dkk-1에 대한 길항제를 포함하는 용기, 및

(b) 길항제를 사용하여 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증을 치료하기 위한 지침

을 포함하는, 인슐린 내성 또는 저인슐린혈증 치료용 킷트.
제17항에 있어서, 길항제가 Dkk-1에 결합하는 항체인 킷트.
제18항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 킷트.
제18항에 있어서, 항체가 인간 Dkk-1에 결합하는 것인 킷트.
제17항에 있어서, 인슐린-비의존성 당뇨병 치료용 킷트.
제17항에 있어서, 인슐린 내성을 치료하는 경우에 인슐린-내성 치료제를 포함하는 용기, 또는 저인슐린혈증을 치료하는 경우에 인슐린을 포함하는 용기를 더 포함하는 킷트.
ATCC 기탁번호 PTA-3084, PTA-3085, PTA-3086, PTA-3087, PTA-3088, PTA-3089 및 PTA-3097로 이루어진 군으로부터 선택되는 하이브리도마.
제23항에 있어서, ATCC 기탁번호가 PTA-3086인 하이브리도마.
제23항의 하이브리도마로부터 생산되는 항체.
비만 또는 고인슐린혈증의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 Dickkopf-1 (Dkk-1)을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 비만 또는 고인슐린혈증을 치료하는 방법.
제26항에 있어서, 포유동물이 인간이고, Dkk-1이 인간 Dkk-1인 방법.
제26항에 있어서, 투여가 전신 투여인 방법.
제26항에 있어서, 유효량의 체중 감량제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
(a) 포유동물로부터의 샘플 중에서 Dickkopf-1 (Dkk-1)의 양을 측정하는 단계, 및

(b) 단계 (a)에서 측정된 양을 표준 샘플에 존재하는 Dkk-1의 양과 비교하여, 단계 (a)에서 측정된 Dkk-1의 양 감소 수준이 비만 또는 고인슐린혈증의 지표가 되는 단계

를 포함하는, 상기 포유동물에서 비만 또는 고인슐린혈증의 존재 또는 징후를 검출하는 방법.
제30항에 있어서, 측정이 항-Dkk-1 항체를 사용하여 면역분석법으로 수행되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 항-Dkk-1 항체가 표지를 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 표지가 형광 표지, 방사성 표지 및 효소 표지로 이루어진군으로부터 선택된 것인 방법.
제31항에 있어서, 면역분석법이 방사성면역분석법, 효소 면역분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법, 샌드위치 면역분석법, 침전 분석법, 면역방사성 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 면역전기영동 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제30항에 있어서, 포유동물이 인간이고, 인간 Dkk-1을 측정하는 것인 방법.
(a) Dkk-1을 포함하는 용기, 및

(b) Dkk-1을 사용하여 비만 또는 고인슐린혈증을 치료하기 위한 지침

을 포함하는, 비만 또는 고인슐린혈증 치료용 킷트.
제36항에 있어서, Dkk-1이 인간 Dkk-1인 킷트.
제36항에 있어서, 비만을 치료하는 경우에 체중 감량제를 포함하는 용기, 또는 고인슐린혈증을 치료하는 경우에 디아족시드를 포함하는 용기를 더 포함하는 킷트.
(a) Dickkopf-1 (Dkk-1)에 결합하는 항체를 포함하는 용기,

(b) Dkk-1을 함유하는 표준 샘플을 포함하는 용기,

(c) 상기 항체 및 표준 샘플을 사용하여 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만을 검출하기 위한 지침

을 포함하는 킷트이며, 여기서 Dkk-1에 결합하는 상기 항체가 검출가능하게 표지된 것이거나, 또는 이 킷트가 검출가능하게 표지되어 Dkk-1에 결합하거나 Dkk-1이 결합하는 항체에 결합하는 제2 항체를 포함하는 다른 용기를 더 포함하는, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 저인슐린혈증 또는 비만의 존재 또는 징후 검출용 진단 킷트.
제39항에 있어서, Dkk-1에 결합하는 항체가 모노클로날 항체인 킷트.
제39항에 있어서, Dkk-1이 인간 Dkk-1이고, 킷트가 인슐린-비의존성 당뇨병 또는 비만 검출용인 킷트.
포유동물에게 유효량의 Dkk-1에 대한 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 근육을 복구 또는 재생시키는 방법.
제42항에 있어서, 길항제가 Dkk-1에 결합하는 항체인 방법.
제43항에 있어서, 포유동물이 인간이고, 항체가 인간 Dkk-1에 결합하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
(a) Dkk-1에 대한 길항제를 포함하는 용기, 및

(b) 길항제를 사용하여 포유동물에서 근육을 복구 또는 재생시키기 위한 지침

을 포함하는, 근육의 복구 또는 재생용 킷트.
면역보강제 중에 희석된 태그 부착 Dkk-1로 마우스를 과면역화시키고; 항-Dkk-1 항체 역가를 갖는 상기 마우스로부터의 B 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시키고 상층액을 수득하고; 상기 상층액을 수거하고; 수거된 상층액을 항체 생산에 대해 스크리닝하고; 제2회 서브클로닝 후에 가장 높은 면역결합을 나타내는 양성 클론을, 생체내 모노클로날 항체 생산을 위해 프라이밍된 (primed) 마우스에 주사하고; 상기 마우스로부터 복수액을 수집하고; 복수액 수집물을 정제하여 항체 제제를 제조함으로써 제조된 모노클로날 항체 제제.
dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물 (transgenic animal)에게 후보 약물을 투여하고, 상기 동물의 혈액으로부터의 글루코스 제거율, 상기 동물에서 순환중인 인슐린의 양, 또는 근육 분화 각각에 대한 상기 약물의 효과를 측정하는 것을 포함하는, 인슐린 내성, 저인슐린혈증 또는 근육 복구에 대한 상기후보 약물의 효과를 평가하는 방법.
dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 2원 형질전환 동물에게 후보 약물을 투여하고, 상기 동물에서 비만의 주요 특성 또는 인슐린의 양에 대한 상기 약물의 효과를 측정하는 것을 포함하는, 비만 또는 고인슐린혈증에 대한 상기 후보 약물의 효과를 평가하는 방법.
dkk-1핵산을 과다발현하는 인간 이외의 형질전환 동물.
제50항에 있어서, 설치류인 동물.
제50항에 있어서, 마우스인 동물.