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KR20020070377A - 신규 면역증강 조성물 - Google Patents

신규 면역증강 조성물 Download PDF

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KR20020070377A
KR20020070377A KR1020027008682A KR20027008682A KR20020070377A KR 20020070377 A KR20020070377 A KR 20020070377A KR 1020027008682 A KR1020027008682 A KR 1020027008682A KR 20027008682 A KR20027008682 A KR 20027008682A KR 20020070377 A KR20020070377 A KR 20020070377A
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KR
South Korea
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matsutake
hot water
extract
alkaline solution
water extract
Prior art date
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Application number
KR1020027008682A
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Inventor
마쯔나가겐이치
Original Assignee
구레하 가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을 유효성분으로서 각각 함유하는, 신규 면역증강 조성물 또는 기능성 식품, 신규 킬러활성 유도 조성물 또는 기능성 식품, 신규 종양 증식억제 조성물 또는 기능성 식품, 신규 인터루킨 12 유도 조성물 또는 기능성 식품, 신규 TGF-β활성억제 조성물 또는 기능성 식품 및 신규 활성산소 포착 조성물 또는 기능성 식품 및 신규 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을 개시한다.

Description

신규 면역증강 조성물{Novel immune enhancing compositions}
기술분야
본 발명은, 신규한 면역증강 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역증강 조성물은, 의약품으로서 투여할 수 있을 뿐 아니라, 여러 형태, 예를 들면, 기능성 식품이나 건강식품(음료를 포함한다), 또는 사료로서 음식물의 형태로 부여하는 것도 가능하다. 더 나아가서는, 입 안에 일시적으로 포함하지만, 그 대부분을 입 안에서 뱉어내는 형태, 예를 들면, 치약제, 세구제, 츄잉껌, 또는 가글제의 형태로 부여하는 것도, 또한, 코로 흡인시키는 흡입제의 형태로 부여하는 것도 가능하다.
배경기술
버섯에는 여러 생리활성물질이 포함되어 있는 것이 알려져 있어, 예를 들면, 일본국 특공소57-1230호 공보 및 특허 제2767521호 명세서에는, 송이버섯에 함유되는 각종 항종양성 물질이 개시되어 있다. 상기 일본국 특공소57-1230호 공보에는, 송이버섯 균사체의 액체배양물을 열수(hot water) 또는 희석알칼리용액으로 추출하여 얻어지는 추출액으로부터 분리정제된 에미타닌-5-A, 에미타닌-5-B, 에미타닌-5-C 및 에미타닌-5-D에, 사르코마 180(sarcoma 180)세포의 증식 저지작용이 있는 것이 개시되어 있다. 또한, 상기 특허 제2767521호 명세서에는, 송이버섯 자실체의물추출물로부터 분리정제된 분자량 20~21만의 단백질(서브유닛의 분자량=10~11만)이 항종양활성을 갖는 것이 개시되어 있다.
본 발명자는, 시판되고 있는 여러 식용 버섯에 대해서, 그 열수추출액의 여러 생리활성을 비교검토한 바, 송이버섯을 포함하는 많은 식용 버섯에 있어서 사르코마 180세포의 증식억제활성이 인정된 것에 대해, 면역증강활성에 관해서는, 송이버섯 만이 매우 높은 활성을 나타내는 것을 새롭게 발견했다. 또한, 송이버섯 열수추출액 뿐 아니라, 송이버섯의 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분도, 면역증강활성을 나타내는 것을 새롭게 발견했다. 이러한 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의 면역증강활성은, 지금까지 전혀 알려져 있지 않아, 본 발명은 이러한 사실에 의한 것이다.
발명의 개시
따라서, 본 발명은, 송이버섯(Tricholoma matsutake) 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 면역증강 조성물, 킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)조성물, 종양 증식억제조성물, 인터루킨 12 유도조성물, TGF-β활성억제조성물 및 활성산소 포착조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는, 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분과 함께 함유하는, 면역증강 기능성 식품, 킬러활성 유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성 유도) 기능성 식품, 종양 증식억제 기능성 식품, 인터루킨 12 유도 기능성 식품, TGF-β활성억제 기능성 식품 및 활성산소 포착 기능성 식품에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 면역증강이 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 면역을 증강하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 킬러활성(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성)을 유도하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 종양 증식억제가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는,종양증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 인터루킨 12 유도가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인터루킨 12를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, TGF-β활성억제가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, TGF-β활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 활성산소 포착이 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 활성산소를 포착하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 면역증강 조성물 또는 면역증강 기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)조성물 또는킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 종양 증식억제 조성물 또는 종양 증식억제 기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 인터루킨 12 유도조성물 또는 인터루킨 12 유도 기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, TGF-β활성억제조성물 또는 TGF-β활성억제 기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 활성산소 포착 조성물 또는 활성산소 포착 기능성 식품을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 흡착획분 D2의1H 일차원 NMR 측정에 의해 얻어진 스펙트럼이다.
도 2는, 흡착획분 D2의13C 일차원 NMR 측정에 의해 얻어진 스펙트럼이다.
도 3은, 흡착획분 D2의 원편광 이색성 분석에 의해 얻어진 CD 스펙트럼이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 열수추출하여, 음이온 교환수지 흡착시켜 얻을 수 있는 본 발명의 신규 획분은, 열수추출공정을 경유함에도 불구하고, 우수한 면역증강활성을 나타낸다. 또한,송이버섯 열수추출액도 우수한 면역증강활성을 나타낸다. 더욱이, 송이버섯의 알칼리용액 추출액도 우수한 면역증강활성을 나타내고, 상기 알칼리용액 추출액을, 음이온 교환수지 흡착시켜 얻을 수 있는 본 발명의 신규획분도 우수한 면역증강활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 의한 면역증강 조성물은, (1) 송이버섯 열수추출액, (2) 송이버섯의 알칼리용액 추출액, (3) 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분 또는, (4) 송이버섯의 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 유효성분으로서 함유하고, 더욱이 약제학적 또는 수의학적으로 허용할 수 있는 통상의 담체를 함유한다.
본 발명의 면역증강 조성물에 있어서의 유효성분인, 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 송이버섯을 열수로 추출하여(이하, 열수추출공정이라고 칭한다), 얻어진 추출액을 음이온 교환수지에 흡착시킨 후(이후, 음이온 교환수지 흡착공정이라고 칭한다), 적당한 용리액으로 흡착획분을 용출(이하, 용출공정이라고 칭한다)함으로써, 얻을 수 있다.
열수추출공정에 사용하는 상기 송이버섯으로서는, 예를 들면, 천연 송이버섯의 자실체(fruit body) 또는 균사체(mycelium), 또는 배양에 의해 얻어지는 송이버섯의 균사체 또는 배양물(broth)을 들 수 있다. 배양에 사용하는 상기 송이버섯으로서는, 예를 들면, 구레하화학공업주식회사 생물의학연구소에서 수립 및 유지하고 있는 송이버섯 CM627-1주를 들 수 있다.
상기 송이버섯으로서 자실체 또는 균사체를 사용하는 경우에는, 추출효율이 향상되도록, 파쇄물 또는 분체의 상태로 가공하는 것이 바람직하다.
열수추출공정에 사용하는 열수의 온도는, 60~100℃인 것이 바람직하고, 80~98℃인 것이 보다 바람직하다. 또한, 추출시에는, 추출효율이 향상되도록, 교반 또는 진탕하면서 실시하는 것이 바람직하다. 추출시간은, 예를 들면, 송이버섯의 상태(즉, 자실체, 균사체, 또는 배양물 중 어느 하나의 상태이던가, 또는, 파쇄물 또는 분체의 상태로 가공한 경우에는 그 가공상태), 열수의 온도, 또는 교반 또는 진탕의 유무 또는 조건에 따라, 적절히 결정할 수 있지만, 통상 1~6시간이고, 2~3시간인 것이 바람직하다.
열수추출공정에서 얻어진 추출액은, 불용물이 혼재하는 상태에서, 그대로, 다음의 음이온 교환수지 흡착공정에 사용할 수도 있지만, 불용물을 제거한 후, 또는, 불용물을 제거하고, 더욱이, 추출액 중의 저분자획분을 제거한 후, 다음의 음이온 교환수지 흡착공정에 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 불용물이 혼재하는 열수추출액을 원심분리함으로써 불용물을 제거하고, 얻어지는 상청 만을, 다음의 음이온 교환수지 흡착공정에 사용할 수 있다. 또는, 불용물이 혼재하는 열수추출액을 원심분리하여 얻어지는 상기 상청을 투석하고, 저분자획분(바람직하게는 분자량 3500 이하의 획분)을 제거한 후, 다음의 음이온 교환수지 흡착공정에 사용할 수 있다.
음이온 교환수지 흡착공정에 사용할 수 있는 음이온 교환수지로서는, 공지의 음이온 교환수지를 사용할 수 있고, 예를 들면, 디에틸아미노에틸(DEAE)셀룰로오스 또는 트리에틸아미노에틸(TEAE)셀룰로오스를 들 수 있다.
용출공정에 사용하는 용리액은, 음이온 교환수지 흡착공정에 사용하는 음이온 교환수지의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있고, 예를 들면, 염화나트륨수용액 등을 들 수 있다.
용출공정에 의해 용출되는 획분은, 그대로, 본 발명의 면역증강 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있지만, 통상, 용리액에 유래하는 염을 함유하기 때문에, 그것을 제거하기 위해, 더욱이 투석을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역증강 조성물에 있어서의 유효성분인 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 아래에 나타내는 이화학적 성질을 갖는다. 또한, 아래에 나타내는 각 수치는, 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의 한 태양인, 후술하는 실시예 2에서 조제한흡착획분 D2의 이화학적 성질로, 후술하는 실시예에 있어서의 「흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토」에 기재의 각 측정방법을 토대로 한 수치이다.
(1) 당질 함량: 글루코오스 환산값으로서 13%이다.
(2) 단백질 함량: 알부민 환산값으로서 86%이다.
(3) 당조성: 만노오스 47.7 ㎍/mg, 갈락토오스 32.43 ㎍/mg, 글루코오스 25.09 ㎍/mg, 아라비노오스 12.09 ㎍/mg, 리보오스 8.30 ㎍/mg, 크실로오스 3.75 ㎍/mg 및 람노오스 0.44 ㎍/mg이다.
(4) 아미노산조성: 아스파라긴산 및 아스파라긴 14.12 몰%, 트레오닌 6.39 몰%, 세린 7.64 몰%, 글루타민산 및 글루타민 13.83 몰%, 글리신 14.03 몰%, 알라닌 7.77 몰%, 발린 5.36 몰%, 1/2-시스틴 0.87 몰%, 메티오닌 1.11 몰%, 이소류신 3.70 몰%, 류신 5.20 몰%, 티로신 1.51 몰%, 페닐알라닌 2.28 몰%, 리신 4.05 몰%, 히스티딘 1.67 몰%, 아르기닌 2.52 몰% 및 프롤린 7.93 몰%이다.
(5) 분자량분포: 약 4.5만~100만 사이에 폭 넓게 분포한다. 그 중에서 피크 톱이 5개 존재하고, 각각의 추정분자량은 약 4.5만, 약 12만, 약 16만, 약 38만 및 100만 이상이다.
(6) 등전점: 등전점 전기영동법에 의해, 3개의 피크가 검출된다. 메인밴드는 4.8 부근(4.5~5.2)이고, 그 밖의 밴드는 7.6 부근(7.35~8.0) 및 9.2 부근 (8.65~9.3)이다.
(7) 자외분광분석: 240~260 nm에 피크가 발견되었다[측정조건은, 후술하는 「흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토」(7)을 참조할 것].
(8)1H 일차원 NMR 분석: 도 1에 나타내는 스펙트럼[측정조건은, 후술하는 「흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토」(8)(i)를 참조할 것]을 나타낸다.
(9)13C 일차원 NMR 분석: 도 2에 나타내는 스펙트럼[측정조건은, 후술하는 「흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토」(8)(ii)를 참조할 것]을 나타낸다.
(10) 원편광 이색성 분석: 도 3에 나타내는 스펙트럼[측정조건은, 후술하는 「흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토」(9)를 참조할 것]을 나타낸다. Chen 등의 방법[BioChemistry, 11, 4120-4131(1972)]에 따라 2차구조를 해석한 바, α헤릭스 17%, β시트 18% 및 불규칙구조 65%이다.
본 발명의 면역증강 조성물에 있어서의 유효성분인, 송이버섯의 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 앞서 설명한 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의 제조방법에 준한 방법으로 얻을 수 있다. 즉, 열수 대신에 알칼리용액을 사용하는 것 이외에는, 송이버섯 열수추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의 상기 제조방법과 동일한 방법에 의해, 조제할 수 있다. 예를 들면, 송이버섯을 알칼리용액으로 추출하여(이하, 알칼리용액 추출공정이라고 칭한다), 얻어진 추출액을 음이온 교환수지에 흡착시킨 후(즉, 음이온 교환수지 흡착공정), 적당한 용리액에 의해 흡착획분을 용출(즉, 용출공정)함으로써, 얻을 수 있다.
알칼리용액 추출공정에 사용하는 알칼리용액으로서는, 이것에 한정되지는 않지만, 예를 들면, 알칼리금속(예를 들면, 나트륨 또는 칼륨)의 수산화물, 특히 수산화나트륨의 수용액을 사용할 수 있다. 상기 알칼리용액의 pH는, 8~13인 것이 바람직하고, 9~12인 것이 보다 바람직하다. 알칼리용액 추출공정은, 0~20℃에서 실시하는 것이 바람직하고, 0~15℃에서 실시하는 것이 보다 바람직하다. 알칼리추출공정에서 얻어진 추출액은, 중화처리를 실시한 후 다음의 음이온 교환수지 흡착공정에 사용할 수 있다.
본 발명의 면역증강 조성물은, 유효성분으로서의 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 약제학적 또는 수의학적으로 허용할 수 있는 통상의 담체와 함께, 동물, 바람직하게는 포유동물(특히 인간)에게 투여할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 면역증강활성, 예를 들면, 킬러활성(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성)의 유도활성, 종양 증식억제 활성, 사이토카인(특히 인터루킨 12)유도활성, TGF-β활성억제활성, 또는 활성산소 포착활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 유효성분인, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 그 단독으로, 또는, 바람직하게는 약제학적 또는 수의학적으로 허용할 수 있는 통상의 담체와 함께, 면역증강이 필요한 대상, 예를 들면, 킬러활성(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성)의 유도가 필요한 대상, 종양 증식억제가 필요한 대상, 사이토카인(특히 인터루킨 12)유도가 필요한 대상, TGF-β활성억제가 필요한 대상, 또는 활성산소 포착이 필요한 대상에, 유효량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 유효성분인, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분은, 면역증강 조성물 또는 면역증강 기능성 식품, 예를 들면, 킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)조성물 또는 킬러활성유도(바람직하게는 장관림프구의 킬러활성유도)기능성 식품, 종양 증식억제 조성물 또는 종양 증식억제 기능성 식품, 인터루킨 12 유도조성물 또는 인터루킨 12 유도 기능성 식품, TGF-β활성억제 조성물 또는 TGF-β활성억제 기능성 식품, 또는 활성산소 포착 조성물 또는 활성산소 포착 기능성 식품을 제조하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 면역증강 조성물의 투여제형으로서는, 특별히 한정이 없고, 예를 들면, 산제, 세립제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼제, 시럽제, 엑기스제, 또는 환제 등의 경구제, 또는 주사제, 외용액제, 연고제, 좌제, 국소투여 크림, 또는 점안약 등의 비경구제를 들 수 있다.
이들 경구제는, 예를 들면, 젤라틴, 아르긴산나트륨, 전분, 콘스타치(corn starch), 백당, 젖당, 포도당, 만니톨(mannitol), 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트린, 폴리비닐피롤리돈, 결정셀룰로오스, 대두레시틴, 수크로오스, 지방산에스테르, 탈크, 스테아린산마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 규산마그네슘, 무수규산, 또는 합성규산 알루미늄 등의 부형제, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 활택제, 유동성 촉진제,희석제, 보존제, 착색제, 향료, 교미제, 안정화제, 보습제, 방부제 또는 산화방지제 등을 사용하여, 일반적인 방법에 따라 제조할 수 있다.
비경구 투여방법으로서는, 주사(피하, 정맥내 등), 또는 직장투여 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서, 주사제가 가장 적합하게 사용된다.
예를 들면, 주사제의 조제에 있어서는, 유효성분으로서의 상기 획분 외에, 예를 들면, 생리식염수 또는 링거액 등의 수용성 용제, 식물유 또는 지방산에스테르 등의 비수용성 용제, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제, 용해보조제, 안정화제, 방부제, 현탁화제, 또는 유화제 등을 임의로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 면역증강 조성물은, 서방성 폴리머 등을 사용한 서방성 제제의 수법을 사용하여 투여하더라도 좋다. 예를 들면, 본 발명에 의한 면역증강 조성물을 에틸렌비닐초산폴리머의 펠릿에 넣고, 이 펠릿을 치료 또는 예방해야 할 조직 중에 외과적으로 이식할 수 있다.
본 발명에 의한 면역증강 조성물은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 0.01~99중량%, 바람직하게는 0.1~80중량%의 양으로 함유할 수 있다.
본 발명에 의한 면역증강 조성물을 사용하는 경우의 투여량은, 병의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 증상의 정도, 또는 투여방법 등에 따라 적절히 결정할 수 있어, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여하는 것이 가능하다.
또한, 형태도 의약품에 한정되는 것이 아니라, 여러 형태, 예를 들면, 기능성 식품이나 건강식품(음료를 포함한다), 또는 사료로서 음식물의 형태로 부여하는 것도 가능하다. 더 나아가서는 입 안에 일시적으로 포함하지만, 그 대부분을 입 안으로부터 뱉어내는 형태, 예를 들면, 치약제, 세구제, 츄잉껌, 또는 가글제의 형태로 부여하는 것도, 또는 코로 흡인시키는 흡입제의 형태로 부여하는 것도 가능하다. 예를 들면, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 첨가제(예를 들면, 식품첨가제)로서, 목적으로 하는 식품(음료를 포함한다), 사료, 치약제, 세구제, 츄잉껌, 또는 가글제 등에 첨가할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 버섯 열수추출액의 생물활성 시험
(1) 버섯 열수추출액의 조제
시판의 이와테현산 송이버섯 자실체 250 g을 동결건조하여 수분을 제거한 후, 분쇄하여 분말 35 g을 얻었다.
1리터 용량의 비이커에, 상기 분말의 일부(20 g)와 순수 800 mL를 가하고, 교반기 교반하, 93~98℃의 워터바스 속에서 3시간 추출했다. 추출종료 후, 실온까지 냉각하여, 원심분리(12000 rpm, 20분간)에 의해, 상청을 얻었다.
상청을 얻은 후의 침전부에는, 순수 500 mL를 가하여, 상기와 동일한 처리를행했다. 이 조작을 합계 3회 행하여, 각 조작에서 얻어진 상청과, 앞서 얻어진 상청을 합친 후, 분자량 3500 분획의 투석막(Spectra/Por3 Membrane; Spectrum, 미국)에 넣고, 수돗물의 유수속에서 2일간 투석했다. 투석막내액을 로터리 에바포레이터(rotary evaporator)를 사용하여 농축한 후, 동결건조를 행하여, 분말 1.12 g을 얻었다.
더욱이, 시판 식용 버섯 13종류에 대해, 상기와 동일한 처리를 행하여, 각각, 분말을 얻었다. 버섯의 종류와 수율(대건조균체 질량%)을 표 1에 나타낸다.
표 1
(2) 버섯 열수추출액의 생물활성 검정
전항 (1)에서 분체로서 얻어진 식용 버섯 추출액을, 마우스에 경구투여하여, 장관림프구의 킬러활성유도에 미치는 영향을 검토했다. 즉, 종양세포를 맹장벽에 이식한 마우스로부터, 장간막 림프절세포를 꺼내, 시험관내에서 상기 종양세포에서 재자극했을 때의 킬러활성을 측정함으로써, 생물활성을 검정했다. 사용한 종양세포는, 마우스 백혈병세포 P815 및 B7/P815세포이고, 이들은 규슈대학 생체방어의학연구소 하라타 마모루박사로부터 공여된 세포주를, 10% 우태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지중에서, 구레하화학공업주식회사 생물의학연구소에서 계대유지하고 있다. 동물은 일본 SLC로부터 구입한 자성 DBA/2 마우스로, 예비사육한 후, 8주령으로 실험에 사용했다.
미리, 펜토바르비탈(다이닛폰세이야쿠) 50 mg/kg을 복강내 투여하여 마취상태로 한 마우스를 고정하여, 그 복부를 가위와 핀셋으로 열어, 맹장부를 꺼내고, 1/8G의 치과용 주사침(하타지루시 모토키 주사침)을 장착한 1 mL용 주사기를 사용하여, B7/P815세포(1 ×106개/50 μL)를 맹장벽 아래로 이식하여, 해부용 호치키스를 사용하여 복부를 닫았다. 마취로부터 깨어난 마우스를 사육장에 넣고, 통상의 사육환경하에서 사육했다. 그리고, 종양세포 이식 다음날부터, 경구투여용 프로브를 사용하여, 각 샘플 500 mg/kg/일을 연일 10일간 경구투여했다(1군당 5~10마리).
최중투여 다음날에 마우스를 도살하여, 장간막 림프절을 무균적으로 꺼내, 행크스 평형염류용액(Hanks Balanced Salt Solution)을 넣은 뮤균샬레로 옮겼다.가위와 핀셋으로 림프절을 가늘게 찢은 후, 메쉬를 통해 림프구의 단세포액을 조제했다. 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지로 세포를 3회 세척한 후, 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄), 5 ×10-5mol/L의 2-메르캅토에탄올, 20 mmol/L의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 및 30 ㎍/mL 겐타마이신을 각각 첨가한 RPMI1640배지로, 세포농도를 5 ×106개/mL로 조정하여, 에펙터세포(effector cell)로서 사용했다.
한편, 자극세포는, 아래의 순서로 조제했다. 즉, P815세포 또는 B7/P815세포를 RPMI1640배지중에 5 ×106개/mL가 되도록 현탁하여, 마이토마이신C(시그마)를 50 ㎍/mL가 되도록 가하여, 5% 탄산가스 배양기중에서 30분간 반응시킨 후, 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지로 세포를 3회 세척하여, 세포농도를 1 ×105개/mL로 조정했다.
혼합림프구 ·종양세포반응(Mixed Lymphocyte Tumor cell Reaction)은, 아래의 조건으로 검토했다.
즉, 96웰의 세포배양용 바닥이 평평한 마이크로플레이트(Falcon 3072; Becton Dickinson Labware, 미국)에, 상기 에펙터세포 및/또는 자극세포를 0.1 mL씩 가하여, 5% 탄산가스 배양기중에서 3일간 배양하여, 세포를 필터상으로 회수했다. 또한, 에펙터세포 및 자극세포 양쪽을 가하는 경우에는, 양자의 세포수비를 12.5(에펙터세포수/자극세포수)로 했다. 본 측정계에 있어서는, 상기 에펙터세포가, 혼합림프구 ·종양세포반응에 있어서의 「림프구」로서 기능하여, 상기 자극세포가 「종양세포」로서 기능한다. 배양종료 24시간 전에, 플레이트의 각 웰에3H-티미딘(Amersham Japan) 37kBq를 가했다. 회수한 세포를 5% 트리클로로초산으로 충분히 세척한 후, 건조하여, 액체용 바이알에 넣어, 액체 신틸레이터를 가하여, 액체 신틸레이션 카운터로, 방사능활성을 측정했다.
스티뮬레이션 ·인덱스(Stimulation Index; S. I. )는, 식:
[S. I.]=(Bmix-Bs)/(Be-Bs)
[식중, Bmix는, 에펙터세포 및 자극세포 혼합배양군의 방사능활성(단위=Bp)이고, Bs는, 자극세포 단독배양군의 방사능활성(단위=Bq)이며, Be는 에펙터세포 단독 배양군의 방사능활성(단위=Bq)이다]
에 의해 산출했다.
한편, 림프구 ·종양세포의 혼합배양에 의한 세포상해활성 유도반응 (Lymphocyte Tumor cell Mixed culture-induced Cytotoxicity)은, 아래의 조건으로 검토했다.
즉, 24웰의 세포배양용 마이크로플레이트(Culture Clastar)(Costar 3524; Corning Inc., 미국)에, 상기 에펙터세포 및 자극세포 (에펙터세포수/자극세포수=12.5)를 1.0 mL씩 가하여, 37℃의 5% 탄산가스 배양기중에서 3일간 배양했다. 배양종료 후, 세포를 회수하여, 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지로 3회 세척했다. 현미경을 사용하여 세포현탁액중의 에펙터세포수 만을 계수하여, 에펙터세포수를 2.5 ×106개/mL로 조정했다.
한편, 별도로 준비한 P815세포를 크롬산나트륨(Amersham Japan)과 37℃에서 20분간 반응시켰다. 미결합의 방사성 물질을 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지로 3회 세척함으로써 제거하고, 방사성 크롬표지 종양세포를 5 ×104/mL로 조정했다.
상기 에펙터세포 또는 그의 2배 희석계열과 방사성 크롬표지 종양세포를 시험관에 0.1 mL씩 가하여, 37℃의 5% 탄산가스 배양기중에서 4시간 반응시켰다. 반응종료후, 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지를 각각의 시험관에 1.5 mL씩 가하여, 믹서로 잘 혼합한 후, 원심분리(1200rpm, 5분간, 4℃)하여 상청을 분리하고, 방사능활성을 감마카운터를 사용하여 측정했다.
특이적 상해율 [Specific Lysis; S. L. (단위=%)]은 식:
[S. L. (%)]={(B-Bf)/(Bmax-Bf)} ×100
[식중, B는 실험군 상청의 방사능활성(단위=Bq)이고, Bf는 자연유리군 상청의 방사능활성(단위=Bq)이며, Bmax는 최대유리군의 방사능활성(단위=Bq)이다]
에 의해 산출했다. 또한, 자연유리군이란, 방사성 크롬표지 종양세포 단독배양군을 의미하고, 최대유리군이란, 트리톤(Triton) 처치 방사성 크롬표지 종양세포군을 의미한다.
전항 (1)에서 조제한 샘플의 혼합림프군 ·종양세포반응, 또는 림프구 ·종양세포의 혼합배양에 의한 세포상해활성 유도반응에 미치는 영향을 측정한 결과(에펙터세포수/종양세포수가 12.5일 때의 값)를 표 2에 나타낸다. 송이버섯 자실체 유래의 샘플에서 유의한 증강이 보였다. 또한, 대조군에는 순수 0.2 mL를 경구투여했다. 표 2에 있어서, *는 대조군에 대해 p<0.05에서 유의한 차가 있는 것을 나타낸다.
표 2
실시예 2: 송이버섯 열수추출액 및 그의 음이온 교환수지 흡착획분의 조제
구레하화학공업주식회사 생물의학연구소에서 수립 및 유지하고 있는 송이버섯 CM627-1주 균사체를 멸균을 끝낸 배지(3% 글루코오스, 0.3% 효모엑기스, pH 6.0) 100 mL가 들어 있는 500 mL용 삼각 플라스크 10개에 접종하여, 22℃에서 250 rpm의 진탕배양기로 4주간 배양을 행했다. 얻어진 배양물을 호모게나이저에 건 후, 교반기 교반하, 93~98℃의 워터바스중에서 3시간 추출했다. 추출종료 후, 실온까지 냉각하여, 원심분리(12000 rpm, 20분간, 4℃)에 의해, 상청을 얻었다.
침전부에는 순수 500 mL를 가하여, 상기와 동일한 처리를 행했다. 이 조작을 합계 3회 행하고, 모든 상청을 합쳐, 투석막(Spectra/Por3 Membrane, 분자량 3500분획)에 넣어, 수돗물 유수속에서 3일간 투석했다. 투석막내액을 로터리 에바포레이터로 농축한 후, 동결건조를 행하여, 분말(획분 D) 3.9 g을 얻었다.
이어서, 상기 분말(획분 D)을 50 mmol/L 트리스 염산완충액(pH 7.0)에 용해하여, 미리 상기 완충액으로 평형화시켜 둔 디에틸아미노에틸(DEAE)셀룰로오스컬럼 (구경=2 cm, 높이=20 cm)에 어플라이하고, 이어서 상기 완충액 100 mL를 흘려, 비흡착획분 D1(이하, 간단히 「D1 획분」이라고 칭하는 경우가 있다)을 얻었다. 이어서, 상기 완충액에 1 mol/L 염화나트륨을 가한 용액 200 mL를 조제하고, 상기 컬럼에 걸어, 흡착물을 용출하여, 흡착획분 D2(이하, 간단히 「D2 획분」이라고 칭하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 비흡착획분 및 흡착획분용액을 각각, 투석막(Spectra/Por3 Membrane, 분자량 3500 분획)에 넣어, 순수중에서 3일간 투석했다. 투석막내액을 로터리 에바포레이터로 농축한 후, 동결건조를 행하여, 비흡착획분 D1 분말 1.9 g 및 흡착획분 D2 분말 1.5 g을 얻었다.
상기 「버섯 열수추출액의 생물활성 시험」(2)와 동일한 방법에 의해 각각의 획분의 면역활성을 조사한 바, 표 3에 나타내는 바와 같이, 흡착획분 D2에 활성이 확인되었다. 또한, 표 3에 있어서, *는 대조군에 대해 p<0.01에서 유의한 차가 있는 것을 나타내고, **는 대조군에 대해 p<0.05에서 유의한 차가 있는 것을 나타낸다. 또한, 획분 D는, DEAE 셀룰로오스컬럼에 걸기 전의 획분을 의미한다.
표 3
흡착획분 D2의 이화학적 성질의 검토
D2 획분의 이화학적 성질을 검토했다. 측정방법 및 그 결과를 아래에 나타낸다.
(1) 당질의 정량
페놀황산법을 사용하여 비색에 의해 정량했다. D2 획분의 당질 함량은, 글루코오스 환산값으로서 13%였다.
(2) 단백질의 정량
구리폴린법(copper-Folin method)을 사용하는 비색에 의해 정량했다. D2 획분의 단백질 함량은, 알부민 환산값으로서 86%였다.
(3) 당질의 조성분석
봉입관에 D2 획분 1.0 mg과 2 mol/L 트리플루오로초산 0.2 mL를 넣고, 100℃에서 6시간 가수분해한 후, 에바포레이터로 감압건조하여, 잔사를 얻었다. 잔사를 순수 500 μL에 용해하여, 순수로 2배 또는 10배 희석했다. 이 용액 500 μL에 내부표준물질 헵토오스 500 ng을 첨가하여, 컬럼 TSK-gel Sugar AXGLC-9A 15 cm ×4.6 mm ID(도소)와 검출기 분광광도계 RF-535(시마즈제작소)를 장착한 고속액체크로마토장치 LC-9A(시마즈제작소)에 어플라이했다. 컬럼온도는 70℃이고, 이동상 및 그의 유속은 0.5 M 붕산칼륨완충액(pH 8.7) 및 0.4 mL/분이었다. 포스트컬럼표지(post-column labeling)의 조건은, 반응시약으로서 1% 아르기닌/3% 붕산을 사용하고, 유속은 0.5 mL/분이고, 반응온도는 150℃이며, 검출파장은 EX320 nm 및 EM430 nm이다.
당 조성은, 많은 쪽부터 순서대로, 만노오스 47.7 ㎍/mg, 갈락토오스 32.43 ㎍/mg, 글루코오스 25.09 ㎍/mg, 아라비노오스 12.09 ㎍/mg, 리보오스 8.30 ㎍/mg, 크실로오스 3.75 ㎍/mg 및 람노오스 0.44 ㎍/mg이었다.
(4) 아미노산 조성 분석
봉입관에 D2 획분 1.0 mg과 6 mol/L 염산 0.1 mL를 넣고, 110℃에서 22시간가수분해한 후, 에바포레이터로 감압건고하여, 잔사를 얻었다. 잔사를 순수 1.0 mL에 용해하고, 그 50 μL를 아미노산분석에 사용했다. 장치는 히타치 L-8500형 아미노산분석계(히타치제작소)이고, 닌히드린발색에 의해 정량했다.
아미노산 조성은, 아스파라긴산 및 아스파라긴 14.12 mol%, 트레오닌 6.39 mol%, 세린 7.64 mol%, 글루타민산 및 글루타민 13.83 mol%, 글리신 14.03 mol%, 알라닌 7.77 mol%, 발린 5.36 mol%, 1/2-시스틴 0.87 mol%, 메티오닌 1.11 mol%, 이소류신 3.70 mol%, 류신 5.20 mol%, 티로신 1.51 mol%, 페닐알라닌 2.28 mol%, 리신 4.05 mol%, 히스티딘 1.67 mol%, 아르기닌 2.52 mol% 및 프롤린 7.93 mol%였다.
(5) 분자량 분포의 측정
D2 획분 1.0 mg을 순수 1.0 mL에 용해한 후, 0.22 ㎛의 필터로 여과하여, 여과액을 얻었다. 이 여과액을 컬럼 Asahipak GS-620 50 cm ×7.6 mm ID(아사히가세이), 시차굴절계 검출기 RID-6A(시마즈제작소) 및 자외부검출기 SPD-6A(시마즈제작소)를 장착한 고속액체 크로마토장치 LC-9A(시마즈제작소)에 어플라이했다. 컬럼온도는 실온이고, 이동상 및 그의 유속은 순수 및 0.5 mL/분이었다.
분자량 분포는, 약 4.5만~100만 사이에 폭 넓게 분포했다. 그 중에서 피크 톱이 5개 발견되고, 각각의 추정 분자량은 약 4.5만, 약 12만, 약 16만, 약 38만 및 100만 이상이었다.
(6) 등전점 분석
D2 획분 190 ㎍을 순수 20 μL에 용해한 후, 그 반량에 40%(체적/체적)정도의 수크로오스를 가하여, 전기영동을 실시했다. 전기영동의 조건은 아래와 같다.
겔: IEF-PAGE mini(4%, pH3~10; 테후코사)
영동용 완충액: (음극) 0.04 mol/L 수산화나트륨용액, (양극) 0.01 mol/L 인산용액
영동조건: 100 V에서 30분간 영동을 행하고, 계속해서, 300 V에서 20분간 영동을 행하고, 더욱이 500 V에서 40분간 영동을 행했다.
PI 마커: 각 밴드가 1.35 g(Pharmacia)
3개의 브로드 피크가 검출되었다. 메인 밴드는 4.8 부근(4.5~5.2)이고, 그 밖에 7.6 부근(7.35~8.0)과 9.2 부근(8.65~9.3)에 밴드가 있었다.
(7) 자외분광 분석(UV)
순수에 용해하여, 0.5 mg/10 mL 농도에서 측정했다. 장치로서, 2500 PC(시마즈제작소)를 사용했다. 240~260 nm에 피크가 발견되었다.
(8) 핵자기공명 분석(NMR)
측정조건은 아래와 같다.
(i)1H 일차원 NMR 측정
측정장치로서는, UNITY INOVA-500형(Varian사)을 사용했다. 용매로서 D화염산구아니디움(deuterated guanidine hydrochloride) D20 용액을 사용했다. 농도는 4 mol/L이고, 내부표준으로서 DSS를 사용하여, 온도는 23℃에서 측정을 실시했다.
얻어진 스펙트럼을 도 1에 나타낸다. 당의 1번 위치의 프로톤에 특징적인 4.5 ppm~5.0 ppm 부근에, 갈락토오스 또는 글루코오스의 α1번 위치로 생각되는 피크가 관측되었다. 또한, 5.0~5.2 ppm 부근에, 갈락토오스 또는 글루코오스의 β1번 위치로 생각되는 피크가 관측되었다.
(ii)13C 일차원 NMR 측정
관측주파수는 150.8 MHz에서 측정했다. 농도는 20.3 mg/0.75 mL이고, 내부표준은 중메탄올(deuterated methanol)(3% 중수용액(deuterated oxide solution), δ=49 ppm)이며, 온도는 45℃이고, 디커플링(decoupling)은1H 완전 디커플링인 조건으로 측정을 실시했다.
결과를 도 2에 나타낸다. 103~104 ppm 부근의 브로드한 피크는, 갈락토오스 또는 글루코오스의 1번 위치의 탄소로, β형으로 글루코시드결합한 것으로 생각된다. 102.96 ppm 및 102.51 ppm의 각 피크는, 각각 만노오스의 α1번 위치와 β1번 위치에서 글루코시드 결합한 것으로 생각된다. 99.17 ppm의 피크는, 갈락토오스 또는 글루코오스의 α1번 위치로, 역시 글루코시드 결합한 것으로 생각된다.
1번 위치 이외에 대해서는, 60~80 ppm의 피크의 화학시프트를 해석했다. 각 단당의 화학시프트를 비교하면, 갈락토오스 또는 글루코오스의 β2번 위치의 탄소, 또는, 만노오스의 2번 위치(α, β)의 탄소가 변화하고 있는 것으로 생각되었다. 또한, 갈락토오스 또는 글루코오스의 α형의 탄소에 대해서는, 화학시프트가 단당과 비교하여 변화하고 있는 것이 발견되지 않기 때문에, 6번 위치가 변화하여, 만노오스의 4번 위치의 시그날(67.8 ppm)과 겹쳐 있는 것으로 추정했다(이 피크의 강도가 큰 것으로부터 추정했다). 이상의 사실로부터, 1번 위치 이외에서 결합에 관여하고 있는 것으로 추정되는 당의 위치는, 갈락토오스 또는 글루코오스의 2번 위치(β형)와 6번 위치(α형), 또는 만노오스의 2번 위치(α, β형)이다. 단, 피크가 전반적으로 브로드하고, S/N도 나쁘기 때문에, 해석의 정도는 높지 않다.
(10) 원편광 이색성 분석(CD)
측정조건은 아래와 같다.
측정장치로서 JASCOJ-500A를 사용하고, 용매로서 물을 사용했다. 단백질농도는 0.125 mg/mL이고, 파장범위는 200~250 nm이며, 셀길이는 1 mm이고, 온도는 실온(24℃)이며, 적산회수는 8회인 조건에서 측정을 실시했다.
얻어진 CD 스펙트럼을 도 3에 나타낸다. CD값(세로축)은, 평균잔기 타원률(average of the residual ellipticity)[θ]로 나타냈다. [θ]의 단위는 deg ·㎠ ·decimol-1이 된다. [θ]로 환산할 때의 평균잔기 분자량은 103.45를 사용했다(아미노산분석으로부터 구했다). 2차구조의 해석은, Chen 등의 방법에 따라 산출한 바, α헤릭스 17%, β시트 18% 및 불규칙구조 65%였다.
흡착획분 D2의 생물활성 평가예
(1) 흡착획분 D2의 사르코마 180 종양 증식억제 활성
동물로서는, 일본크레아(주)로부터 구입한 자성 ICR 마우스를 사용하고, 종양으로서는, 구레하화학공업주식회사 생물의학연구소에서 자성 ICR 마우스의 복강내에서 계대유지하고 있는 사르코마 180 세포를 사용했다. 즉, 5주령의 자성 ICR 마우스의 겨드랑이부(axilla) 피하에, 사르코마 180 세포를 106개 이식했다(1군=10마리). 이식후 다음날부터, 상기 실시예 2에서 얻어진 흡착획분 D2의 소정량(1.0 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 50 mg/kg)을 격일로 10회, 복강내 투여하고, 이식후 25일째에 마우스를 도살하여 종양결절을 적출하여, 중량을 측정했다. 대조로서는 생리식염수 투여군을 설치했다.
증식억제율(단위=%)은, 식:
[증식억제율(%)]={(Wc-W)/Wc} ×100
[식중, W는 샘플 처치군의 평균결절중량(단위=g)이고, Wc는 생리식염수 처치군의 평균결절중량(단위=g)이다]
에 의해 산출했다.
결과를 표 4에 나타낸다. 또한, *는 대조군에 대해 p<0.05로 유의한 차가 있는 것을 나타낸다. 표 4로부터 명백한 바와 같이, D2 획분 투여에 의해 유의한 증식억제가 보였다.
표 4
(2) 흡착획분 D2의 사이토카인 유도활성
8주령의 자성 DBA/2 마우스를 도살후 탈혈하여, 장간막 림프절을 무균적으로꺼내, 행크스 평형염류용액을 넣은 무균 샬레로 옮겼다. 가위와 핀셋으로 림프절을 가늘게 찢은 후, 메쉬를 통해 림프구의 단세포액을 조제했다. 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간의 열처리 끝냄) 첨가 RPMI1640배지로 세포를 3회 세척한 후, 세포수를 2 ×106개/mL로 조정했다. 상기 실시예 2에서 얻어진 흡착획분 D2를 배지에 용해하고, 필터로 제균하여, 샘플용액 250 ㎍/mL를 조제했다. 96웰의 세포배양용 바닥이 평평한 마이크로플레이트(Falcon 3072; Becton Dickinson Labware, 미국)에, 상기 세포 및 샘플을 0.1 mL씩 가하여, 37℃의 5% 탄산가스 배양기중에서 18시간 배양한 후, 원심분리에 의해, 상청을 분리했다. 그리고, 배양상청중의 총(total) 인터루킨 12 함량을, 시판 측정키트(Intertest 12X; Genzyme사, 미국)를 사용하여 측정했다. 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5로부터 명백한 바와 같이, D2 획분에는, 인터루킨 12 유도활성이 인정되었다.
표 5
(3) 흡착획분 D2의 면역억제물질 TGF-β결합 활성
단백질흡착이 적은 폴리프로필렌튜브(멀티실리코나이즈튜브, Safe Seal Microcentrifuge Tube; 후나코시)중에서, 인간 유전자 재조합 트랜스포밍 증식인자β1, [Transforming Growth Factor-β1, (이하, TGF-β1); 후나코시] 표품을 2% 알부민 함유 인산완충액(pH 7.2)에 용해하고, 100 ng/mL 용액으로 조정했다. 한편, 상기 실시예 2에서 얻어진 흡착획분 D2를 2% 알부민 함유 인산완충액에 용해시켜, 2 mg/mL 농도로 조정했다. 상기 TGF-β1용액과 D2 획분용액을 0.5 mL씩, 단백질흡착이 적은 튜브에 넣고, 22℃에서 3시간 반응시켰다. 반응종료 후, 반응액중의 TGF-β1함량을, 시판의 측정키트(Quantikine Human TGF-β1ELISA Kit; 후나코시)를 사용하여 측정했다.
결합률(단위=%)은, 식:
[결합률(%)]={(Tc-T)/Tc} ×100
[식중, T는 D2 획분 첨가군의 TGF-β1실측값(단위=ng/mL)이고, Tc는 2% 알부민 함유 인산완충액 첨가군의 TGF-β1실측값(단위=ng/mL)이다]
에 의해 산출했다.
결과를 표 6에 나타낸다. D2 획분 첨가군에서는, D2 획분 TGF-β1과의 결합이 인정되었다.
표 6
(4) 흡착획분 D2의 활성산소 포착활성
3.0 mol/L 하이포크산틴용액 1000 μL, 2 U/mL 크산틴옥시다아제(베링거만하임) 용액 5 μL, 8 mg/mL-D2 획분 500 μL 및 RPMI1640배지 495 μL를 시험관에 넣은 후, 270 μmol/L의 2-메틸-6-페닐-3,7-디히드로이미다조-[1,2-α] 피라진-3-온(CLA-phenyl; 동경화성) 용액 120 μL를 첨가했다. 계속해서, 반응조를 37℃로 유지한 케미루미네선스 미터(Chemiluminescence meter)(알로카)에 넣고, 30분간 반응시켜, 발생하는 케미루미네선스량을 경시적으로 측정했다.
포착활성(단위=%)은, 식:
[포착활성(%)]={(Cc-C)/Cc} ×100
[식중, C는 D2 획분 첨가군의 케미루미네선스량이고, Cc는 인산완충액 첨가군(대조군)의 케미루미네선스량이다]
에 의해 산출했다. 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7로부터 명백한 바와 같이, D2 획분에 활성산소 포착활성이 인정되었다.
표 7
(5) 흡착획분 D2의 항종양활성
구레하화학공업주식회사 생물의학연구소에 있어서 50 mL용의 세포배양용 플라스크(3014; Becton-Dickinson사)속에서 계대유지하고 있는 스위스 알비노(Swiss albino) 3T3주 및 SV40 형질전환 3T3 세포주[다이닛폰세이야쿠가부시키가이샤 라보라토리 프로덕트부(오사카)로부터 입수]를, 0.125% 트립신용액(시그마사)으로 수분간 처리함으로써 플라스크기벽으로부터 유리시켰다. 세척후, 10% 소태아혈청(56℃에서 30분간 처리한 것) 함유 DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)배지에 현탁하여, 2 ×103개/mL로 조정한 후, 0.1 mL씩 96웰의 세포배양용 바닥이 평평한 마이크로테스트플레이트(3072; Becton-Dickinson사)의 각 웰에 분주했다.
37℃의 5% 탄산가스 배양용기내에서 24시간 배양한 후, 상기 실시예 2에서 얻어진 흡착획분 D2의 소정량 또는 배지 0.1 mL를 가하고, 더욱이 24시간 배양했다. 또한, 배양종료 6시간 전에,3H-티미딘(Amersham International plc) 1 μCi/웰을 첨가했다. 배양종료 후, 세포를 여과지상에 회수하여, 5% 삼염화초산(trichloroacetic acid)으로 충분히 세척한 후, 건조시켜, 세포에 삽입된 방사능을 액체 신틸레이션 카운터로 측정했다. 흡착획분 D2의 50% 저지농도(LD50)는, SV40 형질전환 3T3 세포주에서 약 50 ㎍/mL이고, 스위스 알비노 3T3주에서 약 40 ㎍/mL였다. 또, MTT법에 의해 LD50을 측정한 바,3H-티미딘법에 의해 얻어진 상기 결과와 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 3: 송이버섯 알칼리용액 추출액 및 그의 음이온 교환수지 흡착획분의 조제
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 조제한 송이버섯 CM627-1주 균사체 배양물을, 호모게나이저에 건 후, 전체 농도가 0.1 mol/L가 될 때 까지 수산화나트륨용액을 첨가했다. 교반기 교반하, 22℃에서 1시간 추출했다. 추출 종료후, 원심분리(12000 rpm, 20분간, 4℃)에 의해, 상청을 얻었다.
침전부에 0.3 mol/L 수산화나트륨용액을 가하고, 상기와 동일한 처리를 행하여, 상청을 얻었다. 더욱이, 침전부에 0.5 mol/L 수산화나트륨용액을 가하고, 상기와 동일한 처리를 행하여, 상청을 얻었다. 모든 상청을 합쳐, 상기 상청에 1 mol/L 염산을 가하여, pH를 7.0으로 조정한 후, 투석막(Spectra/Por3 Membrane, 분자량 3500 분획)에 넣고, 수돗물의 유수속에서 3일간 투석했다. 투석막내액을 로터리 에바포레이터로 농축한 후, 동결건조를 행하여, 분말(이하, 획분 A라고 칭한다) 4.3 g을 얻었다.
이어서, 상기 분말(획분 A)을 50 mmol/L 트리스염산완충액(pH 7.0)에 용해하여, 미리 상기 완충액으로 평형화시켜 둔 디에틸아미노에틸(DEAE)셀룰로오스컬럼(구경=2 cm, 높이=20 cm)에 어플라이하고, 이어서 상기 완충액 100 mL를 흘려, 비흡착획분 A1(이하, 간단히 「A1 획분」이라고 칭하는 경우가 있다)을 얻었다. 이어서, 상기 완충액에 1 mol/L 염화나트륨을 가한 용액 200 mL를 조제하여, 상기 컬럼에 걸어, 흡착물을 용출하고, 흡착획분 A2(이하, 간단히 「A2 획분」이라고 칭하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 비흡착획분 및 흡착획분용액을 각각, 투석막(Spectra/Por3 Membrane, 분자량 3500 분획)에 넣어, 순수중에서 3일간 투석했다. 투석막내액을 로터리 에바포레이터로 농축한 후, 동결건조를 행하여, 비흡착획분 A1 분말 및 흡착획분 A2 분말을 얻었다.
획분 A의 생물활성 평가예
상기 「버섯 열수추출액의 생물활성시험」(2)와 동일한 방법에 의해 T세포 증강활성을 평가한 바, 획분 A 투여군(투여량=250 mg/kg)의 활성은, 혼합림프구 ·종양세포 반응에 있어서 130%(대조군에 대한 %)이고, 림프구 ·종양세포 혼합배양에 의한 세포상해활성 유도반응에 있어서 131%(대조군에 대한 %)였다.
또한, 상기 「흡착획분 D2의 생물활성 평가예」(2)와 동일한 방법에 의해 사이토카인 유도활성을 평가한 바, 배지대조군의 총 인터루킨 12 함량이 검출한계 이하였던 것에 대해, 획분 A 첨가군의 총 인터루킨 12 함량은 69 pg/mL였다.
더욱이, 상기 「흡착획분 D2의 생물활성 평가예」(3)과 동일한 방법에 의해 TGF-β결합활성을 평가한 바, 획분 A의 결합활성은 26%였다.
산업상이용가능성
본 발명의 면역증강 조성물에 의하면, 면역능을 증강할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정 태양에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (25)

  1. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분.
  2. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 면역증강 조성물.
  3. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는, 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분과 함께 함유하는, 면역증강 기능성 식품.
  4. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 면역증강이 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 면역을 증강하는 방법.
  5. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 면역증강 조성물 또는 면역증강 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
  6. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 킬러활성 유도 조성물.
  7. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는, 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분과 함께 함유하는, 킬러활성 유도 기능성 식품.
  8. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 킬러활성 유도가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 킬러활성을 유도하는 방법.
  9. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 킬러활성 유도 조성물 또는 킬러활성 유도 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
  10. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 종양증식억제 조성물.
  11. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는, 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분과 함께 함유하는, 종양증식억제 기능성 식품.
  12. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 종양증식억제가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 종양증식을 억제하는 방법.
  13. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 종양증식억제 조성물 또는 종양증식억제 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
  14. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 인터루킨 12 유도 조성물.
  15. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분을 함께 함유하는, 인터루킨 12 유도 기능성 식품.
  16. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 인터루킨 12 유도가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인터루킨 12를 유도하는 방법.
  17. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 인터루킨 12 유도 조성물 또는 인터루킨 12 유도 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
  18. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, TGF-β활성억제 조성물.
  19. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분과 함께 함유하는, TGF-β활성억제 기능성 식품.
  20. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, TGF-β활성억제가 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, TGF-β활성을 억제하는 방법.
  21. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, TGF-β활성억제 조성물 또는 TGF-β활성억제 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
  22. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분과, 약제학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는, 활성산소 포착 조성물.
  23. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 그 단독으로, 또는, 목적에 따라 1 또는 그 이상의 식품성분을 함께 함유하는, 활성산소 포착 기능성 식품.
  24. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분을, 활성산소 포착이 필요한 대상에, 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 활성산소를 포착하는 방법.
  25. 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액, 또는, 송이버섯 열수추출액 또는 송이버섯 알칼리용액 추출액의 음이온 교환수지 흡착획분의, 활성산소 포착 조성물 또는 활성산소 포착 기능성 식품을 제조하기 위한 사용.
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