KR20030032976A - 보르데텔라 페르투시스 및 보르데텔라 파라페르투시스에대한 백신 제조용 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 페르투시스 또는 파라페르투시스에 대한 백신에 사용되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 페르탁틴으로부터 유래되는 것이다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 페르탁틴의 영역 1로부터 얻은 서열, 구체적으로 1 이상의 "GGFGP" 또는 "GGAVP" 반복부를 포함한다. 이와는 달리, 본 발명의 폴리펩티드는 영역 1 또는 영역 2의 일부 또는 전부가 결실된 페르탁틴 서열을 보유한다. 본 발명의 폴리펩티드는 인간 또는 수의학적 용도로 유용한 조성물에 혼입된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 페르탁틴 유래된 폴리펩티드에 대한 항체를 개시한다.
Description
통상적으로, 페르투시스("백일해")에 대한 백신은 비.페르투시스의 전 세포를 주성분으로 하는 것이다. 최근들어, 이러한 소위 "전세포 백신(whole cell vaccine)" 즉 "WCV" 이외에, 비.페르투시스로부터 유래된 특정 항원 예컨대, "페르탁틴(pertactin)"으로도 칭하여지는 비.페르투시스의 선모, 섬유상 적혈구 응집소, 페르투시스 독소 및/또는 표면 결합 단백질을 함유하는 백신이 개발되고 있다. 이러한 소위 "비세포성 백신(acellular vaccine)" 즉 "ACV"는 몇몇 국가에서 사용되고 있다.
비.페르투시스 페르탁틴 서열에 관하여는 공지되어 있다[그 중에서도 Charles외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 May;86(10):3554-8 및 이하 서열번호 6 참조]. 페르탁틴은 약 926개의 아미노산 잔기를 함유하는 69 kD의 단백질로서, X선 데이터를 통하여 단백질의 생물학적 활성과 관련된 서열 모티브를 함유하는 몇몇 돌출형 루프를 보유하는 나선형을 띠는 것으로 알려져 있다[Emsley외 다수, Nature(1996)381:90-92]. 이들은 숙주 조직에의 부착과 관련된 Arg-Gly-Asp(RGD) 트리펩티드 모티브(아미노산 260∼262)를 함유하는 루프와 주요 면역보호성 에피토프를 함유하는 카복시 말단에 인접한 (PQP)5모티브를 보유하는 루프를 포함한다[Charles외 다수, Eur. J. Immunol.(1991)21:1147-1153].
뿐만아니라, 페르탁틴은 전구체 즉, "prn"으로 불리워지는 유전자에 의하여 암호화되는 전구체로부터 형성되는 것으로 공지되어 있다. 이 유전자(도 1에 개략적으로 나타냄)는 2개의 영역 즉, "영역 1" 및 "영역 2"로 불리워지는 영역들을 포함한다[Mooi외 다수, Infect. Immun.(1998)66:670-675]. 이들중 영역 1은 RGD 모티브에 측접하고 다수의 GGxxP 반복부를 포함하는 반면에, 영역 2는 전술한 바와 같은 반복된 PQP 모티브를 포함한다.
WCV가 비.페르투시스 감염의 예방에 있어서 과거 매우 성공적으로 사용되어 왔으며 여전히 효과적임에도 불구하고, 페르투시스가 다시 나타날 수 있는 징후들은 서방 국가 즉, 페르투시스 백신화에 있어서 오랜 전통을 갖는 국가 예컨대, 미국, 네덜란드, 캐나다 및 오스트레일리아에서도 찾아볼 수 있다[Mooi외 다수, Infect. Immun.(1999)67:3133-3134]. 본 발명자들은 이미 이러한 현상에 대한 설명(구체적으로 페르탁틴에 대한 백신 균주 및 순환성 균주 사이의 항원 분화, )을 제시하였다.
이러한 설명을 지지하는데에 있어서, 본 발명자들은 또한 페르탁틴 전구체를 암호화하는prn유전자가 다형성이라는 사실을 밝혀냈다. 지금까지 9개 이하의 상이한 페르탁틴 유형들이 전 세계적으로 순환하는 비.페르투시스 균주에서 동정되었다. 또한 이들 페르탁틴 유형 사이의 변이가 주로 영역 1에 제한되어 있으며, 영역 1의 반복 단위인 GGxxP중에 결실 또는 삽입을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이에 관하여는 역시 Mooie외 다수(1989, 1999, 상동) ; 및 Mastrantonio 외 다수, Microbiology(1990)145:2069를 참조하시오.
비.페르투시스 이외에, 페르투시스의 약 1 ∼ 5%는 비.파라페르투시스(균주)에 의하여 유발된다. 그러나, 이러한 관점에서, 비.페르투시스 항원을 주성분으로 하는 ACV가 (원형 비.페르투시스 페르탁틴을 주성분으로 하는 ACV 포함) 비.파라페르투시스(균주)에 대하여 충분한 보호 효과를 제공할 수 없다는 증거가 있다. 예를 들어, 마우스 모델에서의 테스트 결과, 원형 비.페르투시스 페르탁틴에 의한 면역화는 비.파라페르투시스에 대한 보호 효과를 제공하지 않는다는 사실을 알 수 있다[Khelef외 다수, Infect. Immun. 1993;61(2);486-90]. 따라서, 이러한 ACV의 신규한 세대를 도입시키게 되어 장차 비.파라페르투시스에 의하여 유발되는 백일해를 비교적 증가시킬 수 있다.
현재 사용되는 페르투시스 백신은 비.페르투시스의 상이한 순환하는 균주에 대하여 보호 효과를 제공하는데에 동등한 효과를 나타내지 않을 수 있으며, 비.파라페르투시스(균주)에 대한 보호 효과를 제공하는데에 효과적일 수 없으므로, 페르투시스 백신의 장기간 효능을 확보하기 위하여, 비.(파라)페르투시스에 대한 신규한 백신의 개발, 및 이러한 백신의 제조에 사용될 수 있는 항원의 개발에 관심이 집중되고 있다.
본 발명은 약학적 용도 및/또는 수의학적 용도로 사용될 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 구체적으로 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 및/또는 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis)(이하 총칭하여 "보르데텔라 (파라)페르투시스"라 칭함)에 대한 백신의 제조에 사용될 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 펩티드를 함유하는 백신과, 그 백신의 제조에서의 이러한 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 펩티드에 대하여 생성된 항체와 이러한 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1은 페르탁틴 유전자의 구조를 나타내는 개략도로서, 다형성 위치를 표시하고 있다. 단백 분해 위치들은 별표로 표시하였고 생성물 P69 및 P30을 생성하는유전자의 일부를 나타내었다. 숙주 수용체에 부착하는데에 관여하는 RGD 서열은 음영으로 표시하였다. 영역 1중 3가지 유형의 반복부 GGavP, GGfgP 및 GGgvP가 존재함에 주목하시오. - 표시는 매치 수를 증가시키기 위하여 도입된 서열중 갭을 나타내는 것이다. 숫자는 프로세싱되지 않은 분자의 N 말단에 대한 Prn1중 아미노산의 위치를 나타내는 것이다.
도 2a 및 도 2b는 에피토프 맵핑 및 백신화에 사용되는 펩티드의 아미노산 서열을 나타내는 표이다. 도 2a는 페르탁틴의 영역 1에 특이적인 모노클로날 항체의 에피토프 맵핑 결과를 나타내는 것이다. 각각의 펩티드 서열이 주어졌으며, 부착에 관여하는 RGD 모티브는 음영으로 표시하였다. 펩티드에 대한 모노클로날 항체의 결합 여부는 "-(결합 안함)" 및 "+(결합함)"으로 표시하였다. 백신화에 사용된 펩티드를 파상풍 독소에 접합시켰다. 수막염 구균 펩티드를 백신화 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다. 도 2b는 모노클로날 항체에 의하여 결합한 에피토프를 나타내는 것이다. 영역 1 서열을 어둡게 표시한 것은 각각의 모노클로날 항체에 의하여 결합된 에피토프를 나타내는 것이다.
도 3a 및 도 3b는 명백한 페르탁틴 유형에 대한 모노클로날 항체의 차등적 결합을 나타내는 면역 블롯팅 겔을 나타내는 것이다. 비.페르투시스 균주(Prn1∼6을 발현), 비.브론치셉티카(Bb) 및 비.파라페르투시스(Bpp)로부터 얻은 세포 용균물을 항페르탁틴 모노클로날 항체 PeM5(패널 A) 또는 PeM5(패널 B)를 사용하는 면역 블롯팅에 의하여 분석하였다. 레인 상부에 표시된 번호들은 페르탁틴 유형을 나타내는 것이다. 분자량 마커 위치를 표시하였다.
도 4a는 면역블롯팅 겔을 나타내는 것이고, 도 4b는 페르탁틴의 영역 1이 마우스에서 면역원성임을 나타내는 그래프이다. 마우스를 Prn1으로 면역화시키고 항혈청이 Prn1 ∼ Prn6에서 유래된 MBP 융합 단백질에 결합하는 능력을 평가하였다. 도 4a는 항Prn1 마우스 혈청을 사용한 면역 블롯팅 결과를 나타내는 것이다. MBP-Prn1으로 얻어진 결과만을 나타내었다. MBP-Prn2 ∼ MBP-Prn5를 사용하였을 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다. 동량의 MBP 및 MBP-Prn1을 겔상에 로딩하였다. 페르탁틴 및 MBP-Prn1의 위치를 표시하였다. 도 4b는 항Prn1 마우스 혈청을 이용한 ELISA 결과를 나타내는 것이다. 혈청중 MBP 융합 단백질, 및 MBP에 융합된 페르탁틴 영역의 서열에 대한 항체 적가를 나타내었다.
도 5는 페르투시스 환자들로부터 얻은 혈청이 영역 1에 대하여 생성된 항체들을 보유하고 있음을 나타내는 그래프이다. ELISA 평판을 Prn1으로 코팅하였다. 인간 혈청의 2배 희석액과 함께 예비 항온처리한 후, 모노클로날 항체들 PeM7(영역 1에 대하여 유발됨) 또는 PeM2(모든 페르탁틴 변이체에 존재하는 에피토프에 대하여 유발됨)를 결합시켰다. 한 명의 페르투시스 환자로부터 인간 혈청을 얻었으며, 이 경우 상이한 페르투시스 환자로부터 얻은 혈청 푸울에 의하여 얻어진 결과와 유사하였다.
도 6a∼도 6d는 비강내 비.페르투시스 감염에 대하여 보호 효과를 나타내는 페르탁틴 영역 1로부터 유래된 펩티드를 사용한 면역화의 결과를 나타내는 그래프이다. 마우스를 PBS, 수막염 구균 펩티드, 영역 1로부터 유래한 펩티드의 혼합물 또는 페르탁틴(Prn1)으로 면역화시켰다. 펩티드를 파상풍 독소에 접합시켰다. 면역화 이후, 마우스를 비강내에서 Prn1을 발현하는 비.페르투시스 균주 B213으로 감염시켰다. 허파 및 기관중 세균의 양 및 항체 역가를 감염후 3일 경과시에 측정하였다. 도 6a는 항 파상풍 독소 IgG 역가를 나타내는 것이다. 도 6b는 항 Prn1 IgG 역가를 나타내는 것이다. 도 6c는 허파에서의 CFU를 나타내는 것이다. 도 6d는 기관에서의 CFU를 나타내는 것이다. 가는 선들은 평균치를 나타내는 것이다. P 값을 나타내었다. 본 실험은 3회 수행되었으며 각각의 결과들을 나타내었다.
도 7은 페르탁틴의 영역 1에 대하여 생성되는 모노클로날 항체에 의한, 비.페르투시스 감염에 대한 수동적 보호 효과를 나타내는 것이다. 마우스에 PeM4, 볼거리 바이러스에 대하여 유발된 모노클로날 항체 또는 PBS를 투여하여 수동적으로 면역화시켰다. 면역화 이후, 비.페르투시스 균주 B213(Prn1)을 사용하여 마우스를 비강내 감염시켰다. 허파 및 기관에서의 세균의 양은 감염후 3일 경과시에 측정하였다. 가는 선은 평균값을 나타내는 것이다. P 값을 나타내었다. 본 실험은 3회 수행되었으며 각각의 결과를 나타내었다.
도 8은 명확한 페르탁틴 변이체를 사용하여 비.페르투시스 균주에 대한 교차 면역성을 부여하는 영역 1중에 보존된 에피토프에 대한 모노클로날 항체(PeM4)를 나타내는 것이다. 본 실험은 2회 수행하였으며, 각각의 결과를 나타내었다. 실험에 관한 상세한 설명은 도 7의 제목을 참조하시오.
도 9는 페르탁틴 영역 1로부터 유래된 펩티드를 사용하는 면역화에 의하여, 비강내 비.페르투시스 감염에 대한 보호 효과를 나타내는 그래프이다. 마우스를 PBS, 수막염 구균 펩티드(대조군), 펩티드 GGFGP-GGFGP-GGFGP-, 펩티드 GGAVP-GGFGP-GGFGP 또는 페르탁틴(Prn1)으로 면역화시켰다. 면역화 이후, 마우스를 비.페르투시스로 비강내 감염시켰다. 펩티드를 파상풍 독소와 접합시켰다. 면역화 이후 3일 경과시에, 허파 및 기관내 세균의 수를 측정하였다.
따라서, 비.페르투시스의 실질적으로 모든 균주 또는 적어도 전술한 국가, 특히 유럽에서 순환하고 있는 것으로 공지된 비.페르투시스의 실질적으로 모든 균주에 대한 면역성을 제공하는데에 사용될 수 있는 유용한 백신을 제조하는 것이 본 발명의 일반적인 목적이다. 그러나, 이러한 백신은 비.페르투시스의 다른 (모든) 균주(이들 균주를 포함하나, 이에는 제한되지 않는 균주로서, 아직 동정되지 않았으며/않았거나 장래에 출현할 수 있는 균주)에 대한 보호 효과를 제공할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 백신은 또한 비.파라페르투시스 (균주)에 대하여 보호 효과를 제공하거나, 또는 비.파라페르투시스 (균주)에 대하여 최소 한도의 보호 효과를 제공하여야 하며, 이때 상기 보호 효과는 비.페르투시스 항원을 주성분으로 하는, 구체적으로 본질적으로 원형인 비.페르투시스 페르탁틴을 주성분으로 하는 현 세대의 ACV에 의하여 제공되는 보호 효과보다 더욱 우수하다.
특히 인간, 바람직하게는 유아 또는 다른 포유 동물에 투여시, 예를 들어 상기 인간 또는 포유 동물에서 보호적 면역 반응을 유발시킴으로써 비.(파라)페르투시스에 대한 보호 효과를 제공할 수 있는 약학 성분 및/또는 수의학적 성분을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 성분은 인간용 또는 수의학용의 페르투시스에 대한 백신의 제조/제제화에서 항원성 성분으로서 사용될 수 있는데, 상기 백신은 그 자체로서 공지된 조합 백신 예컨대, "DTP 백신"을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
놀랍게도, 상기 목적들은 비.페르투시스 페르탁틴의 "영역 1"에서 유래된 펩티드, 구체적으로 이하에서 정의된 바와 같은 "본 발명의 펩티드"를 사용함으로써 이루어질 수 있다는 것을 발견하였다. 이는, 실제로 원형 페르탁틴 단백질(예, WCV중 비.페르투시스 세포상에 제공되거나 또는 ACV중 항원으로서 사용되는 단백질)을 사용하면 상이한 비.페르투시스 균주에 대하여 동등하게 유효한 백신을 얻을 수 없는 반면에, 이러한 교차 면역성은 상기 페르탁틴으로부터 유래된 작은 단백질을 주 성분으로 하는 백신을 사용함으로써 얻어질 수도 있다는 사실을 발견하였기 때문에 특히 놀라운 것이다. 또한 본 발명의 백신은 (비.페르투시스 및 비.파라페르투시스의 페르탁틴간 차이에도 불구하고) 비.파라페르투시스 (균주)에 대한 최소한도의 보호 효과(예, ACV의 현재 세대에 의하여 제공되는 보호 효과보다 더욱 양호한 효과)를 제공할 것으로 기대된다.
이러한 발견은 전술한 바와 같이 비.페르투시스 균주가 그 표면에 발현시키는 구별되는 페르탁틴 유형에 있어서 상이하고, 이러한 구별되는 유형 사이에서의 변이는 "영역 1" 즉, 본 발명에 사용되는 펩티드(들)로부터 유래한 동일한 아미노산 서열/에피토프에 실질적으로 제한되기 때문에, 더욱 놀라운 것이다.
감염 또는 백신화는 주로 페르탁틴의 구조적 에피토프에 대한 항체를 유발시킨다는 사실은 설득력이 있는 것이다. 이중에서 영역 1의 구조적 에피토프에 대하여 유발된 모노클로날 항체는 유형 특이적이지만, 선형 에피토프를 안지한 항체들은 모든 비.페르투시스 페르탁틴 변이체에 결합된다는 사실은 중요하다. 그러므로, 교차 면역을 막기 위하여, 세균은 구조적 에피토프에 대한 면역 반응을 유발시키는 진화된 기전을 가질 수 있다. 이러한 추론을 확장시켰을때, 항체가 선형 에피토프에 대하여 유발될 것이기 때문에 영역 1에서 유래된 펩티드에 의한 백신화가 교차 보호 항체를 유도시킬 것이라는 사실은 가능한 사실이다. 뿐만 아니라, 비.페르투시스 페르탁틴의 구조적 에피토프에 대하여 생성된 항체들과는 반대로, 비.페르투시스 페르탁틴의 선형 에피토프에 대한 이러한 항체들은 비.파라페르투시스 페르탁틴에 결합할 수 있다.
그러나, 본 발명은 이하에 기술된 펩티드의 임의의 구체적 설명 뿐만 아니라, 이의 효능에 대한 임의의 기전 및 펩티드가 유리한 교차 면역성을 제공하는 방식에도 제한되지 않는다.
그러므로 본 발명의 제1측면은 다음과 같은 펩티드에 관한 것이다.
(a) 비.페르투시스 페르탁틴의 "영역 1"의 아미노산 서열의 6∼40개, 구체적으로 10∼15개의 인접한 아미노산 잔기들을 포함하는 펩티드 ; 및
(b) 바람직하게는 총 6∼100개의 아미노산 잔기, 및 구체적으로는 6∼50개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 10∼40개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드.
구체적으로 본 발명은 다음과 같은 펩티드에 관한 것이다.
a) 이하 서열번호 1의 아미노산 서열의 6∼36개, 구체적으로 10∼15개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드
TIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGAVPGGFGPGGFGPVL (서열번호 1) ; 및
b) 바람직하게는 총 6∼100개의 아미노산 잔기, 및 구체적으로 6∼50개의 아미노산 잔기, 더욱 구체적으로 10∼50개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드.
전술한 펩티드는 또한 이하에서 "본 발명의 펩티드"라고 칭하여질 것이다. 본원에 구체화된 상기 다른 아미노산 서열은 표준적으로 "1문자 아미노산 암호"로서 나타낼 것이다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드는 본질적으로 보르데텔라 페르투시스 페르탁틴의 영역 1의 아미노산 잔기로부터 유래한/이에 해당하는 아미노산 잔기만을 포함할 것이므로, 총 6∼40개, 바람직하게는 10∼15개의 아미노산 잔기를 함유한다. 그러나, 전술한 정의 및 이하의 상세한 설명으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 몇몇 부가적인 아미노산 잔기들은 총 100개의 아미노산, 바람직하게는 50개의 아미노산 잔기들까지 제외하는 것은 아니다.
이러한 부가의 아미노산 잔기들은 예를 들어 영역 1의 "외부"에 존재하는 페르탁틴 서열의 1 이상의 아미노산 잔기에 해당할 수 있다. 이들은 예를 들어, 영역 1(서열)의 바로 앞에 존재하고/하거나 바로 뒤에 존재하는 아미노산 잔기중 처음 20개 및, 바람직하게는 10개인, 영역 1(서열)에 인접하여 존재하는 페르탁틴 서열중의 아미노산 잔기일 수 있다.
그러나, 본 발명은 본원에 제시된 추가의 조건을 만족시킬 수 있는한, 가장 넓은 의미에서 존재할 수 있는 추가의(즉, 영역 1의 아미노산에 부가적인) 아미노산 잔기에 제한되지 않는다. 더욱이, (상기 설명하고 있는 바와 같이) 본 발명의 펩티드의 "유사체"(1 이상의 아미노산 잔기가 삽입되었거나, 또는 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가된 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌)가 사용될 수 있다. 또한, 하기한 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드가 자연적으로는 결합되지 않은(즉, 천연의 페르탁틴중의) 1 이상의 아미노산 서열을 보유하는 융합 단백질로서 제공될 수 있거나/사용될 수 있다.
본 발명은 또한 조성물, 바람직하게는 약학 조성물 및 구체적으로 본 발명의 1 이상의 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것으로서, 필요에 따라서 1 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 애쥬반트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 백신은 또한 본원에서 "본 발명의 백신"으로서 칭하여질 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 백신의 제조, 구체적으로 비.(파라)페르투시스에 대한 백신 및 임의적으로는 1 이상의 인간의 기타 감염성 질병(디프테리아. 파상풍, 소아마비 및/또는 헤모필러스 인플루엔자 b("Hib")를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님)에 대한 백신의 제조에 있어서의 본 발명의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드에 특이적인 항체 및/또는 이에 대하여 생성되는 항체, 및 이러한 항체를 1종 이상 함유하는 약학 조성물로서, 임의적으로는 1 이상의 약학적 허용 담체, 부형제 또는 애쥬반트를 함유하는 약학 조성물에 관한것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 1종 이상 포함하는 단백질 융합체, 및 이러한 단백질 융합체를 1종 이상 함유하는 약학 조성물, 임의적으로는 1 이상의 약학적 허용 담체, 부형제 또는 애쥬반트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 펩티드는 적당한 방식과 적당한 양(이하에 요약)으로 인간에 투여될때, 인간에서 면역 반응을 나타낼 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 펩티드는 적당한 방식과 적당한 양(이하에 요약)으로 인간에 투여될때, 인간에서 보호적 면역 반응, 구체적으로 인간을 비.페르투시스에 의한 감염에 대하여 보호하고, 바람직하게는 비.파라페르투시스에 의한 감염에 대하여 보호성인 면역 반응을 나타낼 수 있다. 또한 본 발명의 펩티드는, 인간에게 적당한 방식과 적당한 양으로 투여될 경우, 인간에 있어서 "검출 가능한 면역 반응"(일반적으로 인간에 있어서 1 이상의 생물학적 변화를 유도할 수 있으며, 구체적으로 1 이상의 검출 가능한 면역학적 변화를 유도할 수 있는 면역 반응을 의미함)을 나타낼 수 있는 펩티드인 것이 바람직하다. 예를 들어, 이러한 검출 가능한 면역학적 변화는 본 발명의 펩티드에 대한 항체, (본질적으로 원형인) 페르탁틴에 대한 항체 및/또는 비.(파라)페르투시스 (전세포)에 대한 항체의 생성과 관련될 수 있으며, 기타 임의의 검출 가능한/가능하거나 측정 가능한 면역 반응과 관련될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 이러한 "보호적 면역 반응" 및/또는 "검출 가능한 면역 반응"을 제공할 수 있는 것인지 여부를 측정하는 가술은 당업자에게는 명백할 것이며, 이하 실시예에 기술된 방법과 본질적으로 동일할 수 있거나, 또는 본질적으로 유사할 수 있다.
예를 들어, 이러한 기술은 본 발명의 펩티드로 마우스 또는 다른 적당한 동물(포유 동물)을 면역화시킨후, 상기 펩티드에 대하여 항체가 생성되었는지의 여부를 측정하는 것을 포함하는데, 이에 관하여는 본질적으로 실시예중 제2C절에 요약하였다. 이와는 달리, 본 발명의 펩티드로 면역화된 동물은 살아있는 비.(파라)페르투시스 세포에 노출될 수 있는데, 이후 감염에 대한 감수성은 예를 들어, 실시예중 제2D절에 본질적으로 요약되어 있는 바와 같이, 기관지 및/또는 허파의 콜로니화 정도를 측정함으로써, 면역화되지 않은 동물과 비교된다. 특히 바람직한 것은 이러한 테스트에서 전술한 서열번호 5의 펩티드에 의하여, 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 및 더더욱 바람직하게는 70% 이상의 보호 효과를 제공하는 본 발명의 펩티드로서, 예를 들어, 생성된 항체의 역가(예, 본질적으로 실시예 제2C절에 요약된 바와 같이 측정되는 역가) 및/또는 제공된 감염에 대한 보호 정도(예, 본질적으로 실시예 제2D절에 요약한 바와 같이 측정되는 정도)에 의하여 측정될 수 있는 펩티드인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 일반적으로 1 이상의 반복부 GGFGP 및/또는 1 이상의 반복부 GGAVP를 포함하는데, 이러한 반복부의 총 수는 2∼10일 것이다. 예를 들어, 이러한 본 발명의 바람직한 펩티드는 이하의 서열들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
GGFGP-GGFGP (서열번호 2)
GGAVP-GGAVP (서열번호 3)
GGAVP-GGAVP-GGFGP-GGFGP (서열번호 4)
본 발명에 있어서 가장 바람직한 것은 서열번호 5이다.
GGAVPGGFGPGGFGP (서열번호 5)
전술한 본 발명의 펩티드 이외에, 본 발명은 이러한 펩티드의 유사체(이의 용도)를 포함할 수도 있는데, 이는 일반적으로 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 펩티드를 의미하는 것으로서, 8개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 더욱 바람직하게는 2개 이하, 및 더더욱 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 잔기가 결실, 대체, 첨가 및/또는 치환된 펩티드를 의미하는 것이다. 유사체중의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적인 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환이란, 유사한 측쇄를 보유하는 잔기의 호환성을 의미한다. 예컨대, 지방족 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이 있고 ; 지방족 히드록실 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 세린 및 트레오닌이 있으며 ; 아미드 함유 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 아스파라긴 및 글루타민이 있고 ; 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 있으며 ; 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이 있고 ; 황 함유 측쇄를 보유하는 아미노산군으로는 시스테인 및 메티오닌이 있다. 그러므로, 보존적 아미노산 치환이란 주어진 군의 아미노산이 동일 군의 다른 아미노산에 의하여 치환된 경우를 의미하는 것이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군들로서는, 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 있다.
유사체란, 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에 투여되는 경우, 인간에 있어서 면역 반응을 유발할 수 있거나/나타낼 수 있는 것이 바람직하다. 유사체는 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에 투여되는 경우, 인간에 있어서 보호적 면역 반응, 구체적으로 비.페르투시스에 의한 감염, 및 바람직하게는 비.파라페르투시스에 의한 감염에 대하여 인간을 보호하는 면역 반응(전술한 기법중 1 이상의 기법을 사용하여 측정될 수 있는 면역 반응)을 유발할 수 있거나/나타낼 수 있는 것이다. 또한 유사체는 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에 투여되는 경우, 인간에 있어서 "검출 가능한 면역 반응"(유사체에 있어서 사용된 특정 유사체에 대한 항체의 생성을 포함할 수 있고, 또한 전술한 기법들중 1 이상의 것을 이용하여 측정될 수도 있는 면역 반응) 을 유발할 수 있거나/나타낼 수 있는 것이 바람직하다. 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 바람직한 펩티드의 유사체가 특히 바람직하다. 서열번호 5의 펩티드의 유사체가 특히 바람직하다. 이하의 추가의 설명에 있어서, 상기 정의된 유사체들은 다른 언급이 없는한, "본 발명의 펩티드"라는 용어에 포함되는 것으로서 간주되어야 할 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드 및/또는 이의 유사체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있으며(이 형태로 사용될 수 있으며), 이러한 염들은 이하에서 사용된 바와 같이 "본 발명의 펩티드"라는 용어에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 펩티드는 그 자체로서 공지된 방식으로 제공될 수 있으며, 그 자체가 본 발명에 공지된 방식 예컨대, 보호된 아미노산, 카보디이미드 화학 물질 및/또는 Fmoc 화학 물질의 사용을 포함하며, 자동화된 장치를 사용하여 수행될 수있는 펩티드 합성 기법으로 제조될 수 있는 것을 포함한다. 다른 기법으로서는 고체상 펩티드 합성법 예컨대, Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85, 2149(1963)에 의하여 기술된 기법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 기법들 및 다른 기법들은 당업자에게 널리 공지될 것이며/것이거나 표준적인 핸드북에 기술되어 있다.
본 발명의 펩티드는 약학 조성물의 제조, 구체적으로 백신의 제조에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로 본 발명의 펩티드는 비.(파라)페르투시스 감염에 대하여 인간을 보호하기 위한 백신의 제조에 사용될 수 있다. 이 백신은 오로지 페르투시스에 대하여만 보호 효과를 나타내는 백신일 수 있으나(소위 "단일가" 또는 "단일 성분" 백신), 또한 페르투시스 및 페르투시스 이외의 1 이상의 다른 감염성 질병 예컨대, 디프테리아, 파상풍, 소아마비 및/또는 Hib(이들에 한정되는 것은 아님)에 대하여 보호 효과를 나타내는 조합 백신(소위 "다가" 또는 "다성분" 백신)일 수도 있다. 이러한 "조합 백신"의 예는 당업자들에게 명백할 것인데 예컨대, "DTPa" 백신이 그것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다[뿐만아니라, 이러한 (조합) 백신은 종종 유아 및 어린이를 면역화/보호하는데에 사용되기도 한다. 그러므로, 본원에 사용된 바와 같은 "인간"이란 용어는 어떠한 특정 연령층에 국한되는 것은 아니지만, 구체적으로 유아 및 어린이를 포함한다].
본 발명의 펩티드 또는 백신은 일반적으로 인간에게서 면역 반응, 바람직하게는 전술한 바와 같이 검출 가능한 면역 반응 및 가장 바람직하게는 보호적 면역 반응을 나타내는 양으로 인간에게서 면역 반응을 나타낼 처방계획에 따라서 투여될것이다. 이러한 처방계획에는 1회 투여 또는 2회 이상의 투여 예컨대, 1회 이상의 면역화 개시후 1회 이상의 추가면역적 면역화를 포함할 수 있다. 적당한 처방계획은 당업자에게 명백할 것이며 본질적으로는 페르투시스에 대한 공지의 백신을 이용하는 현재 사용되는 처방계획 및/또는 공지의 조합 백신을 이용하는 처방계획과 동일할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드는 1∼100 ㎍, 구체적으로는 4∼20 ㎍/투여량의 양으로 투여될 것이다. 그러므로, 적당한 처방계획은 예를 들어, 본 발명의 펩티드 10 ㎍을 사용하여 면역화를 개시시킨후, 2개월, 3개월 4개월 및 11개월 경과후 동일한 투여량으로 추가로 면역화를 개시하고, 4년 경과후 동일한 투여량으로 추가면역적 투여를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드 또는 백신은 그 자체로서 공지된 임의의 적당한 방식(당업자에게 명백함) 예컨대, 경구적, 경피적, 피하적, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 호흡기관을 통하여 투여될 수 있으며, 근육내 투여가 특히 바람직하다.
본 발명의 백신은 자체로서 공지된 방식으로 제제화될 수 있으며(일반적으로는 의도로하는 투여 경로에 의존성임), 이 경우 임의적으로 1 이상의 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 애쥬반트를 사용할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 백신은 주사용으로 사용할 목적 및/또는 주사용으로 적당한 형태 예컨대, 물 또는 생리학적으로 허용 가능한 완충액 또는 용액중 펩티드(들)의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 펩티드를 사용하면 이러한 백신을 (예컨대, 물 또는 생리학적으로 허용 가능한 완충액 또는 용액을 사용하여) 재구성하여 주사용으로 적당한 제제 예컨대, 건조 또는 동결 건조 분말을 제공할 수 있는 형태로 제공할 수 있도록 만들수도 있다.
본 발명의 백신은 적당한 수용기 또는 용기 예컨대, 앰플, 병 또는 플라스크에, 임의적으로는 생성물 정보를 보유하는 리프렛(leaflet)과 함께 적당히 패킹될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 백신은 본 발명의 펩티드(들)를 1∼100 ㎍, 바람직하게는 4∼20 ㎍의 양으로 함유할 것이며, 보통 단위 투여 제형의 형태로 함유할 것이다. 본 발명의 백신은 또한 백신에 사용되는 것이 허용 가능한 1 이상의 면역학적 애쥬반트 예컨대, 알루미늄 포스페이트 및/또는 알루미늄 히드록시드를 포함할 수도 있다. 이들은 자체로서 공지된 적당한 양 예컨대, 공지의 ACV 제형으로부터 공지된 양으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드는 작용성 잔기 예컨대, 말토즈-결합 단백질, 파상풍 독소 또는 다른 담체 또는 면역 조절기 및/또는 면역 자극기와 접합, (공유)결합 또는 부착될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 백신은 또한 자체로서 공지된 1 이상의 비.(파라)페르투시스 항원 예컨대, 페르투시스 독소, 섬유상 적혈구응집소, 제2 혈청형 선모 및/또는 제3 혈청형 선모를 예컨대, 비세포 백신으로부터 자체로서 공지된 양으로 함유할 수도 있다. 뿐만 아니라, 전술한 바와 같이 조합 백신을 제공하기 위하여, 본 발명의 백신은 또한, 적당한 양으로 인간에 투여되었을때 페르투시스 이외의 1 이상의 (감염성) 질병 예컨대, 디프테리아, 파상풍, 소아마비 및/또는 헤모필러스 인플루엔자 b에 대하여 인간을 보호할 수 있는, 1 이상의 추가의 약학적으로 허용 가능한 성분을 함유할 수도 있다. 일반적으로 이러한 성분은 예컨대,
- 디프테리아 독소와 같이 디프테리아에 대하여 보호 효과를 제공하는 항원
- 파상풍 독소와 같이 파상풍에 대하여 보호 효과를 제공하는 항원
- 비활성 소아마비 바이러스와 같이 소아마비에 대하여 보호 효과를 제공하는 항원
- 헤모필러스 인플루엔자 b(Hemophillus influenzab)에 대하여 보호 효과를 제공하는 항원
또는 이들의 적당한 조합물을 비롯한, 자체로서 공지된 적당한 항원일 수 있다. 그러나, 본원의 우선일 이후에 유용하게 될 수 있는 임의의 적당한 항원(들)도 사용될 수 있다는 것을 파악할 수 있다. 이러한 추가의 항원들은 일반적으로 적당한 처방계획(예, 본 발명의 백신에 관하여 상기 요약됨)에 따라서 인간에게 투여될때, 목적 질병에 대하여 면역 반응, 구체적으로 보호적 면역 반응 및/또는 검출 가능한 면역 반응을 유발시키거나/나타낼 수 있는 양으로 사용될 것이다. 각각의 특적 항원에 대한 적당한 양에 관하여는 당업자에게 명백할 것이며, 이는 또한 자체로서 공지된 백신에 보통 사용되는 양에 해당할 것이다. 본 발명의 바람직하지만 비한정적인 백신은 예를 들어 다음의 성분들중 2 이상을 이하에 규정된 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드4∼20 ㎍ ;
페르투시스 독소5∼50 ㎍ ;
섬유상 적혈구응집소5∼50 ㎍ ;
제2 혈청형 선모2.5∼50 ㎍ ;
제3 혈청형선모2.5∼50 ㎍ ;
디프테리아 독소5∼50 ㎍ ;
파상풍 독소5∼50 ㎍ ; 및/또는
Hib(헤모필러스 인플루엔자 B형)2∼10 ㎍ 다당류(RPR ; 폴리-리보실 포스페이트).
또한, 본 발명의 조합 백신은 전술한 바와 같이, 자체로서 공지된 방식으로 제제화 및 투여될 수 있다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 펩티드(들)은 공지의 ACV에 현재 사용되는, WCV에서 공지된 전세포 비.페르투시스 및/또는 페르투시스 항원((본질적으로) 원형 페르탁틴을 포함하나 이에 한정되는 것은 아님)중 일부 또는 전부를 치환시키는데에 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 작은 항원 펩티드는 신규 유형의 페르투시스 백신 및/또는 페르투시스 백신의 제제화 및/또는 투여의 신규한 방식을 개시할 수 있다는 것을 파악할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 및 백신은, 상기 균주들간 페르탁틴 암호화prn유전자의 다형성에 기인한, 상기 균주들의 표면에 결합된 페르탁틴 단백질간 차이점에도 불구하고, 이들이 동시에 이하 실시예에 사용된 비.페르투시스의 (적어도) 상이한 균주에 대한 면역성을 제공할 수 있는, 현재 사용중인 페르투시스 항원 및 백신에 비하여 이점을 갖는다. 더욱 광범위하게, 본 발명의 펩티드는 현재 순환하는 비.페르투시스의 모든(다른) 균주와, 또한 장래에 동정될 수 있거나 또는 장래에 출현할 수 있는 임의의 균주에 대한 면역성을 제공하는데에 사용될 수 있으며 ; 또한 비.파라페르투시스 (균주)에 대한 보호 작용을 제공할 수도 있다. 더욱이, 작은 항원성 펩티드의 용도는 (현재 사용되는 전세포 및/또는 항원성 성분의용도에 비하여) 백신의 안정성을 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 펩티드의 다른 가능한 용도는 시험관내 분석법 및/또는 생물학적 분석법에서 사용하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드가 자연 발생 페르탁틴에 천연의 상태로 결합되어 있는(결합될 수 있는) 아미노산 서열의 서열과 상이한 1 이상의 추가의 아미노산 서열에 연결되어 있는, 1 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하는 융합 (단백질)에 관한 것이다. 이러한 추가의 단백질 서열 그 자체는, 비.(파라)페르투시스 및/또는 다른 감염성 질병에 대한 (보호적) 면역성을 제공하기 위하여, 임의로는 항원성일 수 있으며/있거나 1 이상의 추가의 (항원성) 에피토프를 포함할 수 있으며/있거나 면역 조절성 및/또는 면역 자극성 아미노산 서열일 수 있다.
이러한 융합체는 자체로서 공지된 방식 예컨대, 적당한 숙주 유기체중 융합체를 암호화하는 핵산 서열의 발현(예, 사용된 숙주 유기체에서 작용 가능한 적당한 프로모터의 제어하에서의 발현)이후, 숙주 유기체 및/또는 배양 배지로부터 융합체를 분리/정제함으로써 제공될 수 있다. 이러한 융합체를 암호화하는 핵산 서열, 이의 숙주 유기체, 적당한 숙주 유기체(예컨대, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 또는 비.(파라)페르투시스) 및 이에서 작용 가능한 프로모터(예컨대, T7 RNA 중합효소 프로모터, lac 프로모터, 또는 비.(파라)페르투시스로부터 유래된 프로모터 예컨대, Omp 또는 섬유상 적혈구 응집소용 프로모터)하에서, 이의 (이종 조직) 발현을 제공하는 적당한 기법 및 이와같이 발현된 융합체(들)를 분리하는 기법은 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게, 이러한 융합체는적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에 투여되는 경우, 이 인간에서 보호적 면역 반응(구체적으로 비.페르투시스 및 바람직하게는 비.파라페르투시스에 의한 감염에 대한 면역 반응) 및/또는 전술한 바와 같은 검출 가능한 면역 반응을 유발시키거나/나타낼 수 있는 것이다.
전술한 융합체는 본질적으로 본 발명의 펩티드에 대하여 상기 요약한 방법으로 약학 조성물, 구체적으로 백신(즉, 비.(파라)페르투시스에 대한 백신)의 제조에 사용될 수 있다.
다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 펩티드에 대하여 유발된/생성된 항체에 관한 것이다. 본원에 사용된 항체로서는 무엇보다도, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 단일쇄 항체 뿐만 아니라, 단편(Fab, Fv 및 Fa) 및 Fab 발현 라이브러리를 포함할 수 있다. 더욱이 "인간화된(humanized)" 항체는 예를 들어 WO 98/49306에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 항체들은 공지된 방법 즉, WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO 98/41633 및/또는 WO 98/49306에 기술된 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체들은 적당한 숙주 예컨대, 염소, 토끼, 양, 래트, 돼지, 마우스 또는 인간을 본 발명의 펩티드로, 임의적으로는 면역원성 담체(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌) 및/또는 애쥬반트 예컨대, 푸룬트 애쥬반트, 사포닌, ISCOM, 알루미늄 히드록시드 또는 유사한 무기 겔, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 유사한 표면 활성 물질을 사용하여 면역화시킴으로써 얻어질 수 있다. 본 발명의 펩티드에 대한 면역 반응이 개시된 이후(일반적으로 1∼7일 이내), 항체들은 자체로서 공지된 방식으로 면역화된 동물로부터 채혈하거나또는 혈청을 취하여 분리될 수 있으며, 이 경우 임의적으로는 목적 특성 예컨대, 목적 특이성 또는 친화성을 갖는 항체를, WO 96/23882에 제시된 사항을 참고로 하여 공지의 면역 분석 기법을 사용하여, 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
모노클로날 항체들은 상기 참고 문헌들에 기술된 바와 같이, 하이브리도마를 포함하는 배양액중에서 연속적 세포주를 사용하여 유사한 기법으로 생성될 수 있다. Fab-단편들 예컨대, F(ab)2, Fab' 및 Fab 단편은 펩신 또는 다른 프로테아제를 사용하여 항체를 절단시켜, 이황화 결합을 감소시킨후 파파인 및 환원제로 각각 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대하여 생성된 항체들은 약학적 및/또는 진단학적 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체들은 비.(파라)페르투시스에 의하여 감염되었거나 또는 감염의 위험이 있는 인간에게 상기 항체를 자체로서 공지된 방식(예, 정맥내, 근육내, 비강내) 및 적당한 양(예, 25 ∼ 1500 ㎎/체중 1㎏)으로 투여함으로써, 비.(파라)페르투시스에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는데에 사용될 수 있다. 이러한 목적으로, 항체들은 일반적으로 본 발명의 펩티드에 대하여 생성된 1 이상의 항체를 포함하는 약학 조성물로서 제제화될 것이며, 임의적으로는 1 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 애쥬반트와 함께 제제화될 것이고 ; 이러한 조성물은 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 특히, 이러한 조성물은 주사 및/또는 주입에 적당한 조성물의 형태로서, 물 또는 생리학적 완충액 또는 용액중 항체의 용액/현탁액을 포함하는 조성물의 형태일 것이다. 본 발명의 펩티드에 대하여 생성된 항체들의 다른 용도로서는 자체로서 공지된 항체를 사용하는 약학적 용도 및/또는 진단학적 용도를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 페르탁틴의 서열에 비하여 다음의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
- 최대한 부분적으로, 및 바람직하게는 본질적으로 완전히 제거된 소위 "영역 1"을 형성하는 아미노산 잔기 ; 및/또는
- 최대한 부분적으로, 및 바람직하게는 완전히 제거된 소위 "영역 2"를 형성하는 아미노산 잔기.
(최소한 일부분의) 영역 1 및/또는 (최소한 일부분의) 영역 2가 제거된 페르탁틴은 또한 이하에서 "결실 페르탁틴"으로 칭하여질 것이다. 이러한 관점에서, "페르탁틴 서열"은 자연 발생 비.페르투시스 페르탁틴(유형)이거나, 또는 이의 유사체 또는 변이체(이의 합성 유사체 또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님)일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 이러한 관점은 다음의 서열들에 의한, 서열번호 6에 나타낸 페르탁틴의 아미노산 서열(또는 이들의 자연 발생적 서열 또는 합성 유사체 또는 변이체)을 보유하는 "결실된 페르탁틴"에 관한 것이다.
- 266∼290 위치의 아미노산 잔기들중 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상 및 최소한 모두 제거된 서열
- 569∼603 위치의 아미노산 잔기들중 3개 이상, 바람직하게는 10개 이상 및 최소한 모두 제거된 서열.
더욱 바람직하게, 본 발명의 이러한 관점은 1 이상의 아미노산 잔기가 다음과 같이 제거되었거나 또는 제거된(즉, 상기 요약된 바와 같이), 서열번호 6에 나타낸 페르탁틴의 아미노산 서열을 보유하는 결실된 페르탁틴(또는 이의 자연 발생적 또는 합성 유사체 또는 변이체)에 관한 것이다.
- 서열번호 6의 260∼290번 위치에 존재하는 아미노산 잔기로부터 1 이상의 반복부 "GGAVP" 및/또는 1 이상의 반복부 "GGFGP" 및/또는 260∼290번 위치에 존재하는 최대한 이런 반복부 모두 예컨대, "GGAVP" 및/또는 "GGFGP"가 제거됨/제거되었음.
바람직하게, 총 2개, 3개, 4개 또는 5개의 반복부 "GGAVP" 및/또는 "GGFGP"는 제거되며, 임의적으로는 상기 반복부를 포함하는 아미노산 잔기의 인접 서열의 형태로 260∼290번 위치에 존재하는 1 이상의 추가의 아미노산 잔기를 보유하며 ; 및/또는
- 서열번호 6의 569∼603번 위치의 아미노산 잔기로부터 1 이상의 모티브 "PQP"및/또는 569∼603번 위치에 존재하는 최대한 모든 모티브 "PQP"가 제거됨/제거되었음.
바람직하게, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 모티브 "PQP"는 제거되며 ; 임의적으로는 1 이상의 추가의 아미노산 잔기가 569∼603번 위치에 예컨대, 상기 PQP 모티브를 포함하는 아미노산 잔기의 인접 서열의 형태로 존재할 수 있다.
가장 바람직하게, 결실된 페르탁틴은 다음과 같은 아미노산 잔기가 제거된, 서열번호 6에 나타낸 페르탁틴의 아미노산 서열(또는 이의 자연 발생 아미노산 서열 또는 합성 유사체 및/또는 변이체)을 보유한다.
- 266번 위치의 Gly로부터 290번 위치의 Pro까지의 잔기들 ; 또는
- 270번 위치의 Gly로부터 285번 위치의 Pro까지의 잔기들 ; 및/또는 다음의 아미노산 잔기중 임의의 것이 제거된 잔기.
- 569번 위치의 Ala로부터 603번 위치의 Ala까지의 잔기들 ; 또는
- 572번 위치의 Pro로부터 599번 위치의 Gln까지의 잔기들 ; 또는
- 575번 위치의 Pro로부터 596번 위치의 Pro까지의 잔기들 사이 ; 또는
- 578번 위치의 Ala로부터 594번 위치의 Glu까지의 잔기들 사이 ; 또는
- 581번 위치의 Pro로부터 591번 위치의 Pro까지의 잔기들 사이 ; 또는
- 584번 위치의 Gln로부터 588번 위치의 Pro까지의 잔기들 사이.
전술한 바와 같은 영역 1 및/또는 영역 2로부터 얻은 1 이상의 아미노산 잔기들에 더하여, 영역 1 및/또는 영역 2에 측접하는 1 이상의 아미노산 잔기들은 예를 들어, 206번 위치의 Thr에서 340번 위치의 His까지 ; 및/또는 569번 위치의 Asn에서 653번 위치의 Gly까지 제거될 수 있다. 전술한 바와 같이, 결실된 페르탁틴은 서열번호 6의 서열로부터 유래될 수 있거나, 또는 자연 발생 서열 및/또는 이의 합성 유사체 또는 변이체로부터 유래될 수 있는데 즉, 1 이상의 아미노산 잔기들이 삽입, 결실, 치환(바람직하게는 "보존적" 치환) 또는 첨가된 유사체 또는 변이체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 이러한 유사체 또는 변이체는 아미노산 서열 상동성 비율을 보유하는데, 이때의 아미노산 서열 동일성은 30% 이상, 바람직하게는 40%, 더욱 바람직하게는 50%, 더더욱 바람직하게는 60%, 더더욱 바람직하게는 70%,더욱 바람직하게는 80% 이상 및 가장 바람직하게는 90% 이상이다.
당 업계에 공지된 바와 같은 "아미노산 서열 동일성"이란, 서열들을 비교함으로써 측정되는 2 이상의 폴리펩티드 서열간의 관계를 의미하는 것이다. 당 업계에서, "동일성"이란, 이러한 서열들의 스트링을 상호 매치시킴으로써 측정되는 바와 같은 폴리펩티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하는 것이다. 이들 2개의 폴리펩티드간 "유사성"이란, 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존적 아미노산 치환체들을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 측정되는 것이다. "동일성" 및 "유사성"은, 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.편저, Oxford University Press, New York, 1988 ; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.편저, Academic Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A.M. 및 Griffn, H.G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987 ; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991 ; 및 Carillo, H., 및 Lopman, D., SIAM J. Applied Math, 48:1073(1988)]에 기술된 방법들을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 공지의 방법으로 용이하게 측정될 수 있다. 동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법들은 테스트될 서열들이 가장 많이 매치되도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 방법들은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 암호화되어 있다. 2개의 서열들간 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J.외 다수, Nucleic AcidsResearch 12(1):387(1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S.F.외 다수, J.Mol.Biol.215:403-410(1990))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공중이 입수 가능한 프로그램이다[BLAST Manual, Altschul,S.외 다수, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul,S.외 다수, J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]. 널리 공지되어 있는 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 측정하는데에 사용될 수 있다. 폴리펩티드 서열 비교용의 바람직한 파라미터들로서는 다음의 것들을 포함한다 즉, 1) 알고리즘 : Needleman 및 Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453(1970) ; 비교 매트릭스 : BLOSSUM62(Hentikoff 및 Hentikoff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915-10919(1992)) ; 갭 페널티 : 12 ; 및 갭 길이 패널티:4. 이러한 파라미터를 사용하는데에 유용한 프로그램은 위스콘신주 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹으로부터 입수된 "Ogap" 프로그램과 같이 공중이 입수 가능한 것이다. 전술한 파라미터들은 펩티드 비교에 있어서 디폴트된 (말단 갭에 대한 페널티가 없는) 파라미터이다.
그러므로, 전술한 바와 같은 "결실된 페르탁틴"은, 바람직하게는 생성된 결실 페르탁틴이 상기 요약된 바와 같은 서열 동일성에 대한 조건과 부합하는 한, 페르탁틴의 1 이상의 부분 또는 이의 단편으로부터 유래되거나 또는 이를 포함할 수도 있다. 이러한 결실된 페르탁틴은 200개 이상의 아미노산, 바람직하게는 400개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 600개 이상의 아미노산 및 더더욱 바람직하게는 800개 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 측면에 따라서 결실된 페르탁틴을 제공하기 위하여, 결실되어 결실된 페르탁틴(즉, 상기한 바와 같음)을 제공하는 1 이상의 아미노산을 1 이상의 아미노산 잔기와 치환시킬 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 결실 아미노산 잔기가 치환된 아미노산 잔기들이 결실된 아미노산 잔기들과 본질적으로 동일한 생물학적 효과(예, 면역학적 효과)를 (임의적으로는 페르탁틴 서열의 나머지 아미노산 잔기들과 결합하여) 제공하지 않도록 치환시킬 수 있다. 더욱 바람직하게, 이러한 폴리펩티드는 전술한 서열 동일성에 대한 조건과 부합하여야 하는데, 결실되어 결실된 페르탁틴을 제공하는 아미노산 잔기들에 대하여 치환된 아미노산 잔기들은 고려하지 않는다.
바람직하게, 전술한 바와 같은 임의의 "결실된 페르탁틴"은 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에게 투여될 때, 인간에서 면역 반응을 나타낼 수 있다. 더욱 바람직하게, 이와같은 임의의 결실된 페르탁틴은 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에게 투여될때, 인간에서 (상기 언급된 기법들중 1 이상의 기법들을 사용하여 측정될 수 있는) 보호적 면역 반응 특히, 비.페르투시스에 의한 감염에 대하여 인간을 보호하고, 바람직하게는 비.파라페르투시스에 의한 감염에 대하여 인간을 보호하는 보호적 면역 반응을 나타낼 수 있다. 또한 이러한 임의의 결실된 페르탁틴은 바람직하게는 적당한 방식 및 적당한 양으로 인간에게 투여될때, 인간에서 "검출 가능한 면역 반응"을 나타낼 수 있는데, 이 반응은 유사체에 있어서도 사용된 특정 유사체에 대한 항체를 생성시킬 수 있으며, 또한 전술한 기법들중 1 이상의 기법을 사용하여 측정될 수도 있다.
전술한 바와 같은 결실된 페르탁틴은, 이러한 결실된 페르탁틴을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적당한 숙주 유기체중에서 발현(예, 사용된 숙주 유기체에서 작용 가능한 적당한 프로모터의 제어하에서의 발현)시킨후, 숙주 유기체 및/또는 배양 배지로부터 얻은 융합체를 분리 및 임의적으로는 추가로 정제하는 것과 같은, 자체로서 공지된 방법으로 제공될 수 있다. 또한 이러한 결실 페르탁틴을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 숙주 유기체, 적당한 숙주 유기체(예컨대, 에스케리챠 콜라이 또는 비.(파라)페르투시스) 및 이에서 작용 가능한 프로모터(예컨대, T7 RNA 중합효소 프로모터, lac 프로모터, 또는 비.(파라)페르투시스로부터 유래된 프로모터 예컨대, Omp 또는 섬유상 적혈구 응집소용 프로모터하에서 이의 (이종 조직) 발현을 제공하는 적당한 기법 및 이와같은 결실된 페르탁틴(들)을 분리하는 기법은 당업자에게 명백힐 것이다.
전술한 결실 페르탁틴은 본 발명의 펩티드에 대하여 전술한 방식으로 약학 조성물의 제조/제제화, 구체적으로 백신(즉, 비.(파라)페르투시스에 대한 백신)의 제조/제제화에 사용하기 위한 항원성 성분으로서도 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 결실 페르탁틴은 본 발명의 펩티드(펩티드를 함유하는 백신)에 대한 전술한 바와 같은 동일한 이점을 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 펩티드를 사용하는 것과 같이, 본 발명의 결실 페르탁틴은 구조, 변이형, 에피토프에 대한 면역 반응을 유발시키도록 세균에 의하여 나타나는 기전을 회피시켜, 그 결과 비.(파라)페르투시스 (균주)에 대한 교차 면역성을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이, 결실된 페르탁틴에 대하여 생성된 항체와, 이러한 항체들을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체들에 있어서 전술한 바와 같이, 본질적으로 이러한 항체들 및 조성물들을 얻어서/얻거나 사용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 약학 조성물, 구체적으로 1 이상의 본 발명의 펩티드를 전술한 바와 같은 1 이상의 결실 페르탁틴과 함께 포함하는 백신(즉, 비.(파라)페르투시스에 대한 백신)에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물/백신은 또한 1 이상의 추가의 성분들(예, 본 발명의 백신에 대하여 전술한 바와 같은 성분)을 포함하여 단일가 및/또는 다가의 백신을 제공할 수 있다.
전술한 본 발명이 주로 인간에 사용됨에도 불구하고, 또 다른 측면에서 본 발명의 펩티드, 본 발명의 결실 페르탁틴 및/또는 전술한 항체들은 수의학적 용도, 구체적으로 포유 동물 예컨대, 고양이, 개, 돼지, 소에서 비.파라페르투시스 및 비.브론치셉티카(B.bronchiseptica)에 의한 감염에 대한 수의학적 백신을 제공하는데에 사용될 수 있다(사용되어 적당하고/적당하거나 의도로한 조성물을 제공할 수 있다). 이러한 백신(단일가 백신 또는 다가 백신)의 제조 및 용도는 당업자에게 명백할 뿐만 아니라, 본원에서 추가로 개시되어 있다.
본 발명은 다음의 비한정적인 실시예들과 비한정적인 도면들에 의하여 예시될 것이다.
실시예 1
1. 방법
1A. 세균 균주 및 플라스미드 :
본 연구에 사용된 비.페르투시스, 비.파라페르투시스 및 비.브론치셉티카 균주들을 표 Ⅰ에 나타내었다. 비. 균주들을 3일 동안 35℃에서 1% 글리세롤 및 15% 양 혈액으로 보충된 Bordet-Gengou(BG) 아가상에서 생장시켰다[Difco Catalog 0048-17-5번, Detroit, USA]. 항생제로 보충된 L-발효액 또는 L-아가상에서 통상적으로 생장된 이.콜라이의 플라스미드 증식에 에스케리챠 콜라이 균주 DH5α 및 BL21(DE3)을 사용하였다. pMAC-c2 벡터를 미국 매사츄세츠 베벌리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 구입하였다.
1B. DNA 서열 결정
본 연구에 사용된 모든 균주들의 페르탁틴 유전자를 본 연구 수행중 미리 서열 결정시켰다[vide Li외 다수 ; Mastrantonio외 다수 ; Mooi외 다수(1998) 및 Mooi외 다수(1999), 상동 ; 표 1 참조]. 표준적인 방법을 사용하여 DNA를 분리하였다. PCR 생성물의 직접적 서열 결정법에 의하여 DNA 서열 결정을 수행하였다. ABI 프리즘 염료 말단기 사이클 서열 결정 준비 키트(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재, Perkin Elmer-Applied Biosystems)를 사용하여 서열 결정을 수행하고 373 ABI DNA 서열결정기(Perkin Elmer)상에서 분석하였다.
1C. 페르탁틴 다형성 영역 1을 함유하는 말토즈 결합 단백질의 구성
서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는prn1유전자의 개방 해독틀의 일부(영역 1로서 정의됨)를 해당 pMAL-c2 벡터중 해당 페르탁틴 DNA 서열을 클로닝시켜 말토즈 결합 단백질(MBP)과의 융합체로서 이.콜라이중에서 발현시켰다[미국 베벌리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스]. 페르탁틴 서열을 다음 2개의 프라이머와 비.페르투시스 균주 B5의 염색체 DNA를 사용하여 PCR에 의하여 얻었다.
TIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGAVPGGFGPGGFGPVL (서열번호 1)
5'-CGGGATCC ACGATACGGCGCGGGGAC-3'(서열번호 7)
5'-GCTCTAGA GAGGACGGGACCGAAGCC-3'(서열번호 8)
클로닝을 촉진시키도록 도입된 프라이머중 BamH1 및 Xba1 제한 위치들을 밑줄로써 표시한 반면에, 페르탁틴 유래 서열은 굵은 글씨로 나타내었다.prn2, prn3, prn4및prn5로부터 유래된 PCR 생성물을 적당한 균주(B394, B365, B705 또는 B1148)(표 1)를 사용하는 유사한 방식으로 얻었다. 겔 정제된 PCR 생성물을 BamH1 및 Xba1으로 절단시킨후 이를 BamH1-Xba1 절단된 pMAL-c2에 결찰시켰다. 모든 플라스미드 작제물을 DNA 서열 결정에 의하여 검사하였다.
1D. 말토즈 결합 단백질-페르탁틴 융합 단백질의 정제 :
pMAL-c2 유도체를 보유하는 500 ㎖ 이.콜라이 배양액(BL21)을 37℃하에 암피실린(200 ㎍/㎖) 및 1% 글루코즈를 함유하는 L-발효액중에서 생장시켰다.OD600㎚=0.5에서 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도 0.3 mM이 되도록 첨가하여 MBP-융합 단백질을 발현시켰다. 이와같이 유도시킨 이후에, 2 시간 동안 계속해서 성장시키고, 20분 동안 13000 ×g에서 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 펠렛을 용균 완충액(10 mM NaPO4, pH 7.2, 0.5 M NaCl, 0.25% Tween 20, 10 mM EDTA 및 0.1 mM PMSF)에 재현탁시키고, 이를 -20℃에서 밤새도록 보관하였다. 이를 해동시킨후, 세포 현탁액을 얼음에서 4 ×30 초 동안 2분 간격으로 초음파 처리하였다[Branson Sonifier 250, 노르말 팁, 수율 50%]. 추출물을 컬럼 완충액 A(20 mM Tris, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 사용하여 100 ㎖로 희석하고 이를 5 ㎖ 아밀로즈 컬럼에 도말하였다. 완충액 A로 철처히 세정한후, 결합된 단백질을 완충액 A(10 mM 말토즈로 보충함)로 용리시키고, 1 ㎖ 분액을 수집하였다. SDS-PAGE 수행 이후 코마쉬 브릴리언트 블루(Serva)로 염색시켜 관찰한 결과 순도는 >99%였다.
1E. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 생성 :
PBS 중 0.35% 알히드로겔에서 Chiron-Biocine SpA(이탈리아 시에나)에 의하여 공급된 Prn1 5 ㎍을 BALB/c 마우스에 반복적으로 주사하여(처음 주사 및 28일 경과시 주사) 페르탁틴에 대한 폴리클로날 항혈청을 제조하였다. 42일 경과시에 마우스로부터 채혈하였다. Speco1과 혼합한 정제 페르탁틴으로 BALB/c 마우스에 3회 피하 주사하여 모노클로날 항체 PeM1, PeM2, PeM3, PeM4, PeM5, PeM6 및 PeM7을 생성시켰다. PeM70, PeM71 및 PeM72도 이와 유사하게 생성시키되, 항원으로서는Prn1, MBP-Prn1을 사용하였다. PeM68을 생성시키기 위하여, 마우스에 MBP-Prn5를 주사하였다. Prn5를 사용하여 PeM80, PeM84 및 PeM85를 생성시켰다. 융합 3일 이전에, 마우스를 정맥내로 추가 면역시켰다. 50% PEG 1500(독일 맨하임 소재, 뵈링거)을 사용하여 비장 세포들을 마우스 골수종 세포 SP2/0와 융합시켰다. ELISA에 의하여 페르탁틴에 대한 하이브리도마 분비 항체를 선별한후, 일정 비율로 희석하여 2회 클로닝하였다. 단백질-G 친화성 크로마토그래피(스웨덴 웁살라 소재, 파마시아)에 의하여 모노클로날 항체들을 정제하였다.
1F. 펩티드 합성 :
Brugghe외 다수, Int.J.Peptide Protein Res. 43:166-172(1994)에 의하여 기술된 바와 같이, 48-컬럼 반응 블록(독일 랑겐펠트 소재, AMS 422, ABIMED Analysen-Technik GmbH)이 장착된 자동화 다기관 펩티드 합성기를 사용하여 펩티드를 조립하였다. 에피토프 맵핑에 사용되는 펩티드는 전술한 바와 같이 제조된 N-말단 아세틸화 다중성(즉, 8량체) 항원성 펩티드(MAP)였다[Rouppe van der Voort외 다수, FEMS Immunol. Med. Microbiol.(1997) 17:139-148]. 페르탁틴 영역 1 특이적 펩티드의 아미노산 서열을 도 2a에 나타내었다. 면역화에 시용되는 펩티드는 동일한 아미노산 서열을 함유하였으나, 단량체였다. 이러한 펩티드들은 S-아세틸메르캅토아세틸기와 함께 N-말단 연장되어[Drijfhout외 다수, Anal.Biochem.(1990)187:349-354], 파상풍 독소에 접합되었다[Brugghe외 다수, (1994), Int.J.Peptide Protein Res.43:166-172 ; 및 van der Ley외 다수, Infect.Immun.(1991)59:2963-2971]. 면역화에 사용된 대조군 펩티드-파상풍 접합체들은 수막염 구균 PorA로부터 유래된 것이었다.
1G. 면역블롯팅 :
비.페르투시스(균주 B391, B596, B647, B705, B935, B1120, B14 및 B24)의 세포 유리 추출물, 또는 정제된 MBP-융합 단백질을 Laemmli, Nature(Lond.)(1970)227:680에 기술된 바와 같이 나트륨 도데실 셀페이트-폴리아크릴아미드(10%) 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의하여 분석하였다. 30분 동안 5 mA/㎠를 적용시키는 전기블롯팅(Biometra 반건조 블롯팅)에 의하여 단백질을 니트로셀룰로즈 필터로 옮겼다. PBS중 0.5% 강화 무지방 건조 우유, 0.1% BSA 및 0.1% Tween 20으로 블로킹시킨후, 필터를 2 시간 동안 항혈청 또는 모노클로날 항체와 함께 항온처리하였다. 필터를 1% Tween(PBS-1% Tween20)을 함유하는 PBS에서 10분 동안 3회 세정한후, PBS중 호오스-래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 접합시킨 염소 항-토끼의 총 IgG와 함께 1 시간 동안 항온 처리하였다. 1% Tween20으로 보충된 PBS중에서 10분씩 2회 세정후 PBS중에서 10분 동안 세정하였으며, 필터를 ECL 기질(Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 항온처리하였으며, 방사능 사진 필름 시트(Hyperfilm-ECL)를 노출시켜 결합형 HRP를 눈으로 확인하였다.
1H. 에피토프 맵핑
폴리스페렌 96-웰 평판(Greiner ELISA)을 37℃에서 2시간 동안 PBS중 용해된 다량체 펩티드(2㎍/㎖)를 100㎕/웰로 코팅하였다. 평판을 TitertekPlus M96V 세정기를 사용하여 웰당 0.05% Tween20(PBST)으로 보충된 PBS 200㎕로 4회 세정하고, 실온에서 1 시간 동안 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, 시그마)으로 보충된 PBST와 함께항온처리하여 블로킹시켰다. PBST중 0.5% BSA로 희석된 모노클로날 항체(쥐과 동물)를 웰에 첨가하고 이를 37℃에서 2 시간 동안 항온처리한후 전술한 바와 같이 4회 세정하였다. 결합된 항체들을 HRP-접합된 항마우스 총 IgG(Cappel, Organo Technica)를 사용하여 검출하였다. 마우스 모노클로날 항체 부기준표분 키트(Isostrip, Boehringer)를 사용하여 마우스 IgG 하위군들을 측정하였다. BioTek 평판 판독기(EL312e, BioTek Instr.)을 사용하여 사멸율(OD450)을 측정하였다.
1I. 마우스의 면역화 및 감염
비.페르투시스 균주 B213(Tohama)(prn1), B1296(prn2) 또는 B1400(prn3)을 3일 동안 35℃에서 스트렙토마이신(30 ㎍/㎖)으로 보충된 BG 아가상에서 생장시켰다. 이후, 세균을 스트렙토마이신을 함유하지 않는 BG 아가 평판상에 도말하였다. 3일 경과후, 세균을 수집하여 이를 Verwey 배지(Verwey외 다수, J.Bacteriol.(1949)50:127-134)에 농도 5 ×108세균/㎖로 재현탁시켰다. 최종 현탁액의 분액을 희석시키고 도말하여 감염 접종원의 CFU를 측정하였다. 8마리의 암컷 BAL/c 마우스(RIVM 또는 Harlan) 군들을 면역화에 사용하였다. 수동 면역화시키기 위하여, 정제된 모노클로날 항체 250 ㎍을 4주령 마우스에 정맥내 주사하였다. 24시간 경과후 마우스를 감염시켰다. 능동 면역화 시키기 위하여, 3주령 마우스를 피하 면역화시켰으며, 감염전, 감염후 14일 경과시 및 28일 경과시에 20 ㎍ Quil A(Spikoside, Iscotec AB, Lulea, Sweden) 및 파상풍-접합 펩티드 50 ㎍ 함유 PBS0.5 ㎖를 주사하였다. 7개의 펩티드 혼합물을 사용할때, 12.50 ㎍의 4개의 펩티드 이외에, 동량의(즉, 6.25 ㎍) 각각의 펩티드를 백신에 첨가하였다. 마우스를 최종 면역화 이후 14일 경과시에 감염시켰다. 감염을 위하여 마우스를 에테르로 가볍게 마취시키고, 접종물 20 ㎕를 각 비공 상부에 적하시켜 실험 동물로 인하여 이를 흡입하도록 하였다. 마우스를 비.페르투시스 세포(총량 2 ×107)으로 감염시켰다. 감염후 3일 경과시 마우스에 바비튜레이트(Nembutal, Sanofi/Algin)를 과량으로 복강내 주사하여 마우스를 죽인후, 허파, 기관 및 혈액을 채취하였다. 세균의 콜로니 화를 측정하기 위하여, 10초 동안 20,000 rpm으로 포켓용 균질화기(Pro Scientific, Pro200)를 사용하여 900 ㎕ Verwey 배지중에서 허파를 균질화시켰다. 기관을 절개해낸 후 5개의 유리 펄스(지름 3 ㎜)를 사용하여 Verwey 배지 200 ㎕중에서 30초 동안 와류시켰다. 균질화물의 적당한 희석물을 스트렙토마이신(30 ㎍/㎖)이 보충된 BG 아가 평판상에 도말하였다. 35℃에서 4일 동안 항온 처리한후 CFU의 수를 계수하였다. 백신화에 사용된 항원에 대하여 유발된 혈청 항체 수준을 전술한 바와 같은 ELISA로 측정하였다. 평판을 파상풍 독소(2 ㎍/㎖) 또는 Prn1(2 ㎍/㎖)를 사용하여 코팅하였다. BioTek 평판 판독기(EL312e, BioTek Instr.)를 사용하여 사멸율을 측정하고 Kineticalc(KC4, BioLyse)를 사용하여 역가를 측정하였다.
1J. 블로킹 ELISA :
Berbers외 다수(1993), J.of Virological Methods 42:155-168에 기술된 바와같이 블로킹 Elisa를 수행하였다. 평판을 전술한 바와 같이 Prn1(2㎍/㎖)로 코팅시켰다. 세정 및 블로킹 이후, 22℃ 및 2 시간 동안 PBST중 0.5% BSA에 희석시킨 인간 혈청의 연속 2배 희석액 100 ㎕로 항온처리하였다. 인간 혈청을 2개의 공급원으로부터 분리하였다. 하나의 혈청은 최근 페르투시스로 감염되어 백신화된 어린이로부터 분리하였다. 혈청 샘플을 상기 질병이 발병한 이후 47일째에 취하였다. 제2 혈청 샘플은 최근에 감염된 몇몇 페르투시스 환자로부터 얻은 혈청의 혼합물을 포함하는 것으로서, 이는 완전히 백신화된 것이다. 상기 평판을 세정한 이후, 페르탁틴 특이적 쥐과 동물 모노클로날 항체들인 PeM7, PeM2, PeM5 또는 PeM6을 첨가한후 이 평판을 22℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 상기 평판을 철저히 세정한후, 이들을 전술한 바와 같이 전개시켜 결과를 판독하였다.
2. 결과
2A. 페르탁틴에 대한 모노클로날 항체의 특성 규명
당 업계에서는 유럽에 순환하고 있는 비.페르투시스 균주중에서 6개의 상이한 페르탁틴 유형들이 예전에 동정된 바 있다[Mastrantonio 외 다수 ; Mooi외 다수 (1998) 및 Mooi 외 다수, (1999), 상동]. 이들 페르탁틴 유형 사이의 변이는 주로 영역 1에 한정되며, 반복 단위인 GGxxP(도 1)에 결실부 및 삽입부를 포함한다. 본원에서, 영역 1의 다형성이 항체의 결합에 영향을 미치는지 즉, 항원 변이를 나타내는지 여부를 관찰하였다. 이 목적을 위하여, 페르탁틴 변이체 및 상이한 페르탁틴 변이체로부터 유래한 영역 1을 보유하는 MBP-융합 단백질을 사용하여 몇몇 모노클로날 항체들을 생성시켰다.
6개의 비.페르투시스 페르탁틴 유형 및 비.브론치셉티카 및 비.파라페르투시스와 밀접하게 관련된 종들로부터 유래된 상동성 단백질들에 모노클로날 항체가 결합하는지 여부를 면역블롯팅에 의하여 분석하였다. 겔상에 로딩된 페르탁틴의 양을, Tam 및 Zavala[1998 ; J.Immunol.Meth.124:53-61]에 기술된 일반적인 방법에 따라서, 페르탁틴의 보존부(즉, APQPPAGR, 영역 2에 인접하여 위치함)에 대하여 유발된 모노클로날 항체 E4D7을 사용하여 표준화하였다. 사용된 모든 균주의 페르탁틴 유전자들을 완전히 서열결정화하여 영역 1의 외부에서의 다형성을 동정하였다. prn1에 비하여, 비.브론치셉티카 및 비.파라페르투시스 페르탁틴 유전자들은 유전자의 전 길이(도시하지 않음)에 걸쳐서 아미노산 치환이 일어났음을 알 수 있었다. 그러나, 비.페르투시스내 prn6만이 영역 1의 외부에 다형성을 나타냈으며 ; prn1, 에 비하여, prn6은 아미노산의 제102번, 제337번, 제532번 및 제853번 위치에서 아미노산 치환이 일어났고, 영역 2에서는 3개의 아미노산이 결실되었음을 알 수 있었다(도 1). 테스트된 14개의 모노클로날 항체들중, 비.브론치셉티카 및 비.파라페르투시스로부터 유래된 페르탁틴과 교차 반응을 일으킨 것은 7개였다(표 2).
14개의 모노클로날 항체들중 2개(PeM5 및 PeM7)가 비.페르투시스 페르탁틴에 차등적으로 결합함을 알 수 있었다(도 3, 표 2). PeM5는 각각 Prn1에 대하여는 가장 많이 결합하였으며, Prn6에 대하여는 가장 적게 결합하였다. Prn2∼5에서는 중간 정도로 결합함이 관찰되었다. 이는 PeM5가 영역 1의 일부를 포함하는 에피토프를 인지한다는 사실을 나타내는 것이다. 영역 1에서 Prn1 및 Prn6는 하나의 아미노산(제268번 위치)이 상이하였는데(도 1), 이는 이 잔기들이 PeM5 에피토프의 구조중 일부임을 암시하는 것이다.
Prn1에 의하여 생성된 PeM7이 Prn1에 비하여 Prn6과 더욱 활발하게 반응을 하였음을 알 수 있었다. Prn2∼5에서는 약한 결합이 관찰되었다(도 3). Prn6을 재외하고, 상이한 페르탁틴 단백질들은 영역 1의 외부가 상이하지 않았기 때문에, 모노클로날 항체의 차등적 결합은 영역 1을 보유하는 에피토프의 인지에 의하는 것이다. PeM5 및 PeM7은 비.브론치셉티카 및 비.파라페르투시스로부터 얻은 페르탁틴과 결합하지 않았다(도 3). 모든 결과를 종합하였을때, 이러한 결과는 영역 1에서 항체 결합에 영향을 미치는 변이를 나타낸다는 것을 말해주는 것이다.
또한 영역 1에 모노클로날 항체가 결합하는 능력을 페르탁틴 변이체 Prn1∼5로부터 유래된 영역 1을 보유하는 MBP-융합 단백질을 사용하여 평가하였다. 결합 여부는 면역 블롯팅에 의하여 평가하였다. 테스트된 14개의 모노클로날 항체들중 7개(PeM3, PeM4, PeM68, PeM70, PeM71, PeM72 및 F6E5)가 융합 단백질에 결합하였으나, MBP에는 결합하지 않았다(표 2). MBP 융합 단백질에의 결합에 있어서, 상기 7개의 모노클로날 항체들 사이에서 양적인 차이점은 관찰되지 않았다. MBP 융합 단백질에 결합하지 않은 모노클로날 항체들은 영역 1의 외부에 위치하는 에피토프를 인지할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 모노클로날 항체들은 영역 1을 포함하는 구조적 에피토프를 인지할 수 있었는데, 이는 페르탁틴에 비하여, MBP 융합 단백질에 있어서 상이하게 폴딩되었다. 실제로, 이들 모노클로날 항체들의 유형 특이성이 페르탁틴의 영역 1에 결합하는 것을 나타내는 것임에도 불구하고, PeM5 및 PeM7은 MBP 융합 단백질에 결합하지 않는다. 중요한 것은, 이들 데이터가 원형 페르탁틴에대하여 생성된 모든(14개) 모노클로날 항체중 다수(8개)가 영역 1에 대하여 유발되는 것임을 나타내는 것인데, 이는 마우스에서의 면역지배적 영역을 나타내는 것이다.
2B. 에피토프 맵핑
전술한 모노클로날 항체들에 의하여 인지되는 에피토프를 나타내기 위하여, 영역 1(Pep1∼7 및 Pep10)에 해당하는 8개의 중첩 펩티드 세트를 사용하였다(도 2a). 융합 단백질에 결합하는 7개의 모노클로날 항체들(F6E5, PeM3, PeM4, PeM68, PeM70, PeM71 및 PeM72)도 펩티드에 결합하였다(도 2a). 모노클로날 항체 F6E5는 이미 RGD 및 GGxxP 반복부를 포함하는 128개의 아미노산의 페르탁틴 펩티드에 결합하는 것으로 보고되어 있다[Charles외 다수, Eur.J.Immunol.(1991), 21:1147∼1153]. 본원에서, F6E5는 펩티드 6 및 7(에피토프로서 서열 GGFGPVLDGW를 한정함)에만 결합한다는 것을 알 수 있었다. 이들의 펩티드에 대한 차등적 결합을 기초로 하였을때, 다른 모노클로날 항체의 에피토프들도 표시하여, 도 2b에 나타내었다. GGFGPGGFGP 및 GGFGP를 포함하는 에피토프들은 2개의 모노클로날 항체들에 의하여 각각 PeM3, PeM4 및 PeM71, PeM72에 의하여 인지되었다. PeM68 및 PeM70에 대한 에피토프들을 각각 GDAPAGGAVP 및 ATIRR로서 동정하였다. PeM5 및 PeM7은 상기 펩티드에 결합하지 않았는데, 이는 이들이 구조적 에피토프를 인지한다는 가정과 일치하는 것이다.
2C. 영역 1에 대한 항체들이 마우스 및 인간에서 유도됨
항체들이 페르탁틴 영역 1에 대하여 유도된다는 사실을 추가로 확인하기 위하여, 마우스를 Prn1으로 면역화하였으며, 생성된 항혈청을 면역블롯팅 및 ELISA로 테스트하였다(도 4). 항원으로서는 페르탁틴 변이체 Prn1∼5로부터 유래된 영역 1을 보유하는 MBP 융합 단백질을 사용하였다. 면역블롯팅에 의하여 모든 MBP-융합 단백질(MBP 제외)에 대한 마우스 항체들을 검출할 수 있었는데, 이는 영역 1에 대한 항체가 존재함을 나타내는 것이다(도 4a). 상이한 페르탁틴 영역 1 서열에 대한 항체의 역가를 ELISA에 의하여 측정하였다(도 4b). 그 결과, 이 혈청이 Prn1 단백질에 대하여 생성되었음에도 불구하고, MBP-Prn2에서 가장 많이 결합하였던 반면에, MBP-Prn1 및 MBP-Prn4에서는 가장 적게 결합하였음을 알 수 있었다. MBP-Prn3 및 MBP-Prn5에서의 결합 수준은 중간 정도였다. 결합 수준은 GGFGP 반복부의 수와 가장 밀접하게 상관되어 있는데(도 4b), 이는 Prn1으로 면역화된 이후 영역 1중의 선형 에피토프를 인지하는 항체의 상당량이 이 에피토프에 대하여 유발된다는 것을 나타내는 것이다.
인간 혈청이 MBP와 교차 반응하므로, 영역 1에 대한 항체들을 검출하는 MBP 융합 단백질을 사용할 수는 없었다. 따라서, 블로킹 ELISA를 사용하여 인간 혈청중 영역 1 특이적 항체들이 존재함을 관찰하였다. 이 분석법에서, 고정화된 Prn1에 결합하기 위하여, 인간 항체들이 (영역 1과 결합하는, 상기 참조) 모노클로날 항체 PeM7과 경쟁하는 능력을 평가하였다. 이 혈청 샘플을 최근에 비.페르투시스에 감염된 어린이로부터 취하였다. 몇몇 어린이로부터 유래된 풀링된 혈청에서 유사한 결과가 얻어졌다(도시하지 않음). PeM7이 Prn1에 결합하는 것은 투여량 의존적 방식으로 억제되었는데(도 5), 이는 영역 1에 대하여 유발된 인간 항체가 존재함을 나타내는 것이다. 모든 테스트된 페르탁틴 변이체에 존재하는 에피토프를 인지하는, PeM2의 결합(표 2)은 인간 항체에 의하여 억제되었다(도 5). 모노클로날 항체 PeM5는, 영역 1 포함 구조적 에피토프(상기 참조)와 결합하고, 또한 인간 항체와 경쟁한다는(도시하지 않음) 점에서, PeM7과 유사하다. 흥미로운 것은, 영역 1중 선형 에피토프(예, PeM4 및 F6E5)를 인지하는 모노클로날 항체들은 페르탁틴(도시하지 않음)과 결합하기 위하여 인간 혈청과 경쟁할 수 없다는 점이다. 이러한 결과들은 원형의 상태로서, 영역 1이 마우스 및 인간에서 항체를 생성시킨다는 것을 나타내는 것이다.
2D. 페르탁틴 영역 1로부터 유래한 펩티드는 보호적 면역성을 나타냄
영역 1이 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 마우스를 영역 1로부터 유래한 7개의 중첩 펩티드(pep1∼pep7, 도 2a)의 혼합물로 면역화하였다. 대조군중 마우스를 수막염 구균 펩티드(도 2a) 또는 PBS로 면역화하였다. Prn1을 사용한 면역화는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 페르탁틴 펩티드 및 수막염 구균 펩티드 모두를 파상풍 독소에 접합시켰다. 면역화되고 감염된 마우스의 혈청 샘플을 분석한 결과, 파상풍 독소에 대한 항체의 역가가 펩티드로 면역화된 두개의 군에서 모두 높았던 반면에(도 6a), 페르탁틴 펩티드 또는 원형 페르탁틴으로 면역화된 마우스만이 항페르탁틴 역가를 보유하였음을 알 수 있었다(도 6b). 페르탁틴 펩티드로 면역화된 마우스는, 수막염 구균 펩티드로 면역화된 군에 비하여 그 허파중에 세균이 35배 이하로 적었다(P = 0.0009, 도 6c). 페르탁틴 펩티드에 의하여 유도된 페르탁틴의 수준은 원형 페르탁틴에 의하여 이루어진 양보다6배 낮았다(P = 0.2968). 페르탁틴 펩티드로 인한 면역화는 기관에서 콜로니화 수준을 수막염 구균 펩티드로 인한 면역화의 경우보다 16배 감소시켰다(P = 0.0037, 도 6d). 허파에 대하여 관찰된 바와 같이, 페르탁틴 펩티드로 인한 면역화는 천연형 페르탁틴으로 인한 면역화의 경우에 비하여 그 효능이 약간(3배) 떨어졌다(P = 0.5278, 도 6d). 결론적으로. 기관 및 허파 모두에서, 영역 1로부터 유래된 펩티드는 보호성 면역화를 유도할 수 있었다.
2E. 영역 1에 대한 모노클로날 항체로 인한 수동적 면역화는 보호 작용을 제공한다.
영역 1에 대하여 유발된 모노클로날 항체가 감염에 대하여 보호 작용을 나타내는지 여부를 관찰하였다. 영역 1중 GGFGPGGFGP 서열에 결합하는 PeM4(상기 참조)를 세균 감염 24시간 이전에 정맥내 투여하였다. 대조군 마우스에 볼거리 바이러스에 대하여 유발된 모노클로날 항체 또는 PBS를 주사하였다. PeM4로 주사된 마우스는 비.페르투시스에 의한 허파의 콜로니화가, PBS가 주사된 마우스에 비하여 10배 낮았다(P<0.0001, 도 7). 볼거리 바이러스 모노클로날 항체에 의한 수동 면역화는 허파의 비.페르투시스 콜로니화를, PBS 대조군에서보다 감소시키지 못하였다. 기관에서 PeM4에 의한 콜로니화는 덜 감소하였으며, 몇몇 실험에 있어서는 콜로니화 정도가 약 2배 감소하였던 반면에, 나머지 실험에 있어서는 콜로니화 정도가 거의 감소하지 않았다(도시하지 않음). 이를 종합한 결과, 페르탁틴 영역 1에 대하여 유발된 면역 반응은 허파에서 보호 작용을 나타낸다는 결과를 확인하였다.
2F. 영역 1중 보존적 선형 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 상이한 페르탁틴 변이체로 인하여 균주에 대해 교차 보호 작용을 제공함
모노클로날 항체 PeM4는 페르탁틴의 모든 공지된 비.페르투시스 변이체에 존재하는 에피토프를 인지하였기 때문에(도 1 및 도 2b), 발현된 페르탁틴의 유형이 상이한 균주들에 대하여 PeM4가 보호 작용을 나타낼 수 있는지 여부를 측정하였다. 비.페르투시스 균주 B213(Prn1), B1296(Prn2) 또는 B1400(Prn3)으로 감염하기 이전에 마우스를 PeM4로 24시간 동안 면역화시켰다. 상기 균주로 감염하기 이전에 대조군 마우스에 PBS를 주사하였다. PeM4는 대조군 PBS에 비하여, 허파에서 Prn1, Prn2 및 Prn3을 발현하는 비.페르투시스 균주들의 콜로니화를 상당히 감소시켰는데(P ≤0.0015)(도 8), 이는 명백한 페르탁틴 변이체를 발현하는 균주에 대하여 동등하게 보호 작용을 나타내는 항체들을 생성시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 2
펩티드 GGAVP-GGFGP-GGFGP로 인한 마우스의 면역화
지금까지 모든 페르탁틴 변이체의 영역 1에서 GGAVP-GGFGP-GGFGP 서열이 동정되었다. 이 펩티드를 사용하여 마우스를 면역화시켜 이것이 비.페르투시스에 대한 보호 효과를 제공하는지 여부를 평가하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, GGAVP-GGFGP-GGFGP로 면역화된 마우스의 경우 허파에서의 콜로니화는 대조군(수막염 구균) 펩티드로 인한 백신화에 비하여 상당히 감소하였다(P = 0.0027). 네덜란드, 핀란드 및 이탈리아에 존재하는 2개의 우성 페르탁틴 유형(즉, 페르탁틴 제2형 및 제3형)의 영역 1에서 발견된 제2 펩티드 GGFGP-GGFGP-GGFGP는 또한 대조군 펩티드에 비하여 상당한 보호 효과를 제공하였다(P = 0.0023). 이러한 결과들은 영역 1에서 유래한 보존적 서열이 교차 보호성 항체를 유도할 수 있다는 사실을 제공하는 것이다.
Claims (19)
- 비.페르투시스 페르탁틴의 "영역 1"의 아미노산 서열의 6∼40개의 인접 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제1항에 있어서, 비.페르투시스 페르탁틴의 "영역 1"의 아미노산 서열의 10∼15개의 인접 아미노산 잔기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 6∼36개의 인접 아미노산 잔기들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제3항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 10∼15개의 인접 아미노산 잔기들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 반복부 GGFGP 또는 1 이상의 반복부 GGAVP로 이루어진 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체로서, 이 반복부의 총 수가 2∼10개인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 이의 유사체.
- 제1항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 비.페르투시스, 비.파라페르투시스 또는 이들 둘다에 대하여 보호 효과를 제공하며, 보호 효과의 10% 이상이 서열번호 5에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제1항 내지 제6항중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- 제1항 내지 제7항중 어느 하나의 항에 있어서, 길이가 6∼100 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 유사체.
- "영역 1" 또는 "영역 2"의 일부인 1 이상의 아미노산이 제거된 것을 특징으로 하는, 페르탁틴의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드.
- 제9항에 있어서, "영역 1" 또는 "영역 2"가 실질적으로 완전히 제거된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제9항에 있어서,a) 266∼290번 위치의 5개 이상의 아미노산 잔기가 제거되었거나 ; 또는b) 569∼603번 위치의 3개 이상의 아미노산 잔기가 제거된 것을 특징으로 하는, 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이의 자연 발생적 아미노산 서열 또는 합성 유사체 또는 변이체를 보유하는 폴리펩티드.
- 제11항에 있어서,a) 266∼290번 위치의 모든 아미노산 잔기가 제거되었거나 ; 또는b) 569∼603번 위치의 모든 아미노산 잔기가 제거된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제11항에 있어서,a) 서열번호 6의 260∼290번 위치의 아미노산 서열로부터 1 이상의 "GGAVP" 또는 "GGFGP" 반복부가 제거되었거나 ; 또는b) 서열번호 6의 569∼603번 위치의 아미노산 서열로부터 1 이상의 "PQP" 모티브가 제거된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제13항에 있어서,a) 모든 "GGAVP" 또는 "GGFGP" 반복부가 제거되었거나 ; 또는b) 모든 "PQP" 모티브가 제거된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제11항에 있어서, 다음의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 아미노산 서열이 결손된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.a) 제266번∼제290번 위치의 서열 ;b) 제270번∼제285번 위치의 서열 ;c) 제569번∼제603번 위치의 서열 ;d) 제572번∼제599번 위치의 서열 ;e) 제575번∼제596번 위치의 서열 ;f) 제578번∼제594번 위치의 서열 ;g) 제581번∼제591번 위치의 서열 ; 및h) 제584번∼제588번 위치의 서열.
- 제1항 내지 제15항중 어느 하나의 항에 정의된 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 다음의 성분들로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분들을 추가로 포함하는 것인 조성물.a) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 ;b) 면역학적 애쥬반트 ;c) 추가의 페르투시스 또는 파라페르투시스 항원 ; 및d) 인간에게 투여시 백일해 이외의 1 이상의 감염성 질병에 대하여 인간 또는 동물에서 보호 효과를 제공하는 항원.
- 포유 동물 감염성 질병에 대하여 비.페르투시스, 비.파라페르투시스, 비.브론치셉티카 또는 이들의 조합군및 추가의 1개 이상의 포유 동물 감염성 질병에 대한 백신을 제조하는데에 사용되는 제1항 내지 제15항중 어느 하나의 항에 의한 폴리펩티드의 용도.
- 제1항 내지 제15항중 어느 하나의 항에 의한 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체.
- 제18항에 정의된 항체를 포함하는 조성물로서, 다음의 성분들로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분들을 추가로 포함하는 것인 조성물.a) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 ;b) 면역학적 애쥬반트 ;c) 추가의 페르투시스 또는 파라페르투시스 항원 ; 및d) 인간에게 투여시 페르투시스 이외의 1 이상의 감염성 질병에 대하여 인간 또는 동물에서 보호 효과를 제공하는 항원.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20021230 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |