KR20030014391A - 혈관 신생요법용 의약조성물 - Google Patents
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Abstract
혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제, 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생제, ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물, ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제 및 ets-1 유전자를 유효성분으로 하는 혈관 신생제.
Description
기술분야
본 발명은, 혈관 신생요법을 위한 신규한 의약조성물에 관한 것이다. 더욱이 상세하게는, 본 발명은, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생요법을 위한 신규한 의약조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 프로스타사이클린 합성효소 유전자(prostacyclin synthase gene)나 ets-1 유전자의, 혈관 신생요법으로의 신규한 적응 등에 관한 것이다.
배경기술
새로운 혈관의 발생이나 혈관 신생은 친혈관(parental blood vessel)의 내피세포의 활성화와 함께 개시되지만, 인 비보에서의 이 혈관 신생을 자극할 뿐 아니라, 인 비트로에서 내피세포에 대해 마이토제닉하게(mitogenically) 작용하는 것이 나타내어져 있는 증식인자를 「혈관 신생인자(혈관 신생 증식인자)」라고 칭하고 있다.
혈관 신생인자의 치료적인 적용은, Folkman등에 의해 최초로 문헌발표되었다(N. Engl. J. Med. 285, 1182-1186(1971)). 또한 그 후의 연구에 의해, 재조합 혈관 신생인자, 예를 들면 섬유아세포 증식인자(FGF)패밀리(Science 257, 1401-1403(1992), Nature 362, 844-846(1993)), 내피세포 증식인자(EGF)(J. Surg. Res. 54, 575-583(1993)) 및 혈관내피 증식인자(VEGF) 등을 사용하여 심근 및 하지허혈증의 동물 모델에 있어서의 측부혈행로의 발달을 촉진 및/또는 증진시킬 수 있는 것이 확인되어 있다(Circulation 90, II-228-II-234(1994)). 더욱이 본 발명자등은, 간 실질세포 증식인자(HGF)가 VEGF와 동일하게 내피 특이적 증식인자로서 작용하는 것을 발견하고 있다(J. Hypertens. 14, 1067-1072(1996)).
혈관장애를 치료하기 위해 상기와 같은 혈관 신생인자를 사용하는 전략은, 「혈관 신생요법」이라고 칭해지고 있다. 특히 최근에는, 상기와 같은 혈관 신생인자의 유전자를 사용하여, 허혈성 질환이나 동맥질환에 대한 혈관 신생요법의 검토가 적극적으로 진행되고 있다.
예를 들면 본 발명자등은, 폐색성 동맥경화증(ASO)에 대한 HGF 유전자의 유효성을 명확하게 하고 있다(Circulation, Vol.100, No.18, No.1672(1999), Japanese Circulation Journal Vol.64, Suppl. I, p478, No.P079(2000)). 또한 심근경색에 있어서의 허혈 재환류상해에 대해서, HGF 유전자가 유효하게 작용하는 것이 나타내어져 있다(Circulation, Vol.96, No.8, No.3459(1997), Ann. Thorac. Surg., 67, p1726-1731(1999), Gene Therapy, 7: 417-427(2000)).
또한 VEGF 유전자에 관해서는, 돼지 심근 허혈 모델에 대한 VEGF 유전자의유효성(Human Gene Therapy 10: 2953(1999))이나, 토끼 하지 허혈 모델에 대한 유효성(Circulation 96(suppl II): II-382-388(1997))이 나타내어져 있고, 더욱이, ASO 환자에 대한 효과(Circulation 97: 1114-1123(1998))나, 협심증환자에 대한 효과(Ann Thorac Surg 68: 830-837(1999))도 보고되어 있다. 현재 미국에서는, Isner등의 그룹 등에 의해, ASO 환자나 협심증환자에 대한 VEGF 유전자 치료의 임상시험이 진행되고 있는 상황에 있다.
더욱이 bFGF 유전자에 관해서는, 근디스트로피 모델 마우스 mdx의 근육 내에 bFGF 유전자를 도입함으로써, 혈관수가 증가한 것이 보고되어 있다(Gene Therapy 6(7): 1210-1221(1999)).
다른 한편, 프로스타글란딘(prostaglandin)의 1종인 프로스타사이클린(프로스타글란딘 I2; PGI2)은, 반감기 5~10분의 불안정한 지질 메디에이터 (mediator)로(Arch. Gynecol. Obstet., 243, p187-190(1988), G 단백질 공역형 수용체를 매개로 하여 cAMP의 레벨을 증가시킴으로써, 강력한 혈관 확장작용 및 혈소판응집 억제작용을 나타내는 것이 알려져 있다(N. Engl. J. Med. 17, p1142-1147(1979)). 그리고, 해당 PGI2나 PGE1(프로스타글란딘 E1) 및 이들의 유도체(아날로그)와 같은 혈관 확장제는, 현재, 여러 혈관장애의 치료에 폭 넓게 사용되고 있다. 즉, ASO나 TAO(폐색성 혈전혈관염) 등의 말초 혈행장애에 대해서, 혈관 확장작용, 혈소판응집 억제작용 등의 작용을 기대하고, PGE1의 동맥내 투여나 정맥내 투여가 행해지고 있어, 확립된 치료법으로 되어 있다. 또한, PGI2에 관해서는 작용이 강하고 실활(inactivation)도 지극히 빠르기 때문에, 여러 유도체(일로프로스트(iloprost)나 베라프로스트나트륨(beraprost sodium) 등)가 개발되어 있고, 이들은 말초혈관 폐색성 질환이나 만성 동맥폐색증의 치료에 사용되고 있다(Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 54, 327-333(1996), 약학잡지, 117, 509-521(1997)). 더욱이, 교원병(collagen disease)에 의한 말초순환장애, 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 체외순환의 유지(Minerva Med. 89, 405-409(1998))나 심부전(Am. Heart J. 134, 44-54(1997)) 등에 대해서도, 이들 PGE1이나 PGI2가 사용되고 있다.
이상과 같이, PGI2등의 혈관 확장작용이나 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질이, 여러 혈관장애에 대해 유효한 것이 알려져 있다. 그러나, 상술한 HGF 유전자 등을 사용한 혈관 신생요법에 있어서 이들 물질을 조합하여 사용한 적은 없어, 어떠한 유효성이 생기는지에 대해서는 조금도 명확해져 있지 않다.
더욱이, HGF나 VEGF, bFGF, EGF 등의 혈관 신생인자는, 전사조절인자인 ets-1(erythroblastosis virus oncogene homolog 1)의 발현을 항진하여, 해당 ets-1을 매개로 하여 혈관 신생에 관한 여러 인자를 활성화하는 것이 알려져 있다(J. Cell. Physiol., 169, 522-531(1996), HGF의 분자의학, 메디컬뷰사, 179-185(1998)). 그러나, 해당 ets-1의 유전자를 혈관 신생요법에 사용한 적은 없어, 그 효과에 대해서는 전혀 명확해져 있지 않았다.
발명의 개시
본 발명은, 혈관 신생요법을 위한 신규한 의약조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 더욱이 상세하게는, 본 발명은, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생요법을 위한 신규한 의약조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한, 프로스타사이클린 합성효소 유전자, 또는 ets-1 유전자의, 혈관 신생요법으로의 신규한 적응에 대해서 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자등은, HGF 유전자를 사용한 혈관 신생요법에 있어서, PGI2를 합성하는 효소(PGI2합성효소, 이하, PGIS라고 칭한다)의 유전자를 병용한 경우에, 어떠한 효과를 나타내는지에 대해 검토했다. 또한 혈관 신생인자의 유전자를 사용한 혈관 신생요법 전반에 있어서, 만족할 만한 병용효과를 나타낸 약제는 지금까지는 발견되고 있지 않고, 더욱이 다른 유전자와의 병용효과 등도 명확해져 있지는 않았다.
마우스 하지 허혈 ASO 모델을 사용한 검토 결과, HGF 유전자 또는 VEGF 유전자와 PGIS 유전자를 병용함으로써, 각 유전자를 단독으로 사용한 경우와 비교하여 예상외로 현저하게, 하지 혈류를 개선하는 것이 명확해졌다. 더욱이 PGIS 유전자는, HGF 유전자 또는 VEGF 유전자에 의한 혈관 신생작용을 증강하고, 또 단독으로도 혈관 신생작용을 갖는다는 것을, 처음 발견했다.
이상의 결과에 의해, 혈관 신생인자의 유전자를 사용한 혈관 신생요법에 있어서, PGI2와 같은 혈관 확장작용이나 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질, 또는 PGIS 유전자와 같은 해당 물질을 생기게 하는 물질의 병용은, 지극히 효과적인 것이 명확해졌다.
더욱이 본 발명자등은, HGF나 VEGF의 시그날전달의 하류에 위치하는 전사조절인자 ets-1을 코드하는 유전자의, 혈관 신생요법으로의 적용에 대해서도 검토했다. 그 결과, 전사조절인자인 ets-1 유전자의 단독 투여에 의해, 혈관 신생작용이 인정되는 것이 처음으로 명확해졌다. 또한, ets-1 유전자와 HGF 유전자와의 병용에 의해, 각각 단독으로 투여한 경우와 비교하여, 더욱이 현저한 혈관 신생작용이 보여지는 것이 명확해졌다.
본 발명은, 이상과 같은 사실을 토대로 완성하기에 이른 것이다.
즉 본 발명의 요지는,
(1) 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(2) 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(3) 혈관 확장작용 및 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(4) 혈관 확장작용 및 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생요법용 의약조성물,
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질이 cAMP의 상승에 관여하는 물질인 혈관 신생요법용 의약조성물,
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질을 생기게 하는 물질이, 유전자의 형태인 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(8) 상기 (7)에 있어서, 유전자가 프로스타사이클린 합성효소 유전자인 혈관 신생요법용 의약조성물,
(9) HGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(10) HGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(11) VEGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(12) VEGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(14) 상기 (13)에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환이, 폐색성 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 심근증 또는 뇌혈관장애 중 어느 하나인 혈관 신생요법용 의약조성물,
(15) 상기 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 유전자를 naked DNA의 형태로 도입하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(16) 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제,
(17) 혈관 확장작용 및 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제,
(18) 상기 (16) 또는 (17)에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생작용의 증강제,
(19) 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질이 cAMP의 상승에 관여하는 물질인 혈관 신생작용의 증강제,
(20) 상기 (16) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생작용의 증강제,
(21) 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 HGF 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제,
(22) 상기 (16) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생작용의 증강제,
(23) 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생제,
(24) 상기 (23)에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생제,
(25) ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(26) ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(27) 상기 (25) 또는 (26)에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생요법용 의약조성물,
(28) HGF 유전자와 ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(29) HGF 유전자와 ets-1 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(30) 상기 (25) 내지 (29) 중 어느 하나에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생요법용 의약조성물,
(31) ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제,
(32) 상기 (31)에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생작용의 증강제,
(33) ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 HGF 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제,
(34) 상기 (31) 내지 (33) 중 어느 하나에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생작용의 증강제,
(35) ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생제, 및
(36) 상기 (35)에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생제에 관한 것이다.
본 발명은, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생요법용 의약조성물을 제공하는 것이다.
여기에서 혈관 신생요법에 있어서 사용되는 「혈관 신생인자를 코드하는 유전자」란, 새로운 혈관의 형성을 유도할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 이들의일부분을 코드하는 유전자를 가리킨다. 구체적으로는, 예를 들면 HGF, VEGF, VEGF-2, 산성 FGF(aFGF), 염기성 FGF(bFGF), FGF-4, EGF, TGF-α, TGF-β, 혈소판 유래 내피세포 증식인자(PD-ECGF), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 종양 괴사인자-α(TNF-α), 인슐린양 증식인자(insulin-like growth factor), 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1) 등을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 또한, VEGF 등의 유전자의 발현을 제어하는 HIF-1, 또는 ets-1를 포함하는 ets 패밀리 등의, 전사인자를 코드하는 유전자도 들 수 있다. 바람직하게는 HGF 유전자 및 VEGF 유전자를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 HGF 유전자를 들 수 있다. 이들 유전자는, 공공의 데이터 베이스에 그 유전자서열이 등록되어 있어, 당업자라면, 이들을 이용함으로써 상기의 유전자를 용이하게 클로닝할 수 있다.
이하, HGF 유전자 및 VEGF 유전자를 예로 들어 설명한다.
본 발명에 있어서 「HGF 유전자」란, HGF(HGF 단백)를 코드하는 유전자를 가리킨다. 또한, 해당 HGF 유전자를 발현 가능하도록 발현 플라스미드에 삽입한 것을, 간단히 「HGF 유전자」라고 칭하는 경우도 있다. 구체적으로는, Nature, 342, 440(1989), 특허 제2777678호 공보, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967(1989) 등에 기재의 HGF의 cDNA를 후술하는 바와 같은 적당한 발현 벡터(비바이러스 벡터, 바이러스 벡터)에 삽입한 것을 들 수 있다. 여기에서 HGF를 코드하는 cDNA의 염기서열은, 상기 문헌에 기재되어 있는 것 외에, Genbank 등의 데이터 베이스에도 등록되어 있다. 따라서 이들 서열정보를 토대로 적당한 DNA 부분을 PCR의 프라이머로서 사용하여, 예를 들면 간장이나 백혈구 유래의 mRNA에 대해 RT-PCR 반응을 행함으로써, HGF의 cDNA를 클로닝할 수 있다. 이들 클로닝은, 예를 들면 Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 등의 기본서에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 HGF 유전자는 상술한 것에 한정되지 않고, 발현되는 단백질이 HGF와 실질적으로 동일한 혈관 신생작용을 갖는 유전자인 한, 본 발명의 HGF 유전자로서 사용할 수 있다. 즉, 1) 상기 cDNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA나, 2) 상기 cDNA에 의해 코드되는 단백질의 아미노산서열에 대해 1 또는 복수(바람직하게는 여러개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA 등 중, 혈관 신생작용을 갖는 단백을 코드하는 것이라면, 본 발명의 HGF 유전자의 범주에 포함된다. 여기에서 상기 1) 및 2)의 DNA는, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발법, PCR법, 또는 통상의 하이브리다이제이션법 등에 의해 용이하게 얻을 수 있고, 구체적으로는 상기 Molecular Cloning 등의 기본서를 참고로 하여 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 「VEGF 유전자」란, VEGF 단백을 코드하는 유전자를 가리킨다. 또한, 해당 VEGF 유전자를 발현 가능하도록 발현 플라스미드에 삽입한 것을, 간단히 「VEGF 유전자」라고 칭하는 경우도 있다. 구체적으로는, VEGF의 cDNA를 후술하는 바와 같은 적당한 발현 벡터(비바이러스 벡터, 바이러스 벡터)에 삽입한 것이 예시된다. VEGF 유전자는, 인간에 있어서는 전사시의 선택적 스프라이싱에 의해, 4종류의 서브타입(VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206)의 존재가 보고되어 있다(Science, 219, 983(1983), J. Clin. Invest., 84, 1470(1989), Biochem.Biophys. Res. Commun., 161, 851(1989)). 본 발명에 있어서는 이들 중 어느 VEGF 유전자도 사용하는 것이 가능하지만, 생물학적으로 가장 활성이 강하다고 하는 관점에서, VEGF165 유전자가 보다 바람직하다. 더욱이 상기의 HGF의 경우와 마찬가지로, 이들 VEGF의 유전자에 대해서 개변 등을 행한 유전자이더라도, 혈관 신생작용을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인 한, 본 발명의 VEGF 유전자의 범주에 포함된다.
해당 VEGF 유전자도 HGF 유전자와 마찬가지로, 문헌(예를 들면 Science, 246, 1306(1989)) 기재의 서열 및 데이터 베이스에 등록되어 있는 서열정보를 토대로, 당업자라면 용이하게 클로닝할 수 있고, 또한 그 개변 등도 용이하게 행할 수 있다.
이상과 같은 HGF 유전자나 VEGF 유전자, 또는 이들의 개변체를 코드하는 유전자가 혈관 신생작용을 갖는 것은, 예를 들면in vitro에 있어서는 국제공개 제97/07824호 공보에 기재의 혈관 내피세포에 대한 증식효과를, 또in vivo에 있어서는 후술하는 실시예에 기재의 마우스 하지 허혈 모델에 대한 혈류 개선효과를 측정하는 것 등에 의해, 조사할 수 있다.
이상과 같은 혈관 신생인자를 코드하는 유전자는, 본 발명의 혈관 신생요법에 있어서 단독으로 사용하더라도 좋고, 또는 복수를 조합하여 사용하더라도 좋다.
그런데 후술하는 실시예에 있어서는, HGF 유전자를 사용한 혈관 신생요법에 있어서, 프로스타사이클린 합성효소 유전자(PGIS 유전자)의 병용이 예상외로 현저한 효과를 초래하는 것을 처음으로 명확하게 했다. 구체적으로는, HGF 유전자 단독에서의 효과 + PGIS 유전자 단독에서의 효과를 초월하는, 상승적인 효과가 초래되는 것을 처음 명확하게 했다.
여기에서, PGIS에 의해 합성되는 PGI2는, 상기한 바와 같이 혈관 확장작용이나 혈관 투과성 항진작용, 혈소판응집 억제작용을 갖는 것이다. 따라서 상기 상승효과가 초래된 이유로서는, HGF 유전자와 PGIS 유전자를 병용함으로써, PGI2가 갖는 혈관 확장작용이나 혈소판응집 억제작용 등의 효과를 통해, 허혈부위에 있어서 HGF가 작용하기 쉬운, 즉 HGF가 혈관 신생을 행하기 쉬운 환경이 초래되어, 그 결과, 상기와 같은 예상 이상의 효과가 생긴 것을 생각할 수 있다.
따라서, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질, 또는 해당 물질을 생기게 하는 물질이라면, PGIS 유전자와 동일한 병용효과를 초래할 수 있다고 생각된다. 따라서 본 발명에 있어서는, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물을 제공하는 것이다.
특히, 혈관 확장작용과 혈소판응집 억제작용 양쪽을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질이, 본 발명의 혈관 신생요법에 있어서 적합하게 사용된다.
여기에서 「혈관 확장작용을 갖는 물질」이란, 공지의 혈관 확장작용을 갖는 물질(시판의 혈관 확장제 등)의 전부를 포함하는 것으로, 유전자, 단백질, 저분자화합물 등의 어떠한 물질이더라도 좋다. 구체적으로는 아래의 것이 예시된다.
즉 일반적인 혈관 확장제(소위 강압제(hypotensive agent))로서는, Ca 길항약, ACE 저해약, α1 차단약, ANP(Atrial Natriuretic Peptide, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드), 칼륨 채널 오프너(potassium channel opener), 또는 히드라진 등을 들 수 있다.
특히 ASO에서 사용되는 혈관 확장제로서는, 예를 들면 PGI2나 PGE1, 또는 이들의 유도체(일로프로스트, 베라프로스트나트륨, lipoPGE1등)라고 하는 프로스타글란딘제제를 들 수 있는 것 외에, 니트로글리세린을 포함하는 아질산화합물 등의 NO 도너 또는 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 약제, 포스포디에스테라아제 저해제 등의 세포내 cAMP를 상승시키는 약제 등을 들 수 있다.
바람직하게는 cAMP를 상승시키는 약제, 또는 프로스타글란딘제제를, 보다 바람직하게는 PGI2, PGE1및 이들의 유도체(아날로그)를, 더욱이 바람직하게는 PGI2유도체를 들 수 있다.
또한 「혈소판응집 억제작용을 갖는 물질」이란, 공지의 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질(시판의 항혈소판제 등)의 전부를 포함하는 것으로, 유전자, 단백질, 저분자화합물 등의 어떠한 물질이더라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 상기 PGI2나 PGE1, 또는 이들의 유도체(일로프로스트, 베라프로스트나트륨, lipoPGE1등)라고 하는 프로스타글란딘제제를 들 수 있는 것 외에, 아라키돈산 대사저해제, 아데닐레이트시클라아제 촉진제, 포스포디에스테라아제 III 저해제, 5-HT2리셉터 길항제, 아라키돈산 대사저해제, 또는 포스포디에스테라아제 V 저해제 등을 들 수 있다.
바람직하게는 cAMP를 상승시키는 약제, 또는 프로스타글란딘제제를, 보다 바람직하게는 PGI2, PGE1및 이들의 안정한 유도체(아날로그)를, 더욱이 바람직하게는 PGI2유도체를 들 수 있다.
상기에 있어서 「혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질을 생기게 하는 물질」이란 즉, 상기 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질을 합성, 생산 또는 유도하는 물질을 의미한다. 구체적으로는, 상기 프로스타글란딘이나 cAMP를 상승시키는 물질을 합성, 생산 또는 유도하는 물질을 가리킨다.
해당 물질은 유전자, 단백질, 저분자화합물 등의 어떠한 물질이더라도 좋지만, 예를 들면 혈관 확장물질 등을 합성하는 합성효소의 경우는, 유전자의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 해당 유전자의 구체예로서는, 예를 들면 PGIS 유전자, 시클로옥시게나아제-1(COX-1)유전자, 시클로옥시게나아제-2(COX-2)유전자(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(16), 7384-7388(1992), NO 합성효소(내피형 ·유도형)유전자, 시토크롬 P450 유전자(cytochrome P450 gene), ANP(Atrial Natriuretic Peptide)유전자, BNP(Brain Natriuretic Peptide)유전자, CNP(C-type Natriuretic Peptide)유전자 등을 들 수 있다. 바람직하게는 PGIS 유전자, COX-1 유전자 및 COX-2 유전자를, 보다 바람직하게는 PGIS 유전자를 들 수 있다. 이들 유전자는, 모두 공공의 데이터 베이스에 그 유전자서열이 등록되어 있어, 당업자라면 이들을 이용함으로써 용이하게 클로닝할 수 있다.
이하, PGIS 유전자를 예로 들어 설명한다.
본 발명에 있어서 「PGIS 유전자」란, PGIS 단백을 코드하는 유전자를 가리킨다. 또한, 해당 PGIS 유전자를 발현 가능하도록 발현 플라스미드에 삽입한 것을, 간단히 「PGIS 유전자」라고 칭하는 경우도 있다. 구체적으로는, B.B.R.C, Vol.200, No.3, p1728-1734(1994) 및 국제공개 제95/30013호 공보에 기재의 PGIS의 cDNA를 후술하는 바와 같은 적당한 발현 벡터(비바이러스 벡터, 바이러스 벡터)에 삽입한 것이 예시된다. 더욱이 상기의 HGF 유전자나 VEGF 유전자의 경우와 마찬가지로, 이들 PGIS의 유전자에 대해서 개변 등을 행한 유전자이더라도, PGIS로서의 작용을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인 한, 본 발명의 PGIS 유전자의 범주에 포함된다.
해당 PGIS 유전자도 HGF 유전자나 VEGF 유전자와 마찬가지로, 상기 문헌 기재의 서열 및 데이터 베이스에 등록되어 있는 서열정보를 토대로, 당업자라면 용이하게 클로닝할 수 있고, 또 그 개변 등도 용이하게 행할 수 있다. 해당 유전자에 의해 코드되는 단백질이 목적으로 하는 PGIS 활성을 갖는 것은, 예를 들면, 6-keto Prostaglandin F1 αenzyme immunoassay kit(Cayman사제, 카탈로그번호 #515211)를 사용한 엔자임 이뮤노어세이, 또는 프로스타사이클린 합성효소의 대사산물을 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 검출하는 방법 등에 의해, 측정할 수 있다. 또한 후술하는 실시예에 기재의 마우스 하지 허혈 모델에 대한 혈관 신생인자와의 병용효과를 측정함으로써, 혈관 신생인자에 의한 혈관 신생작용의 증강효과를 측정할 수 있다.
이상과 같은 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질, 또는 해당 물질을 생기게 하는 물질은, 혈관 신생인자의 유전자를 사용한 혈관 신생요법에 있어서, 단독으로 사용하더라도 좋고, 또는 복수를 조합하여 사용하더라도 좋다.
이하, 본 발명의 혈관 신생요법용 의약조성물의 도입방법, 도입형태 및 도입량 등에 대해 기술한다.
1) 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질(유전자)과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 사용하는 경우
혈관 신생인자를 코드하는 유전자와, 상술한 PGIS 유전자 등의 유전자를 병용하는 경우, 즉 2종류 이상의 유전자를 병용하는 경우는, 모두 유전자 치료제의 형태를 취할 필요가 있다. 대표적인 조합으로서는, HGF 유전자와 PGIS 유전자, 또는 VEGF 유전자와 PGIS 유전자의 조합을 들 수 있다.
해당 유전자 치료제를 환자에게 투여하는 경우, 그 투여형태로서는 비바이러스 벡터를 사용한 경우와, 바이러스 벡터를 사용한 경우의 두가지로 크게 나뉘고, 실험입문서 등에 그 조제법, 투여법이 상세하게 해설되어 있다(별책 실험의학, 유전자 치료의 기초기술, 요도샤, 1996, 별책 실험의학, 유전자 도입 & 발현해석 실험법, 요도샤, 1997, 일본 유전자 치료학회편 유전자 치료 개발연구 핸드북, N ·T ·S, 1999). 이하, 구체적으로 설명한다.
A. 비바이러스 벡터를 사용하는 경우
관용의 유전자 발현 벡터에 목적으로 하는 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 사용하여, 아래와 같은 수법에 의해 목적유전자를 세포나 조직에 도입할 수 있다.
세포로의 유전자 도입법으로서는, 인산-칼슘공침법이나, 미소 유리관을 사용한 DNA의 직접주입법 등을 들 수 있다.
또한, 조직으로의 유전자 도입법으로서는, 내포형 리포솜(internal type liposome)에 의한 유전자 도입법, 정전기형 리포솜(electrostatic type liposome)에 의한 유전자 도입법, HVJ-리포솜법, 개량형 HVJ-리포솜법(HVJ-AVE 리포솜법), 리셉터 개재성 유전자 도입법, 파티클총으로 담체(금속입자)와 함께 DNA 분자를 세포에 이입하는 방법, naked-DNA의 직접도입법, 정전하 폴리머에 의한 도입법 등의 어떤 방법에 사용함으로써, 재조합 발현 벡터를 세포내에 삽입시키는 것이 가능하다. 이 중 naked-DNA의 직접도입법이 가장 간편하여, 이 관점에서 바람직한 도입법이다. 또한 HVJ-리포솜법은, 종래의 리포솜법과 비교하여 세포막과의 융합활성이 매우 높기 때문에, 바람직한 도입형태이다. 또한 HVJ로서는 Z주(ATCC로부터 입수 가능)가 바람직하지만, 기본적으로는 그 밖의 HVJ주(예를 들면 ATCC VR-907, ATCC VR-105 등)도 사용할 수 있다.
여기에서 사용되는 발현 벡터로서는, 생체내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터라면 어떤 발현 벡터이더라도 좋지만, 예를 들면 pCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))나, pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV(인비트로겐사, 스트라타진사) 등을 들수 있다.
상기 2종류 이상의 유전자는, 해당 유전자를 각각의 발현 벡터 속에 삽입하여 제작된 2종류 이상의 재조합 발현 벡터를, 혼합하여 동시에, 또는 시간적 간격을 두고 따로 따로, 생체내에 도입할 수 있다. 또한, 하나의 발현 벡터 속에 2종류 이상의 유전자를 삽입한 단일 발현 벡터를 도입하는 것도 가능하다. 더욱이, 상기 리포솜계 제제에 있어서는, 2종류 이상의 재조합 발현 벡터를 하나의 리포솜 속에 봉입하여 도입하는 것도 가능하고, 또한 각각의 리포솜 속에 개개의 재조합 발현 벡터를 봉입하여, 이것을 도입하는 것도 가능하다.
B. 바이러스 벡터를 사용하는 경우
바이러스 벡터로서는, 재조합 아데노바이러스, 레트로바이러스 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 무독화한 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노수반바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 폭스바이러스 (poxvirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 신비스바이러스(Sindbis virus), 센다이 바이러스(Sendai virus), SV40, 면역부전증 바이러스(HIV) 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 목적으로 하는 유전자를 도입하여, 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 세포 내에 유전자를 도입하는 것이 가능하다.
상기 바이러스 벡터 중, 아데노바이러스의 감염효율이 다른 바이러스 벡터를 사용한 경우 보다도 훨씬 높은 것이 알려져 있어, 이 관점으로부터는, 아데노바이러스 벡터계를 사용하는 것이 바람직하다.
이상과 같은 아데노바이러스 벡터에 관해서도, 상술한 비바이러스 벡터의 경우와 마찬가지로, 2종류 이상의 유전자가 각각의 발현 벡터 속에 삽입된 재조합 발현 벡터를 혼합하여 동시에, 또는 시간적 간격을 두고 따로 따로, 도입할 수 있다. 또한, 하나의 발현 벡터 속에 2종류 이상의 유전자를 삽입한 단일 재조합 발현 벡터를 도입하는 것도 가능하다.
더욱이, 상기 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 양쪽을 사용하여, 2종류 이상의 유전자를 생체내에 도입하는 것도 가능하다.
본 발명의 유전자 치료제의 환자로의 도입법으로서는, 유전자 치료제를 직접 체내에 도입하는in vivo법 및 인간으로부터 어떤 종의 세포를 꺼내 체외에서 유전자 치료제를 상기 세포에 도입하고, 그 세포를 체내에 되돌리는ex vivo법이 있다(닛케이사이언스, 1994년 4월호, 20-45페이지, 월간약사, 36(1), 23-48, 1994, 실험의학 증간, 12(15), 1994, 일본 유전자 치료학회편 유전자 치료 개발연구 핸드북, N ·T ·S, 1999). 본 발명에서는,in vivo법이 바람직하다.
in vivo법에 의해 투여하는 경우는, 치료목적의 질환, 표적 장기 등에 따른 적당한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등에 투여하거나, 또는 병변이 인정되는 조직 그 자체에 직접 국소투여할 수 있다.
제제형태로서는, 상기의 각 투여형태에 맞는 여러 제제형태(예를 들면 액제 등)를 취할 수 있다. 예를 들면 유효성분인 유전자를 함유하는 주사제로 된 경우, 해당 주사제는 일반적인 방법에 의해 조제할 수 있어, 예를 들면 적절한 용제(PBS등의 완충액, 생리식염수, 멸균수 등)에 용해한 후, 필요에 따라 필터 등으로 여과 멸균하고, 이어서 무균적인 용기에 충전함으로써 조제할 수 있다. 해당 주사제에는 필요에 따라 관용의 담체 등을 가하더라도 좋다. 또한, HVJ-리포솜 등의 리포솜에 있어서는, 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜제제의 형태로 할 수 있다.
또한, 질환부위의 주위에 유전자를 존재하기 쉽게하기 위해, 서방성 제제(미니펠릿제제 등)를 조제하여 환부 가까이에 메워 넣는 것도 가능하고, 또는 오스모틱 펌프(osmotic pump)등을 사용하여 환부에 연속적으로 서서히 투여하는 것도 가능하다.
상기 2종류 이상의 재조합 발현 벡터는, 각각의 제제형태를 취하더라도 좋고, 또한 혼합한 합제의 제제형태를 취하더라도 좋다.
제제 중의 유전자의 함량은, 치료목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조절할 수 있지만, 통상, 각각의 유전자로서 0.0001~100 mg, 바람직하게는 0.001~10 mg으로, 이것을 수일 내지 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
2) 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질(저분자화합물, 단백질 등)과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 사용하는 경우
혈관 신생인자를 코드하는 유전자와, 저분자화합물이나 단백질, 펩티드 등을 병용하는 경우, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 대해서는 상술한 유전자 치료제의 형태로 한다. 한쪽의 저분자화합물 등은, 일반적인 의약조성물의 형태로 하여, 경구 또는 비경구적으로 투여된다. 대표적인 조합으로서는, HGF 유전자와 PGI2유도체, VEGF 유전자와 PGI2유도체의 조합 등을 들 수 있다.
이하, 상기 저분자화합물이나 단백질 등을 유효성분으로 하는 의약조성물에 대해 설명한다.
상기 저분자화합물이나 단백질 중, 이미 혈관 확장제나 혈소판응집 억제제(항혈소판제)로서 시판되고 있는 것이라면, 그 능서(statement of virtue)에 따라 투여방법이나 투여량 등을 설정할 수 있지만, 일반적으로는 아래와 같은 투여형태, 투여방법을 들 수 있다.
즉, 경구적으로 투여하는 경우, 통상 당분야에서 사용되는 투여형태로 투여할 수 있다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 국소투여제(경피제 등), 직장투여제, 주사제, 경비제 등의 투여형태로 투여할 수 있다.
경구제 또는 직장투여제로서는, 예를 들면 캡슐, 정제, 환, 산제, 드롭, 좌제, 액제 등을 들 수 있다. 주사제로서는, 예를 들면 무균의 용액 또는 현탁액, 유제 등을 들 수 있고, 구체적으로는 물-프로필렌글리콜용액, 완충화액, 0.4%의 생리식염수 등을 들 수 있다. 구소투여제로서는, 예를 들면 크림, 연고, 로션, 경피제 등을 들 수 있다.
이상의 제형은 통상 당분야에서 행해지고 있는 수법에 의해, 약학적으로 허용되는 부형제, 첨가제와 함께 제제화된다. 약학적으로 허용되는 부형제, 첨가제로서는, 담체, 결합제, 향료, 완충제, 증점제, 착색제, 안정제, 유화제, 분산제, 현탁화제, 방부제, pH조절제, 긴장도조절제(tonicity regulating agent), 침윤제 등을 들 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 담체로서는, 예를 들면 탄산마그네슘, 락토오스, 펙틴, 전분, 메틸셀룰로오스 등을 들 수 있다.
이러한 의약조성물은, 치료목적의 질환, 표적 장기 등에 따른 적당한 투여경로에 따라 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등에 투여하거나, 또는 병변이 인정되는 조직 그 자체에 직접 국소투여할 수 있다. 또한 경구투여나 좌약으로서의 투여도 가능하다.
투여량, 투여회수는 증상, 연령, 체중, 투여형태 등에 따라 다르지만, 통상은 성인에 대해 1일당 약 0.0001~약 500 mg의 범위, 바람직하게는 약 0.001~약 100 mg의 범위를 1회 또는 수회에 나눠 투여할 수 있다.
이상과 같은 저분자화합물이나 단백질을 유효성분으로 하는 의약조성물은, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 함유하는 유전자 치료제와 동시에 투여하는 것도 가능하고, 또한 시간적 간격을 두고 따로 따로 투여하는 것도 가능하다.
이상, 본 발명의 혈관 신생요법용 의약조성물에 대해 기술했지만, 해당 의약조성물은, 혈관 신생요법이 필요로 해지는 모든 질환에 대해 적용할 수 있다. 구체적으로는 허혈성 질환 또는 동맥질환을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 심질환으로서는 허혈성 심질환, 심근경색, 급성 심근경색, 심근증, 협심증, 불안정 협심증, 관동맥경화, 심부전 등을 들 수 있으며, 또 사지 허혈성 질환으로서는, 폐색성 동맥경화증(ASO), 버거스병(Berger's disease), 혈관손상, 동맥색전증, 동맥혈전증, 장기동맥폐색, 동맥류(aneurysm) 등을 들 수 있다. 또한 그 이외로서는 뇌혈관장애를 들 수 있다. 뇌혈관장애로서는, 구체적으로는 뇌혈관폐색, 뇌경색, 뇌혈전, 뇌색전, 뇌졸중, 뇌출혈, 모야모야병(moyamoya disease), 뇌혈관성 치매, 알츠하이머형 치매, 뇌출혈 후유증 또는 뇌경색 후유증을 들 수 있다. 본 발명의 의약조성물은, 이들 질환 중 특히 폐색성 동맥경화증에 대해 유효하게 사용된다.
더욱이 본 발명은, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증가제 역시 제공한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 혈관 신생요법용 의약조성물의 유효성분인 상기 물질은, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용을 증강하는 효과를 가지고 있다. 따라서, 상술한 바와 같이 혈관 신생요법용 의약조성물의 한 성분으로서 사용되는 것 외에, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용을 높이기 위한 증강제로서, 단독으로도 사용할 수 있다. 본 발명의 증강제는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자의 효과가 불충분한 경우 등에 유효하게 사용된다. 또한 본 발명의 증강제는, 하나의 성분(물질)만이더라도 좋고, 또한 복수의 성분(물질)을 조합하여 사용하더라도 좋다.
여기에서 본 발명의 증강제의 유효성분으로서는, 구체적으로는 상술한 PGIS 유전자나 COX 유전자, 더 나아가서는 PGI2, PGE1또는 이들의 유도체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 PGIS 유전자를 들 수 있다. 또한, 혈관 신생인자로서는, 상술한 바와 같이 HGF나 VEGF를 들 수 있다.
본 발명의 증강제의 투여방법 ·투여형태, 또한 적응질환 등은, 상기 혈관 신생요법용 의약조성물과 동일하다.
또한 본 발명은, PGIS 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생제 역시 제공한다. 즉 본 발명에 있어서는, PGIS 유전자의 단독투여에 의해 혈관 신생작용이 생기는 것을 처음으로 발견했다. 이것은 종래 알려져 있지 않았던 신규한 작용으로, 이 사실로 인해 처음으로, PGIS 유전자가 혈관 신생제로서 사용할 수 있는 것이 명확해진 것이다. 본 발명의 혈관 신생제는, 상기와 동일한 혈관 신생을 필요로 하는 모든 질환(허혈성 질환 또는 동맥질환)에 사용할 수 있다. 또한 투여방법 ·투여형태 등은, 상기의 혈관 신생요법용 의약조성물과 동일하다.
더욱이 본 발명에 있어서는, ets-1 유전자가 혈관 신생요법을 위한 유전자 치료제로서 유효한 것을 처음으로 명확하게 했다. 즉 후술하는 실시예에 나타내어지는 바와 같이, ets-1 유전자의 단독투여에 의해 혈관 신생작용이 인정된 것 및 ets-1 유전자와 HGF 유전자와의 병용에 의해, 각각 단독으로 투여한 경우와 비교하여, 보다 혈관 신생이 촉진되는 것이 명확해졌다.
여기에서 ets-1이란, HGF나 VEGF, bFGF, EGF 등의 혈관 신생인자의 작용에 의해 공통으로 발현 촉진되는 전사조절인자로, 상기 혈관 신생인자는 ets-1을 매개로 함으로써, 혈관 신생에 관한 여러 인자를 활성화하는 것이 알려져 있다(J. Cell. Physiol., 169, 522-531(1996), HGF의 분자의학, 메디컬뷰사, 179-185(1998)). 따라서, HGF 유전자 뿐 아니라, VEGF 등의 HGF 이외의 혈관 신생인자 유전자와 해당 ets-1 유전자를 병용한 경우에도, 동일한 병용효과가 보여진다고 생각된다.
따라서 본 발명에 있어서는, ets-1 유전자를 단독, 또는 다른 혈관 신생인자와의 병용에 사용하는 것에 관한, 신규한 혈관 신생요법용 의약조성물을 제공하는 것으로, 구체적으로는, 아래의 3가지 형태를 예시할 수 있다.
(1) ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
(2) ets-1 유전자를 유효성분으로 하는 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제.
(3) ets-1 유전자를 유효성분으로 하는 혈관 신생제.
여기에서 「ets-1 유전자」란, ets-1(ets-1 단백)을 코드하는 유전자를 가리킨다. 또한, 해당 ets-1 유전자를 발현 가능하도록 발현 플라스미드에 삽입한 것을, 간단히 「ets-1 유전자」라고 칭하는 경우도 있다. 구체적으로는, GenBank Acc. No. J04101에 등록되어 있고, 또 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(21), 7862-7866(1988)에 기재의 인간 ets-1의 cDNA를, 상술한 바와 같은 유전자 치료용의 적당한 발현 벡터(비바이러스 벡터, 바이러스 벡터)에 삽입한 것을 들 수 있다. 해당 ets-1 유전자는, 상술한 HGF 유전자나 VEGF 유전자와 동일한 수법에 의해 클로닝할 수 있다. 또한, 본 발명의 ets-1 유전자는 천연형에 한정되지 않고, 발현되는 단백질이 ets-1과 실질적으로 동일한 작용을 갖는 유전자인 한, 본 발명의 ets-1 유전자의 범주에 포함된다.
이러한 ets-1 유전자는, 상술한 HGF 유전자나 PGIS 유전자와 동일한 유전자치료제의 형태로 된다. 또한, 그 생체내로의 도입방법이나 도입량, 제조형태 등도, 상기 HGF 유전자나 PGIS 유전자와 동일하게 된다.
상술한 (1)과 같이, ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른(ets-1 이외의)유전자를 병용하는 경우, 이들 2종류 이상의 유전자는, 아래와 같은 투여형태로 된다. 즉 비바이러스 벡터를 사용하는 경우는, 각각의 발현 벡터 중에 삽입하여 제작된 개개의 재조합 발현 벡터를, 혼합하여 동시에, 또는 시간적 간격을 두고 따로 따로, 생체내에 도입할 수 있다. 또한, 하나의 발현 벡터 중에 2종류 이상의 유전자를 삽입한 단일 발현 벡터를 도입하는 것도 가능하다. 더욱이, 투여형태로서 리포솜계의 제제에 있어서는, 상기 개개의 재조합 발현 벡터를 하나의 리포솜 중에 봉입하여 도입하는 것도 가능하고, 또한 각각의 리포솜 중에 개개의 재조합 발현 벡터를 봉입하여, 이것을 도입하는 것도 가능하다.
한편, 바이러스 벡터를 사용하는 경우도, 상기의 비바이러스 벡터의 경우와 마찬가지로, 2종류 이상의 유전자가 각각의 발현 벡터 중에 삽입된 재조합 발현 벡터를 혼합하여 동시에, 또는 시간적 간격을 두고 따로 따로, 도입할 수 있다. 또한, 하나의 발현 벡터 중에 2종류 이상의 유전자를 삽입한 단일 재조합 발현 벡터를 도입하는 것도 가능하다.
더욱이, 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 양쪽을 사용하여, 상기 2종류 이상의 유전자를 생체내에 도입하는 것도 가능하다.
ets-1 유전자와 병용되는 혈관 신생인자의 유전자로서는, 상술한 바와 같이, 새로운 혈관의 형성을 유도할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 이들의 일부분을코드하는 유전자라면 어떠한 것이더라도 좋지만, 바람직하게는 HGF 유전자 및 VEGF 유전자를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 HGF 유전자를 들 수 있다.
또한 본 발명의 ets-1 유전자는, 상술한 (2)와 같이, HGF나 VEGF 등의 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용을 증강하기 위한 증강제로서, 단독으로 사용하는 것도 가능하다. 이러한 ets-1 유전자를 유효성분으로 하는 증강제는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자의 효과가 불충분한 경우 등에 유효하게 사용된다. 특히, HGF 유전자의 작용을 증강하는 증강제로서, 유효하게 사용된다. 더욱이 본 발명의 ets-1 유전자는, 상술한 (3)과 같이, 혈관 신생제로서 단독으로 사용하는 것도 가능하다. 이와 같이 ets-1 유전자를 단독으로 사용하는 경우도, 상기와 동일한 유전자 치료제로서의 투여방법, 투여형태를 취한다.
이상과 같은 ets-1 유전자를 사용한 혈관 신생요법이 적응되는 질환으로서는, 구체적으로는 허혈성 질환 또는 동맥질환을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 심질환으로서는 허혈성 심질환, 심근경색, 급성 심근경색, 심근증, 협심증, 불안정 협심증, 관동맥경화, 심부전 등을 들 수 있고, 또한 사지 허혈성 질환으로서는, 폐색성 동맥경화증(ASO), 버거스병, 혈관손상, 동맥색전증, 동맥혈전증, 장기동맥폐색, 동맥류 등을 들 수 있다. 또한 그것 이외로서는 뇌혈관장애를 들 수 있다. 뇌혈관장애로서는, 구체적으로는 뇌혈관폐색, 뇌경색, 뇌혈전, 뇌색전, 뇌졸중, 뇌출혈, 모야모야병, 뇌혈관성 치매, 알츠하이머형 치매, 뇌출혈 후유증 또는 뇌경색 후유증을 들 수 있다. 본 발명의 ets-1 유전자를 유효성분으로 하는 의약조성물은, 이들 질환 중 특히 폐색성 동맥경화증에 대해 유효하게 사용된다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, PGIS 유전자, HGF 유전자 + PGIS 유전자)를 투여한 후, 하지 혈류를 레이저 도플러 이메이져(Laser Doppler Imager)를 사용하여 측정하여, 좌우의 비의 경시변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, PGIS 유전자, HGF 유전자 + PGIS 유전자)를 투여한 후, 하지 혈류를 레이저 도플러 이메이져를 사용하여 측정하여, 유전자 투여전에 대한 좌우의 비의 증가율을 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, PGIS 유전자, HGF 유전자 + PGIS 유전자)를 투여한 후, 허혈지 근육내 모세혈관수를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, ets-1 유전자, HGF 유전자 + ets-1 유전자)를 투여한 후, 하지 혈류를 레이저 도플러 이메이져를 사용하여 측정하여, 좌우의 하지 혈류비의 증가율을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, ets-1 유전자, HGF 유전자 + ets-1 유전자)를 투여한 후, 허혈지 근육내 모세혈관 밀도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대해 각 유전자(대조, HGF 유전자, ets-1 유전자, HGF 유전자 + ets-1 유전자)를 투여한 후, 허혈지 근육 중의 래트 HGF 농도를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대해 ets-1 유전자를 투여한 후, 허혈지 근육 중의 래트 HGF 농도를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해 PGIS 유전자, VEGF 유전자, 또는, VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 투여한 후, 허혈 하지근육 중의 인간 VEGF 농도를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는, 마우스 하지 허혈 ASO 모델을 위한 수술로부터 10일 후의 미처리 오른쪽 하지(정상) 및 왼쪽 하지(ASO)의 LDI에 의한 혈류비를 나타내는 그래프이다.
도 10은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해, PGIS 유전자, VEGF 유전자, 또는 VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 투여한 2주일 후, 허혈 하지근육 중의 LDI에 의한 혈류량의 증가율을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해, PGIS 유전자, VEGF 유전자, 또는 VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 투여한 4주일 후, 허혈 하지근육 중의 LDI에 의한 혈류량의 증가율을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해, PGIS 유전자 및 HGF 유전자, VEGF 유전자, 또는 VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 투여한 4주일 후, 허혈 하지근육의 동결 절편을 알칼리포스파타아제 염색(alkaline phosphatase staining)에 의해 염색한 사진이다.
도 13은, 마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대해, PGIS 유전자, VEGF 유전자, 또는 VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 투여한 4주일 후의 모세혈관 밀도를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대한 HGF 유전자, PGIS 유전자의 투여효과
(1) 재료
인간 HGF 유전자는, 인간 HGF의 cDNA(일본국 특개평5-111383호 공보에 기재)는 일반적인 방법에 의해 클로닝하고, 이것을 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus)(CMV)프로모터를 갖는 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)(Invitrogen사)에 삽입한 것을 사용했다.
인간 PGIS 유전자는, 인간 PGIS의 cDNA(B.B.R.C.,Vol.200,No.3,P1728-1734(1994))를 일반적인 방법에 의해 클로닝하고, 이것을 CMV 엔헨서와 β-액틴 프로모터를 갖는 발현 플라스미드 pCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))에 삽입한 것을 사용했다.
(2) 방법
C57BL/6J계 마우스(8주령, 수컷)를 사용했다. 10배 희석의 넴부탈(Nembutal)을 200 ㎕ 복강내 투여하고, 추가가 필요한 경우는 에테르를 흡입시킴으로써, 마우스를 마취했다. 그 후 왼쪽 하지의 동정맥을 결찰하여, 마우스 하지 허혈 ASO 모델을 제작했다. 그 10일 후, Laser Doppler Imager(LDI, Moor Instruments Ltd사제, MLDI5070)를 사용하여 양 하지의 혈류를 평가하고, 좌우의 비율을 산출했다. 평가 후, 왼쪽 하지근육 내에, 상기 (1)의 유전자를 naked plasmid의 형태로 각각 500 ㎍ 투여했다. 군으로서는, 아무 것도 투여하지 않는 대조군, HGF 유전자 단독투여군, PGIS 유전자 단독투여군, HGF 유전자 및 PGIS 유전자 병용군의 4군을 설정했다. 유전자투여 2주일 후 및 4주일 후에도 LDI를 사용하여 혈류를 평가하고, 비교를 산출했다. 또한, 4주일 후에 왼쪽 하지근육을 적출하여, 동결 절편을 제작 후, 알칼리포스파타아제 염색에 의해 근육 내의 모세혈관 밀도를 측정했다. 또한 유의차검정(significant difference test)은 Fisher's PLSD법에 의해 행했다.
(3) 결과
LDI에 의해 측정한 좌우 하지 혈류비율의 경시변화를 도 1에 나타냈다. 또한, 유전자 투여 전의 LDI 비율에 대한 증가율을 도 2에 나타냈다. PGIS 유전자의 투여에 의해 2주일 후의 혈류는 개선되었지만, 4주 후에서는 대조군과 거의 동등했다. HGF 유전자의 투여에 의해 2, 4주일 후의 혈류가 개선되었다. 또한 PGIS 유전자와 HGF 유전자를 병용함으로써, 각 유전자 단독투여의 경우와 비교하여 예상외로 현저하게, 혈류가 개선되었다(2주일 후: 대조: 100%, HGF 유전자 투여: 132%, PGIS 유전자 투여: 125%, HGF 유전자 + PGIS 유전자 투여: 177%, P<0.01; 4주일 후: 대조: 100%, HGF 유전자 투여: 150%, PGIS 유전자 투여: 104%, HGF 유전자 + PGIS 유전자 투여: 166%, p<0.01).
유전자 투여 4주일 후의 근육 내 모세혈관 밀도를 도 3에 나타냈다. PGIS 유전자 또는, HGF 유전자 투여에 의해 모세혈관 밀도가 증가했다. 또한, PGIS 유전자와 HGF 유전자를 병용함으로써, 각 유전자 단독 보다도 현저하게 모세혈관 밀도가 증가했다.
[실시예 2]
래트 하지 허혈 ASO 모델에 대한 HGF 유전자, ets-1 유전자의 투여효과
(1) 재료
인간 HGF 유전자를 갖는 발현 플라스미드는, 실시예 1과 동일한 것을 사용했다. 또한, 인간 ets-1 유전자에 관해서는, 인간 ets-1의 cDNA(GenBank Acc.No.J04101, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(21), 7862-7866(1988))를 일반적인 방법에 의해 클로닝하여, 이것을 시판의 발현 벡터에 삽입한 것을 사용했다.
(2) 방법
Sprauge Dawley 래트(12주령, 수컷)를 사용했다. 한쪽의 대퇴동맥을 적출하여, 래트 하지 허혈 ASO 모델을 제작했다. 그 1주일 후, 왼쪽 하지 근육 내에 HVJ-liposome법을 사용하여 유전자를 각 100 ㎍ 투여했다. 군으로서는, 벡터만의 대조군, HGF 유전자 단독투여군, ets-1 유전자 단독투여군, HGF 유전자 및 ets-1 유전자 병용군의 4군을 설정했다. 유전자 투여 전과 유전자 투여 4주일 후에 Laser Doppler Imager(LDI)를 사용하여, 양 하지의 혈류를 평가하고, 좌우의 혈류비의 증가율을 산출했다. 또한, 왼쪽 하지 근육을 적출하여, 동결 절편을 제작 후, 알칼리포스파타아제 염색에 의해 근육 내의 모세혈관 밀도를 측정했다. 내인성 HGF의 발현에 대한 유전자 투여의 영향을 조사하기 위해, 허혈지 근육 중의 래트 HGF 농도를 ELISA 키트(특수면역연구소제)를 사용하여 측정했다.
(3) 결과
ets-1 유전자의 단독투여에 의해, 근육조직 내의 ets-1 binding 활성이 상승했다. 또한, ets-1 유전자 투여에 의해, LDI를 사용하여 측정한 하지 혈류비의 증가율이 상승하고(도 4), 근육 내 모세혈관 밀도가 증가했다(도 5). 즉, ets-1 유전자 단독투여에 의한 혈관 신생효과와 ASO 모델에 대한 유효성이 나타내어졌다. 또한, ets-1 유전자 단독투여군에서는, 허혈지 근육 중의 HGF 농도가 상승하고 있어(도 6 및 도 7), ets-1 유전자 투여의 유효성 메커니즘의 하나로 생각되었다.
ets-1 유전자를 HGF 유전자와 함께 투여한 군에서는, ets-1 유전자 단독, HGF 유전자 단독을 투여한 군 보다도 LDI 혈류비의 증가율이 현저하게 상승하고(도 4), 근육 내 모세혈관 밀도도 유의하게 증가했다(도 5). 즉, ets-1 유전자 또는 HGF 유전자를 단독으로 유전자 도입하는 것 보다도, 양 유전자를 함께 유전자 도입하는 쪽이 보다 혈관 신생이 촉진되어, 보다 ASO에 대해 유효한 것이 나타내어졌다.
래트 허혈지 근육 중의 내인성 HGF 농도를 측정한 바, HGF 유전자 단독투여군 보다도 HGF 유전자와 ets-1 유전자를 병용한 군에서 래트 HGF 농도가 높았다(도 6). HGF 유전자를 단독으로 투여한 경우 보다도 ets-1 유전자를 함께 투여한 경우에, 내인성 HGF의 발현은 촉진된 것으로부터, HGF가 ets-1의 활성화를 통한 auto-loop형의 조절기구를 가지고 있는 것이 시사되었다.
[실시예 3]
마우스 하지 허혈 ASO 모델에 대한 VEGF 유전자, PGIS 유전자의 투여효과
(1) 재료
인간 VEGF 유전자는, 인간 VEGF165의 cDNA(규슈대학 제2외과, 요네미츠선생으로부터 공여)를 일반적인 방법에 의해 클로닝하여, 이것을 CMV 엔헨서와 β-액틴 프로모터를 갖는 발현 플라스미드 pCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))의 EcoRI 사이트에 삽입한 것을 사용했다.
인간 PGIS 유전자는, 인간 PGIS의 cDNA(B.B.R.C.,Vol.200,No.3,p1728-1734(1994))를 일반적인 방법에 의해 클로닝하여, 이것을 CMV 엔헨서와 β-액틴 프로모터를 갖는 발현 플라스미드 pCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))에 삽입한 것을 사용했다.
(2) 방법
1. C57BL/6J계 마우스(8주령, 수컷)를 사용했다. 10배 희석의 넴부탈을 200 ㎕ 복강 내 투여하고, 추가가 필요한 경우는 에테르를 흡입시킴으로써, 마우스를 마취했다. 그 후 왼쪽 하지의 동정맥을 결찰하여, 마우스 하지 허혈 ASO 모델을 제작했다. 평가 후, 왼쪽 하지 근육 내에, 상기 (1)의 유전자를 naked plasmid의 형태로 각각 1 mg 투여했다. 군으로서는, 아무 것도 투여하지 않는 대조군, VEGF 유전자 단독투여군, PGIS 유전자 단독투여군, VEGF 유전자 및 PGIS 유전자 병용군의 4군을 설정했다. 각 군에는 4마리의 동물이 포함되었다. 좌경골근(left tibialismuscle)에 각 플라스미드를 투여 후 5일째에, 허혈 하지 근육 중의 인간 VEGF 단백질의 농도를, AN'ALYZA Immunoassay System human VEGF 키트(GENZYME)를 사용하여 측정했다(도 8).
2. 상술한 방법과 동일한 방법에 의해 마우스 하지 허혈 ASO 모델을 제작했다. 그 10일 후, Laser Doppler Imager(LDI, Moor Instruments Ltd사제, MLDI5070)를 사용하여 양 하지의 혈류를 평가하고, 좌우의 비율을 산출했다(도 9; 오른쪽 다리(정상), 왼쪽 하지(ASO)). 그 결과, 왼쪽 하지에 있어서 혈류가 정상인 경우를 100%로 한 경우에, 그 약 30%까지 혈류량이 감소하고 있는 것이 확인되었다. 평가 후, 왼쪽 하지 근육 내에, 상기 (1)의 유전자를 naked plasmid의 형태로 각각 500 ㎍ 투여했다. 군으로서는, 아무 것도 투여하지 않는 대조군, VEGF 유전자 단독투여군, PGIS 유전자 단독투여군, VEGF 유전자 및 PGIS 유전자 병용군의 4군을 설정했다. 유전자 투여 2주일 후 및 4주일 후에도 LDI를 사용하여 혈류를 평가하고, 그 증가율을 산출했다. 또한, 4주일 후에 왼쪽 하지 근육을 적출하여, 동결 절편을 제작 후, 알칼리포스파타아제 염색하여(도 12), 근육 내의 모세혈관 밀도를 측정했다. 또한, 유의차검정은, Fisher's PLSD법에 의해 행했다.
(3) 결과
1. 도 8에 나타내는 바와 같이, 허혈 하지 근육 중의 인간 VEGF 단백질의 농도는, 대조 및 PGIS 유전자만을 투여한 경우에는 검출되지 않고, VEGF 유전자만을 투여한 경우 보다도, VEGF 유전자 및 PGIS 유전자를 함께 투여한 경우에 보다 많이 검출되었다.
2. LDI에 의해 측정한 왼쪽 하지 혈류의 2주일 후의 증가율을 도 10에, 그리고 4주일 후의 증가율을 도 11에 나타냈다. VEGF 유전자 단독 및 VEGF 유전자 및 PGIS 유전자의 투여에 의해 2주일 후의 혈류는 개선되지 않지만, 4주일 후에서는 대조군과 비교하여 VEGF 유전자 단독, 그리고 VEGF 유전자 및 PGSI 유전자의 투여에 의해 혈류가 개선되었다. PGIS 유전자와 VEGF 유전자를 병용함으로써, 각 유전자 단독투여의 경우와 비교하여 예상외로 현저하게, 혈류가 개선되었다(2주일 후: 대조: 100%, PGIS 유전자 투여: 105%, VEGF 유전자 투여: 117%, VEGF 유전자 + PGIS 유전자 투여: 115%, 4주일 후: 대조: 100%, PGIS 유전자 투여: 103%, VEGF 유전자 투여: 130%, VEGF 유전자 + PGIS 유전자 투여: 169%, P<0.01).
유전자 투여 4주일 후의 근육 내 모세혈관 농도를 도 13에 나타냈다. VEGF 유전자 투여에 의해 모세혈관 밀도가 증가했다. 또한, PGIS 유전자와 VEGF 유전자를 병용함으로써, 각 유전자 단독 보다도 현저하게 모세혈관 밀도가 증가했다(대조: 100%, PGIS 유전자 투여: 175%, VEGF 유전자 투여: 221%, VEGF 유전자 + PGIS 유전자 투여: 338%, P<0.0001).
산업상이용가능성
본 발명에 의해, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는, 신규하고 또한 유효성이 높은, 혈관 신생요법용 의약조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 의해, 프로스타사이클린 합성효소 유전자나 ets-1 유전자라고 하는, 종래는 혈관 신생요법에 사용될 수 있는 것을 알지 못했던 유전자가, 해당 혈관 신생요법에 적용할 수 있는 것을 새롭게 발견함으로써, 이들 유전자를 유효성분으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물을 제공할 수 있다.
Claims (31)
- 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종과, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질을 생기게 하는 물질이, 유전자의 형태인 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제4항에 있어서, 유전자가 프로스타사이클린 합성효소 유전자인 혈관 신생요법용 의약조성물.
- HGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- HGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- VEGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- VEGF 유전자와 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제10항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환이, 폐색성 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 심근증 또는 뇌혈관장애 중 어느 하나인 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자를 naked DNA의 형태로 도입하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 혈관 확장작용 및/또는 혈소판응집 억제작용을 갖는 물질 및 해당 물질을 생기게 하는 물질로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로서 함유하는, 혈관 신생인자를 코드하는 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제.
- 제13항에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생작용의 증강제.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생작용의 증강제.
- 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 HGF 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생작용의 증강제.
- 프로스타사이클린 합성효소 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생제.
- 제18항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는혈관 신생제.
- ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- ets-1 유전자와 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생요법용 의약조성물.
- HGF 유전자와 ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- HGF 유전자와 ets-1 유전자를 병용하는 것을 특징으로 하는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생요법용 의약조성물.
- ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생인자를 코드하는 다른 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제.
- 제26항에 있어서, 혈관 신생인자가 HGF 및/또는 VEGF인 혈관 신생작용의 증강제.
- ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 HGF 유전자에 의한 혈관 신생작용의 증강제.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥질환의 치료 또는 예방에 사용되는 혈관 신생작용의 증강제.
- ets-1 유전자를 유효성분으로서 함유하는 혈관 신생제.
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