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KR20030031993A - 무세포 단백질 합성용 전사주형의 설계와 구축 및 이를이용하는 희석회분식 밀배아 무세포 단백질 합성방법 - Google Patents

무세포 단백질 합성용 전사주형의 설계와 구축 및 이를이용하는 희석회분식 밀배아 무세포 단백질 합성방법 Download PDF

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KR20030031993A
KR20030031993A KR10-2003-7002766A KR20037002766A KR20030031993A KR 20030031993 A KR20030031993 A KR 20030031993A KR 20037002766 A KR20037002766 A KR 20037002766A KR 20030031993 A KR20030031993 A KR 20030031993A
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KR
South Korea
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primer
cell
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KR10-2003-7002766A
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야에타엔도
다쮸야사와사키
토미오오가사와라
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야에타 엔도
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Abstract

범용성이 있고 번역주형활성이 높고, 구축이 간단한 무세포 단백질 합성용의 전사주형을 설계 및 구축하기 위한 3' 측 폴리머라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 프라이머(primer)로서, 벡터(vector)의 약제내성 유전자 등의 마커(marker) 유전자의 전사 터미네이터 서열과 복제개시부위(Ori)의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스(antisense)를 형성할 수 있는 각각의 벡터 고유의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 5' 측 PCR용 프라이머로서 1종류의 프라이머만을 이용하여 구축된 DNA로부터의 전사가 발생하지 않는다는 조건을 만족하는 2종류의 프라이머에 있어서, 프로모터의 5' 말단측으로부터 적어도 프로모터의 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 함유하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 이들을 이용하는 전사주형의 구축방법 등을 제공한다.

Description

무세포 단백질 합성용 전사주형의 설계와 구축 및 이를 이용하는 희석회분식 밀배아 무세포 단백질 합성방법{Design and construction of transcription template for synthesizing cell-free protein, and dilution batch-type method of synthesizing cell-free wheat germ protein by using the same}
게놈 프로젝트(genome project)의 완료를 눈 앞에 둔 현재, 연구과제의 중심이 유전자 구조해석으로부터 유전자 기능해석으로 급속히 전개되어 가고 있다. 세포 내에서 단백질은 그들 단독으로 기능하고 있는 것이 아니라 다종다양한 단백질 인자, 핵산, 저분자물질 및 세포막 성분 등과 함께 상호작용함으로써 기능을 발현하고, 이러한 상호작용의 총화로서 생물학적 기능이 영위되는 것으로 생각되고 있다.
포스트 게놈 프로젝트(post-genome project)의 중심과제의 하나는 다종다양한 단백질 인자의 복합체 구조와 기능과의 관계를 해석하는 것이다. 이로부터 얻어진 성과는 구조생물학 및 생화학을 비롯한 기초생물학 등의 연구 분야뿐만 아니라, 그 응용으로서의 의학분야에서의 유전자의 번역산물과 질병과의 관계 해명, 의약의 개발 및 생산에 이르는 넓은 분야에 극히 중요한 견해를 제공할 것으로 기대되고 있다.
세포 내에서 높은 효율로 진행하는 단백질 합성반응을 생체 외에서 수행하기 위한 방법으로서, 현재까지는 예를 들어 세포 내에 갖추어져 있는 단백질 번역장치인 리보솜 등을 함유하는 성분을 생물체로부터 추출하고 그 추출액에 번역주형, 기질이 되는 아미노산, 에너지원, 각종 이온, 완충액 및 그 외의 유효인자를 첨가하여 시험관 내에서 단백질을 합성하는 소위 무세포 단백질 합성 등의 연구가 활발히 이루어져 왔다(특개평6-98790, 특개평6-225783, 특개평7-194, 특개평9-291, 특개평7-147992).
이러한 무세포 단백질 합성을 위한 반응계, 즉 무세포 단백질 합성계에서 사용하는 단백질 합성용의 세포 추출액 또는 생체조직 추출액의 조제에는 대장균, 밀배아, 또는 집토끼의 망상 적혈구 등이 사용되고 있다. 무세포 단백질 합성계는 펩타이드의 합성속도와 번역반응의 정확성의 측면에서 볼 때, 생세포에 필적하는 성능을 보유하고 또한 복잡한 화학반응공정이나 번잡한 세포배양공정을 필요로 하지 않는 이점을 갖기 때문에, 현재까지 그 실용적인 시스템의 개발에 대한 연구가 이루어져 오고 있다. 그러나, 일반적으로 생물체의 세포로부터 추출한 세포 추출액은 그 단백질 합성능이 극히 불안정하기 때문에 단백질 합성효율이 낮고, 더욱이 보존 중의 세포 추출액의 품질저하 또한 현저하였기 때문에, 무세포 단백질 합성계에서 얻어진 합성물의 양은 방사성 동위체 표지 등에 의해 검출가능한 정도의 소량이었다. 이로 인하여, 무세포 단백질 합성계는 실용적인 단백질의 생산수단으로서는 이용될 수 없었다.
종래의 효율적인 무세포 단백질 합성방법으로는, Spirin 등에 의해 개발된 연속식 무세포 단백질 합성방법[Spirin, A., et al., (1993) Methods in Enzymology, 217, 123-142]을 들 수 있다. Spirin 등은 목적 유전자를 조합한 발현 플라스미드를 대장균, 밀배아 또는 토끼의 망상 적혈구로부터 조제한 세포 추출액을 이용하는 전사 및 번역공액 무세포 단백질 합성계에 첨가함으로써, 단백질을 높은 효율로 합성할 수 있다는 사실을 밝혔다. 특히, 대장균 추출액을 사용하는 전사 및 번역공액 무세포 단백질 합성계를 이용한 연속식 무세포 단백질 합성법에서는 반응계 1 mL 당 최대 1 mg 전후의 생산물을 얻을 수 있는 것으로 보고되어 있다.
그러나, 대장균을 이용하는 무세포 단백질 합성계는 목적유전자를 조합한 발현플라스미드를 주형으로 하여, 특히 당해 플라스미드를 환상형으로 이용하는 경우에는 높은 단백질 합성능을 발휘하지만, 직쇄 플라스미드나 폴리머라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction)(이하, PCR로 약칭한다)법에서 구축한 직쇄형 전사주형을 이용하면, 대장균 추출액에 혼입되어 있는 DNA 분해효소의 작용에 의해 2시간 정도의 단시간에 주형 DNA가 분해되기 때문에, 합성할 수 있는 단백질량은 종래의 회분법과 동일한 정도의 반응계 1 mL 당 수십 ㎍정도로 저하하는 결점이 있다. 이와 같이 종래의 방법으로 대장균, 밀배아 또는 토끼의 망상 적혈구 등으로 조제된 무세포 단백질 합성용의 세포 추출액 또는 조직 추출액에는 일군의 핵산분해효소, 번역저해 단백질 인자, 단백질 분해 효소 등이 혼입되어 있고, 그들의 작용에 의해 단백질 합성반응 중에 번역반응계의 활성손실 및 불활성화 현상이 발생한다[Ogasawara, T., et al., (1999) EMBO J., 18, 6522-6531]. 이 때문에, 어떠한 세포 추출액 또는 조직 추출액을 이용하는 단백질 합성계에서도 단백질 합성효율이 낮고 얻어진 단백질의 양이 적었다.
최근, 본 발명자들은 이들 무세포 단백질 합성계의 결점을 해결하는 방법, 즉 ① 무세포 단백질 합성용 세포 추출물 제제 및 무세포 단백질 합성방법(WO00/68412호 공보), ② 범용성 및 고효율 기능을 갖는 주형분자 및 이를 이용하는 방법(WO01/27260호 공보)을 제공하고, 밀배아 무세포 단백질 합성계에서의 단백질 합성효율을 현저히 상승시키는 데에 성공하였다. 본 발명자들이 개발한 밀배아 무세포 단백질 합성계에는 핵산분해효소와 번역반응 저해인자군이 포함되어 있지 않기[Madin, K., et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564](WO00-68412호 공보) 때문에, 현재까지는 곤란했던 직쇄 DNA를 전사주형으로 이용하는 고효율의 단백질 합성이 가능하게 되었다.
한편, 상기 고효율 밀배아 무세포 단백질 합성계에서 이용하는 전사주형의 조제는 종래의 PCR법을 이용하는 주형 DNA 구축법에 의해 이루어졌다. 이 방법에서는 프라이머(primer)로, RNA 폴리머라아제(RNA polymerase)의 인식 및 결합부위에 있는 벡터(vector)의 프로모터(promoter) 부위의 전역과, 번역증폭 및 mRNA의 안정화에 기여하는 구조와, 이들에 연결되어 목적 유전자의 단백질번역부위(open reading frame; ORF)의 일부까지를 포함하는 것을 이용하고 있다. 이와 같은 프라이머를 이용하여 목적으로 하는 유전자로부터의 무세포 단백질 합성용 전사주형을 구축하려는 시도가 계속되어 왔다. 이 때문에, PCR법을 이용하는 종래의 전사주형의 구축방법에서는 목적으로 하는 완전한 길이의 전사주형 외에도 반응 중에 생성된 비특이적인 DNA 증폭으로 인하여, 프로모터 서열을 갖는 단쇄의 DNA 단편이 축적한다. 이러한 DNA 단편을 제거하는 것이 곤란하기 때문에 상기 프라이머를 이용하는 PCR 산물을 전사주형으로 하여 RNA를 합성하면, 얻어진 분자의 대부분이 비특이적인 단쇄 DNA의 전사산물인 저분자 RNA가 된다. 이들 RNA 분자 중에는 5' 번역개시서열을 갖는 RNA 단편도 포함되어 있고, 그들이 mRNA로 인식되어 번역된 결과 목적유전자의 번역산물 이외의 저분자의 번역산물이 다량 발생하게 되고, 이로 인하여 얻고자 하는 번역산물의 수득량과 순도 저하가 초래되고 있다.
이와 같이 완전한 길이의 프로모터에 상보적인 염기서열을 갖는 5' 말단측 프라이머를 설계하고, 이를 이용하여 구축한 전사주형을 이용하는 종래의 번역주형의 구축방법은 목적으로 하는 유전자의 전사효율이 극히 낮을 뿐만 아니라 노이즈(noise)가 높은 번역주형을 제공한다는 결점을 갖고 있었다.
더욱이, 상기의 과정을 거쳐 구축한 전사주형을 이용하여도 종래의 회분식 밀배아 무세포 단백질 합성계를 이용하는 전사 및 번역 일체형에 의한 효율적인 단백질 합성은, 전사반응과 번역반응에 있어서 최적 마그네슘 농도가 현저히 다르다는 점에서 불가능한 것으로 알려져 있다. 또한, 전사기질의 잔존물인 4종류의 리보뉴클레오시드 삼인산(ribonucleoside triphosphate; 4NTPs) 및 부산물인 피롤린산(pyroline)이 번역반응을 강하게 저해하는 것도, 무세포 단백질 합성계의 효율이낮은 원인이었다.
게놈 프로젝트의 진행에 수반하여 현재에는 다수의 유전자 구조가 해명되어 있고, 수만 종류의 cDNA 복제품(clone)도 개발되어 오고 있다. 21세기의 기초과학 및 응용과학에 있어서 유전자의 기능과 구조의 해석, 프로테옴(proteome) 해석, 의약품의 개발 등을 향한 일보전진으로서, 우선 이 막대한 유전자 정보로부터 유전자 산물로서의 단백질을 높은 효율로 간편하게 합성해 낼 필요가 있다. 이를 위한 요소기술로서, ① 높은 번역주형 활성을 갖는 mRNA의 설계, ② mRNA 합성용의 전사주형 구축기술과, 이를 이용하는 간편한 ③ 무세포 번역기술을 확립하는 것이 기대되고 있다.
본 발명은 무세포 단백질 합성 시스템에 사용하는 번역주형을 유전자로부터 합성하기 위한 전사주형의 일반적인 설계원리와 그 구축 및 이 전사주형을 이용하는 간편하고 고효율의 밀배아 무세포 단백질 합성방법에 관한 것이다.
도 1은 실시예 1에 있어서 3' 말단 비번역 서열을 갖는 번역주형 활성이 높은 mRNA의 전사주형을 폴리머라아제 연쇄반응법(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 합성해 내기 위한 프라이머의 설계를 나타낸 도면이다. (a)는 단백질번역부위(open reading frame; ORF)로 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFR) 유전자를 이용한 pUC19 유래의 pEU의 구조로, PCR법에 의한 전사주형 구축용 프라이머를 나타낸다. (b)는 SP6 RNA 폴리머라아제에 의한 전사산물을 나타낸다. (c)는 이들의 mRNA를 이용한 회분식 밀배아 무세포 단백질 합성계에서의 단백질 합성을14C-류신의 수득량을 지표로 이용하여 측정한 결과를 나타낸다. 도면에서 Cap는 mRNA의 5' 말단에 7mGpppG를 부가하여 합성한 Cap가 부착된 mRNA이고, 원형 또는 환상 플라스미스를 전사주형으로 하여 구축한 mRNA이다.
도 2는 비교예 1에 있어서 종래의 방법으로 설계한 5' 말단측 프라이머를 이용하는 전사주형의 구축법과 그 전사산물 및 번역활성을 나타낸다. (a)는 전사주형 구축용의 주형인 플라스미드와 PCR용 프라이머의 모식도이다. (b)는 주요한 PCR 산물을 나타낸다. (c)는 PCR 산물로 얻어진 전사주형으로부터 SP6 RNA 폴리머라아제로 전사되는 것으로 예상되는 RNA 분자물질을 나타낸 모식도이다.
도 3은 비교예 1에 있어서 종래법으로 설계한 5' 말단측 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형으로부터 얻은 전사산물의 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동도이다. 각 레인은 세 종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(도면에 나타낸 바와 같이 번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 조합한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 mRNA를 나타낸다. 좌측 레인은 분자량 마커를 나타낸다. 별표는 완전한 길이의 전사산물을 나타낸다.
도 4는 비교예 1에 있어서 종래의 방법으로 설계한 5' 말단측 프라이머에 의해 구축한 전사주형으로부터 얻은 전사산물을 이용하여 무세포 단백질 합성을 실시한 후의 번역산물의 방사능 사진이다. 각 레인은 3종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(도면에 나타낸 바와 같이 번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 조합한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 전사산물로부터 번역된 전사산물을 나타낸다. 좌측 레인은 분자량 마커를 나타낸다. 별표는 완전한 길이의 전사산물을, 화살표는 저분자산물을 나타낸다.
도 5는 실시예 2에 있어서 RNA 폴리머라아제 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하는 전사주형의 구축법과 그 전사산물 및 그 전사활성을 나타낸다. (a)는 전사주형구축용의 주형인 플라스미드와 PCR용 프라이머의 모식도이다. (b)는 주요한 PCR 산물을 나타낸다. (c)는 PCR 산물로서 얻어진 전사주형으로부터 SP6 RNA 폴리머라아제로 전사되는 것으로 예상되는 RNA 분자물질을 나타낸 모식도이다.
도 6은 실시예 2에 있어서 RNA 폴리머라아제 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형으로부터 얻어진 전사물질의 아가로스 겔 전기영동도이다. 각 레인은 3종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(도면에 나타낸 바와 같이 도면에 나타낸 바와 같이 번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)을 각각 조합한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 mNA를 나타낸다. 좌측 레인은 분자량 마커이다.
도 7은 실시예 2에 있어서 RNA 폴리머라아제 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형으로부터 얻어진 전사산물을 이용하여 무세포 단백질합성을 행한 후의 번역산물의 방사능 사진이다. 각 레인은 3종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(도면에 나타낸 바와 같이 번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 조합한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 전사산물로부터 번역된 번역산물을 나타낸다. 좌측레인은 분자량 마커이다.
도 8은 실시예 2에 RNA 폴리머라아제 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형으로부터 전사시킨 mRNA를 이용하는 투석식 밀배아 무세포 단백질 합성방법에 의한 단백질 합성을 나타낸다. 각 레인은 3종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(도면에 나타낸 바와 같이 번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 조합한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 전사산물로부터 번역된 번역산물을 나타낸다. 좌측레인은 분자량 마커이다. 별표는 각 전사물질을 나타낸다.
도 9는 실시예 3에 있어서 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성법에 의한 단백질 합성을 나타낸다. (a)는 종래의 회분식(●-●)과 희석법(○-○)에 있어서14C-류신을 이용하여 단백질의 수득량에 대한 경과변화를 측정한 것으로, 종축의 방사능 카운트는 등량의 배아 추출액량에 대하여 나타낸 것이다. (b)는 얻어진 단백질의 방사능 사진이다.
도 10은 실시예 4에 있어서 전사 및 번역 일체형 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성법에 의한 단백질의 합성을 나타낸 것이다. (a)는14C-류신의 단백질에의 수득량의 경과변화를 측정한 것이다. 도면에서 작은 □-□, 중간 □-□, 큰 □-□는, 전사반응단계에서의 RNA 합성기질의 농도를 나타내고, 각각 1.5 mM, 2.5 mM, 3.0 mM이다. ●-●는 종래의 회분법, ○-○은 희석법을 나타낸다. (b)는 얻어진 단백질의 방사능 사진이다.
도 11은 cDNA 라이브러리로부터 단백질 라이브러리를 작성하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 3' 말단 비번역서열을 갖는 번역주형분자를 작성하기 위하여 전사주형을 폴리머라아제 연쇄반응법(polymerase chain reaction; PCR)으로 작성하는 경우에 사용하는 3' 말단측의 프라이머(primer)의 염기서열에 있어서, 유전자를 복제한 벡터의 약제 내성 유전자 등의 마커유전자의 전사터미네이터 서열과 일부 복제개시부위(replication origin; Ori)를 포함하는 서열과의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스(antisense)를 형성할 수 있는 염기서열을 갖는 염기서열(1), 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열(2), 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열의 주요부를 포함하는 염기서열(3), 상기 (1)~(3)의 어느 하나의 염기서열과 제한(stringent) 조건 하에서 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 염기서열, 또는이들의 상보적인 염기서열이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성법에서 이용하는 번역주형 분자를 작성하기 위한 전사주형을 PCR법으로 작성할 경우에 사용하는 5' 말단측의 프라이머의 염기서열에 있어서, RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열과 부분적으로 상보성을 갖는 염기서열을 포함하는 염기서열(4), 서열목록의 서열번호 2 또는 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열(5), 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 염기서열(6), 상기 (5) 또는 (6)의 염기서열을 주요부로 함유하는 염기서열(7), 상기 (4)~(7)의 어느 하나의 염기서열과 제한 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 염기서열, 또는 이들의 어느 하나와 상보적인 염기서열이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형분자를 작성하기 위하여 전사주형을 PCR법으로 작성하는 경우에 사용하는 5' 말단측의 프라이머의 염기서열에 있어서, 다른 2종류의 염기서열로 구성되는 2종류의 폴리뉴클레오티드(A), (B)를 5' 말단측의 프라이머로 이용하여 PCR에 의해 전사주형을 구축하는 방법에 있어서, 당해 2종류의 PCR용 프라이머의 염기서열은 당해 프라이머 중의 어느 1 종류만을 이용하여 구축되는 DNA로부터는 전사되지 않는다는 조건을 만족시키는 것이고, 당해 프라이머의 하나는 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프로모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 배열을 갖지만, 당해 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A)이고, 당해 프라이머의 다른 하나는 당해 프라이머의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B)인 것을 특징으로 하는 전사주형의 구축방법이다.
본 발명의 한 태양은 폴리뉴클레오티드(B)의 염기서열에 덧붙여, GA 또는 GAA 서열을 삽입하고, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 염기서열과, 또한 번역개시 코돈(codon) ATG, 혹은 목적으로 하는 단백질 번역부위(open reading frame; ORF)의 일부의 혹은 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부의 염기서열에 상보적인 염기서열을 결합한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 상기의 전사주형의 구축방법이다.
본 발명의 한 태양은 폴리뉴클레오티드의 번역부의 개시코돈과 ORF의 사이에, 히스티딘 태그(His-tag)나 글루타치온에스-트랜스퍼라아제(glutathion S-transferase), myb 등의 태그 혹은 에피토프(epitope) 합성용의 염기서열을 조합하는 것을 특징으로 하는 상기의 전사주형의 구축방법이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형분자를 작성하기 위한 전사주형을 PCR법을 이용하여 작성하는 방법에 있어서, 당해 전사주형의 5' 말단측의 프라이머로서, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드; 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열에 담배 모자이크 바이러스(tabacco mossaic virus) 유래의 오메가 서열과 번역개시 코돈인 ATG를 연결한 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드; 및 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열에 번역개시 코돈인 ATG와, 이에 연결하여 전사목적인 유전자 고유의 ORF의 5'말단측 염기서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;를 사용하고, 당해 전사주형의 3' 말단측의 프라이머로, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것을 특징으로 하는 전사주형의 구축방법이다.
본 발명의 한 태양은 전사주형을 PCR법으로 작성하기 위한 프라이머 세트에 있어서, 5' 말단측 프라이머로 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프로모터 기능 부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 당해 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A), 당해 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 함유하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B) 및 폴리뉴클레오티드(B)에 아닐링(annealing)할 수 있는 염기서열에 이어서 번역개시 코돈 ATG, 또는 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부분의 혹은 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부의 염기서열에 상보적인 염기서열을 연결하여 구성되는 폴리뉴클레오티드(C)와, 3' 말단측 프라이머로서 유전자를 클론화한 벡터의 약제내성 유전자 등의 마커 유전자의 전사 터미네이터 서열과 일부 Ori를 포함하는 서열의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스(antisense)를 형성할 수 있는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 한 태양은 폴리뉴클레오티드(B)가 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열에 이어서, GA 혹은 GAA 서열을 삽입하고, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 서열을 연결하고, 또한 번역개시 코돈 ATG, 또는 목적으로 하는 유전자의 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부(5' 말단측)의 염기서열에 상보적인 서열을 연결한 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드인 상기의 프라이머 세트이다.
본 발명의 한 태양은 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드; 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열에 담배 모자이크 바이러스 유래의 오메가 서열과 번역개시코돈인 ATG를 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열에 번역개시 코돈인 ATG와 여기에 이어서 전사목적인 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;를 5' 말단측의 프라이머로서 포함하고, 서열목록의 서열변호 1에 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 3' 말단측의 프라이머로 갖는 무세포 단백질 합성방법에 이용하는 번역주형 분자를 구축하기 위한 전사주형을 PCR에 의해 작성하기 위한 프라이머 세트이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성방법에서 이용하는 고효율 mRNA 합성용의 전사주형에 있어서, 상기의 어느 하나의 구축방법을 이용하여 작성된 전사주형이다.
본 발명의 한 태양은 무세포 단백질 합성법에서 이용하는 고효율 mRNA 합성용 전사주형에 있어서, 상기의 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 합성된 전사주형이다.
본 발명의 한 태양은 상기 어느 하나의 구축방법을 이용하여 작성된 전사주형 또는 상기 어느 하나의 전사주형으로부터 전사된 mRNA를 번역주형으로 이용하는 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 mRNA를 합성한 후 겔여과에 의해 정제하는 상기의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 상기 어느 하나의 구축방법으로 전사주형을 작성하고 전사용 용액을 이용하여 전사반응을 실시한 후에, 무세포 단백질 합성용 반응용액을 첨가하여, 첨가 후의 반응용액에서 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 동시에 당해 반응용액 중의 전사기질 및 전사 부산물의 농도를 저하시켜, 번역반응의 지속시간을 연장하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 연속형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은, 상기 어느하나의 구축방법으로 전사주형을 작성하고, 무세포 단백질 합성용 반응용액에 의해 전사반응을 수행한 후, 희석용액을 첨가하여 희석하고, 당해 반응용액에서 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 동시에 당해 반응용액 중의 전사기질 및 전사부산물의 농도를 저하시켜, 번역반응의 지속시간을 연장하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 일체형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 반응용기 중에 cDNA를 첨가하고, 상기 어느 하나의 전사주형의 구축방법을 실시하여 당해 반응용기 내에서 전사주형을 작성하고, RNA 폴리머라아제와 4종류의 리보뉴클레오시드 삼인산을 함유한 전사용 용액을 이용하여 전사반응을 실시한 후, 무세포 단백질 합성용 반응용액을 더욱 첨가하여, 반응용액 내의 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시켜 번역반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 연속형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 반응용기에 cDNA를 첨가하고, 상기 어느 하나의 전사주형의 구축방법을 실시하여 당해 반응용기 내에서 전사주형을 작성하고, RNA 폴리머라아제와 4종류의 리보뉴클레오시드 삼인산을 함유하는 무세포 단백질 합성반응용액을 가하여 전사반응을 실시한 후, 희석용액을 첨가하여 희석하고, 당해 합성반응용액 중의 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 번역 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 일체형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키는 즉, 마그네슘 농도를 약 1 mM 내지 약 6 mM로 저하시키는 상기 어느 하나의 무세포 단백질 합성방법이다.
본 발명의 한 태양은 밀배아 추출물을 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 어느 하나의 무세포 단백질 합성방법이다.
현재까지 개발되어 있는 무세포 단백질 합성계 중에서도 밀배아 추출물을 이용한 것은 대장균 추출물을 이용한 것에 비하여 특히 핵산분해효소 활성이 낮고, 또한 번역활성이 안정적이면서도 높은 특성을 갖기 때문에[Madin K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564], 플라스미드를 주형으로 하는 전사 및 번역 일체방식에서 고효율의 단백질 합성이 가능하다(WO00/68412호 공보).
이하, 본 발명을 밀배아 무세포 단백질 합성계 및 당해 합성계에서 기능할 수 있는 전사주형의 설계법과 구축법을 예를 들어 설명하지만, 본 발명의 기본원리는 여기에 예시한 방법에 한정되는 것이 아니며, 다른 미생물 및 동물 세포 유래의 세포 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성계 및 그에 이용되는 전사주형의 설계와 구축에도 응용될 수 있다.
(전사주형의 구축에 이용하는 프라이머(primer)의 구조)
본 발명자들은 미리 안정화시키고 효율화시킨 밀배아 추출액을 이용하는 무세포 단백질 합성계를 이용하여, 번역주형활성을 높이기 위하여 필요한 mRNA의 5' 및 3' 말단 비번역 구조를 개발하고 특허출원한 상태이다(WO01/27260호 공보). 특히, 장쇄의 3' 말단 비번역구조를 mRNA에 부착하는 것이 무세포 단백질 합성반응의 효율을 높이는 데에 매우 유효하다는 것을 명확히 하였다.
(1) 3' 말단측 프라이머의 구조
번역주형 활성을 증강하는 데에 유효할 뿐만 아니라 가능한 한 짧은 3' 말단 비번역 구조를 갖는 mRNA의 전사주형을 PCR법을 이용하여 구축하기 위하여, 모델유전자로서 해파리의 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자를 조합한 플라스미드[도 1의 (a) 참조]를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다.
PCR법에 의한 GFP 유전자의 전사주형 증폭용의 5' 말단측 프라이머에는, 「5' GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3'」의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 사용하였다.
3' 말단측 프라이머는 하기 3종류의 프라이머(도 1을 참조)를 사용하여 비교하였다. 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)은 약제 내성 마커 유전자(도 1에서는 Ampr)의 전사 터미네이터 서열과 DNA 복제개시부위(Ori)와의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스를 형성할 수 있는 염기서열이고, 프라이머-Ⅰ 및 Ⅱ는 참고서열이다.
프라이머-Ⅰ : 5' GGGAAGATAAACAGTATTTT 3' (mRNA 1 전사용)
프라이머-Ⅱ : 5' CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA 3' (mRNA 2 전사용)
프라이머-Ⅲ : 5' AGCGTCAGACCCCGTAGAAA 3' (mRNA 3 전사용)
검토 결과, 프라이머-Ⅲ가 전사주형 구축용의 3' 말단측 프라이머로서 가장 적합하고, 높은 전사주형활성을 갖는 mRNA를 얻기 위한 최적의 전사주형을 제공할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
무세포 단백질 합성방법에서 사용하는 번역주형분자의 3' 말단 비번역서열의 전사주형이 되는 염기서열을 PCR법을 이용하여 합성하기 위한 3' 말단측 프라이머로는 상기 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머-Ⅲ를 이용하는 것이 바람직하지만, 여기에 한정되는 것은 아니고 유전자를 클론화한 벡터의 약제내성 유전자 등의 마커 유전자의 전사 터미네이터 서열과 DNA 복제개시염기서열(Ori)를 일부 포함하는 서열과의 사이에 존재하는 염기서열, 예를 들어 각각의 벡터 고유의 염기서열과 안티센스를 형성할 수 있는 염기서열을 포함하는 염기서열로 구성되는 프라이머이어도 좋고, 특정의 염기서열을 갖는 것은 아니다. 예를 들어, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열의 주요부를 포함하는 염기서열, 이들의 염기서열과 제한 조건하에서 하이브리다이즈 가능한 염기서열, 또는 이들의 상보적인 염기서열로 구성되는 프라이머이어도 좋다. 여기서, 「제한 조건 하에서 하이브리다이즈한다」는 것은, 예를 들어, 6×SSC, 0.5% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS) 및 50% 포름아미드(formamide) 용액 내에서 42℃로 가온한 후, 0.1×SSC, 0.5% SDS의 용액 내에서 68℃로 세정하는 조건에서도 여전히 양성의 하이브리다이즈 시그널이 관찰되는 것을 의미하고, 예를 들어 Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 등에 기재된 방법에 의해 이와 같은 염기서열을 얻을 수 있었다.
본 발명에 관한 상기의 3' 말단측 프라이머를 이용하면, 번역주형활성을 증강하는 데에 유효할 뿐만 아니라 가능한 한 짧은 3' 말단 비번역구조를 갖는 mRNA의 전사주형을 PCR법을 이용하여 간단하게 얻을 수 있다. PCR법에서 장쇄 DNA를 증폭하는 것은 그 반응의 성질상 일반적으로 곤란한 경우가 많고, 그 때문에 종래에는 곤란했던 PCR법을 이용하여 장쇄 비번역영역이 부가된 mRNA의 전사주형을 구축하는 것이 본 발명에 의해 가능하게 되었다.
(2) PCR법에 의한 종래 방식의 5' 말단측 프라이머를 이용하는 전사주형의 설계 및 구축
모델 유전자로서 쥐의 간장 유래의 3종류의 cDNA(각각 18 kDa, 25 kDa, 44 kDa의 단백질을 코딩하는 것)와, GFP(27 kDa의 단백질)을 코딩하는 cDNA를 각각 플라스미드 pUC19에 복제한 것을 이용하였다.
첫번째 단계의 PCR에는 5' 말단측 프라이머로, 담배 모자이크 바이러스의 오메가(Ω)서열 유래의 염기서열(5' ACATTCTACAACTACA 3' ; 서열목록의 서열번호 5)을 갖는 하기 프라이머-3을 사용하였다. 아래에 나타낸 염기서열 중에서 밑줄 친 부분의 ATG는 ORF의 개시코돈이고, X는 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열을 나타낸다. 여기에서는 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열로 연속하는 19개의 뉴클레오티드로 구성되는 염기서열을 이용하였지만, X의 수는 약 13개~약 30개이어도 좋다.
프라이머-3 : 5' ACATTCTACAACTACA ATG XXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
PCR용의 3' 말단측 프라이머로는 상기 mRNA 3 전사용의 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)을 이용하였다.
두번째 단계의 PCR에는 5' 말단측 프라이머로, RNA 폴리머라아제의 프로모터 염기서열의 전영역에 대응하는 하기 프라이머-1과,
프라이머-1 : 5' GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3'
이 염기서열에 이어서 오메가 서열 및 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열(XXXXXXXXXXXXXXXXXXX, 19염기)을 포함하는 하기의 서열(프라이머-2)를 사용하였다. 여기서는 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측의 염기서열로서 상기의 각 cDNA의 5' 말단으로부터 연속하는 19개의 뉴클레오티드로 구성되는 염기서열을 이용하였지만, X의 수는 약 13개~약 30개이어도 좋다.
프라이머-2 : 5' GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACA
AACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX
X 3'
PCR용 3' 말단측 프라이머로는 상기 mRNA 3 전사용의 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)의 염기서열을 기본으로 하여 프로모터 서열 상에서 3염기만큼 겹치지 않도록 설계하여 작성한 하기의 프라이머-Ⅳ(서열목록의 서열번호 4)를 이용하였다.
프라이머-Ⅳ : 5' GTCAGACCCCGTAGAAAAGA 3'
(3) 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하는 전사주형의 설계 및 구축
노이즈의 발생이 적은 전사주형의 설계 및 구축에는 5' 말단측 프라이머로서, RNA 폴리머라아제의 프로머터 서열과 각각 부분적으로 상보성을 갖는 2종류의 다른 염기서열로 구성되는 프라이머를 설계하여 이용하였다. 당해 프라이머의 한 쪽은 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프로모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A), 예를 들어 하기 프라이머-①이고, 다른 방향은 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B), 예를 들어 하기의 프라이머-②이다. 즉, 상기 2종류의 프라이머는 각각 프로모터의 염기서열 중의 서로 다른 일부분의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 프로모터 서열분단형의 프라이머인 것이다. 당해 2종류의 프로모터 서열분단형 프라이머는 이들 모두를 이용하여 PCR에 의해 구축된 DNA로부터는 전사가 되지만, 당해 프라이머의 어느 하나만을 이용하여 구축된 DNA로부터는 전사되지 않는 것을 특징으로 한다. 여기서 예시한 프로모터 서열분단형 프라이머-① 및 ②는 SP6 프로모터 서열분단형의 프라이머이지만, 본 발명에 관한 프로모터 분단형의 프라이머는 이들에 한정되지 않고, 다양한 종류의 프로모터에 대해서 그들의 염기서열에 기초하여 작성될 수 있다.
프라이머-① : 5' GCGTAGCATTTAGGTGACACT3' (서열목록의 서열번호 2)
(밑줄 친 부분은 SP6 프로모터의 5' 말단측과의 상보적인 염기
서열이지만, 3' 말단측과의 상보적인 서열인 ATA를 제거한 것이
다).
프라이머-② : 5'GGTGACACTATAGAA (서열목록의 서열번호 3)
(밑줄친 부분은 SP6 프로모터의 3' 말단측과 상보적인 염기서열
이지만, 5' 말단측과의 상보적인 염기서열인 ATTTA를 제거한 것
이다)에 오메가 서열(71염기)과 클론화한 유전자 유래의 ATG가
연결되어 있다.
프라이머-③ : 상기 프라이머 3과 동일함.
모델 유전자로서 3종류의 쥐의 간장유래의 cDNA와, GFP를 코딩하는 cDNA를 각각 pUC19에 클론화한 것을 이용하였다. 첫 번째 단계의 PCR에서는 5' 말단측 프라이머로, 오메가 서열 유래의 염기서열인 5' ACATTCTACAACTACA 3'(서열목록의 서열번호 5)에 이어서 목적으로 하는 유전자의 번역개시코돈 ATG로부터 시작하는 22염기의 ORF의 5' 말단부와의 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머(전체 38염기)를, 3' 말단측 프라이머로는 mRNA 3 전사용의 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 4)를 이용하였다. 또한, 두 번째 단계의 PCR에서는 5' 말단측 프라이머로서 프라이머-① 및 ②를, 3' 말단측 프라이머로서는 상기 프라이머-Ⅳ(서열목록의 서열번호 4)를 이용하였다(프라이머의 몰비는 ①:②:Ⅳ=100:1:100이다). PCR은 반드시 2단계로 나누어 수행할 필요는 없고, 전체 공정을 1단계로 실시하여도 본 발명의 본질이 변하는 것은 아니다.
상기 종래 방식의 5' 말단측 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형과, 상기본 발명에 관한 프로모터 분단형의 5' 말단측 프라이머를 이용하여 구축한 전사주형에 대하여, 번역주형의 합성효율 및 무세포 단백질 합성의 효율을 비교하였더니, 프로모터 분단형 프라이머를 이용하는 편이 효율이 높았다. 프라이머-① 및 ②와 같은 프로모터 서열분단형의 프라이머는, 전사반응 후에 목적으로 하는 크기의 mRNA를 단리시키지 않고도 무세포 단백질 합성계에서 사용할 수 있는 5' 말단 비번역서열을 갖는 번역활성이 높은 mRNA의 번역주형을 PCR법에 의해 구축하는 데에 유용한 것이다. 즉, 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 PCR법에서 얻어진 전사주형으로부터 전사된 mRNA에는, 종래 형태의 프라이머를 이용하여 얻은 mRNA에 혼입하는 비특이적으로 발생하는 단쇄 mRNA가 거의 포함되어 있지 않다. 무세포 단백질 합성법에 있어서, 비특이적인 단쇄 mRNA는 목적으로 하는 단백질의 강력한 합성저해제로 작용하여 합성수득량을 현저히 저하시키는 원인이 되지만, 본 발명에 관한 번역주형을 사용하면 당해 단쇄 mRNA의 영향이 없기 때문에 무세포 단백질 합성을 효율적으로 수행할 수 있다. 또한, 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 PCR법으로 얻어진 전사주형으로부터 전사한 mRNA는 합성 후에 목적으로 하는 크기의 mRNA를 단리하지 않고 무세포 단백질 합성계에 사용할 수 있기 때문에, 간편하게 당해 mRNA의 합성 및 당해 mRNA로부터 단백질을 합성해 낼 수 있다.
상기 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형 분자합성용의 전사주형이 되는 DNA 염기서열을 구축하기 위한 5' 말단측 PCR용 프라이머의 염기서열은 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열과 부분적으로 상보성을 갖는 염기서열을 포함하는 염기서열, 서열목록의 서열번호 2 또는 서열목록의 서역번호 3에 기재된 염기서열,서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 염기서열, 이들 염기서열의 주요부분을 포함하는 염기서열, 이들 염기서열과 제한 조건에서 하이브리다이즈할 수 있는 염기서열, 또는 이들의 상보적인 염기서열일 수 있다.
본 발명에 관한 상기 5' 말단측 프라이머를 이용하면, 백그라운드가 되는 전사산물량이 최소한으로 억제되는 전사주형이 PCR법에 의해 간편하게 얻어진다. 상기 5' 말단측 프라이머를 이용하여 전사주형을 구축할 때에는, 예를 들어 상기 5' 말단측의 PCR용 프라이머의 염기서열인 다른 염기서열로 구성되는 2종류의 프라이머를 사용하면 좋다. 또한, 3' 말단측 프라이머로는 본 발명에 관한 상기 3' 말단측 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 2종류의 5' 말단측 프라이머는 어느 한 종류의 프라이머만으로 구축된 DNA로부터는 전사가 일어나지 않는다는 조건을 만족시키는 것으로, 당해 프라이머의 하나는 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프로모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A)이고, 당해 프라이머의 다른 하나는 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위의 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B)인 것이 바람직하다.
더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드(B)는 그 염기서열에 이어서 GA 혹은 GAA 서열이 삽입되고, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 서열과 번역개시 코돈 ATG, 또는 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부의 혹은 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부(5' 말단측)의 염기서열에 상보적인 서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드이어도 좋다. mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 염기서열은, 예를 들어 담배 모자이크 바이러스의 오메가 서열이나 알팔파 모자이크 바이러스(Alfalfa mosaic virus)의 리더 서열 유래의 염기서열(AMV), 이들을 직결로 결합한 AMV-오메가 서열, 또는 오메가 서열 유래의 29염기 오메가 서열 등을 예로 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고 번역증폭 기능을 부여할 수 있는 염기서열이면 어느 것이나 사용할 수 있다.
또는, 전술한 5' 말단측 프라이머로 상기 폴리뉴클레오티드(A)와 상기 폴리뉴클레오티드(B)에 더하여, 폴리뉴클레오티드(B)에 아닐링(annealing)할 수 있는 염기서열에 이어서 번역개시 코돈 ATG, 혹은 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부의 혹은 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부(5' 말단측)의 염기서열에 상보적인 염기서열을 연결하여 구성된 폴리뉴클레오티드(C)를 포함하는 3종류의 폴리뉴클레오티드를 이용할 수도 있다. 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부는 당해 ORF의 5' 말단으로부터 연속하는 약 13염기~약 30염기로 구성된 염기서열이다. 여기서, 폴리뉴클레오티드(B)는 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열에 이어서, GA 혹은 GAA 서열이 삽입되어, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 서열을연결하고, 번역개시 코돈 ATG, 또는 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부 또는 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부(5' 말단측)의 염기서열에 상보적인 서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일수도 있다.
또한, 상기 5' 말단측 프라이머의 번역부의 개시코돈과 ORF와의 사이에 히스티딘 태그(His-tag), 글루타치온에스-트랜스퍼라아제(glutathion S-transferase; GST) 혹은 myb 등의 태그 또는 에피토프 합성용의 염기서열을 삽입할 수 있다. 이러한 프라이머를 이용하여 작성한 전사주형을 이용하면, 최종적으로 얻어지는 번역산물에는 상기 태그 또는 에피토프가 당해 번역산물의 정제용 혹은 마커용 등으로 부가된다.
상기 2종류의 프라이머의 조합 또는 상기 3종류의 프라이머의 조합은 다양한 유전자에 대해서 그 전사주형을 작성하는 데 있어서, 범용성 있는 5' 말단측 프라이머로 사용할 수 있다. 이하, 프라이머의 조합을 프라이머 세트라고 한다. 또한, 상기 프라이머 세트에 부가하여 3' 말단측 프라이머로 유전자를 클론화한 벡터의 마커 유전자, 예를 들어 약제내성 유전자 등의 전사 터미네이터 서열과 일부 복제개시부위(Ori)를 포함하는 서열과의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스를 형성할 수 있는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 조합한 프라이머 세트는 다양한 유전자에 대해서 그 전사주형을 PCR에 의해 작성하는 데 있어서, 범용성 있는 유용한 프라이머 세트로 사용될 수 있다.
(전사 및 번역 일체형 희석방식 단백질 합성방법 및 전사·번역 연속형 희석방식 단백질 합성방법)
상기 본 발명에 관한 프라이머를 이용하여 PCR법으로 얻어진 전사주형을 이용하면, 간편하고 높은 효율로 단백질을 합성할 수 있다. 예를 들어, 상기의 원리와 방법으로 구축한 전사주형을 이용하여 합성한 mRNA를 번역주형으로 이용하고, 단백질 합성에 충분한 양의 밀배아 추출액을 함유하는 무세포 단백질 합성용 반응용액에 가하여 무세포 단백질 합성을 수행하면, 종래의 전사주형을 이용하여 합성한 mRNA에 의한 단백질 합성에 비하여 합성반응이 장시간 지속될 수 있다. 당해 전사주형으로부터의 mRNA의 합성에는 공지의 전사반응을 이용할 수 있다. 무세포 단백질 합성방법도 공지의 방법에 준하여 이루어질 수 있다[Madin K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564](WO00/68412호 공보). 또한, 합성한 mRNA를 겔여과 등의 방법으로 정제하여 이용하면 단백질의 합성효율을 더욱 상승시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 프라이머를 이용하여 PCR법으로 얻은 전사주형을 기존에 보고되어 있는 전사 및 번역 일체형에 의한 무세포 단백질 합성방법(WO00/68412호 공보)과 조합하여 단백질 합성을 수행하면, 별도로 전사하여 작성한 mRNA를 무세포 단백질 합성계에 첨가하는 번잡성을 회피할 수 있다. 당해 전사주형을 이용한 전사 및 번역 일체형 밀배아 무세포 단백질 합성방법에서는 우선 전사반응에 적합한 조건 하에서 전사반응을 수행한다. 바람직하게는 약 30℃~약 45℃, 보다 바람직하게는 약 35℃~약 40℃에서 전사반응을 수행한다. 그 후, 반응용액에 적당한 희석용액을 첨가함으로써 번역반응에 적합한 조건을 조성하고, 단백질 합성을 실시한다. 번역반응의 온도는 목적으로 하는 단백질에 따라 그 적절한 온도가 선택되는데, 바람직하게는 약 20℃~약 30℃이다. 또한, 희석용액은 번역반응에 필요한 에너지원 및 아미노산류 등을 가하여 조성된 번역반응에 적합한 완충액(buffer)이면 좋고, 적어도 당해 반응용액의 마그네슘 농도가 번역 최적 농도, 바람직하게는 약 1 mM~약 6 mM로 저감되도록 적당한 용량을 첨가한다. 희석용액을 첨가함으로써, 당해 반응용액에 함유되어 있는 전사기질 및 전사부산물의 농도를 동시에 저하시킬 수 있다. 이 결과, 단백질 합성반응의 지속시간을 연장시키는 것이 가능하게 되고 합성효율이 향상된다.
구체적으로는, 예를 들어 전사 및 번역 일체형 희석방식 무세포 단백질 합성법은, 우선 밀배아 추출물을 전체 용량의 48%로 하고(농도는, 200 A260nmunits/mL), 아래와 같은 최종 농도조성[1,000 units/mL 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor; RNAsin), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨(potassium acetate), 16 mM 아세트산마그네슘(magnesium acetate), 2.85 mM 디치오스레이톨(dithiothreitol), 0.5 mg/mL 크레아틴키나아제(creatine kinase), 2.5 mM 아데노신삼인산(adenosine triphosphate; ATP), 2.5 mM 구아닌삼인산(guanine triphosphate; GTP), 2.5 mM 우라실삼인산(uracil triphosphate), 2.5 mM 시토신삼인산(cytosine triphosphate), 1500 unit/mL의 SP6 RNA 폴리머라아제, 16 mM 크레아틴인산(creatine phosphtae), 1.48 mM 스퍼미딘(spermidine), 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM), 25 ㎍/mL의 전사주형인 DNA]을 갖는 반응용액을 조제하여 30℃에서 3시간 동안 전사반응을 수행한다. 그후, 반응액을 희석용액으로 희석한다. 희석용액은 예를 들어, 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 0.4mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 0.94 mM ATP, 0.25mM GTP, 16 mM 크레아틴 인산, 0.380 mM 스퍼미딘, 20 종류의 L형 아미노산(각 0.3mM)로 구성된다. 이와 같은 희석에 의하여, 주성분의 농도는 아래와 같이 변화된다. 즉, 밀배아 추출액은 원액의 8%(원액농도는, 200 A260nmunits/mL), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 3 mM 아세트산마그네슘, 1.2 mM ATP 등이다. 또한, GTP, UTP, CTP에 대해서는 전사반응에서의 소비량이 불명확하기 때문에, 희석 후의 각 농도는 특별히 계산하지 않는다.
상기 전사 및 번역 일체형 희석방식 무세포 단백질 합성법에서는 번역반응에 필요한 세포 추출물인 밀배아 추출물을 반응개시 초기부터 반응용액에 첨가하기 때문에 당해 추출물은 전사반응시에도 존재하고 있다. 당해 추출물을 반응초기부터 반응용액에 첨가할 필요는 없고, mRNA 합성 후에 희석용액을 가하는 때에 최종농도가 번역반응에 적절한 농도에 이르도록 희석용액과 동시에 또는 희석용액에 혼합하여 무세포 단백질 합성계에 첨가하여도 좋다. 여기서는 이 방법을 전사 및 번역 연속희석방식 무세포 단백질 합성방법이라 하기로 한다.
전사 및 번역 일체형 또는 전사 및 번역 연속형의 희석방식 무세포 단백질 합성방법은 복잡한 조작을 거치지 않기 때문에 간편하고, 또한 PCR법으로 구축한 전사주형을 직접 이용하므로 무세포계에서의 고효율의 단백질 합성을 가능하게 한다. 또한, 목적으로 하는 유전자 산물을 히스티딘 태그나 글루타치온에스-트랜스퍼라아제와의 융합 단백질로 합성하면, 이들에 대한 리간드(ligand)의 고정화물을 이용함으로써 유전자 산물을 효율적으로 정제할 수 있다.
예를 들어 도 11에 나타낸 바와 같이, 전체 유전자에 공통적으로 이용할 수 있는 상기 본 발명에 관한 범용성을 갖는 프라이머 세트(5' 말단측의 3종류와 3' 말단측의 1종류)를 사용하여, 한 번에 다종의 단백질을 전사 및 번역 일체형 또는 전사 및 번역 연속형의 희석방식 무세포 단백질 합성방법에 의해 간편하고 효율적으로 합성할 수 있다.
우선 반응용기에 cDNA를 가한다. 이 때, 반응용기로 예를 들어 96웰 타이타 플레이트 등의 시판되고 있는 멀티웰 타이타 플레이트를 이용하여 각 웰마다 다른 종류의 단백질을 코딩하는 cDNA를 넣음으로써, 다양한 종류의 단백질을 동시에 합성할 수 있다. 이와 같이 멀티웰 타이타 플레이트의 각 웰에 다른 종류의 cDNA를 넣은 것은 cDNA 라이브러리로도 사용할 수 있다. cDNA 라이브러리는 시판되는 것을 이용하여도 좋다. 상기 cDNA 라이브러리에 상기 프라이머 세트를 첨가하여 PCR법을 수행하면, 그 결과로 전사주형이 형성된다.
그 후, 전사 및 번역 일체형 희석방식 단백질 합성방법을 실시할 때에는, 각 반응용기 중에 RNA 폴리머라아제, 4NTPs, 밀배아 추출물 등을 함유하는 무세포 단백질 합성용 반응용액(예를 들어 후술하는 실시예 5를 참조)을 가하여, 온도를 약 30℃~약 45℃, 바람직하게는 약 35℃~약 40℃로 유지하고 전사반응을 소정 시간동안 실시한다. 그리고, 희석용액을 첨가하여 마그네슘 농도를 번역반응에 적절한 농도까지 저감시킨 후, 온도를 약 20℃~약 30℃로 유지하여 번역반응을 실시한다.그 결과 번역산물인 단백질을 얻을 수 있다.
전사주형 작성 후에 전사 및 번역 연속형 희석방식 단백질 합성법을 실시하는 때에는, 각 반응용기 중에 RNA 폴리머라아제, 4NTPs 등을 함유한 전사용 용액(예를 들어 후술하는 실시예4를 참조)를 가하여, 온도를 약 30℃~약 45℃, 바람직하게는 약 35℃~약 40℃로 유지하고 전사반응을 소정 시간동안 실시한다. 그 후, 밀배아 추출물 등을 함유한 무세포 단백질 합성반응용액(예를 들어 실시예 4를 참조)을 가하고, 온도를 약 20℃~약 30℃로 유지시키면서 번역반응을 실시한다.
또한, 상기와 같이 전사용 용액 중에서 전사반응을 소정 시간 실시한 후, 번역주형이 형성된 전사반응 후의 용액을 미리 상기의 무세포 단백질 합성용 반응용액을 첨가하여 둔 별도의 반응용기, 예를 들어 멀티웰 타이타 플레이트에 전사반응 후의 용액을 하부에 위치시키고, 당해 무세포 단백질 합성반응용액이 상층에 위치되도록 조용히 중층시킴으로써, 무세포 단백질 합성반응을 실시할 수도 있다. 이 방법에서는 상층과 하층의 사이에 형성된 계면에서 두 층의 용액 내에 함유된 물질이 확산되어, 서서히 상층과 하층이 서로 섞이게 된다. 그 때문에, 연속적으로 번역반응이 서서히 진행되고 장시간에 걸친 단백질 합성이 가능하게 되는 것이다.
이상, 본 발명에 의해 현재까지는 곤란했던 PCR법을 이용하는 간편하고 효율적인 무세포 단백질 합성이 밀배아 고효율 무세포 단백질 합성계, 본 발명에 관한 mRNA 전사부형 구축방법, 및 전사 및 번역 일체형 희석방식 무세포 단백질 합성방법 또는 전사 및 번역 연속형 희석방식 무세포 단백질 합성법을 이용함으로써, 최초로 가능하게 되었다. 또한, 프로모터 부위, 번역증폭구조 및 ORF의 일부까지를포함하는 종래의 프라이머를 이용하여 구축한 무세포 단백질 합성용 주형 DNA를 이용하면, 목적 유전자의 번역산물 이외에 다량의 저분자의 번역산물이 생성되기 때문에 번역효율이 낮았지만, 본 발명에 의해 이 결점을 해소할 수 있었다. 상기 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하는 PCR법에 의한 무세포 단백질 합성용 전사주형의 구축원리는 밀배아 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성계에만 한하지 않고, 대장균 등의 다른 세포 추출물을 사용하는 무세포 단백질 합성계에 있어서의 주형설계의 원리로도 이용할 수 있다.
본 발명에 의하면 어느 벡터에 클론화된 유전자에 있어서도 그 유전자에 상보적인 서열을 갖는 5' 말단측과 3' 말단측의 고유의 프라이머를 준비하면, 전체 유전자에 공통으로 이용가능한 범용성을 갖는 상기의 프라이머 세트를 이용하여, 클론화한 임의의 유전자에 대해서도 간편하게 고효율의 무세포 단백질 합성이 가능하게 된다. 따라서, 본 발명은 게놈프로젝트 완료와 함께 얻어질 막대한 수의 유전자의 기능해석 및 구조해석 등의 기반이 되는 유전자 산물(단백질)의 생산을 위한 기본적인 요소기술을 제공하는 것이다.
이하, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 전사주형 구축용 프라이머의 설계와 번역주형 활성이 높은 mRNA의 구축(mRNA의 3' 말단 비번역 서열 합성에 착안한 전사주형구축법)
번역주형활성을 증강하는 데에 유효할 뿐만 아니라, 가장 짧은 3' 말단 비번역구조를 갖는 번역효율이 높은 mRNA를 얻기 위하여, PCR법을 이용하여 전사주형을구축하였다.
PCR법에서 이용하는 주형으로는 도 1의 (a)에 나타낸 밀배아 무세포 단백질 합성계용의 플라스미드로 개발한 pEU(WO01/27260호 공보)에 해파리의 GFP 유전자를 통상의 방법에 따라 클론화한 것을 이용하였다. 이 플라스미스드의 구조는 5' 말단측 상부에 SP6 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열, 이어서 번역개시반응 서열인 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 오메가 서열, 이어서 GFR 유전자를 연결하여 구성되어 있고, 3' 말단측 하부에는 복제개시점(Ori), 그 하부에는 마커 유전자로서 암피실린(ampicillin) 내성 유전자(Ampr)가 삽입되어 있다[도 1의 (a)].
본 실시예에서 이용한 5' 말단측 프라이머는 SP6 프로모터 서열을 포함하는 프라이머(5' GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3')이고, 3' 말단측 프라이머는 프라이머-Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)이다[도 1의 (a)]. 이하에 그들의 서열을 나타낸다. 이들의 프라이머는 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)사에 의뢰하여 작성하였다.
프라이머-Ⅰ : 5' GGGAAGATAAACAGTATTTT 3' (mRNA 1 전사용)
프라이머-Ⅱ : 5' CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA 3' (mRNA 2 전사용)
프라이머-Ⅲ : 5' AGCGTCAGACCCCGTAGAAA 3' (mRNA 3 전사용)
상기 해파리 GFP 유전자를 삽입한 pEU를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 아래와 같은 조건 하에서 PCR을 수행하였다.
PCR 반응용액
1× ExTaq 버퍼
200 uM 디옥시리보뉴클레오시드 삼인산(deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP)
10 nM 프라이머(5' GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3')
10 nM 프라이머-Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ
0.025 U ExTaq DNA 폴리머라아제
50 pg/uL 주형 플라스미드 DNA
PCR의 반응조건
98℃에서 1분간
↓
(98℃에서 10초간 →60℃에서 30초간 →72℃에서 5분간)을 30 사이클
↓
72℃에서 4분간
↓
4℃
이어서, 상기에서 얻어진 PCR 산물을 전사주형으로 이용하고 SP6 RNA 폴리머라아제를 이용하여, 하기와 같이 조제한 전사용 용액을 37℃에서 2시간 반응시킴으로써 전사산물인 mRNA를 얻었다.
[표 1] 전사용 용액(mRNA 용액)
(uL) 농도
PCR 산물 2.5 0.4 uL/uL
5×버퍼 5 1×
25 mM NTPs 3 3 mM
111 U/uL RNase 저해제 1 4.4 U/uL
50 U/uL SP6 RNA 폴리머라아제 0.75 1.5 U/uL
이온교환수(Milli Q) 12.75
합계 25
또한, 여기서 이용한 5×버퍼의 조성을 이하에 나타낸다.
5×버퍼(1×의 농도)
400 mM HEPES-KOH pH 7.6 80 mM
80 mM 아세트산마그네슘(magnessium acetate) 16 mM
10 mM 스퍼미딘(spermidine) 2 mM
50 mM 디치오스레이톨(dithiothreitol) 10 mM
도 1의 (b)에는 상기와 같이 설계하여 구축한 전사주형으로부터 전사된 다른 염기수의 3' 말단 비번역서열을 갖는 mRNA 분자를 모식도로 나타내었다. mRNA 1은 프라이머-Ⅰ을 이용하여, mRNA 2는 프라이머-Ⅱ를 이용하여, mRNA 3은 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)을 이용하여 구축된 것이다.
도면의 Cap는 mRNA의 5' 말단에 7mGpppG를 부가하여 합성한 Cap 부착 GFP mRNA이고, mRNA 2용의 프라이머-Ⅱ를 이용하여 구축하기 때문에 561염기의 3' 말단 비번역서열을 갖는다. 또한, 동일 도면의 원형 또는 환상 플라스미드를 전사주형으로 구축한 GFP mRNA이고, 주로 1,900염기 또는 5,900염기로 구성되는 2종류의 장쇄의 3' 말단 비번역서열이 포함되어 있다. 이들은 WO01/27260호 공보에 이미 개시되어 있는 방법에 따라서 작성하고, 각각 실험적 대조로서 무세포 단백질 합성반응에 이용하였다.
회분식 밀배아 무세포 단백질 합성계에서 3시간의 번역반응 후에 상기에서 구축한 전사주형을 이용하여 얻어진 mRNA의 번역주형의 활성을 조사하였다. 당해 번역반응은 Madin 등의 방법[Madin, K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564] 및 WO00/68412호 공보에 기재된 방법에 따라서 실시하였다. 또한, 단백질 합성은14C-류신의 수득량을 지표로 하여 측정하고, 종축의 방사능 카운트는 등량의 배아 추출액량에 대하여 나타내었다. 그 결과, 도 1의 (c)에 나타낸 바와 같이 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)을 이용하여 구축한 주형으로부터 전사한 mRNA 3(5' 말단은 오메가 서열, 3' 말단에 1,896염기의 비번역서열을 갖는 GFP mRNA)가 높은 번역효율을 갖는 것으로 나타났으며, 그 효율은 Cap 부착 mRNA나 원형플라스미드로부터 전사한 장쇄의 3' 말단 비번역서열을 갖는 mRNA에 필적한다는 것이 판명되었다.
즉, 밀배아 무세포 단백질 합성계에서 이용하는 mRNA에 3' 말단 비번역배열을 부가하기 위한 전사주형이 되는 DNA 염기서열의 구축에는, 예를 들어 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)의 염기서열과 같이 유전자를 복제화한 벡터의 암피실린 내성유전자의 전사 터미네이터 서열과 Ori 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스를 형성할 수 있는 염기서열을 프라이머로 설계하여 이용하는 방법이 유효한 것으로판명되었다.
비교예 1 : 전사주형구축용 프라이머의 설계와 전사주형의 PCR에 의한 구축(종래의 방법에 의한 전사주형구축법)
PCR법을 이용하여 5' 및 3' 말단 비번역 구조를 갖는 mRNA의 전사주형을 얻기 위하여, PCR에 이용하는 프라이머를 설계하고 구축하였다.
mRNA의 5' 말단 비번역구조로는 공지의 WO01/27260호 공보에 개시된 바와 같이, 알팔파 모자이크 바이러스(AMV) 유래의 염기서열, 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 오메가 서열, 이들을 직렬로 결합시킨 AMV-오메가 서열, 또한 오메가 서열을 짧게 자른 29염기 오메가 서열을 mRNA에 부가하는 것이, 무세포 단백질 합성반응의 효율상승에 매우 효과적이다. 본 비교예에서는 이들 5' 말단 비번역구조 중에서 TMV 오메가 서열을 5' 말단 비번역서열로 채택하여 이용하였다. 3' 말단 비번역서열로는 상기 실시예 1에 나타낸 1,896염기로 구성된 서열을 이용하였다(도 1 참조).
우선, 전사주형의 5' 말단서열구축법으로써 널리 사용되고 있는 3종류의 프라이머를 이용하는 종래의 PCR법에 대해서 검토하였다(도 2). 도 2의 (a)에는 여기서 시험해 본 PCR법의 개략에 대해서, 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드의 구조, 5' 말단서열 구축용의 3종류의 프라이머(프라이머-1, 2, 3)과 3' 말단서열 구축용의 프라이머-Ⅲ을 모식도로 나타낸 것이다. 프라이머-1, 2 및 3의 염기서열을 아래에 나타낸다. 프라이머-3의 염기서열 중, X는 목적으로 하는 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열을 의미한다. 프라이머-Ⅲ은실시예 1에서 이용된 것과 동일한 것이다. 이들 프라이머는 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 작성되었다.
프라이머-1 : 5' GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3'
프라이머-2 : 5' GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACA
AACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX X 3'
프라이머-3 : 5' ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
전사주형 구축용의 주형으로는 pUC19에 cDNA 라이브러리에서 선택한 유전자를 삽입한 플라스미드를 이용하였다. 플라스미드는 쥐의 간장 유래의 3종류의 cDNA 및 GFP 유전자(번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 실시예 1과 동일한 방법으로 조합한 것이다. 상기 프라이머를 이용하는 PCR을 실시예 1과 동일하게 수행하고, 얻어진 PCR 산물을 전사주형으로서 실시예1과 동일하게 실험적으로 전사반응을 2시간 실시하여 전사산물을 얻었다.
도 2의 (b)에는 종래의 PCR법으로 얻어진 주요한 증폭산물과 비특이적으로 생성된 단쇄 DNA 부산물을, 또한 (c)에는 당해 증폭산물을 그대로 전사주형으로서 이용하여 합성된 전사산물을 모식적으로 나타내었다. 도 2의 (c)에서 (1)로 나타낸 mRNA는 완전한 길이의 mRNA이므로, 완전한 길이를 갖는 번역산물을 제공하는 것이 가능하고, (2)에 나타낸 mRNA는 저분자번역산물을 제공하고, (3)에 나타낸 mRNA는 오메가 서열이 없기 때문에 번역주형 활성은 없다. 전사반응에 있어서 생화학적 특성을 고려하면, 합성된 RNA 분자의 대다수는 DNA 장쇄의 짧은 PCR산물 유래인 것으로 예상된다.
도 3에는 상기 전사산물에 대해서 통상의 방법에 따라서 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타내었다. 각 레인은 3종류의 cDNA 또는 GFP 유전자(번역산물의 분자량은 25 kDa, 18 kDa, 44 kDa 및 27 kDa)를 각각 삽입한 주형 플라스미드로부터 작성한 전사주형을 이용하여 얻은 전사산물, 즉 mRNA를 나타내었다. 또한, 별표는 완전한 길이를 갖는 전사산물을 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 ORF가 큰 유전자일수록 그 전사효율이 낮고, 이 방법으로 전사된 산물의 대부분은 저분자 RNA이기 때문에 PCR법에 의해 비특이적으로 생성된 단쇄 DNA 분자물질은 프로모터 서열을 포함하고 있다. 이 사실은 상기 도 2의 (b) 및 (c)에 기초한 예측과 잘 일치하는 결과인 것이다.
다음으로, 상기 각각의 전사산물로부터 목적으로 하는 크기의 mRNA를 단리하지 않고, 전사산물을 탈염 후에 밀배아 무세포 단백질 합성계에 첨가하여 3시간 동안 반응시켜 번역산물을 얻은 후, 이를 일반적으로 사용되고 있는 자기방사표지법(autoradiography)을 이용하여 검출하였다[Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230][Madin K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564]. 번역반응은 상기[Madin K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564] 및 WO00/68412호 공보에 기재된 방법에 따라서 실시하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 별표로 표시한 바와 같이, 각각의 mRNA량에 대응하는 소량의 번역산물을 확인할 수 있었다. 번역산물 중에서 전사산물량이 많은18 kDa 단백질(도 3을 참조)의 합성량이 높은 반면, 대부분의 번역산물이 도 4의 화살표로 나타낸 SDS-폴리아크릴아미드겔의 저분자 영역에서 분리되는 저분자물질이었다. 이로부터, 저분자의 전사산물 중에는 5' 말단의 번역개시 증강구조인 오메가 서열과 ORF의 5' 말단측의 일부를 보유하지만, ORF의 3' 말단측을 제거한 mRNA의 함량이 높은 것을 알 수 있다. 이들 mRNA 단편은 번역개시인자와 강한 친화성을 갖기 때문에, 목적 단백질의 강력한 합성저해제로서 작용하고 전사산물의 수득량을 현저히 저하시키는 원인이 된다.
실시예 2: 고효율 전사주형 구축용 프라이머의 설계와 PCR에 의한 고효율 전사주형의 구축(전사주형의 RNA 폴리머라아제 프로모터 서열에 착안한 전사주형 구축법)
비교예 1에 나타낸 종래의 방법에 기초한 프라이머의 설계방법으로는, 전사반응 후에 목적으로 하는 크기의 mRNA를 단리시키지 않고 무세포 단백질 합성계에서 사용가능한 5'말단 비번역서열을 갖는 번역활성이 높은 mRNA의 전사주형을 PCR법에 의해 구축하기 위하여 유효한 프라이머는 얻을 수 없다. 따라서, RNA 폴리머라아제의 성질을 충분히 활용하는 원리 즉, RNA 폴리머라아제는 완전한 염기서열로 구성되는 프로모터 구조를 인식하지만 불완전한 염기서열로 구성되는 것은 인식하지 못한다는 사실에 기초하여, 이 유효한 프라이머를 설계하여 작성하고 또한 당해 프라이머를 이용한 전사주형의 구축방법을 실시하였다(도 5).
도 5의 (a)에는 여기서 시험해 본 PCR법에서 이용하는 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드의 구조, 5' 말단서열 구축용의 3종류의프라이머(프라이머-①, ②, 및 ③)과 3' 말단서열 구축용의 프라이머-Ⅲ을 모식도로 나타내었다. 각 프라이머의 염기서열을 아래에 나타낸다. 이들 프라이머는, 실시예 1과 동일한 방법으로 작성하였다. 여기서 설계한 프라이머-①은 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프러모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 당해 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 것이고, 프라이머-②는 당해 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 함유하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않기 때문이다. 즉, 프라이머-① 및 ②는 프로모터 서열분단형 프라이머이다. 프라이머-③은 상기 프라이머-3과 동일한 것이고, 프라이머-Ⅲ은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 것이다. 또한, 여기서는 PCR을 2단계로 수행하였기 때문에, 3'말단측 비번역서열 구축용 프라이머로 프라이머-Ⅳ(서열목록의 서열번호 4)를 합성하여 사용하였다. 프라이머-Ⅳ는 상기 프라이머-Ⅲ(서열목록의 서열번호 1)의 염기서열을 기본으로 하여, 플라스미드 중에서 3염기씩 비켜서 설계한 것이고, 이를 하기의 염기서열에 나타내었다. 또한, 하기의 프라이머 서열 중에서 X는 플라스미드에 삽입한 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 서열을 의미한다.
프라이머-① : 5' GCGTAGCATTTAGGTGACACT 3'
프라이머-Ⅲ : 5' AGCGTCAGACCCCGTAGAAA 3'
프라이머-Ⅳ : 5' GTCAGACCCCGTAGAAAAGA 3'
프라이머-③ : 5' ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
프라이머-② : 5' GGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAAC
AACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATG 3'
이들 프라이머를 이용하여 증폭시킨 주요한 PCR 산물의 모식도를 도 5의 (b)에 나타내었다. 도 5의 (b) 중 (2) 및 (3)에 나타낸 DNA는 RNA 폴리머라아제에 의한 인식이 매우 낮기 때문에, 사실상 RNA 합성이 이루어지지 않는 것으로 예측된다. 또한, 이처럼 설계된 프라이머를 이용하여 구축된 전사주형은 도 5의 (c)가 될 것으로 기대된다.
이들 프라이머를 사용하여 전사주형을 구축하였다. 우선, 전사주형 구축용의 주형으로서, pUC19에 cDNA 라이브러리로부터 선택한 유전자를 삽입하여 조성한 비교예 1과 동일한 플라스미드를 이용하였다. 상기 프라이머를 사용하여 2단계의 PCR법에 의해 하기의 조건에서 전사주형을 작성하였다. PCR법에는 폴리머라아제로서 다카라(??)사의 ExTaq DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
첫 번째 단계의 PCR용 혼합물(농도)
1× ExTaq 버퍼
200 uM 디옥시리보뉴클레오시드 삼인산(deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP)
10 nM 프라이머-③
10 nN 프라이머-Ⅲ
0.025 U ExTaq DNA 폴리머라아제
50 pg/uL 주형 플라스미드 DNA
두 번째 단계의 PCR용 혼합물(농도)
1× ExTaq 버퍼
200 uM dNTP
100 nM 프라이머-①
100 nM 프라이머-Ⅳ
1 nM 프라이머-②
0.025 U ExTaq DNA 폴리머라아제
0.05 uL 첫 번째 단계의 PCR 산물
PCR의 반응조건
(첫번째 단계 및 두 번째 단계의 PCR은 동일한 조건에서 실시되었다.)
98℃에서 1분간
↓
(98℃에서 10초간→60℃에서 30초간→72℃에서 5분간)을 30 사이클
↓
72℃에서 4분간
↓
4℃
이어서, 상기에서 얻어진 PCR 산물을 전사주형으로 이용하고, SP6 RNA 폴리머라아제를 이용하여 하기와 같이 조제한 전사용 용액을 37℃에서 2시간 반응시킴으로써 전사산물인 mRNA를 얻었다.
[표 2] 전사용 용액(mRNA 용액)
(uL) 농도
PCR 산물 10 0.4 uL/uL
5×버퍼 5 1×
25 mM NTPs 3 3 mM
111 U/uL RNase 저해제 1 4.4 U/uL
50 U/uL SP6 RNA 폴리머라아제 0.75 1.5 U/uL
이온교환수(Milli Q) 5.25
합계 25
또한, 여기서 이용한 5×버퍼의 조성은 실시예 1에서 사용한 것과 동일하다.
도 6에, 얻어진 전사산물의 아가로스겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타내었다. 저분자 전사물질의 존재는 발견되지 않았고, 각 유전자로부터의 전사산물로서 예상되는 이동도를 갖는 RNA가 합성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
이들 mRNA 표준시료를 탈염하고 번역주형으로서 회분식 밀배아 무세포 단백질 합성계에 첨가하여 단백질 합성을 실시하였다. 합성반응은 [Madin, K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564] 및 WO00/68412호 공보에 기재된 방법에 따라서 실시하였다. 26℃에서 3시간 동안의 단백질 합성반응 후의 자기방사표지법(autoradiography)에 의한 분석결과를 도 7에 나타내었다.
도 4와 도 7을 비교하면, 전사주형에 따라 명확한 차이가 확인된다. 즉, 본 발명에 의한 방법으로 설계 및 구축한 전사주형을 이용한 경우에는 종래의 방법으로 구축한 것에 비하여, 저분자의 번역산물의 합성은 보이지 않고, 어떠한 단백질도 높은 효율로 합성되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기와 같이 설계 및 구축된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 얻은 전사주형을 이용하고, 무세포 단백질 합성을 WO00/68412호 공보에 기재된 투석막을 이용하는 투석법에 따라서 24시간 실시하였다. 각 반응액의 1 uL를 SDS-겔 전기영동하고, 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도면에서 별포는 각각의 유전자로부터 합성된 단백질을 나타낸다. 염색밴드의 패턴으로부터 어떠한 단백질도 높은 효율로 합성된다는 것을 확인할 수 있었다. 밴드의 염색강도의 측정에 의하면, 반응액 1mL 당 25 kDa의 단백질은 0.5 mg, 18 kDa의 단백질은 3.2 mg, 44 kDa의 단백질은 1.2 mg, 27 kDa의 단백질은 1.3 mg의 합성량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: PCR법에 의해 구축한 전사주형을 이용하는 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성방법
실시예 2의 투석막을 이용한 연속식 무세포 단백질 합성법은 효율이 높은 반면 조작이 번잡하였다. 따라서, 보다 간편한 방법으로서 종래의 회분식 무세포 단백질 합성반응을 저농도의 배아 추출액을 함유하는 무세포 단백질 합성용 반응용액 내에서 수행하였다.
이 방법에서는, 종래 기지의 회분방식 무세포 단백질 합성계에서 사용되는 조성의 반응용액을 사용하였다[Madin, K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 97, 559-564]. 우선, 반응용액으로서, 밀배아 추출액(농도는, 200 A260nmunits/mL)을 전체 용량의 48% 함유하고, 다음과 같은 최종농도 조성, 1,000 units/mL 리보뉴클레아제 저해제(RNAsin), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 2.65 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 0.5 mg/mL 크레아틴키나아제, 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM 크레아틴인산, 0.380 mM 스퍼미딘, 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM), 600 ㎍/mL의 GFP를 코딩하는 mRNA로 구성되는 반응용액을 조제하였다. 당해 mRNA는 상기 실시예 2에 기재된 프로모터 서열분단형 프라이머를 이용하여 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR에 의해 얻어진 전사주형으로부터 전사시킨 mRNA이고, 5' 말단에 오메가 서열을 갖지만 CAP 구조를 갖지 않고, 1896 염기의 3' 말단 비번역서열을 담지한다. 상기 반응용액을 26℃에서 15분간 전보온(프리인큐베이션)시킨 후에, 5배의 희석용액[30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 2.65 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM 크레아틴인산, 0.380 mM 스퍼미딘, 20 종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM)]을 첨가하여 희석하였다(희석방식).
또한, 단백질 합성을 아미노산의 수득량을 지표로 하여 측정할 때에는 희석용액에 1mL 당 4 uCi의14C-류신을 첨가한 것을 이용하였다. 희석 후 다시 26℃에서 단백질 합성반응을 개시하였다. 그 결과를 도 9의 (a)에 나타내었다. 종축의 방사능 카운트는 등량의 배아추출액량에 대하여 나타낸 것이다.14C-류신의 단백질로의 수득, 즉 단백질 합성반응은 종래의 회분방식(●-●)으로는 1시간에서 반응이정지하였지만 본 발명에 의한 희석방식(○-○)에 있어서는, 9시간에 걸쳐 합성반응이 지속되고 종래의 회분방식에 비하여 약 8배의 단백질이 합성될 수 있었다. 또한, 얻어진 단백질을 자기방사표지법(autoradiography)을 이용하여 분석하고 그 결과를 도 9의 (b)에 나타내었다. 도면에서, 좌측레인은 분자량 마커를 화살표는 합성산물인 GFP를 나타낸다. 방사능 사진으로부터도 희석방식에서는 9시간에 걸쳐 합성반응이 지속하는 것을 명백히 알 수 있었다. 또한, 그 이동도로부터 합성산물이 완전한 길이의 단백질로 합성되고, 반응액 중에 축적되어 있다는 사실 또한 명백히 알 수 있었다.
여기에 나타낸 희석방식의 무세포 단백질 합성방법은 복잡한 조작을 필요로 하지 않고, PCR에서 구축한 전사주형을 이용하여 고효율의 무세포 단백질 합성을 가능하게 한다.
실시예 4: PCR로 구축한 전사주형을 이용하는 전사 및 번역 연속형 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성방법
실시예 3의 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성방법은 번역효율이 높은 반면, 별도로 전사한 mRNA를 무세포 단백질 합성계에 첨가하지 않으면 안되는 번잡성을 수반한다. 따라서, 종래의 전사계 및 번역계와 희석방식을 조합하여 신규한 전사 및 번역 연속형 희석방식 무세포 단백질 합성방법을 실시하였다.
우선, 하기에 나타낸 전사용 용액을 조제하였다. 여기서 이용한 PCR 산물은 상기 실시예 2에 기재한 프로모터 서열분단형 프라이머 및 Ampr와 Ori 사이에서 상보성을 갖는 3'측 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 구축한 전사주형이며, 유전자로는 GFP를 조합한 것이다. 이 전사용 용액을 37℃에서 3시간 보온시켜 mRNA를 합성하였다.
[표 3] 전사용 용액(mRNA 용액)
(uL) 농도
PCR 산물 10 0.4 uL/uL
5×버퍼 5 1×
25 mM NTPs 3 3 mM
111 U/uL RNase 저해제 1 4.4 U/uL
50 U/uL SP6 RNA 폴리머라아제 0.75 1.5 U/uL
이온교환수(Milli Q) 5.25
합계 25
또한, 상기 전사용 용액의 조성 중 NTPs의 농도만을 바꾸어 2.5 mM 또는 1.5 mM로 한 것을 조제하고, 각각에 대해서 전사반응을 실시하였다. 이 때 이용한 5×버퍼의 조성은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 것이다.
얻어진 mRNA 용액은 마그네슘 이온, ATP, GTP 농도가 번역반응의 최적농도보가 높기 때문에, 무세포 단백질 합성용의 밀배아 추출물을 첨가하는 것만으로는 그대로 연속하여 동일한 계 내에서 번역반응을 수행할 수는 없다. 그 때문에, 얻어진 mRNA 용액 25 uL에 하기의 무세포 단백질 합성용의 반응용액을 첨가하였다. 이를 통하여, 마그네슘 이온 농도가 번역반응의 최적농도, 3.19 mM에 이르기까지 희석되어 단백질 합성이 가능하게 되었다.
[표 4] 반응용액
uL 농도
밀배아 추출물 12 8%
1000 mM HEPES-KOH pH 7.8 2 30 mM
4000 mM 아세트산칼륨 3.5 100 mM
1000 mM 아세트산마그네슘 0 3.19 mM
10 mM 스퍼미딘 1 0.4 mM
50 mM 디치오스레이톨 1.5 2.5 mM
2.5 mM 아미노산 혼합물 16.6 0.3 mM
100 mM ATP 1.3 1.2 mM
20 mM GTP 0 0.33 mM
500 mM 크레아틴 인산 4.8 16 mM
111 U/uL RNase 저해제 0 0.74 U/uL
15 ug/uL tRNA 2 0.2 ug/uL
40 ug/uL 크레아틴 키나아제 1.5 0.4 ug/uL
100 uCi/mL14C-류신 3 4uCi/mL
이온교환수(Milli Q) 75.8
또한, 이러한 희석조작을 통하여 번역반응을 저해하는 전사기질의 잔여성분의 리보뉴클레오시드 삼인산 및 부산물인 피롤린산 농도를 1/6로 저하시켰다. 이와 같은 희석조작 후에 반응온도는 번역 최적농도인 26℃로 설정하고, 보온을 계속하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10의 (a)에는 아미노산의 수득량을 이용하여 측정한 GFP 합성의 결과를 나타내었다. 도 10으로부터, NTPs 농도가 2.5 mM(중간 □-□) 또는 3 mM(큰 □-□)의 전사용 용액을 이용한 경우, 9시간에 걸쳐서 합성반응이 지속하고 회분방식(●-●)에 비하여 약 8배의 단백질을 합성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이 합성효율은 실시예 3에 나타낸 mRNA 첨가형 희석식 무세포 단밸질 합성계(○-○)와 동일한 정도이다.
또한, 도 10의 (b)에 얻어진 단백질의 방사능 사진을 나타내었다. 이 도면으로부터, 전사 및 번역 연속형 희석방식에서는 9시간에 걸쳐 합성반응이 지속된다는 사실뿐만 아니라, 그 이동도로부터 합성산물이 완전한 길이의 단백질로 합성되고, 반응액 중에 축적되어 있는 것도 확인할 수 있었다. 전사반응에 사용되는 리보뉴클레오티드 농도가 2.5 mM(중간 □-□)인 경우에 합성된 단백질량은 최대를 나타내었다. SDS-겔 전기영동 후에 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 단백질의 염색패턴을 얻고 GFP 염색밴드의 강도를 측정하였더니, 반응액 1 mL 당의 GFP 합성량은 0.82 mg이었다.
상기와 같이, 프로모터 서열분단형 프라이머 및 Ampr와 Ori 사이에 상보성을 갖는 3' 측 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 구축한 전사주형을 이용함으로써, 전사 및 번역 연속형 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성을 실시할 수 있고, 효율이 높고 간편한 단백질 합성이 가능하게 되었다.
실시예 5: PCR법으로 구축한 전사주형을 이용하는 전사 및 번역 일체형 희석방식 밀배아 무세포 단백질 합성방법
우선, 밀배아 추출액(농도는, 200 A260nmunits/mL)을 전체 용량의 48% 함유하고, 다음과 같은 최종농도 조성[1,000 units/mL 리보뉴클레아제 저해제(RNAsin), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 16 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨(dithiothreitol), 0.5 mg/mL 크레아틴키나아제, 2.5 mM ATP, 2.5 mM GTP, 2.5 mM UTP, 2.5 mM CTP, 1500 unit/mL의 SP6 RNA 폴리머라아제, 16 mM 크레아틴인산, 1.48 mM 스퍼미딘, 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM), 25 ㎍/mL의 DNA]로 구성되는 반응용액을 조제하였다. 여기서 이용한 DNA는 상기 실시예 2에기재한 프로모터 서열분단형 프라이머 및 Ampr와 Ori 사이에 상보성을 갖는 3' 말단측 프라이머를 이용하여 실시예 2에 기재한 방법으로 구축한 전사주형이고, 유전자로는 GFP를 조합한 것이다. 상기 반응액을 30℃에서 3시간 배양시켜 mRNA을 전사하였다.
이 합성용액 중의 마그네슘 이온의 농도 및 ATP와 GTP 농도는 번역 최적농도에 비하여 현저히 높기 때문에, 전사반응은 일어나지만 정상적인 단백질 합성반응은 진행되지 않는다. 단백질 합성반응을 개시시키기 위하여, mRNA 합성 후에 상기 반응용액의 5배의 희석용액[30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산 칼륨, 0.4 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 0.94 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM 크레아틴 인산, 0.380 mM 스퍼미딘, 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM)로 구성되고, 단백질 합성을 아미노산의 수득량을 지표로 하여 측정하는 경우에는, 본 용액 1 mL에 대하여 4 uCi의14C-류신을 포함시킨다]을 첨가함으로써, 마그네슘 이온 농도를 번역반응에 적합한 농도(3.18 mM)에 이르기까지 저하시킨다. 이 방법에 의해 실시예 4와 동등한 정도 단백질 합성 효율이 확인되었다.
전사 및 번역 일체형 또는 전사 및 번역 연속형의 희석방식 무세포 단백질 합성방법은 복잡한 조작을 필요로 하지 않아 간편하고, PCR법에 의해 구축한 전사주형을 직접 이용하여 단백질의 무세포계에서의 높은 효율의 합성을 가능하게 하였다.
본 발명에 의해, 범용성을 갖고 번역주형 활성이 높고 구축이 간단한 무세포 단백질 합성용의 전사주형의 설계 및 구축이 가능하게 되고, 또한 당해 전사주형을 이용하는 간편한 무세포 단백질 합성법이 확립되었다. 즉, ① 높은 번역주형 활성을 유지하는 mRNA의 설계, ② PCR기술을 기반으로 하여 번역효율이 높은 mRNA를 전사하기 위한 범용성이 있는 전사 백그라운드의 억제 등이 가능한 전사주형을 유전자로부터 구축하기 위한 프라이머의 설계, ③ 구축한 무세포 단백질 합성용 전사주형을 이용하는 간편한 무세포 단백질 합성기술이 확립되었다.
본 발명에 의하면, 어떠한 벡터에 클론화한 유전자에 있어서도, 그 유전자에 상보적인 서열을 갖는 5' 말단측과 3' 말단측의 2종류의 고유의 프라이머를 준비하면, 전체 유전자에 공통으로 이용할 수 있는 범용성 프라이머(5' 말단측의 3종류와 3' 말단측의 1 종류)를 이용함으로써, 클론화된 임의의 유전자에 대해서 간편하게 교효율의 무세포 단백질 합성이 가능하게 된다. 여기서 설명한 발명의 성과는 종래의 연속식 무세포 단백질 합성법과 같은 복잡한 장치나 번잡한 조작을 필요로 하지 않는 이점도 겸비하기 때문에, 게놈 프로젝트 완료와 함께 얻어질 방대한 수의 유전자에 대한 기능해석 및 구조해석의 기반이 되는 유전자산물(단백질)의 생산에 대한 기본적인 요소기술을 제공하게 되는 것이다. 특히, 다검체용 전자동 무세포 단백질 합성 로봇 개발 등의 무세포 단백질 합성 시스템의 자동화를 위한 요소기술로서 중요하다. 따라서, 본 발명은 구조생물화학 및 생화학을 포함하는 기초생물학부터, 그 응용으로서 의약의 개발 및 생산에 이르는 넓은 분야에 있어서 극히 다대한 기여를 하는 것이다.

Claims (20)

  1. 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 3' 말단 비번역서열을 갖는 번역주형 분자를 작성하기 위한 전사주형을 폴리머라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)법으로 작성할 때에 사용하는 3' 말단측의 프라이머(primer)의 염기서열에 있어서, 유전자를 클론화한 벡터의 약제 내성 유전자 등의 마커 유전자의 전사 터미네이터 서열과 일부 복제개시부위(Ori)를 포함하는 서열과의 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스(antisense)를 형성할 수 있는 염기서열을 포함하는 염기서열(1), 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열(2), 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열의 주요부를 포함하는 염기서열(3), 상기 (1)~(3)의 어느 하나의 염기서열과 제한(stringent) 조건에서 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 염기서열, 또는 이들의 상보적인 염기서열.
  2. 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형 분자를 작성하기 위한 전사주형을 PCR법으로 작성할 때에 사용하는 5' 말단측의 프라이머의 염기서열에 있어서, RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열과 부분적으로 상보성을 갖는 염기서열을 포함하는 염기서열(4), 서열목록의 서열번호 2 또는 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열(5), 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 염기서열(6), 상기 (5) 또는 (6)의 염기서열의 주요부를 포함하는 염기서열(7), 상기 (4)~(7)의 어느 하나의 염기서열과도 제한조건에서 하이브리다이즈 가능한 염기서열, 또는 이중 어느 하나와 상보적인 염기서열.
  3. 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형분자를 작성하기 위한 전사주형을 PCR법으로 작성하는 때에 사용하는 5' 말단측의 프라이머의 염기서열에 있어서, 다른 2종류의 염기서열로 구성되는 2종류의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)(A), (B)를 5' 말단측의 프라이머로 이용하여 PCR에 의해 전사주형을 구축하는 방법에 있어서, 당해 2종류의 PCR용 프라이머의 염기서열은 당해 프라이머 중의 어느 한 종류만으로 구축된 DNA로부터는 전사가 일어나지 않는다는 조건을 충족하는 것이고, 당해 프라이머의 하나는 프로모터의 5' 말단으로부터 적어도 프로모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 당해 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A)이고, 당해 프라이머의 다른 하나는 당해 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B)인 것을 특징으로 하는 전사주형의 구축방법.
  4. 제 3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드(B)의 염기서열에 이어서 GA 또는 GAA 서열을 삽입하고, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 염기서열과, 번역개시 코돈 ATG 또는 목적으로 하는 유전자의 단백질번역부위(open reading frame; ORF)의 일부 또는 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부의 염기서열에 상보적인 염기서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 전사주형의 구축방법.
  5. 제 4항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 번역부의 개시코돈과 ORF와의 사이에 히스티딘 태그(His-tag) 또는 글루타치온에스-트랜스퍼라아제(glutathion S-transferase; GST), myb 등의 태그 또는 에피토프(epitope) 합성용의 염기서열을 삽입하는 것을 특징으로 하는 전사주형의 구축방법.
  6. 무세포 단백질 합성법에서 이용하는 번역주형분자를 작성하기 위한 전사주형을 PCR법으로 작성하는 방법에 있어서, 당해 전사주형의 5' 말단측의 프라이머로서 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열에 담배 모자이크 바이러스 유래의 오메가 서열과 번역개시 코돈인 ATG를 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열에 번역개시코돈인 ATG와, 여기에 이어서 전사목적인 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 당해 전사주형의 3' 말단측의 프라이머로서 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 전사주형의 구축방법.
  7. 전사주형을 PCR법으로 작성하기 위한 프라이머세트(primer set)에 있어서,5' 말단측 프라이머로서 프로모터의 5' 말단측으로부터 적어도 프로모터 기능부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 서열을 갖지만, 당해 프로모터의 3' 말단측의 RNA 폴리머라아제 인식부위의 적어도 일부분에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(A), 당해 프로모터의 3' 말단측으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에는 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(B) 및 폴리뉴클레오티드(B)에 아닐링(annealing)할 수 있는 염기서열에 이어서 번역개시 코돈 ATG 또는 목적으로 하는 유전자의 ORF의 일부의 혹은 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부의 염기서열에 상보적인 염기서열을 결합하여 구성되는 폴리뉴클레오티드(C)와, 3' 말단측 프라이머로서 유전자를 클론화한 벡터의 약제 내성 유전자 등의 마커 유전자의 전사 터미네이터 서열과 일부 Ori를 포함한 사이에 존재하는 염기서열과 안티센스를 형성할 수 있는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 구성되는 프라이머 세트.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드(B)가 프로모터의 3' 말단으로부터 적어도 RNA 폴리머라아제 인식부위의 일부분을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖지만, 당해 프로모터의 5' 말단측의 적어도 프로모터 기능부위에 상보적인 염기서열을 갖지 않는 염기서열에 이어서, GA 또는 GAA 서열을 삽입하고, 그 하부에 mRNA의 번역증폭 기능을 부여하는 서열을 연결하고, 또한 번역개시코돈 ATG또는 목적으로 하는 유전자의 ORF를 포함하지 않는 ORF 상부의 염기서열에 상보적인 서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 프라이머 세트.
  9. 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열에 담배 모자이크 바이러스 유래의 오메가 서열과 번역개시코돈인 ATG를 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열에 번역개시 코돈인 ATG와 여기에 이어서 전사목적인 유전자 고유의 ORF의 5' 말단측 염기서열을 연결한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 5' 말단측의 프라이머로 함유하고, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 3' 말단측의 프라이머로서 포함하고, 무세포 단백질 합성법에서 사용하는 번역주형분자를 구축하기 위한 전사주형을 PCR에 의해 작성하기 위한 프라이머 세트.
  10. 무세포 단백질 합성법에서 이용하는 고효율의 mRNA 합성용의 전사주형에 있어서, 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 구축방법으로 작성된 전사주형.
  11. 무세포 단백질 합성법에서 이용하는 고효율 mRNA 합성용의 전사주형에 있어서, 제 7항 내지 제 9항의 어느 한 항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 합성된 전사주형.
  12. 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 구축방법으로 작성된 전사주형 또는 제 10항 또는 제 11항에 기재된 전사주형으로부터 전사된 mRNA를 번역주형으로서 이용하는 무세포 단백질 합성방법.
  13. 제 12항에 있어서, mRNA를 합성 후 겔여과에 의해 정제하는 무세포 단백질 합성방법.
  14. 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 구축방법으로 전사주형을 작성하고, 전사용 용액을 이용하여 전사반응을 실시한 후, 무세포 단백질 합성용 반응용액을 첨가하여, 첨가 후에 반응용액에서 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 동시에 당해 반응용액 중에서 전사기질 및 전사부산물의 농도를 저하시켜 번역반응의 지속시간을 연장하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 연속희석방식의 무세포 단백질 합성방법.
  15. 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 구축방법으로 전사주형을 작성하고, 무세포 단백질 합성용 반응용액을 이용하여 전사반응을 실시한 후에 희석용액을 첨가하여 희석하고, 당해 반응용액에서 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 동시에 당해 반응용액 중의 전사기질 및 전사부산물의 농도를 저하하고, 번역반응의 지속시간을 연장하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 일체형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법.
  16. 반응용기에 cDNA를 첨가하고, 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 전사주형의 구축방법을 이용하여 반응용기 내에서 전사주형을 작성하고, RNA 폴리머라아제와 4종류의 리보뉴클레오시드 삼인산(ribonucleoside triphosphate)를 함유하는 무세포 단백질 합성용 반응용액을 가하여 전사반응을 실시한 후, 다시 무세포 단백질 합성용 반응용액을 첨가하여, 당해 합성용액 중의 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적농도로 저하시켜 번역반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 일체형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법.
  17. 반응용액에 cDNA를 첨가하고, 제 3항 내지 제 6항의 어느 한 항에 기재된 전사주형의 구축방법을 실시하여 당해 반응용기 중에서 전사주형을 작성하고, RNA 폴리머라아제와 4종류의 리보뉴클레오시드 삼인산을 함유하는 무세포 단백질 합성반응용 반응용액을 가하여 전사반응을 실시한 후, 희석용액을 첨가하여 희석하고, 당해 합성용액 중에서 적어도 마그네슘 농도를 번역 최적 농도로 저하시키고, 번역반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 전사 및 번역 일체형 희석방식의 무세포 단백질 합성방법.
  18. 제 14항 내지 제 17항의 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 농도를 약 1 mM 내지 약 6 mM로 저하시킨 무세포 단백질 합성방법.
  19. 제 14항 내지 제 18항의 어느 한 항에 있어서, 전사반응을 약 30℃~약 45℃에서 실시하고, 번역반응을 약 20℃~약 30℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법.
  20. 제 12항 내지 제 19항의 어느 한 항에 있어서, 밀배아 추출물을 이용하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100784164B1 (ko) 2006-05-08 2007-12-10 고려대학교 산학협력단 이중 마커를 이용한 ｓｉＲＮＡ의 정량용 조성물
KR100966655B1 (ko) * 2007-08-30 2010-06-30 (주)차바이오앤디오스텍 무세포 단백질 합성을 이용한 트랜스아미나제의 활성스크리닝 방법 및 키트

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4768155B2 (ja) 2001-07-02 2011-09-07 独立行政法人理化学研究所 鋳型ｄｎａの製造方法及びそれを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法
JP4441170B2 (ja) 2002-11-28 2010-03-31 独立行政法人理化学研究所 Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法
JPWO2004070047A1 (ja) * 2003-02-10 2006-05-25 株式会社セルフリーサイエンス 自動蛋白質合成方法及びそれを行うための装置
CN1777674B (zh) * 2003-04-25 2012-05-23 株式会社无细胞科学 高通量蛋白质合成系统及使该系统自动运行的合成装置
WO2005015212A1 (en) * 2003-08-07 2005-02-17 Cellfree Sciences Co., Ltd. Reagent for producing a protein chip
JP2008029203A (ja) * 2004-11-12 2008-02-14 Cellfree Sciences Co Ltd 無細胞タンパク質合成方法
JP4590249B2 (ja) * 2004-11-17 2010-12-01 独立行政法人理化学研究所 糖タンパク質合成用の無細胞タンパク質合成システム
JP4868731B2 (ja) 2004-11-17 2012-02-01 独立行政法人理化学研究所 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム
JP4787488B2 (ja) 2004-11-19 2011-10-05 独立行政法人理化学研究所 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液
WO2009060857A1 (ja) * 2007-11-05 2009-05-14 Riken 膜タンパク質の製造方法
US20110236941A1 (en) 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof
US20120301904A1 (en) * 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
CA3032514C (en) 2015-07-31 2021-05-04 Takehiro SHINODA Method of producing membrane protein and utilization thereof
CN107629119B (zh) * 2016-07-18 2021-05-14 河南工业大学 一种麦胚抗肿瘤活性蛋白的修饰方法
EP3354736B1 (en) * 2017-01-25 2020-07-01 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Promoter construct for cell-free protein synthesis

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8613481D0 (en) * 1986-06-04 1986-07-09 Diatech Ltd Translation of mrna
EP0485608B1 (en) * 1989-07-31 1995-11-22 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system
US5670617A (en) * 1989-12-21 1997-09-23 Biogen Inc Nucleic acid conjugates of tat-derived transport polypeptides
JP3255784B2 (ja) * 1994-01-26 2002-02-12 弥重太 遠藤 蛋白質の合成方法
JPH1156363A (ja) * 1997-08-19 1999-03-02 Nippon Flour Mills Co Ltd タンパクの製造方法
EP0972838B1 (en) * 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
AU757803B2 (en) * 1998-08-18 2003-03-06 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Gene therapy for regulating smooth muscle cell tone
JP4486187B2 (ja) * 1998-10-27 2010-06-23 武田薬品工業株式会社 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、そのｄｎａおよびそのリガンド
JP4824236B2 (ja) * 1999-07-09 2011-11-30 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸増幅によるｈｉｖ−１の検出
US6303337B1 (en) * 1999-08-25 2001-10-16 Amber Gen. Inc. N-terminal and C-terminal markers in nascent proteins
CA2385134A1 (en) * 1999-10-15 2001-04-19 Wakenyaku Co., Ltd. Template molecule having broad applicability and highly efficient function means of cell-free synthesis of proteins by using the same
EP1310564A4 (en) * 2000-07-21 2004-08-04 Nat Inst Of Advanced Ind Scien METHOD FOR MARKING PROTEINS USING A CELL-FREE PROTEIN SYNTHESIS SYSTEM FROM WHEAT EMBRYO
US6869774B2 (en) * 2000-08-29 2005-03-22 Yaeta Endo Methods of synthesizing cell-free protein

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100784164B1 (ko) 2006-05-08 2007-12-10 고려대학교 산학협력단 이중 마커를 이용한 ｓｉＲＮＡ의 정량용 조성물
KR100966655B1 (ko) * 2007-08-30 2010-06-30 (주)차바이오앤디오스텍 무세포 단백질 합성을 이용한 트랜스아미나제의 활성스크리닝 방법 및 키트

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