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KR20030063610A - 안티센스 ｍＲＮＡ 발현 유도에 따른 ｐＨ안정화 ＣＨＯ세포주 - Google Patents

안티센스 ｍＲＮＡ 발현 유도에 따른 ｐＨ안정화 ＣＨＯ세포주 Download PDF

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KR20030063610A
KR20030063610A KR1020020003820A KR20020003820A KR20030063610A KR 20030063610 A KR20030063610 A KR 20030063610A KR 1020020003820 A KR1020020003820 A KR 1020020003820A KR 20020003820 A KR20020003820 A KR 20020003820A KR 20030063610 A KR20030063610 A KR 20030063610A
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dhfr
cho
cell line
antisense
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김기태
김익환
김홍진
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주식회사 서린바이오사이언스
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Abstract

본 발명은 동물세포주의 발현벡터로 이용되는 pcDNA 3.1(+)에 DHFR 유전자 및 안티센스 LDH-A 유전자가 융합된 cDNA를 클로닝하여 동물세포의 발현벡터내로 삽입하고, 상기 발현벡터를 동물세포, 특히 CHOdhfr-(dihydrofolate reductase-deficient Chinese Hamster Ovary)내로 도입한 후 이를 MTX (methotrexate)를 이용하여 증폭시킴으로써 수득되는, pH 안정화 CHO 세포주 (CHO/dfhr/anti-ldh)에 관한 것이다.

Description

안티센스 ｍＲＮＡ 발현 유도에 따른 ｐＨ안정화 ＣＨＯ 세포주 {pH stabilizing CHO/dhfr/anti-ldh cell line reduced lactate production by using antisense mRNA expression techniques}
본 발명은 단백질을 대량 배양하는 경우 산성화를 억제하여 장기적으로 배양하는 것을 용이하게 하여주는 산성화가 억제된 동물세포주에 관한 것이다. 일반적으로 동물세포에서 단백질의 대량 배양시에 배양액에 축적되는 젖산은 배양액의 산성화 유도로 장기배양을 하는데 어려움이 있다. 본 발명자들은 이와 같은 동물세포에서의 단백질의 대량 배양시 젖산에 의한 산성화를 억제하여 장기배양을 보다 용이하게 할 수 있는 세포주에 관한 연구를 하던 중, 젖산의 생성으로 인한 산성화의 방지를 젖산 생성을 유도하는 단백질의 mRNA에 대한 안티센스 mRNA를 유도할 수 있는 기법을 도입하여 수행함으로써 본 발명을 완성하였다.
통상적으로, 특정 유전자의 발현 억제는 안티센스 올리고머를 배아나 세포내로 직접 도입하는 방법을 이용하는데, 이 방법은 일시적인 효과를 볼 수는 있지만 연속적인 효과를 기대하기는 어렵다. 배아나 세포내로 도입된 올리고머는 분해될 뿐만 아니라 세포분열에 따른 딸세포로의 전달이 이루지지 않는다. 따라서 특정 유전자의 발현을 억제하기 위해서는 매번 안티센스 올리고머를 도입하여야 하고 이 올리고머를 새로이 고안하여야 한다. 이런 결과는 경제성 및 시간의 효율성이 떨어지는 결과를 초래한다.
또한, 박테리아의 발현 벡터에 비해서 동물세포에 적용되는 벡터의 유전자 발현은 매우 낮다. 박테리아는 특정 유전자를 포함한 플라스미드를 도입하였을 때 세포내에서 복제함으로써 유전자의 카피 수가 증가될 수 있고, 세포분열 시에 세포막을 통해서 딸세포로 전달된다. 그러나, 동물세포주에서 특정 유전자의 발현에 이용되는 벡터는 박테리아와 같이 플라스미드의 복제나 딸세포로의 전달이 이루어지지 않는다. 또한 동물세포에 이용되는 벡터는 박테리아가 이용하는 프로모터 보다 휠씬 효율이 떨어진다.
따라서, 본 발명자들은 단백질의 대량생산을 위한 세포의 장기배양시에 배양액의 산성화 유도로 생산성을 감소시키는 젖산의 생성을 억제하고, 이로부터 단백질의 생산성이 높은 세포주를 수득하고자 연구하던 중 본 발명을 완성하였다. 본 발명자는 동물세포에서의 유전자의 카피 수를 증가시키기 위해 DHFR 유전자를 도입하고, 세포내의 젖산 생성의 감소를 위해 DHFR 유전자와 안티센스 LDH (Lactate DeHydrogenase: 젖산 탈수소효소) mRNA를 유도할 수 있는 유전자를 융합하여 도입하는 방법을 사용하였다. 또한 도입한 유전자가 세포분열에 따른 딸세포에로의 전달이 용이하도록 하기 위해서 본 발명자들은 염색체내로 삽입된 세포만을 한 세포가 존재할 수 있을 때까지 희석하여 단일 클론의 형성으로 얻었다.
도 1은 LDH (Lactate DeHydrogenase) 활성을 줄일 수 있는 벡터 개발과 CHO dhfr- 세포내로의 도입을 도시한 것이다.
도 2는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에서 배양액의 락테이트의 양과 세포 안팎의 pH 변화를 도시한 것이다.
도 3은 1 mM Hepes 완충용액 시스템에 노출시킨 후 각 시간대별에 따른 세포성장(가)과 배양액의 pH 변화(나)를 도시한다.
도 4는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에서 급격한 pH 감소로 유발되는 세포사멸의 관찰 결과를 도시한다.
도 5는 pH의 급격한 감소로 유도되는 세포사멸에 수반되는 일련의 반응결과를 도시한다.
본 발명은 일차적으로 서열번호 1 (LDH-A cDNA)의 안티센스 뉴클레오티드(anti-ldh)에 관한 것이다.
본 발명은 DHFR 유전자와 상기 안티센스 뉴클레오티드가 융합된 융합 유전자에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 융합 유전자를 포함하는 동물세포 발현벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 동물세포주의 발현벡터로는 pcDNA 3.1(+)가 사용된다.
본 발명은 발현벡터 pcDNA 3.1(+)에 DHFR 유전자와 안티센스 LDH-A 유전자가 융합된 cDNA를 클로닝하여 발현벡터내로 삽입하고 상기 발현벡터를 동물세포, 특히CHOdhfr - (dihydrofolate reductase-deficient Chinese Hamster Ovary) 세포내로 도입한 후 이를 MTX (methotrexate)를 이용하여 증폭시킴으로써 수득되는, LDH 단백질 생성이 저하된 pH 안정화 CHO 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 pH 안정화 CHO 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)를 사용하여 동물세포 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 젖산은 LDH (Lactate DeHydrogenase)의 활성으로 피루부산으로부터 생성된다. LDH는 A와 B 단량체의 조합으로 이루어진 네개의 단량체로 구성되어 있다. A 단량체는 주로 피루부산으로부터 젖산을 생성하는 기능을 가지고, B 단량체는 젖산을 피루부산으로 전환하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 CHOdhfr - 세포내에 LDH 이소타입으로 A2B2와 A3B의 중간체로써 젖산을 생성할 수 있는 A 단량체가 존재함을 확인하고, LDH-A cDNA를 RT-PCR (Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction; 이하 RT-PCR이라 부름)을 이용하여 CHOdhfr - 세포주로부터 클로닝하였다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 동물세포에 이용되는 발현벡터는 박테리아의 발현벡터에 비해서 발현정도가 훨씬 낮아 특정유전자에 대한 안티센스 mRNA의 효과를 기대하기가 힘들다. 그러나 동물세포에서 대사산물을 생합성하는 몇몇 효소 [DHFR, 메탈로티오닌 (metallothionein), 아데노신 디아미나아제 (adenosine (adenylate)deaminase), 티미딜레이트 합성효소 (thymidylate synthetase), 글루타메이트 합성효소 (glutamate synthetase), 글루타민 합성효소 (glutamine synthetase), 오르니틴 데카복실라아제 (ornithine decarboxylase) 등]들은 그 활성을 억제할 수 있는 저해제가 처리되었을 때 유전자의 카피 수가 증가되는 현상이 나타난다.
본 발명자들은 이에 상기 증폭가능한 유전자 중 DHFR 유전자와 이 효소의 저해제인 MTX를 이용하여 anti-ldh유전자의 증폭을 시도하였다. 즉, 동물세포주의 발현벡터로 이용되는 pcDNA 3.1(+)에 DHFR 유전자와 안티센스 LDH mRNA가 유도될 수 있는 유전자가 융합된 cDNA를 클로닝하여 CHOdhfr - 내로 형질전환하였다.
본 발명에서 동물세포의 발현벡터로서는 특히 제한되지 아니하며, 일반적으로 사용되는 동물벡터 pCIneo, pRc/RSV, pZeoSV2 등이 모두 사용될 수 있다.
본 발명에서의 CHOdhfr -세포주내에는 서열번호 1의 LDH-A cDNA가 존재함으로써 락테이트의 생성으로 세포의 산성화가 유도될 수 있음을 내재하고 있다. 본 발명에서는 CHOdhfr -세포주내에 존재하는 LDH-A 유전자로부터 발현되는 LDH-A 단백질 생성을 mRNA 수준에서 번역을 억제하기 위해서 프로모터의 작동시에 안티센스 LDH-A mRNA가 유도될 수 있는 형태로 구축하였다. 서열번호 1의 상보적 서열을 갖는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 동물세포 발현벡터는 안티센스로 발현될 수 있는 약 400 개의 뉴클레오티드로 이루어져 있고, 이는 LDH-A의 전체 염기서열 (약 960 개의 뉴클레오티드) 중 5' 쪽에 상응하는 부위를 포함하고 있다. 이로 인해 발현되는 안티센스 LDH-A mRNA는 세포내에서 정상적으로 발현되는 센스 LDH-A의mRNA의 5' 부위와 안정화된 결합을 이룸으로써 LDH-A 유전자가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 것이다.
형질전환된 세포주의 선별은 pcDNA 3.1(+) 내에 존재하는 네오마이신 저항성 유전자에 대한 1차적인 선별로 500 μM의 G418을 약 2주 동안 처리하여 얻었다. 이렇게 선별된 형질전환체로부터 동일한 유전자를 가지는 클론은 한 세포가 존재할 수 있는 범위까지 희석하여 얻었다. 이 세포로부터 DHFR 유전자와 안티센스 LDH mRNA가 유도될 수 있는 융합된 유전자의 카피 수가 증가된 세포주는 약 4주 간격으로 DHFR의 활성저해제인 MTX 농도를 50 nM에서 100 μM까지 순차적인 농도의 증가로 획득하였다 (CHO/dhfr/anti-ldh).
DHFR 유전자와 더불어 증폭된 안티센스 LDH mRNA를 유도하는 세포주의 LDH 활성은 대조군 세포에 비해서 약 30 % 감소되었고, 세포내에 원래 존재하는 LDH mRNA와 도입된 유전자에 의해서 전사된 안티센스 LDH mRNA 사이의 안정화된 결합은 결합을 이룬 내부에 위치한 부위와 일치하는 올리고머의 고안으로 RT-PCR을 시행함으로써 이를 증명하였다.
CHO 세포는 10 % 혈청을 포함한 소듐 비카보네이트-완충된 (sodium bicarbonate-buffered) F-12 배양액에서 이산화탄소가 공급되고 습도가 조절되는 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 동물세포의 장기배양시에 유도될 수 있는 배양액의 급격한 pH 감소는 단백질의 생산성을 감소시키는 주 요인중의 하나이다. 본 발명에서는 장기배양시에 유도되는 pH 감소현상과 유사한 조건을 만들어 주기 위해서 각 세포주는 10 % 혈청을 함유한 1 mM Hepes-buffered F-12에서 이산화탄소 공급이 되지 않으면서 습도가 조절되는 37 ℃ 배양기에서 배양하였다.
이산화탄소가 공급되지 않는 조건에서 안티센스 LDH mRNA가 발현되는 세포주의 배양액으로 방출되는 젖산의 양과 pH의 감소는 각각 대조군 세포에 비해서 약 50 %씩 감소하였다. 또한 이산화탄소가 공급되지 않는 배양기에 20시간 노출시킨 후 세포내 pH는 대조군 세포주 (CHOdhfr - )의 경우에 7.305 ±0.051에서 6.582±0.002로 급격히 감소한 반면 안티센스 LDH mRNA가 도입된 세포주(CHO/dhfr/anti-ldh)의 경우에 7.303 ±0.068에서 7.210 ±0.057으로 약간 감소함을 확인하였다.
이산화탄소가 공급되지 않는 조건에서의 세포성장은 대조군 세포에 비해서 안티센스 LDH mRNA가 도입된 세포(CHO/dhfr/anti-ldh)가 훨씬 증가되었을 뿐 아니라 배양액의 pH가 일정히 유지되었다.
대조군에서 산성화에 의한 세포손상은 현미경으로 세포를 관찰하고, 프로피듐 요오다이드 (propidium iodide : PI)로 염색한 후 유식세포측정기로 분석한 결과 세포사멸(apoptosis)로 관찰되었다. 세포의 산성화에 의한 대조군 세포의 사멸은 미토콘드리아의 막전위차 감소와 더불어 미토콘드리아로부터 시토크롬 C가 방출되는 양상을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 또한, 대조군 세포의 세포사멸은 캐스파제-3가 활성화되어 DNA 절편 현상을 유도하는 일련의 반응이 관찰되었다.
결론적으로 안티센스 LDH mRNA를 유도하는 세포주는 세포밖 (배양액)과 세포내의 pH를 일정히 유지할 수 있었으며 산성화에 의한 세포사멸이 현저히 저하되었다. 따라서, 본 발명에서 개발한 pH 안정화 CHO/dhfr/anti-ldh세포주는 단백질의 대량생산을 위한 장기배양시에 이용될 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서의 안티센스 mRNA 발현기술은 세포 분열시에 도입된 유전자가 염색체와 같이 이동함으로써 그 효과가 지속적으로 나타나는 특징이 있다.
하기에 본 발명의 pH 안정화 CHO/dhfr/anti-ldh세포주의 제작과정을 상세히 설명한다. 하기 과정에 의해 제작된 pH 안정화 CHO/dhfr/anti-ldh세포주는 현재 1993년 이후 WIPO (World Intellectual Property Organization)에서 승인한 국제미생물 기탁기관인 한국세포주협회 (KCLRF: Korean Cell Line Research Foundation)에 2001년 11월 17일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00051로 기탁되었다.
CHO 세포로부터 LDH 이소타입의 결정
젖산을 생성하는 LDH는 A와 B의 두 가지의 단량체가 조합하여 이루어진 네개의 단량체로 구성된 효소이다. A 단량체는 주로 피루부산으로부터 젖산을 생성하는 기능을 가지고 B 단량체는 젖산을 피루부산으로 전환하는 활성을 가진다.
CHOdhfr-세포주에 존재하는 LDH 이소타입은 이 세포주로부터 획득한 세포질 단백질의 1 μg을 시그마 회사 (Sigma, U.S.A)로부터 구입한 LDH 진단 키트 (카달로고 넘버; 705-A)에 명시된 절차에 따라 전 처리된 아가로스 (agarose) 겔에 적재한 후 전기이동으로 전개한다. 전개된 아가로스 겔은 다시 LDH 진단키트의 절차에 따라 수행함으로써 발색한다. 본 발명에 사용한 CHOdhfr - 세포의 LDH 이소타입은 A2B2와 A3B의 중간체로 밝혀졌다.
도 1의 가.는 CHOdhfr - 세포주내에 존재하는 LDH의 이소타입 결정 결과를도시하고 있다. 여기서, M은 마커로서 다섯 가지 LDH 이소타입을 나타낸다. CHOdhfr -에 락테이트를 생성할 수 있는 A 단량체가 존재함을 확인하였다.
dhfr/anti-ldh 융합유전자의 제작
이 세포에 존재하는 LDH-A cDNA은 지금까지 다른 종에서 알려진 LDH-A DNA 염기서열을 바탕으로 제작한 올리고머 (P1; 5' TCA AGG ACC AGC TGA TTG TGA AAT-3' P2; 5' CAG GAG TCA GTG TCA CCT TCA CA-3'를 이용하여 RT-PCR 방법으로 얻었고, 이 cDNA의 염기서열을 분석하여 LDH 이소타입임을 결정하였다. RT-PCR로 획득한 LDH cDNA의 부분적인 염기서열 (서열번호 1) 분석 결과는 젠뱅크(GenBank)에 등록(Accession No.; AF344174)하였고, 이 LDH cDNA를 pCR 2.1 클로닝 벡터로 도입한 후 이 유전자에 대한 제한효소 지도를 작성하였다. 서열번호 1은 CHOdhfr - 의 세포질로부터 추출한 RNA를 이용하여 RT-PCR로 얻은 LDH cDNA에 대한 부분적인 염기서열의 분석을 나타낸 것이다.
유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있고 안티센스 RNA를 유도할 수 있는 동물용 벡터를 구축하기 위해서 먼저 ATCC로부터 구매한 pSV2/dhfr(ATCC 37146) 벡터를 HindIII와 BglII 제한효소로 절단한 후 얻은 DHFR 유전자를 HindIII와 BamHI으로 절단한 pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) 내로 프로모트 작동방향과 일치하게 도입하였다. LDH 5'부위의 약 400 bp에 해당되는 안티센스 LDH-A mRNA가 유도될 수 있는 융합 유전자는 pCR 2.1에 LDH 유전자가 클로닝된 벡터로부터 EcoRV 제한효소로 절단한 후 위의 실험 절차로 획득한 pcDNA 3.1(+)/dhfr벡터를 EcoRV로 절단하여클로닝하였다. 도 1 중 나.는 DHFR과 안티센스 LDH-A cDNA가 융합된 형태의 벡터를 도시한 것이다. pcDNA 3.1(+) 내에 존재하는 프로모터에 의해서 전사된 DHFR과 안티센스 LDH-A mRNA가 융합된 형태로 생성되어 세포내에 존재하는 센스 LDH-A 유전자와 안정화된 결합의 유지는 LDH-A 유전자의 번역 감소를 초래할 것이다. LDH 유전자의 번역 감소는 원래 존재하는 LDH-A mRNA와 도입된 안티센스 LDH-A mRNA 사이의 안정화된 결합내에 위치한 P1과 P2 올리고머로 RT-PCR을 수행하여 증명하였다. 도 1 중 다.는 세포내에 원래 존재하는 LDH-A mRNA와 도입된 안티센스 LDH-A mRNA 사이의 안정화된 결합을 RT-PCR 결과를 도시함으로써 증명한 것이다. LDH-A에 대한 센스와 안티센스 RNA 사이의 안정화된 결합으로 인해서 유도된 LDH 활성 억제는 대조군과 안티센스 LDH-A RNA가 유도되는 세포주로부터 획득한 세포질을 이용하여 피루부산에서 락테이트 생성시에 요구되는 NADH 감소량을 340 nm에서 흡광도의 측정으로 확인하였다. 표 1은 대조군 CHOdhfr-세포주와 안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 CHO/dhfr/anti-ldh세포주에서의 LDH 상대적 활성을 보여준다. 안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 세포주의 LDH 활성은 대조군 세포주에 비해 약 30 % 감소하는 패턴을 보였다.
안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 CHO/ dhfr / anti-ldh 세포주에서의 젖산량의측정
대조군 세포 (CHOdhfr-)나 안티센스 LDH 유전자가 도입된 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)에서 생성된 젖산량을 측정하기 위한 시료 준비는 1 mM Hepes에 노출된 배양액을 80 ??에서 15분 동안 방치한 후 4 ??에서 방치하여 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액만을 취한다. 상등액에 포함된 젖산량은 시그마 회사 (Sigma, U.S.A.)로부터 구입한 젖산 발색 키트 (카달로그 넘버; 735-10)의 절차에 따라 발색 용액과 혼합한 후 540 nm에서 흡광도의 측정으로 확인하였다. 배양액의 일정한 pH 유지는 pH meter로 직접 확인하였다. 또한, 세포내의 pH 항상성은 카복시 SNARF-아세테이트 염색제로 염색한 후 유식세포측정기로 분석하여 확인하였다.
도 2에는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에서 배양액의 락테이트 양과 세포 안팎의 pH 변화를 도시하고 있다. 이 중 가.는 배양액의 젖산 변화량을 도시하고, 나.는 배양액의 pH 변화를 도시하며, 다.는 세포내의 pH 변화를 도시한다. 도 2에 도시된 바에서 알 수 있듯이, 안티센스 LDH-A RNA가 발현되는 세포주는 세포내 락테이트 생성이 감소됨으로써 세포안팎의 pH를 일정히 유지할 수 있다.
1 mM 완충용액 시스템에서 세포의 성장과 pH 변화
도 3에 도시된 결과와 같이, 1 mM Hepes 완충용액 시스템에 노출시킨 후 각 시간대별에 따른 안티센스 LDH 유전자가 도입된 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)의 성장은 대조군 세포주 (CHOdhfr-)에 비해서 증가되었을 뿐만 아니라 pH의 안정성을 유지하였다. 따라서, 안티센스 LDH-A가 도입된 세포주는 유용단백질의 대량생산에서 야기될 수 있는 배양액의 산성화 유도를 억제할 수 있다.
세포사멸 현상의 비교
pH의 급격한 변화를 유도할 수 있는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에서 세포사멸 양상은 현미경을 이용하여 세포를 직접 관찰하였고, 프로피듐 요오다이드 (PI)로 염색한 후 유식세포측정기로 확인하였다. 도 4는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에서 급격한 pH 감소로 유발되는 세포사멸의 관찰 결과를 도시화하고 있다. 이 중 가.는 1 mM Hepes 완충용액 시스템에 노출시킨 후 3 일째 세포의 형태를 관찰 (X200)한 사진을 도시하고, 나.는 세포의 산성화로 야기된 세포사멸의 양상을 유식세포측정기 (flow cytometer)로 분석한 결과를 그래프로 도시한 것이다. 도 4의 결과는 락테이트 생성으로 인한 산성화 유도로 세포사멸을 유도할 수 있고, 안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)는 대조군 세포주 (CHOdhfr-)에 비해 세포사멸이 억제됨을 보여준다.
세포사멸에 따른 세포내 반응의 관찰
세포 배양액과 세포내의 산성화에 의한 세포사멸은 세포내의 미토콘드리아 막전위차의 감소와 더불어 미토콘드리아로부터 세포질로의 시토크롬 C 방출로 진행되었다. 또한 세포사멸의 최종단계로 알려진 캐스파제-3 (caspase-3) 활성과 염색체 DNA의 절편현상은 대조군 세포주 (CHOdhfr-)에서는 증가된 반면 안티센스 LDH mRNA가 유도되는 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)에서는 현저히 감소하는 패턴을 보였다.
도 5는 pH의 급격한 감소로 유도되는 세포사멸에 수반되는 일련의 반응결과를 도시하고 있다. 이 중 가.는 미토콘드리아의 막전위차 변화를 도시하고, 나.는 미토콘드리아에서 세포질로 방출되는 시토크롬 C (cytochrome C)를 웨스턴블롯 (western blot)으로 확인한 결과를 도시한다. 다.는 세포사멸시에 세포내에서 활성화되는 캐스파제-3 (caspase-3) 활성을 도시하고, 라.는 세포사멸의 최종단계인 염색체 DNA의 절편 현상 관찰 결과를 도시한다. 도 5의 결과는 세포안팎의 산성화로 야기되는 세포사멸에 대한 일련의 반응이 대조군 세포에 비해 안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh)에서 억제됨을 보여준다.
상술한 바와 같이 안티센스 LDH-A 유전자가 도입된 세포주의 경우 세포성장에 따른 젖산생성이 감소함으로써 그로 인하여 세포주의 pH가 안정화되고 세포사멸이 억제됨을 알 수 있다.
본원발명의 세포주를 사용하여 생산 가능한 동물세포 단백질은 특정 한 단백질에 국한되어 있는 것이 아니라 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tissue plasminogen activator), 인슐린 (insulin), 인터페론 (interferon), 콜로니 자극 인자 (colony stimulating factor), Factor VIII 등의 다양한 유용 단백질의 생산에 적용될 수 있다.
세포의 손상을 야기할 수 있는 세포내의 젖산 생성량을 근복적으로 줄일 수 있는 본 발명의 동물세포주는 특정 단백질의 생산에 국한되어 있는 것이 아니라 다양하고 유용한 동물세포 단백질의 생산에 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포주의 LDH (Lactate DeHydrogenase)의 생성을 저해하는, 서열번호 1 (CHO dhfr- LDH-A cDNA)에 대해 상보적 서열을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-ldh).
  2. 제 1 항의 안티센스 뉴클레오티드와 DHFR 유전자 (ATCC 37146)가 융합된 융합 유전자(dhfr/anti-ldh).
  3. 제 2 항의 융합 유전자 (dhfr/anti-ldh)를 포함하는 동물세포의 발현벡터.
  4. 제 3 항의 동물세포 발현벡터를 CHOdhfr-세포주로 형질전환시키고, 이 후 세포주내의 상기 융합 유전자를 MTX (methotrexate)를 이용하여 증폭시킴으로써 수득되는, pH 안정화 CHO 세포주 (CHO/dhfr/anti-ldh) KCLRF-BP-00051.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100887881B1 (ko) * 2007-05-15 2009-03-06 고려대학교 산학협력단 재조합 인간 ＥＰＯ의 생산 증대를 위한 ＭｎＳＯＤ가과발현된 부유성 세포주
KR100887882B1 (ko) * 2007-05-15 2009-03-06 고려대학교 산학협력단 재조합 인간 ＥＰＯ의 생산 증대를 위한 안티센스 젖산탈수소효소 ｍＲＮＡ가 발현되고 ＭｎＳＯＤ가 과발현된부유성 세포주
CN111139263A (zh) * 2018-11-06 2020-05-12 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种高效制备长效干扰素的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochem Biophys Res Commun. 2001 Dec 21;289(5):1141-9 *
Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr;12(2):175-9 *
Glycobiology. 1999 Sep;9(9):841-50 *
J Membr Biol. 1994 Oct;142(1):21-34 *
Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jun 24;94(13):6658-63 *
Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Feb 2;96(3):1129-34 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100887881B1 (ko) * 2007-05-15 2009-03-06 고려대학교 산학협력단 재조합 인간 ＥＰＯ의 생산 증대를 위한 ＭｎＳＯＤ가과발현된 부유성 세포주
KR100887882B1 (ko) * 2007-05-15 2009-03-06 고려대학교 산학협력단 재조합 인간 ＥＰＯ의 생산 증대를 위한 안티센스 젖산탈수소효소 ｍＲＮＡ가 발현되고 ＭｎＳＯＤ가 과발현된부유성 세포주
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