KR20020065494A - Ｌ-피페콜린산의 생물학적인 제조방법 - Google Patents

Abstract

피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 이용하여 델타-1-피페리딘-6-카르본산의 환원을 행하는 공정을 포함하여 이루어지는 L-피페콜린산의 제조방법. 이 제조에 이용되는 핵치환 세균도 제공된다. L-피페콜린산(또는 2-피페리신 카르본산)의 효율 좋은 생물학적인 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

Ｌ-피페콜린산의 생물학적인 제조방법{PROCESS FOR THE BIOLOGICAL PRODUCTION OF L-PIPECOLIC ACID}

L-피페콜린산은 의약품의 합성원료로서 중요하다. 현재, L-피페콜린산은 L-리신(lysine)으로부터의 합성법(J. Chem. Soc. Chem. Commun.1985년, 633∼635페이지) 또는, 피콜린산으로부터의 합성법에 의해 만들어진 DL-피페콜린산의 광학분할에 의해 제조되고 있다(Method of Enzymol. 17B, 174∼188페이지, 1971년). 광학분할의 방법으로서는, D-주석산을 이용하는 디아스테레오머염법과 돼지의 간장 유래의 D-아미노산 옥시다아제에 의해 D체를 분해하여 L체를 남기는 효소법이 알려져 있다.

한편, L-피페콜린산은 동물(J. Biol. Chem., 211권, 851페이지, 1954년)이나 식물(J. Amer. Chem. Soc. 74권, 2949페이지, 1952년), 미생물(Biochemistry, 1권, 606∼612페이지, 1962년;특개평6-38781호)에서 생성된다는 것으로 알려져 있으나, 축적량이 적기 때문에 이들 생물을 이용하는 L-피페콜린산의 생산방법은 실용화되기에는 미흡하다. 지금까지의 L-리신의 대사연구에서, L-리신으로부터 리신-6-아미노트랜스퍼라아제(이하, LAT라고도 한다)에 의한 아미노기 전이반응(Biochemistry, 7권, 4102∼4109페이지, 1968년)을 개재하거나, 혹은 L-리신-6-데히드로게나아제 J.Biochem. 105권, 1002∼1008페이지, 1989년)에 의해 델타-1-피페리신-6-카르본산 (이하, P6C라고도 한다)이 발생하는 것으로 알려져 있다.

P6C는 산화백금을 이용한 수소첨가에 의해 화학적으로 L-피페콜린산으로 변환할 수 있다는 것이 보고되어 있으나(Biochemistry, 7권, 4102∼4109페이지, 1968년), P6C의 생물학적 내지 효소적 환원에 의한 L-피페콜린산의 생성에 대해서는 보고되어 있지 않다. 또, 슈드모나스·푸티다(Pseudomonas putida)가 D-리신으로부터 델타-1-피페리신-2-카르본산을 경유하여 L-피페콜린산을 생성하는 것의 대사경로가 추정되어 있다(J. Bacteriology, 149권, 864∼871페이지, 1982년). 이와 같은 생물학적인 경로도 L-피페콜린산의 대량생산에는 이용이 곤란하다.

상기한 화학합성법으로써 제조한 DL-피페콜린산을 광학분할 하는 방법에서는, 사용하는 광학분할제가 고가이면서 조작이 복잡하고, 또 광학분할에 효소를 이용하는 방법은 정제한 효소를 사용하기 때문에 역시 고가이며, 어느 것도 이들 결점 때문에 공업적 제법으로서는 효율적이지 않고 L-피페콜린산을 저가로 제조할 수 없다.

또, 종래의 미생물을 이용하여 L-피페콜린산을 제조하는 방법은 축적량이 낮기 때문에 실용화되어 있지 않다.

본 발명은, L-피페콜린산(또는 2-피페리신 카르본산 또는 L-호모 프롤린)의 생물학적인 제조방법 및 이 제조방법에 적절하게 이용할 수 있는 조환 대장균 또는 코리네형(coryneform) 세균에 관한 것이다.

도 1은 대장균중에서 L-리신으로부터 L-피페콜린산을 생산하기 위한 본 발명에 관련하는 플라스미드의 개략도이다.

도 2는 코리네형 세균 중에서 L-피페콜린산을 생산하기 위한 본 발명에 관련하는 플라스미드의 개략도이다.

본 발명자들은 이번에, 하기와 같이 델타-1-피롤린-5-카르본산을 L-프롤린

으로 환원하는 피롤린-5-카르본산 리닥타아제[EC 1. 5. 1. 2]가, 하기와 같이 P6C도 대응하는 L-피페콜린산까지 효율 좋게 환원할 수 있다는 것을 발견하였다.

또, 이와 같은 환원계는, 다른 생물학적인 P6C의 생산계와 적절하게 조합하여 사용할 수 있다는 사실도 알아냈다.

본 발명은, 이들의 지식과 견문을 바탕으로 하여, 피롤린-5-카르본산 리닥타아제의 작용을 이용함으로써, 효율 좋게 L-피페콜린산을 제조하기 위한 수단을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명은, 피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 이용하여 델타-1-피페리신-6-카르본산(P6C)의 환원을 행하는 공정을 포함하여 이루어지는 L-피페콜린산의제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, P6C의 환원공정이, 리신-6-아미노 트랜스퍼라아제(LAT)를 이용하는 L-리신으로부터 P6C로의 변환공정과 조합된다.

또, 본 발명은, LAT를 코드하는 유전자를 발현할 수 있는 형태로 포함하여 이루어지는 조환 대장균 또는 코리네형 세균에도 관한 것이다.

또한, 본 발명에 있어서,「외래의…유전자」라고 하는 경우는, 언급되어 있는 세포 또는 미생물에 대해 이종 또는 동종인지를 불문하고, 언급되어 있는 세포 그 자체와는 다른 세포에서 유래하는 유전자를 의미한다.

본 발명에서 말하는, 피롤린-5-카르본산 리닥타아제(EC 1. 5. 1. 2;이하, P5C리닥타아제라고도 한다)는, 통상, 아르기닌, 글루타민산으로부터 프롤린을 합성하는 대사경로에 관여하는 효소로서 알려져 있으며, 환원형 니코틴-아미드-아데닌-디누클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴-아미드-아데닌-디누클레오티드-인산 (NADPH)의 도움으로, 상기와 같이, 델타-1-피롤린-5-카르본산을 프롤린으로 환원하는 활성을 갖는다. P5C리닥타아제는, 넓게는 각종 세균, 식물이나 동물에 분포하는 것이 알려져 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 P5C리닥타아제는, P6C를 L-피페콜린산으로 환원하는 활성을 갖는 것이면 기원에 의해 한정되는 것은 아니다. P5C리닥타아제는, 정제된 것 및 세포의 용해물과 같은 조제물, 및 살아있는 세포로부터 선택되는 어느 한 형태로 존재하는 것이라도 좋다. 또한, 조제물을 이용할 경우, 본 발명에 따른 환원을 행하기 위해서는, 경우에 따라, NADH 또는 NADPH를 공존시킬 필요가 있을것이다.

그런데, 본 발명에 따라, P5C리닥타아제를 이용하여 환원해야 하는 델타-1-피페리신-6-카르본산(P6C)은, L-리신으로부터 리신-6-아미노 트랜스퍼라아제(LAT)의 작용에 의해 생성하는 2-아미노 아디핀산6-세미알데히드가 비효소적으로 탈수폐환된 형태에 상당하는 것이다. 통상, 이 세미알데히드는, 수용액중에서 P6C와 평형혼합물과 존재하는 것으로 보여지고 있으므로, 본 발명의 반응계에 있어서는, P6C와 이 세미알데히드는 등가의 것이라고 이해되어 있다. 따라서, 본 발명의 반응계에는, P6C를 P6C 그 자체, 또는 P6C와 이 세미알데히드의 혼합물, 또는 이 세미알데히드 그 자체를 첨가할 수 있으며, 이와같은 모든 실시예도 본 발명에 포함된다.

P6C(또는 2-아미노아디핀산6-세미알데히드)는, 화학 합성적 및 생물학적을 비롯한 어떠한 수단에 의해 제조된 것도 사용할 수 있지만, 특정의 광학이성체인 L-피페콜린산을 경제적으로 제조한다는 관점에 서면, L-피페콜린산에 대응하는 입체배치(구체적으로는 2위에 존재하는 부제(不齊)탄소에 있는)를 지니는 P6C를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 P6C의 환원을 행하는 공정은, 통상의 효소반응이 진행되는 조건하에서 P6C에 P5C리닥타아제를 작용시킴으로써 실시한다. 상술한 바와 같이, P5C리닥타아제는, 정제된 것 및 세포의 용해물과 같은 조제물, 및 살아있는 세포 중 어느 형태라도 P6C에 작용시킬 수 있다. 그러나, 이 효소반응에, 예를들면 NADH 또는 NADPH와 같은 조효소(coenzyme)가 관여하는 것을 고려하면, 세포의 용해물 또는 살아있는 세포 그 자체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 세포로서는, P6C를L-피페콜린산으로 변환(즉, 환원)하는 능력을 지니는 P5C리닥타아제 활성을 나타내는 미생물 중에서, 특히 대장균 또는 코리네형 세균이 바람직하게 사용될 수 있다. 대장균에는, P5C리닥타아제를 코드하는 유전자 proC가 존재한다는 것이 알려져 있으며, 그밖에도 proC의 배열과 그 발현에 대해서도 보고되어 있다(A. H. Deutch et al., Nucleic Acids Research, vol. 10, 1982, 7701∼7714참조).

따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, P5C리닥타아제 활성을 갖는 대장균 또는 상기 유전자 proC를 발현할 수 있는 상태로 포함하는 대장균 또는 그 밖의 미생물과 P6C를, 이들 미생물이 생존하고, P5C리닥타아제 활성을 발생시키는 조건하에서 인큐베이트(incubate)함으로써 P6C를 L-피페콜린산으로 환원할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 특정의 유전자를 발현할 수 있는 상태로 포함한다 또는 조합한다는 것은, 해당 유전자가 숙주세포의 염색체 중에, 필요에 의해 프로모터, 레귤레이터 등을 수반한 상태로 조합되거나, 또는 발현벡터에 해당 유전자가 적당한 프로모터 등을 수반하여 조합된 상태로, 숙주세포 중에 포함되는 것을 의미한다. 상기의 P5C리닥타아제 활성을 발생시키는 조건이란, 각각의 미생물이 생존할 수 있는 조건에 있어서, 바람직하게는, 증식할 수 있는 배양조건 하에 있는 것을 말한다. 이들 조건은 당업자에게 주지한 것으로, 또, 당업자라면, 후술할 실시예를 참조로 쉽게 설정할 수 있을 것이다.

P6C는, 상기 미생물의 현탁액 또는 배양물에 직접 첨가하여 목적의 반응을 행할 수 있지만, 본 발명에 의하면, 리신-6-아미노 트랜스퍼라아제(LAT)를 이용하여, 입수 용이한 L-리신으로부터 P6C로의 변환공정을 상기 P5C리닥타아제를 이용하는 환원공정과 조합함으로써, P6C를 환원공정에 공급하는 것이 바람직하다. 이러한 조합에 있어서, P5C리닥타아제원으로서 대장균을 이용할 경우, 통상, 대장균에는 L-리신으로부터 P6C로의 변환과정을 촉매하는 효소계가 존재하지 않거나, 존재한다 해도 매우 활성이 낮으므로 이종세포 유래의 LAT 효소계를 해당 대장균의 효소계와 조합시킬 필요가 있다. 이러한 조합에 사용할 수 있는 LAT는, L-리신을 P6C로 환원하는 활성을 갖는 것이라면 기원에 의해 한정되는 것은 아니지만, 플라보박테리움·루테센스(Flavobacterium lutescens)유래의 LAT를, 바람직한 것으로 들 수 있다. 이 미생물의 전형적인 것, 예를들면 IFO 3084주는, 통상, L-리신의 바이오어세이(bioassay)에 이용되고 있으며, LAT활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Soda et al. Biochemistry 7(1968), 4102-4109, 동일 4110-4119). 또한, 일정한 F.lutescens는, 그것이 갖는 델타-1-피페리신-6-카르본산 데히드로게나아제의 작용에 의해 P6C를 α-아미노아디핀산까지 산화하는 능력을 지닌다(Biochem J.(1977), 327,59-64). 또, P5C리닥타아제 또는 P6C리닥타아제 활성에 의해 P6C로부터 생성된 L-피페콜린산은, 다음 대사경로에서 다른 화합물로 변환될 가능성이 있다. 따라서, 통상, 이 세균의 효소계를 이용하면 L-리신으로부터 L-피페콜린산까지의 변환이 불가능하거나, 변환이 일어난다 해도 L-피페콜린산이 축적되지 않는 경우가 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는, 상기와 같은, 이종세포(또는 미생물)간의 효소계를 조합시키는 것이 바람직하다. 이러한 효소계의 조합된 미생물로서는, 한정되는 것은 아니지만, 상술한 대장균에, 예를들면 F.lutescens의 LAT를 코드(code)하는 lat유전자를 발현할 수 있는 상태로 조합한것, 역으로, 대장균의 proC유전자를 F.lutescens에 조합한 것, 또한, 다른 발명의 목적 상, 적절하게 사용할 수 있는 숙주미생물에 해당 lat 및 proC를 함께 발현할 수 있는 상태로 조합한 것을 들 수 있다. 숙주로의 각 유전자의 조합은, 조환 플라스미드를 개재하여 도입하거나, 또는 숙주의 염색체 상에 직접 발현할 수 있는 상태로 조합해도 좋다. 또, F.lutescens를 숙주로 할 경우, 해당 미생물은 생산된 L-피페콜린산을 다음 대사경로에서 대사할 가능성이 있으므로, 필요에 따라, 이러한 대사경로를 블록시킨 변이주를 사용할 필요가 있을 것이다. 본 발명에 따라서, L-리신으로부터 L-피페콜린산까지의 변환을 행하기에 적합한 효소계는, 계의 안정성, 처리의 용이함, 변환효율이 높다는 점 등으로부터, 숙주로서 대장균(경우에 따라 proC의 공급원으로도 된다)을 사용하고, 이에 적어도 F.lutescens의 lat를 조합하여 구축하는 것이 적절하게 사용될 수 있다. 또 숙주로서 대장균을 사용할 경우에는, lat유전자 외에, 외래의 proC유전자를 조합해도 좋지만, 특히, 출발원료인 L-리신의 균체 내로의 수취를 용이하게 하기 위해, 외래 대장균의 리신 특이적 수취(또는 투과)효소를 코드하는 유전자(리신 수취에 관여하는 유전자라고도 한다)를 조합하는 것이 바람직하다. 이와 같은 유전자의 대표적인 것으로서는, 한정되는 것은 아니지만, 리신 특이적 퍼미아제를 코드하는 유전자(lysP)나 리신, 아르기닌 및 오르니틴의 수취에 관여하는 LAO 시스템을 구성하는 단백질을 코드하는 유전자(argT, hisP 및 hisQ)를 들 수 있다. 예를들면, J. Bacteriol., vol. 174, 3242-3249, 1992에 의하면, 유전자 lysP를 멀티 복제 플라스미드로 도입한 대장균은 리신의 수취속도가 20배로도 상승한다는 것이 시사되어 있다.

이상과 같은 본 발명에서 사용할 수 있는 효소계 또는 유전자의 조합된 계는, 그 자체가 당업자에게 통용되고 있는 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 미생물학, 조환DNA에 관한 기법에 따라 구축 내지는 작성할 수 있다. 이러한 기법은, 예를들면 Molecular cloning A Laboratary Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratary Press:1989):DNA Cloning, Volumes Ⅰ and Ⅱ(D. N. Glover ed., 1985); 01igonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed., 1984):Mullis et al. 미국특허 제 4,683,195호, Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins. 1984)를 참조할 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서, 특히 바람직하게 이용할 수 있는 효소계 또는 미생물의 구축 내지는 작성에 대해서, 숙주로서 대장균(이하, E. coli라고 간략하게 기재한다)을 이용할 경우에 대해서, 이하, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

숙주·벡터계:

각각 시판되고 있는 것을 적절하게 사용할 수 있지만, 여기서는, 숙주로서, 대장균BL21(DE3), 대장균BL21 또는 대장균C600주를, 그리고 벡터로서 pET계 또는 pUC계를 사용하는 예를 든다. 그 밖의 벡터로서는, 통상산업생(通商産業省) 「조환DNA 기술공업화 지침」지침 제 二장 제 三2. (2)에 해당하는 벡터가 바람직하게 사용될 수 있다.

lat유전자의 클로닝 및 발현:

플라보박테리움·루테센스(F.lutescens) IFO 3084주의 배양 상청으로부터 소수(疎水) 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마터그래피에 의해 LAT를 정제하였다. LAT의 효소활성의 측정은 오르토 아미노벤즈 알데히드를 이용하는 발색법(Biochemistry, 7권, 4102∼4109페이지, 1968년)으로써 행하였다. 정제한 LAT의 N말을 KLLAPLAPLRAHAGTRLTQGL로 결정하고, 이 아미노산 배열에 의거하여 믹스프라이머를 설계하고 플라보박테리움·루테센스IFO 3084주의 게놈DNA로부터의 PCR반응에 의한 lat의 DNA단편의 증폭을 행하고, 또한 얻어진 DNA단편을 이용하여 역PCR법에 의해 약 1.6kbp로 이루어지는 lat유전자 전체를 취득하였다. lat의 DNA배열 및 LAT의 아미노산 배열을 배열번호 1로 나타낸다. 또한, 필요가 있다면, lat유전자의 클로닝의 상세한 것에 대해서는, 본원과 동시 계속중인 국제출원 PCT/J99/04197을 참조할 수 있다.

이렇게 해서 결정된 lat유전자의 염기배열로부터 lat유전자의 N말단 ATG 부근을 NdeⅠ사이트로 바꾼 Forward DNA primer

ETlaNdeF:TCCATATGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGCCC(배열번호:2)

및 종지 코돈(codone) 하류를 BamHI로 바꾼 Reverse DNA primer

ETlaBamR:GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG(배열번호:3)

을 작성하고, 이를 이용하여 PCR반응을 행하고 lat유전자영역 약 1.6kbp를 증폭시켰다. 이 증폭단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHI로 소화한 것을 인서트DNA용액으로 하였다. 한편, 발현 벡터 pET11a(Novagen제)를 제한효소 NdeⅠ과 BamHI로 소화하고, 이와 인서트DNA용액을 Ligation Kit version2(TaKaRa제)를 이용하여 연결반응한 플라스미드를 pETlat로 하였다. pETlat는 생래의 LAT 단백질이 발현되도록설계한 플라스미드이다. 이 플라스미드로 E. coli BL21(DE3)을 형질전환한 주(株)를 E. coli BL21(DE3)pETlat주로 하였다.

발현 벡터 pET11a 대신에 pUC19를, 그리고 숙주E. coli BL21주를 이용할 경우에는, 상기 lat 유전자의 염기배열로부터 lat 유전자의 N말단 ATG 부근을 HindⅢ사이트로 바꾼 Forward DNA primer

lathiF19:ATAAGCTTGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGC (배열번호:4)

및 종시코돈 하류를 BamHⅠ으로 바꾼 Reverse DNA Primer

ETlaBamR:GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG (배열번호:3)

을 작성하고, 이를 이용하여 PCR반응을 행하고 lat유전자 영역 약 1.6kbp를 증폭시켰다. 이 증폭 단편을 제한 효소 HindⅢ과 BamHI으로 소화한 것을 인서트 DNA용액으로 하였다. 한편, 벡터pUC19를 제한효소 HindⅢ과 BamHⅠ으로 소화하고, 이와 인서트 DNA용액을 Ligation Kit version 2(TaKaRa제)을 이용하여 연결반응한 플라스미드를 pUClat(도 1참조)로 하였다. pUClat는 LacZ-LAT융합 단백질이 발현되도록 설계한 플라스미드이다. 이 플라스미드로 E. coli BL21을 형질전환한 주를 E. coli BL21pUClat주로 하였다.

E. coil BL21(DE3)pETlat주 및 E. coli BL21pUClat를, 각각 L-리신을 첨가한 배지(Bacto tryptone 1.5%, 효모 엑기스 3.0%, 글리세린 0.5%, pH7)에서 배양한 결과, 각각 배지중에 L-피페콜린산이 축적된 것을 확인할 수 있었다. 이것은 L-리신으로부터 LAT아미노기 전이반응에 의해 생긴 P6C를 환원하는 효소가 숙주인 대장균에 존재하고 있는 것을 의미하고 있다.

이 P6C환원효소의 탐색을 행하였다. 대장균의 전체 게놈의 유전자 정보로부터 P5C환원효소가 P6C도 환원하고 있다고 추측하여, proC결손주인 proC32변이주의 E. coli RK4904주(Yale University의 E. coli Genetic Stock Center로부터 취득)를 이용하여 L-피페콜린산 생산에 있어서의 proC의 역할의 검토를 행하였다. 먼저 proC(배열번호:5참조)의 효과를 조사하기 위해 pUClat에 proC를 도입하는 것을 시도해 보았다. 말단에 KpnⅠ사이트를 부착시킨, proC를 포함하는 약 1.5Kbp를 증폭시키는 DNA primer

procKpnF:AGGGTACCATAAAATCGCGCATCGTCAGGC (배열번호:6)

procKpnR:CCGGTACCGCCACAGGTAACTTTACGGATT (배열번호:7)

을 작성하고, 이를 이용하여 PCR반응을 행하였다. 이 증폭단편 약 1.5Kbp를 제한효소 KpnⅠ으로 소화한 것을 인서트 DNA용액으로 하였다. 한편, pUClat제한효소 KpnⅠ으로 소화하고, 이와 인서트 DNA용액을 Ligation Kit version 2(TaKaRa사)를 이용하여 연결반응하였다. lat와 proC가 서로 순방향으로 연결된 플라스미드를 pUClatproC로 하였다.

이 플라스미드로 E. coli RK4904를 형질전환한 주를 E. coli RK4904pUClatproC주로 하였다. 또한 proC만 놓인 플라스미드를 작성하였다. 즉, pUClatproC를 제한효소BamHI와 HindⅢ로 소화하고, 이를 Blunting Kit(TaKaRa제)를 이용하여 평활화 한 후, 자기 연결반응한 플라스미드를 pUCproC로 하였다. 이 플라스미드로 E. coli RK4904를 형질전환한 주를 E. coli RK4904pUCpro주로 하였다. 이렇게 해서 구축한 E. coli RK4904pUC19주, E. coli RK4904pUClat주, E. coliRK4904pUCproC주, 및 E. coli RK4904pUClatproC주를 이용하여 L-피페콜린산의 생산시험을 행한 결과, E. coli RK4904pUClatproC에 있어서만 L-피페콜린산의 축적이 보여지고, 다른 주에서는 L-피페콜린산의 생산은 보여지지 않았다.

이 결과는 lat과 proC 양자가 E. coli 내에서 발현했을 때 비로서 L-피페콜리산이 생산되는 것, 또한, proC가 코드되어 있는 단백질인 P5C리닥타아제가 P6C도 환원하고 있는 것을 나타내고 있다. 본 발명자들이 아는 한도에서는, 지금까지 P6C를 환원하는 효소는 문헌에 기재되어 있지 않으며, 본 명세서에 의해 최초로 개시된다.

lysP유전자의 클로닝 및 lat유전자의 동시 조합:

상술한 J. Bacteriol., vol. 174, 3242-3249, 1992에 의하면, 리신의 대장균 내부로의 수취속도가 대장균에 의한 L-피페콜린산의 생산에서 생산속도가 율속(律速)으로 되어 있을 가능성이 있다. 따라서, 이하, 리신 특이적 퍼미아제를 코드하는 유전자lysP를 플라스미드 pETlat로 도입하는 것을 시도해 보았다. 대장균의 lysP의 유전자 배열정보(배열번호:8참조)로부터 말단에 BglⅡ, BamHI사이트를 부착시킨, lysP를 포함하는 약 2.2Kbp를 증폭시키는 DNA primer

lysPBgBmF:TGAGATCTGGATCCTGCGTGAACGCGGTTC (배열번호:9)

lysPBgBmR:GCAGATCTGGATCCCAGAAAGCCGGAACAG (배열번호:10)

를 작성하고, 이들을 이용하여 lysP를 클로닝하기 위해 PCR반응을 행하였다. 이 증폭단편 약 2.2Kbp를 제한효소 BglⅡ로 소화한 것을 인서트 DNA용액으로 하였다. 한편, pETlat를 제한효소 BglⅡ로 소화하고, 이와 인서트 DNA용액을 LigationKit version 2(TaKaRa사)를 이용하여 연결반응하였다. 이렇게하여 구축된 lat와 lysP가 서로 역방향으로 연결된 플라스미드를 pETlatlysP로 하고, 이 플라스미드로 E. coli BL21(DE3)을 형질전환한 주를 E. coli BL21(DE3)pETlatlysP주로 하였다. 이 E. coli BL21(DE3)pETlatlysP주와, 다른 한편, 앞서 작성한 pETlat로 형질전환한 E. coli BL21(DE3)pETlat주로 L-피페콜린산의 생산시험을 행한 결과, E. coli BL21(DE3)pETlatlysP주는 E. coli BL21(DE3)pETlat주 보다도 L-피페콜린산을 3배 많게 생산하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 증폭단편 약 2.2Kbp를 제한효소BamHI로 소화한 것을 인서트 DNA용액으로 하였다. 한편, pUClat를 제한효소BamHI로 소화하고, 이와 인서트 DNA용액을 Ligation Kit version 2(TaKaRa사)를 이용하여 연결반응하였다. 이렇게 해서 구축된 lat와 lysP가 서로 순방향으로 연결된 플라스미드를 pUClatlysP(도 1참조)로 하고, 이 플라스미드로 E. coli BL21을 형질전환한 주를 E. coli BL21pUClatlysP주로 하였다. 이 E. coli BL21pUClatlysP주와 E. coli BL21pUClat주로 피페콜린산의 생산시험을 행한 결과, E. coli BL21pUClatlysP주는 E. coli BL21pUClat주보다도 L-피페콜린산을 3배 많게 생산하는 것을 확인할 수 있다. 이렇게 해서, 숙주에 대장균을 이용할 경우에는, lysP유전자를 증강하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르는, E. coli BL21pUClatlysP주는, 1999년 12월 20일자로 일본국 이바라키(茨城)현 츠쿠바시 히가시 1쪼메(丁目) 1반(番) 3고(號)의 통상산업생 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되고, FERM P-17681로 수탁되고, 그 후, 소위 부다페스트조약의 규정 하에 해당 연구소의 국제기탁 당국으로 상기 기탁이 이관되어, FERM BP-7326로 수탁되어 있다.

yeiE유전자의 도입:

BL21pUClatlysP주의 L-피페콜린산 생산능력을 향상시키기 위하여, 또한 lysP활성을 높이는 것을 시도해 보았다. E. coli의 게놈 프로젝트에 의해 lysP 주변영역의 DNA 시퀀스(sequence)도 명확하게 되어 있다. 이에 따르면 lysP의 상류에 lysP와 탠덤(tandem)하게 배열되는 유전자 yeiE(배열번호:11참조)가 존재하고 있었다. yeiE는 박테리아로 잘 보존되어 있는 lysR형의 전사조절 배열인 것이 그 아미노산 배열로부터 시사되었다. 이 yeiE가 lysP의 전사를 제어하고 있는 것으로 예상되었으므로, yeiE와 lysP를 함께 플라스미드 상에 얹어 놓음으로써, lysP의 전사량이 증대되고, L-리신의 수취능력이 상승되며, L-피페콜린산의 생산능력이 향상되는 것이 기대되었다.

이 플라스미드 pUClatlysPL을 다음과 같이 구축하였다. 말단에 BglⅡ 부위를 부착시킨 Forward DNA primer

ATAGATCTCTTGTTGCCTAAAACCATCCCCAA (배열번호:12)

및 말단 kpnⅠ site를 부착시킨 Reverse DNA primer

GTGGTACCCCCCAGAAAGCCGGAACAGCCTC (배열번호:13)

를 이용하여 PCR반응을 행하고 yeiE와 lysP를 포함하는 약 3Kbp를 증폭시켰다. 이 증폭단편을 제한효소BglⅡ와 kpnⅠ으로 소화한 것을 인서트DNA로 하였다. 한편, pUClatlysP를 제한효소BamHI와 kpnI으로 소화하고, 이와 인서트 DNA를 Ligation Kit version2(TaKaRa사)를 이용하여 연결반응한 플라스미드를pUClatlysPL로 하였다(도 1 참조). 이 플라스미드로 E. coli BL21을 형질전환한 주를 E. coli BL21pUClatlysPL주로 하였다.

argT유전자의 클로닝 및 도입:

lysP는 리신 농도가 높을 때는 그 발현이 억제되고 낮을 때는 유도되는 것으로 알려져 있다(J.Bacteriol.(1996)vol. 178, 5522-5528). 그래서, 또한 리신의 세포내로의 수취에 관여하는 유전자의 도입을 계획하였다. 지금까지는 대장균에는 리신, 아르기닌, 오르니틴의 균체내로의 수취시스템(LAO 시스템)이 존재하는 것이 알려져 있다(Jounal of Biological Chemistry, vol.265, p1783-1786(1990)). 또, 게놈 프로젝트에 의해 명백해진 대장균의 유전자 argT는, 살모넬라·타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium)에서 명백해져 있는 LAO 시스템(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, p6038-6042(1981))에 관여하는 argT와 높은 상동(相同)성을 갖고 있으므로, 대장균의 argT도 리신의 수취에 관여할 가능성이 높을 것으로 예상되었다.

따라서, argT의 효과를 알아보기 위해 lat와 argT가 놓인 플라스미드 pUClatargT를 이하와 같이 구축하였다.

프라이머argTkpnF:TCGGTACCTCGACATTTTGTTTCTGCC (배열번호:14)

프라이머argTkpnR:ATGGTACCATAAAATTGACCATCAAGG (배열번호:15)

를 이용하여 대장균의 게놈 DNA를 템플레이트(template)으로 하여 argT를 PCR반응으로써 증폭시켰다. 반응조건은 98℃20초, 60℃30초, 68℃1분의 25cycle로 하였다. 이 증폭단편 약 1.5Kbp를 제한효소 KpnI으로 소화하고, pUClatlysPL의 KpnⅠ사이트로 도입하였다. 또, 얻어진 플라스미드의 ScaⅠ사이트에 테트라사이클린내성유전자를 도입하였다. 즉, pBR322를 템플레이트로 하고, 단말에 ScaⅠ사이트를 추가한 프라이머

프라이머TetF:TTAGTACTCTTATCATCGATAAGCTTTAAT (배열번호:16)

프라이머TetR:GCAGTACTACAGTTCTCCGCAAGAATTGAT (배열번호:17)

를 이용하여 테트라사이클린 내성유전자를 PCR반응으로써 증폭시켰다. 이를 pUClatlysPL의 암피실린 내성유전자 내에 존재하는 ScaⅠ사이트로 도입한 플라스미드를 pUClatlysPLargT-tet로 하였다. 또, 이 플라스미드를 대장균BL21주에 도입한 것을 E. coli BL21 pUClatlysPLargT-tet주로 하였다. argT의 DNA배열 및 아미노산 배열은 배열번호:18에 나타낸다.

코리네형 세균에서의 lat형질 전환주의 구축과 발현:

이상에서 설명한 바와 같이 lat발현 대장균을 이용한 L-리신으로부터 L-피페콜린산으로의 변환반응에 의한 L-피페콜린산의 생산계를 확립할 수 있었다. 이 조환 대장균계에서는 L-리신의 균체 내로의 수취가 피페콜린산의 생산의, 경우에 따라서 율속인 것이 시사되었으므로, 배양액중에 L-리신을 첨가하지 않고 균 자신이 L-리신을 생산하여 피페콜린산으로 변환시키는 피페콜린산 직접생산균을 제공하는 것도 바람직할 것이다. 이러한 제공은, 이하와 같은 전략에 따를 수 있다. L-리신은 코리네박테리아·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 의해 대량으로 발효 생산되고 있다. 따라서, C.glutamicum의 벡터계로서 확립되어 있는 pC2플라스미드(PLASMID, vol.36, 62-66(1996))에 lat을 얹어 놓고, C.glutamicum ATCC31831에 도입하여 lat를 발현시킬 수 있으면, 균체 내에서 생합성된 L-리신을 P6C로 변환하고, 또, C.glutamicum의 게놈에 코드되어 있는 proC의 발현에 의한 피롤린-5-카르본산 환원효소에 의해 P6C가 피페콜린산으로 변환될 수 있을 것이다. 이러한 전략의 유효성은, 예를들면 이하의 실험을 행함으로써 확인할 수 있다.

상기 pC2플라스미드를 이용하여 lat발현 플라스미드 pClat을 이하와 같이 구축하였다.

프라이머ClatBamF:GGGGTACCCATGTCCCTTCTTGCCCCGCT (배열번호:19)

프라이머ClatBamR:GGGGATCCCGCGGCCTGTTGCCGCTGGT (배열번호:20)

를 이용하여 플라보박테리움·루테센스(Flavobacterium lutescens)의 게놈 DNA를 템플레이트로 하여 lat를 PCR반응으로써 증폭시켰다. 반응조건은 98℃ 20초, 68℃ 2분의 25사이클로 하였다. 이 증폭단편 약 1.5kbp를 KpnⅠ과 BamHI으로 소화하고, pC2의 KpnⅠ, BamHI사이트에 연결반응하였다(도 2). 이 플라스미드 pClat을 대장균 JM109에 도입한 주를 이용하여 L-리신으로부터 피페콜린산으로의 변환반응이 진행하는 것, 즉 LAT활성을 갖는 것을 확인하였다.

다음에 pClat에 의한 C.glutamicum의 형질전환법을 행한다. 예를들면, L배지 3ml에 C.glutamicum을 식균하고, 32℃에서 17시간 진탕배양하였다. 이 배양액 30㎕을 L배지 3㎖에 식균하고, 32℃에서 2.5시간 진탕배양하였다. 이에 페니실린G칼륨용액(2㎎/㎖)을 1.5㎕ 첨가하고, 또 1.5시간 진탕배양하였다. 전량을 집균하고, 10% 글리세롤용액 5㎖로 세정하고, 10% 글리세롤용액 700㎕로 현탁한 것을 일렉트로셀로 하였다. 일렉트로셀 200㎕에 TE용액에 녹인 플라스미드(200㎍/㎖)를 0.5㎕ 첨가하고, 12.5kV/cm, 25uF, 200Ω의 조건에서 일렉트로포레이션을 행하였다. L배지 1㎖를 첨가하고, 32℃에서 2시간 진탕배양한 후, 카나마이신 10㎍/㎖를 포함하는 L플레이트에 도포하고, 32℃에서 3일간 배양하여 출현한 콜로니를 선발함으로써 목적의 형질전환주를 제공할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 코리네형(coryneform)세균이란, 전형적으로는 코리네 박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 L-리신을 생산하고, 본 발명의 목적에 따르는 것이라면 어떠한 종의 것도 포함한다.

상기 각 유전자 또는 DNA배열의 개변(改變)체

본 발명에 따르면, 상기 각 효소를 코드하는 유전자 또는 DNA에서는, 그들(예를들면, 배열번호:1, 배열번호:5, 배열번호:8, 배열번호:11 및 배열번호:18참조)과 각각 스트린젠트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)하고, 그리고 그들이 발현함으로써 생산되는 폴리펩티드가, 각각 목적의 효소활성을 갖는 것이라면 어떠한 개변체도 본 발명에서 말하는, 리신-6-아미노트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자, 피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 코드하는 유전자, 리신 특이적 수취효소를 코드하는 유전자, 및 lysP의 전사를 조절하는 유전자에 포함된다.

스트린젠트한 조건은, 당업자에게 주지한 것으로, 예를들면, 상술한 Sambrook 등의 9.31∼9.62페이지에 기재되어 있다. 이들 개변체는, 각각 목적으로 하는 효소활성에 필수적이지 않거나 또는 악영향을 미치지 않는다고 볼 수 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기(殘基)가 결실(缺失) 또는 부가된 것이거나, 또는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 간(間), 예를들면, 염기성 측쇄(리신, 아르기닌, 히스티딘 등), 산성 측쇄(아스파라긴산, 글루타민산 등), 무하전극성 측쇄(글리신, 아스파라긴, 그루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 등), 비극성 측쇄(알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 등), β-분기된 측쇄(예를들면, 스레오닌, 발린, 이소로이신 등) 및 방향족 측쇄(예를들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 등)를 갖는 아미노산 잔기 사이에서, 각각 상호 치환되는지, 등을 지표로 하여, 그 자체가 이미 알려진 점돌연변이(point mutation), 부위 특이적 돌연변이 유발법 등, 또는 화학합성법 등으로 작성할 수 있다. 또, 이러한 유전자에 의한 숙주세포의 형질전환 또는 트랜스포메이션은, 상술한 조작 또는 당업자에게 주지의 방법에 의해 행할 수 있다.

또한, 생성된 피페콜린산이 L체인 것의 확인은 키랄컬럼을 이용한 HPLC법(Agric. Biol. Chem., 52권, 1113∼1116페이지, 1988년)에 의해 실시하였다. 컬럼은 DAICEL CHIRAL PAK WH(4.6×250㎜, 다이셀(Daicel Chemical Industries, Ltd)제)를 이용하고, 이동상은 0.25mM 황산구리수용액을 이용하고, 컬럼온도 50℃, 유속 1.0㎖/min, 검출은 UV243nm에서 실시하였다. 이 HPLC조건에서 D체의 피페콜린산의 유지시간은 11.5분, L체의 피페콜린산의 유지시간은 15분으로, 본 발명에 의한 조환 대장균이 생산하는 피페콜린산을 분석한 결과, 생산된 피페콜린산은 상기 유지시간이 15분이었다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

실시예에 있어서 L-피페콜린산의 정량은 단실화(dansylation)한 후, 고속 액체크로마토그래피(이하 HPLC라고 간략하게 기재)에 의해 프롤린을 내부표준으로서 정량하였다. 즉 배양상청(上淸)을 증류수로 100배 희석하고, 내(內) 10㎕를 에펜튜브로 이동시키고, 여기에 5㎍/㎖의 프롤린을 포함하는 40mM탄산리튬 완충액(pH 9.5) 200㎕와 아세트니트릴에 녹인 3.0㎎/㎖의 단실 클로라이드(dansyl chloride) 100㎕를 첨가하고, 교반하여 실온의 어두운 곳에서 2시간 반응시켰다. 2%의 메틸아민염산염 10㎕를 첨가하여 교반하고, 그 상청을 분석 샘플로 하였다. HPLC 분석조건은, 컬럼은 YMC-pack ODS-A A-303(4.6×250㎜, YMC제)을 사용하고, 이동상은 0.003M L-프롤린과 0.0015M 황산구리와 0.0039M 아세트산 암모늄을 함유하는 33.2% 아세트니트릴 용액(암모니아수로 pH7로 조정)을 사용하여, 유속 0.8㎖/분, 실온, 검출은 여기파장 366nm, 형광 510nm에서 행하였다. 이 조건에서 L-피페콜린산의 유지시간은 13분이었다.

실시예 1

E. coli BL21pUClatlysP(FERM BP-7326)주, E. coli BL21(DE3)pETlatlysP주, E. coli C600pUClatlysP주 및 E. coli BL21pUClatlysPL주에 대해서 L-피페콜린산의 생산시험을 행하였다. 암피실린나트륨 50㎍/㎖을 함유하는 L-배지(폴리펩톤 1.0%, 효모엑기스 0.5%, NaCl 0.5%, 글루코오스 0.1%, pH7.2) 3㎖에 각각의 균주를 식균하고, 32℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 이들을 종균으로 하여 각 275㎕를 암피실린나트륨 100㎍/㎖을 함유하는 TB배지(글리세린 0.44%, Bacto-트립톤 1.33%, Bacto-효모엑기스 2.67%, KH₂PO₄0.21%, K₂HPO₄1.14%) 27.5㎖에 식균하고, 각각 32℃에서 4.5시간 진탕배양하였다. 또, E. coli BL21(DE3)pETlatlysP와 같은 pET형 벡터를 사용한 미생물의 배양에서는, lat를 유도하기 위해 100mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 275㎕를 첨가하고, 추가로 4시간 32℃에서 진탕배양하였다. 이에 반해, pUC형 벡터를 사용한 경우에는, IPTG는 첨가할 필요가 없다. 이들에 각각 50% L-리신염산염 500㎕과 인산 완충액(pH6.8)에 녹인 50% 글리세린 250㎕를 첨가하고, 32℃에서 계속해서 진탕배양하였다. L-리신염산염을 첨가 후 15시간, 39시간, 63시간, 87시간, 120시간, 159시간에서도 50% L-리신염산염 500㎕과 인산 완충액(pH6.8)에 녹인 50% 글리세린 500㎕를 첨가하였다. 15시간, 39시간, 87시간, 120시간, 159시간, 207시간으로 100㎕를 샘플링하고, HPLC로 L-피페콜린산의 정량(定量)을 행하였다. 이들의 결과, 각 균주는 배양액 속에 다음의 농도로 L-피페콜린산을 축적하였다.

E. coli BL21pUClatlysP10g/l

E. coli BL21(DE3)pETlatlysP26g/l

E. coli C600pUClatlysP0.8g/l, 및

E. coli BL21pUClatlysPL15g/l.

실시예 2

P5C리닥타아제의 L-피페콜린산 생산에 있어서의 역할을 명확히 하기 위해proC 결손주인 E. coli RK4904주를 숙주로 하는 조환주 E. coli RK4904pUC19주, E. coli RK4904pUClat주, E. coli RK4904pUCproC주, 및 E. coli RK4904pUClatproC주에 대해서 L-피페콜린산의 생산성을 조사하였다. 암피실린나트륨 50㎍/㎖를 함유하는 L배지(폴리펩톤 1.0%, 효모엑기스 0.5%, NaCl 0.5%, 글루코오스 0.1%, pH 7.2) 3㎖에 식균하고, 32℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 이를 종균으로 하고 그것의 275㎕를 암피실린나트륨 50㎍/㎖를 함유하는 TB배지(글리세린 0.44%, Bacto-트립톤 1.33%, Bacto-효모엑기스 2.67%, KH₂PO₄0.21%, K₂HPO₄1.14%) 27.5㎖에 식균하고, 32℃에서 8시간 진탕배양하였다. 이에 50% L-리신염산염 500㎕와 인산 완충액(pH6.8)에 녹인 50% 글리세린 500㎕를 첨가하고, 32℃에서 계속해서 진탕배양하였다. 40시간에서 100㎕를 샘플링하고, HPLC로 L-피페콜린산의 정량을 행하였다. 그 결과, E. coli RK4904pUClatproC주에서만 0.765g/l의 L-피페콜린산의 축적이 보여졌으나, 다른 주에서는 피페콜린산의 축적은 보여지지 않았다.

실시예 3

E. coli C600pUClatlysP주를 이용하여 배지의 탄소원의 검토를 행하였다. 배지 조성은, TB배지(글리세린 0.44%, Bacto-트립톤 1.33%, Bacto-효모엑기스 2.67%, KH₂PO₄0.21%, K₂HPO₄1.14%)의 글리세린을 각종 탄소원으로 치환한 배지를 사용하였다. 탄산원으로서는, 글리세린, 피루빈산 나트륨, 구연산, 프로피온산, 말레인산, 젖산, DL-능금산에 대해서 검토하였다. 배양은 250㎖용량의 에를렌마이어 플라스크에 25㎖의 배지를 넣고 32℃에서 진탕배양을 행하였다. 배지 24시간째에서의 L-피페콜린산의 축적량은 각각, 4.8g/l, 3.3g/l, 2.8g/l, 2.6g/l, 3.5g/l, 4.7g/l, 4.7g/l이었다. 본 발명에서는 탄소원으로서 유기산도 사용가능하다는 것을 보여주고 있다.

실시예 4 균체 파쇄물에 의한 L-피페콜린산의 생산

암피실린 나트륨 50㎍/㎖를 함유하는 L배지 3㎖에 E. coli RK4904pUC19주, E. coli RK4904pUClat주, E. coli RK4904pUCproC주, 및 E. coli RK4904pUClatproC주를 식균하고, 32℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 이들을 종균으로 하여 275㎕를 암피실린나트륨 50㎍/㎖를 함유하는 L배지 50㎖ 에 각각 식균하고, 32℃에서 8시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심(遠心)하고, 균체를 0.85%NaCl로 수세하어, BugBuster(Novagen) 2㎖를 첨가한 상청을 균체 파쇄액으로 하였다. 이들의 균체 파쇄액 100㎕에 L-리신-HCl 20μ㏖, 2-케토글루탈산 20μ㏖, 피리독살 인산 0.075μ㏖, 및 β-NAD⁺200μ㏖를 함유하는 0.2M 인산버퍼(pH7.2)를 1㎖ 첨가하고, 32℃에서 15시간 방치하였다. 이들의 반응액 5㎕을 TLC 플레이트(Merck Art. 13143)에 스폿(spot)하고, 전개액(1-부탄올:아세트산:물=3:1:1)으로 전개한 후 닌도린 발색하였다. 이 결과 E. coli RK4904pUClatproC주 균체 파쇄액에서만 L-피페콜린산의 스폿이 확인되었다. 이것은 플라스미드 상에 코드된 lat유전자로부터 생성된 LAT와, proC로부터 생성된 피롤린-5-카르본산 리닥타아제에 의해, 시험관내 반응에 있어서도 L-피페콜린산이 생산되는 것을 보여주고 있다.

실시예 5

pUClatlysPLargT-tet와 마찬가지로, pUClatlysPL의 ScaI 사이트에 테트라사이클린 내성(耐性)유전자를 도입한 플라스미드 pUClatlysPL-tet를 구축하고, 이하의 변환반응을 행하였다.

테트라사이클린 25㎍/㎖를 함유하는 L-배지(3㎖/원심관)에 2균주, E. coli BL21 pUClatlysPLargT-tet주와 E. coli BL21 pUClatlysPL-tet주의 동결 종모를 식균하고 32℃에서 18시간 로터리 쉐이커 상에서 배양하였다. 이들의 종모를 테트라사이클린 25㎍/㎖을 함유하는 TB배지(27.5㎖/원심관)에 500㎕ 식균하고 32℃에서 24시간 로터리 쉐이커 상에서 배양하였다. 배양 종료시의 660nm의 O.D.는 각각 3.98, 9.38이었다. 각각의 배양액 4.71㎖, 2.00㎖로부터 원심분리에 의해 균체를 회수하고, 회수한 균체에 25mM 인산 완충액(pH 6.8) 1㎖를 첨가하고, 또 20% L-리신용액 20㎕, 20% 글리세롤 20㎕을 첨가하여 32℃에서 변환반응을 개시하였다. 반응개시 2시간 후, 7시간 후, 24시간 후에 각각 100㎕씩 샘플링하고 피페콜린산과 리신의 양을 HPLC를 사용하여 정량하였다.

변환반응 2시간 후, 7시간째, 24시간째에서의 피페콜린산의 축적량은 각각 E. coli BL21 pUClatlysPLargT-tet주가 0.36g/l, 0.73g/l, 2.0g/l인데 비해, E. coli BL21 pUClatlysPL-tet주에서는 0.88g/l, 1.3g/l, 1.4g/1이었다. 이와 같이 E. coli BL21 pUClatlysPL-tet주는 피페콜린산 생산속도가 서서히 둔해지는데 비해, E. coli BL21 pUClatlysPLargT-tet주는 출발시의 피페콜린산 생산속도는 약간 떨어지지만, 거의 일정한 피페콜린산 생산속도를 유지하였다. 이 피페콜린산 생산속도는 리신 감소속도에 완전하게 대응하고 있었다. 이 실험결과에 의해, 피페콜린산 생산에 있어서의 argT 유전자의 효과를 확인하였다.

실시예 6

코리네형 세균의 lat형질전환주 C. glutamicum ATCC31831 pClat주의 배양시험을 행하였다. 대조로서 lat가 삽입되어 있지 않은 플라스미드를 유지하는 C. glutamicum ATCC31831 pC2주도 동일하게 시험하였다. 2주의 한천평판 상의 코로니를 카나마이신 20㎍/㎖를 함유하는 L배지 3㎖를 넣은 시험관에 각각 식균하고, 32℃에서 18시간 로터리 쉐이커 상에서 배양하였다. 얻어진 배양액 275㎕ 각각을 카나마이신 20㎍/㎖를 함유하는 TB배지 27.5㎖가 든 250㎖용량의 에를렌마이어 플라스크에 식균하고, 32℃에서 로터리 쉐이커 상에서 본배양하여, 배양개시 후 5, 15, 39, 63시간에서 인산 완충액(pH 6.8)에 녹인 50% 글리세린을 550㎕씩 첨가하였다. 글리세린의 첨가를 개시하고 나서 135시간 후에 배양을 종료하고, 배양상청중의 피페콜린산을 HPLC를 사용하여 정량하였다. 그 결과, C. glutamicum ATCC31831 pClat주는 최초의 글리세린 첨가 후 135시간에서 약 0.7g/l의 피페콜린산을 축적하였다. 한편, 대조의 C. glutamicum ATCC31831 pC2주에서는 피페콜린산의 생산은 보여지지 않았다. 이것은, 코리네형 세균에 있어서도 플라스미드로 도입한 lat 유전자가 발현하는 것, 및 코리네형 세균이 피롤린-5-카르본산 환원효소(유전자, proC)가 LAT에 의해 리신으로부터 변환된 P6C를 피페콜린산으로 환원하는 것을 보여주고 있다.

Claims (11)

1. 피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 이용하여, 델타-1-피페리딘-6-카르본산의 환원을 행하는 공정을 포함하여 이루어지는 L-피페콜린산의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,

   피롤린-5-카르본산 리닥타아제가 대장균(Escherichia coli)또는 코리네형 (coryneform)세균에서 유래하는 L-피페콜린산의 제조방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

   델타-1-피페리딘-6-카르본산이 리신-6-아미노트랜스퍼라아제를 이용하는 L-리신으로부터의 변환공정에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 L-피페콜린산의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서,

   리신-6-아미노트랜스퍼라아제가 플라보박테리움·루테센스(Flavobacterium lutescens)에서 유래하는 L-피페콜린산의 제조방법.
5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,

   델타-1-피페리딘-6-카르본산의 환원을 행하는 공정 및 리신-6-아미노트랜스퍼라아제를 이용하는 L-리신으로부터 L-피페콜린산으로의 변환공정이, 리신-6-아미노트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로서 형질전환된 피롤린-5-카르본산 리닥타아제 활성을 갖는 대장균 또는 코리네형 세포를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 L-피페콜린산의 제조방법.
6. 제 5항에 있어서,

   대장균 또는 코리네형 세균이, 외래의 피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 코드하는 유전자 및 외래의 리신 수취에 관여하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-피페콜린산의 제조방법.
7. 리신-6-아미노트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 발현할 수 있는 형태로 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조환 대장균 또는 코리네형 세균.
8. 제 7항에 있어서,

   외래의 피롤린-5-카르본산 리닥타아제를 코드하는 유전자 및 외래의 리신 수취에 관여하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 발현할 수 있는 형태로 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조환 대장균.
9. 제 8항에 있어서,

   리신의 수취에 관여하는 유전자가, 리신 특이적 퍼미아제를 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 조환 대장균.
10. 제 8항에 있어서,

    리신의 수취에 관여하는 유전자가, 리신 특이적 퍼미아제를 코드하는 유전자이고, 그리고 그 상류에 탠덤(tandem)하게 배열되는 전사 조절인자를 코드하는 배열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조환 대장균 또는 코리네형 세균.
11. 제 7항 내지 제 10항의 어느 한 항에 기재된 조환 대장균 또는 코리네형 세균를 L-리신 함유배지에서 배양하고, 다음에 배양물 중에 축적된 L-피페콜린산을 채취하는 공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 L-피페콜린산의 제조방법.