KR20030039981A - 동충하초의 코르디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동충하초 중 하나인 코르디셉스 속 (Cerodyceps genus) 균의 자실체로부터 분리된 코르디세핀(Cordycepin)을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관한 것이다.

Description

동충하초의 코르디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물{A composition for preventing formation of thrombosis containing Cordycepin isolated from Cordyceps genus}

본 발명은 동충하초 중 하나인 코르디셉스 속(Cerodyceps genus) 균의 자실체로부터 분리된 코르디세핀(Cordycepin)을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관한 것이다.

코르디셉스 속(Cordyceps genus) 균은 동충하초의 일종으로, 겨울철에는 곤충 내에 있다가, 여름에는 충체를 기주로 자실체를 형성하는 버섯이며, 자낭균강의 맥각균목 동충하초과에 속한다^1-2). 동충하초균은 한국을 비롯하여 일본, 중국 등에 널리 분포하고, 토양 어디서나 살 수 있으며, 실과 같은 나선형의 자낭포자를 형성한다. 이 균은 대표적으로 벌, 개미, 잠자리 나비, 매미, 노린제, 딱정벌레, 파리 및 거미 등의 곤충에 기생하며, 이들의 알, 유충, 번데기 및 성충 등에 침입하여 숙주를 죽인 후, 자실체를 형성한다.

전 세계적으로 자실체를 형성하는 동충하초로는 약 300 여종이 보고되어 있다. 이 중, 코르디셉스 속 균, 특히 코르디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)는 오래 전부터 중국에서 성인병 치료제, 정력 강장제 등의 한약재로 사용되어 왔으며³⁾, 1950년 컨닝햄(Cuningham) 등은 코르디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)의 약효성분으로 코르디세핀을 분리하였다⁴⁾.

코르디세핀 성분은 뉴클레오사이드(nucleoside)의 대사산물로 동충하초의 주요 생리활성 성분이다. 이의 생물학적 작용으로는, DNA와 RNA의 합성을 억제, 세포 분화의 강화⁶⁾, 세포의 사이토스켈레톤 분포(cytoskeleton distrbution)에 관여^7-8), 단백질 키나아제(kinase) 활성 억제⁹⁾, 방광암, 폐암, 결장암 및 섬유암(fibrosarcoma)의 억제작용¹⁰⁾, 면역증강, 항균작용^11-12)및 핵산의 메틸화(methylation) 억제작용¹³⁾등이 알려져 있다. 한편, 코르디셉핀은 3'-디옥시아데노신(3-deoxyadenosine)의 정식명칭을 갖는 분자로 그 구조가 밝혀졌으며, 그의 화학구조는 도 1에서 보는 바와 같다¹⁴⁾.

한편, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색 등의 뇌혈관 질환 및 심장질환 등의 순환기계 질환은 사망원인 1, 2위를 차지(2000년도 통계청 자료)하고 있는 성인병이다. 이러한 성인병은 현대사회로 발전하면서 식생활 양식의 변화 및 내외부적인 환경 스트레스로 인해 중장년층에서 빈번하게 발생하고 있다. 이들 질환의주요 발병원인으로는 혈전(thrombus)으로 알려져 있으며, 혈전은 과잉 혈소판 응집에 의해 매개되는 병리현상으로 인식되고 있다^15-17).

한편, 혈소판은 혈관 손상시 콜라겐(collagen), 트롬빈(thrombin), ADP 등과 같은 각종 작용물질(agonists)의 자극에 의해 활성화되어 점착반응(adhesion), 방출반응(secretion) 및 응집반응(aggregation)을 일으킨다^20-21). 이러한 반응들은 지혈(hemostasis)에 관련되어 있지만, 혈전증(thrombosis) 등을 포함하는 순환계 질환의 발병에 중요한 역할을 수행한다.

종래에 보고된 바에 의하면, 혈소판에 콜라겐, 트롬빈, ADP 및 아드레날린(adrenaline) 등의 자극²²⁾이 가해지면, 혈소판 막 내에 존재하는 인지질 분해효소로서 포스포리파아제 C(phospholipase C)가 활성화되고^23-25), 이로 인해 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; PIP₂)가 분해되어, 그 결과로 디아실글리세롤(diacylglycerol; DG)과 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(inositol-1,4,5-trisphosphate; IP₃)가 생성된다^26-27). 이때 생성된 DG는 단백질 키나아제 C(C-kinase)를 활성화시켜, 40KDa 단백질의 인산화와, DG-리파아제 및 MG-리파아제의 활성화에 의한 아라키돈산(arachidonic acid)의 세포질로의 방출을 유도한다. 방출된 아라키돈산(20:4)은 사이클로옥시게나아제에 의해 PGG₂(prostaglandin endoperoxides prostaglandin G₂)/PGH₂(prostaglandinendoperoxides prostaglandin H₂)로 전환되며, 이로부터 트롬복산 A₂(TXA₂)가 생성된다^22,28-29). 이들 트롬복산은 혈액응고, 혈소판 응집 및 혈전형성 등에 중요하게 관여한다.

한편, IP₃는 혈소판 내의 Ca²⁺저장소인 ER에 존재하는 IP₃-수용체에 작용하여 Ca²⁺을 세포질로 동원시킨다^21,23-25). 동원된 Ca²⁺은 칼모듈린(calmodulin)과 결합하여 미오신 작은쇄 키나아제(myosin light chain kinase)의 일종인 Ca²⁺/칼모듈린-의존 단백질 키나아제의 활성을 촉진시켜, 20KDa 단백질을 인산화시킨다. 그 결과로, 혈소판의 응집과 함께, 농과립(dense body) 및 α-과립(granule)에 함유되어 있던 세로토닌(serotonin), ATP, ADP, 혈액응고 인자들, PDGF(platelet derived growth factor)의 분비, TGF-β(transforming growth factor beta)의 분비, PF-4(platelet factor-4) 및 피브리노겐(fibrinogen)의 분비가 유도된다^18-19,30-32). 이 중, PDGF는 동맥경화 등의 죽종(atheroma) 형성의 주요 원인이 되며, TGF-β는 암의 전이 증식인자로서 기능을 한다. 또한, 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)은 중추신경계의 신경전달물질, 심혈관계 및 위장간계의 평활근 작용, 혈소판 응집 촉진 작용 및 혈전형성의 조절자로서 다양한 생리작용을 도모한다.

한편, 혈소판에는 세로토닌 합성효소가 없기 때문에, 장크롬친화성 세포에서 합성된 세로토닌이 혈류에 의해 운반되어, 혈소판 내로 능동 수송을 통해 흡수된다음, 밀집체 내부에 저장된다. 그 후 특정한 자극에 의해 혈소판이 활성화되어, 저장된 세로토닌이 방출된다^33-36).

방출된 세로토닌은 TXA₂와 함께 혈소판의 응집 반응을 촉진시킴으로써 혈전을 유발하는데 주요 역할을 담당하며, 편두통을 유발하기도 한다^37-40). 이외에도, 세로토닌 외 혈전을 유발하는 하는 매개자로서 ADP, ATP, 각종 혈액응고 인자 등도 알려져 있다.

한편, 혈소판 응집반응과 더불어 각종 분비반응을 억제시킬 수 있는 물질은 혈전, 동맥경화, 편두통, 암 등의 예방을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 세포질 내부의 Ca²⁺농도 상승은 혈소판의 응집과 분비반응에 밀접하게 관련되어 있다^41-47). 또한, 세포의 Ca²⁺이동은 '세포질 내의 Ca²⁺이동'과, '세포 외부에 존재하고 있는 Ca²⁺의 이동'으로 이루어진다^41-47). 자극이 없는 상태의 혈소판에서는, 세포질 내에 약 0.1 μM(100 nM) 정도의 자유 Ca²⁺이 존재하고, 세포 외부의 Ca²⁺농도는 약 1mM이며, 세포 내 소기관들 중 Ca²⁺의 저장소인 ER 내부의 Ca²⁺농도는 약 10 mM정도이다. 이때, 세포에 자극이 가해지면, Ca²⁺은 세포막에 존재하는 Ca²⁺채널(channel)들 및 ER에 존재하는 IP₃-수용체 Ca²⁺채널과 리아노딘-수용체 Ca²⁺채널을 통해 세포질로 이동하게 된다. 한편, 자극되지 않은 혈소판의 세포질 내 Ca²⁺농도는 세포 외부에 비해서 약 10,000배정도 낮기 때문에 세포질 내의 높은 Ca²⁺농도는 세포에 치명상을 입힐 수 있다. 따라서, 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가는 빠른 시간 내에 정상 수준으로 회복되어야 한다. 이런 항상성을 유지하기 위해서, 증가된 세포질 내 Ca²⁺은 Ca²⁺수용과 제거 경로를 통해서 세포질로부터 제거된다. 즉, Ca²⁺수용은 세포질 내 ER에 있는 Ca²⁺-ATPase(Ca²⁺-펌프)를 통해서, Ca²⁺제거는 세포막에 존재하는 Na⁺/Ca²⁺안티포트(antiport)와 Ca²⁺-ATPase에 의해 진행된다^41-48).

한편, 콜라겐, ADP, 트롬빈 등과 같은 작용물질이 혈소판을 자극할 경우에는, 세포질 내 Ca²⁺농도는 수초 내에 10배정도 증가하게 된다⁴⁹⁾. 이러한 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가는 혈소판의 응집 및 방출반응 등과 같은 일련의 반응에 관여하게 된다^45.46). 따라서, 콜라겐, ADP, 트롬빈 등의 자극에 의한 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가를 억제할 수 있는 물질은 혈소판 응집뿐만 아니라 혈소판으로부터 각종 혈전형성에 관여된 매개물질들의 방출을 억제할 수 있으므로, 이러한 물질은 항혈전 물질로서 유용하게 이용될 수 있다.

한편, cAMP와 cGMP 등의 사이클릭(cyclic) 뉴클레오타이드는 혈소판 내부의 Ca²⁺농도를 감소시키는 기능을 가지며^50-52), TXA₂의 생성과 ADP 방출 억제에도 관여하여 혈소판응집 억제 작용을 하는 이차신호전달물질(second messengers)이므로, 항혈전 및 혈소판 응집 억제제(즉, 항혈소판제)로서 유용하게 이용될 수 있다.

지금까지 개발된 항혈소판제로는 데오필린(theopylline), 몰시도민(molsidomine), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine) 등이 있으며, 이들은 cAMP와 cGMP의 생성을 촉진하여 Ca²⁺의 동원을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 아스피린, 이미다졸, 인도메타신 등의 비스테로이드계 화합물들은 TXA₂의 생성을 저해함으로써 항혈소판 작용을 가지는 약물들로 알려져 있다. 그러나, 상기 언급한 약물들은 의약품이긴 하지만 인체에 지혈과다억제, 불임, 소화기 장애 등의 여러 부작용을 야기하는 문제점이 있다.

혈전(thrombus) 형성으로 유발되는 순환기계 질환(뇌혈전, 심혈전, 동맥경화증, 기타)은 수없이 많고, 이들 질환의 주요 원인인 혈전(thrombus) 형성은 혈소판 응집반응 및 방출반응이 주요 역할을 매개한다. 즉, 혈소판은 혈관이 손상되었을 때에 각종 작용물질(agonists)의 자극에 의해 활성화되어 점착반응, 방출반응 및 응집반응을 일으키며, 이때 각종 혈액응고인자와 혈소판 활성화인자 및 세포증식인자들을 방출하게 되는데, 이 과정은 지혈(hemostasis)뿐만 아니라 혈전증(thrombosis) 등을 포함하는 순환계 질환에 중요한 역할을 한다.

따라서, 혈소판 응집반응, 방출반응 및 혈액응고 반응을 억제시킬수 있는 물질은 상기 혈전형성을 수반하는 질환들의 예방과 치료에 대한 해결책이라 할 수 있다. 그러나, 현재 개발된 많은 항혈소판 제제, 항응고제, 혈전용해제는 모두 정제된 화학 물질로 인체에 미치는 여러 부작용이 문제시되고 있다. 따라서, 천연물에서 기능성 물질을 찾아서 개발하고자 하는 연구가 당업계에서 수행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 없는 천연물질로서, 항혈전 작용을 하는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 동충하초의 속균인 코르디셉스 속의 균들이 생산하는 코르디세핀를 유효성분으로 함유하는 조성물이 항혈전 효과가 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 코르디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물에 관한 것이다.

도 1은 코르디세핀(Cordycepin)의 화학 구조식을 나타낸 도면이다.

도 2는 코르디세핀이 콜라겐에 의해 유도된 사람 혈소판 응집을 억제함을 보여주는 도면이다(도 1에서, A는 콜라겐만을 처리한 것, B는 콜라겐과 50μM의 코르디세핀을 처리한 것, C는 콜라겐과 100μM의 코르디세핀을 처리한 것, D는 콜라겐과 500μM의 코르디세핀을 처리한 것의 결과이다.).

도 3은 콜라겐에 의해 유도된 사람 혈소판 응집에 대한 코르디세핀, 몰시도민(Molsidomine) 및 데오필린(Theophylline)의 억제효과를 비교한 도면이다(도 3에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 유도한 것이며, a는 콜라겐 단독처리를, b는 콜라겐 및 500μM의 코르디세핀의 처리를, c는 콜라겐 및 몰시도민의 처리를, d는 콜라겐 및 데오필린의 처리를 나타낸 도면이다.).

도 4는 코르디세핀과, 몰시도민(Molsidomine) 또는 데오필린(Theophylline)이 동시에 작용하였을 때, 상승작용에 의해 콜라겐에 의한 혈소판 응집이 억제됨을보여주는 도면이다(도 3에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 수행한 것이며, a는 콜라겐 단독처리를, b는 콜라겐, 코르디세핀 및 몰시도민의 처리를, c는 콜라겐, 코르디세핀 및 데오필린의 처리를 나타낸다.).

도 5는 탑시가르긴(Thapsigargin)에 의해 유도된 사람 혈소판 응집 반응을 코르디세핀이 억제함을 보여주는 도면이다(도 5에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 수행한 것이며, a는 탑시가르긴만을 처리한 것이고, b는 탑시가르긴 및 500μM의 코르디세핀을 동시 처리한 것을 나타낸다.).

도 6은 탑시가르긴에 의해 유도된 사람 혈소판 응집 진행 중에, 코르디세핀을 처리하면, 진행되던 혈소판 응집반응이 억제됨을 보여주는 도면이다(도 6에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 수행한 것이며, a는 탑시가르긴만을 처리한 것이고, b는 탑시가르긴 및 500μM의 코르디세핀을 처리한 것을 나타낸다.).

도 7는 콜라겐에 의해 유도된 사람 혈소판 응집반응에 대한 LY-83583 및 코르디세핀의 영향을 보여주는 도면이다(도 9에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 수행한 것이며, a는 콜라겐만을, b는 LY-83583 및 콜라겐를, c는 LY-83583, 콜라겐 및 코르디세핀을 처리한 결과를나타낸다.).

도 8은 LY-83583 및 코르디세핀을 처리한 후에, 콜라겐에 의해 혈소판 응집반응을 유도했을 때, 혈소판 응집 반응이 억제됨을 보여주는 도면이다(도 9에서, A는 1mM의 CaCl₂의 존재하에서, B는 2mM의 CaCl₂의 존재하에서 혈소판 응집반응을 수행한 것이며, a는 콜라겐만을, b는 LY-83583 및 콜라겐을, c는 LY-83583, 콜라겐 및 코르디세핀을 처리한 결과를 나타낸다.).

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명에 따른 항혈전제 조성물은 유효성분으로 동충하초의 속균인 코르디셉스 속의 균들이 생산하는 코르디세핀를 함유함을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항혈전제 조성물에서 유효성분인 코르디세핀의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 코르디세핀을 10∼1,000μM의 생체내 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

코르디세핀을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해 혈전에 의해 원인이 되거나 혈전형성을 수반하는 각종 질환들, 바람직하게는 순환기계 질환들의 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의하면, 동충하초의 속균인 코르디셉스 밀리타리스의 자실체(fruit body) 및 균사체(hypha)를 물로 추출하여 얻은, 코르디세핀을 함유하는 물추출물은 트롬빈 및 콜라겐에 의해 유인된 혈소판에서의 세로토닌 방출을 억제한다. 종래에 보고된 바에 의하면, 세로토닌은 혈소판이 트롬빈 또는 콜라겐 등의 외부자극에 의해 자극될 때, 혈소판 내의 α-과립(granules)으로부터 방출되는 물질로서, 혈소판으로부터 방출된 세로토닌은 순환기계에서 혈전을 형성하는 중요인자일 뿐만 아니라 편두통 유발의 주요 인자이다. 본 발명의 코르디셉스 밀리타리스 자실체(fruit body) 및 균사체(hypha)의 물추출물은 트롬빈 및 콜라겐의 자극에 의한 세로토닌 방출을 막을 수 있으며, 이러한 사실은 이들 물추출물이 항혈전제 및 항편두통제로서 이용될 수 있다는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에서는 상기 코르디셉스 밀리타리스 물추출물 중에 함유하고 있는 코르디세핀이 콜라겐에 의해 유인된 혈소판 응집을 농도 의존적으로 강력하게 억제함을 발견하였다.

마찬가지로, 세포외 칼슘 이온의 농도는 세포내 칼슘 농도에 중요하게 관여한다⁴⁸⁾고 알려져 있어 생체내 환경과 동일하게 외부 Ca²⁺의 환경을 조성하기 위하여, 혈소판 세포 외부의 Ca²⁺농도를 1mM Ca²⁺농도의 반응계를 조성하거나, Ca²⁺에 의한 혈소판 응집을 더욱 촉진시키기 위하여 2mM Ca²⁺농도의 반응계를 조성한 후, 콜라겐에 의해 유인되는 혈소판 응집을 수행한 결과에서도, 코르디세핀은 강력한 혈소판 응집억제반응을 나타내었다. 혈소판 응집반응이 혈전 형성을 촉진하므로, 상기 코르디세핀의 혈소판 응집 억제작용은, 코르디세핀을 함유하는 조성물이 항혈전제 조성물로서 이용될 수 있다는 것을 뒷받침한다.

한편, 콜라겐 등으로 혈소판을 자극하면, 세포질 내 Ca²⁺농도가 증가하게 된다. Ca²⁺은 세포의 생리학적 변화 및 생화학적 변화에 중요하게 관여하는 이차 신호전달물질 중의 하나로서, 종래에 보고된 바에 의하면, 이러한 혈소판의 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가는 혈소판 응집, 혈전형성 및 혈전형성에 관련된 각종 매개자의 방출반응을 매개한다고 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 코르디세핀은 이러한 콜라겐에 의해 유인된 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가를 억제할 수 있다. 이러한 사실은 코르디세핀을 함유하는 조성물이 항혈전제 조성물로서 이용될 수 있다는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에 따르면, ER의 Ca²⁺-ATPase의 활성을 특이적으로 억제하면서리아노딘 수용체(ryanodine receptor) Ca²⁺-채널(channel)을 통해 Ca²⁺의 분비를 촉진하는 기능을 가진 것으로 알려진 탑시가르긴(thapsigargin)에 의해 혈소판 응집반응을 유도한 후, 코르디세핀을 처리하면, 혈소판 응집반응이 현저하게 억제된다. 이는, 코르디세핀이 Ca²⁺-ATPase 활성화에 관여하여 세포질 내의 Ca²⁺을 ER 내부로 유입시켜 혈소판 내부의 유리(free) 상태의 Ca²⁺농도를 저하시키는 작용에 관여할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.

또한, 탑시가르긴이 췌장 소엽 세포(pancreatic acinar cells)에서 Ca²⁺-ATPase를 억제하면서 ER막의 GC(guanylate cyclase)을 활성화시켜, cGMP의 생성을 촉진한다는 연구 ⁵³⁾ 보고가 있으므로, 본 발명의 코르디세핀도 이러한 작용을 억제할 수 있다.

본 발명에 의하면, 코르디세핀은 GC 활성 억제제인 LY-83583⁵⁴⁾에 의한 혈소판 응집촉진에 대해서도 억제작용을 나타낸다. 이러한 결과는, 코르디세핀이 cGMP의 생성에도 관여하여 혈소판 응집을 억제할 수 있음을 의미한다. 즉, 종래에 보고된 바에 의하면, 콜라겐 등의 외부자극에 의해서 혈소판이 활성화되면, 구아닐레이트 사이클라아제(GC) 및 아데닐레이트 사이클라아제의 활성이 억제되어, 세포질 내 cAMP 및 cGMP의 생성량이 감소하게 되고, 이로 인해 세포질 내 Ca²⁺의 농도가 증가되어 혈소판 응집반응이 촉진된다. 즉, 혈소판 응집에 따른 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가는 cAMP/cGMP-상승제에 의해 저해될 수 있는데, 특히 cGMP-상승제인 니트로프루사이드(nitroprusside), 내피유도 이완인자(endothelium-derived relaxing factor) 등의 니트로바소딜레이터의 경우, 혈소판에 작용하는 작용물질에 의한 ER로부터의 Ca²⁺동원을 억제시킨다는 보고⁵²⁾가 있다.

한편, 본 발명에 의하면, 코르디세핀은 종래에 항혈전 작용제로서 공지된 몰시도민(Molsidomine), 데오필린(Theophylline) 또는 이들의 조합과 함께 사용하였을 때, 혈소판 응집효과의 억제작용에 상승작용을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 코르디세핀 외에, 다른 유효성분으로 몰시도민, 데오필린 또는 이들의 조합을 약 1∼100μM의 양으로 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여, 더욱 구체적으로 설명하지만, 이에 의해서 본 발명이 국한되지 않고, 당업자에 의해서 실시될 수 있는 통상적인 변형, 즉 부가, 삽입, 치환 등도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 것이다.

본 발명에서 코르디세핀이 혈소판 응집반응을 억제할 수 있다는 것만을 보여주었지만, 혈소판 응집반응 억제효과가 항혈전 작용과 밀접한 관련성이 있으므로, 코르디세핀이 항혈전 작용제로 이용될 수 있다는 것도 당업자는 자명하게 인식할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은, 항혈전에 관련된 질환의 치료에 이용될 수 있으며, 그러한 질환의 예를 들면, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색 등이 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[참고 실시예 1] 물질

1. 코르디세핀(코르디셉스 미리타리스로부터 분리, C ₁₀ H ₁₃ N ₅ O ₃ , FW 251.2)

동충하초의 주요 생리활성 성분으로 알려진 코로디세핀은 단일 정제 화합물로서 시그마화학주식회사(Sigma Chemical Co.)로부터 구입한 것을 사용하였으며, 사용시의 코르디세핀은 에탄올로 용해하여 재구성하여 이용하였다. 한편, 저장시에는 5mM 저장용액으로서 38%의 에탄올에 용해하여 재구성한 형태로 저장하였으며, 이후의 실험에서 적당하게 희석하여 사용하였다.

2. 탑시가르긴(Thapsigargin; C ₃₄ H ₅₀ O ₁₂ , FW 650.8)

세포질내 ER의 Ca²⁺-ATPase 억제제 및 IP₃-의존 세포내 칼슘 방출제로 알려진 세포-투과성 탑시가르긴은 시그마화학주식회사로부터 구입한 것을 사용하였다. 저장시에는 0.04% 에탄올에 용해시켜 100μM 농도의 저장용액으로 저장하였으며, 이후의 실험에서 적당하게 희석하여 사용하였다.

3. 몰시도민(Molsidomine; C ₉ H ₁₄ N ₄ O ₄ , FW 242.2) 및 데오필린(Theopylline; C ₇ H ₈ N ₄ O ₂ , FW 180.2)

cAMP 및 cGMP의 생성을 촉진하여 세포질 내 Ca²⁺농도를 감소시킴으로써 혈전형성을 억제하는 것으로 알려진 몰시도민 및 데오필린은 시그마화학주식회사로부터 구입한 것을 사용하였다. 저장시에는 0.5% 에탄올에 용해시켜 500 μM 농도의 저장용액으로 저장하였으며, 이후의 실험에서는 적당하게 희석하여 사용하였다.

4. LY-83583(6-Anilinoquinoline-5,8-quinone; C ₁₅ H ₁₀ N ₂ O ₂ , FW 250.3)

구아닐레이트 사이클라아제(gualnylate cyclase)를 억제하여 cGMP의 생성량을 감소시키는 것을 알려진 LY-83583은 바이올 연구실(Biomol Research Lab.)로부터 구입하였으며, 0.7% DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시켜 100 μM 농도의 저장용액으로서 저장하였고, 이후의 실험에서는 적당하게 희석하여 사용하였다.

5. Fura2/AM

세포질내 Ca²⁺측정용 세포 투과성 형광 프로브인 Fura2/AM은 시그마화학주식회사로부터 구입하였으며, DMSO에 용해시켜 20mM 농도의 저장용액으로서 저장하고, 통상적으로 사용되는 농도로 희석하여 이후의 실험에 사용하였다. Fura2/AM을 처리한 후, 형광광도는 본래 340/380㎚의 여기파장, 510㎚의 방출파장에서 측정하지만, 본 실험들에서는 340㎚의 여기파장 및 510㎚의 방출파장에서 측정하여, 세포질 내 Ca²⁺의 농도를 측정하였다.

[참고 실시예 2] 코르디셉스 밀리타리스로부터 추출한 물추출물 중에 함유된 코르디세핀의 함량 측정

코르디세핀을 측정하기 위한 코리디셉스 밀리타리스의 동충하초는 (주) 고려식료(경남 김해시 추춘면 원지리 1066번지)로부터 구입한 것을 이용하였으며, 중국산 동충하초는 중국 현지에서 시판되고 있는 것을 구입하여 하기의 실험에 이용하였다.

코르디셉스 밀리타리스의 자실체(fruit body) 100g 또는 균사체(hypha) 100g을 혼합기(Mixer 4-8-5241, 한일전기)로 분쇄한 후, 증류수 1ℓ를 첨가하고, 70∼80℃에서 2시간씩 3번 반복 중탕·교반한 다음, 원심(6000rpm, 20 min, 20℃)하여 얻은 상층액을 여과지(Advantec No. 2)로 여과하였다. 그런 다음, 여과액을 40℃에서 농축한 후, 동결건조시켜 코르디셉스 밀리타리스 자실체 또는 균사체 물추출물을 제조하였다.

상기 자실체 또는 균사체의 물추출물에 함유된 코르디세핀의 함량은, N. M. Kredich and A. J. Guarino (1960), Biochim. Biophys. Acta, 41, 363-365에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 즉, 상기 자실체 또는 균사체의 물추출물 40 ㎍에, 폴리사카리드들에 존재하는 포도당, 리보오스, 프룩토오스의 등의 정성분석에 사용하는 시약으로서, 사카리드와 반응하여 청녹색(blue-green)을 나타내는 시약으로 안트론 시약(anthrone reagent) 40㎕을 첨가하고, 100℃ 끓는 물에서 10분간 반응시킨 후, 냉각하고, 260㎚에서 흡광도를 측정하여, 물추출물 내의 코르디세핀 함량을 측정하였다. 이때, 표준용액으로는 1㎎/㎖의 코르디세핀(Sigma Chemical Co.)을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	균사	자실체	중국산
코르디세핀(단위: ㎍/㎎)	166.4±12.1	78.7±9.1	29.0±4.7
* 상기 코르디세핀의 양은 각 부위를 물로 추출한 후 분리하여 측정한 양임.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 균사 및 자실체의 물추출물에는 중국산에 비하여 국산 동충하초에서 코르디세핀을 더 많은 양으로 함유하고 있음을 확인하였다.

[참고 실시예 3] 농축된 사람 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 제조

본 실험에 사용한 PRP(Platelet-Rich Plasma)는 경상남도 적십자 혈액원으로부터 구입하였으며, 1,000rpm로 25℃에서 15분 동안 원심분리하여, 미처 분리되지 않은 적혈구를 침전시켜, 순수한 PRP을 얻어내었다. 이를 다시 3,000rpm로 25℃에서 10분 동안 원심하여, 상기 얻어낸 'PRP를 혈소판이 없는 혈장(Platelet-Poor Plasma; PPP)' 및 '혈소판(platelets; PLTs)'으로 분리하였다. 그런 다음, 다음과 같은 방법에 의해서 농축된 PRP를 제조하였다. 즉, 적당량의 상층 PPP로 PLTs을 현탁한 후, UV/가시 분광기의 660㎚에서의 흡광도 측정값을 이용하여, 여분의 PPP로 더 희석하여 5×10⁸혈소판/㎖을 함유한 농축된 PRP를 제조하였다. 이때, 660㎚에서 OD값이 1.1이면, 1×10⁸개의 PLTs를 의미한다.

[참고 실시예 4] 세척된 사람 혈소판 현탁액의 제조

본 실험에 사용된 세척 완충액은 129mM NaCl, 10.9mM Na·시트르산 디하이드레이트, 8.9 mM NaHCO₃, 1㎎/㎖ 포도당, 10mM 트리스-히드록시메틸아미노 메탄, 2.8mM KCl, 0.8 mMKH₂PO₄, 2mM EDTA이 함유된 pH 6.5의 완충액을 사용하였다. 또한, 본 실험에 사용된 현탁 완충액은 상기 세척 완충액 중 EDTA만을 첨가하지 않은 pH 6.9의 완충액을 사용하였다.

상기 참고 실시예 3과 동일한 방법에 의해서 PRP를 원심분리하여, PPP와 혈소판을 분리한 후, 상층의 PPP를 제거하였다. 그런 다음, PLTs에 적당량의 세척완충액으로 현탁한 후, 충분한 양의 세척 완충액를 더 첨가하고, 3,000rpm로 25℃에서 10분 동안 원심분리하여, 완충액층과 PLTs층을 분리하였다. 그런 다음, 하층의 PLTs을 현탁 완충액으로 재현탁한 후, 충분한 양의 현탁 완충액을 더 첨가하고, 3,000rpm로 25℃에서 10분 동안 원심분리하여, 다시 완충액층과 PLTs층을 분리하였다. 그런 다음, 하층의 PLTs에 현탁 완충액을 적당량 다시 첨가하여 사람 혈소판 현탁액을 제조하였다. 제조된 사람 혈소판은 상기 참고 실시예 3과 동일한 방법에 의해서 혈소판 수가 5×10⁸혈소판/㎖가 되도록 조정하였다.

[참고 실시예 5] Fura2/AM-로딩된 사람 혈소판의 제조

상기 참고 실시예 3과 동일한 방법에 의해서 PRP를 원심분리하여, PPP와 혈소판을 분리한 후, 상층의 PPP를 분리하였다. 그런 다음, 하층의 PLTs를 상기 분리한 PPP 20㎖로 현탁한 후, 최종농도가 5μM이 되도록 20mM의 Fura2-AM 5㎕을 더 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다. 그런 다음, 37℃에서 60분간 배양한 후, 3,000rpm로 25℃에서 10분동안 원심시켜 상층의 PPP층과 Fura2/AM이 로딩된 PLTs 하층을 분리했다. 그런 다음, 하층의 PLTs에 상기한 세척 완충액을 첨가하여 2회 세척 후, 현탁 완충액으로 PLTs 층을 현탁하였다. 상기한 방법과 동일한 방법에 의해서 혈소판 층의 세포수를 5×10⁸/㎖로 조정하였다. 반응액은 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 상태에서 Fura2/AM-로딩된 사람 혈소판을 제조하였다.

[참고 실시예 6] 세로토닌-로딩된 사람 혈소판의 제조

상기 참고 실시예 3과 동일한 방법에 의해서 PRP를 원심분리하여, PPP와 혈소판을 분리한 후, 상층의 PPP를 분리하였다. 그런 다음, 하층의 PLTs를 상기 분리한 PPP 40㎖로 현탁한 후, 최종농도 1μM이 되도록 세로토닌, 즉 5-[G-³H]트립타민 무수물(hydrous[G-³H]tryptamine)을 더 첨가하였다. 그런 다음, 1,100×g에서 10분 동안 원심분리하고, 하층의 PLTs에 세척완충액을 첨가하여 2회 세척한 후, 현탁 완충액으로 세포를 현탁하였다. 그런 다음, 상기와 동일한 방법에 의해서 혈소판 수를 측정하여, 혈소판이 5×10⁸세포수/㎖가 되도록 조정하였다.

[실시예 1] 사람 혈소판으로부터의 세로토닌 방출검사

상기 참고 실시예 6의 세로토인 로딩된 사람 혈소판에, 상기 참고 실시예 2에서 준비한 코르디셉스 밀리타리스의 자실체 또는 균사체의 물추출물을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서, 37℃에서 교반하면서 2분간안정화시킨 다음, 20㎍/㎖의 콜라겐 또는 2U/㎖의 트롬빈으로 5분 동안 자극하였다. 그런 다음, 반응액에 16.5% 포름알데히드를 첨가하여 반응을 정지시키고, 그 후 즉시 25℃에서 1,100×g로 10분간 원심하여 생긴 상층액 300㎕를 Scint A-XF(Packard) 10㎖가 함유된 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 첨가한 후, 액상 신틸레이션 측정기(liquid scintillation counter)로 cpm을 측정하였다. 세로토닌 방출은 Costa and Murphy의 방법에 따라 방출율(%)을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 2 내지 표 4에 나타내었다.

	세로토닌 방출(%)	억제율(%)
콜라겐 20㎍/㎖	25.1±1.4	0
코르디세핀(자실체내 함유량; ㎍/㎖)	12.5	12.6±0.5	49.8
	25	10.5±0.0	58.2
* 상기 결과들은 평균±S.D.(n=3)로서 나타낸 것이다.

	세로토닌 방출(%)	억제율(%)
대조군	189.3±42.9	-
트롬빈(2U/㎖)	5529.7±193.1	0
코르디세핀(균사체 내 함유량; ㎍/㎖)	50	2876.7±40.0	48.0
	100	2453.3±227.5	55.6
*상기 결과들은 평균±S.D.(n=3)로서 나타낸 것이다.

	세로토닌 방출(%)	억제율(%)
대조군	189.3±42.9	-
트롬빈(2U/㎖)	5529.3±193.2	0
코르디세핀(자실체 내 함유량; ㎍/㎖)	50	3716.3±135.1	32.8
	100	3094.7±132.5	44.0
* 상기 결과들은 평균±S.D.(n=3)로서 나타낸 것이다.

상기 표 2에서의 대조군은 20㎍/㎖의 콜라겐을 단독 처리하였을 때 유도되는 세로토닌의 방출량으로 하였으며, 표 3 및 표 4에서의 대조군은 2U/㎖의 트롬빈을 처리하였을 때의 세로토닌 방출량으로 하였다.

상기 표 2 내지 표 4에서 보는 바와 같이, 코르디세핀을 함유하고 있는 코르디셉스 밀리타리스의 동충하초로부터 분리한 자실체 및 균사체의 물추출물은, 콜라겐 및 트롬빈으로 혈소판을 자극하였을 때 유도되는 트롬빈의 방출을 현저하게 억제함을 알 수 있다.

종래에 보고된 바에 의하면, 트롬빈, 콜라겐 등에 의해 혈소판이 자극되면, 각종 혈소판 응집인자 및 세로토닌이 방출된다고 알려져 있으며, 혈소판으로부터방출된 세로토닌은 TXA₂와 함께 혈전형성, 동맥경화의 유발 등에 중요한 매개자로서 역할을 한다. 그 외에도, 세로토닌은 편두통 및 암 등의 발병에도 중요한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 표 2 내지 4의 결과에서 보는 바와 같이, 코르디세핀을 함유하고 있는 코르디셉스 밀리타리스 자실체 및 균사체의 물추출물은 트롬빈 및 콜라겐의 자극에 의한 혈소판의 트롬빈 분비를 현저하게 억제할 수 있기 때문에, 항혈전제 및 항 편두통 약제로서 기능할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 콜라겐에 의한 혈소판 응집에 대한 코르디세핀의 억제효과

상기 참고 실시예 3에서 준비된 농축 PRP을 이용하여 코르디세핀의 혈소판 응집 억제효과를 다음과 같은 방법에 의해서 검사하였다.

우선, 농축된 PRP으로 500㎕의In vitro반응계를 조성하였다. 농축된 PRP를 37℃에서 3분 동안 안정화시킨 후, 자극제인 콜라겐(Chrono-Log.)을 10㎍/㎖의 농도로 처리하여 5분간 응집반응을 유도하였다. 이를 대조군으로 사용하였다. 한편, 상기와 동일한 반응계에 50, 100 또는 500 μM 농도의 코르디세핀을 처리하고, 3분 동안 반응시킨 후, 상기와 동일한 방법에 의해서 콜라겐으로 5분간 자극하여 응집을 유도한 후 응집된 혈소판을 측정하였다.

혈소판 응집은, 37℃에서 AGGREGOMETER(Chrono-Log Co.)를 이용하여 빛 투과도(light transmission) 변화로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 도 2에 나타내었다. 코르디세핀의 용매인 에탄올 또한 혈소판 응집억제 효과에 미약하지만, 영향이 있는 것으로 당업계에 보고되어 있다. 본 실험에서 에탄올은 콜라겐 자체의 측정값에 대하여 약 4% 정도의 혈소판 응집억제 작용이 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, 표 5의 응집 억제율은 이러한 에탄올의 영향을 에탄올 용매에 의한 영향을 빼준 값이다.

	응집(%)	억제(%)	도 2
콜라겐 (10 ㎍/㎖)	58.1	-	A
코르디세핀(μM)	50	48.1	17.2	B
	100	24.3	58.2	C
	500	5.6	90.4	D

[실험예 1] 세척된 PLTs에 대한 혈소판 응집 측정

상기 참고 실시예 4에서 준비된 세척된 PLTs를 이용하여 250㎕의In vitro반응계를 조성하고, 상기 반응계에 CaCl₂를 첨가하여 외부 Ca²⁺농도에 따른 코르디세핀의 혈소판 응집억제 작용을 검사하였다.

1mM 또는 2mM의 CaCl₂ 존재하에서 혈소판을 3분간 안정화시킨 후, 10㎍/㎖의 콜라겐으로 자극하여 혈소판 응집 유도하였고, 이를 대조군으로 하였다. 또한, 1mM 또는 2mM의 CaCl₂존재하에서 코르디세핀 등의 검사물질을 세척된 PLTs와 함께 첨가한 후, 상기와 동일한 방법에 의해서 콜라겐을 처리한 후, 혈소판 응집을 측정하였다.

혈소판 응집은, 37℃에서 AGGREGOMETER(Chrono-Log Co.)를 이용하여 빛 투과도(light transmission) 변화로 측정하였다.

[실시예 3] Ca ²⁺ 의존성 혈소판 응집에 대한 코르디세핀의 억제작용

Ca²⁺의존성 혈소판 응집에 대한 코르디세핀의 억제작용을 검사하기 위하여, 상기 검사물질로서 500μM의 코르디세핀, 10μM의 몰시도민 또는 10μM의 데오필린을 사용하여, 상기 실험예 1에 기재된 방법에 의하여 Ca²⁺의존성 혈소판 응집을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 도 3에 나타내었다. 하기 표 6의 측정값은 코르디세핀의 용매인 0.19% 에탄올에 의한 혈소판 응집 억제효과(CaCl₂1mM 및 2mM일 때, 콜라겐 단독처리에 대하여 각각 약 3%, 5%의 억제효과)를 배제한 것이다. 또한, 몰시도민 및 데오필린의 경우는 용매로서 0.01% 에탄올에 의한 혈소판 응집 억제효과(CaCl₂1mM 및 2mM일 때, 각각 2.5% 및 5%의 억제효과)를 배제하여 하기 표 6에 나타내었다.

	CaCl21 mM	CaCl22 mM
	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)	도 3
콜라겐(10 ㎍/㎖)	54.4	-	73.8	-	a
콜라겐+코르디세핀500 μM	21.9	59.7	29.7	59.8	b
콜라겐+몰시도민10 μM	48.8	10.1	70.0	5.1	c
콜라겐+데오필린10 μM	53.8	0.9	73.8	0	d

상기 표 6 및 도 3에서 보는 바와 같이, 혈소판 응집 반응은 세포 외부의 Ca²⁺농도에 의존하여 증가한다. 이는 외부 칼슘 농도가 높을수록 혈소판 응집반응이 더욱 촉진된다는 것을 의미한다.

코르디세핀은 이러한 Ca²⁺의존적으로 일어나는 콜라겐-유인 혈소판 응집 반응을 강하게 억제하였다. 또한, 코르디세핀은 1mM 및 2mM의 Ca²⁺농도에서 비슷한 정도의 혈소판 응집 억제효과를 나타냈으며, 이는 코르디세핀이 2mM의 반응계에서 더욱 현저한 혈소판 응집을 억제함을 나타낸다. 실제로, 본 명세서에는 나타내지는 않지만, 상기 실험을 반복하였을 때, CaCl₂2mM에서 혈소판 응집이 더욱 강하게 억제되었다. 이러한 결과로부터, 코르디세핀은 강력한 혈소판 응집 억제제로서 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 항혈전제로서 공지된 몰시도민과 데오필린을 각각 10μM 농도로 처리한 결과, 이들은 그다지 강력한 혈소판 응집 억제 작용을 갖지 못하였다.

[실시예 4] Ca ²⁺ 의존성 혈소판 응집 억제에 있어서, 코르디세핀의 상승효과

Ca²⁺의존성 혈소판 응집 억제에 대한 기존의 항혈전제와 코르디세핀과의 상승작용을 검사하기 위하여, 상기 검사물질로서 300μM의 코르디세핀과 몰시도민 10μM의 혼합물, 300μM의 코르디세핀과 10μM의 데오필린의 혼합물을 사용하여, 상기 실험예 1에 기재된 방법에 의하여 Ca²⁺의존성 혈소판 응집을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 7 및 도 4에 나타내었다. 한편, 코르디세핀의 용매인 0.19% 에탄올과, 몰시도민 또는 데오필린의 용매인 0.01% 에탄올을 함께 첨가하여, 혈소판의응집억제 작용을 측정한 결과, 모두 약 3%의 억제효과가 관찰되었으며, 하기 표 7의응집율 및 억제율(%)은 이러한 에탄올 용매의 영향을 배제한 것이다.

	CaCl21 mM	CaCl22 mM
	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)	도 4
콜라겐 10㎍/㎖	54.4	-	73.8	-	a
콜라겐+코르디세핀 300 μM+몰시도민 10 μM	22.5	58.6	34.5	53.3	b
콜라겐+코르디세핀 300 μM+데오필린 10 μM	24.4	55.1	35.1	52.4	c

상기 표 7 및 도 4에서 보는 바와 같이, 300μM의 코르디세핀과 몰시도민 또는 데오필린을 동시처리하였을 때의 혈소판 응집 억제효과는 500μM의 코르디세핀을 단독처리하였을 때의 혈소판 응집 억제효과(약 60%, 도 6 참조)와 비슷하였다. 상기 표 6에서 몰시도민 및 데오필린이 거의 혈소판 응집 억제효과가 없으므로, 상기 표 7의 결과는 코르디세핀과 몰시도민 또는 데오필린의 동시처리는 혈소판 응집억제에 있어서 상승작용을 나타냄을 의미한다.

따라서, 항혈전 또는 혈소판 응집억제를 위하여 임상에서 코르디세핀을 적용할 때, 몰시도민 또는 데오필린 등의 기존의 항혈전제와 같이 사용하면 그 효과에 있어서 상승작용을 얻어낼 수 있다.

[실시예 5] 세포내 칼슘 이동에 대한 코르디세핀의 억제작용

상기 참고 실시예 5의 방법에 의해서 준비된 Fura2/AM-로딩된 사람 혈소판을 이용하여, 세포내 칼슘이동에 대한 코르디세핀의 억제작용을 다음과 같은 방법에 의해서 측정하였다.

즉, 참고 실시예 5의 방법에 의해서 준비된 Fura2/AM-로딩된 사람 혈소판에,1mM 또는 2mM의 CaCl₂존재하에서 검사물질로서 500μM의 코르디세핀, 10μM의 몰시도민 또는 10μM의 데오필린을 처리하고, 여기파장 340㎚, 방출파장 510㎚으로 셋팅하여 37℃에서 8분간 시간경과에 따른 측정(time drive)을 시행하였다. 이때, 검사물질 처리 후 3분되는 지점에서 10㎍/㎖의 콜라겐을 처리한 다음, Ca²⁺의 양을 모니터하였다. 세포질 내 Ca²⁺양([Ca²⁺]_c)은 혈소판 내에 로딩된 Fura2-AM의 형광지표 염색제의 형광변화를 SPF 25 fluorometer(Kontron)로 측정하여 얻었다. 대조군은 검사물질을 처리하지 않은 것으로 하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

[Ca²⁺]_c은 상대적 형광이므로, F_max와 F_min을 측정한 후, 이들 값과 Fura2-AM의 분해정수(K_d=224 nM)를 이용하여 혈소판 내부의 [Ca²⁺]_c을 계산하였다.

[Ca²⁺]_c= K_d×(F_o-F_min)/(F_max-F_o)

(여기에서, F_o는 자극 전의 형광도; F_min는 최소 형광도로서 CaCl₂를 첨가하지 않을 때의 형광도로서 10% 트리톤 X-100과 2M 트리스-300 mM EGTA만을 처리한 결과값; F_max는 최대 형광도로서 충분한 Ca²⁺을 첨가해 준 후, 10% 트리톤 X-100을 첨가한 다음의 측정값을 의미한다.)

한편, 코르디세핀의 용매인 0.19% 에탄올이 콜라겐에 의해 유도되는 세포질내 [Ca²⁺]_c에 미치는 영향은, 콜라겐 자체 측정값에 대하여 약 2nM 감소되었으며, 10μM의 몰시도민과 10μM의 데오필린의 용매로서 0.01% 에탄올은 약 20.7 nM 감소되는 것으로 측정하였다. 따라서, 하기 표 8의 값은 이들 용매의 영향을 배제하여 계산한 것이다.

기본, 63.3nM	[Ca2+]c,nM	억제율(%)
콜라겐(10 ㎍/㎖)	100.2	-
콜라겐+코르디세핀(500 μM)	72.5	27.6
콜라겐+몰시도민(10 μM)	104.5	0
콜라겐+데오필린(10 μM)	111.3	0

상기 표 8에서 보는 바와 같이, 콜라겐에 의해 기본 농도인 63.3nM에서 100.2nM로 증가된 세포질 내 Ca²⁺의 농도([Ca²⁺]_c)는 크르디세핀에 의해 72.5nM로 감소하였지만, 몰시도민 및 데오필린의 경우에는 오히려 세포질 내 칼슘 농도가 더욱 증가됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 코르디세핀이 몰시도민이나 데오필린보다도 세포질 내부로의 Ca²⁺이온의 유입을 억제하여 혈소판 응집 반응을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

[실시예 6] 탑시가르긴에 의해 유도되는 Ca ²⁺ 의존성 혈소판 응집 반응에 대한 코르디세핀의 억제효과(1)

탑시가르긴(Thapsigargin)은 혈소판 내부로 들어가서 ER막에 존재하는 Ca²⁺-ATPase의 활성을 억제하여 혈소판 자극시에 세포질에 증가하는 Ca²⁺이 ER로 유입되어 저장되어지는 것을 억제하는 기능을 가지고 있다. 이에, 본 실시예에서는 탑시가르긴이 혈소판 응집에 미치는 영향과 이에 대한 코르디세핀의 억제작용을 확인하고자 하였다.

검사방법으로는, 10㎍/㎖의 콜라겐 대신에 10μM의 탑시가르긴을 처리한 것과, 검사물질로는 500μM의 코르디세핀을 처리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법을 수행하였다. 혈소판 응집율 및 억제율의 계산을 위한 대조군으로는 상기 실험예 1에서와 같이 콜라겐 단독 처리에 의한 결과값으로 하였다. 그 결과는 하기 표 9 및 도 5에 나타내었다. 한편, 탑시가르긴의 용매인 0.004% 에탄올에 의한 혈소판 응집은 관찰되지 않았으며, 따라서, 표 9의 측정값은 코르디세핀의 용매인 0.19% 에탄올에 의한 혈소판 응집억제만을 배제한 것이다.

	CaCl21 mM	CaCl22 mM
	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)	도 5
탑시가르긴 10 μM	45.6	-	66.9	-	a
코르디세핀 500 μM+탑시가르긴 10 μM	1.25	97.3	5.0	92.5	b

상기 표 9에서 보는 바와 같이, 탑시가르긴은 혈소판 응집을 촉진시키는 기능을 갖고 있으며, 탑시가르긴에 의한 혈소판 응집은 코르디세핀의 처리로 인해 억제되었다. 이러한 결과는, 코르디세핀이 소포체에 존재하는 Ca²⁺-ATPase에 작용하여 세포질 내부의 Ca²⁺을 소포체 내부로 유입시킨 결과 세포질 내부의 Ca²⁺의 농도가감소된 것에 기인하고 있음을 의미한다.

[실시예 7] 탑시가르긴에 의해 유도되는 Ca ²⁺ 의존성 혈소판 응집 반응에 대한 코르디세핀의 억제효과(2)

상기 실험예 1과 동일하게 CaCl₂1mM과 2mM의 반응계를 조성하고, 10μM의 탑시가르긴을 첨가한 반응계에 어떤 것도 첨가하지 않고 8분간 혈소판 응집 반응을 상기 실시예 6과 동일한 방법에 의해 수행하였다. 또한, 이와 동일한 과정을 수행하면서, 탑시가르긴 처리 후 3분이 경과되는 지점에서 500μM의 코르디세핀을 첨가하고, 혈소판 응집을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10 및 도 6에 나타내었다. 하기 표 10의 측정값은 코르디세핀의 용매인 0.19% 에탄올의 영향을 배제한 것이다.

탑시가르긴 10 μM	CaCl21 mM	CaCl22 mM
	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)	도 6
3분 지점	46.3	-	58.8	-	a
5분 지점	51.9	-	63.1	-
8분 지점	55.0	-	65.6	-
3분 지점에서 500 μM의 코르디세핀 첨가	3.8	56.3	3.1	54.4	b

상기 표 10 및 도 6에서 보는 바와 같이, 반응 초기부터 일어나던 혈소판 응집은 500μM의 코르디세핀을 첨가하는 순간부터 응집이 억제된다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 코르디세핀이 소포체에 존재하는 Ca²⁺-ATPase에 작용하여 세포질 내 Ca²⁺의 양을 감소시킬 수 있다는 상기 실시예 6의 결과를 뒷받침한다.

[실시예 8] 콜라겐이 유도하는 혈소판 응집 반응에서 LY-83583과 코르디세핀의 영향

<실험 1>

LY-83583은 구아닐레이트 사이클라아제(guanylate cyclase) 활성 억제제로서 cGMP의 생성을 억제하는 물질이다. 이러한 LY-83583이 혈소판 응집반응에 있어서, 어떠한 기능을 하는지 확인하고자 하였다. 검사방법으로는, 검사물질로서 LY-83583을 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 실험을 수행하였다. 즉, 상기 실험예 1과 동일한 CaCl₂1mM과 2mM의 반응계를 조성한 후, 10μM의 LY-83583을 첨가한 다음, 10㎍/㎖의 콜라겐으로 자극하여 혈소판 응집 반응을 유도한 후, 혈소판 응집을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11 및 도 7에 나타내었다. 한편, LY-83583의 용매인 0.07% DMSO는 콜라겐 단독으로 처리한 것에 대하여 CaCl₂1mM일 때 약 10%의 혈소판 응집 억제효과를 갖고 있었고, CaCl₂2mM일 때에는 약 10%의 혈소판 응집 촉진효과를 갖고 있었다. 따라서, 표 11의 해당 측정값은 이들 용매의 영향을 배제한 것이다.

<실험 2>

한편, 검사물질로서 10μM의 LY-83583과 500μM의 코르디세핀을 함께 처리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법에 의해서 혈소판 응집을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 11 및 도 8에 나타내었다. 마찬가지로, 표 11의 해당 측정값은 LY-83853 및 코르디세핀의 용매로서 각각 0.07% DMSO와 0.19% 에탄올의 동시 처리에 의한 영향 (CaCl₂1 mM일 때 약 11%의 혈소판 응집 촉진효과; CaCl₂2mM일 때 약 0.7% 혈소판 응집 촉진효과)을 배제한 것이다.

<실험 3>

또한, 실험예 1과 동일하게 조성한 CaCl₂1mM과 CaCl₂2mM의 반응계에 10μM의 LY-83583을 혈소판과 함께 첨가하고, 3분이 경과된 후 500μM의 코르디세핀을 첨가하고, 다시 3분 후에 콜라겐(10 ㎍/㎖)으로 혈소판 응집 반응을 유도하고, 혈소판 응집 정도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 11 및 도 7에 나타내었다. 표 11의 측정값은 마찬가지로 LY-83583 및 코르디세핀 대신에 그의 용매만을 동일하게 처리하여 측정된 용매의 영향을 배제하였다.

	CaCl21 mM	CaCl22 mM
	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)	도 7
콜라겐 10㎍/㎖	45	-	63.8	-	a
콜라겐+LY-83583 10μM	60.0	-	62.5	-	b
콜라겐+LY-83583 10μM+코르디세핀 500μM	0	100	18.8	70.0	c
LY-83583 10μM+ 코르디세핀 500μM+ 콜라겐 10㎍/㎖	3.7	93.8	31.3	50.0	도 8

상기 표 11 및 도 7, 도 8의 결과에서 보는 바와 같이, 코르디세핀은 LY-83583에 의한 cGMP 생성의 억제를 다시 회복할 수 있으며, 이를 통해 Ca²⁺의 동원을 억제하여, 혈소판 응집 반응을 억제하는 것으로 볼 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 동충하초로부터 분리한 코르디세핀은 혈전형성, 특히 콜라겐에 의해 유발되는 혈전형성을 억제할 수 있음을 보여주었다. 또한, 본 발명에서는, 코르디세핀이 혈전형성에 중요한 역할을 수행하는 콜라겐 및 트롬빈에 의한 세로토닌의 분비를 억제할 수 있으며, 혈전형성에 관련된 신호전달 과정에서 매개자로서 역할을 수행하는 구아닐레이트 사이클라아제의 활성을 억제할 수 있다는 것도 보여주었으며, 혈전형성의 이차 신호전달 물질로서 칼슘 이온의 세포질내 증가도 억제할 수 있음을 보여주었다. 또한, 본 발명에서는 코르디세핀이 종래에 항혈전 물질로서 이용되었던 몰시도민 또는 데오필린과 함께 작용할 경우에 항혈전 효과가 상승작용이 있다는 것도 보여주었다.

따라서, 동충하초에서 생상되는 코르디세핀을 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 매우 항혈전 효과가 우수하며, 항혈전을 수반하는 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 뇌경색 등의 질환에 대하여 치료에 이용될 수 있다.

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Claims (7)

1. 혈전형성을 수반하는 질환을 갖는 환자에게 투여하기 위해, 유효성분으로 코르디세핀(cordycepin)을 함유함을 특징으로 하는 항혈전제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 코르디세핀은 체내에서 10∼1,000μM의 체내농도가 되도록 함유함을 특징으로 하는 항혈전제 조성물
3. 제 1항에 있어서, 몰시도민(molsidomine), 데오필린(theopylline) 또는 그들의 조합을 더 함유함을 특징으로 하는 항혈전제 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물의 항혈전제 작용은 혈소판 응집반응에 의해 매개됨을 특징으로 하는 항혈전제 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 콜라겐에 의해 유발된 혈소판 응집은 세로토닌 방출, 세포질 내 Ca²⁺농도의 증가, 구아닐레이트 사이클라아제의 활성억제 및 ER(endoplasmic reticulum) 내 Ca²⁺-ATPase의 활성화로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종 이상의 생화학반응에 의해 매개됨을 특징으로 하는 항혈전제 조성물.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈전형성을 수반하는 질환은 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항혈전제 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 혈전형성을 수반하는 질환은 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항혈전 조성물.