KR20030042944A

KR20030042944A - 전신성 홍반 낭창(ｓｌｅ) 특이적 마커의 동정 방법 및 그용도

Info

Publication number: KR20030042944A
Application number: KR1020010073861A
Authority: KR
Inventors: 정두일; 임윤; 이대연; 조범수; 이성은; 이호순; 이미나; 백명인; 황규춘; 김종완; 송영욱; 방영주; 김대기; 박세영
Original assignee: 주식회사 인투젠
Priority date: 2001-11-26
Filing date: 2001-11-26
Publication date: 2003-06-02

Abstract

본 발명은 SLE(전신성 홍반 낭창)에 특이적인 다양한 분자를 제시한다. 또한, 본 발명은 이 분자를 기초로 하여 SLE 질환 또는 SLE 질환으로의 진행 가능성을 측정, 모니터 및/또는 진단하는 방법을 제공한다. 이 진단 방법은 인간의 생물학적 시료, 예컨대 혈청, 혈액 또는 혈장을 사용하여 SLE 질환 또는 이 질환으로의 진행 가능성을 간단하고 신속, 정확하게 측정, 모니터 및/또는 진단할 수 있다.

Description

전신성 홍반 낭창(ＳＬＥ) 특이적 마커의 동정 방법 및 그 용도 {IDENTIFICATION OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS(SLE)-SPECIFIC MARKERS AND THEIR USES}

본 발명은 SLE(전신성 홍반 낭창)에 특이적인 다양한 분자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 분자를 기초로 한 진단 방법에 관한 것이다.

전신성 홍반 낭창(SLE)은 면역 복합체 및 자가항체가 조직에 침착하여 조직을 손상시키는 것을 특징으로 하는 자가면역 류마티스 질환이다[B.L.Kotzin, Systemic lupus erythematosus, Cell 85:303-306(1996)]. 그 병세도 경증에서부터 중증에 이르기까지 다양한 자가면역 질환이다. 이러한 자가면역 질환은 정상적인 자신의 조직에 대하여 유도되는 항체의 비정상적 면역 반응으로부터 발생된다.

SLE는 주로 가임 연령의 여성들이 잘 걸리는 병이다. 사춘기와 40대 사이에 이 질환의 발병을 경험한 약 60%의 SLE 환자(미국의 경우)에서 여성 대 남성의 비는 9:1 이다. SLE는 남성에게는 드물지만 기능성 남성호르몬감소증 및 정상 보다 높은 에스트라디올/테스토스테론 비를 가진 남성에게도 나타나는 것으로 추정되고 있다[J.F.Sequeira et al., Systemic lupus erythematosus: sex hormones in male patients, Lupus 2(5):315-317(1993)]. SLE는 미국 백인 보다 아프리카계 미국 흑인에게서 3배 정도 더 많이 나타난다. 또한, 아시아인의 경우에도 일반적이고 중국인의 경우에는 류마티스성 관절염 보다 더 흔한 질환으로 추정되고 있다. SLE(미국의 경우)는 매년 100,000명당 6 내지 35명의 새로운 증례가 저위험군 내지 고위험군으로서 발병하고 있다. 한국에서는 500 내지 1000명 당 한 명의 발병률로 나타나고 있다.

SLE의 원인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 자가면역성, 유전적 소인, 성호르몬, 환경적 촉진인자, 화학적 자극 등이 원인일 가능성은 있다. SLE의 유전자 체계는 알져지지 않은 비멘델의 유전 방식으로 다소 복잡하다. 유전적 소인의 근거는 SLE에 걸린 환자에게서 나타나는 2가지 조직적합성 유전자, 즉 HLA-DR2 및 HLA-DR3 비율의 증가를 통해 암시되었다. 또한, 광범위한 반수체형 HLA-A1 및 HLA-B8의 빈도수 증가도 관찰되었다. SLE와 관련이 있는 기타 유전자로는 C1q, TNF-α, hsp70-2, PARP, IL-6, IL-10, Bcl-2, T-세포 수용체 알파쇄 및 베타쇄가 있다. 보고에 따르면, 이들 유전자의 다형성이 SLE와 관련이 있다고 한다[F.C.Arnett,Jr., The genetics of human lupus, In:Dubois' Lupus Erythematosus, 5th ed., D.J.Wallace and B.Hahn,eds., Williams and Wilkins, Baltimore, pp.77-117(1997); T.J.Vyse and B.L.Kotzin, Genetic susceptibilityto systemic lupus erythematosus, Ann.Rev.Immunol. 16:261-92(1998); M.Botto et al., Homozygous C1q deficiency causes glomerulonephritis associated with multiple apoptotic bodies, Nat.Genet. 19:56-59(1998); P.Bowness et al., Hereditary C1q deficiency and systemic lupus erythematosus, Quart.J.Med., 87:455-464(1994); F.C.Arnett,Jr.(1997); T.J.Vyse and B.L.Kotzin(1998), J.Wu et al., A. novel polymorphism of FcγRlilA, which alters function, associates with SLE phenotype, J.Invest.Med. 45:200A(1997); R.Mehrian et al., Synergistic effect between IL-10 and Bcl-2 genotypes in determining susceptibility to systemic lupus erythematosus, Arthritis Rheum.41:596-602(1998)]. 개체, 가계내 질환의 격절(segregation of disease in families) 및 쌍둥이 유사율에 대한 연구는 유전적 소인이 SLE의 요인에 영향을 미친다는 것을 암시한다. SLE의 연구를 복잡하게 하는 요인으로는 민족 특유의 다양성, 임상적 이종원성, 표현율 감소 및 환경적 요인이 있다[E.S.Lander and N.J.Schork, Genetic dissection of complex traits, Science 265:2037-48(1994)]. 환경 역시 SLE의 진행에 관여한다. 예를 들어, 엡스타인 바르 바이러스는 SLE와 관련이 있는 것으로 밝혀져 있다. 하지만, 이 바이러스는 단독적으로 SLE를 일으키지는 않는다. 햇빛이 SLE에 큰 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 피부가 햇빛에 노출되면 햇빛은 피부 표면 밑에 있는 세포의 구조를 변화시키고, 면역계는 이와 같이 변화된 피부 세포를 이종 물질로 인식하여 자가면역을 개시시킨다.

SLE의 원인 중 하나인 자가면역성은 다양한 항체가 자기항원을 공격할 때 일어난다. 이러한 항체는 전신성 홍반 낭창(SLE), 전신 경화증, 혼합 결합 조직 질환(MCTD) 및 쇼그렌 증후군과 같은 질병을 겪는 환자의 체액에서 주로 나타난다(Tan et al., 1989). SLE 환자에서 일어나는 B세포와 T세포간의 불완전한 상호작용은 자가항체(항핵 항체)를 생성시킨다. 이와 같이, SLE는 자가면역 질환의 공통적인 특징인 세포핵에 대하여 지향성인 항체, 즉 항핵 항체(ANA)와도 관련이 있다. 이 항체들은 항원-항체 상호작용에 의해 면역복합체를 형성하는 것으로 생각된다. 이와 같이 형성된 면역 복합체는 축적하여 신장, 혈관, 관절 및 기타 부위에 침착되어 염증과 조직 손상을 일으킨다.

SLE는 또한 다른 요인, 예컨대 화학 물질, 약물 및 피로 등에 의해서도 유도될 수 있다.

SLE는 다발성 경화증 및 타입 I 진성당뇨병과 같은 다른 류마티스 질환과 달리 복수의 기관계가 직접적으로 관련되어 다양한 임상적 증상을 나타낸다. SLE 환자의 일반적 증상으로는 관절통, 38℃ 이상의 열, 관절염이 가장 흔하고, 얼굴의 나비 모양의 발진과 피로, 그리고 빈혈과 신장 질환 등이 동반되기도 한다.

이와 같은 복수 기관계에 의한 다양한 임상적 증상 뿐만 아니라, 자가면역 질환에 대한 일반적 처방인 면역억제제의 사용으로 인해 수반되는 합병증은 SLE를 신속하고 정확하게 진단할 수 없도록 한다. 예를 들어 프로카인아미드 또는 하이드랄라진과 같은 약물은 항핵 항체를 생성해서 SLE와 유사한 증상, 예를 들어 발열, 혈액이상, 자가면역성 용혈성 빈혈 등을 유발한다. 그러나, 이들 증상은 약물 투여를 중지한 후 1년 이내에 사라진다.

SLE의 많은 증상은 다른 질병과 유사하고, 다른 자가면역 질환과 공통되는 유전적 소인과 다양한 항핵 항체(ANA)가 연루되어 있어서 SLE를 정확하게 진단하는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서, SLE의 진단은 환자의 전체 병력, 환자의 최근 증상, 실험실적 검사와 면역검사 결과 등의 분석을 통해 종합적으로 실시하는 것이 일반적이다. 최근에 SLE 진단에 가장 많이 이용되고 있는 실험실적 검사법으로서, ANA 시험은 SLE 환자의 거의 대부분에서 양성을 나타낸다. 이러한 ANA 시험의 혈청학적 지표는 dsDNA, ssDNA, sm 단백질 및 염색질에 대한 IgG 항체의 혈청내 상승된 농도이다. 이와 같은 자가항체가 유도되는 기작은 아직 불확실하지만, SLE에서는 괴사된 세포에 의해 방출되는 염색질이 자가면역 질환을 유도하는 자가항원으로서 작용할 수 있다고 추정되고 있다.

미국 특허 제5,573,911호 공보에서는, 몇 가지 자가항체가 SLE와 연관이 있다고 설명하고 있다. 그 예로는, dsDNA, 스미드(smith), U1-RNP, Ro/SSA, La/SSB에 대한 자가항체가 있다. SLE 환자에서 나타나는 dsDNA의 빈도는 75 내지 90% 범위이고 스미드의 빈도는 25 내지 30% 범위이다(Victor J et al.; Methods and materials for detecting autoimmune antibodies) 범위이다. SLE의 진단 마커로 사용되는 dsDNA에 대한 항체는 또한 루푸스 사구체신염(GN)의 진행에 주요한 역할을 한다는 보고가 있다[B.H.Hahn and B.Tsao, Antibodies to DNA, In: Dubois' Lupus erythematosus, 4th ed., D.J.Wallace and B.Hahn, eds., Lea and Febiger, Philadelphia, pp.195-201(1993); Ohnishi et al., Comparison of pathogenic and nonpathogenic murine antibodies to DNA: Antigen binding and structuralcharacteristics, Int.Immunol. 6:817-830(1994)]. 전술한 다른 자가항체는 CREST, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증 및 MCTD를 비롯한 다른 류마티스 질환에서도 발견되는 것으로 보고하고 있다. 이외에도, SLE와 연관이 있는 자가항체에는 더 많은 종류가 존재할 수 있다는 것은 자명한 일이다.

또한, SLE의 유전학적 진단법의 하나로서, 미국 특허 제6,280,941 B1호에서는 폴리(ADP-라이보실)전달효소(PARP; 본 발명에서는 ADPRT로 명명되는 단백질) 유전자의 변형 대립유전자의 존재가 인간의 SLE와 관련이 있음을 개시하고 있다(Tsao BP et al. Genetic marker test for lupus). 이러한 PARP의 변형 대립유전자로는 PARP의 촉매 활성을 상실시키는 단독 점 돌연변이[Trucco C et al. Mutations in the amino-terminal domain of the human poly(ADP-ribose) polymerase that affect its catalytic activity but not its DNA binding capacity. FEBS Letters, 399:313-316. 1999] 뿐만 아니라 PARP 발현 감소[Lee JS et al. Decreased mRNA levels coding for Poly(ADP-ribose) polymerase in Lymphocytes of patients with SLE. Lupus, 3; 113-116. 1994] 또는 PARP의 기능적 활성을 감소시키는 모든 가능한 돌연변이 또는 다형성을 포함한다고 설명하고 있다[Haug BL et al. (1994) Altered Poly(ADP-ribose) metabolism in family members of patients with systemic lupus erythematosus, J.Rheumatol., 21;851-856.; Sibley JT et al. Altered metabolism of poly(ADP-ribose) in the peripheral blood lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 32(8): 1045-1049, (1989)].

이와 같이, SLE를 정확하게 진단하기 위한 다양한 검사법이 계속적으로 개발되고 있으나, 아직도 당해 기술 분야에서는 신속하고 용이하며 정확한 SLE 특이적 진단 시험법이 필요로 되고 있다. 따라서 본 발명에서는 SLE 특이적인 진단 마커의 개발을 SEREX (serological analysis of cDNA expression library) 기법을 통해 이룩하고자 한다. SEREX 기법은 1990 년 대 초에 개발되어 암을 위주로 한 질환 특이적 마커 발굴에 지대한 공헌을 해왔다 (Obata Y et al. Isolated nucleic acid molecules associated with gastric cancer and methods for diagnostic and treating gastric cancer. 2001, US Patent 6218521 B1.). SEREX기법은 cDNA 마이크로어레이 및 프로테옴 기법이 해결하지 못한 제반 단점을 극복한 방법으로서 다수의 질환 특이적 단백질 발굴에 최선의 방법임이 입증되어왔다.

따라서, 본 발명은 전술한 당해 기술 분야의 요구에 따라 SLE 질환에만 특이적 관련성이 있는 다양한 분자, 즉 진단학적 마커들을 동정하는 방법, 이 방법을 통해 동정된 SLE 특이적 분자들을 포함하는 SLE 측정용 킷트 및 상기 동정된 SLE 특이적 분자들을 이용하여 SLE를 보다 정확하고 신속하게 측정, 모니터 및/또는 진단하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 ADPRT(ADP 라이보실 전달효소) 클론의 SLE 환자의 혈청에 대한 혈청반응성을 도시한 것이다.

본 발명은 SLE와 특이적 관련성이 있는 SLE의 진단학적 마커를 동정하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 이 방법은 (a) 인간 세포 주 또는 조직 세포로부터 cDNA 발현 라이브러리를 수득하는 단계, (b) 이 cDNA 발현 라이브러리를 SLE 환자의 생물학적 시료, 예컨대 혈청, 혈액 또는 혈장을 사용하여 선별하는 단계, (c) SLE 환자의 혈청과 반응하는 양성 클론을 선발하여 절제하고 서열 분석하는 단계, (d) 그 결과 얻어지는 유전자 서열을 공지된 젠뱅크(GenBank)의 서열과 비교하여 동정하는 단계, 및 (e) 동정된 양성 클론이 다른 류마티스 질환 환자 유래의 혈청과 교차 반응성 이 있는지를 확인하기 위하여 다른 질환 환자의 혈청을 사용하여 동종 시험을 실시함으로써 SLE에만 특이성이 있는 클론을 확인하는 단계를 포함하며, 이에 따라 SLE에 특이적 관련성이 있는 진단학적 마커를 수득할 수 있다.

본 방법의 일 구체 예로서, 본 발명에 사용되는 cDNA 발현 라이브러리는 인간 폐암 세포 주(예컨대, NCI H1703), 고환 조직 또는 신장 조직 등에서 얻을 수 있으며, 이 세포 주 또는 조직에 국한되는 것은 아니다. 최근, 인간 골육종 유래의 MG63, 인간 간암 유래의 HepG2 세포, 또는 마우스 배아 유래의 3T6 세포주와 같은 세포주가 류마티슴의 관련 단백질을 포함하고 있다는 보고가 있다. 얻어진 cDNA 발현 라이브러리는 그 다음, SLE 환자의 생물학적 시료, 바람직하게는 SLE 환자의 혈청 수집물을 이용하여 선별한다. SLE 환자의 혈청과 반응하는 클론은 당해 기술 분야에 널리 알려진 다양한 검출 방법으로 확인할 수 있다. 일 예로, 환자의 혈청과 반응하는 클론을 알칼리성 포스파타제가 접합된 항 인간 IgG 와 항온 처리한 후 NBT(니트로블루 테트라졸륨)/BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트) 발색 용액과 항온 처리하여 발색 반응을 통해 양성 클론을 가시화 할 수 있다. 그 결과 얻어지는 양성 클론은 절제하여 서열 분석한다. 여기에서 양성 클론은 SLE 환자의 혈청과 반응하는 항원을 발현하는 cDNA 유전자를 포함한다. 본 명세서에 사용된SLE의 진단학적 마커는 SLE 환자의 혈청과 반응성이 있는 상기 cDNA 발현 라이브러리로부터 선별된 cDNA 유전자 유래의 항원이거나 또는 이 항원에 대하여 유발되는 SLE 환자 혈청 유래의 자가항체를 포함한다. 이와 같은 SLE 관련 항원 또는 이에 대한 자가항체의 동정 방법은 SEREX("Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning") 방법으로서, 1990년대 초에 처음으로 암과 관련 있는 다양한 항체를 동정하는데 사용된 바 있으나 (Sahin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11810-11913(1995); 미국 특허 제6,025,191호 및 제5,698,396호 참조), 본 발명에서와 같이 SLE 관련 항체를 동정하는 데에는 사용되거나 교시된 바는 없다.

일 구체 예로서, 전술한 본 발명의 방법에 의해 수득된 SLE 관련 자가항원은 하기 기술되는 표 1에 제시된 유전자 유래의 항원을 포함한다. 특히, SLE 특이적 관련성이 있는 항원으로는 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGM1), ADP 라이보실 전달효소(ADPRT), H2A 히스톤 단백질(H2AFY), 및 U1소핵 라이보핵산단백질(U1snRNP)이 있다. 특히 ADPRT 및 U1snRNP가 바람직하다(표 2 참조).

또 다른 양태로, 본 발명은 인체의 SLE를 측정, 모니터 및/또는 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 인체로부터 생물학적 시료를 수집하는 단계; b) 전술한 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGM1), ADP 라이보실 전달효소(ADPRT), H2A 히스톤 단백질(H2AFY), 및 U1소핵 라이보핵산단백질(U1snRNP)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 발현하는 플라크를 함유하는 막과 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 막에 존재하는 플라크로부터 발현되는 1종 이상의단백질과 생물학적 시료 사이에 형성된 모든 면역 복합체를 검출하여 인체 중의 SLE의 존재를 나타내는 단계를 포함한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어 인간의 혈액, 혈장 또는 혈청을 포함한다. 특히, 혈청이 바람직하다. 막으로는 예컨대, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드)를 포함한다. 막에는 전술한 1종 이상의 단백질을 발현하는 플라크를 함유할 수 있는데, 특히 ADPRT 또는 U1snRNP를 각각 발현하는 플라크, 또는 이 두 플라크의 조합물을 함유하는 막이 바람직하다. 상기 플라크는 전술한 각 단백질의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포의 클론을 의미한다. 숙주 세포는 대장균인 것이 바람직하다.

면역 복합체의 검출은 통상의 웨스턴 면역블롯 분석으로 실시할 수 있다. 간략히 설명하면, 정선된 단백질을 함유하는 막을 환자 혈청과 항온처리한 다음, 알칼리성 포스파타제가 접합된 항인간 IgG Ab와 항온처리한다. 형성된 면역 복합체의 검출은 NBT(니트로블루 테트라졸륨)/BCIP(5-브로모 4-클로로 3-인돌릴 포스페이트)를 이용한 발색 반응으로 실시한다. 또는, 전술한 임의의 단백질에 대한 항체를 사용하여 인간 혈청 중에 존재하는 단백질의 양을 측정할 수 있다. 측정은 당해 기술 분야에 공지된 ELISA 분석법으로 실시할 수 있다.

대안적으로, 항원-항체 복합체는 인간 IgG에 거의 불가역적으로 결합하는 프로테인(Protein) A(또는 프로테인 G)를 사용하여 검출할 수도 있다. 프로테인 A는 바이오틴과 같은 시그널 발생 시스템으로 표지할 수 있으며, 이 바이오틴은 알칼리성 포스파타제와 같은 효소에 결합시킨 스트렙트아비딘을 사용하여 측정할 수 있다. 형성된 항원-자가항체-프로테인 A-바이오틴-스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타제 복합체는 막 위에 가시적인 발색 밴드를 생성하는 기질과의 효소 반응을 통해 검출한다. 일반적으로, 알칼리성 포스파타제에 대한 기질로서 전술한 BCIP/NBT가 사용된다. 이외에도, 항체-특이적 시약으로는 모노클로널 항면역글로불린 항체 또는 폴리클로널 항면역글로불린 항체 등이 있다.

항체-특이적 시약은 이 항체-특이적 시약에 결합하고 측정가능한 시그널을 생성할 수 있는 시그널 생성 분자로 표지된 제2 시약과 접촉시키고 이와 같이 항체-특이적 시약에 결합된 제2 시약에 의해 생성되는 시그널을 측정하므로써, 이 시그널로부터 상기 조직 시료 중에 자가항체의 존재 또는 양을 알 수도 있다. 시그널 생성 분자는 방사성동위원소, 효소 및 형광분자로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

또한, 자가항체의 검출은 면역형광성(IF), 면역확산, 면역침전 및 웨스턴 블롯을 비롯한 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법으로도 실시할 수 있다.

이와 같은 방법들에 의해 검출되는 혈청과 단백질 사이의 면역 복합체의 존재는 인체가 다른 류마티스 질환 보다는 SLE로 진단될 가능성이 있음을 시사한다.

본 발명은 또한 1 또는 그 이상의 용기 중에 (a) 본 발명의 진단학적 마커의 동정 방법에 따라 동정된 PGM1, ADPRT, H2AFY, 및 U1snRNP로 구성된 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 발현하는 플라크를 함유하는 막과 (b) 양성 또는 음성의 자가항체 대조용 제제를 포함하는, SLE의 진단 및/또는 모니터를 보조하기 위한 키트를 제공한다. 양성 또는 음성의 자가항체 대조용 제제는 전술한 SLE 관련항원에 대한 자가항체 중 임의의 자가항체를 포함하거나 포함하지 않는 제제를 의미한다. 이 키트는 추가로, (c) 막 세척용 완충액 및 (d) 항체를 측정하고 가시화하기 위한 시약을 포함할 수도 있다. 이러한 항체 검출 시약은 전술한 바와 같다.

본 발명의 보다 용이한 이해를 위하여, 본 명세서에 사용된 용어들을 간략히 설명하면 다음과 같다. 이 용어들의 의미는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하고 있는 범위이다.

"SEREX(재조합 발현 클로닝에 의한 항원의 혈청학적 분석)"는 cDNA 발현 라이브러리를 이용하여 다양한 질환과 관련있는 항원을 선별하는 방법을 의미한다.

"펩타이드"란 용어는 아미노산으로 이루어진 분자를 의미한다.

"웨스턴 블롯 분석"이란 용어는 항체를 사용하여 당해의 단백질을 검출하는 생물학적 방법을 의미한다.

"시료"는 가장 광범위한 의미로서, 예를 들어, 핵산 분자를 함유하는 시료는 생물학적 조직 또는 그 단편, 세포, 막 유래의 추출물, 용액 상태 또는 기재에 결합된 상태의 DNA, RNA 또는 cDNA를 포함한다.

"유전자"란 기능이 알려지거나 또는 알려지지 않은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

"정제된"이란 자연 환경에서 제거되고 자연적으로 결합되어 있는 다른 성분으로부터 분리되고 유리된 생물학적 분자를 의미한다.

"벡터 제작물"이란 용어는 다양한 숙주 세포에서 당해의 유전자를 발현시킬 수 있는 합성 DNA 분자를 의미한다.

"단백질"이란 용어는 자연 발생물 또는 합성물에 관계없이 아미노산 서열, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 의미한다.

"총 RNA"란 용어는 리보솜 RNA, 메신저 RNA 및 트란스퍼 RNA를 구성하는 RNA 분자의 수집물을 의미한다.

"조절하는"이라는 용어는 핵산, 단백질, 소분자 또는 화학물질과 분자 사이의 특이적 결합으로부터 산출되는 분자의 발현 농도 또는 생물학적 활성의 변화를 의미한다.

"형질감염"이란 용어는 외인성 또는 내인성의 유전자를 정선된 세포로 도입시키는 절차를 의미한다.

"역전사"란 총 RNA 또는 mRNA를 cDNA로 전환시키는 과정을 의미한다.

"발현 농도"란 용어는 화학물질이나 스트레스를 비롯한 자극에 대한 반응 또는 자연에서 내인성이거나 외인성인 유전자의 형질감염으로 일정 농도를 유지하거나 변화하는 RNA 또는 단백질의 양을 의미한다.

"단편"이란 용어는 사용하기에 알맞은 기능적 특징을 보유하는 핵산 분자의 일부를 의미한다.

"면역침전"이란 용어는 단백질의 발현 농도를 정량적으로 측정하고, 또한 단백질 사이의 상호작용을 정량적으로 측정하는 생물학적 방법을 의미한다.

"ELISA(효소 결합된 면역흡착 분석법)"란 용어는 건강인이나 환자의 혈청을 사용하여 항원의 발현 농도를 측정하는 분석법을 의미한다.

이하 설명되는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

SLE 관련 항원 및 이 항원에 대한 자가항체의 동정

SLE 환자에 존재하는 SLE 관련 항체를 동정하기 위하여 다양한 cDNA 발현 라이브러리를 제작하였다. 이것을 위하여 인간 고환 조직, 신장 조직, 인간 폐암 세포주를 사용하였다. 인간 고환의 메신저 RNA(mRNA)는 클론테크 컴패니(미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재)에서 입수하였다. 인간 신장 mRNA는 바이오니어 컴패니(대한민국 청원군에 소재)에서 입수하였다. 인간 폐암 세포주(NCIH1703)는 대한민국 세포주은행(대한민국 서울시 소재)에서 입수하였다. SLE 환자의 혈청은 서울대 송영욱 교수(대한민국 서울시에 소재하는 서울대학교 병원에 재직)에게서 분양받았다.

인간 폐암 세포주는 페니실린 G(100㎍/㎖) 및 스트렙토마이신(100 유닛/㎖)과 함께 10% FBS를 함유하는 RPMI에서 증식시켰다. cDNA 발현 라이브러리의 작제는 제조자(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재)의 지시 매뉴얼에 따라 실시하였다. 간략히 설명하면, 총 RNA는 제조자의 지시 매뉴얼에 따라 트리졸 시약(Life Technologies Inc., 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재)을 사용하여 분리하였다. 이와 같이 분리된 총 RNA를 사용하여 메신저 RNA를 분리하였다. mRNA의 분리에는 퀴아겐 키트(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재)를 사용하였다. 이와 같이 얻어진 mRNA를 역전사효소를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. mRNA 총 5㎍을 사용하여 cDNA 발현 라이브러리를 제작하였다. 이와 같이 얻어진 cDNA는 올리고(dT)-링커를 포함한다. 이 cDNA를 당해 기술 분야에 공지된 통상의 방법으로 바이러스 벡터(람다 ZAP 벡터)에 클로닝 하였다. 이와 같이 제조된 cDNA 푸울을 함유하는 제작물을 이용하여 대장균을 형질전환 시켰다. 고환, 신장 및 NCIH1703으로부터 각각 총 5x10⁵cDNA 클론, 7x10⁵cDNA 클론 및 6x10⁵cDNA 클론을 수득하였다.

선별 반응을 수행하기 전에 5명의 SLE 환자의 혈청을 수집하여 대장균 용균물과 예비흡착 시켰다. 이것은 인간의 혈청이 박테리아 단백질에 대한 항체를 포함하고 있기 때문이다. 간략히 설명하면, 대장균/파지 용균물(Stratagene)을 세척 완충액(KPL Company, 미국 매릴랜드주 게터스버그 소재)에 1:10으로 희석하였다. 대장균/파지 용균물에 니트로셀룰로스 막을 침지 시키고 실온에서 30분 동안 항온처리 하였다. 막을 공기 건조시켰다. 그 다음, 막을 50㎖ 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 막을 차단 용액(KPL Company, 미국 매릴랜드주 게터스버그 소재)과 실온에서 1시간 동안 항온처리 하였다. 차단 후, 세척 용액으로 막을 3회 세척하였다. 세척 후, 환자의 혈청을 세척 용액에 1:5로 희석하고, 이 혈청에 막을 첨가하였다.

SLE 관련 항원의 선별에는 예비흡착 된 혈청을 사용하였다. 간략히 설명하면, 20,000개의 플라크를 함유하는 평판에 니트로셀룰로스 막(10 mM IPTG 처리된 막)을 배치하였다. 37℃에서 12시간 동안 항온처리 한 후, 막을 세척 용액으로 3회 세척하였다. 세척된 막을 차단 용액과 실온에서 1시간 동안 항온처리 하였다. 차단 후, 막을 예비흡착된 희석 혈청과 실온에서 2시간 동안 항온처리 하였다. 항온처리후, 막을 세척 용액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 막을 1:5,000 희석률의 알칼리성 포스파타제 가 접합된 항 인간 IgG와 항온처리 하였다. 항체 반응 후, 막을 세척 용액(KPL Company)으로 세척하였다. 세척 후, 막을 NBT(니트로블루 테트라졸륨, 0.3㎎/㎖)/BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 0.15㎎/㎖) 발색 용액과 항온처리 하여 SEREX 양성 클론을 가시화 하였다. 면역 선별 된 클론은 in vivo 절제하고 서열분석하였다. in vivo 절제는 제조자의 지시 매뉴얼(Stratagene)에 따라 실시하였다. 이와 같이 3가지 각각의 cDNA 발현 라이브러리를 5명의 SLE 환자의 혈청 수집물로 선별하여 총 68개의 클론을 동정하였다. 이 중에서, 21개의 클론이 독립적인 것이었다.

이중 몇 가지 유전자의 목록을 표 1에 제시하였다. 유전자 뱅크 데이터베이스를 검색하여 이 클론들이 모두 공지된 유전자와 유의적인 상동성이 있다는 것을 관찰하였다. SLE 환자의 혈청에 존재하는 것으로 공지된 U1snRNP 유전자도 관찰되었다.

SLE와 관련있는 후보 유전자 목록

클론	클론의 수	유전자	젠뱅크 수탁번호
S-1	1	포스포글리세레이트뮤테이스	XM012219
S-2	2	아연단백질	XM028970
S-3	5	ADP 라이보실 전달효소	NM001618
S-4	7	핵자가항원(55KD)	BC001047
S-5	1	라밥틴-5	NM004703
S-6	1	H2A 히스톤 단백질	XM047728
S-7	1	DNA 결합단백질 B형	M24070
S-8	1	중심체 자가항원 C형	M95724
S-9	2	U1소핵 라이보핵산단백질	M22636

실시예 2

SLE 관련 자가항체의 빈도수 측정

표 1에 기재된 클론들의 빈도수를 측정하기 위하여 동종 시험(allogenic test)을 실시하였다. 동종 시험은 제조자(Stratagene)의 지시 매뉴얼에 따라 실시하였다. 간략히 설명하면, 비교군으로서 다른 류마티스 질환자 및 정상인에게서 채취한 혈청의 연속 희석물을 사용하여 실시예 1에서 사용했던 동일한 플라크 분석법으로 표 1에 기재된 SLE 면역반응성 클론의 교차반응성을 시험하였다. 다른 류마티스 질환자의 혈청은 서울대병원에 재직중인 송영욱 교수에게서 분양받은 류마티스성 관절염, 근종 및 경피증 환자의 혈청을 포함한다. 각 분석시 음성 대조군으로는 삽입체가 없는 λ-ZAP 클론을 공동배양하여 포함시켰다.

그 결과, 표 1에 기재된 모든 클론은 정상인 68 명의 혈청과는 반응하지 않았다. SLE를 포함하는 류마티스성 질환이 있는 환자의 혈청에 존재하는 SLE 관련 자가항체의 빈도 수는 표 2에 제시한 바와 같다. 분석 결과는 시험 클론이 음성 대조군 파지와 분명하게 구별될 때에만 양성으로 기록하였다.

SLE 관련 유전자의 동종 시험

	빈도 수
유전자	전신성 홍반낭창	류마티스성 관절염	근종	경피(경화)증	정상
S-1	5/50	0/50	0/37	1/18	0/68
S-3	22/50	0/50	0/37	0/18	0/68
S-6	3/50	0/50	0/37	0/15	0/68
S-9	21/50	0/50	2/37	3/18	0/68

표 2에 제시된 바와 같이, ADPRT(ADP 라이보실 전달효소;S-3) 및 U1snRNP(U1소핵 라이보핵산단백질;S-9) 자가항체는 SLE 환자의 혈청에서 최고의 빈도수로 나타났다. 도 1에는 SLE 환자의 혈청에 대한 ADPRT 클론의 혈청 반응성을 제시하였다. 음성 대조군으로 삽입체가 없는 λ-ZAP 벡터를 ADPRT 클론과 함께 혼합하였다. 분석 결과는 시험 클론이 대조용 파지와 분명하게 구별될 때에만 양성으로 기록하였다. SLE 환자의 혈청은 1:200 희석물로 사용하였다.

ADPRT는 세포괴사의 공지된 마커이다. 세포괴사 동안 ADPRT는 절단된다. 발명의 상세한 설명에 전술한 바와 같이, ADPRT의 변형 대립유전자 또는 다형성이 SLE와 관련이 있다는 보고는 있으나, ADPRT 항원 또는 이에 대한 자가항체 자체가 SLE 질환의 진단 마커로 사용될 수 있음이 개시되거나 암시된 바는 없다. 따라서, 본 발명의 ADPRT 진단 마커는 SLE의 면역학적 진단 시험법에 보다 신속하고 정확한 마커로서 당해 진단 시험에 높은 실용성과 효율성으로 편리하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

또한, PGM1, ADPRT, H2AFY, 및 U1snRNP 클론들이 SLE 혈청에 비해 류마티스성 관절염, 근종 및 경피증 환자의 혈청과는 거의 대부분 반응성이 없다는 것을 확인하였다. 이는 상기 시험 클론들이 SLE 특이적이라는 것을 증명하는 것이다.

이상 설명드린 발명의 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것이다. 따라서, 당업자라면, 첨부되는 특허청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위와 영역 내에서 다양한 수정과 변형 예를 용이하게 실시할 수 있으며, 이러한 수정과 변형 예들도 본 발명에 포함되는 것이다.

전술한 바와 같은 SLE 관련 항원 및 자가항체의 동정 방법에 따르면, SLE와 특이적 관련성이 있는 다양한 항원 및 자가항체를 동정할 수 있으며, 이와 같이 동정된 항원 및 자가항체를 사용하면 지금까지 사용되었던 어떤 SLE 진단 시험들 더 보다 신속하고 정확하며 편리하게 SLE를 다른 류마티스 질환으로부터 특이적으로 구별하여 측정, 모니터 및/또는 진단할 수 있을 것이다. 또한 이 방법으로 SLE 치료제 개발의 목표가 되는 단백질의 동정이 가능함으로써 이에 대한 다양한 종류의 치료제 개발이 신속히 이루어 질 수 있게 된다.

[참조문헌]

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Francoeur, A.-M. et al. (1989) Anti-SM and Anti-U1RNP Lupus Fine Specificities. Journal of Clinical Immunology 9(3): 256-263.

Lee JS et al. Decreased mRNA levels coding for Poly(ADP-ribose) polymerase in Lymphocytes of patients with SLE. Lupus, 3; 113-116. 1994.

Haug BL et al. (1994) Altered Poly(ADP-ribose) metabolism in family members of patients with systemic lupus erythematosus, J.Rheumatol., 21;851-856.

Sibley JT et al. Altered metabolism of poly(ADP-ribose) in the peripheral blood lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 32(8): 1045-1049, (1989).

Tsao BP et al. Evidence for linkage of a candidate chromosome 1 region to systemic lupus erythematosus, Arthritis &Rheum., 39: S 217. (1996).

Victor J et al. Methods and materials for detecting autoimmune antibodies. US patent 5,573,911 (1996).

Claims

SLE와 특이적 관련성이 있는 SLE의 진단학적 마커를 동정하는 방법으로서,

(a) 인간 세포주 또는 조직으로부터 cDNA 발현 라이브러리를 수득하는 단계,

(b) 이 cDNA 발현 라이브러리를 SLE 환자의 생물학적 시료를 사용하여 선별하는 단계,

(c) SLE 환자의 생물학적 시료와 반응하는 양성 클론을 선발하여 절제하고 서열 분석하는 단계,

(d) 그 결과 얻어지는 유전자 서열을 공지된 젠뱅크의 서열과 비교하여 동정하는 단계, 및

(e) 동정된 양성 클론이 다른 류마티스 질환 환자 유래의 생물학적 시료와 교차 반응성 이 있는지를 확인하기 위하여 다른 질환 환자의 생물학적 시료를 사용하여 동종 시험을 실시함으로써 SLE에만 특이성이 있는 클론을 확인하는 단계를 포함하며, 이에 따라 SLE에 특이적 관련성이 있는 진단학적 마커를 수득하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 인간 세포 주 또는 조직이 인간 폐암 세포 주, 고환 조직, 또는 신장 조직을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 시료가 인간의 혈청, 혈장 또는 혈액을 포함하는것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, SLE에 특이적 관련성이 있는 진단학적 마커가 PGM1, ADPRT, H2AFY, 및 U1snRNP 항원 또는 이에 대한 자가항체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 단독물 또는 2종 이상의 조합물인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 진단학적 마커가 ADPRT 항원 또는 이에 대한 자가항체인 것이 특징인 방법.
a) 인간 피검체로부터 생물학적 시료를 수집하는 단계;

b) 제1항의 방법에 따라 동정된 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGM1), ADP 라이보실 전달효소(ADPRT), H2A 히스톤 단백질(H2AFY), 및 U1소핵 라이보핵산단백질(U1snRNP)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 발현하는 플라크를 함유하는 막과 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계;

c) 상기 막에 존재하는 플라크로부터 발현되는 1종 이상의 단백질과 상기 생물학적 시료 사이에 형성된 상기 단백질과 이에 대한 자가항체의 면역 복합체를 검출하여 인간 피검체 중의 SLE의 존재를 예측하는 단계를 포함하여, 인간 피검체의 SLE 증상 여부 또는 SLE의 진행 가능성을 측정, 모니터 및/또는 진단하는 방법.
제6항에 있어서, 막이 니트로셀룰로스, 나일론 및 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 생물학적 시료가 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
제8항에 있어서, ADPRT를 발현하는 플라크를 포함하는 막이 인간의 혈청과 반응되는 것이 특징인 방법.
제8항에 있어서, ADPRT 와 U1snRNP를 각각 발현하는 플라크를 포함하는 막이 인간의 혈청과 반응되는 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 플라크는 ADPRT 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포의 클론인 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 플라크는 ADPRT와 U1snRNP 유전자 서열을 각각 포함하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포의 클론인 것이 특징인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 자가항체가 ADPRT 자가항체인 것이 특징인 방법.