KR20030010011A - A process of extraction of epigallocatechin gallate from green tea - Google Patents
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Abstract
본 발명은 녹차로부터 얻어지는 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분쇄된 녹차에 물을 첨가하고 가열하여 추출하는 단계; 상기 단계에서 얻어진 추출액을 클로로포름에 분배시켜 불순물을 제거하는 단계; 상기 물층을 분리한 후 에틸아세테이트에 분배시키는 단계; 상기 에틸아세테이트 층을 분리한 후 역상 크로마토그래피에 적용시키는 단계로 구성된 녹차로부터 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법에 관한 것으로서, 본 발명의 추출방법은 에피칼로카테킨 갈레이트를 고수율로 선택적으로 용이하게 얻을 수 있으며, 상기 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트는 항산화력이 우수하여 항산화제로 특히 화장품 분야에 적용될 수 있다.The present invention relates to a method for extracting epigallocatechin gallate obtained from green tea, and more particularly, adding water to ground green tea and extracting it by heating; Distributing the extract obtained in the above step in chloroform to remove impurities; Separating the water layer and distributing to ethyl acetate; A method for extracting epigallocatechin gallate from green tea consisting of separating the ethyl acetate layer and applying it to reverse phase chromatography, and the extraction method of the present invention is easy to selectively select epicalocatechin gallate in high yield. The epigallocatechin gallate extracted may be excellent in antioxidant power and may be particularly applied to cosmetics as an antioxidant.
Description
본 발명은 녹차로부터 얻어지는 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분쇄된 녹차에 물을 첨가하고 가열하여 추출하는 단계; 상기 단계에서 얻어진 추출액을 클로로포름에 분배시켜 불순물을 제거하는 단계; 상기 물층을 분리한 후 에틸아세테이트에 분배시키는 단계; 상기 에틸아세테이트 층을 분리한 후 역상 크로마토그래피에 적용시키는 단계로 구성된 녹차로부터 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법에 관한 것으로서, 본 발명의 추출방법은 에피칼로카테킨 갈레이트를 고수율로 선택적으로 용이하게 얻을 수 있으며, 상기 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트는 항산화력이 우수하여 항산화제로 특히 화장품 분야에 적용될 수 있다.The present invention relates to a method for extracting epigallocatechin gallate obtained from green tea, and more particularly, adding water to ground green tea and extracting it by heating; Distributing the extract obtained in the above step in chloroform to remove impurities; Separating the water layer and distributing to ethyl acetate; A method for extracting epigallocatechin gallate from green tea consisting of separating the ethyl acetate layer and applying it to reverse phase chromatography, and the extraction method of the present invention is easy to selectively select epicalocatechin gallate in high yield. The epigallocatechin gallate extracted may be excellent in antioxidant power and may be particularly applied to cosmetics as an antioxidant.
녹차는 최근 건강식품으로 주목을 받고 있는 물질로서 많은 유용한 성분을 포함하고 있으며, 그 중 카테킨 화합물은 항산화 효과가 크기 때문에, 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 상기 녹차에 포함된 카테킨 화합물은 예를들면, 에피갈로카테킨(epigallocatechin; EGC), 에피카테킨(epicatechin; EC), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)와 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate; ECG)등이 있다. 상기 카테킨 화합물은 항산화 효과가 우수하며, 이외에 항암 효과, 면역체계강화, 피부암 예방, 항혈전 효과, 심장병 예방과 콜레스테롤 예방 등의 효과를 가지고 있다[Masami Suganuma, et al.,Mutation Research, 428, 339 (1999);Chi Han, et al.,Cancer letter, 114, 153 (1997);W. S. Kang, et al.,Nutritional Pharmaceuticals,16, 315 (1999); Ian R. Record, et al.,Mutation Research, 422, 191, (1998)].Green tea has recently attracted attention as a health food, and contains many useful ingredients. Among them, catechin compounds have a large antioxidant effect, and thus many studies have been conducted. The catechin compound included in the green tea is, for example, epigallocatechin (EGC), epicatechin (EC), epigallocatechin gallate (EGCG) and epicatechin gallate (ECG) ). The catechin compound has an excellent antioxidant effect, and also has anti-cancer effects, immune system enhancement, skin cancer prevention, antithrombotic effect, heart disease prevention and cholesterol prevention [Masami Suganuma, et al., Mutation Research , 428, 339 ( 1999 ); Chi Han, et al., Cancer letter , 114, 153 ( 1997 ); WS Kang, et al., Nutritional Pharmaceuticals, 16, 315 ( 1999 ); Ian R. Record, et al., Mutation Research , 422, 191, ( 1998 )].
따라서, 녹차에 포함된 카테킨 화합물의 음료와 제약 분야에 대한 응용이 계속 연구되어지고 있다. 녹차에 대한 연구가 가장 활발하게 진행되고 있는 곳은 중국으로 이미 녹차에 관한 많은 제품들이 상품화되고 있다. 현재 시밍산 천연 생물학적 생산품(주), 중국 티안바오 생화학 공장(Simingshan natural biological product Co., Ltd, China tianbao biochemical plant)과 헬스랜드공급(주)(HealthLand Supplies Ltd.)등의 회사에서는 녹차 추출물에 대한 제품이 시판되고 있으며 많은 연구가 진행 중이다. 일본에서도 카테킨 화합물에 대한 연구 결과 大同藥品工業株式會社의 'β-카테킨'과 三井農林株式會社와 三明株式會社의 '카테킨 화합물 분말'은 이미 상업화가 이루어졌으나 보다 높은 수율 및 경제성을 갖는 공정을 얻기 위해서 계속적인 연구와 투자를 아끼지 않고 있다 [일본특허 제 08 26 991호, 1996 : 일본특허 제 08 03 053호, 1996].Therefore, the application of the catechin compound contained in green tea to the beverage and pharmaceutical fields is continuously studied. The most active research on green tea is in China, where many products are already commercialized. At present, companies such as Simingshan Natural Biological Products Co., Ltd., Simingshan Natural Biological Products Co., Ltd, China tianbao biochemical plant and HealthLand Supplies Ltd. Korean products are commercially available and a lot of research is in progress. As a result of research on catechin compounds in Japan, 'β-catechin' and 'catechin compound powders' of Sanitin Corporation and Santen Co., Ltd. have already been commercialized, but have a higher yield and economical process. To this end, he has spared no effort in research and investment [Japanese Patent No. 08 26 991, 1996: Japanese Patent No. 08 03 053, 1996].
상기 카테킨 화합물 중 에피갈로카테킨 갈레이트는 항산화성이 우수하여, 일반 화장품의 항산화제로 많이 쓰이고 있는 비타민 C에 비하여 20배, 비타민 E보다는 30배, BHA나 BHT보다는 2 ∼ 4배 강한 항산화 효과를 가지고 있다고 알려져 있다 [Vinson, F. A., et al.,J. of Agricultural and Food Chemistry, 43, 2800 (1995)].Epigallocatechin gallate of the catechin compound is excellent in antioxidant properties, 20 times higher than vitamin C, 30 times higher than vitamin E, and 2 to 4 times stronger than BHA or BHT. (Vinson, FA, et al., J. of Agricultural and Food Chemistry , 43, 2800 ( 1995 )).
항산화제는 반응성이 높은 성분으로 자유 라디칼이 DNA나 다른 생체 세포와 반응하기 전에 자유 라디칼을 흡수하여 세포를 보호하는 역할을 하여 피부 변형 속도를 감소시키는 효과를 가져온다. 따라서 앞으로의 화장품 산업에서 카테킨 화합물의 항산화 효과가 상당한 주목을 받을 것으로 기대된다.Antioxidants are highly reactive ingredients that absorb free radicals and protect the cells before they react with DNA or other living cells, reducing the rate of skin transformation. Therefore, the antioxidant effect of the catechin compound is expected to receive considerable attention in the future cosmetic industry.
실제로, 녹차를 화장품의 원료로 사용하여 상품화된 제품이 이미 시판되고 있다. 영국에서는 Elizabeth Arden이라는 상품명으로 판매되고 있으며 국내에서도 태평양 화장품에서 녹차팩이 상용화되고 있다. 미국에서도 카테킨 화합물을 생산하기 위한 방법과 공정에 대한 특허[미합중국특허 제6,210,679호, 4/2001, David T., Bailey et al. : 미합중국특허 제4,613,672호, 9/1986, Yukihiko Hara, Shizuoka et al.]가 발표되었고 특히 자외선 차단을 위하여 녹차를 화장품 원료로 사용하는 방법에 대한 특허 [미합중국특허 제5,306,486호, John P., McCook, Guilford et al.]가 이미 발표되었다.In fact, products commercialized using green tea as a raw material for cosmetics are already commercially available. It is sold under the brand name Elizabeth Arden in the UK, and green tea packs are commercially available in Pacific cosmetics in Korea. Patents for methods and processes for producing catechin compounds in the US [US Pat. No. 6,210,679, 4/2001, David T., Bailey et al. : U.S. Patent Nos. 4,613,672, 9/1986, Yukihiko Hara, Shizuoka et al.] And published patents on the use of green tea as a cosmetic ingredient, particularly for UV protection [US Pat. No. 5,306,486, John P., McCook , Guilford et al. Have already been published.
이에 본 발명자들은 녹차에 함유된 카테킨 화합물, 특히 에피갈로카테킨 갈레이트를 추출하고자 노력한 결과, 물 또는 알코올을 이용하여 녹차로부터 카테킨 화합물을 추출하고, 얻어진 카테킨 화합물 추출물을 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 분배하고, 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 에피갈로카테킨 갈레이트를 선택적으로 고수율로 추출하였으며, 상기 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트가 항산화성이 매우 우수함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors tried to extract the catechin compound, especially epigallocatechin gallate, contained in green tea, and extracted the catechin compound from green tea using water or alcohol, and the obtained catechin compound extract was extracted using chloroform and ethyl acetate. After partitioning, separation and purification by chromatography, epigallocatechin gallate was selectively extracted in high yield, and the epigallocatechin gallate extracted was found to be very excellent in antioxidant activity, thus completing the present invention.
본 발명의 목적은 녹차로부터 항산화성이 우수한 에피갈로카테킨 갈레이트를 고수율로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for extracting epigallocatechin gallate having excellent antioxidant properties from green tea in high yield.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 녹차로부터 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트를 포함하는 화장품용 항산화제를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an antioxidant for cosmetics comprising epigallocatechin gallate extracted from the green tea.
도 1은 본 발명의 에피갈로카테킨 갈레이트 추출 공정을 간략히 도식화한 것이고, 1 is a schematic of the epigallocatechin gallate extraction process of the present invention,
도 2는 추출 용매 및 온도에 따라 녹차 잎으로부터 추출된 카테킨 화합물을 분석한 크로마토그래피로; 2 is a chromatographic analysis of catechin compounds extracted from green tea leaves according to extraction solvent and temperature;
는 50 ℃물을, ··는 100 ℃물을, － 는 80 ℃물을, ‥‥ 는 40 ℃에탄올을 나타낸다.50 represents 50 ° C. water, · · represents 100 ° C. water, − represents 80 ° C. water, and… represents 40 ° C. ethanol.
도 3은 물로 추출된 카테킨 화합물 추출물을 클로로포름으로 분배 후 물층에 존재하는 카테킨 화합물을 분석한 크로마토그래피로; 3 is a chromatographic analysis of the catechin compound present in the water layer after dispensing the catechin compound extract extracted with water to chloroform;
‥‥ 는 클로로포름으로 1회 분배한 것이고, － 는 클로로포름으로 3회 분배한 것이다.... is distributed once in chloroform, and-is distributed three times in chloroform.
도 4는 클로로포름을 이용하여 분배 후 클로로포름 층에 존재하는 카페인을 분석한 크로마토그래피로; 4 is a chromatographic analysis of caffeine present in the chloroform layer after distribution using chloroform;
－ 는 1회 분배, 는 2회 분배, ‥‥ 는 3회 분배한 것이다.-Is distributed once, is distributed twice, and ... is distributed three times.
도 5는 에틸아세테이트로 2차 분배 후 에틸아세테이트 층을 제조용 역상 액체 크로마토그래피로 분석한 그래프이고, 5 is a graph of an ethyl acetate layer analyzed by reversed phase liquid chromatography for preparative distribution with ethyl acetate,
이때 이동상으로는0.1 % 아세트산을 포함한 물 : 아세토나이트릴 : 에틸아세테이트 = 85 : 12 : 3 (v/v)을 사용하였고, 이때 유속은 20 ml/min 이다.In this case, water: acetonitrile: ethyl acetate = 85: 12: 3 (v / v) containing 0.1% acetic acid was used, and the flow rate was 20 ml / min.
도 6은 카테킨 화합물을 크로마토그래피를 이용하여 에피갈로카테킨 갈레이트를 분리한 그래프로, 6 is a graph of epigallocatechin gallate separated using a catechin compound chromatography,
이때 이동상으로는 0.1 % 아세트산을 포함한 물 : 아세토나이트릴 : 에틸아세테이트 = 87 : 10 : 3 (v/v)을 사용하였고, 유속은 20 ml/min 이다.In this case, water: acetonitrile: ethyl acetate = 87: 10: 3 (v / v) containing 0.1% acetic acid was used, and the flow rate was 20 ml / min.
도 7은 본 발명에서 추출한 에피갈로카테킨 갈레이트 카테킨 화합물, 에피갈로카테킨 갈레이트, 일본 이시마로사의 녹차, 비타민 E를 각각 0.05 %, 0.005 % 농도에서 측정한 항산화력을 나타낸 그래프이다. FIG. 7 is a graph showing the antioxidant activity of the epigallocatechin gallate catechin compound, epigallocatechin gallate, green tea from Japan, Ishimarosa, and vitamin E, measured at 0.05% and 0.005%, respectively.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention
a) 분쇄된 녹차에 물 또는 에탄올을 첨가하고 가열하여 추출하는 단계(단계 1);a) adding water or ethanol to the ground green tea and extracting by heating (step 1);
b) 얻어진 추출액을 클로로포름에 분배시켜 불순물을 제거하는 단계(단계 2);b) dispersing the obtained extract in chloroform to remove impurities (step 2);
c) 단계 b)의 물층을 분리한 후 에틸아세테이트에 분배시키는 단계(단계 3)c) separating the water layer of step b) and partitioning into ethyl acetate (step 3)
d) 에틸아세테이트 층을 분리한 후 역상 크로마토그래피에 적용시키는 단계(단계 4)로 구성된 녹차로부터 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법을 제공한다.d) providing an extraction method of epigallocatechin gallate from green tea consisting of the step of separating the ethyl acetate layer and then subjected to reverse phase chromatography (step 4).
본 발명의 추출방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.(도 1참조)The extraction method of the present invention will be described in detail for each step. (See FIG. 1 ).
단계 1에서는, 녹차를 물 또는 에탄올 용매 하에서 40 ∼ 100 ℃로 가열하여 녹차에 포함된 카테킨 화합물을 추출한다.In step 1, the green tea is heated to 40-100 ° C. under water or ethanol solvent to extract the catechin compound contained in the green tea.
보다 구체적으로, 물로 추출하는 경우 40 ∼ 100 ℃, 바람직하기로는 80 ∼ 100 ℃에서 추출한다. 80 ℃에서 추출하는 경우, 약 40분, 100 ℃에서 추출하는 경우 약 15분 정도가 소요되었다. 온도에 따른 카테킨 화합물의 추출 함량을 살펴보면도 2에 나타난 바와 같이, 80 ∼ 100 ℃에서 추출한 경우 많은 양의 카테킨 화합물을 추출할 수 있다. 온도에 따른 물/에탄올에 대한 카테킨 화합물은 충분히 용해되었지만 시간에 따른 용해도를 함께 고려해야 한다.More specifically, in the case of extraction with water, the extraction is performed at 40 to 100 ° C, preferably 80 to 100 ° C. Extraction at 80 ° C. took about 40 minutes and extraction at 100 ° C. took about 15 minutes. Looking at the extraction content of the catechin compound according to the temperature, as shown in Figure 2 , when extracted at 80 ~ 100 ℃ can extract a large amount of catechin compound. The catechin compound for water / ethanol over temperature was sufficiently dissolved but the solubility over time should also be considered.
본 발명의 실시예에 따르면,도 2에 나타나 있는 것처럼, 에탄올을 50 ℃에서 사용하여 추출한 경우, 40 ℃의 물을 사용하여 추출한 것에 비하여 추출양은 많았으나, 80 ∼ 100 ℃ 의 물을 사용하여 추출한 것에 비해서 추출량이 적었다. 에탄올을 추출하는 경우, 에탄올에 에틸아세테이트와 섞이는 관계로, 에탄올을 농축시킨 후 잔사에 물을 첨가하여 다음 단계를 진행한다.According to an embodiment of the present invention, as shown in Figure 2 , when extracted using ethanol at 50 ℃, the amount of extraction compared to the extraction using 40 ℃ water, but extracted using water of 80 ~ 100 ℃ The extraction amount was lower than that. When ethanol is extracted, ethanol is mixed with ethyl acetate, and ethanol is concentrated, and then water is added to the residue to proceed to the next step.
단계 1에서 추출된 카테킨 화합물은 크로마토그래피로 분석 결과(도 2) 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 카페인 및 불순물이 포함되어 있음을 알 수 있다.The catechin compound extracted in step 1 is analyzed by chromatography ( FIG. 2 ) and it can be seen that epicatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate, caffeine and impurities are included.
단계 2에서는 상기 단계 1에서 얻어진 카테킨 화합물 추출물 중의 불순물을 제거하기 위하여 클로로포름을 사용하여 클로로포름층/물층으로 분배한다. 이때 카테킨 화합물 추출물은 물층에 존재한다.In step 2, chloroform is used to distribute the chloroform layer / water layer to remove impurities in the catechin compound extract obtained in step 1. At this time, the catechin compound extract is present in the water layer.
단계 1에서 얻어진 카테킨 화합물에는 카페인 및 불순물이 존재하므로, 이를 클로로포름으로 추출하여 간단히 분리할 수 있다. 구체적으로는, 상기 단계 1에서 물 또는 알코올로 추출된 카테킨 화합물 추출물은 수용액을 클로로포름과의 부피비로 1 : 1 ∼ 1 : 1.5 가 되도록 혼합하여 40 ∼ 50 ℃로 가열 교반하여 불순물을 제거한다. 상기 분배 단계에서 카페인과 약간의 불순물이 클로로포름층으로 이동하고, 카테킨 화합물 추출물은 물층에 남아 있게 된다.Caffeine and impurities are present in the catechin compound obtained in step 1, it can be easily separated by extraction with chloroform. Specifically, the catechin compound extract extracted with water or alcohol in step 1 is mixed with an aqueous solution in a volume ratio of chloroform to 1: 1 to 1: 1.5, and heated and stirred at 40 to 50 ° C. to remove impurities. In the dispensing step, caffeine and some impurities migrate to the chloroform layer, and the catechin compound extract remains in the water layer.
클로로포름을 이용한 불순물의 제거는 2 ∼3 회 정도 수행한다.도 4에 따르면, 클로로포름을 사용하여 상기 물로 추출된 카테킨 화합물 추출물은 한 번 추출한 경우 다량의 카페인이 남아 있으나 2 ∼ 3회 정도 수행한 경우에는 대부분의 카페인이 분리되었음을 알 수 있다.Removal of impurities using chloroform is carried out 2-3 times. According to Figure 4 , the catechin compound extract extracted with water using chloroform can be seen that most of the caffeine is separated when a large amount of caffeine is extracted once, but performed 2-3 times.
그 결과, 클로로포름을 이용한 불순물의 제거는 적어도 2회 이상 수행하는 것이 바람직하다.As a result, the removal of impurities using chloroform is preferably performed at least twice.
이때, 카테킨 화합물을 에탄올로 추출한 경우, 상기 에탄올이 단계 2에서 클로로포름과 섞여 층분리가 일어나지 않게 되므로 에탄올을 농축한 후 물을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.In this case, when the catechin compound is extracted with ethanol, the ethanol is mixed with chloroform in step 2 so that no layer separation occurs, and it is preferable to use ethanol after concentrating water.
단계 3에서는, 상기 단계 2에서 불순물이 제거된 카테킨 화합물 추출물을 에틸아세테이트로 분배하는 제 2 분배 단계를 수행한다. 이때, 상기 카테킨 화합물 추출물은 에틸아세테이트 층으로 이동한다.In step 3, a second distribution step of distributing the catechin compound extract from which impurities are removed in step 2 to ethyl acetate is performed. At this time, the catechin compound extract is moved to the ethyl acetate layer.
제 1 분배 단계에서 분배된 카테킨 화합물 추출물이 포함된 물층과 에틸아세테이트를 1 : 1 ∼ 1 : 1.5 (v/v)의 비율로 혼합하여 제 2 분배를 수행한다.The second distribution is performed by mixing the water layer containing the catechin compound extract distributed in the first distribution step and ethyl acetate in a ratio of 1: 1 to 1: 1.5 (v / v).
상기 에틸아세테이트 층에 존재하는 성분을 분석하기 위하여 크로마토그래피로 분석한 결과가도 3에 나타나 있다. 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트와 에피카테킨 갈레이트와 같은 카테킨 화합물, 미량의 카페인 및 불순물이 포함되어 있음을 알 수 있다.Chromatographic analysis results of the components present in the ethyl acetate layer are shown in FIG. 3 . It can be seen that catechin compounds such as epigallocatechin, epicatechin, epigallocatechin gallate and epicatechin gallate, trace amounts of caffeine and impurities.
단계 4에서는 상기 단계 3에서 분배된 에틸아세테이트 층에 포함된 카테킨 화합물 추출물을 분리 농축하여 크로마토그래피를 수행하여 에피갈로카테킨 갈레이트를 분리한다. 이때 43 ∼ 60 ㎛， 바람직하게는 50 ㎛의 C18충전물이 채워진 제조용 컬럼을 사용하며 이동상으로는 0.1 % 아세트산이 포함된 물 : 아세토나이트릴: 에틸아세테이트 = 87 ∼ 85 : 10 ∼ 12 : 2 ∼ 5 (v/v) 비율의 혼합 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 이동상의 유속은 15 ∼ 25 ml/min 로 한다.In step 4, the catechin compound extract contained in the ethyl acetate layer distributed in step 3 is separated and concentrated to perform chromatography to separate epigallocatechin gallate. At this time, a preparative column filled with a C 18 packing material of 43 to 60 µm, preferably 50 µm, and water containing 0.1% acetic acid as a mobile phase: acetonitrile: ethyl acetate = 87 to 85: 10 to 12: 2 to 5 Preference is given to using a mixed solution of (v / v) ratio. At this time, the flow velocity of a mobile phase shall be 15-25 ml / min.
도 5에 따르면, 단계 2의 에틸아세테이트 층을 크로마토그래피로 분석한 결과 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨, 에피카테킨 갈레이트 및 카페인이 존재함을 알 수 있었으며, 이들 중 에피갈로카테킨 갈레이트만 따로 분리하여 농축하여 에피갈로카테킨 갈레이트를 순수하게 분리할 수 있다.(도 6)According to FIG. 5 , the ethyl acetate layer of step 2 was analyzed by chromatography, and epigallocatechin gallate, epicatechin, epicatechin gallate, and caffeine were found, and only epigallocatechin gallate was present. Epigallocatechin gallate can be isolated purely by separating and concentrating. ( FIG. 6 )
또한, 본 발명은 녹차로부터 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트가 포함된 화장품용 항산화제를 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic antioxidant containing epigallocatechin gallate extracted from green tea.
본 발명에 의해 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트는 항산화력이 우수하여 화장품에 사용되었을때 피부의 항산화를 촉진하는 자유 라디칼을 흡수하여 피부의 변형속도를 감소시킨다.Epigallocatechin gallate extracted by the present invention is excellent in antioxidant power, when used in cosmetics to absorb the free radicals that promote the antioxidant of the skin to reduce the rate of deformation of the skin.
본 발명의 실시예에 따르면, 에피갈로카테킨 갈레이트의 항산화력을 측정한 결과(도 7), 종래 화장품의 주요 항산화제로 사용되고 있는 비타민 E보다 강한 항산화력을 나타내었고 일본 이시마로사 녹차 추출물보다도 강한 항산화력을 나타내었다.According to an embodiment of the present invention, as a result of measuring the antioxidant power of epigallocatechin gallate ( FIG. 7 ), it showed stronger antioxidant power than vitamin E, which is used as a major antioxidant in conventional cosmetics, and compared to Ishimarosa green tea extract in Japan. It showed strong antioxidant power.
이하, 본 발명의 실시예를 하기에 의해 설명하는바 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술 분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 보호 범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능할 것이다.Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described by the following, but the scope of the present invention is not limited to these examples, and a person of ordinary skill in the art of the present invention will appreciate Various modifications and variations will be possible within the scope of protection.
<실시예 1> 녹차로부터 물 또는 알코올을 이용한 카테킨 화합물의 추출 단계Example 1 Extraction of Catechin Compound from Green Tea Using Water or Alcohol
녹차에 함유되어 있는 카테킨 화합물을 추출하기 위하여 순수한 물과 에탄올을 추출 용매로 하였고 온도 및 시간을 변화시키면서 카테킨 화합물 추출 실험을 하였다.In order to extract the catechin compound contained in green tea, pure water and ethanol were used as the extraction solvent, and the catechin compound extraction experiment was performed while changing the temperature and time.
먼저, 추출의 효율을 높이기 위해서 녹차 잎을 분쇄하고, 잘게 분쇄된 전남 보성산 녹차 잎 3 g에 물/에탄올을 각각 60 ㎖를 넣었다. 물을 사용한 경우 50 ℃ 에서 4시간, 80 ℃에서 40분 , 100 ℃에서 15분 동안 300 ∼ 400 rpm으로 교반하여 추출하였고, 에탄올은 40 ℃에서 2시간 동안 가열 교반하여 추출하였다. 추출 후 얻어진 카테킨 화합물 추출물은 5 ㎛의 세공크기를 가지고 있는 여과지로 여과한 다음 분석하였다.First, in order to increase the efficiency of extraction, green tea leaves were pulverized, and 60 ml of water / ethanol was added to 3 g of finely pulverized green tea leaves of Jeonnam. When water was used, the mixture was extracted by stirring at 300 to 400 rpm for 4 hours at 50 ° C., 40 minutes at 80 ° C., and 15 minutes at 100 ° C., and ethanol was extracted by heating and stirring at 40 ° C. for 2 hours. The catechin compound extract obtained after the extraction was filtered through a filter paper having a pore size of 5 μm and analyzed.
분석용 역상 액체 크로마토그래피에서 분석하였으며, 이러한 결과는도 2에 나타나 있다. 이때 15 ㎛인 C18충전물 2.24 g이 채워진 컬럼(300 ×3.90 ㎜)을 사용하였고, 이동상으로는 0.1 % 아세트산이 포함된 물 : 아세토나이트릴 : 에틸아세테이트 = 87 : 10 : 3 (v/v)을 사용하고, 이때의 유속은 20 ml/min 로 했다.Analysis was performed in analytical reversed phase liquid chromatography, and the results are shown in FIG. 2 . At this time, a column (300 × 3.90 mm) filled with 2.24 g of a C 18 charge having a thickness of 15 μm was used, and water: acetonitrile: ethyl acetate containing 0.1% acetic acid was used as a mobile phase = 87: 10: 3 (v / v). It used and the flow velocity at this time was 20 ml / min.
도 2에 따르면, 물 또는 에탄올로 추출된 카테킨 화합물 추출물은 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 및 에피카테킨 갈레이트가 포함되어 있음을 알 수 있다. 또한, 카테킨 화합물은 물을 이용하여 80 ∼ 100 ℃에서 추출한 경우가 가장 많은 함량으로 추출됨을 알 수 있다.According to Figure 2 , it can be seen that the catechin compound extract extracted with water or ethanol contains epigallocatechin gallate, epigallocatechin, epicatechin, and epicatechin gallate. In addition, it can be seen that the catechin compound is extracted with the highest content when extracted at 80 to 100 ° C. using water.
<실시예 2> 클로로포름에 의한 제 1 분배 단계Example 2 First Distribution Step with Chloroform
상기 실시예 1에서 추출된 카테킨 화합물 추출물에 포함된 다량의 카페인 및 불순물을 제거하기 위해서 유기용매로 클로로포름을 이용하여 수차 분배 단계를 수행하였다.In order to remove a large amount of caffeine and impurities contained in the catechin compound extract extracted in Example 1, a number of distribution steps were performed using chloroform as an organic solvent.
실시예 1에서 추출된 카테킨 화합물 추출물 : 클로로포름 = 1 : 1 (v/v)비율로 하여 50 ℃에서 20분 동안 교반하였다.The catechin compound extract extracted in Example 1: chloroform = 1: 1 (v / v) ratio was stirred for 20 minutes at 50 ℃.
상기 제 1 분배 단계에서 클로로포름층의 화합물을 분석하기 위해서, 실시예1과 동일한 방법으로 분석용 역상 크로마토그래피를 사용하여 분석하여 클로로포름층에 포함된 화합물을 확인하였다.In order to analyze the compound of the chloroform layer in the first partitioning step, the compound contained in the chloroform layer was confirmed by analyzing using reverse phase chromatography for analysis in the same manner as in Example 1.
그 결과가도 4에 나타나 있다.도 4는 추출물을 클로로포름으로 1 ∼ 3회 분배를 실시하여 각각의 횟수에 따른 카페인의 제거 효율을 나타낸다. 클로로포름으로 2회 분배를 실시한 결과가 1회 분배를 실시한 결과와 비교해서 더 많은 카페인이 제거됨을 보여준다. 하지만 3회 실시한 결과는 2회 실시한 결과와 별 차이가 없었다. 그러므로 클로로포름을 이용한 분배는 2회 실시하는 것이 가장 경제적이고 효과적이었다.The result is shown in Fig. Figure 4 shows the removal efficiency of caffeine according to the number of times by performing the distribution 1 to 3 times the extract with chloroform. The results of two distributions with chloroform show that more caffeine is removed compared to the results of one distribution. However, the results of the 3 times did not differ from those of the 2 times. Therefore, the distribution using chloroform twice was the most economical and effective.
<실시예 3> 에틸아세테이트에 의한 제 2 분배 단계Example 3 Second Distribution Step with Ethyl Acetate
상기 1 분배 단계 후 물층에 남아 있는 카테킨 화합물을 얻기 위하여 에틸아세테이트를 사용하여 제 2 분배 단계를 실시하였다. 이때 에틸아세테이트는 추출물과 같은 부피로 사용하였다.In order to obtain the catechin compound remaining in the water layer after the first distribution step, a second distribution step was performed using ethyl acetate. At this time, ethyl acetate was used in the same volume as the extract.
상기의 제 2 분배 단계에서 분배된 에틸아세테이트 층을 분석하기 위해서 실시예 1과 동일한 방법으로 크로마토그래피 분석을 수행하였다. 그 결과 에틸아세테이트 층의 화합물을 확인하였고, 이는도 3에 나타나 있다. 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨과 소량의 카페인이 검출되었다.도 3은 또한, 상기 단계 2의 분배 단계에서 클로로포름의 추출 회수에 따라서 카페인과 불순물의 양이 감소된 것을 보여준다.Chromatographic analysis was performed in the same manner as in Example 1 to analyze the ethyl acetate layer distributed in the second partitioning step. As a result, it was confirmed the compound of the ethyl acetate layer, which is shown in Fig. Epigallocatechin gallate, epicatechin gallate, epigallocatechin, epicatechin and a small amount of caffeine were detected. Figure 3 also shows that the amount of caffeine and impurities is reduced with the extraction and recovery of chloroform in the distribution step of step 2.
1회 분배를 실시했을 때 보다 3회 분배를 실시한 결과 카페인의 함량이 감소하였다.Three distributions resulted in a lower caffeine content than one distribution.
<실시예 4> 크로마토그래피를 이용한 분리 및 정제 공정Example 4 Separation and Purification Processes Using Chromatography
상기 실시예 3에서 얻어진 에틸아세테이트 층에 포함된 카테킨 화합물 중에서 에피갈로카테킨 갈레이트를 분리하기 위하여 크로마토그래피를 수행하였다.Chromatography was performed to separate epigallocatechin gallate from the catechin compound included in the ethyl acetate layer obtained in Example 3.
제조용 액체 크로마토그래피에서 크기가 50 ㎛인 C18충전물 101 g이 채워진 컬럼(500 ×25.4 ㎜)을 사용하여 분석을 행하였다. 이때의 유속은 20 ml/min이고 시료 주입량은 1 ml였고, 이때 이동상의 조성은 0.1 % 아세트산을 포함한 물 : 아세토나이트릴 : 에틸아세테이트 = 85 : 12 : 3 (v/v)이었다.The analysis was carried out in preparative liquid chromatography using a column (500 × 25.4 mm) filled with 101 g of a C 18 charge of 50 μm in size. At this time, the flow rate was 20 ml / min and the sample injection amount was 1 ml, and the composition of the mobile phase was water: acetonitrile: ethyl acetate = 85: 12: 3 (v / v) containing 0.1% acetic acid.
도 5에는 상기 조건으로 실시예 3의 추출물을 크로마토그래피로 분리한 결과가 나타나 있다. 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트와 소량의 카페인이 검출되었다. 5 shows the results of chromatographic separation of the extract of Example 3 under the above conditions. Epigallocatechin, epicatechin, epigallocatechin gallate and small amounts of caffeine were detected.
에피갈로카테킨은 10 분에서 13분 사이에 에피카테킨은 18분에서 20분 사이에 그리고 에피갈로카테킨 갈레이트는 31분에서 37분 사이에 검출되었다.도 5그래프의 피크에 잘 나타나 있는 것처럼 에피갈로카테킨 갈레이트의 양이 가장 많이 검출되었다. 또한 다른 화합물과 완전히 분리되어 검출되었다. 따라서, 크로마토그래피에서 31분부터 37분 사이에 나오는 유출액을 모아서 에피갈로카테킨 갈레이트만을 따로 얻을 수 있었다.Epigallocatechin was detected between 10 and 13 minutes, epicatechin between 18 and 20 minutes, and epigallocatechin gallate between 31 and 37 minutes. The amount of epigallocatechin gallate was detected the most as shown in the peak of the graph of FIG. 5 . It was also detected in isolation from other compounds. Therefore, by extracting the effluent from 31 to 37 minutes in chromatography, only epigallocatechin gallate could be obtained separately.
도 6에는 분석 시간 31분부터 37분까지 유출액을 포집하여 얻은 분획물을 회전식 증발기로 농축하여 실시예 1, 2와 같은 분석용 크로마토그래피에서 분석한 결과이다. 거의 순수한 에피갈로카테킨 갈레이트를 제조용 규모로 얻을 수 있었다. 6 is a result of analyzing the fractions obtained by collecting the effluent from the analysis time 31 minutes to 37 minutes by a rotary evaporator and analyzed in the same analytical chromatography as in Examples 1 and 2. Nearly pure epigallocatechin gallate could be obtained on a manufacturing scale.
<실험예 1> 카테킨 화합물의 항산화력 시험Experimental Example 1 Antioxidant Test of the Catechin Compound
상기 실시예 1 ∼ 4의 단계에 의해 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트에 대한 항산화력을 알아보기 위해서 통상적으로 사용하는 DPPH(1,1-diphenyl -2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거율 방법으로 항산화력을 실험하였다.Antioxidation by the DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) radical scavenging method commonly used to determine the antioxidant power of the epigallocatechin gallate extracted by the steps of Examples 1 to 4 Was tested.
상기 DPPH 라디칼 소거율 방법은, 메탄올에 용해되면서 생성된 비교적 안정한 청남색 DPPH 라디칼을 소거시키면 맑은 용액으로 변하게 되고 파장 516㎚에서 흡광도가 감소하는 정도를 측정하는 방법이다.The DPPH radical scavenging method is a method of measuring the degree of decrease in absorbance at a wavelength of 516 nm when releasing relatively stable blue-blue DPPH radicals dissolved while being dissolved in methanol.
본 발명에 의해 녹차로부터 분리된 카테킨 화합물, 에피갈로카테킨 갈레이트, 일본 이시마로사 녹차 및 비타민 E를 대상으로 상기 DPPH 방법을 이용하여 항산화력을 측정하여 비교하였고, 농도에 따른 항산화력의 세기 변화를 함께 비교하기 위해서 각 시료마다 0.05 %. 0.005 %일 때 모두 항산화력을 측정하였으며, 그 결과는표 1및도 7에 나타나 있다.The catechin compound, epigallocatechin gallate, Japanese Ishimarosa green tea and vitamin E isolated from green tea according to the present invention were measured and compared with antioxidant concentrations using the DPPH method. 0.05% for each sample to compare changes together. Antioxidant activity was measured at 0.005%, and the results are shown in Table 1 and FIG. 7 .
도 7은, 본 발명에 의해서 분리된 에피갈로카테킨 갈레이트의 항산화력을 종래의 항산화제의 항산화력과 비교한 그래프이다.도 7에 따르면, 본 발명에서 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트의 항산화력은 자유 라디칼의 소거율로서 89 ∼ 93 %이고, 카테킨 화합물의 항산화력은 93 ∼ 95 %이다. 이에 대하여 일본 이시마로사의 녹차 추출물은 농도에 따라서 항산화력의 차이가 70 %이상이 차이가 났으며, 또한 이들의 항산화력은 9 ∼ 53 %으로 본 발명 추출물에 비하여 2 ∼ 10배나 약하였다. 또한 현재 화장품의 주요 항산화제로 쓰이고 있는 비타민 E는 항산화력이 2 ∼ 5 %사이로 본 발명의 추출물에 비하여 20 ∼ 40배 가량 낮았다. 7 is a graph comparing the antioxidant power of epigallocatechin gallate isolated by the present invention with that of a conventional antioxidant. According to FIG. 7 , the antioxidant power of the epigallocatechin gallate extracted in the present invention is 89 to 93% as free radical scavenging rate, and the antioxidant power of the catechin compound is 93 to 95%. On the other hand, the green tea extract of Ishimarosa, Japan, had a difference of more than 70% of the antioxidant power depending on the concentration, and their antioxidant power was 9 to 53%, which was 2 to 10 times weaker than the extract of the present invention. In addition, vitamin E, which is currently used as a major antioxidant in cosmetics, has an antioxidant power of 2 to 5%, which is about 20 to 40 times lower than the extract of the present invention.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 녹차에서 추출된 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법을 이용하면 고수율로 에피갈로카테킨 갈레이트를 얻을 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 추출한 에피갈로카테킨 갈레이트는 현재 화장품의 원료로 쓰이고 있는 다른 여러 항산화제보다 월등한 항산화력을 가지고 있어 화장품용 항산화제로서 유용하게 사용이 가능하다.As described above, by using the extraction method of epigallocatechin gallate extracted from green tea according to the present invention, epigallocatechin gallate can be obtained in high yield, and epigallocatechin extracted by the method of the present invention. Gallate is superior to many other antioxidants currently used in cosmetics, so it can be used as an antioxidant for cosmetics.
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