KR20020086678A

KR20020086678A - 조직 등가물의 동결 보존 방법 및 동결 보존된 조직 등가물

Info

Publication number: KR20020086678A
Application number: KR1020027012544A
Authority: KR
Inventors: 야마모토나오카; 노무라마사요; 모리야마다케시
Original assignee: 가부시끼가이샤 메니콘
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2002-11-18
Also published as: CA2404007A1; JP4204784B2; EP1269840A1; WO2001070021A1; CN1184884C; EP1269840A4; AU2001236053A1; CN1419410A; US20030118982A1

Abstract

본 발명은 동결 세포의 생존율 및 융해 세포의 생물 활성이 향상되고, 공정이 간략화된 조직 등가물의 동결 보존 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어지는 동결 보존된 조직 등가물을 제공한다.

동결 보존액에 현탁한 세포를 기재에 파종하고 세포가 기재에 접착하기 전에 동결시킨다.

Description

조직 등가물의 동결 보존 방법 및 동결 보존된 조직 등가물 {METHOD OF PRESERVING TISSUE EQUIVALENT AND TISSUE EQUIVALENT PRESERVED IN FROZEN STATE}

종래의 일반적인 조직 등가물의 보존 방법에서는 세포를 배지에 현탁하여 기재에 파종하고, 배양해서 기재에 접착시켜 일정 시간 동결 보존액에 침지해서 평형화한 후, 서냉 동결하는 방법을 채용하고 있다.

그러나, 종래의 방법은 세포의 생존율이 대단히 좋지 않을 뿐만 아니라, 일정한의 온도 강하를 조절하기 위하여 정밀하고 고가인 프로그램 프리저 등의 동결 장치를 필요로 한다는 문제점이 있었다. 또한, 기재에 접착시키기 위하여 세포를 사전 배양하는 공정(수시간에서 하룻밤)이나, 동결 전에 세포를 동결 보존액으로 세정하는 공정을 필요로 하며, 동결 보존액의 세포 내로의 침투 또는 평형화에 시간이 소요된다는 문제점도 안고 있다.

특히, 특허공보 제2722134호에는 인공 피부에 있어서 시트 형태의 상피 세포를 동결 상태로 보존하기 위한 방법이 제시되어 있으며, 일본 특개평 제8-23968호 공보에는 졸-겔법을 이용해 배양 피부를 고정화하여 보존·수송하는 방법이 제시되어 있다.

또한, 일본 특표평 제9-505032호 공보에는 조직 등가물을 동결 보호제 용액에 침지하고, 교반하여 동결 보호제 용액을 조직 등가물 중에 충분히 침투시킨 후에 동결시키는 조직 등가물의 동결 보존 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 조직 등가물이 비교적 두껍고 불균일한 경우에도 구조 보전이 손상되는 일이 없이 세포 생활력을 유지한 상태로 조직 등가물을 동결 보존하는 것을 가능하게 했지만, 동결 보호제 용액의 침투에 시간을 요한다는 점에서 동결 보존 공정의 간략화를 충분히 만족시키지 못한다.

또한, 일본 특개평 제9-87102호 공보에는 식물 세포의 동결 보존 방법 및 해동 방법이 기재되어 있으며, 일본 특개소 53-56897호, 일본 특개평 2-71755호 및 일본 특표평 11-506687호 공보에는 인공 간장(肝臟)의 동결 보존 방법이 기재되어 있으며, 미국특허 5374515호에는 각막 조직 등가물의 동결 보존 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이들 방법은 동결 세포의 높은 생존율, 융해 후의 높은 생물 활성(예를 들면, 세포의 증식 활성(율), 물질 생산능 등) 및 동결 보존 공정의 간략화를 충분히 만족시키지 못한다.

따라서, 본 발명은 동결 세포의 생존율 및 융해 세포의 생물 활성이 향상되면서도, 공정이 간략화된 조직 등가물의 동결 보존 방법을 제공하는 것을 목적으로한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어지는 동결 보존된 조직 등가물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 조직 등가물의 동결 보존 방법 및 동결 보존된 조직 등가물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 세포를 동결 보존액 중에 현탁하는 공정, 상기 세포를 기재 상에 파종하는 공정, 및 이렇게 하여 얻어진 조직 등가물을 세포 기재에 접착하기 전에 동결시키는 공정으로 이루어지는 조직 등가물의 동결 보존 방법 및 상기 방법에 의해 얻어지는 동결 보존된 조직 등가물에 관한 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 동결 보존액 중에 현탁된 세포를 기재에 파종하고 세포가 기재에 접착하기 전에 동결함으로써, 세포의 생존율 및 생물 활성을 높게 유지한 상태로 조직 등가물을 보존할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은,

세포를 동결 보존액 중에 현탁하는 공정, 기재 상에 상기 세포를 파종하는 공정, 및 이렇게 하여 얻어진 조직 등가물을 세포가 기재에 접착하기 전에 동결시키는 공정으로 이루어지는 조직 등가물의 동결 보존 방법,

세포가 포유동물 유래의 섬유 아세포, 표피 세포, 혈관 내피 세포, 랑게르한스 세포, 멜라노사이트, 지방 세포, 모모세포(毛母細胞), 모유두세포(毛乳頭細胞), 평활근 세포, 간 세포, 각막 실질 세포, 각막 상피 세포 및 각막 내피 세포로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 상기 동결 보존 방법, 그리고

세포를 동결 보존액 중에 현탁하는 공정, 기재 상에 세포를 파종하는 공정, 및 이렇게 하여 얻어진 조직 등가물을 세포가 기재에 접착하기 전에 동결시키는 공정으로 이루어지는 방법에 의해 얻어지는 동결 보존된 조직 등가물

에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 "세포"는 최종적으로 인공 피부, 인공 간장, 인공 각막으로서 이용하기 위한 것이다. 구체적으로, 인공 피부의 경우에는 포유동물 유래의 섬유 아세포, 표피 세포, 랑게르한스 세포, 멜라노사이트, 지방 세포, 모모세포 및 모유두세포로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하고, 인공 혈관의 경우에는 혈관 내피 세포, 평활근 세포 및 섬유 아세포로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하고, 인공 간장의 경우에는 간 세포가 바람직하고, 인공 각막의 경우에는 각막 실질 세포, 각막 상피 세포 및 각막 내피 세포로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 "현탁"이란 용액 중에 있는 세포를 분산시키는 조작을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서의 "파종"이란 배지 등에 현탁한 세포를 배양 용기의 배지 중 또는 기재에 심는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서의 "동결"이란 기재 상에 세포를 파종하여 만들어진 조직 등가물을 배양하지 않고, 즉시 동결시켜 보존하는 공정을 의미한다. 사전 배양하여 세포가 기재에 접착한 후에 동결시키면 세포의 생존율이 대단히 낮아지기 때문에, 세포를 파종한 후 세포가 기재에 접착하기 전에 세포를 동결시키는 것이 바람직하다. 이 때, 세포가 기재에 접착하지 않았더라도 융해 후의 세정에 의한 세포의 손실은 거의 없다. 여기서, 접착이란 물리적인 힘을 가했을 때에 세포가 기재로부터 용이하게 유리되지 않는 상태를 말한다. 또한, 세포의 파종 후, 세포가 기재로부터 용이하게 유리될 수 있는 시간 내에 세포를 동결시키는 것이 보다 바람직하다. 여기서, 유리란 세포가 기재로부터 용이하게 분리되어 용액 중에 부유하고 있는 상태를 말한다. 따라서, 구체적으로는 4∼10℃까지는 세포가 기재에 접착하지 않는 속도로 냉각해야 한다. 냉각 속도가 낮은 경우에는 세포가 기재에 접착하게 되고, 이 상태로 조직 등가물을 동결시키면 세포의 생존율이 저하된다. 이 때의 냉각 속도는 사용하는 세포 및 동결 보존액의 종류, 냉각 시작 시 조직 등가물의 온도 등에 따라 변화된다. 예를 들면, 두께 2∼3 mm의 콜라겐 스펀지에 섬유 아세포를 파종한 인공 피부의 경우, 4℃∼상온에서 세포를 파종한 경우에는 3시간 이내에 4℃까지 냉각하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 동결 방법은 특별히 제한되지 않으나, 서냉 동결법, 급속 동결법 및 유리화(vitrification) 동결법 등이 바람직하다.

여기서, "서냉 동결법"이란 동결 보호제를 첨가한 용액을 이용해 인공적으로 세포 외에서 형성시킨 빙정을 완만하고 적당한 냉각 속도로 냉각함으로써 서서히 성장시키고, 저속으로 세포내를 탈수 및 농축하여, 그 후의 급격한 냉각에 의한 세포내 동결을 방지해 보존함으로써 융해 후 높은 생존성이 얻어지는 방법이다(일본 배이식학 잡지 제18권 1호, "체외 수정 유래 소 배의 유리화 보존" 가축 개량 사업단·가축 바이오텍 센터). 냉각 속도는 4℃까지는 전술한 바와 같이 세포가 기재에 접착하지 않는 속도로 냉각하고, 그 이후는 적어도 -20℃ 또는 그 이하의 온도에 도달할 때까지 -0.1℃/분∼-10℃/분이 바람직하고, -0.2∼-5℃/분이 보다 바람직하다.

"급속 동결법"이란 동결 보호제를 첨가한 용액을 이용해 초저온 냉동고 등에서 조직 등가물(또는 세포)을 빙점 이하로 급속히 냉각 동결시키는 방법이다. 냉각 속도는 4℃까지는 전술한 바와 같이 세포가 기재에 접착하지 않는 온도로 냉각하고, 그 이후에는 -10℃/분∼-30℃/분이 바람직하며, -10℃/분∼-20℃/분이 보다 바람직하다. 냉각 속도가 -30℃/분보다 빠르면 세포내 동결이 일어나 세포가 파쇄될 우려가 있다.

"유리화 동결법"이란 고농도의 동결 보호제를 첨가한 용액(유리화 용액이라고 하며, 통상은 세포 침투성의 것과 세포 비침투성의 것을 병용)에 세포를 부유시킨 후에 액체 질소에 투입하는 등을 통해 급속히 냉각하여 동결시키는 방법이다. 이것은 고농도의 수용액이 고속으로 냉각되는 경우, 빙정핵이 존재하지 않는 유리화(vitrification) 상태가 되는 현상을 응용하고 있다(생식 세포의 배양법, 학술 출판 센터, 1993년; 연구 저널 21(9), 志水學 편저, 1998년). 본 방법에서는 조직 등가물을 수초에 동결한다.

본 발명의 방법에 있어서 조직 등가물의 보존 온도는 장시간 생물 활성을 높게 유지하기 위해 상기 3가지 동결 방법 중 어느 것에 대해서도 -20℃∼-196℃가 바람직하고, -80℃∼-196℃가 보다 바람직하다. -20℃보다 높은 경우는 장기 보존(수개월 이상)하면 세포의 생존율이 저하된다. 따라서, 단기간 보존하는 경우에는-20℃로 충분하지만, 장기간 보존하는 경우에는 보다 저온에서 저장하는 것이 필요하게 된다. -80℃에서는 1∼2년의 보존이 가능하고, -120℃ 이하(질소 증기) 또는-196℃(액체 질소)에서는 반영구적으로 보존할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "동결 보존액"이란 동결에 의한 세포의 상해를 방지하는 효과를 가지는 동결 보호제를 적어도 1종류 포함하는 용액을 의미한다.

서냉 동결법 및 급속 동결법의 경우, 동결 보호제로는 글리세롤, 디메틸설폭사이드(DMSO), 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 자당, 카르복시메틸셀룰로스염, 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 단당류 및 2당류(트레할로스 등)로 이루어지는 군에서 적어도 1종류가 선택되는 것이 바람직하다. 용매로는 수용액이 사용된다. 특히, 생리적 염류 용액이 바람직하다. 생리적 염류 용액이란 세포의 생존에 알맞은 pH와 침투압을 갖는 염류 용액을 의미하며, 생리적 식염수(0.9% 수용액), 생리적 식염수에 K⁺, Ca²⁺등의 여러 종류의 중요한 이온을 보충한 염류 용액 또는 각종 세포 배양액 등을 들 수 있다. 구체적으로는 DMEM(Dulbecco 변형 이글 최소 필수 배지), 인산 완충액, 링거액, 링거-록액, 타이로이드액, 아르액, Hanks 용액, 록액, 이글 최소 필수 배양액, 햄(Ham)의 합성 배양액 F12, 그린 배양액, 레이보빗쯔(Leibovitz)의 L-15 배양액, 치즈 필수 배양액, 변형 이글 배양액, 웨이마우쓰(Waymouth) 배양액, 크렙스(Kreb's) 배양액, 및 무혈청 배양액 MCDB153, MCDB151, MCDB104, MCDB131, MCDB402, MCDB201, MCDB302, MCDB105 및 MCDB110 등을 들 수 있다.

유리화 동결법의 경우, 동결 보호제로서 비세포 침투성 유리화제 및/또는 세포 침투성 유리화제가 이용된다. 비세포 침투성 유리화제로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(Ficoll; Amersham Pharmacia·biotech사 제조) 및 덱스트란 등의 다당류 및 자당 등이 바람직하고, 세포 침투성 유리화제로는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 및 DMSO 등이 바람직하다. 또한, 용매로는 서냉 동결법 및 급속 동결법의 경우와 같이 생리적 염류 용액이 바람직하다. 구체적으로는 DMEM, 인산 완충액, 링거액, 링거-록액, 타이로이드액, 아르액, 행크tm 용액, 록액, 이글의 최소 필수 배양액, 햄의 합성 배양액 F12, 그린 배양액, 레이보빗쯔의 L-15 배양액, 치즈 필수 배양액, 수식 이글 배양액, 웨이마우쓰 배양액, 크렙스 배양액, 그리고 무혈청 배양액 MCDB153, MCDB151, MCDB104, MCDB131, MCDB402, MCDB201, MCDB302, MCDB105 및 MCDB110 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "기재"는 조직 등가물을 환자에게 적용(첨부)한 경우에 환자의 면역 기능에 의해서 거절되지 않도록, 생체 적합성이 우수한 재질이어야 한다 또한, 후에 제거할 필요성도 없기 위해 생분해성 재질인 것이 바람직하다. 구체적으로는 생체 유래의 재료인 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 피브린, 및 콘드로이친, 콘드로이친 황산 및 하이알론산 등의 무코 다당류; 생분해성 고분자인 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 이들의 혼합물; 비생분해성의 합성 고분자 중 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트 등의 세포 접착성이 좋은 것; 및 이들의 혼합물로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 생체 적합성이 우수하고 세포가 기재 내에 머물기 쉽도록, 다공질의 스펀지상 형태를 갖는 아테로콜라겐, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이친 황산, 하이알론산이 보다 바람직하다. 세포를 파종할 때에 세포가 스펀지 내에 침투하기 쉽도록, 구멍은 세포의 파종면에 대해 수직인 종형의 빈 구멍으로, 표면 및/또는 표면에 대향하는 면에 일정한 크기의 빈 구멍이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 구멍 직경은 파종 시에 세포가 침투하기 쉽고 기포가 들어가기 어렵게 하기 위해 통상 20 ㎛∼1000 ㎛의 범위가 바람직하다. 단, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 반드시 이들 수치 범위로 한정되지는 않는다.

본 발명의 "조직 등가물"이란 기재와 포유동물 유래의 세포를 조합하여 제작한 포유동물 조직의 적어도 일부와 동등한 기능을 유지하는 구성물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 조직 등가물은 기재와 그 조직의 대표적인 세포를 포함하는 것이다. 그의 대표적인 세포는 상기 기재 상 또는 내부에서 상기 조직의 세포와 동등한 활성을 갖기 때문에, 상기 조직 등가물은 (1) 조직의 손상, 절제 등에 의해 조직 또는 장기가 기능 부전인 환자의 조직 또는 장기를 완전 또는 부분적으로 치환하기 위해 여러 가지 방법을 통해 이식 또는 매립할 목적으로 사용하거나, 또는 (2) 여러 가지 제품ㆍ원재료와 조직의 상호 작용 또는 이들이 조직에 부여하는 영향을 조사하는 목적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 "인공 피부"란 기재와 포유류의 피부 유래의 세포(섬유 아세포, 표피 세포, 혈관 내피 세포, 랑게르한스 세포, 멜라노사이트, 지방 세포, 모모세포, 모유두세포 등)를 조합하여 조제한 포유류(특히 인간)의 피부 조직 등가물을 의미한다. 본 발명의 인공 피부는 창상 치유를 촉진하는 목적으로 열상(裂傷) 부위, 궤양 부위, 욕창 부위, 피부 채취 부위 등의 각종 피부 결손 부위에 적용된다. 인공 피부를 구성하는 각종 세포는 상처 표면에서 증식하는 동시에, 창상 치유에 유효한 물질(각종 세포의 증식ㆍ이동 및 증식 인자의 분비 등을 자극함으로써 창상 치유를 촉진하는 사이토카인, 주변의 세포가 이동하는 조직을 재구축할 때의 발판이 되는 세포외 기질 등)을 합성ㆍ분비한다.

본 발명의 "인공 간장"이란 기재와 포유동물 유래의 간 세포를 조합하여 제작한 포유동물의 간장 조직 등가물을 의미한다. 상기 인공 간장은 생명에 필요한 물질의 대사 또는 합성, 유해 물질의 이화 작용, 중간 대사산물의 제거라고 하는 간장이 담당하는 기능의 일부를 대행할 목적으로 개발되어 있으며, 말기의 급성 및 만성 간부전 환자를 치료하는 방법으로서의 임상 응용이 기대될 수 있다.

인공 피부의 일반적인 제조 방법으로는 우선 피부 유래의 세포를 이용해 세포 현탁액을 조제한 후, 기재에 상기 세포 현탁액을 파종함으로써 얻는 방법이 있다. 이하에 섬유 아세포로부터 인공 피부를 제조하는 경우를 예시한다.

우선 청결한 환경 하에서 채취된 피부(표피 및 진피의 일부 또는 전체 층을 포함함)를 소독하고, 항생 물질을 함유하는 생리적 식염수 또는 Hanks 용액 등의 완충액에 침지한다. 이 피부를 디스파제 농도 1000 IU/㎖으로 조제한 DMEM에 침지한 후, 진피와 표피로 분리한다. 얻어진 진피를 가위로 미세하게 저며, 호모게나제 등을 이용해 파쇄하고, 0.5% 콜라게나제 용액(0.5%(w/v) 콜라게나제 함유 DMEM)에 침지하여, 37℃에서 교반하면서 결합 조직을 용해시킨다. 이어서, 약 200∼1000×g로 원심분리하여, 진피 섬유 아세포를 회수한다. 얻어진 섬유 아세포는 FBS(소 태아 혈청)을 10%(v/v) 농도가 되도록 첨가한 DMEM(이하, DMEM + 10% FBS라 함) 등을 배양액으로 하여 37℃에서 배양한다. 필요에 따라 계대배양한다. 배양한 섬유 아세포는 0.25% 트립신 용액(0.25%(w/v) 트립신 및 0.005 mM 에틸렌디아민 4아세트산나트륨(EDTA) 함유 인산 완충액)을 이용해 배양 플라스크로부터 분리해 원심분리하여 회수한다. 얻어진 섬유 아세포의 침전물을 DMEM 등으로 현탁하여 섬유 아세포 현탁액을 조제한다. Buker-Turk 혈구 계측기 등을 이용해 얻어진섬유 아세포 현탁액의 세포 농도를 측정한다. 이어서, 다시 원심분리하여 섬유 아세포를 회수하고, 글리세롤 등의 동결 보호제를 포함하는 동결 보존액을 이용해 1×10⁴∼5×10⁶세포/㎖, 바람직하게는 5×10⁴∼2×10⁶세포/㎖ 밀도의 현탁액을 조제한다. 돼지 또는 소 유래의 아테로콜라겐 용액을 겔화 및 동결 건조함으로써 얻어진다. 상기 섬유 아세포 현탁액을 1×10²∼1× 10⁶세포/cm², 바람직하게는 1×10⁴∼2×10⁵세포/cm²의 세포 밀도로 종형의 빈 구멍을 가지는 콜라겐 스펀지에 파종한다. 세포 현탁액이 스펀지에 침투할 때까지 정치한 후, 조직 등가물이 얻어진다.

인공 간장의 경우, 세포의 단리법으로는 간 조직에 콜라게나제 용액을 관류시켜 세포를 분산시키는 콜라게나제 관류법을 예로 들 수 있으나, 본 발명은 이들 단리 기술에 의존하지 않는다. 또한, 이용되는 배지로는 DMEM, 치즈 필수 배지, 수식 이글 배지, 레이보빗쯔 배지, 웨이마우쓰 배지, 크렙스 배지, 그린 배지, L-15 배지 등에 10%(v/v) FBS를 첨가한 배지 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 그린 배지에 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨을 첨가한 배지가 바람직하다.

인공 각막의 경우, 각막 상피, 각막 실질, 각막 내피 세포를 조직으로부터 단리하는 방법의 예로는 먼저 각막을 디스파제 용액에 침지하고 가온·교반을 통해 각막 내피 세포를 박리시킨 뒤, 가위 또는 면도기의 칼을 이용해 현미경 하에서 각막으로부터 각막 상피를 박리해 미세하게 각인함으로써 각막 상피 세포를 단리하고, 얻어진 각막 내피 및 각막 상피 세포를 제거한 각막을 디쉬 상에서 배양하여,조직으로부터 유주해 오는 세포를 회수함으로써 각막 실질 세포를 단리하는 방법(Adclheid I. Schneider et al., In Vitro Cell. Dev. Biol-Animal, Vol. 35. 515-526(1999) 및 Yoichi Minami et al., Investigativc Ophthalmology & Visual Science, Vol. 34. 2316-2324(1993))이 알려져 있으나, 본 발명은 이들 단리 기술에 의존하지 않는다. 또한, 이용되는 배지로는 각막 실질 세포의 경우, DMEM, 수식 이글 배지, 이글 최소 필수 배지, 수식 이글 배지 등에 10%(v/v) FBS를 첨가한 배지 등을 들 수 있으며, DMEM + 10% FBS가 바람직하다. 또한, 각막 상피 세포의 경우는 그린 배지 등에 10%(v/v) FBS를 첨가한 배지가 바람직하다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다.

실시예 1-1: 인간 섬유 아세포 유래의 인공 피부의 서냉 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 피부의 동결 보존

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 섬유 아세포를 DMEM + 10% FBS로 배양하였다. 대수 증식기에 있는 섬유 아세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. FBScryo(20%(v/v) FBS 및 10%(v/v) 글리세롤 함유 DMEM), 셀반가 II(日本全藥工業(주) 제조), 셀베션(Cellvation)(ICN 바이오메디컬사 제조)의 3종류의 동결 보존액에 각각의 세포를 현탁하여 9.0×10⁵세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형(圓形) 콜라겐 스펀지에 세포 현탁액을 0.5 ㎖씩 파종하였다(1.2×10⁵세포/cm²). 세포 현탁액이 스펀지에 침투할 때까지 정치한 후, 12웰 플레이트를 -0.5∼-2℃/분의 속도로 냉각하여 동결시켰다.

A-1) 인공 피부의 융해 및 생존율 측정

필요한 기간 동안 -80℃에서 보존한 후에 인공 피부를 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 10∼15분간 정치하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM로 2회 세정하였다. 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM을 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 15시간 이상 배양하였다. 이어서, 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 얻어진 인공 피부를 침지하고, 37℃의 워터 배스 내에서 5∼10분간 진탕하여 상기 조직 등가물을 용해시켰다. 4℃의 조건 하에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하고 세포를 회수해 생존율을 측정하였다. 표 1에 세포의 생존율을 나타낸다. 어떠한 동결 보존액을 이용한 경우에도, 동결 시에는 생존율이 급격히 저하되고, 그 후 1개월 뒤까지는 생존율이 거의 변하지 않거나, 또는 서서히 저하되는 것으로 나타났다. 또한, 1개월 후에도 50% 이상의 생존율이 얻어졌다.

[표 1]

동결 보존액	세포의 생존율(%)
동결 보존액	0일	1일	1주	1개월	3개월
FBScryo	97.2	70.2	62.9	58.2	42.3
셀반가-II	97.2	-	59.8	67.3	39.5
셀베션	97.2	-	69.9	59.0	57.1

A-2) 인공 피부의 융해 및 생물 활성의 측정

A-2-1: 세포 증식율

-80℃에 보존하고 있었던 인공 피부를 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 10∼15분간 정치해 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM로 2회 세정하였다. 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM을 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 3일간 또는 7일간 배양하였다. 이어서, 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 얻어진 인공 피부를 침지하고, 37℃의 워터 배스 내에서 5∼10분간 진탕하여 상기 인공 피부를 용해시켰다. 4℃의 조건 하에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하고, 트리판블루 색소 배제법을 통해 총세포수, 생세포수 및 세포의 생존율을 계수하였다. 특히, DMEM + 10% FBS로 배양한 경우에는 배양 3일 후∼7일 후에 걸쳐 생세포수가 1.4배까지 증가하였다. 표 2에 융해 후의 인공 피부 중의 생세포수를 나타낸다.

[표 2]

	보존방법	세포	보존배지	배양배지	생세포수(개)
본 발명	서냉동결서냉동결	부유부유	FBScryoFBScryo	DMEM+10%FBSDMEM	1.41×10⁵1.30×10⁵	1.94×10⁵1.42×10⁵
비교예	비동결비동결	접착접착	DMEM+10%FBSDMEM	DMEM+10%FBSDMEM	3.07×10⁵2.36×10⁵	2.44×10⁵2.04×10⁵

A-2-2: 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF) 생산능

-80℃에 저장하고 있었던 인공 피부를 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 10∼15분간 정치하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS또는 DMEM로 2회 세정하였다. 각 배양액 2 ㎖을 각각 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배양 3일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중의 VEGF 양을 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 측정하였다. 대조군으로서 동결시키지 않은 인공 피부에 대해서도 동일한 측정을 수행하였다. 생세포당 VEGF 생산량에 있어, 동결한 인공 피부(표 3의 ① 및 ②)와 동결하지 않은 인공 피부(표 3의 ③ 및 ④) 사이에서 차이는 거의 인지되지 않았다. 표 3에 배양 3일 후의 인공 피부의 VEGF 생산량(pg/㎖/10⁵생세포)을 나타낸다.

[표 3]

	보존방법	배양배지	VEGF 생산량
본 발명	1) 서냉동결2) 서냉동결	DMEM+10%FBSDMEM	13991474
비교예	3) 비동결4) 비동결	DMEM+10%FBSDMEM	9831137

A-2-3: 콜라겐 타입 I 생산능

-80℃에 저장하고 있었던 인공 피부를 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 10∼15분간 정치하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2 ㎖의 DMEM로 2회 세정하였다. DMEM 2 ㎖을 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배양 3일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중의 콜라겐 타입 I의 양을 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 대조군으로서 동결하지 않은 인공 피부에 대해서도 동일한 측정을 수행하였다. 본 발명자들이 이용하는 항콜라겐 타입 I 항체는 배지에 포함되는 혈청 중의 소 콜라겐과 교차 반응하기 때문에, DMEM로 배양한 인공 피부에 대해서만 콜라겐 타입 I을 정량하였다. 배양 3일 후의 생세포수당의 콜라겐 생산량은 동결하지 않은 인공 피부와 대략 동등하였다. 표 4에 배양 3일 후의 인공 피부의 콜라겐 타입 I 생산량(ng/㎖/105생세포)을 나타낸다.

[표 4]

보존방법	배양배지	콜라겐 타입 I 생산량(ng/㎖/10⁵생세포)
서냉동결(본 발명)	DMEM	1883
비동결(비교예)	DMEM	1928

B. 종래의 방법에 따른 인공 피부의 동결 보존

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 섬유 아세포를 DMEM + 10% FBS로 배양하였다. 대수 증식기에 있는 섬유 아세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. DMEM + 10% FBS로 9.0×10⁵세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 세포를 0.5 ㎖씩 파종하였다(1.2×10⁵세포/cm²). 12웰 플레이트를 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 15시간 이상 배양하였다. 세포가 접착한 것을 확인한 후, 배지를 흡인 제거하고, 동결 보존액(FBScryo, 셀반가 II, 셀베손) 2 ㎖로 각각 2회 세정하였다. 각 웰에 동결 보존액 2 ㎖을 각각 첨가하고, 12웰 플레이트를 -0.5∼-2℃/분의 속도로 냉각하여 동결시켰다.

B-1) 인공 피부의 융해 및 생존율의 측정

필요 기간 동안 -80℃에서 보존한 후의 인공 피부를 5% 탄산 가스, 37℃의조건 하에서 10∼15분간 정치하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM로 2회 세정하였다. 2 ㎖의 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM을 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 15시간 이상 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 피부를 0.5% 콜라게나제 용액 5.0㎖에 침지하고, 37℃의 워터 배스 내에서 5∼10분간 진탕하여 인공 피부를 용해시켰다. 4℃의 조건 하에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. 동결 하루 후에 인공 피부를 용해시키고 총세포수, 생세포수 및 세포 생존율을 측정하였다. 세포가 콜라겐 스펀지에 접착한 상태로 서냉 동결시키면, 동결 보존액의 종류에 관계없이 세포 생존율이 10∼20%로 대단히 낮았다. 표 5에 세포의 생존율을 나타낸다.

[표 5]

동결 보존액	조성 및 제조원	세포의 생존율(%)
FBScryo	FBS 20%(v/v)글리세롤 10%(v/v)DMEM	11
셀반가 II	日本全藥工業(주) 제조	15
셀베션	ICN 바이오메디컬사 제조	15

C. 동결 시의 세포 형태와 세포 생존율의 상관관계

세포가 콜라겐 스펀지에 접착한 상태로 인공 피부를 동결시키는 종래의 방법에서는 동결 보존액의 종류에 관계없이 세포 생존율이 대단히 낮았다. 본 발명의 방법에 따라 인공 피부와 세포가 콜라겐 스펀지에 접착된 상태로 동결된 인공 피부 사이에서 생존율의 차이가 인지되지 않은 원인으로, 동결 시 세포 형태의 차이가 고려되었다. 이런 이유에서, 인공 피부 동결 시의 세포 형태와 생존율의 관계를명확히 하기 위하여, 동결 전의 배양 시간을 변화시키고, 이것 외에는 실시예 1-1의 A와 동일한 절차로 인공 피부를 제작하여 동결 및 융해 후의 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로는 세포 현탁액이 스펀지에 침투할 때까지 정치시킨 후(본 발명), 또는 37℃에서 2시간 또는 15시간 배양한 후에 실시예 1-1의 A와 동일한 절차로 인공 피부를 제작·동결하였다. 또한, 대조군으로서 세포를 파종 후 37℃에서 48시간 배양한 인공 피부에 대해서도 동일한 방식으로 세포 생존율을 측정하였다. 세포를 파종 후, 2시간∼15시간 배양한 인공 피부에서는 생존율이 낮았으나, 세포를 파종 후 즉시 동결한 인공 피부에서는 대단히 높은 생존율이 얻어졌다. 동결 전에 현미경 하에서 관찰한 결과, 파종 후 2시간 배양한 인공 피부에서는 절반 이상의 세포가 스펀지에 접착한 것으로 확인되었고, 15시간 이상 배양한 인공 피부에서는 모든 세포가 스펀지에 접착한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 세포의 생존율은 동결 시의 세포 형태에 따라 다른 것으로 생각되었다. 세포가 접착하지 않은 상태로 동결한 인공 피부의 세포 회수율은 동결하지 않은 인공 피부에 비해 90% 이상이었다. 따라서, 인공 피부를 융해한 후 세정을 하더라도 세포는 콜라겐 스펀지에 체류하는 것으로 생각되었다. 표 6에 세포 생존율 및 총세포수를 나타낸다.

[표 6]

	동결보존방법	사전배양	세포의 생존율(%)	총세포수(개)
본 발명	① 서냉동결	없음	71.2	2.21×10⁵
비교예	② 서냉동결③ 서냉동결④ 비동결	2시간15시간48시간	20.119.890.7	2.04×10⁵2.51×10⁵2.31×10⁵

실시예 1-2: 인간 섬유 아세포 유래의 인공 피부의 급속 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 피부의 동결 보존

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 섬유 아세포를 DMEM + 10% FBS로 배양하였다. 대수 증식기에 있는 섬유 아세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. FBScryo로 세포를 현탁하여 9.0×10⁵세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 미리 12웰 플레이트 상에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 세포 현탁액을 0.5 ㎖씩 파종하였다(1.2×10⁵세포/cm²). 세포 현탁액이 스펀지에 침투할 때까지 정치한 후, 12웰 플레이트를 플라스틱 테이프로 밀봉하였다. 12웰 플레이트를 그 상태로 -152℃의 초저온 냉동고에 직접 넣어 동결 보존하였다.

A-1) 인공 피부의 융해 및 생존율의 측정

동결 하루 후, -152℃에 보존하고 있었던 인공 피부를 37℃ 워터 배스 중에 3분간 침지하여 융해시켰다. FBScryo 배지를 흡인 제거한 후, DMEM + 10% FBS 2 ㎖로 2회 세정하였다. DMEM + 10% FBS 2 ㎖를 첨가한 후, 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 15시간 이상 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 피부를 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 침지하고, 37℃의 워터 배스 내에서 5∼10분간 진탕하여 상기 인공 피부를 용해시켰다. 4℃의 조건 하에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하고, 트리판블루 색소 배제법을 통해 총세포수, 생세포수 및 생존율을 계측하였다. 대조군으로서, 동결하지 않은 인공 피부에 대해서도 동일한 방식으로 생존율을 측정하였다. -152℃에서 급속 동결한 인공 피부에 있어 77.4%로 높은 생존율이 얻어졌다. 이 결과는 서냉 동결한 경우와 동등하다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 동결한 인공 피부를 융해시킨 후, 하룻밤 배양함으로써 세포가 위족(僞足)을 연장해 콜라겐 스펀지에 접착하는 것을 확인하였다. 표 7에 세포 생존율을 나타낸다.

[표 7 ]

	사전배양	세포파종 시의배지	동결보존액	동결온도	세포의 생존율(%)
동결(본 발명)	없음	FBScryo	FBScryo	-152℃	77.4
비동결(비교예)	48시간	DMEM+10%FBS	비동결	-	88.7

실시예 2: 표피 세포 유래의 인공 피부의 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 피부의 제작 및 동결 방법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 표피 세포를 3%(v/v) FBS 함유 그린 배지(이하, 그린 배지 + 3% FBS)에서 배양하였다. 인간 표피 세포를 1000 유닛/㎖ 디스파제(合同酒精(주) 제조)로 조제한 PBS(-)(인산 완충액) 용액 2 ㎖로 처리하여 회수하였다. 회수한 표피 세포를 다시 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 단세포화하였다. 동결 보존액 A(10%(v/v) 글리세롤, 20%(v/v) FBS 함유 그린 배지)에 현탁하여 2.5×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(3.3×10⁵세포/cm²). 이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 피부를 제작하였다.

① 파종 후 세포가 스펀지에 충분히 침투할 때까지 정치한 후, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

② 파종 후 세포가 스펀지에 충분히 침투할 때까지 정치한 후, -80℃의 초저온 냉동고에 넣어 동결시켰다(급속 동결법).

③ 파종 후 세포가 스펀지에 충분히 침투할 때까지 정치한 후, -152℃의 초저온 냉동고에 넣어 동결시켰다(급속 동결법).

B. 종래 방법에 따른 인공 피부 및 대조군 인공 피부의 제조법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 표피 세포를 그린 배지 + 3% FBS로 배양하였다. 인간 표피 세포를 1000 유닛/㎖ 디스파제(合同酒精(주) 제조)로 조제한 PBS(-)(인산 완충액) 용액 2 ㎖로 처리하여 회수하였다. 회수한 표피 세포를 다시 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 단세포화하였다. 그린 배지 + 3% FBS로 현탁하여 2.5×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(3.3×10⁵세포/cm²).

이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 피부를 제작하였다.

④ 파종 후 하룻밤(15시간 이상) 동안 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배지를 흡인 제거한 후, 동결 보존액 A로 2회 세정하였다. 각 웰에 동결 보존액 A를 1.5 ㎖씩 첨가하고, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

⑤ 동결하지 않은 상태로 2일간 배양하여, 하기 C의 방법에 따라 세포 생존율을 측정하였다.

C. 인공 피부의 융해 및 생존율의 측정

상기 실시예 2의 A 및 B에서 제작한 인공 피부 중의 세포 생존율을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1∼7일 동안 -80℃ 또는 152℃의 초저온 냉동고 내에서 동결 보존한 인공 피부를 37℃ 워터 배스에 5∼10분간 침지하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2.0 ㎖의 그린 배지 + 3% FBS로 인공 피부를 2회 세정하였다. 이 배지 1.5 ㎖를 첨가하여 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 하룻밤(15시간 이상) 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 피부를 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 침지하고, 37℃ 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반해 콜라겐 스펀지를 용해시켰다. 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. 상청을 제거한 후, 0.25% 트립신 용액 3.0 ㎖을 세포에 첨가해 37℃ 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반하였다. 다시, 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. 그린 배지 + 3% FBS로 세포를 현탁하고, 트리판블루 색소 배제법을 통해 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 세포를 콜라겐 스펀지에 파종한 후 세포가 접착하기 전에 서냉 동결(본 발명, 표 8의 ①) 또는 급속 동결(본 발명, 표 8의 ② 및 ③)한 인공 피부에서는 높은 생존율이 얻어졌다. 이것에 비해, 세포를 파종 후 15시간 배양한 뒤에 서냉 동결한 인공 피부(종래 방법, 표 8의 ④)에서는 세포 생존율이 낮았다. 표 8에 세포 생존율을 나타낸다.

[표 8]

	보존방법	사전배양	동결온도(℃)	세포의 생존율(%)
본 발명	① 서냉동결② 급속동결③ 급속동결	없음없음없음	-80-80-152	84.674.683.2
비교예	④ 서냉동결⑤ 비동결	15시간48시간	-80-	19.189.6

실시예 3: 혈관 내피 세포 유래의 인공 혈관의 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 혈관의 제작 및 동결 방법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 혈관 내피 세포를 10%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF(인간 섬유 아세포 증식 인자) 함유 그린 배지에서 배양하였다. 인간 혈관 내피 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. 동결 보존액 B(10%(v/v) 글리세롤, 20%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF 함유 그린 배지)에 현탁하여 1.4×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.6㎖ 씩 파종하였다(2.2×10⁵세포/cm²).

이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 혈관을 제작하였다.

① 파종 후, 세포가 스펀지에 충분히 침투할 때까지 정치한 후, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

B. 종래 방법에 따른 인공 혈관 및 대조용 인공 혈관의 제작법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 혈관 내피 세포를 10%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF 함유 그린 배지에서 배양하였다. 인간 혈관 내피 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. 10%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF 함유 그린 배지에 세포를 현탁하여 1.4×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.6㎖ 씩 파종하였다(2.2×10⁵세포/cm²).

이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 혈관을 제작하였다.

② 파종 후 하룻밤 배양하여 동결 보존액 B로 2회 세정한 후, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

③ 동결하지 않은 상태로 2일간 배양하여 하기 C의 방법에 따라 세포 생존율을 측정하였다.

C. 인공 혈관의 융해 및 생존율의 측정

상기 실시예 3의 A 및 B에서 제작한 인공 혈관 중의 세포 생존율을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1∼7일간 -80℃의 초저온 냉동고 내에서 동결 보존하고 있었던 인공 혈관을 37℃ 워터 배스에 5∼10분간 침지하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2.0 ㎖의 10%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF 함유 그린 배지로 인공 혈관을 2회 세정하였다. 이 배지 1.5 ㎖를 첨가하여 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 하룻밤(15시간 이상) 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 혈관을 0.5% 콜라게나제 용액 5.0㎖에 침지하고, 37℃ 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반해 콜라겐 스펀지를 용해시켰다. 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. 상청을 제거한 후, 0.25% 트립신 용액 3.0㎖을 세포에 첨가해 37℃의 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반했다. 다시, 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. 10%(v/v) FBS 및 10 ng/㎖ 인간 FGF 함유 그린 배지로 세포를 현탁하고, 트리판블루 색소 배제법을 통해 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 세포를 콜라겐 스펀지에 파종한 후 세포가 접착하기 전에 서냉 동결한 인공 혈관(본 발명, 표 9의 ①)에서는 높은 생존율이 얻어졌다. 이에 비해, 세포를 파종 후 15시간 배양한 후에 서냉 동결한 인공 혈관(종래 방법, 표 9의 ②)에서는 세포 생존율이 낮았다. 표 9에 세포 생존율을 나타낸다.

[표 9]

	보존방법	사전배양	동결온도(℃)	세포의 생존율(%)
본 발명	① 서냉동결	없음	-80	83.7
비교예	② 서냉동결③ 비동결	15시간48시간	-80-	51.187.7

실시예 4: 간 세포 유래의 인공 간장의 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 간장의 제작 및 동결 방법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 간 세포를 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖의 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지에서 배양하였다. 인간 간 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하고 회수하였다. 동결 보존액C(10%(v/v) 글리세롤, 20%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지)에 현탁하여 1.5×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(2.0×10⁵세포/cm²). 이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 간장을 제작하였다.

B. 대조용 인공 간장의 제작법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 인간 간 세포를 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지에서 배양하였다. 간 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하고 회수하였다. 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지에 현탁하여 1.5×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(2.0×10⁵세포/cm²).

이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 간장을 제작하였다.

④ 파종 후 하룻밤(15시간 이상) 동안 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배지를 흡인 제거한 후, 동결 보존액 C로 2회 세정하였다. 각 웰에 동결 보존액 C를 1.5 ㎖ 첨가하고, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

⑤ 파종 후 하룻밤(15시간 이상) 동안 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에 배양하였다. 배지를 흡인 제거한 후, 동결 보존액 C로 2회 세정하였다. 각 웰에 동결 보존액 C을 1.5 ㎖ 첨가하여, -80℃의 초저온 냉장고에 넣어 동결시켰다.

⑥ 동결하지 않은 상태로 2일간 배양하여, 하기 C의 방법에 따라 세포 생존율을 측정하였다.

C. 인공 간장의 융해 및 생존율의 측정

상기 실시예 4의 A 및 B에서 제작한 인공 간장 중의 세포 생존율을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1∼7일간 -80℃ 또는 152℃의 초저온 냉동고 내에서 동결 보존하고 있었던 인공 간장을 37℃ 워터 배스에 5∼10분간 침지하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2.0 ㎖의 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지로 인공 간장을 2회 세정하였다. 이 배지 1.5 ㎖를 첨가하여 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 하룻밤(15시간 이상) 동안 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 간장을 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 침지하고, 37℃ 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반해 콜라겐 스펀지를 용해시켰다. 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심조작하여 세포를 회수하였다. 10%(v/v) FBS, 10 ng/㎖ 인간 FGF 및 13 ㎍/㎖ 헤파린 나트륨 함유 그린 배지로 세포를 현탁하여, 트리판블루 색소 배제법을 통해 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 세포를 콜라겐 스펀지에 파종한 후 세포가 접착하기 전에 서냉 동결(본 발명, 표 10의 ①) 또는 급속 동결(본 발명, 표 10의 ② 및 ③)한 인공 간장에서는 높은 생존율이 얻어졌다. 이것에 비해, 세포를 파종 후 15시간 배양한 후에 동결한 인공 간장(종래 방법, 표 10의 ④ 및 ⑤)에서는 세포 생존율이 낮았다. 표 10에 세포 생존율을 나타낸다.

[표 10]

	보존방법	사전배양	동결온도(℃)	세포의 생존율(%)
본 발명	① 서냉동결② 급속동결③ 급속동결	없음없음없음	-80-80-152	88.578.579.6
비교예	④ 서냉동결⑤ 급속동결⑥ 비동결	15시간15시간48시간	-80-80-	23.922.994.0

실시예 5: 각막 실질 세포 유래의 인공 각막의 동결 보존

A. 본 발명의 방법에 따른 인공 각막의 제작 및 동결 방법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 토끼 각막 실질 세포를 DMEM + 10% FBS로 배양하였다. 토끼 각막 실질 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. 동결 보존액 FBScryo에 현탁하여 1.0×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(1.3×10⁵세포/cm²). 이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 각막을 제작하였다.

② 파종 후 세포가 스펀지에 충분히 침투할 때까지 정치한 후, -152℃의 초저온 냉동고에 넣어 동결시켰다(급속 동결법).

B. 대조용 인공 각막의 제작법

배양 플라스크(배양 면적 80 cm²)를 이용해 토끼 각막 실질 세포를 DMEM + 10% FBS로 배양하였다. 각막 실질 세포를 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 회수하였다. DMEM + 10% FBS에 현탁하여 1.0×10⁶세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하였다. 이것을 미리 12웰 플레이트에 넣어 둔 직경 22 mm의 원형 콜라겐 스펀지에 0.5 ㎖씩 파종하였다(1.3×10⁵세포/cm²).

이어서, 다음과 같은 방법으로 인공 각막을 제작하였다.

③ 파종 후 하룻밤(15시간 이상) 동안 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배지를 흡인 제거한 후, FBScryo로 2회 세정하였다. 각 웰에 FBScryo를 1.5 ㎖ 첨가하고, -0.2∼-5℃/분의 속도로 -80℃까지 냉각하여 동결시켰다(서냉 동결법).

④ 파종 후 하룻밤(15시간 이상) 동안 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 배지를 흡인 제거한 후, FBScryo로 2회 세정하였다. 각 웰에 FBScryo를 1.5 ㎖ 첨가하고, -80℃의 초저온 냉장고에 넣어 동결시켰다.

⑤ 동결하지 않은 상태로 2일간 배양하여, 하기 C의 방법에 의해 세포 생존율을 측정하였다.

C. 인공 각막의 융해 및 생존율의 측정

상기 실시예 5의 A 및 B에서 제작한 인공 각막 중의 세포 생존율을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1∼7일간 -80℃ 또는 152℃의 초저온 냉동고 내에서 동결 보존하고 있었던 인공 각막을 37℃ 워터 배스에 5∼10분간 침지하여 융해시켰다. 배지를 흡인 제거한 후, 2.0 ㎖의 10%(v/v) FBS로 인공 각막을 2회 세정하였다. 이 배지 1.5 ㎖를 첨가하여 5% 탄산 가스, 37℃의 조건 하에서 하룻밤(15시간 이상) 동안 배양하였다. 이어서, 얻어진 인공 각막을 0.5% 콜라게나제 용액 5.0 ㎖에 침지하고, 37℃ 워터 배스 중에서 5∼10분간 교반해 콜라겐 스펀지를 용해시켰다. 4℃에서 약 400×g로 5분간 원심 조작하여 세포를 회수하였다. DMEM + 10% FBS로 세포를 현탁하고, 트리판블루 색소 배제법을 통해 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 세포를 콜라겐 스펀지에 파종한 후 세포가 접착하기 전에 서냉 동결(본 발명, 표 11의 ①) 또는 급속 동결(본 발명, 표 11의 ②)한 인공 각막에서는 높은 생존율이 얻어졌다. 이것에 비해, 세포를 파종 후 15시간 배양한 후에 동결한 인공 각막(종래 방법, 표 11의 ③ 및 ④)에서는 세포 생존율이 낮았다. 표 11에 세포 생존율을 나타낸다.

[표 11]

	보존방법	사전배양	동결온도(℃)	세포의 생존율(%)
본 발명	① 서냉동결② 급속동결	없음없음	-80-152	63.572.4
비교예	③ 서냉동결④ 급속동결⑤ 비동결	15시간15시간48시간	-80-80-	14.99.188.2

본 발명의 동결 보존 방법은 종래의 방법보다 세포 생존율이 높기 때문에, 창상 치유에 유효한 조직 등가물을 보다 장기간 보존할 수 있다. 또한, 본 방법은 동결 전의 사전 배양 및 세정 공정을 생략할 수 있고, 융해 후의 세정 조작이 간단하기 때문에 종래의 방법에 비해 간편하고 저렴하다. 또한, 본 방법으로는 간단한 프리저(-85℃∼-20℃)를 이용한 조직 등가물의 동결 보존이 가능하기 때문에, 보다 많은 의료 시설에서 보존할 수 있다. 나아가, 본 방법에 따라 동결 보존된 조직 등가물은 독성도 없고 안전성이 높기 때문에 즉시 임상에 사용할 수 있다.

Claims

세포를 동결 보존액 중에 현탁하는 공정, 상기 세포를 기재 상에 파종하는 공정, 및 이렇게 하여 얻어지는 조직 등가물(組織等價物)을 세포가 기재에 접착하기 전에 동결시키는 공정으로 이루어지는 조직 등가물의 동결 보존 방법.
제1항에 있어서,

세포가 포유동물 유래의 섬유 아세포, 표피 세포, 혈관 내피 세포, 랑게르한스 세포, 멜라노사이트, 지방 세포, 모모세포(毛母細胞), 모유두세포(毛乳頭細胞), 평활근 세포, 간 세포, 각막 실질 세포, 각막 상피 세포 및 각막 내피 세포로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 방법.
제1항에 있어서,

동결시키는 공정이 서냉 동결법에 의해 행해지는 방법.
제1항에 있어서,

동결시키는 공정이 급속 동결법에 의해 행해지는 방법.
제1항에 있어서,

동결시키는 공정이 유리화(vitrification) 동결법에 의해 행해지는 방법.
제1항에 있어서,

동결 후의 보존 온도가 -196℃ 이상 -20℃ 이하인 방법.
제1항에 있어서,

조직 등가물이 인공 피부, 인공 혈관, 인공 간장 또는 인공 각막인 방법.
동결 보존액 중에 현탁된 세포를 기재 상에 파종하고, 그것을 세포가 기재에 접착하기 전에 동결시킴으로써 얻어지는 동결 보존된 조직 등가물.
제8항에 있어서,

조직 등가물이 인공 피부, 인공 혈관, 인공 간장 또는 인공 각막인 조직 등가물.
제8항에 있어서,

기재와 세포의 조합이 아테로콜라겐으로 이루어지는 스펀지와 인간 유래의 섬유 아세포의 조합인 조직 등가물.
제10항에 있어서,

아테로콜라겐으로 이루어지는 스펀지가 종형의 빈 구멍을 가지는 조직 등가물.