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KR20030084998A - 히드록시알킬 전분 및 활성제의 결합물 - Google Patents

히드록시알킬 전분 및 활성제의 결합물 Download PDF

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KR20030084998A
KR20030084998A KR10-2003-7012061A KR20037012061A KR20030084998A KR 20030084998 A KR20030084998 A KR 20030084998A KR 20037012061 A KR20037012061 A KR 20037012061A KR 20030084998 A KR20030084998 A KR 20030084998A
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KR
South Korea
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compound
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tumor
pharmaceutical composition
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KR10-2003-7012061A
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English (en)
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클라우스 좀머마이어
울프람 아이히너
스벤 프라이
코넬리우스 융하인리히
롤랜드 샤프페
카타리나 루터벡
Original Assignee
프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하
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Publication date
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Abstract

본 발명은 히드록시알킬 전분(HAS) 및 활성제의 결합물을 포함하는 화합물에 관한 것으로, 여기서 히드록시알킬 전분(HAS)은 직접 또는 링커를 통해 활성제에 공유 결합되어 있다. 또한 본 발명은 공유 HAS-활성제 결합물의 생성 방법에 관한 것으로, 여기서 HAS 및 활성제는 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 하는 반응 매질내에서 서로 반응한다.

Description

히드록시알킬 전분 및 활성제의 결합물{CONJUGATE OF HYDROXYALKYL STARCH AND AN ACTIVE AGENT}
약제의 많은 활성 성분의 임상적 용도는 많은 문제점들에 의해 불리하게 영향을 받고 있다[참고문헌: Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,Vol.9 (3, 4), (1992) p.p. 249-304]. 비경구적으로 투여된 천연 단백질은 예를 들면 세망내피계(reticuloendothelial system), 간, 신장 및 비장에 의해 배설된다. 배설은 탄수화물 쇄의 하전, 단백질용 세포 수용체의 존재 및 분자의 모양과 크기에 달려있다. 신장 사구체 여과의 배설 범위는 예를 들어 대략 67 kD이다.
단백질 분해의 결과로서, 생물학적 활성의 급속한 감소 또한 관찰될 수 있다.
다른 제조합 단백질 뿐만 아니라 세균에 의해 발현되는 단백질은 증가된 면역원성을 가질 수 있고 생명을 위협하는 과민 반응을 유발할 수 있다. 해당 반응들은 이러한 제품의 의학적 사용을 자연적으로 막는다.
이러한 이유 때문에, 화학적인 변형, 특히 중합화 또는 거대분자 중합체와의 결합에 의한 외인성 단백질의 특성 개선에 대한 연구가 70년대 말부터 이미 당 분야에서 체계적으로 수행되어왔다. 많은 연구 과제들이 한편으로는 단백질 또는 다른 활성 성분으로부터 그리고 다른 한편으로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 부터의 결합물의 제조에 집중되었다(US 4,179,337). 각각의 결합 반응으로부터 예상되는 잇점은 단백질의 개선된 생체내 반감기, 감소된 독성, 활성 성분의 개선된 안정성 및 개선된 용해도를 포함한다[참고문헌: Abuchowski and Davis, Enzymes as drugs, Holcenberg and Rubberts, Publisher, p.p. 367-383, John Wiley & Sons N.Y. (1981)].
그러나, 단백질의 활성 그룹이 PEG와의 결합에 의해 불활성화되거나 상기 반응들은 적절한 수율로 반응 생성물을 제공하지 못했기 때문에, 활성 성분들을 결합시키는 방법은 문제가 있는 것으로 입증되었다. 활성 성분의 활성도에 불리하게 영향을 끼치지 않는 특정 결합을 얻기 위해서, 활성 그룹들을 PEG 또는 활성 성분으로 도입하거나 또는 화합물을 링커와 결합시켰다. 이러한 목적을 위해서, PEG에는 결합될 수 있는 단백질의 그룹에 추후 공유 결합되는 활성 그룹이 통상 제공된다.
따라서 예를 들어, PEG와 결합 후에, 항체 및 그의 단편의 결합 활성의 손실이 문헌 [Kitamura et al., Cancer Res., Vol. 51 (1991), p.p. 4310-4315; 및 Pedley, et al., Br. J. Cancer, Vol. 79 (1994), p.p. 1126-1130)에 기재되어 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 채프만 등[참고문헌: Nature Biotech., Vol. 17 (1999), p.p. 780-783]은 PEG를 항체의 특정 결합 부위에 결합시키는 것을 제안한다.
또한, 결합 파트너의 활성 손실이 국제특허 WO 95/13090에 기술되어 있다. 해결책으로서, 반응성 그룹을 갖는 PEG를 활성화하여 이 반응성 그룹을 통해 계면활성제의 존재하에 PEG를-인터페론과 결합시키는 것이 제안되어 있다. 바람직한 반응성 그룹으로서, 명명된 조건하에 리진의 ε-아미노 그룹과 우레탄 결합을 형성하는 것으로 알려진 N-숙신이미드 카보네이트(N-succinimide carbonate)가 있다.
또한 국제특허 WO 96/41813은 중합체(특히 PEG)가 특정 부위에서 유도체화(derivatized)되어 폴리펩티드와 결합하는 중합체-폴리펩티드 결합물의 제조 방법을 개시한다. 아미노-옥시-아세틸 그룹이 바람직하게는 PEG내로 도입되고 이 화합물은 폴리펩티드, 특히 IL-8, hG-CSF 및 IL-1에 결합된다.
해당 결합물의 다수의 예들이 문헌[PEG-인슐린 결합물은 미국특허 4,179,337에, PEG-소-헤모글로빈 결합물은 미국특허 4,412,989에, PEG-리보뉴클리아제 결합물 및 PEG 활성산소 디스뮤타제 결합물은 Veronese et al. Applied Biochem. Biotech.,Vol.11, p. 141-152 (1995)에, PEG-IL-2 결합물 또는 PEG-IFN-결합물은 미국특허 4,766,106에, PEG-폴리믹신 결합물은 국제특허 WO 90/15628에, 그리고PEG-IL-2 결합물은 국제특허 WO 90/07939에 기재되어 있음]에 개시되어 있다. 몇몇 결합물은 현재 임상적으로 사용되고 있다. 예를 들어, PEG와의 결합물 형태로 인해 효소 아스파라기나제의 특성이 개선되었고, PEG-아스파라기나제 결합물은 암 치료용으로 온카스파(Oncaspar®)로 시판되고 있다. 최근에, PEG-결합된 G-CSF는 미국식약청(Pegfilgastim)에 의해 승인되었다. 다수의 보다 더 페길레이티드된 (pegylated) 제품들이, 예를 들어 PEG-CDP870, PEG-드로나비놀 등(참고: www.enzon.com 또는 www.inhale.com의 PEG-파이프라인)이 임상 개발 중이다.
단백질 뿐만 아니라 다른 화합물 또한 이러한 계획에 따라 PEG 및 다른 중합체에 결합되었다. 국제특허 WO 97/33552 및 97/38727은 예를 들어 PEG와 파클리탁셀의 결합 및 종양 치료를 위한 결합물의 사용을 개시한다. 종양 치료용 PEG-캄프토테신 결합물의 사용은 엔존에 의해 임상시험 제1상 단계에서 연구되고 있다.
또한 항생제는 PEG에 결합되어 왔다. 예를 들어, 다울링과 러셀은 옥시테트라사이클린-PEG 결합물의 약물동력학을 기술한다[참고문헌: J. Vet Pharmacol. Ther., vol. 23 (2000), p. 107-110]. 당 분야에서, 항생제는 새로운 작용을 얻기 위해 다른 방법을 사용하여 유도체화되어 왔다. 예를 들어, 프로카인 페니실린 유도체, 즉 프로카인 염기와 페니실린의 염인 데포 페니실린(depot penicillin)이 생산되었다. 이 유도체는 확장된 활성을 가지며, 예를 들어 매독의 치료에 사용된다.
또한 둘 이상의 화합물을 갖는 결합 반응이 보여졌다. 예를 들어, 국제특허 WO 93/23062는 B 세포 림프종에 대한 항체, 활성화된 PEG 및 톡신으로부터의 결합생성물의 제조를 개시한다.
그러나 PEG-활성 성분 결합물은 생체내 분해 경로가 기술된 천연 구조를 가지고 있지 않다. 이러한 이유로 인해 다른 것들 중에서 PEG 결합물이외에 다른 결합물 및 단백질 중합체가 상기 언급된 문제를 해결하기 위해 생산되어왔다. 따라서, 다른 단백질을 교차결합시키고 거대분자에 단백질을 결합시키는 다수의 방법들이 있다[참고문헌: Wong, S.S. 요약서, "Chemistry of protein conjugation and cross linking", CRCS, Inc. (1993년)].
히드록시에틸 전분(HES)은 자연적으로 생기는 아밀로펙틴의 유도체이고-아밀라제에 의해 체내에서 분해된다. HES-단백질 결합물의 제조는 문헌(독일특허 26 16 086 또는 26 46 854에 HES-헤모글로빈 결합물이 개시되어 있음)에 이미 기술되어 있다.
헤모글로빈은 혈액-대체 및 산소-운반제(소위, "헤모글로빈-기초-산소 담체, HBOC"라고 불리움)로서 의학적으로 매우 중요한 단백질이다. 그러나, 비록 생성물에 대한 수요가 일찌기 인식되었다고 하더라도[참고문헌: Rabiner, J. Exp. Med.126,(1967) 1127], 알려진 HBOC 생성물 중 아직까지 승인된 약품으로 알려진 것은 없다.
천연 헤모글로빈은 보철 그룹으로서 헤모(haeme)와 각각 결합하는 두개의와펩티드 쇄로 구성된다. 그러나 분리된 헤모글로빈 분자는 매우 불안정하고 좀더 안정된,이량체(분자량 32 kDa)로 급속도로 분해된다. 이량체가 신장을통해 급속도로 제거되기 때문에, 혈액순환에서 분리된 헤모글로빈의 생물학적 반감기는 약 1시간이다. 이 과정에서, 이량체는 신장독성 부작용을 낳는다[참고문헌: Bunn & Jandl, J. Exp. Med.129,(1967) p.p. 925-934]. 그러므로 유도된 헤모글로빈 분자들에 대한 개발연구는 주로 헤모글로빈의 분자내 교차결합, 중합체성 HOBC 형을 형성하기 위한 분자간 교차결합 및/또는 중합체와의 결합 쪽으로 향해졌다.
공지된 헤모글로빈 결합물은 예를 들어 슈와 윙의 문헌[참고문헌: Meth. in Enzymol., 231 (1994), p.p. 308-322]과 독일특허 26 16 086 및 26 46 854에 기술되어있다. 후자는, HES를 우선 헤모글로빈이 결합하는 나트륨 과요오드산염 디알데히드 형과 반응시키므로써 헤모글로빈이 HES에 결합되는 방법을 기술한다. 반면에, 독일특허 26 16 086은 먼저 교차결합제(예를 들어, 브롬시안)를 HES에 결합시키고 그 다음 헤모글로빈을 중간 생성물에 결합시키는 방법에 따라 HES와 헤모글로빈의 결합을 개시한다.
HES는 최대 95% 농도로 옥수수 전분에서 생기는 탄수화물 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 유리한 유동성 특성을 가지며 최근에는 부피-대체제 로서 그리고 혈액희석(haemodilution) 치료용으로 임상에서 사용된다[참고문헌: Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie,Vol. 8(8), (1987), p.p. 271-278 및 Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41, (1991) p.p. 494-498].
아밀로펙틴은 글루코스 단위로 구성된다. 여기서, 주 쇄는-1,4-글리코시드 결합을 가지지만-1,6-글리코시드 결합이 분지화 부위에 존재한다. 이 분자의물리적-화학적 특성은 본질적으로 글리코시드 결합 형태에 의해 결정된다. 분지화된-1,4-글리코시드 결합 때문에 나선형 구조가 턴(turn) 당 대략 6 글루코스 단량체를 가지고 형성된다.
중합체의 물리-화학적 및 생화학적 특성들은 치환에 의해 변형될 수 있다. 히드록시에틸 그룹의 도입은 알칼리성 히드록시에틸화에 의해 이루어질 수 있다. 히드록시에틸화와 비교하여 비치환된 글루코스 단량체내의 관련 히드록실 그룹의 다른 반응성은 반응 조건을 통해 이용될 수 있으며, 따라서 치환 형태에 제한된 영향을 미치는 것이 가능하다.
그러므로, HES는 본질적으로 분자량 분포 및 치환도에 의해 특징지워진다. 치환도는 모든 글루코스 단위의 치환된 글루코스 단량체의 비율을 언급하는 DS "치환도"로서 또는 글루코스 단위 당 히드록시에틸 그룹의 수를 주는 MS "몰 치환"으로 나타낼 수 있다.
HES 용액은 치환 형태 뿐만 아니라 중합 정도, 분지화 부위의 수와 배열, 중합도에 대해 개별 분자가 서로 상이한 폴리디스퍼스(polydisperse) 조성물로서 존재한다. HES는 다른 분자량을 갖는 화합물들의 혼합물이다. 따라서, 특정 HES 용액은 통계학적 변수들을 사용하여 평균 분자량에 의해 결정된다. Mn은 분자의 수에 대한 단순한 연산 평균으로서 계산되는 반면, Mw, 중량 평균은 질량-관련 측정 변수를 나타낸다.
그러나 HES에 대한 단백질의 선택적 화학 결합은 HES가 선택적으로 활성화되지 않는다는 사실로 인해 지금까지 방해를 받았다. 따라서 당 분야에서 공지된 단백질-HES 결합물은 헤모글로빈에 대한 브롬시안-활성화된 HES의 비-선택적인 결합으로부터 나온다(참고: 독일특허 26 16 086). 해당 방법은 불균일 특성 및 잠재적 으로 독성인 부작용을 갖는 폴리디스퍼스 생성물을 생성할 수 있다.
이 방법은 하시모토에 의해 처음으로 기술되었다[참고문헌: Hashimoto et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern,Vol. 9, (1992) p.p. 1271-1279]. 상기 문헌에서는, 사카라이드의 환원 알데히드 말단 그룹이 선택적으로 산화되어 반응성 에스테르(락톤)가 얻어진다.
이러한 방법을 기초로, 국제특허 WO 98/01158은 헤모글로빈 및 HES가 헤모글로빈의 유리 아미노 그룹과 산화된 형태로 존재하는 HES의 환원 말단 그룹 사이의 아미드 결합을 통해 선택적으로 서로 연결되어 있는 헤모글로빈-히드록시에틸 전분이 수득될 수 있음을 개시한다. 그러나, 이 두 방법, 하시모토의 방법과 국제특허 WO 98/01158의 방법은 둘 다 유기 용매에서 사카라이드 (HES) 및 단백질 (헤모글로빈) 사이에서의 반응을 기초로 한다. 디메틸 술폭시드 (DMSO)가 사실상 문헌에서 사용되었다.
당 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 많은 단백질이 수용액에서 전환되지 않는 유기 용매내 구조 변화의 대상이라는 사실을 잘 알고 있다. 규칙적으로, 활성의 손실은 구조 변화와 함께 일어난다. 모든 경우에, 유기 용매의 잔류 부분조차 의도된 의학적 사용에 허용되지 않을 수도 있기 때문에, 유기 용매의 값비싼 제거가 필요하다. 불순물 및 단백질 구조 변화의 잠재적 위험조차 의도된 용도와 관련하여 배제되어야 한다.
본 발명은 히드록시알킬 전분(HAS)과 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물에 관한 것으로, 여기에서 히드록시알킬 전분(HAS)은 직접 또는 링커를 통해 활성 성분에 결합되어 있다. 또한 본 발명은 HAS 및 활성 성분이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물인 반응 매질내에서 서로 반응하는 공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결합물의 의학적 용도에 관한 것이다.
도1은 방법 A. III에 따른 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도2는 방법A. IV에 따른 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도3은 방법A. V에 따르며 2시간의 반응시간을 갖는 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도4는 방법 A. V에 따르며 반응이 밤새 진행된 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도5는 2시간의 반응후(도 5a) 및 밤새 반응후(도 5b) 방법 A. V에 따른 옥스-HES 10 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도6은 24시간의 반응 시간후 방법 A. VII에 따른 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도7은 방법 B. V에 따른 옥스-HES 130 kD와 HSA 간의 결합 반응의 GPC 크로마토그램이다.
도8은 HES와 HSA 간의 다른 결합 반응들의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western Blot)이다.
도9는 HES와 HSA 간의 다른 결합 반응들의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western Blot)이다.
도10은 HES-DNA 결합물의 제조에 대한 반응 도식이다.
도11은 제한 효소를 사용한 분해전 및 분해후 HES-DNA 결합물을 보여주는 겔의 상이다.
본 발명의 목적은 매일 임상 실습에서 사용될 수 있는 생물학적으로 활성인결합물인 개선된 히드록시알킬 전분-활성 성분 결합물과 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 부산물이 생성물의 후속 정제과정에 의미있는 정도로 불리하게 영향을 끼치므로, 이들 부산물이 의미있는 양으로 생성되지 않는 히드록시알킬 전분-활성 성분 결합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적은 히드록시알킬 전분이 직접 또는 링커를 통해 활성 성분과 공유 결합되어 있는 히드록시알킬 전분과 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물에 의해 놀랍게도 해결되었다. 예를 들어, 해당 HAS-활성 성분 결합물은 HAS 및 활성 성분이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물인 반응 매질에서 결합되는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
아울러, 본 발명은 HAS 및 적어도 하나의 활성 성분이 수성 반응 매질내에서 결합되어 있고 반응 매질이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 하는, 공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, HAS가 활성 성분에 결합되기 전에 산화되며, 환원 말단 그룹의 특정 산화가 특히 바람직하다. 또는, 결합은 중간 생성물로서 아민 그룹-운반 활성 성분과 HAS간 쉬프 염기의 형성을 통해 일어날 수 있다. 이 중간 생성물은 이어 환원되어, 메틸렌 아민 그룹을 형성한다.
본 발명은 히드록시알킬 전분이 직접 또는 링커를 통해 활성 성분에 공유 결합되어 있는, 히드록시알킬 전분 및 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물을 처음으로 제공한다. 추가로, 본 발명은 HAS 및 적어도 하나의 활성 성분이 수성 반응 매질내에서 서로 반응하는 방법에 의해 제조될 수 있는 HAS-활성 성분 결합물을 제공한다. 추가로 본 발명은 반응 매질이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 한다.
본 발명의 명세서에서, 만약 화합물이 치료 또는 진단 목적용 조성물의 활성 성분으로 적합하다면 화학 화합물은 활성 성분으로 언급된다. 바람직하게는, 활성 성분은 약품의 활성 성분, 즉 대상으로의 투여후 생리학적 효과를 얻는 약물 형태의 화합물이다.
승인된 약품의 개요 및 그의 활성 성분은 약전에 나와 있다. 약전에 명명된 모든 활성 성분은 본 발명에 따른 방법에 의한 HAS-활성 성분 결합물의 제조용으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에서, "활성 성분" 용어는, 비록 진단 또는 치료용으로 적합하다고 알려져 있다 하더라도, 상기 언급된 문제때문에 현재까지 이러한 목적으로 사용될 수 없었던 모든 화합물을 포함한다. 활성 성분은 바람직하게는 비타민, 백신, 톡신, 항생제(또는 항감염제), 항부정맥제, 식욕 억제제, 마취제, 진통제, 항류머티즘제, 항알러지제, 항천식제, 항우울제, 항당뇨제, 항히스타민제, 항고혈압제 또는 항종양제이다. 구조적으로, 활성 성분은 예를 들어, 호르몬, 스테로이드, 지질, 단백질, 올리고- 또는 폴리펩티드, 핵산, 특히 D-DNA, L-DNA, D-RNA 또는 L-RNA와 같은 D- 또는 L-핵산이다. HAS 결합 파트너로서 단백질, 펩티드, D-또는 L-핵산의 사용이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따라 제조된 결합물은 활성 성분의 활성 및 HAS의 이로운 특성을 보유할 뿐 아니라, 활성 성분의 개선된 생체내 반감기, 감소된 독성, 활성 성분의 개선된 안정성 및/또는 개선된 용해도를 나타내므로써 질병의 진단 및 치료의 용도로 유용하게 시용될 수 있다.
투여 후에, HAS 쇄는 혈장내에서-아밀라제에 의해 짧아진다. 따라서, 결합 생성물의 활성은 결합후 직접 천연 결합 생성물의 활성으로서 또는 결합 생성물의 생체내 대사후 대사된 결합 생성물의 활성으로서 결정될 수 있다. 생체내 대사는 시험관내 분해에 의해 촉진될 수 있다.
활성 성분의 활성도는 당 분야에서 이러한 화합물용으로 공지된 방법에 의해 결정된다. 예를 들면, 항종양제의 활성은 억제 농도(IC)로서 결정되고 항감염제의 활성은 최소 억제 농도(MIC)로서 결정된다. 바람직하게는, 이러한 결정은 적당한 표적 세포를 가지고 시험관내에서 수행된다[참고문헌: Chow et al., Haematologica, Volume 86 (2001), p.p. 485-493]. 시험관내의 효과는 관련 동물 모델에 의해 확인될 수 있다[참고문헌: 예를 들어, 신장 세포 종양의 쥐 모델이 기술된 Changnon et al.; BJU Int., Volume 88 (2001), p. 418-424].
비결합된 물질과 비교하여, 천연 결합 생성물은 증가된 또는 감소된 활성을 가질 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 활성은 5-배(fold) 이상 감소되지 않고, 더욱 바람직하게는 3- 또는 2-배 이상 감소되지 않는다. 물질대사된 생성물은 바람직하게는 결합전의 비-결합 물질의 활성과 비교될만한 활성을 가진다. 물질대사된 결합물은 활성 성분 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%를 가진다. 여기에서 적어도 95% 활성의 유지가 특히 바람직하다.
본 발명의 명세서에서, "히드록시알킬 전분" 용어는 탄소수 1 내지 3의 히드록시알킬 그룹으로 치환되는 전분 유도체를 언급하는데 사용된다. 따라서, "히드록시알킬 전분"으로 지정된 그룹은 히드록시메틸 전분, 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분을 포함한다. 본 발명의 모든 실시예에서 결합 파트너로서의 히드록시에틸 전분(HES)의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라, 히드록시에틸 전분이 1 내지 300 kDa의 평균 분자량을 갖는 것이 바람직하고, 여기에서 5 내지 200 kDa의 평균 분자량이 특히 바람직하다. 더 나아가, 히드록시에틸 전분은 0.1 내지 0.8의 치환 몰도(molar degree) 및 각각의 경우 히드록시에틸 그룹에 대해 2 내지 20 범위의 C2:C6치환비율을 가질 수 있다.
활성 성분을 HAS에 결합시키기 위해서는, 활성 그룹을 활성 성분 및/또는 HAS로 도입하는 것이 제1 단계로 필요하다. 해당 활성 그룹은 예를 들어 티올 그룹 또는 아미노 그룹일 수 있다(실시예 참조).
더욱이, 활성 성분 및 HAS는 링커의 사용에 의해 서로 결합될 수 있다. 어떠한 교차결합제라도 링커로서 사용될 수 있다. SMCC(숙신이미딜-4-(N-말레이미도-메틸)-시클로헥산-1-카복실레이트; 실시예 7 참조)와 같은 다수의 교차결합제는 시판되고 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다(Perbio 회사의 상품 카탈로그에 알파벳순으로 "교차결합제"가 나열되어 있으며 www.piercenet.com 참조).
본 발명의 실시예에 따르면, 아미노 당을 포함하는 수용성 항생제 유도체, 특히, HAS-다우노루비신 및 HAS-독소루비신 결합물 및 이들의 제조 방법은, 독일특허 101 29 369에 기술되어 있는 한, 본 발명의 범위에 포함되지 않는다.
바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 HAS와 항종양 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물 및 종양 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
종양 세포는 생리적 성장 조절에 더 이상 따르지 않으며, 따라서 증가된 세포분열속도를 갖는다는 점에서 정상 체세포와 다르다. 항종양 활성 성분의 독성 활성이 우선적으로 증식하는 세포로 향하기 때문에, 종양 치료에 있어 항종양 활성 성분의 치료 용도는 이러한 차이점에 근거한다. 그 결과로서, 화합물은 그들이 증식 세포에 대해 독성 활성을 나타낸다면 항종양 활성 성분 또는 세포증식억제제로서 지정된다[종양학의 기초 및 현행 치료학적 접근이 문헌(Internistic Oncology, Schmoll et al. (eds.), Springer, 1996)에 요약되어 있다].
이의 화학에 대해서, 항종양 활성 성분은 매우 이질적인(heterogeneous) 그룹을 나타낸다. 증식 억제 이외에도, 세포사멸의 유도 및 프로그램된 세포사가 최근의 논문에서 지난 수년간 중요시되어 왔다. 항종양 활성 성분의 분류는 예를 들어 관련 표적 분자를 기초로 하여 수행될 수 있다(Schmoll et al., 상기 참조):
1. 예를 들어, MTX, 5-FU, Ara-C 또는 히드록시 우레아와 같은 항대사제와 같은 DNA 생합성을 억제하는 화합물.
2. 예를 들어, 알킬화제, 백금 착물, 안트라사이클린류, 블레오마이신, 악티노마이신-D 또는 에피포도필로 톡신과 같은, 토포이소머라제(topoisomerase) 톡신,스트랜드간 교차 결합의 변형, 삽입, 스트랜드 브레이크 유도에 의해 DNA에 작용하는 화합물.
3. 예를 들어, 안트라사이클린, 블레오마이신, 악티노마이신-D 또는 항물질대사제을 포함하는 RNA내로의 삽입 또는 통합에 의해 mRNA-합성을 차단하므로써 RNA에 작용하는 화합물.
4. 예를 들어, 튜불린 중합의 억제 (예를 들어, 빈카 알칼로이드)에 의해, 단백질 교차결합 (예를 들어, 알킬화제)에 의해 또는 포스포릴화 (예를 들어, 단백질 키나제 C의 억제제)에 의해 수용체 결합 (예를 들어, 호르몬 또는 길항제)의 수준에서 단백질에 작용하는 화합물.
항종양 활성으로 인해, 모든 활성 성분은 빠르게 증식하는 조직의 억제로서 주로 발생하는 상당한 부작용을 가진다. 이러한 이유로 인해, 특히 에리트로-, 류코- 및 트롬보포이에시스는 억제되고 점막 상피의 성장이 불리하게 영향을 받는다. 결과적으로, 각각 위장 장애 또는 정자생성의 비가역적 손상 또는 무배란이 생길수 있다. 피부 및 피부 보조 기관 또한 일반적으로 영향을 받는다. 예를 들어, 많은 환자들은 가역적 모발 손실로 인해 고통을 겪는다.
심각한 경우, 부작용은 신장 기능의 급성 손상 및 심장, 폐, 간 및 신경계에 대한 독성-관련 기관의 손상에 이를 수 있다. 최종적으로, 면역억제 효과의 결과로서, 감염 수의 증가가 예상되어야 한다.
그러므로, 항종양제를 포함하는 결합물의 제조 및 연구는 활성 성분의 내성 개선에 촛점을 두었다. 이러한 목적을 위해서, 다른 항종양 활성 성분은 덱스트란과 같은 거대분자에 결합되어 왔다(문헌: Kojima et al., J. Pharm. Pharmakol., Vol. 32 (1980), p. 30-34; Nakane et al., J. Pharm. Pharmakol, Vol. 40 (1988), p. 1-6, Nomura et al., J. Controlled Release, Vol. 52 (1998), p.p. 239-252; Sato et al., J. Pharm. Sci., Vol. 78 (1989), p.p. 11-16). 몇몇 경우에, 결합물의 개선된 항암 효과가 증명되었다.
선택적으로, 미토마이신 C와 같은 활성 성분은 또한 N-숙시닐키토산(문헌: Song et al., J. Controlled Release, Vol. 42 (1996), p.p. 93-100), 카복시메틸키틴(문헌: Song et al., Arch. Pract. Pharm. Vol. 53 (1993), p.p. 141-147) 및 올리고펩티드[문헌: Soyez et al., J. Controlled Release, Vo. 47 (1997), p. 71-80]에 결합되었다. 개별 항종양 활성 성분과 비교하여 결합물의 개선된 항암 활성이 다수의 분석에서 다시금 관찰되었다.
본 발명에 따라, 항종양 활성 성분을 포함하는 HAS-활성 성분 결합물이 암 세포에 대한 개선된 독성 효과 및/또는 다른 세포에 대한 감소된 독성을 갖는다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 따라서, 상기 결합물은 넓은 치료 범위를 허용한다.
상기 결합물의 혈장 반감기가 의미있게 증가된다. 이는 보다 긴 노출에 의한 암세포내 복구 메커니즘을 극복하는 것을 허용한다. 동시에, 본 발명은, 특히 건강한 조직에서 보다 느린 대량출혈(flooding)을 가능하게 하므로써 환자에 대해 감소된 피크 농도와 향상된 내성이 얻어진다.
본 발명에 따른 결합물의 제조를 위해, 임의의 항종양 활성 성분이 사용될 수 있다. 항종양 활성 성분은 예를 들어, 알킬화제, 항물질대사제, 항생제 또는 천연 물질로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 항종양 활성 성분은 미토마이신 C, 시클로포스파미드, 블레오신, 클로람부실, 시스플라틴, 아라-C, 플루다라빈, 독소루비신, 에토포시드, 5-FU, MTX, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 히드록시 우레아, 6-MP 또는 CCNU이다.
활성 성분으로서 미토마이신 C의 사용은 더욱 바람직하다. 미토마이신 C는 항생제 그룹에 속하고 아지리딘 그룹, 퀴논 그룹 및 미토산 환을 포함한다. 활성 성분은 다른 비뇨기 질병 뿐만 아니라 신장 세포 암 및 방광암을 치료하는데 사용된다. 화합물은 메톡시 그룹의 손실 및 퀴논의 세포내 효소 또는 자연 화학적 환원에 의해 저산소증 세포(이는 바람직하게는 암세포를 의미함)내 대사에 대해서만 활성을 갖는다. 바람직하게는, HAS는 링커를 통해 상기 메톡시 그룹에 결합될 수 있다. 치환기를 세포내적으로 분열시킨 후, 동일한 활성 성분은 DNA의 알킬화 교차결합을 야기하므로써 독성 효과를 나타내는 새포내에 존재한다. 선택적으로, HAS는 또한 두개의 NH2-그룹의 하나와 결합할 수 있다. 미토마이신 C는 전형적인 조직 특이성을 보인다. 본 발명에 따르면, 이러한 특이성 - 특히 배설 기관용 -은 HAS-결합에 의해 증가되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 항종양 활성 성분은 임의의 방법에 의해 HAS에 결합될 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 정의된 결합물을 생성하므로, HAS의 환원 말단 그룹에의 특정 결합이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 히드록시에틸 전분은 미토마이신 C의 메톡시 그룹과 결합될 수도 있다. 미토마이신 C의 메톡시 그룹에 대한 결합은 링커를 통해 일어날 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 본 발명은 HAS와 항종양 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조 방법은 HAS가 직접 또는 링커를 통해 향종양 활성 성분에 공유 결합되어 결합물이 분리되는 단계를 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 HAS와 향종양 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 나아가 약제학적으로 양립가능한 담체 및/또는 시토킨을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 시토킨은 IL-2, α-인터페론 또는 γ-인터페론이다.
약학 조성물은 당 분야에서 공지된 임의의 적용 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물의 제형화는 당 분야에서 공지된 방법에 따라 수행된다. 활성 성분이외에, 조성물은 약제학적으로 양립가능한 담체 및 하나 이상의 보조제 및 임의의 보존제, 용해도 촉진제 등을 일반적으로 포함한다.
최종적으로, 본 발명은 종양 및/또는 그의 전이 치료용, 특히 비뇨기 종양 및/또는 비뇨기 종양의 전이 치료용, 신장 세포 종양의 전이 치료용, 또는 CLL, 호치킨 림포마, NHL, 다발성 골수종, 발덴스트룀 증상과 같은 림프계 질병 치료용 약제를 제조하기 위한 HAS와 항종양 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물의 용도에관한 것이다. 본 발명의 실시예에 따라서, 약제는 IL-2, α-인터페론 또는 γ-인터페론과 같은 시토킨을 더 포함한다.
신장 세포 암의 전이 치료용과 같은 비뇨기 종양 및/또는 비뇨기 종양의 전이 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도가 특히 바람직하다. 현재는, 신장 세포 암의 치료는 조합 화학요법 또는 미토마이신 C 단독 어느 것으로도 달성될 수 없다. 이것은 신장 제거 부분이 약 18 %에 이르기 때문에, 화합물의 바람직하지 않은 약물동력학에 기인할 수 있다. HAS가 신장을 통해 거의 완전히 제거되기 때문에, 결합물은 비-결합된 물질과 비교하여 신장 제거의 보다 높은 비율을 나타낸다. 본 발명의 이러한 실시는 HAS의 세포내 중간 저장을 이용한다. 특히, 높게 치환된 HAS 종 (HAS 200/0.62)은 과부하의 극단적인 경우에 증가된 세포내 저장을 보여준다. 이런 현상은 또한 근접 세뇨관 부분에서 관찰되었다[참고문헌: Peron et al., Clinical Nephrology, Vol. 55 (2001), p.p. 408-411].
이러한 실시예에 따라, 본 발명은 임의의 표적 세포 또는 조직내에서 항종양 활성 성분의 축적을 제공한다. 그러므로, 결합물의 개선된 약물동력학는 낮은 전신 농도를 사용하면서 표적 기관의 세포내에서 상당히 높은 농도에 이르게 하는 것을 가능하게 만든다. 이러한 의학적 사용은 바람직하게는 모든 조직학적 형태의 약 90 %를 구성하는 크로모필릭 신장 종양(chromophylic renal carcinoma)과 하이퍼네프로이드 종양(hypernephroid carcinoma)에 사용된다.
다른 실시예에 따라, 본 발명은 CLL, 호치킨 림포마, NHL, 다발성 골수종, 발덴스트룀 증후군과 같은 림프계 질병 치료용 약제의 제조를 위한 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 항종양 활성 성분과 HAS를 결합시키므로써, 활성 성분의 세포내 흡수는 쇄 길이 및 치환 정도에 따라 감소된다. 더욱이, 방사능 동역학 연구는 HAS가 림프계(lymphatic) 기관 중 임의의 기관내에 전신에서 보다 오랜 시간 동안 저장된다는 것을 보여주었다[참고문헌: Bepperling et al., Crit. Care, Vol. 3, Suppl. 1 (1999), p. 153]. 따라서, 표적 세포내에서의 결합물의 축적이 일어나 보다 낮은 전신 독성을 갖는 약물동력학의 개선을 가져온다.
활성 성분으로서 플루다라빈을 사용하여 림프계 질병을 치료하는 것이 바람직하다. 플루다라빈은 탈아민화(deamination)에 저항하는 할로겐화된 아데닌 유사체이다.
또한 본 발명은 피부/국소의 일차 악성 종양 또는 그의 전이 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다. 이를 위해서, 열거된 조직에 의한 유도된 증가된 흡수 및 조직 밖에서의 HAS 결합물의 감속된 운반이라는 두가지 효과가 이용될 수 있다. 상기 두가지 효과는 표적 세포내에서 결합물의 축적으로 이끌어진다.
또한 본 발명은, 예를 들어, 작지 않은 세포 폐 암 및 작은 세포 폐 암, 유방 암, 식도 편평상피 세포 종양, 신장 세포 종양, 고환 종양, 악성 흑색종, ALL 또는 CML과 같은 종양 질병 또는 혈액계 질병의 치료용 약제 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 신장 세포 종양 치료용으로 결합물을 사용할때, 결합물의 친수성 증가 및 이에 따른 보다 강한 신장 배출에 의해 영향받은 조직내에서의 화합물의 강한 축적으로 인해 장점이 발생한다. 본 발명의 실시를 위해서 활성 성분으로서 빈데신(vindesine)의 사용이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명은, 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로서, 여기에서 화합물은 하나 이상의 추가의 항종양 활성 성분 또는 시토킨과 함께 조합 치료로서 사용된다. 상기 조합 치료는 모든 활성 성분을 포함하는 제제의 투여 또는 각각이 하나의 활성 성분을 함유하는 두개 이상의 다른 조성물의 투여에 의해 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 새로운 조합 치료에 적합한 본 발명에 따른 화합물 및 시토킨을 포함하는 약제의 제조 방법을 제공한다. 해당 제제는 특히 진행된 신장 세포 종양 치료용으로 적합하다.
본 발명의 좀 더 바람직한 실시예에 따르면, 부정맥 치료용으로의 용도 뿐만 아니라 항부정맥 활성 성분과 HAS의 결합물이 제공된다.
정상적인 심장 속도로부터의 심장 박동의 규칙성과 일시적 연속으로부터의 편차가 부정맥으로서 언급된다. 대부분의 경우에, 이러한 편차는 심장 여기 또는 유도 무질서에 의해 야기된다. 부정맥 특히 심실 부정맥 치료에 적합한 물질을 항부정맥 활성 성분 또는 항부정맥제로서 언급한다.
항부정맥 활성 성분의 효과에 따라, 나트륨 채널 차단제[퀴니딘, 프로카인아미드(procainamide), 디이소피라미드(disopyramide) 등], β-수용체 차단제[아테놀롤(atenolol), 프로파놀롤(propanolol), 등], 선택적 재분극 연장 활성 성분[아미오다론니(amiodarone), 소탈롤(sotalol) 등], 칼슘 길항제[베라파밀(verapamil), 갈로파밀(gallopamil) 등] 및 국소 마취제로 구별된다.
그러나, 당 기술 분야에서 통상적인 항부정맥 활성 성분은 부분적으로 작용의 짧은 지속시간을 나타낸다. 예를 들어, 아데노신은 매우 짧은 반감기를 갖는 항부정맥 활성 성분이다. 이 물질의 작용 지속은 단지 몇분에 불과하다. 많은 경우에 반감기 및 작용 지속의 연장이 필요하다.
추가적으로, 몇몇 항부정맥 활성 성분은 프로(pro)-부정맥 부작용을 낳고 부분적으로는 심지어 사망율을 증가시킨다.
본 발명은 예를 들면, 연장된 작용 지속을 가지는 개선된 항부정맥 활성 성분을 제공한다. 본 발명에 따라, HAS-항부정맥 결합물은 의미있게 보다 길어진 생체내 혈장 반감기를 가지며 활성 성분의 활성은 HAS에 결합하므로써 의미있는 정도까지 불리하게 영향을 받지 않는다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
본 발명에 따르면, 임의의 항부정맥 활성 성분은 결합물의 제조용으로 사용될 수 있다. 항부정맥 활성 성분은 나트륨 채널 차단제, 베타-수용체 차단제, 선택적 재분극 연장 활성 성분, 칼슘 길항제 및 국소 마취제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 활성 성분은 아데노신, 키니딘, 프로카인아미드, 디이소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 아자말린, 파즈말리움, 프로파페논, 아테놀롤, 프로파놀롤, 아미오다론, 소탈롤, 베라파밀, 갈로파밀 또는 딜티아젬이다. 여기에서 아데노신의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 항부정맥 활성 성분 및 HAS간의 결합은 HAS의 환원된 말단 그룹을 통해 일어난다.
아데노신이 사용될때, 이 활성 성분은 예를 들면, 아미노 그룹을 통해 HAS에결합될 수 있고, 여기서 아데노신의 아미노 그룹 및 HAS의 환원된 말단 그룹 간의 결합이 특히 바람직하다. 물질대사 (HAS를 분리시키는) 후에 천연 아데노신이 존재하는 결합 변형이 바람직하다.
선택적으로, 활성 성분은 소위 링커를 통해 HAS에 결합될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 화합물들 중 하나를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 약학 조성물은 약제학적으로 양립가능한 담체를 추가로 포함하고 예를 들어 정맥 적용을 위해 제형화 될 수 있다.
최종적으로. 본 발명은 부정맥 치료, 특히 심실 부정맥 치료용 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 종양 조직 또는 염증 조직에서의 세포사멸 유도용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 각각 HAS 및 항감염 활성 성분 또는 항생제의 결합물을 포함하는 화합물 뿐만 아니라 감염성 질병의 치료용 이의 용도에 관한 것이다.
미생물(바이러스, 세균, 진균, 원생동물)의 거대생물(식물, 동물, 인간)로의 침투 및 거대생물내에서의 번식을 감염이라고 한다. 감염성 질병의 형성 및 경로는 실질적으로 미생물의 병원성 및 거대생물의 면역성에 의존한다.
수십년동안, 항감염 활성 성분은 감염성 질병과 싸우기 위해 화학요법으로서 사용되어 왔다.
에이. 플레밍은 이미 1928년에 배양 플레이트상에서 스타필로코치가 없는 지역을 형성하는 활성 성분의 특징에 의해 페니실린을 동정했다. 페니실린은 산업적 규모로 얻어진 첫번째 항생제이고 이는 임상실험에서 큰 의의를 갖는다.
현재는, 페니실리움 종[예를 들어, 피. 크리소제넘(P. chrysogenum) 및 피. 노타툼(P. notatum)]의 진균으로부터 생성된-락탐-항생제 그룹으로부터의 활성 성분들을 페니실린이라 한다. 항균 효과는 세균 세포 벽 합성의 차단에 기초한다. 페니실린은 세균성 효소 트랜스펩티다제를 불활성화하므로써 세포벽 뮤레인(murein)의 폴리사카라이드 쇄의 교차 결합을 막는다.
발견 이래로, 미생물의 성장을 억제하거나 또는 미생물을 죽이는 다수의 활성 성분들이 분리 및 합성되었다. 대부분의 항생제들은 토양으로부터 분리된 스트렙토마이세스 종(약 65%)으로부터 유래한다. 이러한 물질들은 토양내에서 경쟁상대를 억압하기 위해 미생물에 의해 사용되는 것으로 추정된다.
분리된 항생제의 수는 대략 8000 정도로 생각되며, 그 중 약 100개 정도가 의학 분야에서 사용될 수 있다. 활성 성분들의 다른 물질 군으로의 분류는 다른 측면, 예를 들어 화학 구조 또는 작용의 방식에 따라 수행되었다.
한편, 항생제들은 감염성 질병과 싸우기 위해서 뿐만 아니라 항-종양 치료에있어 세포증식 억제제, 면역 억제제로서, 식품 보존을 위한 식물 보호제로서, 동물사료에서 비육 보조제로서 승인된다.
최근에는, 항생제에 내성을 갖는 다수의 미생물 균주들이 발견되었다. 단일-내성 균주이외에도, 어떤 질병과의 싸움을 복잡하게 만드는 다(multi)-내성 균주들이 종종 발견되었다.
어떤 병원균에 대한 다른 항생제들의 활성을 연구할 때, 몇몇의 활성 성분들, 예를 들어 아목시실린 또는 암피실린이 세포밖에서 거의 배타적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다[참조: Scaglione et al., Chemotherapie, Vol. 39 (1993), 416-423; Balland et al., J. Antimicorb. Chemother. Vol. 37 (1996), 105-115]. 그러므로, 이러한 활성 성분들은 우선적으로 세포내에 존재하는 미생물에 대항하여 사용될 수 없다. 암피실린-나노입자들은 세포내 활성을 증진시키기 위해서 생산되어 왔다(Balland et al. 상기 참조).
마이코박테리움에 의해 야기된 결핵 또는 다른 감염과 같은 감염을 위해서는, 치료 가능성의 스펙트럼 확장이 항상 요구되는 조합 치료로 인해 바람직할 것이다. 동맥경화증의 병인에 대한 잠재적 중요성이 최근에서야 발견된[참고문헌: Stille und Dittmann, Herz, Vol. 23 (1998), p.p. 185-192], 클라미디아 감염과 같은 다른 세포내 감염의 관점에서는, 데포 효과(depot effect)를 갖는 세포내 항생제가 치료 및 예방에 있어 중요한 진전을 나타낼 수 있을 것이다.
발명에 따르면, HAS와 항감염 활성 성분의 결합으로 활성 성분의 약물 동력학적 특성이 개선되고, 특히 생체내 반감기가 길어지며, 세포내 흡수가 향상되고/되거나 활성 성분의 효과가 개선된다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
본 발명에 따르면, 임의의 항감염 성분 또는 항생제 각각이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 활성 성분은 아미노페니실린, 세팔로스포린, 아미노세팔로스포린, 베타-락탐-항생제, 카바페넴, 아미노 글리코시드, 테트라사이클린, 마크로리드-항생제, 지라제 억제제, 글리코펩티드 항생제, 린코마이신, 스트렙토그라민, 에버니노마이신, 옥사졸리디논, 니트로이미다졸, 술폰아미드, 코-트리목사졸, 국소 항생제, 바이러스억제제, 항균제(antimycotics) 또는 결핵억제제로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
예를 들어, 암피실린, 아목시실린, 세포탁심, 세프타지딤, 반코마이신, 클린다마이신, 메트로니다졸, 이소니아지드, 리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴, 에탐부톨, 피라시나미드, 스트렙토마이신, 프로티온아미드 또는 답손일 수 있고, 암피실린, 아목시실린, 마크로리드 또는 스트렙토마이신과 같은 아미노 페니실린의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 아미노 페니실린은 아미노 페니실린의 아미노 그룹을 통해 히드록시에틸 전분에 직접 공유결합되어 있는 활성 성분으로서 사용된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 아미노 세팔로스포린은 아미노 페니실린대신 사용되므로써 감소된 알러지반응성(allergenicity)을 얻는다. 다른 실시예에서는, 마크로리드-HAS 결합물이 사용될 수 있는데, 여기에서는 에리트마이신 또는 그의 유도체가 사용되며, 특히 에리트로 마이실라민이 사용된다. 대안으로서, 스트렙토마이신이 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 따르면, 항감염 활성제 및 히드록시에틸 전분 사이의 결합은 히드록시에틸 전분의 환원 말단 그룹을 통해 일어날 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 항감염 활성제는 링커를 통해 히드록시에틸 전분에 결합된다.
본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함한다. 일반적으로, 약학 조성물은 약제학적으로 양립가능한 담체를 추가로 포함한다.
최종적으로, 본 발명은 감염성 질병 치료용 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물 중 하나의 용도에 관한 것이다. 약학 조성물은 세포내 병원체에 의해 유발된 감염성 질병을 치료하는데 특히 적합할 수도 있다. 이들은 병원성 및 임의 병원성의 완전한 스펙트럼, 예를 들어, 세균, 바이러스, 또는 기생 병원체, 마이코플라즈마, 마이코박테리아, 클라미디아 또는 리케치아 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, HAS-핵산 결합물이 제공된다. 현재, 핵산 라이브러가 목적하는 활성을 갖는 핵산을 위해 대량으로 스크리닝된다. 예를 들어, 각 활성은 어떤 다른 핵산, 수용체 또는 바이러스성 단백질에 결합하는 핵산의 능력일 수 있다. 이러한 결합은 생물학적 신호에 의해서 자극되거나 억제될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 자연 발생 D-DNA 및 D-RNA 분자이외에도, L-DNA 및 L-RNA 분자가 핵산의 구성 성분으로서 상응하는 D-형대신 L-리보스 및 L-데옥시리보스를 포함한다는 점에서(참조: 국제특허 WO 98/08856), 자연 발생 분자와는 상이한 L-DNA 및 L-RNA 분자가 또한 사용된다. 본 발명의 명세서에서는, HAS-핵산 결합물이 그들의 천연 기능을 보유한 채 제조될 수 있는 것으로 나타났다(실시예 7 참조).
본 발명은 공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 수성 또는 유기 반응 매질내에서 수행될 수 있으며, 여기에서는 수성 매질내에서 결합을 수행하는 것이 바람직하다.
따라서, HAS 및 적어도 하나의 활성 성분이 반응 매질내에서 서로 반응하는공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조 방법이 제공된다. 반응 매질은 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 반응 매질은 적어도 10 중량%, 바람직하게는 적어도 50 중량%, 특히 적어도 80 중량% (예를 들어, 90 중량% 또는 최대 100 중량%)의 물, 및 따라서 최대 90 중량%, 바람직하게는 최대 50 중량%, 특히 최대 20 중량% (예를 들어, 10 중량% 또는 0 중량%까지)의 유기 용매를 포함한다. 이 반응은 수성상내에서 일어난다. 바람직한 반응 매질은 물이다.
본 발명에 따른 방법은, 독성학적으로 허용가능하지 않은 용매가 반드시 사용되어야 할 필요가 없기 때문에 유리하며, 따라서 본 발명에 따라 제조된 생성물에서는, 원하지 않는 용매의 오염을 피하기 위해 공지의 방법에 따라서 항상 필요한 독성학적으로 허용가능하지 않은 용매의 적은 양의 잔류물의 제거가 불필요하게 된다. 또한, 독성학적으로 해로운 용매의 잔류물을 위한 당 기술 분야에 공지된 방법에 따라 필요한 추가의 품질 조절이 생략될 수 있는데, 그 이유는 본 발명에 따른 방법은 독성학적으로 허용가능한 용매의 사용을 선호하기 때문이다. 발명에 따라 바람직한 용매는 예를 들어 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 독성학적으로 해롭지 않은 양자성 용매이다.
나아가, 유기 용매내 방법에서 체계적으로 배제될 수 없는, 유기 용매에 의해 유도되는 펩티드 또는 단백질의 비가역적 또는 가역적 구조 변화를 근본적으로 피할 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 생성물은 DMSO에서 제조된 생성물과 결과적으로 다르다.
본 발명에 따르면, 활성 성분과 HAS의 결합이 상당한 정도로 관찰되는 2차 반응없이 수용액내에서 수행될 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 직접적으로 높은 순도의 개선된 생성물을 가져온다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 활성 성분이 활성 형태로 존재하고 HAS의 유리한 특성이 보유되어 있는 HAS-활성 성분 결합물의 간단한 제조를 처음으로 가능하게 한다. 반응이 수성 상내에서 일어나기 때문에, 즉 유기 용매가 반드시 정제되어야 할 필요가 없기 때문에, 반응 혼합물로부터 HAS-활성 성분 결합물을 분리시키는 특별한 방법이 필요하지 않다.
본 발명에 따르면, HAS는 활성 성분의 ε-NH2-그룹,-NH2-그룹, SH-그룹, COOH-그룹 또는 -C(NH2)2-그룹에 직접적으로 결합하는 것이 바람직하다. 또는, 추가의 반응성 그룹은 HAS로 도입될 수 있거나 또는 HAS와 활성 성분 간의 결합이 링커를 통해 일어날 수 있다. PEG와 활성 성분의 결합을 위한 해당 링커의 사용은 당 기술 분야에 공지되어 있다. 문헌(국제특허 WO 97/38727 및 EP 605 963)에 개시된, 링커로서 히드라진 및 옥실아민 유도체뿐 아니라 아미노산, 특히 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신 및 페닐알라닌의 사용이 바람직하다.
본 발명 방법의 일 실시예에 따라, HAS는 활성 성분과 결합하기 전에 산화된다. 산화는 당 분야에서 공지된 방법중의 하나에 따라 일어날 수 잇으며, HAS의 환원 말단 그룹의 선택적 산화가 바람직하다. 이는 HAS의 산화된 환원 말단 그룹이 활성 성분의 아미노 그룹과 반응하여 아미드를 형성하게 되는 방법을 촉진한다. 이실시예는 HAS와 활성 성분간의 특정 결합, 따라서 특별하게 동질의 생성물을 얻게되는 장점을 갖는다.
HAS는 산화된 환원 말단 그룹 및 활성 성분과 바람직하게는 적어도 12시간, 가장 바람직하게는 적어도 24시간동안 반응될 수가 있다. 또한, 임의의 활성화제, 예를 들어 에틸디메틸-아미노프로필-카보디이미드(EDC)를 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 반응도중 HAS와 활성 성분간의 몰비는 임의로 선택될 수 있으나, 통상 20:1 내지 1:20의 HAS:활성 성분의 범위이며 6:1 내지 1:6의 비가 특히 바람직하다. 가장 우수한 결과는 HAS:활성 성분의 몰비가 약 2:1인 경우에 얻어졌다.
HAS와 활성 성분의 아미노 그룹사이의 다른 결합 반응도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 예를 들어, 중간 생성물로서 HAS와 활성 성분사이에서 쉬프 염기 형성, HAS와 활성 성분이 서로 직접 반응하는 방법이 포함된다. 쉬프 염기의 아조메틴 그룹 -CH=N-은 그 다음 <2H>의 형식적 부가로 메틸렌아민 그룹 -CH2-NH-로 환원될 수 있다. 이러한 환원을 위해, 당업자는 당 기술 분야에서 공지된 수 많은 환원제를 사용할 수 있으며, BH4를 사용한 환원이 특히 바람직하다.
HAS는 활성 성분의 어떤 그룹과도 결합될 수 있다. 결합은 바람직하게는 결합물이 결합전 활성 성분의 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%를 나타내며, 특히 바람직하게는 활성의 적어도 95%를 보유하는 방식으로 수행된다. 결합 반응은 또한 HAS가 활성 성분의 하나 이상의 특정 그룹에, 예를 들어 펩티드의 리진 또는 시스테인 잔기에 배타적으로 결합되는 방식으로 조절될 수 있다. HAS가 산화된 환원 말단 그룹을 통해 활성 성분의 하나 이상의 특정 그룹에 결합된다면, 특별한 장점이 얻어지는데, 즉 동질의 HAS-활성 성분 결합물이 해당 방법으로 얻어진다.
본 발명 방법의 바람직한 실시예에 따라, HAS와 단백질 또는 펩티드가 반응을 위한 출발 물질로서 사용된다. 천연 또는 재조합 기원의 임의의 치료 또는 진단 단백질이 사용될 수 있다. 현재 시판중인 재조합 제제의 활성 성분의 목록이 문헌(Pharma Business, July/August 2000, p. 45 - 60)에서 발견된다. 본 발명은 이 문헌에 기재된 활성 성분들 중 임의의 하나를 포함하는 HAS-활성 성분 결합물의 제조를 포함한다.
시토킨, 예를 들어 인터페론, 인터류킨, 성장 인자, 효소, 효소 억제제, 수용체, 수용체 단편, 인슐린, 인자 VIII, 인자 IX, 항생제(또는 항감염제), 펩티드 항생제, 바이러스성 피막 단백질, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 알부민, hTPA, 항체, 항체 단편, 단일-쇄 항체, DNA, RNA, 또는 그의 유도체를 사용한 결합물의 제조가 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에서 펩티드 또는 재조합 단백질을 사용할 때 장점을 얻는다. 이미 언급된 바와 같이, 해당 단백질은 사람에 대해 항원성인 그의 특성으로 인해 활성 성분으로서 종종 사용될 수 없다. 그러나, 본 발명의 방법에 의해 HAS와 결합한 후, 재조합 단백질의 면역원성이 감소되고 따라서 사람에게의 의학적 사용이 허용된다.
나아가, 짧은 쇄 및 보다 적은 펩티드를 갖는 단백질과 HAS의 결합시 장점이 얻어진다. 현재, 많은 수의 펩티드 라이브러리가 제조되고 있는데, 예를 들어 짧은올리고펩티드(예를 들어, 3 내지 20 mers)가 파아지의 표면상에서 발현되는 파아지 라이브러리 등이 있다. 또한, 단일 폴리펩티드 쇄(소위 "단일 쇄 항체")로부터의 항체는 세균내에서 또는 파이지의 표면상에서 발현된다. 이러한 라이브러리들은 특정 활성 성분 또는 결합 활성을 위해 스크리닝된다. 그러나, 이제까지 해당 펩티드 활성 성분 또는 항체의 치료 및 진단 목적의 사용은 실패하여 왔는데, 그 이유는 이들이 작은 크기로 인해 생물체로부터 매우 빨리 배출되기 때문이다(참고: Chapman et al., 1999, loc. cit.). 본 발명의 방법에 따라, 이러한 펩티드는 HAS에 유리하게 결합될 수 있으며, 활성 성분으로서 동일한 것의 사용을 허용하는 생체내 반감기를 가질 수 있다.
상기 실시예의 대안으로서, 호르몬, 스테로이드 호르몬, 아미노산으로부터 유래된 호르몬 또는 지방산으로부터 유래된 호르몬을 활성 성분으로서 사용할 수 있다. 특정한 경우, HAS와 결합하기 전, 예를 들어 링커를 사용하여 호르몬으로 활성 그룹을 도입하는 것이 필요할 수도 있다.
본 발명에 따라, 임의의 생리학적으로 양립가능한 HES가 출발 물질로서 사용될 수 있다. 1 내지 300 kDA의 평균 분자량(중량 평균), 특히 1 내지 150 kDA의 평균 분자량을 갖는 HES가 바람직하다. 2 내지 40 kDA의 평균 분자량을 갖는 HES가 특히 바람직하다. HES는 바람직하게는 히드록시에틸 그룹에 대해 각각의 경우에 2 내지 20의 C2:C6치환비 및 0.1 내지 0.8의 치환 몰도를 갖는다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 수득가능한 HAS-활성 성분 결합물에 대한것이다. 이 결합물은 유리한 특성들, 즉 활성 성분의 높은 활성, 낮은 면역원성, 체내 긴 체류시간 및 탁월한 유동 특성을 가지며, 이러한 특성은 결합물의 의학적 이익을 향상시킨다.
따라서, 본 발명은 유사하게 HAS-활성 성분 결합물이 상기 방법들 중 하나에 따라 제조되어 당 기술 분야에서 공지된 약제학적으로 양립가능한 담체, 보조제와 혼합되는, 약제 또는 진단제의 제조방법 뿐 아니라 이 방법에 따라 수득가능한 약제 또는 진단제를 포함한다.
상응하는 약제의 의학적 용도는 사용되는 활성 성분의 형태에 달려 있다. 예를 들어, 헤모글로빈이 활성 성분으로 사용된다면, 결합물은 산소 운반제로서 사용될 수 있다. 한편, 시토킨이 제조용 활성 성분으로서 사용된다면, 결합물은 예를 들어 종양 치료에 사용될 수 있다. 약제내 각각의 경우에 사용되는 결합물의 농도는 당업자에 의한 용량-효과(dose-effect) 시험에서 즉시 확인될 수 있다.
진단제는 질병 또는 장애를 진단하기 위해 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 만일 항체 또는 항체 단편이 활성 성분으로서 사용된다면, 결합물은 예를 들어 당 기술 분야에서 통상적인 엘리사 검출법을 수행하는데 적합하다.
실시예에서, 다음에 기재된 물질들이 사용되었다:
사람 혈청 알부민: 시그마-알드리히 A3782
HES 130 kD: 형태 130/0.5, T91SEP(Fresenius Kabi)로부터 제조
데이터: Mw: 130 000 ± 20 000 D
Mn: 42 600 D
HES 10 kD: 형태 HHH 4-2 (Fresenius Kabi)
데이터: Mw: 9 800 D
Mn: 3 695 D
EDC: 시그마-알드리히 16.146-2번
(에틸디메틸 아미노프로필 카보디이미드)
HOBt: 시그마-알드리히 15.726-0번
(1-히드록시-1H-벤조트리아졸히드레이트)
DIG 글리칸 검출 키트: 로슈-베링거 1142 372번
다음의 실시예 1 내지 6은 산화된 환원 말단 그룹을 갖는 HES에 대한 디아미노부탄과 HSA의 결합 또는 HES와 HSA의 직접 결합을 기술한다. HSA 및 디아미노부탄은 상기 언급된 활성 성분들의 단순 예이다. 실시예 7은 HES와 올리고 뉴클레오티드의 결합을 기재한다.
실시예 1: 히드록시에틸 전분의 환원 말단 그룹의 선택적 산화
히드록시에틸 전분(130 kD 및 10 kD)의 환원 말단 그룹의 선택적 산화를 위해, 동일한 것을 최소량의 물에 용해시켜 서로 다른 양의 요오드 용액과 수산화칼륨 용액과 반응시켰다.
요오드를 나타내는 색이 사라질때까지 혼합물을 교반하였다. 보다 많은 양의 요오드 용액과 수산화칼륨 용액의 부가를 얻기 위해서 이 방법을 여러번 반복하였다. 이어 용액을 앰버라이트 IR 120 나트륨 양이온-교환 수지를 이용하여 정제하고, 20시간동안 증류수에 대해 투석하고(4 내지 6 kD의 배제 제한을 갖는 투석관) 동결건조하였다.
문헌(Somogyi, N.; Method in Carbohydride Chemistry,Vol. 1, 1962, p. 384-386)에 기재된 방법을 사용하여 각 경우에 있어 산화도를 측정하였다. 산화 반응의 프로토콜은 표1에 기재되어 있다:
방법 HES(Mn) 요오드 용액0.1N KOH 용액0.1N 용매 반응시간 수율
산화(1)HES 130 1g2.4×10-5mol 0.3ml3.0×10-5mol 0.5ml5.0×10-5mol 물4.0ml 4시간25℃ 30.1%
산화(2)HES 130 4g9.4×10-5mol 1.0ml1.0×10-4mol 1.5ml1.5×10-4mol 물6.0ml 밤새25℃ 24.8%
산화(3)HES 130 5g1.2×10-4mol 1.2ml1.2×10-4mol 1.5ml1.5×10-4mol 물7.5ml 밤새25℃ 24.3%
산화(4)HES 130 5g1.2×10-4mol 3.0ml3.0×10-4mol 4.5ml4.5×10-4mol 물7.5ml 밤새25℃ 60.8%
산화(5)HES 130 5g1.2×10-4mol 4.0ml4.0×10-4mol 5ml5.0×10-4mol 물7.5ml 밤새25℃ 80.0%
산화(6)HES 130 8g1.9×10-4mol 7.0ml7.0×10-4mol 11.5ml1.2×10-3mol 물7.5ml 밤새25℃ 88.4%
산화(7)HES 130 10g2.4×10-4mol 10ml1.0×10-3mol 20ml2.0×10-3mol 물7.5ml 밤새25℃ 100%
산화(1)HES 10 5g1.4×10-3mol 2.0ml2.0×10-4mol 2.0ml2.0×10-4mol 물10.0ml 20시간25℃ 3.0%
산화(2)HES 10 5g1.4×10-3mol 3.5ml3.5×10-4mol 4.5ml4.5×10-4mol 물10.0ml 밤새25℃ 5.3%
산화(3)HES 10 15g4.1×10-3mol 21.0ml2.1×10-3mol 31.0ml3.1×10-3mol 물 밤새25℃ 10.5%
산화(4)HES 10 8g2.2×10-3mol 83.0ml8.3×10-3mol 180.0ml1.8×10-2mol 물 밤새25℃ 80.0%
산화(5)HES 10 7g1.9×10-3mol 95.0ml9.5×10-3mol 210.0ml2.1×10-2mol 물 밤새25℃ 100.0%
산화(6)HES 10 6.4g1.7×10-3mol 50ml5.0×10-3 150ml1.5×10-2mol 물 밤새25℃ 100.0%
표 1: 다른 조건하에서 HES (130 kD 및 10 kD)의 환원 말단 그룹의 산화
상기 표에 요약된 프로토콜은 산화 (6), HES 10kD에 대해 다음에 상세하게 기재되어 있다: 6.4 g HES 10kD(1.7 mmol)을 반응 용기내에 용해시켜 수 ml의 물내에서 연속적으로 교반하였다. 50 ml의 0.1 N 요오드 용액 (5.0 mmol)과 150 ml의 KOH 용액 (15 mmol)을 부가하였다. 이 혼합물을 25℃ 에서 밤새 정치하였다. 혼합물을 앰버라이트 IR 120 (Na+ 형)로 정제하여 물에 대해 투석시켰다(셀룰로스 아세테이트 투석관; 4 내지 6 kD 컷 오프). 투석된 생성물을 동결건조하였다(Heraeus-Christ Alpha, 밤새 플라스크-건조).
표 1로부터 유추될 수 있는 바와 같이, 요오드 양이 3.0 × 10-5몰로부터 1.0 × 10-3ml까지 상승된 후, HES 130 kD의 환원 말단 그룹( 100%수율에 상응)의 완전한 산화가 얻어졌다.
HES 10kD의 환원 말단 그룹의 완전한 산화를 위해 2.1 × 10-3보다 큰 농도로의 요오드 양의 추가 상승이 필요하였다.
실시예 2: 수성상내에서 산화된 환원 말단 그룹을 갖는 HES의 HSA와의 결합
결합을 위해, 산화된 환원 말단 그룹(옥스-HES)을 갖는 히드록시에틸 전분과 HSA를 물에서 완전하게 용해시켰다. 용액이 맑아지면, 물에 용해된 EDC를 가하였다. 적절한 교반이 수반되는 EDC에 의한 활성화후 추가량의 EDC를 가하였다. 경우에 따라, 반응을 HOBt로 활성화하여 밤새 정치하였다. 생성물을 증류수에 대한 투석에 의해 15시간 동안 정제한 후 동결건조하였다(다음에서 방법 A라 함). 결합 반응의 프로토콜이 표 2에 있다:
방법 A HSA ox-HES (Mn) EDC HOBt 용매 활성화 반응
결합 Ⅰox-HES 130 300mg4.4×10-6mol 100mg(1)2.4×10-6mol 25mg1.6×10-4mol 100mg7.7×10-4mol H2O/디옥산13ml/2ml 1.5시간3-4℃ 4시간25℃
결합 Ⅱox-HES 130 100mg1.5×10-6mol 300mg(2)7.0×10-6mol 15mg9.7×10-5mol 100mg7.7×10-4mol H2O/디옥산10ml/3ml 1.5시간3-4℃ 밤새25℃
결합 Ⅲox-HES 130 200mg3.0×10-6mol 3.8g(5)8.9×10-5mol 46.5mg3.0×10-4mol 20mg1.5×10-4mol H2O/디옥산10ml/3ml 0시간 24시간25℃
결합 Ⅳox-HES 130 100mg1.5×10-6mol 1.9g(5)4.5×10-5mol 25mg1.6×10-4mol 20mg1.5×10-4mol 물 1.5시간3-4℃ 밤새25℃
결합 Ⅴox-HES 130 200mg3.0×10-6mol 4.3g(5)1.0×10-4mol 100mg6.0×10-4mol 0mg 물 0시간 밤새25℃
결합 Ⅵox-HES 130 100mg1.5×10-6 130mg(7)3.0×10-6mol 50mg3.0×10-4mol 0mg 물＊5ml+10ml 0시간 5시간25℃
결합 Ⅶox-HES 10 100mg1.5×10-6 130mg(7)3.0×10-6mol 200mg3.0×10-4mol 0mg 물＊5ml+2×10ml 0시간 24시간25℃
결합 Ⅰox-HES 10 100mg1.5×10-6mol 300mg(1)8.1×10-5mol 5mg3.0×10-5mol 100mg7.7×10-4mol H2O/디옥산13ml/2ml 1.5시간3-4℃ 밤새25℃
결합 Ⅱox-HES 10 70mg1.0×10-6mol 1.0g(2)2.7×10-4mol 15.5mg1.0×10-4mol 0mg 물 10ml0시간 밤새25℃
결합 Ⅲox-HES 10 200mg3.0×10-6mol 2.0g(3)8.1×10-4mol 77.5mg5.0×10-4mol 20mg1.5×10-4mol 물 0시간 6시간25℃
결합 Ⅳox-HES 10 50mg7.4×10-7mol 7.4g(4)2.0×10-3mol 282mg1.5×10-3mol 0mg 물 0시간 밤새25℃
결합 Ⅴox-HES 10 100mg1.5×10-6mol 103g(6)2.8×10-5mol 93mg5.6×10-4mol 0mg 물＊4ml 0시간 20시간25℃
결합 Ⅵox-HES 10 100mg1.5×10-6mol 103g(6)2.8×10-5mol 200mg1.2×10-3mol 0mg 물＊3×5ml 0시간 30시간25℃
＊= 60분내에 적가 깔대기로 EDC 용액의 부가
표 2: 다른 조건하에서 산화된 환원 말단 그룹을 갖는 HES (130 kD 와 10kD) 및 HSA 사이의 결합 반응 (방법 A; HES 컬럼의 [ ]내 숫자가 표 1에 따른 산화 방법을 나타낸다).
옥스-HES 130 kD와 HSA사이의 결합 반응 VII이 다음에 상세하게 설명되어 있다: 바닥이 둥근 플라스크내에 130 mg 옥스-HES 130kD(약 100%의 산화도) 및 100 mg HSA를 실온하에 약 5 ml 물내에서 교반하여 용해시켰다. 용액이 맑아지는 대로, 셋으로 나눈(각각은 5 내지 10 ml 물에 용해되어 있다) 200 mg EDC 를 1시간에 걸쳐 부가하였다. 각각의 부가사이에, 반응 생성물을 약 4시간동안 실온에서 교반하였다. 24시간의 반응 시간후, 혼합물을 물에 대해 투석하였다(셀룰로스 아세테이트 투석관; 4 내지 6 kD 컷 오프). 그 다음 생성물을 동결건조하였다.
실시예 3: 수성상내에서 HSA와 HES의 직접 결합
이 반응의 원리는 HES와 단백질의 아미노 그룹 사이에서 쉬프 염기의 형성에 기초하며, 반응은 NaBH4에 의한 상응하는 아민으로의 쉬프 염기의 반응을 통해 조절된다(다음에서 방법 B라 함).
이를 위해, HES를 소량의 물에 완전히 용해시켰다. 이러한 목적을 위해, pH 9.0의 붕산염 완충액에 용해된 HSA를 가하였다. NaBH4를 이 용액에 가하고, 전체 용액을 교반하면서 실온에 방치하였다. 추가의 NaBH4가 뒤따르는, 추가 분취량의 HES 130 kD를 가하였다. 반응이 종결된 후, 투석과 동결건조를 기술된 바와 같이 수행하였다.
개별 시험의 프로토콜이 표 3에 요약되어 있다:
방법 B HSA HES(Mn) NaBH4 완충액 pH 반응시간
결합 ⅠHES 130 50mg7.5×10-7mol 500mg1.2×10-5mol 500mg1.3×10-2mol Na2HPO4,0ml7.4 48시간25℃
결합 ⅡHES 130 100mg1.5×10-6mol 1.0g2.4×10-5mol 60mg1.6×10-3mol Na2HPO4,1ml7.4 20시간25℃
결합 ⅢHES 130 50mg7.5×10-7mol 9.8g2.3×10-4mol 285mg7.5×10-3mol Na2HPO4,1ml7.4 36시간25℃
결합 ⅣHES 130 50mg7.5×10-7mol 2.0g4.7×10-5mol 180mg4.7×10-3mol 붕산염 0.1M7.4 30시간25℃
결합 ⅤHES 130 50mg7.5×10-7mol 4.0g9.4×10-5mol 60mg1.6×10-3mol 붕산염 0.1M7.4 100시간25℃
결합 ⅠHES 10 50mg7.5×10-7mol 2.8g9.4×10-5mol 28mg1.6×10-3mol 붕산염 0.1M9.0 80시간25℃
표 3: 다른 조건하에서 HES (130 kD 및 10 kD) 및 HSA 사이의 직접 결합(방법 B).
상세하게는, HES 130 kD의 결합을 위해, 이 화합물 2.0 g을 물(약 5 ml)에 완전하게 용해시켰다. 1 ml의 0.1 M 붕산염 완충액 (pH 9.0)에 용해된 50 mg의 HSA를 가하였다. 30 mg의 NaBH4를 이 용액에 가하고 전체 용액을 교반하면서 실온에 방치하였다. 18시간후, 추가의 30 mg NaBH4가 뒤따르는, 2.0 g HES 130 kD의 추가 분취량을 가하였다. 총 100 시간의 반응후, 투석과 동결건조를 수행하였다(결합 V, HES 130kD).
HES 10 kD의 결합을 위해, 이 화합물 1.4 g을 물(약 5 ml)에 완전하게 용해시켰다. 1 ml의 0.1 M 붕산염 완충액 (pH 9.0)에 용해된 50 mg의 HSA를 가하였다. 14 mg NaBH4를 이 용액에 가하고 전체 용액을 교반하면서 실온에 방치하였다. 18시간후, 추가의 14 mg NaBH4가 뒤따르는, 1.4 g HES 10 kD의 추가 분취량을 가하였다. 총 80 시간의 반응후, 투석과 동결건조를 수행하였다(결합 I, HES 10 kD).
실시예 4: GPC를 사용한 결합 생성물의 분석
반응 생성물을 먼저 겔-침투 크로마토그래피 (GPC)를 사용하여 분석하였다.
4.1HPLC UV 모니터 (히다치)에 연결된 FPLC 장치 (파마시아) 를 GPC용으로 사용하였다. 또한, 다음의 조건을 사용하였다.
컬럼: 수퍼로스 12 HR 10/30 (1×30 cm) (파마시아)
UV 모니터: 280 nm
펌프: 0.2 ml/분
완충액: 50 mM 인산염/150 mM NaCl pH 7.2
이러한 조건하에서, HSA 피크는 통상 63분후 발견되고, HSA 이량체에 의해 생긴 작은 피크는 또한 약 57분정도에 측정될 수 있다. GPC에 의해 수득된 크로마토그램은 다음과 같이 분석될 수 있다:
4.2도 1은 HSA와 옥스-HES 130 kD의 결합(결합 III)후, 생성물의 크기 분포를 보여주는 크로마토그램이다. 이러한 결합 방법을 가지고, HOBt 활성화없이 매우우수한 결과가 얻어졌다. 분명한 단일의 넓은 피크가 37분에 측정되고, 추가의 더 작은 밴드가 45분에 측정되었는데, 이는 결합 생성물이 HSA보다 더 큰 분자량을 갖는다는 것을 나타낸다. 동시에, 비-변형된 HSA의 흔적이 발견되었다.
도 2는 HSA와 옥스-HES 130kD의 결합(결합 IV)후 생성물의 크기 분포를 보여준다. 반응은 HOBt로 활성화되었다. 이 활성화가 가능하게는 2차 반응을 촉진시키므로써 수율을 감소시키는 것으로 보여진다.
도 3 및 도 4는 HSA와 옥스-HES 130kD의 결합반응(결합 V) 도중 및 결합반응후, 반응 생성물의 크기 분포를 보여준다. 2시간의 반응후, 비-변형된 HSA가 가장 높은 농도를 갖는 생성물로서 발견되었으나, 또한 보다 큰 분자량을 갖는 제1 결합 생성물이 발견되었다. 반응이 종결된 후, 약 35분의 체류 시간을 갖는 동질의 결합 생성물이 높은 농도로 발견되었다. 비-변형된 HSA와 다른 결합 생성물이 비교적 낮은 농도로 존재한다.
도 5는 HSA와 옥스-HES 10kD의 결합반응(결합 V) 도중 및 결합반응후, 반응 생성물의 상응하는 크기 분포를 보여준다. 또한, HSA의 중량위에 있는 분자량을 갖는 결합 생성물의 농도는 반응 도중 증가하는 것이 보여진다.
마지막으로, 거의 모든 HSA 분자가 동질의 결합 생성물로 전이될 수 있는 결합 반응이 도 6에 도시되어 있다(결합 VII의 반응 생성물).
4.3HSA와 HES의 직접 결합의 분석시 얻어진 크로마토그램의 예가 도 7 (방법 B, HES 130kD, 결합 V)에 도시되어 있다. 의미있는 피크가 약 65분에서 발견되었다(HSA). 그러나, 결합 생성물도 또한 보여진다 (약 42분에서의 피크).
실시예 5: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 결합 생성물의 분석
5.1PAGE를 비오라드로부터의 미니프로틴 II(Miniprotean II) 및 7.5 % 아크릴아미드 겔을 사용하여 나트륨 도데실 술페이트(SDS)의 존재하에 실시하였다. 전기영동을 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 단백질을 눈으로 볼 수 있도록 하기 위해, 블룸 방법(ElektrophoresisVol.8, 1997, p. 93-99)을 사용하여 겔을 은으로 착색하였다.
결합 생성물내 글리칸의 존재가 로슈-베링거로부터의 글리칸-검출-키트 및 웨스턴 블롯을 사용하여 검출되었다. SDS-PAGE에 의한 생성물의 분리후, 이들은 미니프로틴 II 전기영동 단위의 블롯팅 장치를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 전이되었다. 그 다음 근접한 OH그룹만이 산화되는 조건하에 과요오드산염을 사용하여 막을 산화시켰다. 그 다음 이를 아미노-작용화된 디곡시게닌과 반응시켰다. 결합된 디곡시게닌이 알칼리성 포스파타제에 결합된 특정 모노클로날 항체를 이용하여 검출되었다. 이를 위해, 포스파타제의 기질(4-니트로-테트라졸리움 클로라이드/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트)을 가하는데, 이는 용해되기 어려운 블루-바이올렛 생성물을 생성한다. 이 생성물은 막에 침전하여 밴드를 눈으로 볼 수 있게 해준다. 비-변형된 HSA 및 크레아티나제는 음성 대조군으로서 사용되는 반면, 트랜스페린은 양성 대조군으로서 사용되었다.
정확한 방법 단계들이 이 키트(로슈-베링거)에 첨부된 지시서에 기재되어 있다.
5.2도 8 및 도 9는 각각 은으로 착색된 SDS-PAGE 겔의 그림(상부) 및 글리칸 검출과 막으로의 전이후 상응하는 생성물의 그림(하부)를 보여준다. 이들 도면으로부터 유추될 수 있는 바와 같이, 비교적 동질의 글리칸이 결합 반응 도중 반응 생성물로서 형성되는 반면, 동시에 비-변형된 HSA의 농도는 감소한다.
실시예 6: 잠재적 2차 반응의 분석
HES의 산화된 환원 말단 그룹과의 자기-응축 형태의 2차 반응이 일어나는 지의 여부를 판단하기 위해, 다음의 반응 혼합물을 제조하였다:
ox-HES EDC HOBt 물 반응시간
HES 130 kD 500mg1.2×10-5mol 15mg7.8×10-5mol - 5.0ml 30시간25℃
HES 130 kD 500mg1.2×10-5mol 15mg7.8×10-5mol 포화용액 5.0ml 30시간25℃
HES 10 kD 100mg2.7×10-5mol 3.4mg1.8×10-5mol - 5.0ml 30시간25℃
HES 10 kD 100mg2.7×10-5mol 3.4mg1.8×10-5mol 포화용액 5.0ml 30시간25℃
HES 130 kD 700mg1.6×10-5mol 31mg1.6×10-4mol - 5.0ml 30시간25℃
HES 130 kD 700mg1.6×10-5mol 31mg1.6×10-4mol 포화용액 5.0ml 30시간25℃
표 4: 2차 반응의 분석을 위한 반응 혼합물
실험의 목적은 HOBt의 존재하 또는 부재하에 HES의 잠재적 자기-응축 어느 정도까지 일어나는 지를 보여주는 것이다. 샘플을 동결건조하여 분석 수행을 위해프레세니우스-카비(Fresenius-Kabi)로 보냈다.
수 %의 검출 한계내에서 GPC 및 광-산란 측정을 이용하여 조사한 결과, 분자량에 있어 증가는 발견되지 않았다.
실시예 7: DNA와 산화된 HES의 결합 및 결합 생성물의 작용성 분석
반응 원리:
반응의 도식이 표 10에 기재되어 있다. 제 1단계에서, 아민-HES12KD3의 아미노 그룹이 SMCC4의 N-히드록시숙신이미드 그룹과 반응하여 결합물5를 형성한다. 반응하지 않은 SMCC4를 원심분리/투석 단위를 이용한 원심분리에 의해 분리한다. 이어 결합물5의 말레이미드 그룹을 티오-DNA1의 티올 그룹과 반응시켜 목적하는 생성물6을 제조한다. 진하게 표시된 영역6은 단지 스페이서를 나타내며 어떠한 형태라도 가질 수 있다.
결합물6의 생물학적 활성의 평가를 제한 효소 EcoR1을 이용한 제한을 통해 수행하였다. 제한 효소는 단지 본래의 인지 서열을 갖는 이중-나선 DNA를 갈라 놓는다.
DNA:
합성된 이중 나선 DNA(MWG Biotech Corporation, Ebersberg, Germany)를 사용하였다. 단일 스트랜드의 서열은 다음과 같다:
서열 번호 1 (SEQ ID NO.1)
5'-GTAGAGACAGGAGGCAGCAGTTGAATTCGCAGGGTGAGTAGCAGTAGAGC-3';
서열 번호 2 (SEQ ID NO.2)
5'-GCTCTACTGCTACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTCCTGTCTCTAC-3';
MWG에 의해 5' 티올 C6 S-S로 변형됨.
두 개의 DNA 단일 스트랜드를 2 μg/μl의 농도로 (bidest) 물에 용해시켜, 2 μg/μl의 농도를 갖는 이중-나선 티오-DNA1과 96 ℃에서 1:1의 비율로 하이브리드화하였다.
생성물의 분석:
각각의 경우에 100 ml 겔당 50 μg 에티디움 브로마이드의 존재하에 1 μg DNA를 사용하여 1 mM EDTA과 45 mM 트리스 보레이트로 이루어진 TBE 러닝 완충액(pH 8.0)을 가지고 4 % 아가로스 겔상에서 겔 전기영동에 의해 분석을 수행하였다. 312 nm에서 UV 트랜스실루미네이터 UVT-20 S/M/L(Herolab, Wiesloch, Germany)과 CCD-시스템 모듈러(INTAS Imanging Instruments, Gottingen, Germany)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
반응 혼합물 1 μl (1 μg DNA)를 취해, 1 μl (20 U) EcoR1 제한 효소 (New England Biolabs, Schwalmbach/Taunus, Germany), 1 μl 반응 완충액 (50mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 트리스 HCl, 10 mM 마그네슘 클로라이드, 0.025 % 트리톤 X-100, pH 7.5, New England Biolabs으로부터 구입) 및 7 μl (bidest) 물로 37 ℃에서 3 시간동안 분할하였다.
HES의 변형
옥스-HES12KD2로 요오드 용액을 이용한 12,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는HES12KD (Fresenius, Lot 2540SR2.5P)의 산화를 문헌 (DE 196 28 705)에 기재된 방법에 따라서 수행하였다.
옥스-HES 12KD2와 1,4-디아미노부탄의 반응:
1.44 g (0.12 mmol)의 옥스-HES12KD2를 수분이 없는 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시키고, 질소하에 1.5 ml(1.50 mmol)의 1,4-디아미노부탄 용액에 적가하여, 19시간동안 40 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 80 ml 에탄올과 80 ml 아세톤의 혼합물에 가하였다. 형성된 침전물을 원심분리하여 40 ml 물에 재현탁시켰다. 용액을 물에 대해 4일 동안 투석한 후(스나케스킨 투석관, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland, Bonn, Germany), 이어 동결건조하였다. 수율은 80%(1.06 g) 아미노-HES12KD3이었다.
티오-DNA1과 아미노-HES12KD 3의 결합
50 μl 수분이 없는 DMSO에 용해된 1 mg SMCC4를 150 mM 나트륨 클로라이드와 10 mM 나트륨 포스페이트의 완충액(pH 7.44)내 아미노-HES12KD3의 10 mg/ml-용액 400 μl에 부가하고, 혼합물을 실온에서 80분간 그리고 46 ℃에서 10분간 배양하였다. 이어, 혼합물을 원심분리하고 상등액을 침전물로부터 분리하여 다시 원심분리하였다. 상등액 200 μl을 취해 마이크로콘 YM-3 (아미콘, 밀리포아, 에쉬본, 독일) 원심분리-투석 단위를 사용하여 14000 g에서 45분동안 원심분리하였다. 10 mM 나트륨 포스페이트와 150 mM 나트륨 클로라이드로 이루어진 완충액(pH 7.44) 400 μl의 부가후, 그것을 다시 45분동안 원심분리하였다. 추가의 400 μl 완충액을 가하고 그것을 60분동안 원심분리하였다. 투석 단위에 남겨진 결합 용액의 양을 최대 50 μl까지 채웠다. 이 용액 10 μl를 10 μl의 티오-DNA 용액1에 가하고, 이 둘을 실온에서 14시간동안 서로 반응시켰다. 1 μl를 분석을 위해 취했다. 도 11은 2 및 3 레인에서 결과를 보여준다.
기재된 실험 및 변형된 반응 조건을 갖는 실험을 위한 반응 조건이 표 1에 요약되어 있다. 결과를 도 11에 나타낸다.
결과의 요약:
다음 조건을 분석하였다:
1. SMCC의 양: 각각 1 mg (2, 6, 10, 14 레인) 또는 5.6 mg (4, 8, 12, 16 레인);
2. 티오-DNA1과의 반응을 위한 온도: 각각 실온 (2, 4, 6, 8 레인) 또는 37 ℃ (10, 12, 14, 16 레인)
3. 완충액 조건:
각각 10 mM 인산염, 150 mM 나트륨 클로라이드(EDTA 없음), pH 7.44 (2, 4, 10, 12 레인) 또는 100 mM 인산염, 150 mM 나트륨 클로라이드 + 50 mM EDTA, pH 7.23 (6, 8, 14, 16 레인)
도 11에서, 2 내지 18 레인은 SMCC를 사용한 티오-DNA1과 아미노-HES12KD3의 8 결합 실험의 결과를 나타낸다. 반응으로부터 직접적인 결과 또는 반응과 DNA의 후속 분해후의 결과가 각각 다음에서 서로 보여진다. 1 레인에서, 상이한 참고 DNA들의 혼합물이 길이 마커로서 부하된다. 18 레인과 19 레인은 각각 티오-DNA1또는 분해된 티오-DNA1을 보여준다. 반응하지 않은 티오-DNA1이외에, 모든실험은 보다 높은 매쓰(mass)에서 결합 생성물을 보여준다 (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 레인). HES12KD는 서로 다른 크기 분자의 혼합물이므로, 결합 생성물은 또한 분자량 분포를 나타낸다. 모든 결합 생성물은 그들이 EcoR1에 의해 완전하게 분해될 수 있기 때문에 본래의 DNA를 포함한다.
이는 또한 분해후 상응하는 확산 밴드의 거의 완전한 소멸에 의해 입증된다 (3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 레인).
표 1: 티오-DNA1과 아미노-HES12KD3의 결합의 반응 조건
레인 실험 온도[℃] SMCC[mg] DNA HES12KD 완충액
1 마커
2 19A1 RT 1 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.44,10 mM
3 분해
4 19B1 RT 5.6 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.44,10 mM
5 분해
6 19C1 RT 1 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.23,100 mM
7 분해
8 19D1 RT 5.6 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.23,100 mM
9 분해
10 19A2 37℃ 1 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.44,10 mM
11 분해
12 19B2 37℃ 5.6 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.44,10 mM
13 분해
14 19C2 37℃ 1 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.23,100 mM
15 분해
16 19D2 37℃ 5.6 티오-DNA 아미노-HES12KD 7.23,100 mM
17 분해
18 티오-DNA
19 분해
본 발명에 따라 제조된 결합물은 활성 성분의 활성 및 HAS의 이로운 특성을 보유할 뿐 아니라, 활성 성분의 개선된 생체내 반감기, 감소된 독성, 활성 성분의 개선된 안정성 및/또는 개선된 용해도를 나타내므로써 질병의 진단 및 치료의 용도로 유용하게 시용될 수 있다.

Claims (72)

  1. 반응 매질이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 하는, HAS 및 활성 성분이 반응 매질내에 혼합되어 있는, 공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조방법에 의해 수득가능한 HAS-활성 성분 결합물.
  2. HAS가 활성 성분에 직접 또는 링커에 의해 결합되어 있는 HAS 및 활성 성분의 결합물을 포함하는 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 성분이 비타민, 백신, 톡신, 항생제, 항부정맥제, 식욕 억제제, 마취제, 진통제, 항류머티즘제, 항알러지제, 항천식제, 항우울제, 항당뇨제, 항히스타민제, 항고혈압제 또는 항종양제 화합물인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 호르몬, 스테로이드, 지질, 단백질, 올리고- 또는 폴리펩티드 또는 핵산, 특히 D-DNA, L-DNA, D-RNA 또는 L-RNA와 같은 D- 또는 L-핵산인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 효소, 효소-억제제, 수용체, 수용체-단편, 인슐린, VIII 인자, IX 인자, 시토킨, 인터페론, 인터류킨, 성장 인자, 펩티드-항생제, 바이러스성 피막 단백질, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 알부민, hTPA, 항체, 항체-단편, 단일 쇄-항체 또는 그의 유도체인 화합물.A, L-DNA, D-RNA 또는 L-RNA와 같은 D- 또는 L-핵산인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 스테로이드 호르몬, 아미노산으로부터 유도된 호르몬 또는 지방산으로부터 유도된 호르몬인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, HAS가 활성 화합물의 ε-NH2-그룹,-NH2-그룹, SH-그룹, COOH-그룹 또는 -C(NH2)2-그룹에 결합되어 있는 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, HAS가 히드록시에틸 전분이고 바람직하게는 1 내지 300 kDa, 바람직하게는 5 내지 200 kDa의 평균 분자량을 갖는 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 히드록시에틸 전분은 각각 히드록시에틸 그룹에 대해 2 내지 20 범위의 C2:C6치환 관계 및 0.1 내지 0.8의 치환 몰도(molar degree)를 갖는 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항종양 활성 성분이 알킬화제, 항물질대사제, 항생제 또는 천연 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 항종양 성분이 미토마이신 C, 시클로포스파미드, 블레오마이신, 클로람부실, 시스플라틴, 아라-C, 플루다라빈, 독소루비신, 에토포시드, 5-FU, MTX, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 히드록시우레아, 6-MP 또는 CCNU에 결합되어 있는 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 항종양 성분이 히드록시에틸 전분의 환원 말단 그룹에 결합되어 있는 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 항종양 활성 성분이 미토마이신 C인 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 히드록시에틸 전분이 미토마이신 C의 메톡시 그룹에 결합되어 있는 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 히드록시에틸 전분이 링커를 통해 미토마이신 C의 메톡시 그룹에 결합되어 있는 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 시토킨을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 시토킨이 IL-2, α-인터페론 또는 γ-인터페론인 약학 조성물.
  20. 종양 및/또는 그의 전이 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제10항 내지 제15항중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 비뇨기 종양 및/또는 비뇨기 종양의 전이 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 용도.
  22. 제21항에 있어서, 약학 조성물이 간세포 종양 또는 간세포 종양의 전이를 치료하는데 사용되는 약학 조성물을 제조하기 위한 용도.
  23. 제22항에 있어서, 약학 조성물이 깨끗한 세포 또는 크로모필 신장 세포 종양의 치료를 위해 제조되는 용도.
  24. 제20항에 있어서, 약학 조성물이 림프계 무질서를 치료하는데 사용되는 용도.
  25. 제24항에 있어서, 림프계 무질서가 CLL, 호치킨 림폼, NHL, 다발성 골수종, 모버스 발덴스트룀인 용도.
  26. 제25항에 있어서, 항종양 활성 성분이 글루타라빈인 용도.
  27. 제10항에 있어서, 종양이 투탄, 국소의 일차 악성 종양 또는 그의 전이인 용도.
  28. 제27항에 있어서, 종양이 혈액계 질병 또는 종양 질병, 예를 들어, 작지 않은 세포 또는 세포 기관지 종양, 유방 종양, 식도판 상피 종양, 신장 세포 종양, 고환 종양, 악성 흑색종, ALL 또는 CML인 용도.
  29. 제20항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물이 시토킨을 추가로 포함하는 용도.
  30. 제20항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서, 시토킨이 IL-2, α-인터페론 또는 γ-인터페론인 용도.
  31. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 활성 성분이 나트륨 채널 차단제, β-수용체 차단제, 재분극의 선택적 상승제, 칼슘 길항제 및 국소 마취제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  32. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 활성 성분이 아데노신, 키니딘, 프로카인 아미드, 디이소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 아자말린, 파즈말리움, 프로파페논, 아테놀롤, 프로파놀롤, 아미오다론, 소타롤, 베라파밀, 갈로파밀 또는 딜티아젬인 화합물.
  33. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 화합물이 히드록시에틸 전분의 환원 말단 그룹에 결합되어 있는 화합물.
  34. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 화합물이 아데노신인 화합물.
  35. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 활성 성분이 아미노 그룹을 통해 히드록시에틸 전분에 결합되어 있는 아데노신인 화합물.
  36. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항부정맥 활성 성분이 링커를 통해 히드록시에틸 전분에 결합되어 있는 화합물.
  37. 제31항 내지 제36항중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  39. 심장 박동 질병 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제31항 내지 제36항중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  40. 세포사멸(apoptosis)이 바람직하게는 종양 조직내에서 유도되는 세포사멸 유도용 약학 조성물을 제조하기 위한 제31항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  41. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 항감염 활성 성분 또는 항생제로서, 바람직하게는 아미노페니실린, 세팔로스포린, 아미노세팔로스포린, 베타-락탐-항생제, 카바페넴, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 마크로리드-항생제, 지라제-억제제, 글리코펩티드-항생제, 린코마이신, 스트렙토그라민, 에버니노미신, 옥사졸리디논, 니트로이미다졸, 술폰아미드, 소트리목사졸, 국소 항생제,바이러스억제제, 항균제 또는 결핵억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  42. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 암피실린, 아목시실린, 세포탁심, 세프타지딤, 반코마이신, 클린다마이신, 메트로니다졸, 이소니아지드, 리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴, 에탐부톨, 피라시나미드, 스트렙토마이신, 프로티온아미드 또는 답손인 화합물.
  43. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 암피실린, 아목시실린, 마크로리드 또는 스트렙토마이신과 같은 아미노페니실린인 화합물.
  44. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 아미노페니실린의 아미노 그룹을 통해 히드록시에틸 전분에 직접 공유결합되어 있는 아미노 페니실린인 화합물.
  45. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 에리트로마이신 또는 그의 유도체인 화합물.
  46. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 에리트로마이신 유도체가 에리트로마이실 아민인 화합물.
  47. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 스트렙토마이신인 화합물.
  48. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 히드록시에틸 전분의 환원 말단 그룹에 결합되어 있는 화합물.
  49. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 항감염 활성 성분이 히드록시에틸 전분에 리커에 의해 결합되어 있는 화합물.
  50. 제41항 내지 제49항중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  52. 감염성 질병 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제41항 내지 제49항중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  53. 제52항에 있어서, 약학 조성물이 세포내 감염제에 의해 유발된 감염성 질병을 치료하는데 적합한 용도.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 약학 조성물이 세균, 바이러스, 또는 기생 병원체,마이코플라즈마, 마이코박테리아, 클라미디아 또는 리케치아와 같은 임의 병원체 유발제 또는 병원체에 의해 유발된 감염성 질병을 치료하는데 적합한 용도.
  55. 반응 매질이 물 또는 적어도 10 중량% 물을 포함하는 유기 용매와 물의 혼합물임을 특징으로 하는, HAS 및 활성 성분이 반응 매질내서 결합되어 있는, 공유 HAS-활성 성분 결합물의 제조방법.
  56. 제55항에 있어서, 활성 성분이 비타민, 백신, 톡신, 항생제, 항부정맥제, 식욕 억제제, 마취제, 진통제, 항류머티즘제, 항알러지제, 항천식제, 항우울제, 항당뇨제, 항히스타민제, 항고혈압제 또는 항종양제 화합물인 제조방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 활성 성분이 호르몬, 스테로이드, 지질, 단백질, 올리고- 또는 폴리펩티드 또는 핵산인 제조방법.
  58. 제55항 내지 제57항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 효소, 효소-억제제, 수용체, 수용체-단편, 인슐린, VIII 인자, IX 인자, 씨토킨, 인터페론, 인터류킨, 성장 인자, 펩티드-항생제, 바이러스성 피막 단백질, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 알부민, hTPA, 항체, 항체-단편, 단일 쇄-항체 또는 그의 유도체인 제조방법.
  59. 제56항 내지 제58항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 스테로이드 호르몬, 아미노산으로부터 유도된 호르몬 또는 지방산으로부터 유도된 호르몬인 제조방법.
  60. 제1항 내지 제59항중 어느 한 항에 있어서, HAS가 활성 화합물의 ε-NH2-그룹,-NH2-그룹, SH-그룹, COOH-그룹 또는 -C(NH2)2-그룹에 결합되어 있는 제조방법.
  61. 제1항 내지 제60항중 어느 한 항에 있어서, HAS가 활성 성분에 결합되기 전에 산화되는 제조방법.
  62. 제61항에 있어서, HAS의 환원 말단 그룹이 선택적으로 산화되는 제조방법.
  63. 제1항 내지 제62항중 어느 한 항에 있어서, HAS의 산화된 환원 말단 그룹이 활성 성분의 아미노 그룹에 결합되어 아미드를 생성하는 제조방법.
  64. 제1항 내지 제63항중 어느 한 항에 있어서, 아미노 그룹이 쉬프 염기가 형성되도록 HAS에 결합되는 제조방법.
  65. 제63항에 있어서, 쉬프 염기의 아드소미틴 그룹 -CH=N- 이 메틸렌 아민 그룹 -CH2-NH- 로 환원되는 제조방법.
  66. 제1항 내지 제65항중 어느 한 항에 있어서, BH4-가 환원제로서 사용되는 제조방법.
  67. 제1항 내지 제66항중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분 또는 HAS가 결합물의 제조전에 링커에 결합되는 제조방법.
  68. 제1항 내지 제67항중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 300 kDa의 평균 분자량(평균 중량)을 갖는 히드록시에틸 전분이 사용되는 제조방법.
  69. 제1항 내지 제68항중 어느 한 항에 있어서, 평균 분자량 2 내지 40 kDa를 갖는 히드록시에틸 전분이 사용되는 제조방법.
  70. 제1항 내지 제69항중 어느 한 항에 있어서, 각각 히드록시에틸 그룹에 대해 2 내지 20 범위의 C2:C6치환비 및 0.1 내지 0.8의 치환 몰도(molar degree)를 갖는 히드록시에틸 전분이 사용되는 제조방법.
  71. 제55항 내지 제70항중 어느 한 항에 따라 HAS 활성 성분이 제조되어 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 보조 화합물과 혼합되는 단계를 포함하는 약학 또는 진단 조성물의 제조방법.
  72. 제71항에 따라 수득가능한 약학 조성물.
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