KR20030045087A - 고정화된 dna 중합효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 공유결합에 의해 고정화된 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 관한 것으로서, 높은 활성을 유지하고 있는 고정화된 DNA 중합효소 및 DNA 기질이 결합하여 활성부위가 보호된 상태의 고정화된 DNA 중합효소를 제공한다. 본 발명인 고정화된 DNA 중합효소는, DNA 중합효소, 연결물질 및 지지대로 구성되며, 상기 DNA 중합효소는 상기 적어도 하나의 연결물질과 공유결합하고, 상기 연결물질은 상기 지지대와 화학결합하며, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성보다 10% 이상 유지되도록, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질에 결합되는 상기 DNA 중합효소의 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절된 것을 특징으로 한다.

Description

고정화된 DNA 중합효소{Immobilized DNA Polymerase}

효소는 생체 내에서 화학반응을 촉진시키는 촉매작용을 하는 단백질로서, 각 반응 및 기질에 따라 매우 특이적인 촉매활성을 가지고 있다. 효소의 이러한 특이적 촉매활성을 이용한 효소반응은 생명과학 및 의학 분야에서의 연구 및 진단을 위하여, 그리고 촉매화학 공정의 효율 향상을 위하여 다양하게 활용되고 있다. 이와 같은 효소반응의 활용에 있어서, 반응생성물을 정제하거나 효소를 회수하여 재사용하기 위한 목적으로, 반응이 끝난 후 반응용액으로부터 효소를 분리하는 과정이 필요한 경우가 많다. 그러나, 용액 상태의 반응시료로부터 효소, 반응생성물 등의 구성물질을 분리, 정제하는 것은 장시간이 소요되는 번거로운 작업이므로, 효소의 분리 공정을 간편화할 수 있는 방법의 개발은 효소반응의 활용에 있어서 대단히 중요하다.

고정화된 효소의 개발은 상기 효소의 분리 공정을 간편화할 수 있는 아주 효율적인 방안이므로 이에 대한 다양한 연구들이 광범위하게 수행되어져 오고 있다. 고정화된 효소란 지지대에 물리적, 또는 화학적으로 결합된 상태로 존재하면서 촉매활성을 유지하고 있는 효소를 의미한다. 이러한 고정화된 효소를 사용함으로써 얻을 수 있는 일반적인 장점은 다음과 같다. 첫째, 반응후 지지대를 제거함으로써 효소를 간편하게 반응용액으로부터 분리, 회수할수 있으므로 시료의 정제과정을 간단하게 할 수 있으며, 둘째, 상기 회수된 고정화된 효소를 재사용함으로써 비용을 절감할 수 있고, 셋째, 효소반응이 포함된 다단계 공정들을 단순화할 수 있게 됨에 따라 반응공정상의 효율을 높일 수 있다. 또한, 효소를 고정화시킴에 따라 효소의 물리적 안정성이 향상되거나, 효소반응의 조건이 변화되는 등의 부대적 효과에 의해 활용 효율이 향상될 수도 있다.

효소의 고정화 방법으로, 물에 불용성인 담체에 효소를 고정화하는 담체결합(Carrier-Binding) 방법, 다기능기를 가진 시약을 사용하여 효소들 사이를 연결하는 교차결합(Cross-Linking) 방법, 그리고 반투과성의 겔이나 고분자 막으로 효소를 감싸는 포획(Entrapping) 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소는 공유결합에 의해 효소를 지지대에 고정하는 일종의 담체결합 방법에 의해 제조된 것이므로, 담체결합 방법의 특성에 관하여 아래에 상술한다.

담체결합 방법은, 효소가 결합한 후의 특성이나 결합되는 양이 담체의 특성및 결합방법에 의해 영향을 많이 받으므로, 효소와 담체 사이의 화학적, 물리적 작용을 고려하여 담체의 종류 및 결합방법을 선정하게 된다. 이 방법은 효소와 담체 사이의 결합방법에 따라 분류되는데, 수소결합이나 반데르발스 결합에 의한 물리적 흡착 방법, 이온교환기를 가진 다당류나 합성 고분자에 효소가 이온결합하는 이온결합 방법, 효소와 담체 사이에 공유결합을 형성하는 공유결합 방법이 있다.

상기 물리적 흡착이나 이온결합에 의한 담체결합 방법은 담체에 효소를 결합시키는 공정이 비교적 간편하며, 약한 결합으로 인하여 효소의 활성부위구조에 미치는 영향이 상대적으로 약하여 효소의 활성이 고정화 결합에 의해 손상될 가능성이 낮은 장점이 있다. 그러나, 효소와 담체 사이의 약한 결합으로 인하여 온도나 pH의 작은 변화에도 효소의 유실이 쉬우며, 다른 단백질과도 비특이적 결합이 일어날 수 있어 특이성이 낮다는 단점이 있다. 상기 공유결합에 의한 담체결합 방법은 효소와 담체 사이에 강한 공유결합을 형성시켜 효소를 고정화시키므로 상기 두 방법이 가지는 단점을 해결할 수 있는 방안이 될 수 있으므로, 여러 종류의 담체를 이용한 다양한 공유결합성 고정화 방법에 대한 연구들이 수행되어진 바 있다. 담체와의 공유결합을 형성할 수 있는 효소의 반응기로서 아미노기, 카르복실기, 수산기, 티올기, 이미다졸기 등이 있으므로, 이러한 반응기들을 대상으로 한 아미드 결합 반응, 알킬화 또는 아릴화 반응, 디설파이드 반응, 디아조 반응 등을 수용액 상에서 실시할 수 있는 고정화 반응들이 개발되어 있으며, 지지대 표면의 반응기와 효소의 반응기를 직접 반응시키는 방법, 양쪽 말단에 반응기를 가진 연결물질을 사용하여 지지대와 효소를 연결하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 담체와 효소 사이의 강한 공유결합의 형성에 의해 효소의 구조적 변화가 유발되어 효소의 활성이 손상될 가능성이 높으므로, 공유결합에 의한 담체결합 방법은 고정화 후 효소의 활성을 유지하는 것이 난점이 되고 있다.

공유결합에 의해 효소를 지지대에 고정화하기 위하여 가장 중요한 점은, 고정화 결합에 의하여 효소의 활성 부위에 변화가 생겨서 효소의 활성이 손상되는 것을 방지하여야 한다는 것이다. 따라서, 고정화 반응이 효소의 활성부위 또는 활성 부위에 근접한 곳에서 일어나서는 안되며, 효소의 활성 부위에서 멀리 떨어진 곳이라고 하더라도 그 반응의 결과 효소의 전체 구조에 영향을 미쳐서 궁극적으로 효소 활성을 저하시키는 알로스테릭 효과(Allosteric effect)가 생기지 않아야 함이 필수적인 조건이다. 따라서, 효소의 활성을 유지하면서 고정화시키기 위해서는 고정화 결합이 일어나는 효소의 부위를 선택하여, 즉 고정화 결합이 형성되더라도 활성이 손상되지 않는 특정 위치에 있는 효소의 반응기를 선택하여 고정화 반응을 실시할 수 있어야 한다. 즉, 특정 위치의 효소의 반응기를 선택하여 배향된 상태로 효소가 고정화 반응을 할 수 있는 배향된 고정화 반응(oriented immobilization)이 가능하여야 한다. 그러나, 많은 수의 아미노산이 아미노 결합에 의해 연결된 거대고분자인 효소의 특성상 고정화 반응이 가능한 반응기, 예를 들어 아민기, 카르복실기, 수산기 등이 아주 많이 존재하며, 효소의 전체 부위에 걸쳐 분포되어 있으므로 특정 위치에 있는 효소의 반응기를 선택하여 배향된 고정화 반응을 일어날 수 있게 하는 것은 현재까지 개발된 기술들로는 불가능하다. 즉, 종래의 고정화 방법들을 이용한 효소의 고정화에서는 효소가 가지는 다수의 반응기들에 대한 불특정적고정화 반응(random immobilization)에의해 효소의 활성을 손상시키는 부위에 고정화 결합이 형성되거나, 또는 여러 개의 고정화 결합이 형성되게 되어 효소 활성의 손상이 심각하게 유발되게 된다.

상술한 종래의 고정화 방법들의 불특정적 반응 특성에서 기인하는 효소 활성의 손상에 더하여, 전자(electron)의 재배치를 필요로 하는 강한 고정화 공유결합의 형성은 그 자체로서도 효소 활성을 저하시킬 가능성이 높다. 즉, 특정 위치에 있는 효소의 반응기를 선택하여 배향된 고정화 반응을 시킬 수 있다고 하더라도, 이러한 배향된 고정화 반응을 실제로 실시해보기 전에는 활성이 손상되지 않고 유지된 상태인 공유결합으로 고정화된 효소의 존재유무를 확인하는 것은 불가능하다고 할 수 있다.

본 발명에서 고정화한 DNA 중합효소(DNA polymerase)는 유전공학 분야의 유전자 재조합 공정들을 비롯하여, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의한 염기서열 증폭기술 등에서 연구개발 및 임상적 진단 목적으로 광범위하게 활용되고 있다. 그러나, 상기 유전자 재조합 공정 및 PCR 염기서열 증폭기술 등에 사용할 수 있을 정도로 DNA 중합반응 활성이 높게 유지된 상태로 고정된 DNA 중합효소는 아직 개발된 바가 없다.

발명의 개시

본 발명은 공유결합에 의해 고정화되어 있으며, 높은 활성을 유지하고 있는 고정화된 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 DNA 중합효소를 공유결합에 의해 고정화시키되,상기 고정화된 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질과 결합하는 결합부위가 선택되고, 또한 상기 고정화된 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절되어, 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성에 비하여 10% 이상 유지되는 고정화된 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 고정화된 DNA 중합효소에 DNA 기질이 결합하여 활성부위가 보호된 상태의 고정화된 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그리고, 본 발명은 상기 고정화된 DNA 중합효소 및 상기 활성부위가 보호된 상태의 고정화된 DNA 중합효소를 제공함으로써, 분리 및 회수가 용이하고 재사용이 가능한 고정화된 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 명세서의 도면, 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 본 발명의 다른 목적 및 장점을 쉽게 인식할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 공유결합에 의해 고정화되고 높은 활성을 유지하는 새로운 고정화된 DNA 중합효소를 제공한다.

보다 상세하게, 본 발명은, 고정화된 DNA 중합효소로서, DNA 중합효소, 연결물질 및 지지대로 구성되며, 상기 DNA 중합효소는 상기 적어도 하나의 연결물질과 공유결합하고, 상기 연결물질은 상기 지지대와 화학결합하며, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성보다 10% 이상 유지되도록, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질에 결합되는 상기 DNA 중합효소의 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절된 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명은 또한, 고정화된 DNA 중합효소로서, DNA 기질로 활성부위가 마스킹된 DNA 중합효소, 연결물질 및 지지대로 구성되며, 상기 DNA 중합효소는 상기 적어도 하나의 연결물질과 공유결합하고, 상기 연결물질은 상기 지지대와 화학결합하며, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성보다 10% 이상 유지되도록, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질에 결합되는 상기 DNA 중합효소의 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절된 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소를 제공한다.

공유결합에 의하여 효소를 지지대에 고정화하기 위하여 가장 중요한 점은, 고정화 결합에 의하여 효소의 활성부위에 변화가 생겨서 효소의 활성이 손상되는 것을 방지하여야 한다는 것이다. 종래의 불특정적 고정화 반응(random immobilization)에 의해 공유결합으로 고정화된 효소의 구성은 효소의 활성부위 또는 활성부위에 근접한 곳에 고정화 공유결합이 형성되거나, 효소의 활성부위에서 멀리 떨어진 곳에 고정화 결합이 형성되더라도 효소 활성을 저하 또는 손상시키는 알로스테릭 효과에 의해, 고정화 후의 활성을 유지하기가 어려운 경우가 대부분이다.

본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소는 연결물질을 통하여 지지대에 공유결합시킴에 있어서, 다음과 같은 두 가지 특징을 가지게 함으로써 고정화후 높은 활성이 유지되도록 한다.

첫째, 본 발명에서는 DNA 중합효소의 활성부위가 아닌 쪽에 고정화 공유결합이 형성되도록 배향된 고정화반응(oriented immobilization)이 일어나게 하여, 고정화 공유결합 이후에 효소의 활성이 유지되는 구성이 되도록 하였다. 배향된 고정화 반응이 일어나도록 하기 위하여, DNA 중합효소의 활성부위에 선택적으로 결합하는 DNA 기질을 결합시킴으로써, 활성부위를 마스킹(masking)하여, DNA 중합효소의 활성 부위 또는 활성부위에 근접한 위치에 고정화 공유결합이 일어나는 것을 방지하였다. 마스킹 방법을 적용하지 않은 DNA 중합효소를 동일한 방법으로 고정화하는 경우, 즉, 불특정적 고정화 반응에 의해 고정화하는 경우, 고정화 후의 활성이 거의 남아있지 않음을 확인함으로써, 마스킹 방법에 의해 배향된 고정화 반응이 일어남을 확인하였다.

둘째, 본 발명에서는 DNA 중합효소를 공유결합에 의해 고정화시킴에 있어서, 고정화반응의 조건을 조절함으로써 고정된 DNA 중합효소의 활성이 높은 구성이 되도록 하였다. 고정화 반응의 조건을 조절하기 위하여, 지지대에 화학결합된 연결물질의 농도를 조절함으로써 DNA 중합효소와 고정화 공유결합을 형성하는 지지대 표면의 고정화 반응기의 농도를 조절하였다. 고정된 DNA 중합효소의 활성이 높게 하기 위해서는,(1) 지지대의 단위면적 당 고정화된 DNA 중합효소의 수가 높아야 하며, (2) 고정화된 DNA 중합효소 당 형성된 고정화 공유결합의 수가 가장 바람직하게는 1 개로 되어야 하며, 고정화 반응의 조건상 불가피한 경우 효소의 활성부위에 영향을 미치지 않는 범위에서 가능한 최소로 유지되어야 한다. 그러나, 화학반응에 있어서 상기 두가지 조건을 각각 만족시키는 반응조건은 서로 배치되는 조건이다. 즉, 고정화된 DNA 중합효소의 수를 증가시키기 위해서는 이와 반응하는 고정화 반응기의 농도를 증가시켜야하나, 이 경우 고정화된 DNA 중합효소는 너무 많은 고정화 반응기의 존재로 인해 다수의 고정화 공유결합을 형성할 확률이 높아져서 활성을 상실할 확률이 높아지게 된다. 이와 반대의 경우, 즉, 고정화 반응기의 농도가 낮은 경우, 고정화된 DNA 중합효소 당 형성되는 고정화 공유결합의 수가 효소의 활성이 유지될 수 있을 정도로 적어지게 되지만, 고정화된 DNA 중합효소의 수가 감소하게 되어 전체적인 활성이 낮아질 수 있다. 본 발명에서는 지지대 표면의 고정화 반응기의 농도를 증가시킴에 따라 고정화된 DNA 중합효소의 활성이 증가 후 감소됨을 확인함으로써, 상기 두 가지 배치되는 고정화 반응조건이 절충되어 최적화된 활성을 나타내는 고정화된 DNA 중합효소의 구성이 가능함을 입증하였다.

상기와 같이 고정화된 DNA 중합효소의 활성을 측정하기 위하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 실시하였으며, 지지대의 표면에 고정화될 수 있는 DNA 중합효소의 최대량에 해당하는 액체 상태의 DNA 중합효소를 사용한 PCR 반응 결과와 비교하여, 고정화된 DNA 중합효소의 용액상태 대비 평균활성을 측정하였다. 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소는 고정화 결합 양상이 서로 다른 DNA 중합효소들의 혼합물 상태일 것으로 판단되므로, 용액 상태의 DNA 중합효소의 최대 활성과 대비한 평균활성으로 고정화된 DNA 중합효소의 활성을 나타내게 된다. 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소의 평균 활성은 용액 상태에서의 최대 활성에 비하여 10% 이상이었으며, 고정화 반응조건에 따라 약 80%까지 나타났다. 또한, PCR 반응 후 분리 회수하여 반복하여 재사용 가능하다는 것도 확인되었다.

본 발명에서는 상기와 같은 구성을 사용하여, 높은 활성을 유지한 상태의 공유결합에 의해 고정화된 DNA 중합효소를 구체적으로 실현시킴으로써, 적어도 DNA 중합효소의 경우에는 고정화된 DNA 중합효소의 여러 상태들 중 효소 활성이 용액 상태의 DNA 중합효소에 근접하는 고정화된 상태가 있음을 입증하였다.

현재의 기술로는 상기 고정화된 DNA 중합효소의 구조를 정확하게 분석하는 것은 어려우므로, 고정화 반응조건에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성변화 경향으로부터 고정화된 DNA 중합효소의 구조를 특징지을 수 있다.

본 발명의 실시 예에서 사용한TaqDNA 중합효소는 832개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 분자량 94 kD인 단백질이다. 본 발명의 실시 예에서 실험한 바와 같이 연결물질의 고정화 반응기가 카르복실기인 경우 이와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 일차 아민기를 가진 아미노산 잔기를TaqDNA 중합효소는 146 개 포함하고 있다.TaqDNA 중합효소의 내부에 위치하여 고정화 반응에 참여할 수 없는 잔기를 감안한다 하더라도, 효소의 외부에 위치한 고정화 결합을 형성할 수 있는 일차 아민기의 개수는 수십 개에 달할 것으로 추정된다. 따라서, 종래의 불특정적 고정화 반응에 의하여 이들이 무작위로 고정화 결합을 형성하게 되면, 효소의 활성부위 또는 활성부위에 근접한 위치에 여러 개의 공유결합이 형성되게 되어, 활성부위의 변형 또는 손상에 의해 고정화된 DNA 중합효소의 활성이 없어질 확률이 매우 높다. 이러한 예상은 본 발명의 실시 예 4에서 대조군으로 실험한 불특정적 고정화 반응예의 결과로부터 확인되었다.

본 발명에서는 우선, DNA 기질을 DNA 중합효소의 활성부위에 결합시켜 활성부위를 마스킹한 상태에서 고정화 반응을 수행함으로써, 활성부위 및 활성부위에근접한 위치에서 고정화 반응이 일어나지 못하게 하여, 배향된 상태로 DNA 중합효소가 고정화되게 하였다. 이와 같은 배향된 고정화 반응에 의하여, 활성부위로부터 상대적으로 멀리 떨어진 위치에서 고정화 반응이 일어나게 하더라도, 고정화 반응이 가능한 다수의 반응기가 DNA 중합효소의 표면에 존재하므로 여러 개의 고정화 공유결합이 형성되어 고정화된 DNA 중합효소의 활성이 손상될 수 있다. 그러므로 본 발명에서는 연결물질에 의해 형성된 지지대 표면의 고정화 반응기의 농도를 조절함으로써, 고정화된 DNA 중합효소 당 고정화 결합의 평균 갯수를 조절할 수 있도록 구성하였다.

실시 예 4에서 보인 바와 같이 지지대 표면의 고정화 반응기로 사용된 카르복실기의 농도가 약 5%일 때 고정화된 DNA 중합효소의 용액 상태 대비 평균활성이 최대가 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 다음과 같이 해석될 수 있다. 지지대 표면의 카르복실기 농도가 0%에서 5%까지 증가함에 따라 관측되는 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성의 급격한 증가는, 고정화되는 DNA 중합효소의 개수가 증가하며, 이와 동시에 고정화된 DNA 중합효소 당 형성되는 고정화 공유결합의 개수가 단 하나 또는 DNA 중합효소의 활성이 유지될 수 있는 최소의 개수로 제한된 상태로 DNA 중합효소가 고정화됨을 나타낸다. 지지대 표면의 카르복실기 농도가 약 5%에서 약 10%까지 증가할 때 관측되는 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성의 급격한 감소는, 고정화된 DNA 중합효소의 개수가 증가함에도 불구하고, 고정화된 DNA 중합효소의 활성이 손상될 정도의 다수의 고정화 공유결합이 상당수의 고정화된 DNA 중합효소에 형성됨을 나타낸다.

따라서 본 발명의 가장 최적화된 고정화된 DNA 중합효소의 구조는 다음과 같이 특징지을 수 있다.

첫째, 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소는, 활성부위 및 활성부위에 근접한 위치에 고정화 공유결합이 형성되지 않으며, 활성부위로부터 상대적으로 먼 위치에 고정화 결합이 형성된 배향된 상태로 고정화된 구조를 가진다.

둘째, 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소는 상기 배향된 상태로 고정화된 구조를 가짐과 동시에, 고정화된 DNA 중합효소 당 단 한 개 또는 활성이 손상되지 않는 범위에서 최소 개수의 고정화 공유결합을 형성한 구조를 가진다.

본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소를 구성하는 요건들을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

첫째, 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소는TaqDNA 중합효소 및 그 유도체 등 고온 안정성 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소 및 그들의 유도체 등 고온 안정성이 없는 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 중합효소를 사용하여 구성할 수 있다.

이는 상기 DNA 중합효소들의 단백질 구조가 유사하며 그 기능이 같다는 사실에 근거한다. DNA 중합효소는 크게 보아 2 개의 단백질 도메인이 구조적으로 분리된 상태로 구성되어 있으며, 상기 2 개의 단백질 도메인 중 1 개 도메인이 DNA 중합반응 활성을 가지고 있어 기능적으로도 상기 2 개의 단백질 도메인은 분리되어 있다. DNA 중합반응이 일어나기 위해서는, 상기 DNA 중합반응 활성을 가진 도메인에 부분적으로 이중가닥이 형성된 DNA가 결합되어야 한다. 본 발명의 고정화된 DNA중합효소는, 부분적으로 이중가닥이 형성된 DNA 기질로 DNA 중합효소의 활성부위가 마스킹되어 상기 DNA 중합반응 활성을 가진 단백질 도메인에 고정화 공유결합이 형성되기가 어려운 배향된 고정화가 일어난 구성이다. 따라서, 상기 DNA 중합반응 활성을 가진 도메인이 아닌 다른 단백질 도메인에 주로 고정화 공유결합이 형성되어 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소가 구성된다. 이와 같은 본 발명의 사상에 비추어 볼 때, 본 발명의 실시 예에서 사용한TaqDNA 중합효소 뿐아니라,TaqDNA 중합효소와 유사한 구조 및 기능을 가진 다른 DNA 중합효소를 사용하더라도 동일한 구조적 특성을 가지고 높은 활성을 유지한 상태의 고정화된 DNA 중합효소를 구성할 수 있음은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명백하다고 할 것이다.

둘째, 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소는 양쪽 말단에 상기 DNA 중합효소 및 상기 지지대와 각각 결합할 수 있는 반응기를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 다양한 연결물질을 사용하여 구성할 수 있다.

본 발명의 실시 예에서는 11개의 탄소사슬 양쪽 말단에 각각 지지대 및 DNA 중합효소와 결합을 형성할 수 있는 반응기를 가진 12-머캅토도데칸산을 연결물질로 사용하였으나, 양쪽 말단에 DNA 중합효소 및 지지대와 각각 결합할 수 있는 반응기를 가지고 있는 물질이면 어느 것이나 사용이 가능하다. 다만, 고정화된 DNA 중합효소와 지지대 표면 또는 지지대 표면에 형성된 매트릭스 물질과의 작용을 최소화할 수 있는 충분한 길이를 가진 연결물질을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명의 실시 예에서 사용한 것과 같은 단일 알칸 사슬을 가진 연결물질 외에도, 불포화된 탄소 결합, 질소, 산소, 황, 인 등이 포함된 연결물질을 사용하거나 가지를 가진 사슬구조의 연결물질 등을 사용할 수 있다.

셋째, 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소의 지지대는 금속, 비금속, 준금속, 이들의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되어지며, 상기 지지대의 표면에 상기 연결물질과 화학결합 할 수 있는 반응기 또는 반응자리를 가지고 있는 것을 사용하여 구성할 수 있다.

본 발명의 실시 예에서는 고정화 반응조건의 조절이 용이한 금을 지지대로 사용하였으나, 연결물질을 화학결합에 의하여 지지대 표면에 결합시킬 수 있는 반응기 또는 반응자리를 가지고 있는 물질은 모두 지지대로 사용하는 것이 가능하다.

넷째, 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소는 상기 DNA 중합효소와 상기 연결물질 간에 공유결합을 형성하여 구성할 수 있다. 특히 효소의 구조에 영향을 미치지 않도록 온화한 조건에서 반응이 가능한 일차아민기와 카르복실기 간의 아미드 결합인 것을 특징으로 하여 구성하는 것이 더 바람직하다. 일반적으로 단백질이 가지고 있는 반응기는 아민기, 카르복실기, 수산기, 이미다졸기, 페놀기, 티올기, 인돌기 등이 있으며, 고정화 반응의 종류를 선택함으로써 이들 반응기 중 특정 반응기를 선택하여 고정화 반응을 시키는 것이 가능하다. 그러나, 고정화 반응조건이 효소의 안정성에 영향을 미칠 수 있을 정도로 격렬한 경우보다 상대적으로 온화한 조건에서 고정화 반응이 가능한 반응기를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 수용액 상에서 낮은 온도 조건에서 고정화 반응이 가능한 일차아민기와 카르복실기 사이의 아미드 결합 형성반응을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 실시 예에서는 DNA 중합효소가 가진 일차아민기와 연결물질의 카르복실기 간의 반응에 의한 아미드 결합 형성반응을 사용하였으나, DNA 중합효소의 카르복실기와 연결물질의 아민기를 아미드 결합으로 연결하는 반대의 경우도 가능하다.

다섯째, 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소는 상기 연결물질과 함께 비반응성 말단기를 가진 매트릭스 물질이 상기 지지대에 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 매트릭스 물질은 고정화된 DNA 중합효소의 안정화를 저해하는 물질이 아니면 어떤 물질이라도 가능하다. 본 발명의 실시 예에서는 반응성 작용기를 가진 연결물질의 농도를 조절하기 위하여 상기 매트릭스 물질을 사용하였다. 즉, 상기 연결물질과 상기 매트릭스 물질의 상대적 농도를 조절하여 지지대 표면에 결합된 연결물질의 농도를 조절하였다. 이러한 기능 이외에도, 적절한 매트릭스 물질을 선택하여 사용함으로써, 고정화된 DNA 중합효소의 활성 보존율을 높이거나 안정성을 향상시키는 것이 가능하다. 본 발명의 실시 예에서,6-머캅토-1-헥산올 및 1-헵탄티올을 사용한 두 가지 경우를 비교함으로써 매트릭스 물질의 종류에 따른 영향을 보여주고 있다.

상술한, 목적, 특징 및 장점들은 첨부된 도면과 관련한 다음의 상세한 설명을 통하여 보다 분명해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

본 발명은, 공유결합에 의해 고정화된 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 지지대(supporting material)에 화학결합에 의하여 연결되어 있는 최소 하나의 연결물질(linker)과 DNA 중합효소가 공유결합을 형성하여 고정화되어 있으며, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질과 결합하는 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절되어, 고정화된 상태의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성에 비하여 10% 이상 유지됨을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소에 관한 것이다.

도1은 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소의 구성도,

도2는 본 발명에 의한 DNA 기질이 결합하여 활성부위가 마스킹된 상태의 고정화된 DNA 중합효소의 구성도,

도3a, 3b는 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소와 일반적인 방법으로 고정화된 DNA 중합효소의 활성을 비교하는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도4a, 4b는 매트릭스 물질의 특성에 따른 DNA 중합효소의 활성 변화를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도5a, 5b는 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소의 고정화 결합 부위가 활성부 위 마스킹에 의해 배향됨을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도6a, 6b는 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소의 제조 과정에서 DNA 중합효소와 연결물질 간의 반응 pH에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성 변화를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도7a, 7b는 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 사용했을 때의 PCR 반응 사이클 수에 따른 DNA 증폭 효율을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도8a, 8b는 고정화된 DNA 중합효소의 재사용 실험 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프,

도9a, 9b는 고정화된 DNA 중합효소의 안정성을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진 및 그래프이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 : DNA 중합효소

2 : 연결물질

3 : 지지대

4 : 매트릭스 물질

5 : DNA 기질

발명의 최선의 실시예

<실시 예>

실시 예 1 : 본 발명에 의한 고정화된 DNA 중합효소의 제조 - PIM(Protected Immobilization Method)

아래에 도시된 65개 염기의 단일가닥 DNA와 KS 프라이머를 1:1 몰비로 넣은 완충용액을 94℃에서 10분 동안 방치한 후, 35℃ 이하가 될 때까지 느린 속도로 냉각시킨다. 이때 65개 염기의 단일가닥 DNA와 KS 프라이머가 어닐링되어 부분적으로 이중가닥이 된 DNA가 생성되게 된다. 이 용액에 적정몰수의 AmpliTaq Gold DNA 중합효소(Perkin Elmer사, 미국)를 넣고, 72℃ 건조욕(dry bath)에서 10 분 동안 방치한 후, 50℃ 건조욕으로 옮겨 DNA 중합효소의 활성부위를 마스킹하여 PIM 효소용액을 제조하였다.

KS 프라이머 5'-CGAGGTCGACGGTATCG-3'

65-mer

유리표면에 두께 약 1000Å의 금 박막이 진공 증착된 3.0 mm x 5.0 mm 크기의 절편을 지지대로 사용하였다. 금 박막 표면의 청결도를 보장하기 위하여 사용 직전 피란하(Piranha) 용액에 60 ∼ 70℃에서 10 ∼ 15 분 동안 넣어 두었다가, 탈이온수에 이어서 절대 에탄올로 세척하였다.

금 박막 표면에 고정화 반응성 작용기를 도입하기 위하여 티올기를 가지고 있는 연결물질과 금 사이에서 일어나는 티올레이트 형성 반응, 즉 Au-S 결합 형성반응을 이용하여 금 박막 표면에 티올 분자 단층막을 도입하여 지지대를 형성시켰다. 이때 고정화 반응성 작용기와 비반응성 말단기를 가지는 2가지 티올 분자가 혼합된 용액을 사용하고, 고정화 반응성 작용기를 가지는 티올 분자의 몰분율을 0 ∼ 100%로 조정하여 기판 표면에 도입되는 고정화 반응성 작용기의 몰분율을 조절하였다. 고정화 반응성 작용기로서 카르복실기를 도입하기 위하여 알킬 사슬의 길이가 상대적으로 긴 티올 분자인 12-머캅토도데칸산을 연결물질로 사용하였고, 비반응성 말단기를 가지는 티올 분자인 6-머캅토-1-헥산올 또는 1-헵탄티올을 매트릭스 물질로 사용하였다. 총티올 분자 농도 2 mM의 에탄올 용액 100 ㎕에 금 박막을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 금 박막을 건져내어 절대 에탄올로 세척함으로써, 금 박막 표면에 카르복실기를 도입하였다.

카르복실기가 도입된 금 박막을 10 mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 5 mM의 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 포함하는 에탄올 용액 120 ㎕에 넣어 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 상기 카르복실기는 EDC의 존재 하에서 NHS와 반응하여 NHS-에스테르를 형성함으로써 활성화된다.

티올 분자 단층막의 카르복실기를 활성화시킨 후 금 기판을 건져내어 PIM 효소용액에 넣고 반응시켰다. 이 때, 티올 분자 단층막의 활성화된 카르복실기(NHS-에스테르)와 단백질의 일차 아민기와의 반응에 의하여 아미드 결합(-CO-NH-)이 형성되어,TaqDNA 중합효소가 지지대에 고정된다. 연결물질의 결합에 의해 형성된 지지대 표면의 카르복실기의 농도, DNA 중합효소의 농도, pH, 반응시간 등을 변화시키면서 고정화된 DNA 중합효소를 제조하였다. 본 실시 예의 방법으로 제조한 고정화된 DNA 중합효소의 기본적인 구성도를 도1에 나타내었다. DNA 중합효소(1)는 연결물질(2)과 공유결합을 이루고 있는데, 본 발명에서는 DNA 중합효소의 일차 아민기와 연결물질의 카르복실기가 아미드 결합을 이루고 있다. 연결물질(2)은 지지대(3)에 Au-S 화학결합을 통하여 연결되어 있다. 본 실시 예에서와 같이 비반응성 말단기를 가진 매트릭스 물질(4)을 도입하여 구성할 수도 있고, 매트릭스 물질을 사용하지 않는 것도 가능하다.

본 실시 예의 방법에 의하여 일차적으로 제조되는 고정화된 DNA 중합효소의 구성도는 도2에 나타내었다. 이 경우에는 DNA 중합효소(1)의 활성부위가 DNA 기질(5)로 마스킹된 상태에서 연결물질(2)에 결합되어 있다. 도2의 구성을 가진 고정화된 DNA 중합효소를 dNTP 존재 하에서 중합반응을 실시함으로써 마스킹에 사용된 DNA 기질이 제거된 도1의 구성을 가진 고정화된 DNA 중합효소를 제조할 수 있다.

실시 예 2 : 일반적인 방법으로 고정화된 DNA 중합효소의 제조 - RIM(Random Immobilization Method)

본 실시 예에서는 실시 예 1에서 사용한 부분적으로 이중가닥이 형성된 DNA 기질로 활성부위가 마스킹된TaqDNA 중합효소를 사용하는 대신, 마스킹 되지 않은TaqDNA 중합효소를 사용한 RIM 효소용액을 사용하여 고정화 반응을 실시하였다. 그 외의 고정화 반응 방법 및 반응 조건은 실시 예 1과 동일하게 실시하였으며, 활성화된 금 기판을 RIM 효소용액에 넣어 고정화된 DNA 중합효소를 제조하였다.

실시 예 3: 고정화된 DNA 중합효소의 활성 측정

실시 예 1 및 2의 방법으로 각각 제조한 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성 측정을 위하여, PCR 반응을 행하고, 이때 복제되어 증폭된 DNA의 양을 정량하였다. PCR 반응은 Perkin Elmer 사의 Model 480 PCR 장치를 사용하여 수행하였다. PCR 반응에서의 기질은 위에서 도시한 65 염기의 단일가닥 DNA를 사용하였으며, 프라이머는 KS 프라이머와 SK 프라이머(3'-CTAGGTGATCAAGATCT-5')를 사용하였다. 사용된 반응용액의 부피는 50㎕이며, 65 염기의 단일가닥 DNA 25 fmol과 KS 프라이머와 SK 프라이머 각 10 pmol, dNTP 1.0 nmol을 넣었다. 완충용액으로는 Perkin Elmer사에서 구입한 pH 8.3, 10X 완충액을 10 배 희석시켜서 사용하였다. PCR 반응에서의 온도 설정은 다음과 같다.

고온 개시 단계 : 94℃, 10 분

PCR 사이클 (20 ∼ 45 사이클): 94℃, 30 초; 50℃, 60 초; 72℃, 30 초

PCR 방법에 의해 증폭된 DNA의 정량을 위하여 20 ㎕의 PCR 반응용액을 취하여 아가로스 겔 전기영동법을 사용하여 전개하고, 에티듐 브로마이드 염료로 착색시키고, UV 조사시 나타나는 형광으로 PCR 생성물을 가시화한 후 이를 덴시토메터(densitometer)로 정량하였다.

실시 예 4 : 카르복실기 몰분율에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성

고정화 반응은 pH 8.3 인산염 완충용액에서 50℃ 조건에서 30 분 동안 수행하였다. 50 ㎕의 고정화 반응용액에 0.75 pmolTaqDNA 중합효소를 사용하여, 실시 예 1 및 2의 방법으로 각각 고정화된 효소를 제조하였다. 실시 예 1의 PIM 고정화 방법의 경우 1.5 pmol의 활성부위 마스킹용 DNA를 사용하여 제조하였다. 0.75 pmolTaqDNA 중합효소는 고정화 지지대로 사용된 금 박막절편의 면적 3 mm x 5 mm에 3 개의 단층막을 형성할 수 있는 양이다. 12-머캅토도데칸산을 연결물질로 사용하였고, 비반응성 말단기를 가지는 6-머캅토-1-헥산올을 매트릭스 물질로 사용하여, 35 사이클의 PCR 반응을 수행하여 효소 활성을 측정하였다.

PCR 생성물의 아가로스 겔 전기영동 사진 결과는 도3a에 나타내었다. 맨 왼쪽 레인은 이중가닥 DNA의 크기를 나타내는 마커이고, 맨 오른쪽 레인은 1개의 단층막 양에 해당하는 용액 상태TaqDNA 중합효소를 사용하여 증폭한 결과이며, 그 외의 레인들은 고정된TaqDNA 중합효소를 사용하여 증폭한 결과이다. 아래쪽에 표시한 숫자는 카르복실기를 도입하기 위하여 사용된 총 티올 분자 몰수에 대한 12-머캅토도데칸산의 몰분율을 나타낸다.

도3a의 아가로스 겔 전기영동 사진 결과에 나타난 효소 활성을 도3b에 그래프로 나타내었다. 가로축은 카르복실기 도입을 위하여 사용된 12-머캅토도데칸산의 총 티올 분자 몰수에 대한 몰분율을 나타낸다. 세로축은 고정된TaqDNA 중합효소의 상대적 효소활성으로서, 1 개의 단층막 양에 해당하는TaqDNA 중합효소를 사용하여 용액 상태에서 측정한 활성을 기준으로 한 상대활성 값이다. 도3a 및 3b에 도시된 바와 같이 활성부위가 마스킹되어 배향된 고정화가 일어나게 되는 PIM 고정화 방법의 경우가 마스킹되지 않은 상태에서 불특정적 고정화 반응이 일어나게 되는 RIM 고정화 방법의 경우보다 모든 카르복실기 농도 영역에서 높은 활성을 보임을 알 수 있다. 이는 활성부위가 마스킹된 상태에서 고정화 반응이 일어나는 PIM 방법의 경우, 배향된 고정화가 효율적으로 실행되어 RIM 방법에 비하여 고정화 후의 활성 보존율이 높게 됨을 입증한다.

또한 도3a 및 3b의 결과는, 고정화 반응성 작용기인 카르복실기의 농도가 변화함에 따라, PIM 방법에 의해 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성에 변화가 일어남을 보여주며, 특히 0% ∼ 10% 카르복실기 농도영역에서 급격한 변화가 일어남을 보여준다. 지지대 표면의 카르복실기 농도가 0%에서 5%까지 증가함에 따라 관측되는 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성의 급격한 증가는, 고정화되는 DNA 중합효소의 개수가 증가하며, 이와 동시에 고정화된 DNA 중합효소 당 형성되는 고정화 공유결합의 개수가 단 하나 또는 DNA 중합효소의 활성이 유지될 수 있는 최소의 개수로 제한된 상태로 DNA 중합효소가 고정화됨을 나타낸다. 지지대 표면의 카르복실기 농도가 약 5%에서 약 10%까지 증가할 때 관측되는 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성의 급격한 감소는, 고정화된 DNA 중합효소의 개수가 증가함에도 불구하고, 고정화된 DNA 중합효소의 활성이 손상될 정도의 다수의 고정화 공유결합이 상당수의 고정화된 DNA 중합효소에 형성됨을 나타낸다.

실시 예 5: 매트릭스 물질에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성

PIM 고정화 방법으로 고정화시킬 때 매트릭스 물질을 변화시켜도 본 발명의 효과를 얻을 수 있음을 확인하기 위하여, 매트릭스 물질로 1-헵탄티올을 사용하고 고정화 반응시간을 90분으로 하여, 실시 예 4의 PIM 고정화 방법과 같은 방법으로 고정화된 DNA 중합효소를 제조하여 활성을 측정하였다.

도4a와 4b는 본 실시 예의 결과를 보여준다. 도4a의 아래쪽에 표시한 숫자는 카르복실기를 도입하기 위하여 사용된 총 티올 분자 몰수에 대한 12-머캅토도데칸산의 몰분율을 나타낸다. 이 결과에 나타난 바와 같이 매트릭스 물질을 변경하여도 역시 10% 이상의 효소활성을 나타내고 있다. 1-헵탄티올을 지지대에 결합하였을 때 형성되는 비반응성 말단기는 메틸기로 6-머캅토-1-헥산올에 의하여 형성되는 알콜기와 물리적 화학적 특성이 다르므로, 카르복실기의 몰분율에 따른 활성의 변화에 차이를 보이고 있음을 알 수 있다.

실시 예 6 : 활성부위 보호율에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성

활성부위 마스킹용 부분 이중가닥 DNA의 몰수를 고정화 반응에 사용된TaqDNA 중합효소 총 몰수에 대하여 0 ∼ 2 배가 되는 범위로 변화시키면서 PIM 고정화 방법에 의해 고정화된Taq중합효소의 활성을 측정하였다. 카르복실기를 금 표면에 도입하기 위하여 사용한 총 티올 분자 몰수에 대한 12-머캅토도데칸산의 몰분율은 5.0%이었다. 고정화 반응에 사용된TaqDNA 중합효소의 총량은 3 개의 단층막에 해당하는 0.75 pmol이었으며, 그 외 다른 고정화 반응조건 및 PCR 반응조건들은 실시 예 4와 같다.

이 결과를 도5a와 도5b에 나타내었다. 고정된 효소의 활성을 도3b와 같이 용액 상태를 기준으로 한 상대적 효소 활성으로 표시하였다. 도5a에서 맨 왼쪽 레인과 맨 오른쪽 레인은 도3a와 같으며, 그 외의 레인들은 각각의 활성부위 보호율에서 고정화된TaqDNA 중합효소를 사용하여 증폭한 결과이다. 도5a 의 아가로스 겔 전기영동 사진에서 아래쪽에 표시한 숫자는 활성부위 보호 율, 즉 활성부위 마스킹을 위해 사용된 부분 이중가닥 DNA의 몰수를TaqDNA 중합효소 몰수에 대비하여 나타낸 비율이다. 도5a와 5b에서 나타낸 고정화된 DNA 중합효소의 활성은 활성부위 보호율이 1.0이 될 때까지 증가하며, 그 이상에서는 큰 변화를 보이지 않는 포화 상태에 도달한다. 이는 전체효소 중에 기질 DNA에 의하여TaqDNA 중합효소의 활성부위가 마스킹된 비율에 따라 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성이 비례하여 증가하는 것을 나타내는 것으로서, 활성부위 마스킹에 의하여 배향된 고정화 반응이 일어나 고정화된 효소의 활성이 보존될 수 있음을 명백하게 증명한다.

실시 예 7: PIM 고정화 반응의 pH에 따른 고정화된 DNA 중합효소의 활성

본 실시 예에서는 카르복실기를 금 박막 표면에 도입하기 위하여 사용한 12-머캅토도데칸산의 총 티올 분자 몰수에 대한 몰분율을 5.0%로 고정하고, 완충액의 pH를 변화시키면서 측정하였다. 그 외의 다른 고정화 반응조건들 및 PCR 반응조건들은 실시 예 4와 같다.

이 결과는 도6a와 6b에 나타나 있다. 도6a에서 맨 왼쪽 레인과 맨 오른쪽 레인은 도3a와 같으며, 그 외의 레인들은 아래쪽에 표시한 pH에서 고정화된TaqDNA 중합효소를 사용하여 증폭한 결과이다. 도6a와 6b는 PIM 효소용액의 pH에 따라 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성이 변화됨을 보여준다.TaqDNA 중합효소의 결합활성이 최대가 되는 pH 8.3에서 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성이 가장 높게 관측되었다는 사실은 활성부위 마스킹에 의한 배향된 고정화가 고정화된 효소의 활성보존을 위하여 중요하다는 것을 다시 한번 입증한다.

실시 예 8 : PCR 반응 사이클 횟수에 따른 용액 상태 및 PIM 방법에 의해 고정화된 DNA 중합효소의 활성 비교

본 실시 예에서는 카르복실기를 금 박막 표면에 도입하기 위하여 사용한 12-머캅토도데칸산의 총 티올 분자 몰수에 대한 몰분율을 5.0%로 고정하고, PIM 고정화 방법의 고정화 반응의 조건들은 실시 예 4와 같이 하여 실시하고, PCR 반응 사이클 횟수를 변화시키면서 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성을 측정하였다.

이 결과는 도7a와 7b에 나타나 있다. 도 7a에서 PCR 사이클 횟수를 각 레인의 아래쪽에 표시하였다. PCR 반응의 사이클 수가 증가함에 따른 변화가 액체 상태의TaqDNA 중합효소와 동일한 패턴을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 고정화된TaqDNA 중합효소가 용액 상태에서와 마찬가지로 중합반응 활성을 제대로 유지하고 있음을 확인할 수 있다.

실시 예 9: PIM 고정화 방법에 의해 고정화된 DNA 중합효소의 재사용 실험

본 실시 예에서는 카르복실기를 금 박막 표면에 도입하기 위하여 사용한 12-머캅토도데칸산의 총 티올 분자 몰수에 대한 몰분율을 5.0%로 고정하고, PIM 고정화 방법의 고정화 반응의 조건들은 실시 예 4와 같이 하여 실시하여 고정화된TaqDNA 중합효소를 제조하여 실험하였다. 고정화된TaqDNA 중합효소의 재사용시의 활성 변화를 관측하기 위하여, 고정화된TaqDNA 중합효소를 실시 예 3에 기술한 조건의 매 35 사이클 PCR 반응이 끝날 때마다 회수하여 새로운 PCR 반응용액에 반복하여 재사용하여, 각 PCR 반응 생성물의 농도를 측정하였다. 이 결과들은 도8a와 8b에 도시된 바와 같다. 도 8a의 각 아가로스 겔 전기영동 사진의 위쪽에 표시된 숫자는 총 PCR 반응 사이클 수를 나타낸다.

용액 상태의TaqDNA 중합효소의 PCR 반응 사이클 횟수에 따른 변화와 비교하기 위하여, 다음과 같은 대조군 실험을 실시하였다. 35 사이클 PCR 반응의 경우는 실시 예 3에 기술한 조건에서 실시하였으며, 그 이상의 PCR 반응 사이클 횟수의 경우에는 dNTP가 존재하지 않는 상태에서 PCR 반응 사이클을 실시한 후 최종 35 사이클에서만 dNTP를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. 용액 상태의TaqDNA 중합효소는 활성을 유지하여 분리하기가 어려우므로, 각각의 PCR 반응마다 새로운TaqDNA 중합효소를 사용하여 실시하였다.

도8a와 8b에 도시된 바와 같이, 본 실시 예의 고정화된TaqDNA 중합효소의 PCR 사이클 횟수에 따른 활성 변화가 용액 상태의TaqDNA 중합효소의 활성 변화 양상과 동일함을 나타낸다. 그리고, 고정화된 DNA 중합효소를 회수하여 수차례 반복하여 재사용하는 것이 가능함을 보여 준다. PCR 반응 사이클의 증가에 따른 활성의 감소는, PCR 반응 중 디내쳐레이션 단계가 진행되는 90℃ 이상의 고온 상태에서TaqDNA 중합효소가 열에 의한 활성의 손상을 받기 때문이다. 고온 공정이 없는DNA 중합반응에 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소를 사용하는 경우, 보다 많은 횟수의 재사용이 가능할 것이다.

실시 예 10 : PIM 고정화 방법에 의해 고정화된 DNA 중합효소의 저장 안정성 시험

본 실시 예에서는 카르복실기를 금 박막 표면에 도입하기 위하여 사용한 12-머캅토도데칸산의 총 티올 분자 몰수에 대한 몰분율을 5.0%로 고정하고, PIM 고정화 방법의 고정화 반응의 조건들은 실시 예 4와 같이 하여 실시하여 고정화된TaqDNA 중합효소를 제조하여 저장용액에 담구어 4℃에서 보관하였다. 저장용액은 100 mM 염화칼륨, 0.1 mM EDTA, 1.0 mM DTT, 0.5% 트윈(Tween) 20, 50% 글리세롤을 포함하는 pH 9.0인 20 mM의 트리스 완충액을 사용하였다. 각 저장기간이 경과한 후, 실시 예 3에 기술된 조건으로 35 사이클 PCR 반응을 실시하여 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성을 측정하였다.

도9a와 9b는 저장기간에 따른 고정화된TaqDNA 중합효소의 활성변화를 보여준다. 도9a의 위쪽에 표시한 숫자는 저장 일수를 나타낸다. 결과는 약 2개월의 저장기간이 경과하여도 초기 활성 대비 약 70%의 활성이 유지될 수 있음을 보여준다. 따라서 본 발명의 고정화된 DNA 중합효소는 제조 후의 장기간 저장, 사용 후의 저장 및 재사용 등이 가능한 안정화된 상태의 고정화된 DNA 중합효소임을 확인할 수 있다.

상기의 도면과 실시 예를 바탕으로 볼 때, DNA 중합효소의 활성부위 반대쪽에 공유결합이 형성되도록 효소를 배향시켜 고정화하고, 그 공유결합이 하나 또는적절한 개수의 결합으로 유지되는 한정적인 구조를 만드는 조건에서, 본 발명에서 제공하는 고정화된 DNA 중합효소가 10% 이상 바람직하게는 80% 까지 활성을 유지할 수 있음을 알 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 높은 활성을 유지할 수 있도록 구성된 고정화된 DNA 중합효소를 제공함으로써, 이를 이용한 효소반응 후 분리 및 회수가 용이하게 하여, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 재사용이 가능하게 하고 반응시료의 정제를 간편하게 한다. 따라서, 상기 고정화된 DNA 중합효소를 사용하는 효소반응 공정 및 장치에 있어서 효소의 분리과정을 간편하게 하여 상기 효소반응 공정 및 장치의 효율성을 향상시킬 수 있게 한다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시 예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백하다. 그 때문에, 전술한 실시 예들은 모든 점에서 단순한 예시에 지나지 않으며, 한정적으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서 나타나는 것으로써, 명세서 본문에 의해서는 아무런 구속도 되지 않는다.

Claims (7)

1. 고정화된 DNA 중합효소로서, DNA 중합효소, 연결물질 및 지지대로 구성되며, 상기 DNA 중합효소는 상기 적어도 하나의 연결물질과 공유결합하고,

   상기 연결물질은 상기 지지대와 화학결합하며, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성보다 10% 이상 유지되도록, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질에 결합되는 상기 DNA 중합효소의 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절된 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
2. 고정화된 DNA 중합효소로서, DNA 기질로 활성부위가 마스킹된 DNA 중합효소, 연결물질 및 지지대로 구성되며, 상기 DNA 중합효소는 상기 적어도 하나의 연결물질과 공유결합하고, 상기 연결물질은 상기 지지대와 화학결합하며, 상기 고정화된 DNA 중합효소의 평균활성이 용액 상태에서의 평균활성보다 10% 이상 유지되도록, 상기 DNA 중합효소가 배향되게 상기 연결물질에 결합되는 상기 DNA 중합효소의 결합부위가 선택되고, 상기 DNA 중합효소 당 상기 공유결합의 평균수가 조절된 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는TaqDNA 중합효소 및 그 유도체 등 고온 안정성 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소및 그들의 유도체 등 고온 안정성이 없는 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 연결물질은 양쪽 말단에 상기 DNA 중합효소 및 상기 지지대와 각각 결합할 수 있는 반응기를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 지지대는 금속, 비금속, 준금속, 이들의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되어지며, 상기 지지대의 표면에 상기 연결물질과 화학결합 할 수 있는 반응기를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소와 상기 연결물질 간의 공유결합이 일차아민기와 카르복실기 간의 아미드 결합인 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 연결물질과 함께 비반응성 말단기를 가진 매트릭스 물질이 상기 지지대에 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 고정화된 DNA 중합효소.