KR20030062506A

KR20030062506A - 실시간 디엔에이 증폭을 통한 비형 간염 바이러스디엔에이의 고속 정량 방법

Info

Publication number: KR20030062506A
Application number: KR1020020002733A
Authority: KR
Inventors: 조우영; 김정민; 김경원; 김태균; 이미경; 조영규; 최종류; 황재택
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2003-07-28

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus; 이하 'HBV'라 칭한다)의 복제를 저해하는 화합물의 역가를 측정하기 위해 실시간 DNA증폭 방법을 이용한 고속정량방법에 관한 것으로서, B형 간염 바이러스를 생산하는 세포주에 역가를 측정하고자 하는 화합물을 처리하여 배양하고 상기 세포 배양액을 가열 처리하여 희석 시킨 후 B형 간염 바이러스에 본 발명에 의해 제공되는 특이적인 프라이머와 형광으로 표지된 탐침자를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시간 DNA증폭기를 사용하여 간편하게 정량적으로 HBV DNA를 분석할 수 있게 함으로써 종래의 방법에 비하여 시간과 노동이 절약될 뿐만 아니라 실험의 재현성이 높지 않은 문제점을 해결한, B형 간염 바이러스 치료제의 선별에 효과적으로 이용될 수 있는 고속정량방법을 제공한다.

Description

실시간 디엔에이 증폭을 통한 비형 간염 바이러스 디엔에이의 고속 정량 방법{Method of quantifying HBV DNA through real-time PCR}

B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus; 이하 'HBV'라 칭한다)는 헤파드나비리데(Hepadnaviridae)에 속하며 인간의 간세포에만 특이적으로 감염한다. 전세계적으로 3억 5천만명의 만성 보균자가 있는 것으로 추정되며 한국의 경우 인구의 약 7%인 3백만명 정도가 감염되어 있는 것으로 판단된다. 전세계 감염환자의 분포를 보면 아프리카, 동남아, 중국에 많이 분포하고, 오스트레일리아, 서유럽 및 북미에는 상대적으로 적다. 미국에서는 연간 14만명에서 32만명의 인구가 B형 간염 바이러스에 감염되어 있는 것으로 추정되며 만성 간염 환자는 120만명 정도이다. 유럽지역에서는 연간 90만명에서 100만명의 인구가 B형 간염 바이러스에 감염되어 있다고 알려져 있다(Andre F, 2000. Vaccine. 18 Suppl S20-2. ; Tiollais P, Buendia MA, 1991. Sci Am. 264(4). 116-23. ; Fallows DA, Goff SP, 1996. Adv Virus Res . 46. 165-94 ; Maddrey WC. 2000. J Med Virol 61(3):362-6).

주된 감염 경로인 감염된 어머니로부터 출산 전후 및 신생아기에 감염되는 경우 만성화율이 90%에 달하며, 성인이 된 후 감염된 경우 만성화율은 10%내외이다. 성관계나 주사침등에 노출될 때 상처를 통해 감염될 수 있다(Tiollais P, Buendia MA, 1991. Sci Am. 264(4). 116-23 ; Maddrey WC. 2000. J Med Virol 61(3):362-6.).

어린 시절 감염된 환자의 경우, 바이러스의 증식은 일어나지만 간염 증상이 나타나지 않는 면역 관용(Immune tolerance)시기가 10-30년 지속적으로 일어나지만 이들 보균자(Healthy Carrier)가 일정한 시기(15-30세)가 되면 면역기구의 작용으로 간세포가 손상을 입게 되고 급성 간염으로 발전한다. 혈청전환(Seroconversion)이 빠른 시일 내 일어나는 경우 바이러스 증식이 억제되며 간염의 증상이 더 이상 발전되지 않지만 바이러스의 증식이 효과적으로 억제되지 않는 경우 간경변증이 생기고 만성 간염으로 발전하며 심한 경우 간암으로 발전한다(Ganem D, Varmus HE.,1987. Ann Rev Biochem.. 56:651-93 ; Beasley RP, Hwang LY, Lin CC, Chien CS., 1981. Lancet. 21;2(8256):1129-33 ; Maddrey WC. 2000. J Med Virol 61(3):362-6).

간염의 증상은 가벼운 경우 피로감을 느끼게 되고, 심한 경우 황달이 나타난다. 만성 간염의 말기에는 간경변의 합병증이 발생하고 복수, 부종, 위식도 정맥류 출혈, 간성 뇌증, 혈액응고 이상, 비장 항진증 등이 나타나게 된다.

B형간염바이러스는 외막에 싸인 바이러스(Enveloped Virus)로 3.2kb의 작은 게놈(genome)을 가지며 부분적인 이중환상DNA(partially duplex circular DNA)로 구성되어 있다. 이로부터 4개의 단백질이 발현되는데 표면항원(Surface Antigen), 코어 단백질(Core), DNA 중합효소(DNA Polymerase), X단백질이 된다.

바이러스가 숙주 세포내로 침입한 후 게놈은 핵으로 이동되고 숙주세포의 복구기구(Repair system)에 의해 부분적이던 이중가닥이 완전한 이중가닥 DNA(cccDNA, covalently closed circular DNA: 또는 Relaxed circular DNA라고도 한다)가 된 후 프리지노믹 알엔에이(Pregenomic RNA)가 전사(Transcription)된 후 코어내로 싸여 들어가서(Encapsidation) 프리지노믹 알엔에이를 주형으로 B형 간염바이러스 DNA폴리머레이즈에 의한 복제과정이 일어난다. 이후 성숙된 바이러스 입자가 숙주세포를 빠져 나오며 새로운 감염주기가 반복된다(Ganem D, Varmus HE.,1987. Ann Rev Biochem.. 56:651-93).

B형 간염 바이러스의 치료제로는 바이러스의 DNA중합효소를 겨냥해 많은 약물이 개발되었거나 과정 중에 있다. 현재 시판되고 있는 약물은 인터페론 알파와 라미부다인(Lamivudine, 이하 '3TC'라 칭한다)이 있다. 인터페론 알파는 비용이 많이 들고 치료율이 20%에 불과한 문제점이 있으며(Hoofnagle JH, di Bisceglie AM, 1997. N Engl J Med 0;336(5):347-56), 3TC의 경우 경구투여가 가능하고 약효가 뛰어나며 부작용이 적지만 내성 바이러스가 발생하여 치료효과가 감소하는 단점이 있어 새로운 약물의 개발이 요구되고 있었다( De Clercq E, 1999. Int JAntimicrob Agents ;12(2):81-95).

아데포비르(Adefovir: 이하 'PMEA'라 칭한다)는 임상III상이 진행 혹은 완료되었다. 이 약물은 원래 에이즈 치료제로 개발되다가 신장 독성으로 임상단계에서 중단된 것으로, 투여용량을 낮춰 B형 간염 치료제로 임상실험중이다. 약효가 우수할 뿐만 아니라 3TC 내성 바이러스에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 AM-365, L-FMAU등이 임상 실험중인 것으로 보고되고 있다(Zoulim F, 1999. Antiviral Res 1999 Nov;44(1):1-30 ).

지금까지 B형 간염치료제의 바이러스 복제 저해 정도는 써던 블라팅(Southern blotting), 다트 블라팅(Dot blotting), B형 간염 바이러스 DNA중합효소(HBV DNA Polymerase)의 활성 분석, 정량적 피씨알 분석(Quantititive PCR)등을 통하여 측정되었다(Zoulim F, Dannaoui E, Borel C, Hantz O, Lin TS, Liu SH, Trepo C, Cheng YC. 1996. Antimicrob Agents Chemother 40(2):448-53 ; Wu J, Sullivan DE, Gerber MA, 1994. J Virol Methods 49(3):331-41).

그러나, 기존의 방법들은 B형 간염 바이러스 DNA를 정제하는데 많은 시간과 노동이 소요될 뿐만 아니라 실험의 재현성이 높지 않은 문제점이 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 대한민국 특허출원 공개번호 제1995-23713호에서는 프로틴에이즈 K(Proteinase K)처리 등을 생략한 분석방법에 대하여 개시된 바 있으며, 대한민국특허 등록번호 제10-0194003호에서는 세포배양액을 수산화나트륨 및 베타-머캅토에탄올로 처리한 후 중화 및 가열처리하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 칭한다)시킴으로써 DNA정제과정의시간, 노동을 단축하고 PCR반응중의 오염에 대한 우려를 최소화 하는데 성공하였으나, PCR반응 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동 및 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide, 이하 'EtBr'이라 칭한다)로 염색한 후 영상분석기로 강도를 분석하여야 하기 때문에 다량의 화합물 분석시 여전히 많은 시간과 노동이 소요되며, 이 과정에서 실험상의 오차가 발생하여 정확한 결과를 얻기 어려운 문제점이 있었다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 B형 간염 바이러스 복제를 저해하는 화합물의 역가를 간편, 신속, 정확하게 분석하기 위한 HBV DNA의 초고속 정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 및 2는 아데포비르(Adefovir: 이하 'PMEA'라 칭한다)를 농도별로 처리한 후 배양액을 실시간 DNA증폭(이하 '실시간 PCR'이라 칭한다)한 것을 로그(Log)값으로 나타낸 것이다.

도 1은 프라이머 HBV2001, HBV2319로 실시간 PCR시의 융해곡선(melting curve)를 나타낸 그래프이다.

도 2는 프라이머 HBV2005, HBV2122로 실시간 PCR시의 융해곡선(melting curve)를 나타낸 그래프이다.

도 3 및 4는 라미부다인(Lamivudine, 이하 '3TC'라 칭한다)과 PMEA를 농도별로 처리한 후 배양액을 실시간 PCR한 결과를 통계 분석하여 나타내는 것으로, 약물의 농도가 높을수록 HBV DNA양이 감소하는 상관 관계를 나타내는 것으로서, 도 3은 배양액을 8배, 40배, 200배로 연속 희석하여 전처리 과정을 거친 후 프라이머 2005(SEQ ID NO 5), 2122(SEQ ID NO 6)쌍으로 86℃에서 정량 PCR 하였을 때 나타나는 그래프이며, 도 4는 도 3의 결과를 수치화하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 3TC를 농도별로 처리한 후 배양액을 실시간 PCR한 것을 로그(Log)값으로 나타낸 그래프이다.

도 6은 PMEA를 농도별로 처리한 후 배양액을 실시간 PCR한 것을 로그(Log)값으로 나타낸 그래프이다.

도 7은 3TC와 PMEA를 농도별로 처리한 배양액 시료에서 대한민국특허 등록번호 제10-0194003호와 동일한 방법으로 정량 PCR을 수행하고 2% 아가로스겔에서 전기영동 및 EtBr로 염색한 것을 나타낸 사진이다.

도 8은 도 7의 겔(gel) 분석한 결과에 대하여 회귀분석곡선으로 나타낸 그래프이다.

도 9는 실시간 PCR분석을 통한 결과에 대하여 회귀분석곡선으로 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 PCR반응 중에 형광으로 표지된 탐침자(probe)에서 발생되는 형광을 탐지함으로써 시료의 증폭 초기의 양을 자동적으로 정량하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR에 의한 HBV DNA의 고속정량방법 및 이를 이용한 역가 측정방법을 제공한다.

보다 상세하기로 본 발명은, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)의 복제 수준을 탐지하기 위한 DNA의 정량방법에 있어서, HBV를 생산하는 세포주의 배양액을 95 내지 100℃에서 10분 내지 15분 동안 가열하는 가열단계; 상기 가열단계에서 얻어진 시료에 HBV에 특이적인 프라이머 및 탐침자를 넣고 실시간 PCR(real-time PCR)을 실시하는 증폭단계; 및 증폭과정에서 형광신호를 85 내지 86℃에서 측정하여 반응물 내의 최초 시료량을 정량하는 정량단계; 들을 포함하여 이루어짐을특징으로 하는, 실시간 PCR에 의한 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 고속정량방법에 있어서, HBV에 특이적인 프라이머는 하기의 서열(SEQ ID NO 5, 6)을 갖는 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

HBV2005 : 5'-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3'(SEQ ID NO 5)

HBV2122 : 5'-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3'(SEQ ID NO 6)

또한 본 발명은 상기 고속정량방법에 있어서, HBV에 특이적인 탐침자는 하기의 서열(SEQ ID NO 3)을 갖고 양쪽 말단에 형광표지 되는 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

HBV core : 5'-6-FAM-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-BHQ-1-3' ('6-FAM'과 'BHQ-1'의 사이에 존재하는 염기서열은 SEQ ID NO 3으로 표시하였다)

또한 본 발명은 상기 고속정량방법에 있어서, 실시간 PCR에서 반응물 중에 프라이머의 최종농도는 150 내지 250nM인 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 고속정량방법에 있어서, 실시간 PCR에서 반응물 중에 탐침자의 최종농도는 200 내지 300nM인 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 고속정량방법에 있어서, 실시간 PCR에서 반응물 중에 마그네슘의 최종농도는 3 내지 4mM인 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속정량방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 고속정량방법을 이용하여 HBV의 복제를 억제하는 약물의 역가를 측정하는 방법을 제공한다.

실시간 DNA 증폭(Real-time PCR)은 순방향과 역방향의 프라이머 사이에 있는 염기서열을 갖는 형광 탐침자(Dual labeled Fluorogenic Probe)를 사용한다. 5'말단(5'end)에는 빛을 발산하는 형광물질이. 3'말단(3' end)에는 빛을 억제하는 물질이 표지(labeling)되어 있는데 PCR반응중 주형 DNA(Template DNA)에 붙어있던 탐침자들의 5' 말단이 중합반응 과정에서 떨어져 나감으로써 형광이 나타나고 이것이 기계에 탐지되게 된다. 이러한 형광 탐침자에 표지되어지는 물질들로, 5' 말단에는 빛을 발산하는 형광물질(emitting fluorescence)인 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7- dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 등의 그룹에서 선택되어지며, 3' 말단에는 형광 억제 물질(Quencher)로는 6-카르복시테트라메틸로다민(6-TAMRA ; 6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1,2,3(블랙홀 형광 억제 물질 ; Black Hole Quencher), 댑실 다크 형광 억제 물질(DABCYL Dark Quencher) 등의 그룹에서 선택되어지는 것을 사용한다. 이때 일반적인 PCR 반응의 구성분에 형광프로브가 첨가되며, 그 농도는 실험에 따라 달라질 수 있음은 당업자에게는 용이하게 이해될 수 있는 것이다. 또한, 이때의 반응온도는 94℃ 반응 후, 60℃ 반응을 반복(cycling)하거나 또는 94℃ 어닐링(anealing) 후, 60℃ 반응을 반복(cycling)하는 것이 가능하다.

기존의 정량 PCR방법이 반응의 포화상태 이전의 지수적으로 증폭된 DNA 양을 측정하는데 비해 실시간 PCR방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기의 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(C_threshold, 이하 'Ct'라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석 방법이며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 이 방법은 겔(gel)을 전기 영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 이 과정이 자동화, 수치화 되므로 간편성과 신속성, 정확성에서 크게 향상된 방법이라고 할 수 있다.

이러한 실시간 PCR은 시료의 종류에 따라 최적조건을 설정하는 것이 중요하다. 더욱이 B형 간염 바이러스 생산 세포주의 경우처럼 바이러스의 DNA가 소량인 경우 정량화 하기 위해서는 특정화된 조건이 필요하게 된다. B형 간염바이러스의 경우, 정제된 DNA나 환자혈청으로부터 정제한 DNA를 이용해 실시간 PCR을 적용한 경우는 있다(Abe A, Inoue K, Tanaka T, Kato J, Kajiyama N, Kawaguchi R, Tanaka S, Yoshiba M, Kohara M., 1999. J Clin Microbiol. . 37(9):2899-2903 ; Loeb KR, Jerome KR, Goddard J, Huang M, Cent A, Corey L., 2000. Hepatology. 32(3):626-9).

그러나 다량의 화합물을 처리한 시료들로부터 일일이 정제하는 것은 시간과 노동이 많이 소요되므로 부적절한 방법이다. 따라서 세포 배양액을 가열하고 희석하는 간단한 전처리 과정 후 실시간 PCR을 하는 조건이 요구되며 이러한 방법은 아직 보고 되어 있지 않으므로 본 발명의 의의가 있다고 할 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<전처리단계> 세포배양 및 화합물 처리 및 세포배양액의 전처리

B형 간염 바이러스를 생산하는 세포주인 2.2.15세포(M.A.Shells 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005 (1987))를 T75 플라스크내 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, 이하 'FBS'라 칭한다, GIBCOBRL사 제품, 카탈로그번호 제16000-044호),1% ABAM(Antibiotic-Antimycotic, GIBCOBRL사 제품, 카탈로그번호 제15240-062호), 최종농도 400㎍/㎖의 지네티신(Geneticin, GIBCOBRL사 제품, 카탈로그번호 제11811-098호)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, GIBCOBRL사 제품, 카탈로그번호 제12800-017호)배지에서 배양하였다.

플라스크내에 세포가 밀집될 때까지 배양한 후, 트립신(Trypsin, GIBCOBRL사 제품, 카탈로그번호 제15400-054호)으로 처리하여 96공 마이크로 플레이트의 각 공에 1.5*10⁴세포를 분주하고 FBS의 농도만을 2%로 낮춘 상기의 배지에서 5% CO₂조건으로 2일 동안 배양하였다.

세포가 96공 마이크로 플레이트(96 well micro plate) 바닥에 80%정도 차게 되었을 때 B형 간염바이러스의 복제 억제물질로 알려진 3TC(Lamivudine)와 PMEA(Adefovir)를 2%배지 200㎕내에 100, 20, 4, 0.8, 0.16μM로 처리하였으며 2일 간격으로 약물처리 및 배지 교환을 하였으며, 검체당 반복수는 2회로 하였다. 또한 약물 처리 후 10일째에 배양액을 수집하였다.

수집된 배양액은 95 내지 100℃에서 10분에서 15분간 가열하여 세포를 파괴하였고, 8000rpmM으로 1분간 원심분리하여 파괴된 세포를 제거한 후, 배양액만을 이용하였다. 배양액중의 B형 간염바이러스 DNA 증폭반응의 저해물질을 최소화하기 위해 배양액 10㎕ 에 90㎕의 물을 첨가해 10배로 희석하여 사용하였다.

대조군으로써 약물을 처리하지 않은 2.2.15세포 배양액에 대해서도 앞서 기술한 것과 동일한 조작을 하였다.

<실시예 > 실시간 PCR을 통한 정량 PCR반응 및 자동분석

<실시예 1> 기존의 프라이머를 이용하여 정제된 DNA와 배양액에서 정량 PCR한 경우의 문제점 파악

(1) 단계 1 : 프라이머와 형광탐침자의 선정

우선적으로 프라이머는 대한민국특허 등록번호 제10-0194003호에서 사용한 HBV 게놈DNA의 염기서열 2001번부터 2018번 사이의 5'말단 프라이머(HBV2001: 5'-CGCCTCAGCTCTGTATCG-3', SEQ NO ID 1)와 2319번부터 2300번까지의 3'말단 프라이머(HBV2319: 5'-GATAGGGGCATTTGGTGGTC-3', SEQ ID NO 2)를 사용하였고 상기의 프라이머를 이용하기 위해서 두 프라이머 사이의 염기서열을 포함하도록 하기의 형광탐침자를 고안하였다.

형광탐침자는 HBV 게놈DNA의 2050번부터 2073번 사이의 염기서열을 이용하였으며 5'말단에는 발광물질인 6-FAM(6-Carboxyfluorescein)을, 3'말단에는 형광억제물질인 BHQ-1(Black Hole Quencher)을 표지하였다. 상기 탐침자 올리고머는 바이오서치 테크놀로지사(Biosearch Technologies, Inc.)로부터 주문 제작하였다.

HBVcore : 5'-6-FAM-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-BHQ-1-3' (6-FAM과 BHQ 사이의 염기서열은 SEQ ID NO 3 으로 표시하였다)

(2) 단계 2 : 실시간 PCR반응 및 정량적 분석

시료 10㎕에 폴리머레이즈 완충용액(10mM 트리스-HCl(pH8.3), 50mM KCl), 200μM dNTP, 800nM 프라이머, 500nM 탐침자, 3.5mM MgCl₂, 1U의 타크(Taq) DNA 폴리머레이즈(AmpliTaq DNA Polymerase, PERKIN ELMER사 제품, 카탈로그번호 제N808-0152호)를 가하고 실시간 DNA증폭기(Real-time PCR machine, 제품명 "Rotor-gene 2000 Real-time Cycler, CORBETT Research.사 제품)를 이용하여 94℃에서 5분 반응시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광의 탐지는 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.

반응에 이용한 시료는, 농도를 알고있는 HBV DNA를 10pg, 1pg, 100fg, 10fg으로 희석한 시료와 약물을 처리하지 않은 배양액을 2배에서 64배까지 2배씩 희석한 후 상기 전처리 과정을 거친 시료, 그리고 약물(3TC)을 농도별로 처리한 배양액을 10배로 희석한 후 상기 전처리 과정을 거친 시료를 사용하였다.

PCR반응을 자동 분석한 결과 기준값(Standard)의 경우 계산값(Calculated Concentration)이 주어진 농도에 비례하는것으로 나타나지만 100fg, 10fg의 경우 DNA주형가닥을 넣지 않은 대조군(NTC ; No Template Control, 이하 'NTC'라 칭한다)의 Ct값과 유사하거나 높게 나타나므로 유효한 값으로 볼 수 없었다..

약물을 처리하지 않은 시료를 2배에서 64배까지 2배씩 희석한 경우와 약물을농도별로 처리한 경우 모두 농도별로 비례하는 양상이 보이지 않았다.

<실시예 2> 반응의 최적조건 확립

상기의 실시예에서 나타난 문제점으로는 일관성이 없으며, 주형 DNA를 넣지 않은 대조군(NTC)의 Ct값과 비교해서 배양액 시료의 Ct값의 차이가 거의 없거나 높음으로써 유효성이 없기 때문에 약효 검색에 적절치 않다는 점이었다.

이를 극복하기 위해서 우선 PCR의 최적조건을 찾고, NTC와 시료의 Ct값을 구분할 수 있는 방법이 요구되었다.

우선 최적 반응의 농도를 결정하기 위하여 탐침자의 농도를 50, 100, 200, 300mM에서, 마그네슘 농도를 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6mM에서, 프라이머 농도를 100, 200, 300, 400mM 조건으로 설정한 후 각각을 조합한 반응 조건에서, 배양액을 8배, 40배, 200배 연속 희석한 시료로부터 실시간 PCR 반응을 실시하여 가장 PCR반응이 잘 되며(낮은 Ct값) 시료간 상관관계가 잘 나타나는 조건을 탐색하였다.

탐침자의 경우 200nM과 300nM에서, 마그네슘 농도는 3mM과 4mM에서, 프라이머의 경우 200nM에서 최적의 PCR 결과가 나타났다.

반면, 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 'BSA'라 칭한다), 트라이톤 X-100(Triton X-100), 엔피-40(NP-40), 트윈-20(Tween-20), 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, 이하 'DMSO'라 칭한다)등의 첨가제를 최종농도 5%로 넣어 주었을 때 PCR 반응이 증가하는 효과가 없었다.

타크 DNA 폴리머레이즈(Taq DNA Polymerase)의 경우 제품명 엠플리텍 골드 DNA 폴리머라제(AmpliTaq Gold DNA Polymerase, PERKIN ELMER사 제품, 카탈로그번호 제N808-0241호)를 사용함으로써 다량의 시료를 준비하는 과정에서 발생할 수 있는 비특이적인 프라이밍, 즉 프라이머들 간의 결합으로 인한 오차발생을 억제하고자 하였다.

그러나, PCR반응이 개선되었음에도 불구하고 배양시료의 Ct값은 NTC대조군과 큰 차이를 보이지 않았기 때문에 하기와 같은 실험을 하였다..

<실시예 3> 융해점 분석 및 반응 및 형광탐지 조건 확립

합성한 탐침자를 중심으로 기존의 프라이머와 다른 프라이머쌍을 만들어 차이점을 비교해보고 융해 곡선(Melting curve)를 분석함으로써 최적의 프라이머를 찾고자 하였다.

추가적으로 HBV 게놈DNA의 염기서열 2142번부터 2125번에 해당하는 3'밀단 프라이머(5'-CGCTGGATCTTCCAAATT-3', SEQ ID NO 4)와 염기서열 2005번부터 2024번 사이의 5'말단 프라이머(5'-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3', SEQ ID NO 5) 및 염기서열 2122번부터 2103번까지의 3'말단 프라이머(5'-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3', SEQ ID NO 6)를 각각 합성하고 염기서열 2001 내지 2319, 2001 내지 2148, 2005 내지 2122 사이에서 PCR을 실시한 후 융해 곡선을 분석해보니 프라이머 자체간의 상호 작용이나 비특이적인 프라이밍으로 인해 발생한 형광이 72 내지 85℃사이에서 크게 나타남을 알 수 있었다. 반면 시료의 경우는 85 내지 90℃사이에서 주된 융해점(Melting point)을 형성하고 있었다(도 1 내지 2 참조).

따라서 이 경우, 85℃ 이상에서 중합반응 및 형광을 탐지한다면 비특이적인 프라이밍에 의해 나타나는 결과를 상당부분 제거시켜 줄 것이며 이 경우 시료의PCR반응시 나타나는 융해점 부근에서 프라이머의 시그널이 최소로 나타나는 2005(SEQ ID NO 5)와 2122(SEQ ID NO 6)의 쌍이 최적의 프라이머로 나타났다.

실제로 72℃와 86℃에서 각각의 프라이머 쌍으로부터 실시간 PCR한 결과, 86℃에서 중합반응 및 시그널을 탐지한 경우 NTC와 기준값의 Ct값과의 차이가 크게 나타남을 알 수 있었다.

<실시예 4> 약물의 억제효과 분석 및 기존의 겔(gel) 분석과의 비교

배양액을 8배, 40배, 200배 연속 희석한 시료로부터 DNA농도와 시그널 사이의 상관관계를 알아보고, HBV복제의 저해물질로 알려진 3TC와 PMEA를 처리한 배양액 시료로부터 약물의 바이러스 복제 저해 효과를 알아보기 위해 상기의 최적화된 실험조건을 토대로 실시간 DNA증폭방법으로 분석하였으며, 또한 그 결과를 기존의 겔(gel)분석과 비교하였다.

(1) 단계1 : 프라이머 및 탐침자의 제작

프라이머는 상기 실시예 3에서 밝혀진 바와 같이, HBV게놈 DNA의 염기서열 2005번부터 2024번 사이의 5'말단 프라이머와 2122번부터 2103번까지의 3'말단 프라이머를 사용하였다.

HBV2005 :5'-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3'(SEQ ID NO 5)

HBV2122 :5'-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3'(SEQ ID NO 6)

형광탐침자는 상기 실시예 1의 단계 1에서와 같이, HBV게놈 DNA의 2050번부터 2073번 사이의 염기서열(SEQ ID NO 3)을 이용하였으며 5'말단에는 발광물질인 6-FAM을, 3'말단에는 형광억제물질인 BHQ-1을 표지하였다. 상기 탐침자는 바이오서치 테크놀로지사(Biosearch Technologies, Inc.)로부터 주문 제작하였다.

HBV core :5'-6-FAM-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-BHQ-1-3' (6-FAM 과 BHQ사이의 염기서열은 SEQ ID NO 3로 표시하였다)

(2) 단계 2 : 실시간 DNA반응

상기 전처리과정을 거친 배양액 6㎕에 폴리머레이즈 완충용액(10mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH8.3), 50mM KCl), 200μM dNTP, 200nM 프라이머, 200nM 탐침자, 3mM MgCl₂, 1U의 앰플리텍 골드 DNA 폴리머레이즈(AmpliTaq Gold DNA Polymerase)를 가하고 94℃에서 10분 반응시킨후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 86℃에서 30초 반응과정을 40회로 설정하였다. 형광의 탐지는 86℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.

(3) 단계 3 : 반응결과 분석

자동적으로 계산된 시료의 농도는 약물 처리하지 않은 시료의 값을 기준으로 하여 나머지 시료의 상대적인 값을 계산한 후 통계프로그램인 PRISM(GraphPad Software사 제품)으로 분석하였다

도 3은 배양액을 8배, 40배, 200배로 연속 희석한 후 상기의 전처리 과정을 거친 후 프라이머 2005(SEQ ID NO 5), 2122(SEQ ID NO 6)쌍으로 86℃에서 정량 PCR 하였을 때 나타나는 그래프이고, 도 4는 그 결과를 수치화하여 나타낸 것으로 시료의 DNA농도와 시그널 사이에는 상관관계가 성립함을 알 수 있었다.

도 5와 도 6는 3TC와 PMEA를 농도별로 처리한 후 배양액을 실시간 PCR한것을로그(Log)값으로 나타낸 것이고 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

번호	명칭	종류	Ct	농도(Given Conc.)	계산값(Calc. Conc.)	CV	Ct Std. Dev.
A1	10p	Standard	17.56	600,000	635,037	5.84%	0.16
A2	10p	Standard	17.89	600,000	511,135	14.81%	0.16
A3	1p	Standard	20.93	60,000	69,209	15.35%	0.17
A4	1p	Standard	21.26	60,000	55,706	7.16%	0.17
A5	100f	Standard	24.71	6,000	5,760	4.00%	0.1
A6	100f	Standard	24.5	6,000	6,613	10.22%	0.1
A7	10f	Standard	27.68	600	817	36.11%	0.49
A8	10f	Standard	28.65	600	431	28.09%	0.49
B1	3TC-100	Sample	30.91		98
B2	3TC-100	Sample	31.09		87
B3	3TC-20	Sample	31.44		69
B4	3TC-20	Sample	31.54		64
B5	3TC-4	Sample	31.46		68
B6	3TC-4	Sample	31.21		80
B7	3TC-0.8	Sample	29.66		222
B8	3TC-0.8	Sample	30.16		160
C1	3TC-0.16	Sample	28.24		565
C2	3TC-0.16	Sample	28.21		576
C3	3TC-0	Sample	27.36		1,008
C4	3TC-0	Sample	27.15		1,157
A1	10p	Standard	18.82	600,000	433,565	27.74%	0.18
A2	10p	Standard	18.46	600,000	562,767	6.21%	0.18
A3	1p	Standard	21.01	60,000	88,709	47.85%	0.2
A4	1p	Standard	21.42	60,000	65,911	9.85%	0.2
A5	100f	Standard	24.73	6,000	5,990	0.16%	0.01
A6	100f	Standard	24.7	6,000	6,122	2.04%	0.01
A7	10f	Standard	27.63	600	733	22.13%	0.35
A8	10f	Standard	28.34	600	438	26.98%	0.35
B1	pmea-100	Sample	28.12		514
B2	pmea-100	Sample	27.99		565
B3	pmea-20	Sample	25.91		2,548
B4	pmea-20	Sample	25.94		2,493
B5	pmea-4	Sample	24.55		6,825
B6	pmea-4	Sample	24.6		6,582
B7	pmea-0.8	Sample	24.34		7,946
B8	pmea-0.8	Sample	24.41		7,554
C1	pmea-0.16	Sample	24.15		9,119
C2	pmea-0.16	Sample	24.1		9,456
C3	pmea-0	Sample	23.85		11,333
C4	pmea-0	Sample	23.78		11,923
H2	Ntc	NTC	32.19
H2	Ntc	NTC	32.19

상기 표 1에 의하면 기준값이 농도별로 상관성 있게 나타났으며 시료와 NTC대조군 사이에서도 Ct값의 차이가 커져 S/N 비율이 높아진 것을 알 수 있었다. 또한 약물처리시 농도가 감소함에 따라 HBV의 복제에 대한 억제효과가 감소함을 알 수 있었다.

도 7은 3TC와 PMEA를 농도별로 처리한 배양액 시료에서 대한민국특허 등록번호 제10-0194003호와 동일한 방법으로 정량 PCR을 수행하고 2% 아가로스겔에서 전기영동 및 EtBr로 염색한 것을 나타낸 사진이며, 이후 디지털 영상분석기인 케미이미저 4400(ChemiImager 4400, Alpha Innotech Corporation사 제품)로 분석하여 수치화하였다. 겔(Gel)분석의 결과를 보면 처리한 3TC와 PMEA의 농도가 높을수록 HBV DNA양이 감소하는 상관 관계가 나타나며, 3TC가 PMEA보다 우수한 효과를 보임을 알 수 있는데 이는 표1의 실시간 PCR분석 결과와 일치한다.

도 8 및 9는 도 5 내지 7에 나타난 실시간 PCR분석과 겔(Gel)분석의 결과를 통계 프로그램인 PRISM으로 분석하여 회귀곡선(Nonlinear regression)으로 나타낸 것이고 그 결과는 하기 표 2에 요약하였다.

	Gel 분석	실시간 PCR(Real-time PCR)
	3TC	PMEA	3TC	PMEA
EC ₅₀	0.1099	4.434	0.1432	5.825

상기 표 2에서 알수 있는 바와 같이, 약물을 처리하지 않은 대조군의 HBV DNA의 양을 100%로 보았을 때 HBV DNA의 양이 50% 억제되는 약물의 농도인 EC₅₀(Effective Concentration 50)은 3TC의 경우 100nM, PMEA의 경우 5μM정도로 두 방법에서 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은, HBV복제를 억제하는 화합물에 의한 HBV 게놈 DNA의 감소를 실시간 PCR로 신속, 정확하게 정량화 할 수 있어 B형 간염 바이러스 치료제 발굴을 위한 효과적인 방법으로 이용될 수 있는 유용한 발명인 것이다.

Claims

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; 이하 'HBV'라 칭한다)의 복제 수준을 탐지하기 위한 DNA의 정량방법에 있어서,

HBV를 생산하는 세포주의 배양액을 95 내지 100℃에서 10분 내지 15분 동안 가열하는 가열단계;

상기 가열단계에서 얻어진 시료에 HBV에 특이적인 프라이머 및 탐침자를 넣고 실시간 PCR(real-time PCR)을 실시하는 증폭단계; 및

증폭과정에서 형광신호를 85 내지 86℃에서 측정하여 반응물 내의 최초 시료량을 정량하는 정량단계;

들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는, 실시간 PCR에 의한 HBV DNA의 고속정량방법.
제 1항에서 있어서,

상기 HBV에 특이적인 프라이머는 하기의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 HBV DNA의 고속정량방법.

HBV2005 : 5'-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3'(SEQ ID NO 5)

HBV2122 : 5'-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3'(SEQ ID NO 6)
제 1항에서 있어서,

상기 HBV에 특이적인 탐침자는 하기의 서열(SEQ ID NO 3)을 갖는 상기 HBV DNA의 고속정량방법.

HBV core : 5'-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-3'(SEQ ID NO 3)
제 3항에 있어서,

상기 HBV에 특이적인 탐침자는

6-FAM (6-Carboxyfluorescein), TET (2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7- dichlorofluorescein), 6-JOE (6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein) 또는 HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되어지는 형광물질(emitting fluorescence)이 5' 말단에 표지되고;

6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1,2,3 (Black Hole Quencher), 댑실 다크 형광 억제 물질(DABCYL Dark Quencher)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되어지는 형광억제물질(Quencher)이 3' 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 HBV DNA의 고속 정량 방법.
제 1항에 있어서,

상기 실시간 PCR에서의 반응물 중 프라이머의 최종농도는 150 내지 250nM인 것을 특징으로 하는 상기 HBV DNA의 고속정량방법.
제 1항에 있어서,

상기 실시간 PCR에서 반응물 중 탐침자의 최종농도는 200 내지 300nM인 것을 특징으로 하는 상기 HBV DNA의 고속정량방법.
제 1 내지 9항중 어느 한 항의 방법을 이용하여 HBV의 복제를 억제하는 약물의 역가를 측정하는 방법.