KR20030074589A

KR20030074589A - 우로코르틴 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20030074589A
Application number: KR10-2003-7001559A
Authority: KR
Inventors: 베일윌리더블유; 사우첸코폴에프; 루이스케티에이; 바우한조안엠; 레이스테레사엠; 리비어진이; 호게네슈존비; 페린마릴린에이취
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2003-09-19
Anticipated expiration: 2021-07-31
Also published as: JP4873825B2; CN1484650A; US20050191650A1; EP1305334B1; ATE408622T1; DE60135850D1; CY1110424T1; IL154102A; ES2313978T3; WO2002012307A1; CN1484650B; CA2418144C; PT1305334E; DK1305334T3; US20070191592A1; US20100168021A1; US6838274B2; RU2278871C2; EP1305334A1; IL154102A0

Abstract

CRF 신경펩타이드류와 상당한 서열 상동성이 있는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 동정되었다. 본 발명에서 우로코르틴 II로 지정된 예측된 38개 아미노산 펩타이드 단백질을 암호화하는 전뇌 폴리(A+) RNA로부터 마우스 cDNA를 분리하였다. 사람의 URP와 마우스 구성원인 CRF와 우로코르틴(Ucn) 펩타이드들은 모두 기본 조건 및 스트레스 조건하에서 시상하부-뇌하수체-부신 축의 조절에 관여하는 바, 이는 URP와 Ucn II의 역할이 유사함을 시사한다. 합성된 Ucn II와 URP 펩타이드는 CRF-R1 보다는 CRF-R2에 높은 친화성으로 결합한다. Ucn II와 사람 URP는 체온과 식욕을 조절하는데 관여하는 것으로 보이며, 다른 스트레스 관련 현상에도 중요한 역할을 할 수 있다. 이와 같은 발견으로, 중추적으로 발현되어 CRF-R2에 결합하는 CRF류의 신경펩타이드의 새로운 구성원으로서 Ucn II와 사람 URP를 확인하였다.

Description

우로코르틴 단백질 및 이의 용도{Urocortin proteins and uses thereof}

코르티코트로핀 방출 인자(CRF)는 타입 1의 CRF 수용체가 매개하는 효과인 스트레스에 대한 뇌하수체-부신 반응의 개시에 없어서는 안되는 역할을 하는 것으로 가장 잘 알려진 41개 아미노산 펩타이드이다(참조번호: 1) . 또한, 코르티코트로핀 방출 인자는 뇌에 널리 분포되어 있고, 다양한 위험 환경에 상보적인 자율 및 행동 적응의 운용에 관여하는 것으로 여러번 밝혀진 바 있다(참조번호: 2,3). 이것은 코르티코트로핀 방출 인자 및 이와 관련된 펩타이드류가 기본 조건 및 스트레스 조건하에서 시상하부-뇌하수체-부신 축(HPA)의 조절에 중요한 역할을 한다는 널리정연된 가설을 지지하였다(참조번호: 4, 5). 또한, 코르티코트로핀 방출 인자는 많은 조직에서 다른 신경내분비 반응 및 주변분비 반응에 관여하는 것으로 추정되고 있다. CRF류의 성분들은 스트레스 요인에 대한 내분비 반응, 자기분비 반응 및 행동 반응들을 통합 조정한다. 이 펩타이드들은 또한 식욕, 각성 및 인식 기능의 조절에도 관여할 수 있다. 장기간의 스트레스 효과에 대한 결과로서 불안증, 신경성 식욕부진 및 우울증과 같은 심각한 정신적 및 생리적 결과가 일어날 수 있다.

코르티코트로핀 방출 인자류의 성분들은 고친화성인 CRF 수용체에 특이적으로 결합하여 자신들의 생물학적 작용을 매개한다(참조번호: 6,7). CRF 수용체는 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase)를 통해 작용하고 구조적으로 세크레틴류와 관련이 있는 G-단백질 결합 수용체이다. 이 세크레틴류에는 또한 GRF, VIP, PTH 및 칼시토닌 수용체가 있다. CRF 수용체 유전자는 13개의 엑손을 갖고 있으며, 이 수용체의 여러가지 스플라이싱 변형체도 밝혀져 있다. CRF-R1 수용체는 뇌에 분포되어 있고 감각 및 운동 릴레이 부위에서 발견된다(참조번호: 8). CRF-R2β는 CRF-R1이 매우 적게 발현되거나 전혀 발현되지 않는 부위인 측격막, 복부 중앙 시상하부, 고속의 핵 및 등쪽 솔기핵에 분포되어 있다(참조번호: 9). CRF-R2β는 대부분 심장, 혈관, 위장관, 부고환, 폐 및 피부를 비롯한 말초 부위에서 발견된다(참조번호: 7,10). 이와 같은 2가지 형태의 수용체의 약리학은 코르티코트로핀 방출 인자가 CRF-R1에 대해서는 높은 친화성(Ki=1 내지 2nM)이지만, CRF-R2에 대해서는 친화성이 낮다(Ki=15 내지 100nM)는 점에 차이가 있다. 다른 관련 펩타이드들인 잉어의 우로텐신(urotensin), 개구리의 사우바긴(sauvagine) 및 우로코르틴은 CRF-R2에 대해서 높은 친화성이 있다. CRF-R2 녹아웃 마우스는 스트레스 요인에 대한 과민성에 의해 유발되는 증가된 불안과 유사한 행동을 보인다(참조번호: 11).

스트레스와 유사한 자율 및 행동 반응을 유도해내는데 있어서 펩타이드 작용 부위로서 밝혀진 다양한 세포 그룹들에는 필요 리간드(들), 수용체(들) 또는 양자의 발현이 결실되거나 희박한 것으로 밝혀져 있다(참조번호: 12,13). 이러한 현상으로 인하여 현재 2개의 리간드, 2개의 상이한 유전자에서 유래되는 G 단백질 결합 수용체(CRF-R1 및 CRF-R2) 및 기능이 완전히 밝혀져 있지 않은 하나의 결합 단백질을 포함하는 다른 CRF 관련 시그날 전달 분자에 대한 연구가 활발해졌다(참조번호: 14,15).

제2의 포유동물 CRF 관련 신경펩타이드인 우로코르틴(Ucn)이 최근 발견되었는데(참조번호: 16), 이것은 CRF가 CRF-R1에 우선적으로 결합하는 반면 공지의 두 CRF 수용체 유형에 높은 친화성으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 중추로 투여된 우로코르틴은 식욕을 억제하는데 있어서 CRF 보다 더 강력하였지만 급성 불안 유사 증상 및 일반적인 행동 활성화를 발생시키는데에는 보다 강력하지 못하였다(참조번호: 17). 이는 우로코르틴이 최소한 부분적으로는 CRF-R2에 대한 내인성 리간드로서 작용하여 초기에 CRF에 기인하는 몇몇 스트레스 관련 효과를 매개할 수 있음을 시사하는 것으로 간주되었다. 그러나, 이러한 견해는 뇌에 존재하는 우로코르틴 발현에 관여하는 주요 세포 부위가 주요 스트레스 관련 회로의 필수 성분으로서 인식되지 않으며 CRF-R2 발현이 일어나는 대부분의 주요 부위가 우로코르틴 함유 투사물에 의해 거의 활성화되지 않는다는 관찰들과는 상충된다(참조번호: 18). 이와 같은 발견 및 기타 발견들은 포유 동물 뇌에 하나 이상의 추가 CRF 수용체 리간드가 존재할 가능성이 있음을 지지하는 것이다.

종래 기술에서는 추가 우로코르틴 유전자 및 단백질에 대한 인식이 부족하다는 문제점이 있었다. 본 발명은 이와 같은 기술 분야의 오랜 염원을 충족시키는 것이다.

발명의 요약

사람 게놈과 마우스 게놈의 서열 데이터 축적이 급진전되어 많은 단백질류의 새로운 성분들을 동정할 수 있는 기회를 제공하게 되었다. 새로운 펩타이드 서열인 사람 우로코르틴 관련 펩타이드(URP)는 공개된 사람 게놈 데이터베이스를 통해 확인하였다. 우로코르틴 관련 펩타이드 서열은 사람의 우로코르틴(44%), 잉어의 우로텐신(39%) 및 사람의 CRF(36%)에 대해 상동성을 갖고 있다. 합성된 우로코르틴 관련 펩타이드는 CRF-R1(Ki=70nM) 보다 CRF-R2(Ki=0.5nM)에 보다 높은 친화성으로 결합한다. 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드는 우로코르틴이나 CRF와 비교했을 때 효능은 훨씬 낮지만 래트의 뇌하수체 전엽 세포로부터의 ACTH 분비를 자극한다. 서열 상동성 조사 기구를 사용하여 CRF류의 신경 펩타이드에 속하는 새로운 성분을 나타내는 38개 아미노산 펩타이드를 암호하는 마우스 유전자를 동정하였다. 우로코르틴 II(Ucn II)라고 지칭한 이 펩타이드는 CRF-R2에 대해 높은 선택성으로 결합한다는 점에서 다른 공지의 성분들과 상이하다. 래트 뇌에 우로코르틴 II가 존재한다는 증거는 우로코르틴 II에 대해 고도로 특이적인 항체를 사용하여 면역조직화학 연구및 동일계내(in situ) 하이브리드화 연구를 통해 제시하였다.

본 발명의 제1 양태로서, 본 발명은 우로코르틴 II를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다. 이 서열은 우로코르틴 II를 암호화하는 분리 정제된 DNA; 높은 엄중 조건(65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 의미함) 하에 우로코르틴 II DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA; 및 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 서열 차이가 있는 우로코르틴 II를 암호하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택될 수 있다. 이 DNA는 바람직하게 서열 10 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 전구체를 암호화한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 우로코르틴 II를 발현할 수 있는 벡터에 관한 것이다. 이 벡터는 세포내에서 우로코르틴 II를 발현하는데 필요한 조절 인자와 우로코르틴 II를 암호화하는 DNA로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 이 벡터는 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다. 또한, 본 발명은 이 벡터로 형질감염되어 우로코르틴 II를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 단백질은 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포 중에서 선택되는 세포 종류에서 발현될 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 당해 단백질은 이. 콜리에서 발현된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 바와 같은 DNA로부터 암호화된 분리 정제된 사람 우로코르틴 II 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 서열 11에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 우로코르틴 II 단백질에 대해 지시된 항체를 제공한다. 이 항체는 모노클로날 항체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 우로코르틴 II 단백질을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 약제학적 조성물은 체온을 저하시키고, 식욕을 억제하며, 충혈성 심부전 및 다양한 스트레스 관련 질환을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다. 이 서열은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 분리 정제된 DNA; 높은 엄중 조건(65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 의미함) 하에 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA; 및 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 서열 차이가 있는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택될 수 있다. 이 DNA는 바람직하게는 서열 1 에 제시된 서열을 갖고 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 전구체를 암호화한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현할 수 있는 벡터에 관한 것이다. 이 벡터는 세포내에서 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현하는데 필요한 조절 인자와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 이 벡터는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다. 또한, 본 발명은 이 벡터로 형질감염되어 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 단백질은 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포 중에서 선택되는 세포 종류에서 발현될 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 당해 단백질은 이. 콜리에서 발현된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 바와 같은 DNA로부터 암호화된 분리 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 서열 3에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 대해 지시된 항체를 제공한다. 이 항체는 모노클로날 항체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 약제학적 조성물은 체온을 저하시키고, 식욕을 억제하며, 충혈성 심부전 및 다양한 스트레스 관련 질환을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질의 서열 및 각 아미노산이 변형된 우로코르틴 II 및 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 대한 다양한 변형체를 제공한다. 이와 같은 변형체로는 우로코르틴 II 및 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드에 형광성 라벨, 복합체화된 방사선핵종 및 독소를 접합시킨 접합체를 포함한다.

본 발명은 일부 연방 정부의 자금(교부 번호 DK-26741)을 받아 실시된 것으로, 연방 정부는 본 발명에 일부 권리를 갖고 있다.

본 발명은 개괄적으로 신경내분비학 분야와 스트레스에 관련된 기작에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 스트레스 반응에 관여하는 신규 코르티코트로핀 방출 인자와 관련된 펩타이드인 우로코르틴 II 및 사람 우로코르틴 관련 단백질에 관한 것이다.

전술한 본 발명의 특징, 장점 및 목적은 물론 이로부터 자명하게 알 수 있는 다른 특징, 장점 및 목적이 수득되고 상세하게 이해될 수 있도록, 상기 간략히 요약된 본 발명을 첨부되는 도면에 예시된 특정 양태들을 참조로 하여 보다 상세하게설명할 것이다. 이 도면은 본 명세서의 일부를 구성하는 것이다. 그러나, 첨부되는 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시하는 것이지, 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

도 1은 우로코르틴 및 CRF에 관련된 신규 펩타이드의 존재가 예측되는 사람 게놈 DNA 서열을 도시한 것이다. 이 게놈 서열은 공지의 데이터베이스에서 동정하여 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드의 신규 서열을 예측하는데 사용하였다. 추정상의 출발 부위는 위치 1이고, 성숙 펩타이드 서열은 진하게 표시된 부분이다. 예측되는 시그날 펩타이드 절단 부위는 화살표로 표시한 부분이다.

도 2는 추정상의 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 전구체를 도시한 것이다. 밑줄친 영역은 사람의 췌장섬 cDNA 라이브러리로부터 PCR로 분리한 부분 cDNA 서열을 나타낸다.

도 3은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드(URP)를 사람 Ucn, 우로텐신 I, CRF, 개구리 사우바긴 및 돔발상어류의 CRF/Uro와 비교하여 제시한 것이다. 최고 상동성 영역은 백색 박스 내에 있는 부분이다. 보존성 아미노산이 숫자로 표시되어 있다.

도 4A는 UcnII의 예측된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 진하게 표시된 출발 메티오닌은 박스친 부분인 펩타이드 암호 영역의 업스트림에 위치하고 있다. 전체 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크(수탁번호 AF331517)에 기탁하였다. 도 4B는 마우스 UcnII를 상동성인 사람 및 어류의 펩타이드(URP) 및 래트 Ucn 및/또는 래트/사람 CRF와 정렬시킨 것이다. 마우스 UcnII 서열과 동일한 잔기는 박스친 부분이다.■는 아미드화 부위를 나타낸 것이다.

도 5는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 매개로 한 CRFR1 및 CRFR2β에 대한¹²⁵I-사우바긴의 결합 치환반응을 도시한 것이다. CHO 세포에서 안정적으로 발현되는 CRFR1 및 CRFR2β에 대한 Ucn 및 URP 펩타이드들의 친화성은¹²⁵I-사우바긴의 경쟁적 치환반응으로 측정하였다. 이 데이터는 3회 실험의 대표값이고 억제 해리 상수(K_i)값(95% 신뢰도 범위)은 프리즘(Prism) 프로그램을 사용하여 계산하였다.

도 6A 내지 도 6C는 래트 뇌에서 나타나는 우로코르틴 II mRNA 발현 정도를 도시한 것이다. 암시야 광현미경 사진들은 마우스 우로코르틴 II cDNA로부터 생성된 동위원소로 표지된 안티센스 cRNA 프로브를 사용하여 선택 영역 상에서 관찰된 표지(백색 얼룩)를 나타낸 것이다. 양성의 하이브리드화 시그날은 시상하부의 실방핵(도 6A)과, 주로 이 핵의 확대세포성(magnocellular) 분열부(pm) 상에서 관찰되고, 많은 확산 시그날이 파르보세포(parvocellular) 측(mp)에서 관찰되며, 뇌간의 일부(LC; 도 6B), 안면 운동 핵(VII, 도 6C) 및 뇌의 복면에 있는 뇌막(men)에서 넓게 관찰된다. 다른 약어로서 CBL은 소뇌; v3은 제3 뇌실; v4는 제4 뇌실이다. 배율은 도 6A와 6B는 75배(X75)이고 도 6C는 50배(X50)이다.

도 7은 원시 시상하부에서 나타나는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 발현의 자동방사선사진이다. PVH는 실방핵, SO는 시색상핵, CN은 미상핵, och는 시각교차, me는 중앙 융기부, ac는 전교련, ic는 내부 피막, Sept는 격막을 나타낸다.

도 8A 내지 도 8F는 중심 우로코르틴 II 미량주사에 대한 반응으로 나타나는세포 활성화 패턴을 도시한 것이다. 도 8A 내지 도 8C 및 도 8E는 합성 마우스 우로코르틴 II 1㎍을 icv 주사한 후 2시간이 경과한 다음 사멸시킨 래트에서의 Fos 발현 유도를 나타내는 면역퍼옥시다제 제제의 명시야 광현미경사진이다. 도 8C와 도 8E에 제시된 것에 상응하는 영역에서 CRF-R2 mRNA의 하이브리드화 조직화학적 국재화를 나타내는 암시야 광현미경사진은 각각 도 8D와 도 8F에 제시하였다. 중심 우로코르틴 II 주사는 주로 실방핵의 파르보세포 분열(도 8A), 편도의 중심핵(도 8B) 및 고속의 핵(NTS, 도 8C)를 비롯한 중추 자율 및 신경내분비 조절에 관여하는 일군의 상호연관된 구조들에서 Fos 유도를 자극했다. 이 중에서 NTS만은 CRF-R2 발현 부위이다(도 8D). 다른 CRF-R2 발현의 주요 부위들로서 시상하부의 복중앙 핵 등은 조사된 펩타이드 용량 범위(1 내지 10㎍)에서 우로코르틴 II에 의해 유도되는 Fos 발현을 나타내지 못했다. 광현미경사진은 모두 75X 배율로 촬영한 것이다.

도 9는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드의 중심 주사후 다음과 같은 부위에서 핵의 FOS 발현의 자극을 조사함으로써 주요 스트레스 관련 세포 군의 활성화를 나타낸 것이다: 분계선조(stria terminalis)(BST), 시상하부의 실방핵(PVH), 편도의 중심핵(CeA), 측 부상완 핵(PBI), 뇌간의 일부(LC) 및 고속 핵(NTS). BSTov는 분계선조 침대핵(난형 아핵); ic는 내부 피막; CP은 미골핵, ac는 전교련; V3은 제3 뇌실; AHA는 전시상하부 영역; pm은 후 확장세포 부분(실방핵); fx는 원개; CeAm은 편도의 중심핵(중앙부); BLA는 편도의 기저측 핵; scp는 상부 소뇌각; PBel은 부상완 핵(외부 측부분); V4는 제4 뇌실; ep는 뇌실막; AP는 맨아래구역(area postrema); DMX는 미주신경의 등쪽 운동 핵; ts는 고속; cc는 중심관을 의미한다.

도 10A 및 도 10B는 음식 섭취 및 전체 운동 활동 시 중심 우로코르틴 II의 효과를 나타낸 것이다. 도 10A는 CRF, 우로코르틴 또는 우로코르틴 II를 icv로 1㎍ 투여한 후 야간 음식 섭취량의 평균(±SEM; n은 그룹 당 3 내지 6) 누적값을 나타낸 것이다. CRF와 우로코르틴은 식염수를 주사한 대조군에 비하여 주사후 4시간째부터 음식 섭취량을 크게 감소시킨 반면, 우로코르틴 II의 효과는 처치후 6시간까지도 크게 나타나지 않았다. *p<.002(CRF 및 Ucn 대 식염수). **p<.002(CRF, 우로코르틴 및 우로코르틴 II 대 식염수). 도 10B는 CRF를 icv로 주사한 동물에서 크게 상승된 전체 운동 활동을 원격 측정한 결과를 나타낸 것이다; 우로코르틴이나 우로코르틴 II는 운동 활동에 거의 영향을 미치지 않았다. *p<.001(CRF 대 식염수).

도 11은 우로코르틴 및 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 의한 래트의 뇌하수체 전엽 세포로부터 방출되는 ACTH 분비 자극을 도시한 것이다. 래트의 뇌하수체 전엽 세포를 배양물로 만들고 래트의 우로코르틴 또는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드로 처리하였다. ACTH 분비량은 키트(Nichols Institute Diagnostics)를 사용하여 측정하였다.

도 12는 본래의 CRF-R2β를 발현하는 A7R5 세포에 존재하는 cAMP 농도에 사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 미치는 효과를 도시한 것이다. cAMP 생산시 우로코르틴(○) 또는 hURP(●)와 30분 동안 항온처리하여 용량 의존적 효과를 관찰하였다. cAMP 함량은 RIA(Biochemical Technologies)로 측정하였다.

도 13은 래트들의 전체 운동 활동에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드(hURP)의 효과를 도시한 것이다.

도 14는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드(URP)를 뇌실내로 주사하여 래트의 체온에 미치는 효과를 도시한 것이다.

도 15는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드(hURP)를 뇌실내로 주사하여 래트의 야간 음식 섭취 효과를 도시한 것이다.

도 16은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드가 CRF-R1 및 CRF-R2에 작용하는 방식을 모델화하여 도시한 것이다. 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드는 CRF-R1 및 CRF-R2 모두에 결합하는 우로코르틴과 달리 CRF-R1에는 결합하지 않고 CRF-R2에만 높은 친화성으로 결합한다. CRF는 CRF-R2에는 결합하지 않고 CRF-R1에만 높은 친화성으로 결합한다.

본 발명에는 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 당해 기술분야에 속하는 재조합 DNA 기법들을 이용할 수 있다. 이와 같은 기법들은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 그 예로는, 문헌[Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volumes I and II(D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization"[B.D. Hames & S.J.Higgins Eds.(1985)]; "Transcription and Translation"[B.D. Hames & S.J. Higgins Eds. (1984)]; "Animal Cell Culture"[R.I. Freshney, ed. (1986)];"Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press(1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide To MolecularCloning"(1984)] 등이 있다. 따라서, 본원에 제시되는 다음과 같은 용어들은 하기 기술되는 정의를 의미하는 것이다.

본원에 사용된 "cDNA"라는 용어는 유전자의 mRNA 전사체의 DNA 카피를 의미한다.

본원에 사용된 "유도된 아미노산 서열"이란 용어는 cDNA 내의 뉴클레오타이드 염기들의 3중자(triplet) 서열을 판독하여 결정된 아미노산 서열을 의미하는 것이다.

본원에 사용된 "라이브러리 선별"이란 용어는 적당한 조건하에 특정 DNA 라이브러리에 존재하는 프로브에 상보적인 서열이 있는지를 검사하기 위하여 표지된 프로브를 사용하는 방법을 의미한다. 또한, "라이브러리 선별"은 PCR로 실시될 수 있다.

본원에 사용된 "PCR"이란 용어는 뮬리스(Mullis)에게 허여된 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호는 물론 당해 기술분야에 공지된 개량 문헌들의 요지인 폴리머라제 연쇄 반응을 의미한다.

본원에서 모든 아미노산 잔기 서열은 좌우 배향이 통상적인 아미노 말단에서 카복시 말단으로의 방향인 형식으로 제시되고 있다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 말단에 대시(-)는 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 다른 서열에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다.

본원에 기술된 아미노산은 "L" 이성질체 형태인 것이 바람직하다. 그러나, 목적하는 면역글로불린 결합의 기능적 성질이 폴리펩타이드에 의해 유지되기만 한다면 모든 L-아미노산 잔기 대신 "D" 이성질체 형태의 잔기로 대체될 수도 있다. NH₂는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 의미하는 것이다. COOH는 폴리펩타이드의 카복시 말단에 존재하는 유리 카복시기를 의미하는 것이다.

기존 아미노산의 화학적 변형이나 단백질의 인공 합성을 통해 비표준 아미노산이 단백질 중에 포함될 수도 있다. 비표준 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화된 20개의 표준 아미노산과 화학적 구조가 상이한 아미노산을 의미한다. 생체내에서의 해독후 변형은 단백질내 비표준 또는 아미노산 유도체의 존재를 유도할 수 있다. 단백질의 N-말단 NH₂및 C-말단 COOH 기도 역시 단백질의 천연 또는 인공 해독후 변형에 의해 변형될 수 있다.

단백질은 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 종종, 일부 변화가 단백질 활성의 유의적인 변화를 이끌 수도 있고, 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수도 있다. 보존적 치환은 단백질 활성을 급격하게 변형시킬 가능성이 적다. "보존적 아미노산 치환"은 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산이 치환되는 것을 의미하는 것으로서, 즉 비극성 아미노산의 다른 비극성 아미노산으로의 치환; 극성 아미노산의 다른 극성 아미노산으로의 치환; 산성 아미노산 잔기의 다른 산성 아미노산 잔기로의 치환 등을 의미한다. 바람직한 보존적 치환의 예에 대해서는 다음 표 1에 제시하였다.

"화학적 유도체"란 기능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩타이드를 의미한다. 이와 같이 유도체화된 폴리펩타이드로는 예를 들어 유리 아미노기가 아민 염산염, p-톨루엔 설포닐기, 카보벤족시 기, t-부틸로사이카보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기를 형성하기 위해 유도체화된 것을 포함한다. 유리 카복실기는 유도체화되어 염, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 또는 다른 형태의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성할 수 있다. 화학적 유도체는 20개 표준 아미노산의 천연 발생 아미노산 유도체를 하나 이상 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 세린 대신 치환될 수 있고, 오르니틴은 라이신 대신 치환될 수 있다. 본 발명에 포함되는 펩타이드로는 또한 본원에 서열이 제시된 특정 펩타이드에 대해 하나 이상의 잔기가 첨가 및/또는 결실된 펩타이드를 포함한다. 단, 변형된 펩타이드는 필수적인 생물학적 활성은 유지해야 한다.

"레플리콘(replicon)"은 생체내에서 DNA 복제의 독립적 단위로서 작용하는, 즉 자신의 통제하에 복제할 수 있는 모든 유전 인자(예, 플라스미드, 염색체, 바이러스)를 의미한다.

"벡터"는 부착된 분절의 복제를 유발시키기 위해서 다른 DNA 분절을 부착시킬 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.

""DNA 분자"는 일본쇄 또는 이본쇄 나선구조인 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 사이토신)의 중합 형태를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하며 특정 3차 형태를 한정하여 나타내는 것이 아니다.즉, 이 용어는 특히 선형 DNA 분자(예, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이본쇄 DNA를 포함한다. 본원에서 구조에 대한 논의는 DNA의 비전사 쇄(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 쇄)를 따라 5'에서 3' 방향으로 단지 서열을 제공하는 일반적인 관행에 따른다.

"복제 오리진"은 DNA 합성에 관여하는 DNA 서열을 의미한다.

DNA "암호 서열"은 적당한 조절 서열의 조절하에 배치되었을 때 생체내에서 폴리펩타이드로 전사 및 해독되는 이본쇄 DNA 서열을 의미한다. 암호 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에 있는 개시 코돈과 3' (카복시) 말단에 있는 해독 종지 코돈에 의해 결정된다. 암호 서열은 비제한적으로 원핵세포의 서열, 진핵세포의 mRNA 유래의 cDNA, 진핵세포 (예, 포유동물) DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그날 및 전사 종지 서열은 보통 암호 서열의 3'쪽에 위치하는 것이다.

전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호 서열을 발현시키는 DNA 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 종결 인자 등이다.

"프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제와 결합하여 다운스트림(3' 방향) 암호 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명의 설명상, 프로모터 서열은 그 3' 말단이 전사 개시 부위에 결합되고 업스트림(5' 방향)으로 신장하여, 배경농도 이상의 검출가능한 농도로 전사를 개시시키는데 필요한 최소의 염기 또는 인자를 포함한다. 프로모터 서열내에는 전사 개시 부위는 물론 RNA 폴리머라제의 결합에 중요한 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)도 볼 수 있다. 진핵세포의 프로모터는 항상은 아니지만 종종 "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 포함한다. 원핵세포의 프로모터는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 외에도 -10 컨센서스 서열 및 -35 컨센서스 서열을 포함한다.

"발현 조절 서열"은 다른 DNA 서열의 전사와 해독을 조절하고 제어하는 DNA 서열이다. 암호 서열은 RNA 폴리머라제가 암호 서열을 mRNA로 전사할 때 세포내에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하에" 있으며, 그 다음 mRNA는 암호 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독된다.

"시그날 서열"은 암호 서열의 부근에 포함될 수 있다. 이 서열은 폴리펩타이드의 N-말단에 있는 시그날 펩타이드를 암호화하여 숙주 세포가 폴리펩타이드를 세포 표면으로 유도하거나 폴리펩타이드를 배지로 분비하도록 유도하며, 이 시그날 펩타이드는 단백질이 세포로 방출되기 전에 숙주 세포에 의해 절단제거된다. 시그날 서열은 원핵세포 및 진핵세포 본래의 다양한 단백질과 결합된 상태로 관찰되어진다.

본원에서, 본 발명의 프로브로 언급되어 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 2개 이상의 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 3개 이상의 리보뉴클레오타이드로 이루어진 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는 많은 인자에 따라 다양하고 이어서 올리고뉴클레오타이드의 궁극적인 기능 및 용도에 따라 다양하다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "프라이머"는 뉴클레오타이드 및 유도 인자(예를 들어, DNA 폴리머라제)의 존재, 적합한 온도 및 pH에서, 핵산 쇄에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓여지는 경우 합성 개시점으로서 작용할 수 있는 정제된 제한 분해물로서 천연적으로 존재하거나 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오타이드를 언급한다. 프라이머는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있으며, 유도 인자의 존재하에 바람직한 신장 생성물의 합성을 개시시키기에 충분한 길이이어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 기원 및 사용방법을 비롯한 많은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 진단용인 경우 표적 서열의 복잡성에 따라 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 15 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 보통이며, 물론 이 보다 적은 수의 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다.

본원에서 사용된 프라이머는 특정 표적 DNA 서열의 상이한 쇄들에 "실질적으로" 상보적인 것으로 선택한다. 이것은 프라이머가 각각의 쇄들과 하이브리드하기에 충분한 상보성이어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은 반드시 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비상보성의 뉴클레오타이드 단편이 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있으며, 물론 나머지 프라이머 서열은 쇄에 상보성이어야 한다. 또는, 비상보성의 염기 또는 보다 긴 서열이 프라이머에 산재해 있을 수도 있다. 다만, 프라이머 서열은 서열과 충분한 상보성이 있어서 그 서열과 하이브리드하여 신장 생성물을 합성하는데 유용한 주형을 형성할 수 있어야 한다.

본원에 사용된 "제한 엔도뉴클레아제 및 제한 효소"란 용어는 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 그 부근에서 이본쇄 DNA를 절단하는 효소를 의미한다.

외인성 또는 이종성 DNA가 세포내로 도입되었을 때 세포는 그 DNA에 의해 "형질전환"된다. 형질전환용 DNA는 세포의 게놈내로 통합(공유 결합)되거나 통합되지 않을 수 있다. 원핵세포, 효모 및 포유동물 세포의 경우, 예를 들어 형질전환 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 인자에 유지될 수 있다. 진핵세포의 경우, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체내로 통합되어 염색체 복제를 통해 딸세포로 유전되는 세포이다. 이와 같은 안정성은 형질전환 DNA를 함유하는 딸세포 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 형성시키는 진핵세포의 능력으로 입증된다. "클론"은 단세포 또는 원종에서부터 유사분열에 의해 유래되는 세포 집단을 의미한다. "세포주"는 많은 세대 동안 시험관내에서 안정적으로 성장할 수 있는 1차 세포 클론이다.

2개의 DNA 서열은 소정 길이의 DNA 서열 상에서 뉴클레오타이드의 약 75% 이상(바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)이 일치하는 경우 "실질적으로 상동성"인 것이다. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 입수용이한 표준 소프트웨어를 사용하여 서열을 비교하거나 또는 예를 들어 특정 시스템마다 정해진 바와 같은 엄중 조건하에서의 서던 하이브리드화 실험으로 확인할 수 있다. 적당한 하이브리드화 조건은 당해 기술 분야에 통상적인 지식을 가진 자라면 용이하게 한정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., 상기문헌설명 참조; DNA Cloning, Vols. I & II, 상기문헌설명 참조; Nucleic Acid Hybridization, 상기문헌설명 참조]을 참조할 수 있다.

DNA 작제물의 "이종성" 영역은 본래 큰 분자내에 결합 상태로 발견된 적이 없는 큰 DNA 분자내에 제공된 확인가능한 DNA 분절이다. 따라서, 이종 영역이 포유동물 유전자를 암호화하는 경우에, 이 유전자는 보통 원종의 게놈에서는 포유동물의 게놈 DNA에 인접해있지 않는 DNA에 인접하게 되는 것이다. 또 다른 예를 들면, 암호 서열이 암호 서열 자체가 천연에서는 발견되지 않는 작제물인 것이다(예를 들어, 게놈의 암호 서열이 천연 유전자와 다른 코돈을 갖는 합성 서열이나 인트론을 포함하는 cDNA). 대립유전자 변형 또는 천연 돌연변이 과정은 본원에 정의된 바와 같은 DNA의 이종성 영역을 형성시키지 않는다.

본 연구에 가장 일반적으로 사용된 표지는 방사선인자, 효소, 자외선에 노출시 형광을 띠는 화학물질 등이다. 많은 형광 물질이 알려져 있으며 표지로서 이용될 수 있다. 그 예로는, 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우가 있다. 특별한 검출 물질은 염소에서 제조되고 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인에 접합된 항래빗 항체이다.

당해 기술분야에서 개발되고 이용된 특정 분석 시스템은 수용체 분석법으로 알려진 것이다. 수용체 분석법에서 분석 물질은 적당한 표지를 부착시킨 후, 일정량의 두 표지와 함께 특정세포 시험 콜로니를 접종배양한 다음, 결합 연구를 실시하여 표지된 물질이 세포 수용체에 결합하는 정도를 측정한다. 이와 같은 방식으로 물질간의 친화성 차이를 확인할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "숙주"라는 용어는 원핵세포 뿐만 아니라 효모, 식물 및 동물 세포와 같은 진핵세포도 포함하는 것이다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자 또는 유전자는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 임의의 기법을 사용하여 숙주를 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 원핵세포 숙주로는 이. 콜리, 에스. 팀피뮤리엄(S.tymphimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 진핵세포 숙주로는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 포유동물 세포 및 곤충 세포를 포함한다.

일반적으로, 숙주와 함께 삽입된 DNA 단편의 효과적인 전사를 용이하게 하는 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터가 사용된다. 발현 벡터는 일반적으로 복제 오리진, 프로모터, 종결 인자, 뿐만 아니라 형질전환된 세포들을 표현형으로 선택할 수 있는 특정 유전자를 포함한다. 형질전환된 숙주는 최적의 세포 성장이 이루어질 수 있도록 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 발효 배양될 수 있다.

당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 적당한 전사 및 해독 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y.]에 기재된 기법을 사용할 수 있다. 유전자와 이의 전사 조절 서열은 이 전사 조절 서열이 유전자의 전사를 효과적으로 조절한다면 "작동가능하게 결합"된 것으로 정의할 수 있다. 본 발명의 벡터로는 비제한적으로 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.

본 발명은 우로코르틴 II를 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 이 서열은 우로코르틴 II를 암호화하는 분리 정제된 DNA 일 수 있다. 또는, 이 서열은 높은 엄중 조건(65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 의미함) 하에 우로코르틴 II DNA의 안티센스 쇄에 높은 엄중 조건에서 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA일 수 있다. 마지막으로, DNA는 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 서열 차이가 있는 우로코르틴 II를 암호하는 분리 정제된 DNA일 수 있다. 이 DNA는 바람직하게는 서열 10 에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 11에 제시된 아미노산을 갖는 단백질을 암호화하는 것이다.

본 발명은 또한 우로코르틴 II를 발현할 수 있는 벡터에 관한 것이다. 이 벡터는 세포내에서 우로코르틴 II를 발현하는데 필요한 조절 인자와 우로코르틴 II를 암호화하는 DNA로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 이 벡터는 서열 10의 아미노산 서열이나 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다. 또한, 본 발명은 이 벡터로 형질감염되어 우로코르틴 II를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 단백질은 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포 중에서 선택되는 세포 종류에서 발현될 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 당해 단백질은 이. 콜리에서 발현된다.

본 발명은 전술한 바와 같은 DNA로부터 암호화된 분리 정제된 사람 우로코르틴 II 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 정제된 우로코르틴 II는 서열 10 또는 서열 11에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 우로코르틴 II 단백질에 대해 지시된 항체에 관한 것이다. 이 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 우로코르틴 II 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 당해 약제학적 조성물은 체온을 저하시키고, 식욕을 억제하며, 충혈성 심부전을 치료 또는 예방하고, 스트레스 및 불안증을치료하고, 바람직하지 않을 정도로 낮은 수준의 ACTH 분비량을 변화시키는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 이 서열은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 분리 정제된 DNA일 수 있다. 또는, 이 서열은 높은 엄중 조건(65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 의미함) 하에 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 DNA의 안티센스 쇄에 높은 엄중 조건에서 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA일 수 있다. 마지막으로, 이 DNA는 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 서열 차이가 있는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호하는 분리 정제된 DNA일 수 있다. 이 DNA는 바람직하게는 서열 1에 제시된 서열을 갖고, 바람직하게는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 단백분해 가공되는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 전구체를 암호화하는 것이 바람직하다.

본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현할 수 있는 벡터에 관한 것이다. 이 벡터는 세포내에서 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현하는데 필요한 조절 인자와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 이 벡터는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다. 또한, 본 발명은 이 벡터로 형질감염되어 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 단백질은 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포 중에서 선택되는 세포 종류에서 발현될 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 당해 단백질은 이. 콜리에서 발현된다.

본 발명은 전술한 바와 같은 DNA로부터 암호화된 분리 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 서열 3에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 대해 지시된 항체에 관한 것이다. 이 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명은 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이 약제학적 조성물은 체온을 저하시키고, 식욕을 억제하며, 충혈성 심부전을 치료 또는 예방하고, 스트레스 및 불안증을 치료하며 바람직하지 않게 낮은 수준의 ACTH 분비량을 변화시키는데 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 단백질의 방사능요오드화를 위한 타이로신 잔기를 포함하는 변형된 우로코르틴 II 및 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드에 관한 것이다. 특정 변형 중 하나는 우로코르틴 II 또는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드의 N-말단에 Tyr-Gly로 이루어진 서열을 첨가하는 것이다.

본 발명은 또한 우로코르틴 II 또는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드의 결실 변이체에 관한 것이다. 특히 유용한 결실은 단백질의 N-말단에서부터 1 내지 5개의 아미노산이 결실된 것이다.

또한, 본 발명은 표준의 "L형" 이성질체 아미노산이 "D형" 이성질체 아미노산으로 대체된 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 관한 것이다. 사람 우로코르틴 관련 단백질에서, 서열 3에 제시된 위치 9에 해당하는 이소로이신 잔기가 D-이소로이신, D-페닐알라닌 및 D-로이신 또는 다른 D형 아미노산으로 치환된 단백질이 특히 유용하다. 또 다른 치환으로서, 서열 3 또는 11에 제시된 위치 17의 글루탐산 잔기가 D-글루탐산으로 치환되는 것도 유용하다.

본 발명은 또한 다양한 아미노산들이 비표준 아미노산들로 대체된 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 관한 것이다. 비표준 아미노산의 예로는 C_α-메틸화 로이신, C_α-메틸화 알라닌, N-im-벤질히스티딘, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시라이신, 3-메틸히스티딘, 호모세린 및 오르니틴이 있다.

또한, 본 발명은 N-말단이 아실화된 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 관한 것이다. 이 단백질의 아실화는 효소 분해로부터 Ucn II 또는 URP를 보호하거나 친수성/소수성과 같은 단백질의 다양한 성질을 변화시키기 위해 단백질의 N-말단에 지방산과 같은 분자를 결합시키는데 사용할 수 있다. 이와 같은 변형은 생체내에서 단백질의 생체내이용률이나 지속기간을 변화시키는데 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 조영화(imaging) 또는 생물학적 분석법에 사용하기 위하여 형광 표지를 포함하도록 변화시킨 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 방사선핵종을 위해 착물화제가 접합된 우로코르틴 II 또는 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 관한 것이다. 방사선핵종에 복합체화된 Ucn II는 섬광조영법이나 다양한 분석법에 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 독소가 접합된 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 관한 것이다. 그 결과 수득되는 독소 접합체는 CRF 수용체 함유 세포를 표적으로 하는 파괴에 사용할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위한 것으로, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예 1

사람 우로코르틴 관련 단백질의 동정

새로운 CRF-R 리간드를 동정하기 위하여, HMMER 소프트웨어 팩키지(Sean Eddy, Department of Genetics, Washington University, St. Louis, MO; 참조번호: 19 참조)를 사용하여 래트/사람 CRF, 래트 Ucn, 사람 Ucn, 개구리 사우바긴 및 백색빨판어류 우로텐신 I을 포함하는 공지의 CRF류의 단백질을 클러스털 W 정렬(Clustal W alignment)시켜 숨겨진 마코브 모델(hidden Markov model)(HMM)을 제작하였다. 이 HMM을 사용하여 공개된 사람 게놈의 데이터베이스를 조사한 결과, 유의적인 서열 상동성이 있는 109 bp 영역을 함유하지만 이전에 동정된 유전자의 일부분은 아닌 염색체 3p21.3-4 유래의 BAC(진뱅크 수탁번호 AC005903)를 조사하였다. 이 영역은 이 서열과 중첩되는 사람 EST 클론(진뱅크 수탁번호 BE622276)을 동정하여 621bp로 신장시켰다. 그러나, 이 사람 서열에는 펩타이드의 C-말단 프로세싱에 사용되는 컨센서스 단백분해 절단 부위가 없었다. 따라서, 이 단백질을 사람 우로코르틴 관련 펩타이드(hURP) 서열로 지정하였다. 도 1은 사람 URP 단백질의 예측된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열(서열 1)을 도시한 것이다. 이 유전자는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화한다.

사람 우로코르틴 관련 펩타이드 유전자의 존재와 서열을 확인하기 위하여 게놈 클론으로부터 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 서열을 증폭시키는데 사용된 것과 유사한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 사람 췌장섬 cDNA 라이브러리로부터 부분 cDNA 단편을 분리하였다. 이 단편은 pGEM 벡터에 서브클로닝하고 서열분석하였다. 이 cDNA의 서열은 게놈 서열의 일부에 상응하였다. cDNA 부분 서열은 도 2의 서열 중 밑줄친 부분에 상응하였다. 도 1과 2에 제시된 서열은 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 폴리펩타이드 전구체를 암호화한다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 처음 19개 뉴클레오타이드는 단백질의 해독후 변형동안 절단되는 시그날 펩타이드를 암호화하여 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 성숙한 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 생산한다:

IVLSLDVPIGLLQILLEQARARAAREQATTNARILARVGHC-NH₂(서열 3)

도 3은 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 아미노산 72 내지 109와, 이와 동등한 사람 우로코르틴, 사람 우로텐신 I, 사람 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 개구리 사우바긴 및 돔발상어류의 CRF/Uro의 분절들 간의 상동성 비교 결과를 도시한 것이다. 이 영역에서의 상동성은 26 내지 42% 범위였다.

실시예 2

마우스 우로코르틴 II의 동정

사람의 유전자 서열에 기초하여 제작한 단편성 cDNA 프로브들은 래트 조직(뇌)과 특이적으로 교차 하이브리드화하였고, 이로부터 두 종간에 상당한 상동성이 존재한다는 것을 알 수 있었다. 이 사람 서열을 기초로 하여, cDNA 말단의 급속 증폭방법(RACE)으로 상동성 마우스 유전자를 동정하기 위한 프라이머를 디자인하였다. RACE용 cDNA는 마우스 전뇌(全腦) 폴리(A+) RNA로부터 증폭 키트(SMART RACE cDNA 증폭 키트, Clontech)를 사용하여 제작하였다. 이종성 프라이밍을 최대화하기 위하여 낮은 엄중도(낮은 T_m) 조건하에 PCR 반응을 실시하였다. 1차 증폭은 터치다운 프로토콜(94℃, 30초; 70℃에서 55℃로 증분, 30초; 72℃, 3분)을 사용하여 실시하고, 그 다음 2차 증폭은 복수의 그물형 프라이머를 사용하여 (94℃, 20초; 55℃, 20초; 72℃, 3분)간 실시하였다. PCR 생성물 중 선발된 후보는 pCRII-TOPO(Invitrogen)에 클로닝하여 양 쇄를 서열분석하였다. 후보 5' 및 3' 반응 생성물은 예상 크기(사람 서열로부터 유추)에 기초하여 동정하고 클로닝한 뒤 서열분석하였다.

마우스 Ucn II에 대한 아미노산 예측 서열은 도 4A에 제시하였다. 이 유전자는 112개 아미노산 전구체를 암호화하고, C-말단은 추정상의 38개 아미노산 성숙 펩타이드의 암호 영역(박스친 부위로 표시)을 포함한다(도 4A). 암호 서열의 C-말단 부분 다음에는 각각 전구체로부터 아미드화 및 절단에 관여할 것으로 추정되는 글라이신 및 쌍을 이룬 염기성 잔기(R-R)가 있다.

또한, 2가지 다른 추정되거나 공지된 우로코르틴 관련 펩타이드가 있는데, 그 하나는 공개된 사람 EST로부터 펩타이드 서열이 추론된 사람의 펩타이드이고, 다른 하나는 최근 클로닝된(참조번호: 20) 복어 URP(Takifugu rubripes 유래)이다. 사람 및 어류 우로코르틴 관련 펩타이드, 래트 Ucn 및 래트/사람 CRF와 함께 정렬 배치하여 도 4B에 제시하였다. 아미노산 수준에서, 마우스 Ucn II의 암호 영역은 사람 및 어류 우로코르틴 관련 펩타이드와 각각 77% 및 45%의 상동성을 보인다. 마우스 Ucn II는 래트 CRF 및 래트 UCN과 각각 36% 및 44%의 아미노산 동일성을 나타내는 바, 이 펩타이드류의 공지 성분들과 비교적 관련성을 보였다. 보존적 치환을 고려하면, 관련성은 62%(CRF) 및 59%(Ucn)로 증가한다.

실시예 3

펩타이드 합성

뮤린의 Ucn II 및 사람의 Ucn 관련 펩타이드는 고상법, 메틸벤즈하이드릴 아민 수지 및 Boc 전략을 사용하여 수작업으로 합성하였다(참조번호: 21). Boc 기를 제거하기 위하여 트리플루오로아세트산을 디클로로메탄 중에 용해시킨 60% 용액을 사용하였다. 주쇄의 조합은 디이소프로필카보디이미드를 매개로 하여 실시하였다. 펩타이드를 절단한 뒤 플루오르화수소산으로 보호기를 제거한 뒤 3 용매 시스템(트리에틸암모늄 포스페이트 pH 2.25 및 6.5 및/또는 0.1% TFA) 및 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다(참조번호: 22). 펩타이드는 각각 HPLC 및 CZE 기준에 따라 95% 이상의 순도로 정제하였다. 질량 스펙트럼을 사용하여 제제들의 조성을 확인하였다.

실시예 4

Ucn II에 의한 수용체 활성화

CRF-R1 및 CRF-R2 수용체에 대한 Ucn II의 친화성은 방사능수용체 분석법을 사용하여 평가하였다. 먼저, CRF-R1 또는 CRF-R2β 중 어느 하나를 안정되게 발현하는 CHO 세포로부터 미정제 막 분획을 제조하였다. 시험 펩타이드들과 방사능리간드인¹²⁵I-[Tyr⁰,Glu¹,Nle¹⁷]-사우바긴을 분석 완충액(20mM HEPES, 2mM EGTA, 0.1% BSA, 10% 슈크로스, pH 7.6)으로 희석하고, 0.1% 폴리에틸렌 이민으로 예비코팅된 MAGV 미세역가 평판(Millipore)에 주입한 상기 수용체 막 제제와 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 항온처리한 뒤, 분석 완충액으로 2회 신속하게 세척하고 여과하였다. 방사능리간드 복합체는 감마 방사선 계수기로 정량하였다. 억제 결합 상수는 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 그 결과는 표 2에 요약하였다.

선별된 CRF 수용체 리간드의 결합 성질 및 기능 활성

펩타이드	CRF-R1	CRF-R2
펩타이드	평균 K_i(nM)(결합)	평균 EC₅₀(nM)(cAMP)	평균 K_i(nM)(결합)	평균 EC₅₀(nM)(cAMP)
우로코르틴 II(마우스)	>100	>100	0.66(0.13 - 3.3)	0.14(0.03 - 0.52)
URP(사람)	>100	>100	0.50(0.22 - 1.16)	0.42(0.16 - 1.1)
우로코르틴(래트)	0.32(0.14 - 0.77)	0.29(0.12 - 0.70)	0.62(0.14 - 2.8)	0.17(0.043 - 0.68)
사우바긴(개구리)	0.94(0.49 - 1.8)	N/A	1.7(0.77 - 3.9)	N/A

이 결과값들은 각 시험 펩타이드에 대하여 안정되게 형질감염된 CHO 세포 또는 이들의 막을 사용하여 실시한 3 내지 6회의 독립 실험을 통해 측정된 것이다. EC₅₀및 K_i값은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 이들의 log₁₀값을 평균하였다(γ). 평균 EC₅₀또는 K_i는 10^γ로 표시하였다. log₁₀값의 표준 편차도 계산하였다(σ). 제시된 범위는 [(10^γ)10^σ또는 10^γ/10^σ]으로 나타내었다.

우로코르틴과 비교해보면, Ucn II는 CRF-R1에 대한 표지된 사우바긴의 결합과 경쟁시 1000배 이상으로 효과가 낮은 반면, CRF-R2에 대한 결합의 경쟁시에는 Ucn과 거의 동등한 효과가 있었다. 이와 같은 타입 2 수용체에 대한 유의적인 선택성은 세포내 cAMP의 축적으로 측정되는 수용체 활성화에서도 관찰되었다. 안정되게 형질감염된 CHO 세포(DMEM/10% FBS에서 배양)를 48웰의 조직배양 접시(Costar)에 평판배양하고 24시간동안 복원시켰다. 처리하기 적어도 2시간전에 배지를 DMEM/0.1% FBS로 변화시켰다. 이 세포를 0.1mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴과 30분 동안 예비항온처리한 뒤 37℃에서 20분 동안 펩타이드에 노출시켰다. 세포내 cAMP를 추출하고 RIA 키트(Biomedical Technologies)를 사용하여 3개의 웰로부터 2회 측정하였다. cAMP 분석에서, Ucn II는 Ucn에서와 같이 CRF-R2에 대해 상당한 효과를 나타내었다(표 2). CRF-R1에 대한 Ucn II의 매우 낮은 친화성으로 인하여 이 수용체에 대한 Ucn II의 효과는 측정하지 않았다.

실시예 5

진공 여과 복수선별 분석 시스템(Millipore)을 사용하여 96웰의 0.2㎛ Durapore 평판에서 결합을 실시하였다. 각 웰에 결합 완충액 50㎕(10% 슈크로스, 0.1% BSA, 2mM EGTA, 20mM HEPES 완충액, pH 7.5); 결합 완충액에 다양한 희석률로 희석시킨 비표지 경쟁인자(우로코르틴 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드) 50㎕; 150,000cpm/웰 농도의¹²⁵I-사우바긴 50㎕; 및 세포막 50㎕로 이루어진 총 200㎕ 용액을 주입하였다. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 진공여과한 뒤, 결합 완충액으로 2회 세척한 뒤 건조시켰다. 각 여지를 천공시킨 뒤 감마계수기를 사용하여 계수하였다.

CHO 세포에서 안정되게 발현되는 CRF-R1 및 CRF-R2β에 대한¹²⁵I-사우바긴 결합의 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 의한 치환반응을 도 5에 나타내었다. 이 데이터로부터 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 해리상수(K_i)가 CRF-R1에 대해서는 78nM이고 CRF-R2β에 대해서는 0.23nM임을 알 수 있었다. 한편, Ucn의 해리상수는 CRF-R1에 대해서는 0.13nM이고, CRF-R2β에 대해서는 0.15nM이었다. 따라서, 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 우로코르틴 보다 코르티코트로핀 방출 인자 타입 II 수용체에 대하여 특이성이 월등히 높았다.

실시예 6

Ucn II mRNA 발현

하이브리드화 조직화학을 실시하여 마우스 및 래트 뇌에서 나타나는 Ucn II mRNA 발현 패턴을 분석하였다. 클로랄 수화물(350㎎/㎏, ip)로 동물을 심부 마취시키고, 상행대동맥을 통해 식염수와 그 다음 빙냉시킨 0.1% 붕산염 완충액(pH 9.5) 중의 4% 파라포름알데하이드를 관류시켰다. 뇌를 16시간 동안 후고정시키고 0.1M 인산염 완충액 중의 10% 슈크로스 용액에 넣어 하룻밤동안 동결보호시켰다. 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 30㎛ 두께의 동결 분획 4개(마우스) 또는 6개(래트)를 잘라내어 저온의 에틸렌글리콜계 동결보호제에 넣은 뒤 조직화학 분석시까지 -20℃에 저장하였다.

마우스 cDNA를 함유하는 TOPO-II 플라스미드를 먼저 선형화하여 작제한³⁵S-표지된 안티센스 및 센스(대조군) cRNA 프로브를 사용하여 동일계 하이브리드화를 실시하였다(참조번호: 23). 프로브는 1 내지 3 x 10⁹dpm/㎍의 비활성으로 표지하고 약 10⁷cpm/㎖ 농도로 슬라이드에 적용한 뒤 높은 엄중도(50% 포름아마이드) 하에 56℃에서 하룻밤동안 하이브리드화하였다. 마지막으로 15mM NaCl/1.5mM 구연산나트륨을 사용하여 65 내지 68℃에서 세척을 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 탈수시키고 x선 필름(β-Max; Kodak)에 16시간 동안 노출시킨 뒤 Kodak NTB-2액 에멀젼으로 코팅한 뒤 4℃에서 21 내지 28일 동안 노출시켰다.

하이브리드화 조직화학분석 결과 마우스 및 래트 뇌에서 일정한 제한된 Ucn II mRNA 발현 패턴을 나타내었다. 안티센스 프로브와 유사한 비활성으로 표지된 센스쇄 유출물은 배경 농도 이상의 하이브리드화 시그날을 나타내지 않았다. 관찰 결과 Ucn II mRNA의 분포는 주로 피질하인 것으로 나타났으며, 주요 발현 부위로는 시상하부의 아치형 핵, 실방핵, 안와위 핵 및 입쪽 교뇌의 뇌간의 일부인 LC(locus coeruleus)를 포함한다(도 6). 뇌간(삼차, 안면, 설하)의 운동 핵은 물론 척수 전각의 운동 핵 역시 Ucn II mRNA 발현 부위로서 확인되었다. 비뉴런 인자 중에는 수막 상에서 양성의 하이브리드화 시그날이 일정하게 관찰되었으나 맥락얼기 또는 상의세포에서는 관찰되지 않았다. 교질 인자에 의한 Ucn II mRNA 발현은 명백하게 암시되는 바가 전혀 없었다.

실시예 7

영장류 뇌에서의 우로코르틴 관련 펩타이드 발현

영장류 뇌에서 사람의 우로코르틴 관련 펩타이드가 발현되는지를 동일계내 하이브리드화 실험으로 조사하였다. 이 동일계내 하이브리드화는 게잡이 원숭이(Macaca fascicularis)에서 얻은 뇌조직 단편을 가지고 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 약 400 염기쌍에 해당하는³⁵S-표지된 안티센스 cRNA 프로브를 사용하여 실시하였다. 이 프로브는 10⁷cpm/ml의 농도로 슬라이드에 가하고, 하룻밤동안 하이브리드화를 진행시켰다. 하이브리드화 후 슬라이드를 리보뉴클레아제 A 20㎍/ml로 37℃에서 30분간 처리하고 15nM NaCl/1.5mM 구연산나트륨/50% 포름아마이드로 70℃에서 세척하였다. 슬라이드를 탈수시키고 24시간 동안 X선 필름(BetaMax; Kodak)에 노출시켰다. 시료의 자동방사능사진은 도 7에 제시하였다.URP에 대한 양성 시그날이 영장류 시상하부의 실방핵(PVH)와 안와위 핵에서 관찰되었다.

실시예 8

Ucn II에 의해 유도된 Fos 발현

중심 Ucn II 투여에 반응성인 세포 그룹을 동정하고, 이 세포 그룹들이 CRF-R2 발현 부위와 부합하는 정도를 평가하기 위하여 icv 펩타이드 투여에 대한 반응으로 즉시 초기 유전자 산물인 Fos의 유도 발현을 모니터하였다. 성숙한 수컷 스프라그 돌리(Sprague-Dawley) 래트(실험 초기 중량 250 내지 300g)와 C57 BL/6 마우스(25 내지 40g)를 12:12 명:암 사이클로 조절되는 콜로니 룸에 수용하여 실험 전까지 음식과 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 뇌실내(icv) 주사를 위하여 래트를 케타민/크실라진/아세프로마진으로 마취시키고 26ga 가이드 캐뉼라를 측뇌실까지 정위 이식시켰다. 펩타이드를 정맥내(iv) 투여하기 위하여 동물에게 내재성 경정맥 카테터를 장착시켰다. icv 주사를 처치한 래트에게는 전체 활동 준위와 체온을 원격으로 모니터하기 위하여 송신기(Mini-Mitter)를 복부내에 장착시켰다. 수술 후, 동물을 실험에 앞서 7일 동안 회복시키면서 매일 길들였다. 이 모든 절차는 동물 보호 및 이용 협회(Institutional Animal Care and Use Committee of the Salk Institute)의 승인을 받아 실시하였다.

Fos 발현의 유도 패턴을 모니터하기 위하여 래트에게 오전 10시에 합성 Ucn II를 icv 또는 iv 주사하거나(icv 주사시에는 식염수 2㎕ 중에 또는 iv 투여시에는식염수 200㎕ 중에 1㎍/동물, 5㎍/동물 또는 10㎍/동물의 농도로 사용), 또는 부형제만을 주사하고 2시간 후 관류시켰다. 음식 섭취에 대한 펩타이드 투여 효과를 모니터하기 위하여 동물에게 합성 마우스 Ucn II, 래트 Ucn 또는 래트/사람 CRF를 소등하기 30분 전에 icv로 주사하였다. 그 다음, 음식 소비량을 6시간 동안에는 매시간 측정하고 그 다음에는 12시간째 측정하였다. 복수 비교에 대한 본페로니 보정(Bonferoni correction)을 인증받은 방식대로 적용하면서 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 데이터를 분석하였다.

면역조직화학을 위하여 조직을 0.3% 과산화수소와 1% 붕수소화나트륨으로 연속하여 예비처리하였다. 그 다음 PBS/0.2% 트리톤 X-100을 침투시키고 PBS/2% 차단 혈청 중에서 1차 항혈청과 48시간 동안 항온처리하였다. Fos 면역반응성은 사람 Fos 단백질의 N-말단 합성 단편에 대하여 래빗 중에서 생성된 폴리클로날 항혈청을 사용하여 위치조사하였다(Santa Cruz Biotechnology, 1:5K). 위치조사는 개시된 바와 같이 니켈을 증가시키면서 종래의 아비딘-바이오틴 면역퍼옥시다제 방법을 사용하여 실시하였다(참조번호: 24).

합성 Ucn II 1㎍의 주사는 중추 자율신경 조절에 관여하는 상호연관된 구조 군 중에서 가장 두드러진 활동 반응을 유발시켰다(참조번호: 25, 26). 그 반응은 분계선조 침대핵, 편도 중심핵, 시상하부 실방핵(PVH), 부상완핵 및 고속핵(NTS; 도 8)의 독특한 양태를 포함한다. 이 중에서, NTS 만은 CRF-R2 발현좌로서 개시된 바 있다(참조번호: 27). 다른 CRF-R2 발현의 주요 부위, 예컨대 외측 중격, 중뇌 솔기핵 및 배쪽내측시상하부핵 등에서의 Fos 유도(참조번호: 27,28)는 식염수를 주사한 대조군에서 관찰되는 Fos 유도와 큰 차이가 없었다. 보다 다량의 펩타이드(5 또는 10㎍)는 유사한 분포에서 보다 강력한 활동 반응을 자극하였다.

icv 주사의 잠재적 전신 효과를 조절하기 위하여 유사한 투여량 범위의 Ucn II를 다른 래트 그룹에게 정맥내로 투여하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 뚜렷한 Fos 유도를 유발한 것은 최고(10㎍) 투여량의 경우에만 나타났다. 패턴은 중심 주사에 대한 반응에서 관찰되는 것과 유사하였지만, 표지된 세포 수나 염색 강도는 Ucn II 1㎍의 icv 주사후 관찰되는 믿을만한 결과에는 도달되지 못하였다.

실시예 9

뇌에서 FOS 발현을 자극하는 우로코르틴 관련 펩타이드

사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 의한 중추 스트레스 관련 세포의 활성화는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사한 후 세포에 나타나는 Fos 유전자 산물을 검출하여 조사하였다. 실험하기 7일전에 래트의 외측 뇌실로 가이드 캐뉼라를 이식시켰다. 시험 당일, 래트에게 합성 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 5㎍을 멸균 식염수 5㎕에 용해시킨 용액을 주사하였다. 2시간 후 래트를 죽이고 다양한 뇌절편을 슬라이드에 고정시켜 준비하였다. 슬라이드는 사람 Fos 단백질의 3 내지 16개 잔기에 대하여 래빗내에서 유발시킨 폴리클론 혈청을 사용하여 면역퍼옥시다제로 슬라이드를 염색시켜 Fos 면역반응성의 위치를 조사하였다.

도 9에 도시한 바와 같이, Fos 면역반응성은 분계선조 침대핵(BST), 시상하부 실방핵(PVH), 편도 중심핵(CeA), 외측 부상완핵(PBI), 뇌간의 일부(LC) 및 고속핵(NTS)에서 검출되었다. 이 부위들은 각각 CRF 관련 펩타이드 활성 부위로서 관련이 있음을 이미 설명한 바 있다.

실시예 10

Ucn II의 행동 효과

CRF 및 Ucn과 같이, Ucn II는 음식 섭취를 억제하는데 있어서 중추 작용을 할 수 있다(도 10A). 주야 사이클의 야간 단계 개시시에 이 펩타이드들(1㎍, icv)을 주사한 다른 래트 그룹을 대상으로 측정한 결과, 두 주요 효과들이 모두 신뢰성있는 결과를 제시하여 처리와 시간점 간의 유의적인 상호작용이 있음을 명백하게 나타내었다[F (18,95)=4.22, p<0.0001]. 상기 3가지 펩타이드는 30%(CRF)에서 35%(UcnII) 내지 70%(Ucn) 범위의 억제도를 나타내어 12시간 간격 동안 음식 섭취량의 유의적인 감소를 나타내었다. 이와 같은 효과는 Ucn 처리 동물과 CRF 처리 동물의 경우에는 Ucn II 처리 래트(6시간)의 경우보다 시험 기간 중 보다 빠르게(4 내지 5시간) 식염수 주사 대조군에 비하여 유의적인 식욕 저하를 보여, 시간 상으로는 다른 분포를 보였다.

이와 동일한 검체들에 대하여 전체 운동 활동 및 체온을 원격으로 모니터하였다(도 10B). 활동 데이터를 분석한 결과, 두 주요 효과들이 모두 유의적 결과를 제시하여 약물과 시간점 간의 유의적인 상호작용이 있음을 명백하게 나타내었다[F (33,110)=1.94, p<0.006]. 사후비교 결과, CRF를 투여받은 동물이 주사후 2 내지 6시간 동안 부형제 처리된 래트에 비하여 유의적으로 보다 활동적인 것으로 관찰되었다(p<.001). Unc이나 Ucn II 처리에 의해서는 주사후 어떤 시기에 측정하여도 믿을만한 변화를 일으키지 않았다. 중심 체온도 기록한 결과, 각 펩타이드가 비교적 온화하고(0.5 내지 1℃) 일시적인(2시간) 고온 반응(데이터는 제시되지 않음)을 일으키는 것으로 나타났다.

실시예 11

래트 뇌하수체 전엽 세포에 미치는 hURP 매개 효과의 시험관내 생물검정

뇌하수체 작용을 위하여, 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 대한 ACTH 분비 반응을 제시된 바와 같이 래트 뇌하수체 전엽 세포의 1차 배양물을 가지고 측정하였다(참조번호: 30). ACTH 면역분석 키트(Nichols Institute Diagostics)를 사용하여 ACTH 농도를 측정하였다. 래트의 뇌하수체 전엽 세포를 래트 우로코르틴이나 사람 우로코르틴 관련 펩타이드로 처리한 뒤, 키트(Nichols Institute Diagnostics)를 사용하여 ACTH 분비량을 측정하였다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 ACTH 분비에 미치는 효과를 도 11에 제시하였다. 뇌하수체 전엽 세포에서의 ACTH 분비 자극은 우로코르틴에 비하여 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 대하여 더 민감하지 못한 것으로 관찰되었다.

실시예 12

A7R5 세포에 미치는 hURP 효과의 시험관내 생물검정

천연의 CRF-R2β를 발현하는 A7R5 세포에서 cAMP 농도에 미치는 hURP의 효과를 측정하였다. A7R5 세포주는 10% 태내 송아지 혈청, 2mM L-글루타민, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 보강시킨 DMEM에서 유지시켰다. 세포를 10,000세포/㎠ 농도로 접종하고 6일동안 증식시켰다. 혈청을 제거한 세포를 분석 배지 중의 0.1mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴과 20분 동안 예비항온처리하고, 제시된 농도의 펩타이드로 30분 동안 처리하였다. cAMP 농도는 RIA(Biochemical Technologies)로 측정하여 도 12에 제시하였다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 우로코르틴과 유사한 cAMP 생산 효과를 나타내었다.

실시예 13

전체 활동에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효과

스트레스 반응의 생성에 사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 작용하는지 측정하기 위하여 래트의 전체 운동 활동에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효과를 조사하였다. 전체 운동 활동을 계속 모니터하기 위하여 캐뉼라는 우측 뇌실로 이식하고 원격측정기는 복부내로 이식하였다. 수술 후 7일간 동물을 회복시켰다. 이 기간 동안 동물을 매일 길들여서 동물이 주사 절차에 적응하도록 하였다. 주사 접종일에 4시간 동안 기본 활동을 기록하였다. 오후 6시에 소등을 개시하고 동물에게 식염수 5㎕ 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 총 5㎍을 첨가한 식염수 5㎕를 주사하였다. 활동 계수치는 4 시간 동안 종합하였다. 그 결과는 도 13에 요약하였다. 그 결과, 대조군 동물에 비하여 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사한 동물에서 전체 운동 활동의 큰 차이를 보이지는 않았다.

실시예 14

체온에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효과

사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 래트의 체온에 미치는 효과를 조사하였다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사하기 위한 캐뉼라는 우측 뇌실로 이식하고, 체온을 연속하여 보이지않게 측정하기 위한 원격측정기는 복부내에 이식하였다. 수술 후 7일간 동물을 회복시켰다. 이 기간 동안 동물을 매일 길들여서 동물이 주사 절차에 적응하도록 하였다. 주사 접종일에 3시간 동안 기본 온도를 기록하였다. 오후 6시(소등 개시)에 동물에게 식염수 5㎕ 또는 1㎍/㎕ 농도의 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 식염수 용액 5㎕를 주사하였다. 체온은 12시간 동안 5분마다 측정하였다. 도 14에 제시한 바와 같이 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사한 동물은 주사 후 즉시와 7시간째 보다 낮은 체온을 나타내었다.

실시예 15

식욕에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효과

식욕에 미치는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효과도 래트에서 조사하였다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사하기 위한 캐뉼라는 우측 뇌실로 이식하고, 7일간 동물을 회복시켰다. 이 기간 동안 동물을 매일 길들여서 동물이 주사 절차에 적응하도록 하였다. 주사 접종일에 동물에게 식염수 5㎕ 또는 1㎍/㎕ 농도의 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 식염수 용액 5㎕를 주사하였다. 각 동물이 섭취하는 음식 양은 6시간 동안 매시간 마다, 그 다음 14시간째 기록하였다.

실험 동안 소비한 총 음식 양은 도 15A에 각 시간마다 나타내었다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 주사한 동물이 대조 동물에 비하여 음식 소비량의 유의적인 감소를 나타내었다. 도 15B는 각 시간 마다 소비한 음식의 양을 요약한 것이다. hURP 처리 동물은 특히 주사 후 1시간째와 3시간째는 물론 마지막 8시간째에도 음식 섭취량의 감소를 보여주었다.

실시예 16

유용한 우로코르틴 II 및 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 변형 및 유도체

본원에 개시된 우로코르틴 II와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 이 단백질들의 가장 가능성있는 프로호르몬 형태를 나타낸 것이다. 따라서, 호르몬의 활성화시 단백분해 과정을 일으켜 변형과 같이 상기 단백질들에 다른 유형의 변형이 일어나 비아미드화된 형태의 단백질이 형성될 것으로 생각된다.

다른 CRF 수용체에 대한 리간드를 이용한 종래 연구에서는 리간드의 생물활성 중 수용체에 결합하는 성질을 잃지 않고도 리간드들에 많은 아미노산 치환이 이루어질 수 있음을 밝힌 바 있다. 우로코르틴을 이용한 종래의 많은 연구들에서는 1개, 2개 또는 심지어 3개의 치환도 용이하게 허용된다는 것을 밝힌 바 있다. 몇몇 경우에는 우로코르틴의 변형이 보다 바람직한 약리적 성질이 있는 단백질을 산출하기도 하였다. 우로코르틴 II와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드는 소형 단백질이므로, 이와 같은 변형은 당해 기술분야에 공지된 펩타이드 합성법에 의해 매우 용이하에 실시될 수 있다. 그 예로는 고상 기법, 부분 고상, 단편 축합 및 통상적인 용액 첨가법이 있다. 이 방법들은 특히 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 비표준 아미노산이 첨가되어야 하는 경우에 특히 바람직하다. 또는 변형이 전적으로 천연 아미노산에 의해 이루어지는 경우에는 재조합 DNA 기법을 사용하여 돌연변이시키고 이어서 변형된 우로코르틴 II와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 발현시킬 수 있다.

사람 우로코르틴 관련 펩타이드에는 타이로신 잔기가 없다. 타이로신 잔기는 단백질의 방사능요오드화에 유용한 바, 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 가능한 1가지 변형은 타이로신을 단백질 중의 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. Tyr-Gly으로 이루어진 서열을 우로코르틴의 N-말단에 첨가하는 변형에 대해서도 이미 설명하였다. 그 결과 얻어지는 단백질은 CRF 수용체 결합과 생물활성을 유지하지만 단백질의 방사능요오드화에도 유용할 것이다. 본 발명에 제시된 단백질의 다른 N-말단 신장된 단백질도 표지화 및 다른 목적을 위해 작제할 수 있다.

우로코르틴의 처음 7개 내지 10개의 잔기의 결실은 효과적인 우로코르틴 길항제를 형성시키는 것으로 관찰되었다. 이 단백질은 CRF 수용체에 결합할 수는 있으나 수용체를 유의적으로 자극하거나 활성화시키지는 못했다. 따라서, 최고 5개의 아미노산이 결실된 우로코르틴 II 또는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드가 효과적인 길항제 역할을 할 수 있을 것으로 추정된다. 또한, 다른 우로코르틴 II 및 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단편으로부터 길항제를 만들수도 있다. 이 길항제들은 일반적으로 CRF 결합 단백질에 의해 명백해지는 내인성 펩타이드의 농도를 증가시키는데 효과적일 수 있다. CRF 결합 단백질과 결합시키고, 동일 단백질에 결합하는CRF, 우로코르틴, 우로코르틴 II 및 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 차단시킴으로써 내인성 CRF, Ucn 및 Ucn II의 효과적인 생체내 농도를 증가시킨다. 이와 같은 길항제는 그 효과를 상승시키기 위하여 CRF, Ucn, Ucn II 또는 URP의 다른 효능제 또는 길항제와 공동으로 투여할 수도 있다.

다른 CRF 수용체 결합 단백질에 대한 추가 분석 결과, 일반 아미노산을 D-이성질체 아미노산이나 환형 아미노산으로 치환시키면 CRF 수용체에 대한 친화성이 증가하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 특히 유용한 치환은 서열 3 또는 서열 11에 제시된 서열의 위치 9에 해당하는 이소로이신 잔기의 "D형" 이성질체 아미노산, 바람직하게는 D-이소로이신, D-페닐알라닌 및 D-로이신으로의 치환이다. 이와 마찬가지로, 서열 3 또는 서열 11에 제시된 서열 중 위치 17에 상응하는 글루탐산 잔기는 D-글루탐산으로 치환될 수 있다. 환형 아미노산은 2개 이상의 아미노산 잔기들의 측쇄 사이에 화학적 결합에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 인접한 글루탐산과 라이신 잔기는 반응하여 아마이드 결합을 형성하여 락탐 환을 생성할 수 있다. 사람 우로코르틴 관련 펩타이드의 효능제 또는 길항제를 형성하기 위하여 비표준 아미노산, 예를 들어 C_α-메틸화 로이신, C_α-메틸화 알라닌, N-im-벤질히스티딘, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시라이신, 3-메틸히스티딘, 호모세린 및 오르니틴으로 치환시킬 수도 있다.

본원에 개시된 우로코르틴 II 및 사람 우로코르틴 관련 펩타이드에 대한 변형은 실시할 수 있는 가능한 변형을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하기위한 것이 아니다.

토론

CRF류의 신경펩타이드들에 속하는 새로운 구성원을 동정하기 위하여 전게놈적 상동성 조사를 이용하였다. 새로운 리간드 중 하나인 Ucn II는 CRF-R2에 선택적으로 결합하고 래트 CNS의 다른 부위에서 발현되며 본능적인 감각 정보의 프로세싱과 자율신경계 유출을 조절하는데 관여하는 중추신경원을 활성화시킨다. 또한, Ucn II는 전체 운동 활동에 영향을 미치지 않고 음식 섭취를 억제한다.

CRF류의 성분들이 나타낼 것으로 예상되는 구조, 결합, 활성 및 발현 특성을 나타내는 뮤린 펩타이드 외에도 뉴클레오타이드 수준에서 마우스 서열과 80% 동일한 사람 URP(공개적으로 입수용이한 EST 서열에 기초하여)를 동정하였다. 그러나, 사람 펩타이드에서 명백하게 관찰되는 중요한 차이는 사람 동족체의 C-말단 프로세싱에 필요한 어떤 분명한 단백분해적 절단 부위가 없다는 것이다. 따라서, 이 단백질로부터 어떤 상동성의 사람 펩타이드가 생성될 수 있을지는 아직 연구되어야 할 사항이다. 그러나, Ucn은 CRF-R1 및 CRF-R2 모두에 높은 친화성으로 결합하여 강력하게 신호를 전달한다(참조번호: 14-16). 마우스 Ucn II 및 사람 URP는 이와 같은 측정시 고도의 CRF-R2 선택성을 나타내어 두 수용체 종류에 의해 매개되는 기능을 구별하는데 중요한 역할을 할 것임은 의심의 여지가 없다. 도 16은 우로코르틴 II가 CRF-R1 및 CRF-R2에 작용하는 방식에 대한 모델을 도시한 것이다. Ucn II는 CRF-R1이 아닌 CRF-R2에 대해 높은 친화성으로 결합한다. 우로코르틴은 두 수용체모두에 결합하는 반면 CRF는 CRF-R2가 아닌 CRF-R1에 대해 높은 친화성으로 결합한다.

Ucn II mRNA는 CRF 분포(실방핵; 예, 참조번호 31) 및 Ucn 분포(뇌간 및 척수 운동 핵; 예, 참조번호 18)와 부분적으로 표면상 중복되지만, 설치류 뇌에 특유한 제한된 피질하 분포를 나타낸다. 특히, 그 전사체가 스트레스와 관련된 생리적 기능과 행동 기능들에 관여하는 세포 그룹들에서 발현된다는 사실은 흥미롭다(참조번호: 13). 그 예로는, 대뇌피질로 넓은 투사부를 형성하고 각성과 불안증을 발생시키는데 관련이 있는 뇌간의 일부인 LC(예, 참조번호: 32)와, 복수의 신경분비성 신경원 군을 수용하고 CNS 내에서 투사하여 중추 자율신경 회로에서 교통하는 감각 및 운동 신경을 조절하는 실방핵(예, 참조번호: 33) 및 음식 섭취와 에너지 균형의 조절을 보조하는 파생 시스템의 주요 성분으로 확인된 바 있는 아치형 핵(예, 참조번호: 34)을 포함한다. 이 문헌들에서 제시된 새로운 펩타이드의 위치를 한정하는 해부학적이며 기능적인 데이터들은 아직까지도 부족하지만, 중추 Ucn II 시스템은 보다 광범위한 중추 CRF 망계의 분야로서 오랫동안 연관이 있던 스트레스 관련 기능들에 관여할 것이라는 잠재성을 유지하고 있다. 이는 뇌에서 세포 발현의 주요 부위인 에딩거 웨스트팔(Edinger-Westphal) 핵이 상기와 관련하여 주로 전뇌에 대한 소수의 입증된 투사들로 인하여 매우 제한된 효과를 나타내는 Ucn과는 대조적인 것이다(참조번호: 16,18).

그 결합 특성과 활동을 고려해볼 때 CRF-R2 분포를 면밀히 모방하기 위하여 중심 Ucn II에 의해 유도된 세포 활성화 패턴의 손상은 예상치못한 것이었다. 최근icv CRF 또는 UCN에 의해 유도된 Fos 발현의 분포를 비교하는 연구에서는 공지된 두 유전자에 의해 암호화된 CRF-R들에 대한 상기 펩타이드들의 결합 친화성과 대략적으로 일치하는 활성화 패턴을 입증하였다(참조번호: 35). 즉, 여기에서 이용된 용량과 유사한 양의 CRF가 고도의 선택적 방식으로 CRF-R1 발현 부위를 활성화시킨 반면, UCN은 각 수용체를 발현하는 세포 그룹들의 일부에서 주로 Fos 유도를 자극하였다. 그러나, 또한 양 펩타이드는 여기에서 래트 뇌에 존재하는 Ucn II에 의해 유도된 활성화 반응의 주요 부위인 것으로 관찰된 중심 해부구조들과 매우 동일한 세트의 구조를 갖추고 있다. 이것은 중심 해부 시스템의 인자들이 CRF 유사 펩타이드들이 스트레스와 관련된 자율 및 행동 반응들을 유도하기 위해 작용할 수 있는 가장 잘 입증된 부위에 속하는 것이라는 점에서 중요하다. 이러한 발견은 이 시스템에 대한 기본적 이해는 불명확한 상태일지라도 타입 1은 물론 타입 2 수용체 활성화가 이 시스템을 유인할 수 있음을 암시하는 것이라 할 수 있다. 중심 자율신경망계에 존재하는 결절점 중에서 부상완핵(R1)과 NTS(R2)만이 CRF-R 발현 부위로서 확인되었고(참조번호: 27,28,35), 이 중 어느 하나 또는 둘 모두의 수용체 매개 활성화가 전체적으로 시스템을 참여시키기에 충분한 것인지는 측정되어야 한다. 중요한 것은, 합성 Ucn II의 전신 주사에 의해 icv 주사 연구에서 사용했던 동일한 범위의 용량에서 중심 자율 세포 그룹들에 의한 비교적 강력한 활성화 반응을 유도하지 못한다는 점이다. 이는, 말초 CRF-R2의 활성화가 혈압을 현저하게 지속적으로 감소시킬 수 있고(참조번호: 16,17), 현저한 저혈압 공격이 중심 Ucn II 투여에 반응성인 것과 똑같은 중심 자율신경 구조를 활성화시킬 수 있으므로(참조번호:36,37), 중요한 대조군이다.

음식 섭취 및 활동에 미치는 icv Ucn II 효과의 초기 특성은 스트레스 관련 행동들에 있어서 각 CRF-R들의 역할들을 빼내기 위한 최근의 노력을 보완한다. 예를 들어, 수용체 중 어느 하나의 무돌연변이(null mutation) 함유 마우스는 정상적인 기본 음식 섭취 특성을 보이는 반면, CRF-R1 결손 동물은 주사후 나중에는 아니지만 그 즉시에는 UCN의 식욕감퇴 효과에 반응하지 않는 것으로 관찰되었고, CRF-R2 돌연변이 마우스에서는 반대로 주사후 그 즉시는 아니지만 나중에는 UCN의 식욕감퇴 효과에 반응하지 않는 것으로 관찰되었다(참조번호: 11,38,39). 이것은 Ucn 매개의 식욕 억제 단계가 초기와 후기에 각각 CRF-R1과 CRF-R2가 매개하는 것일 수 있음을 암시하는 것이라 볼 수 있다. 다른 범례(결식 유도된 재급식 보다는 야간 자유 급식)를 사용하여 R2 특이적 리간드가 초기에 음식 섭취를 믿을만하게 억제하지 못하고 주사 후 6시간이 지나서 억제한다는 입증 데이터를 제공하였다.

또한, 운동 활동 측정은 이 변수에 CRF-R이 관련이 없음을 지지하였다. 운동 활성화가 CRF-R1 매개 과정인 것으로 암시하는 녹아웃 마우스에서의 최근 증거(참조번호: 40)와 마찬가지로, R1 선택성 효능제인 CRF는 전체 운동 활성을 유의적으로 증가시킨 반면 UCN II 투여는 그렇지 않은 것으로 관찰되었다. 흥미로운 것은, 두 수용체에 의해 높은 친화성으로 결합되어 있는 UCN 처리가 CRF에 대한 반응에서 관찰되는 것보다 훨씬 낮은 값을 나타내면서 활성 증가에 대해 유의적이지 못한 경향을 보인다는 점이다. 이는 공지된 두 수용체 종류 사이에 기능적 길항작용을 지지하는 증가하는 증거와 대략적으로 일치하는 것이다. CRF-R1 결손 마우스가 스트스에 대해 감소된 내분비 및 불안증 유사 반응을 보이는 반면(참조번호: 41), CRF-R2 변이주는 이 변수들의 증가를 보이는 바(참조번호: 11,39,42), CRF-R2의 기본 활성화가 CRF-R1에 의한 스트레스 반응을 억제하는 역할을 할 수 있음을 암시한다.

스트레스와 관련된 생리적 기능과 행동적 기능에 작용하는 각각의 CRF 관련 시그날 전달 분자들의 역할을 보다 상세하게 분석하기 위해서는 내인성 CRF-R2 선택 리간드의 동정이 필요할 것이다. Ucn II mRNA의 중심 발현을 통해, 펩타이드의 중심 투여에 반응하는 세포 그룹을 동정하고 지금까지 가설화된 CRF-R2 활성화 결과와 일치하는 행동 반응을 확인하였다. 스트레스 생물학에서 이 펩타이드의 위치에 대한 보다 상세한 통찰에는 Ucn II 함유 세포의 중심 투사들의 묘사와 유전자 발현과 펩타이드 방출을 조절하는 인자 및 주위 여건들의 동정을 필요로 할 것이다.

본원에는 다음과 같은 참조문헌들이 인용되었고 이들을 참조번호로서 명시하였다:

본원에 기재된 모든 특허 또는 공개 문헌들은 본 발명이 속하는 당업자의 수준을 나타내는 것이다. 이 특허 및 공개 문헌들은 각 공보가 특이적으로 각각 참조 인용되는 것으로 표시되었지만 본 발명에 동등한 정도로 참조인용된 것이다.

당업자라면, 본 발명이 본질적 것은 물론 본원에 기술된 목적을 수행하고 결과와 장점을 얻기 위하여 최적화된 것임을 잘 이해할 것이다. 본원에 기술된 방법,절차, 처리, 분자 및 구체적 화합물과 함께 본 발명의 실시예는 현재 바람직한 양태를 예시하고 본 발명의 영역을 제한하기 위한 것이 아니다. 본원에 기재된 변형 및 다른 용도는 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 취지내에 포함되는 범위내에서 당업자에 의해 실시될 수 있다.

Claims

(a) 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA,

(b) 65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 특징으로 하는 높은 엄중 조건(high stringency condition)에서 상기 (a)의 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리된 DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA 및

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 (a) 및 (b)의 분리된 DNA들과 코돈 서열에 차이가 있는, 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 우로코르틴 II를 암호화하는 DNA.
제1항에 있어서, 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 우로코르틴 II 단백질 전구체 펩타이드를 암호화하는 DNA.
제1항에 있어서, 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 DNA.
제1항에 따른 DNA 및 당해 DNA를 세포내에서 발현시키는데 필요한 조절 인자를 포함하는, 당해 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터.
제4항에 있어서, DNA가 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 벡터.
우로코르틴 II 단백질을 발현하는 제4항에 따른 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
제6항에 있어서, 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 숙주 세포.
제7항에 있어서, 세균 세포가 이. 콜리인 숙주 세포.
(a) 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA,

(b) 65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 특징으로 하는 높은 엄중 조건에서 상기 (a)의 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리된 DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA 및

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 (a) 및 (b)의 분리된 DNA들과 코돈 서열에 차이가 있는, 우로코르틴 II 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA에 의해 암호화된 분리 정제된 우로코르틴 II 단백질.
제9항에 있어서, 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 분리 정제된 우로코르틴 II 단백질.
제9항에 따른 우로코르틴 II 단백질에 대해 지시된 항체.
제11항에 있어서, 모노클로날 항체.
제9항에 따른 우로코르틴 II 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제13항에 따른 약제학적 조성물을 병태생리학적 상태의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 병태생리학적 상태를 치료하는 방법.
제14항에 있어서, 병태생리학적 상태가 높은 체온, 식욕 부진, 충혈성 심부전, 스트레스, 불안증 및 바람직하지 않게 낮은 ACTH 분비량으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 방법.
(a) 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA,

(b) 65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을세척하는 것을 특징으로 하는 높은 엄중 조건에서 상기 (a)의 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리된 DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA 및

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 (a) 및 (b)의 분리된 DNA들과 코돈 서열에 차이가 있는, 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA.
제16항에 있어서, 서열 1의 서열을 갖는 DNA.
제16항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 전구체 단백질을 암호화하는 DNA.
제16항에 있어서, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 DNA.
제16항에 따른 DNA와 당해 DNA를 세포내에서 발현시키는데 필요한 조절 인자를 포함하는, 당해 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터.
제20항에 있어서, DNA가 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 벡터.
사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 발현하는 제20항에 따른 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
제22항에 있어서, 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 숙주 세포.
제23항에 있어서, 세균 세포가 이. 콜리인 숙주 세포.
(a) 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA,

(b) 65℃에서 0.1 x SSC와 기능적으로 등가인 저염 농도 및 고온에서 막을 세척하는 것을 특징으로 하는 높은 엄중 조건에서 상기 (a)의 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리된 DNA의 안티센스 쇄에 하이브리드화하는 분리 정제된 DNA 및

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 (a) 및 (b)의 분리된 DNA들과 코돈 서열에 차이가 있는, 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA에 의해 암호화된 분리 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드.
제25항에 있어서, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 분리 정제된 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질.
제25항에 따른 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질에 대해 지시된 항체.
제27항에 있어서, 모노클로날 항체.
제25항에 따른 사람 우로코르틴 관련 펩타이드 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제29항에 따른 약제학적 조성물을 병태생리학적 상태의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 병태생리학적 상태를 치료하는 방법.
제30항에 있어서, 병태생리학적 상태가 높은 체온, 식욕 부진, 충혈성 심부전, 스트레스, 불안증 및 바람직하지 않게 낮은 ACTH 분비량으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 방법.
우로코르틴 II와 사람 우로코르틴 관련 펩타이드로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 변형 단백질.
제32항에 있어서, 타이로신 잔기를 포함하도록 변형된 변형 단백질.
제32항에 있어서, Tyr-Gly으로 이루어진 서열이 단백질의 N-말단에 첨가되어 변형된 변형 단백질.
제32항에 있어서, 제1 아미노산, 제1 및 제2 아미노산, 제1 내지 제3 아미노산, 제1 내지 제4 아미노산, 및 제1 내지 제5 아미노산으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 아미노산이 결실된 N-말단 결실에 의해 변형된 변형 단백질.
제32항에 있어서, 서열 3 및 서열 11의 단백질 또는 이 중에서 선택되는 단백질이고, 당해 단백질의 위치 9에 해당하는 이소로이신 잔기가 "D형" 이성질체 아미노산으로 치환된 변형 단백질.
제36항에 있어서, "D형" 이성질체 아미노산이 D-이소로이신, D-페닐알라닌 및 D-로이신으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 변형 단백질.
제32항에 있어서, 서열 11의 우로코르틴 II 및 서열 11의 사람 우로코르틴 관련 단백질로 이루어진 그룹으로 부터 선택되고, 당해 단백질의 위치 17에 해당하는 글루탐산 잔기가 D-글루탐산으로 치환된 변형 단백질.
제32항에 있어서, 아미노산이 당업계에 공지된 비표준 아미노산으로 치환된 변형 단백질.
제39항에 있어서, 비표준 아미노산이 C_α-메틸화 로이신, C_α-메틸화 알라닌, N-im-벤질히스티딘, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시라이신, 3-메틸히스티딘, 호모세린 및 오르니틴으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 변형 단백질.
제32항에 있어서, 단백질의 N-말단에서 아실화되어 있는 변형 단백질.
제32항에 있어서, 지방산에 의해 아실화된 변형 단백질.
제32항에 있어서, 형광 표지를 포함하도록 변형된 변형 단백질.
제32항에 따른 단백질이 독소와 결합된 접합체.
제32항에 따른 단백질이 방사능핵종을 위한 복합체화제와 결합된 접합체.
제45항에 있어서, 방사능핵종과 복합체화된 접합체.