KR20020048416A - 렙틴 분석법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샘플에서 렙틴의 존재를 확인하는 방법을 제공한다.

Description

렙틴 분석법{LEPTIN ASSAY}

제지방중량(lean body mass)에 비하여 과량의 체지방(body fat)으로 정의되는 비만은 중요한 생리적인 병적상태 및 의학적 병적상태와 연관하는데, 후자에는 고혈압, 상승된 혈중 지질, II형이나 비-인슐린-의존성 당뇨병(NIDDM)이 포함된다. 65세 인구의 18%를 포함하여 미국에는 6백만-천만명의 NIDDM 환자가 존재한다(Kamel, HK, et al. Clin. Geriatr. Med., 1999, 15, 265). NIDDM 환자중 대략 45%의 여성과 70%의 남성이 비만으로, 이들의 당뇨병은 체중 감소에 의해 현저하게 개선되었다(Harris 1991, Diabetes Care, 14, 639).

비만 유전자 산물인 렙틴(Zhang. Y., et al. 1994, Nature 372, 425)은 뇌에서 음식 섭취와 에너지 대사를 조절하는 말초 신호로 작용한다. 렙틴은 수용체 OB-R을 통하여 시상하부에 작용하는 것으로 생각된다(Tartaglia, L.A., et al 1995, Cell 83, 1263). 렙틴 또는 전장 OB-R의 정상적인 발현을 예방하는 돌연변이를 보유하는 설치류는 심각할 정도로 비만하게 되고, 감소된 대사분해율을 보인다(Coleman, D.L. 1978, Diabetologia 14, 141). 하지만, 사람의 비만은 렙틴 또는 OB-R을 인코드하는 유전자상의 돌연변이와 무관한 것으로 보인다(Considine, R. V., et al. 1995, J. Clin. Invest. 95, 2986; Considine, R. V., et al, 1996, Diabetes 19, 992). 변이된 비만 유전자를 갖는 생쥐는 재조합 렙틴을 투여하면 정상 체중을 회복할 수 있지만(Pelleymounter, M. A. et al. 1995, Science 269, 540; Halaas, J.L., et al, 1995, Science 269, 543; Campfield, L. A., et al, Science 269, 546), 혈청 렙틴 수준이 만성적으로 상승하는 비만한 사람에서 이런 방법이 성공할 가능성은 없어 보인다(Maffei, M., et al, 1995, Nature Med. 1, 1155; Considine, R. V. et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334, 292; Sinha, M. K., et al., 1996, J. Clin. Invest. 98, 1277). 따라서, 비만한 사람은 혈관-뇌 장벽을 통한 렙틴의 불완전 전달(Caro, J. F., et al, 1996, Lancer 348, 159) 또는 부적당한 OB-R 반응으로 인해 혈청 렙틴 수준과 비례하는 신호를 발생시키지 못한다는 점에서, "렙틴 저항성"인 것으로 생각된다(Maffei, M. et al., 1995, Nature Med. 1, 1155; Flier, J. S.& Elmquist, J. K. 1997, Nature Biotech. 15, 20; Campfield, L. A., et al, 1996, Horn. Metab. Res. 28, 619). OB-R 신호전달경로의 분석에서, 렙틴 저항성 및 역 비만을 극복하기 위하여 OB-R 반응을 촉진하는 대안적 치료요법적 방법을 모색할 수 있다. 렙틴과 OB-R은 각각 4중-나선다발 사이토킨과 수용체 대과의 원소다(Tartaglia, L. A., et al, 195, Cell 83, 1263; Mad더, T., et al, 1995, FEBS Lett. 373, 13). OB-R은 인터루킨-6과 CNTF와 같은 사이토킨에 의해 활성화되는데, 이들의 신호전달경로는 광범위하게 연구되고 있다(Kishimoto, T., et al, 1992, Science 258, 593; Stahl, N. & Yancopoulos, G. D. 1994, J. Neurobiology 25, 1454). 렙틴 수용체는 별개의 세포질 도메인을 가진 상이하게 접합된 수가지 산물로 번역되지만(Tartaglia, L. A., et al, 1995, Cell 83, 1263; Lee, G. H., et al, 1996, Nature Med. 2, 585; Wang, M. Y. et al, 1996, FEBS Lett. 392, 87), OB-Rb로 공지된 한가지 동소체만 렙틴의 중량조절효과를 매개할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Lee, G. H., et al, 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al, 1996, Cell 84, 491; Ghilardi, N., et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6231; Baumann, H., et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8374). 비만성 당뇨병(db) 생쥐는 OB-Rb 접합 변이체의 발현을 예방하는 OB-R상의 돌연변이를 보유하는데, 이런 돌연변이는 이들 생쥐가 렙틴의 작용을 적절히 매개할 수 없도록 야기한다(Lee, G. H., et al, 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al, 1996, Cell 84, 491).

생명을 위협하는 질환의 치료를 위한 약물로 사용되는 신규한 생물학적 활성분자의 발견에는 2가지 기본적인 전략이 활용된다: (i) 화학적 합성을 통하여 제조된 또는 천연 원료로부터 분리된 분자 후보의 다소 무작위적 선택, (ii) 소요 특성에 대한 분자 후보의 검사. 발견 사이클은 소요 특성을 보유하는 분자가 확인될 때까지, 무한히 반복한다. 대부분의 경우에, 검사에 선택되는 분자형은 상당히 좁게 한정된 화학적 부류에 속한다. 가령, 신규한 펩티드 호르몬의 발견에는 펩티드를 이용한 작업이 포함된다; 신규한 치료요법적 스테로이드의 발견에는 스테로이드를 이용한 작업이 포함된다. 결과적으로, 본질적으로 특이적이고 세렌디피티(serendipity)에 의존하는 신규한 기능분자의 발견은 많은 시간이 소모되고 힘들며 예측이 불가능하고 희생이 많은 작업이다.

생물학적 활성의 현대 이론은 생물활성 및 이에 따른 생리상태가 분자 인식 현상의 결과라고 기술한다. 가령, 뉴클레오티드는 상보성 염기쌍을 형성하고, 따라서 상보성 단일-가닥 분자는 하이브리드를 형성하게 되는데, 여기서 유전자 발현의 조절에 관여하는 것으로 보이는 이중- 또는 삼중-나선 구조가 만들어진다. 다른 예에서, 리간드라고 하는 생물학적 활성분자는 다른 분자, 일반적으로 리간드-수용체라고 하는 거대분자(예, 수용체 또는 효소)와 결합하는데, 이런 결합은 궁극적으로 생리 상태, 예를 들면 정상적인 세포 성장과 분화, 신생물 형성으로 이어지는 비정상적인 세포 성장, 혈압 조절, 신경-자극-발생 및 증식을 유발하는 일련의 분자 현상을 유도한다. 리간드와 리간드-수용체간의 결합은 기하학적으로 특징적이고 특이적인데, 여기에는 적절한 3-차원 구조적 배열 및 화학적 상호작용이 포함된다.

질병을 치료하는데 사용할 수 있는 약물의 개발을 위하여 최근에 선호되는 전략에는 이런 리간드를 모방하고 수용체에 의해 유도되는 활성을 증진(즉, 촉진)하는 또는 억제하는(즉, 길항하는) 리간드형의 생물학적 수용체, 효소 또는 관련된 거대분자의 발견이 포함된다. 이런 바람직한 리간드의 발견은 전통적으로 분자의 무작위 스크리닝(화학적 합성을 통하여 생산 또는 자연 공급원으로부터 분리, K. Nakanishi, Acta Pharm. Nord., 1992, 4, 319-328), 또는 리드-구조, 일반적으로고유 리간드의 구조 확인 및 다수 반복되는 구조적 재고안과 생물학적 검사를 통한 특성의 최적화를 포함하는 "추리적" 방식(Teata, B. &Kier, L.B. Med. Res. Rev. 1991, 11, 354; Rostein, S.H. & Mureko, M.A., J. Med. Chem. 1993, 36, 1700)으로 실시되어 왔다. 대부분의 유용한 약물이 "추리적" 방법이 아닌 임의 선택된 화합물의 스크리닝으로 발견되고 있긴 하지만, 최근에 약물 발견에 대한 하이브리드 방식이 등장했는데, 이는 특정 생물활성에 대하여 스크리닝되는 임의로 조합된 화학적 구조의 거대 라이브러리를 구성하기 위하여 조합 화학의 유용성에 기초한다(Brenner, S. & Lerner, R.A. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1992, 89, 5381). 임의로 조합된 화학적 구조의 이런 거대 라이브러리에 대한 임의 스크리닝은 자동화된 비용-효율적인 생물학적 분석을 필요로 한다.

렙틴은 전통적으로, ob/ob 생쥐에 주사하고 체질량의 감소를 측정하여 생체내 분석한다. 이런 생물분석은 성가시고 시간이 많이 걸리고 반복재현성이 없다. 이는 또한, 수백만개의 화합물을 포함하는 라이브러리의 고성능 스크리닝에 적합하지 않다. 그래서 좀더 단순한 분석 시스템이 제시되었다. 가령, STAT3 활성화를 지정하는 모티프(Stahl, N., et al, (1995) Science 267, 1349)인 긴 형태의 OB-R이 YXXQ 서열(Tartaglia, L. A., et al, (1995) Cell 83, 1263)을 보유한다는 발견은 STAT3이 렙틴 반응을 매개하는데 결정적일 가능성을 제기하였다. 최근의 연구결과는 STAT3이 배양된 세포(Ghilardi, N., et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6231; Baumann, H., et al, (1996) Proc. natl. Acad. SCi. USA 93, 8374; Rosenblum, C. I., et al, (1996) Endocrinology 137, 5178) 및 생체내(Vaisse,C., et a;, (1996) Nature Gen. 14, 95)에서 긴 형태의 OB-R에 의해 활성화되지만, 절두된 OB-R 또는 변이된 YXXQ 모티프를 가진 긴 형태의 OB-R에 의해 활성화되지 않는다는 것을 입증한다(Baumann, H., et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8374; White, D. W., et al, (1997) J. Biol. Chem. 272, 4065). PCT 특허출원 No. WO9857177은 간단한 시험관내 렙틴 생물분석을 위한 기초로서 STAT3 활성화의 활용을 제안한다. 하지만, STAT3은 IL-6, CNTF, 인터페론 알파와 베타, 성장 호르몬 및 좀더 많은 사이토킨과 폴리펩티드 호르몬을 비롯한 다양한 호르몬과 사이토킨에 의해 활성화된다.

PCT 출원 WO9740380은 "렙틴 반응 요소"라고 하는 DNA 카세트의 용도를 개시한다. 이런 DNA 카세트를 티미딘 키나아제 프로모터와 같은 프로모터 및 루시페라제와 같은 리포터 유전자에 부착시키면, 적합한 리포터 벡터가 만들어진다. 렙틴 수용체 OB-Rb를 발현하는 세포는 리포터 벡터로 트랜스펙션시킨다. 이런 세포는 렙틴의 시험관내 분석을 위한 도구로서 제시되고 있다. 하지만, PCT 출원 WO9740380에 따르면, 제안된 "렙틴 반응 요소"는 다양한 다른 사이토킨 및 특히 인터페론 감마, 인터페론 알파와 인터페론 베타에 의해 활성화되는 공지된 요소인 감마 활성화 서열"과 동일하다. 따라서, 감마 활성화 서열에 기초한 분석은 렙틴-모방 활성 및 예로써 인터페론-모방 활성을 구별하지 못한다.

또한, 시험관내 분석은 막통 도메인에 융합된 OB-R의 세포외 도메인 및 IL-3 수용체와 같은 리포터 수용체의 세포내 도메인으로 구성되는 키메라 수용체에 기초한다. 상기 키메라 수용체를 발현하는 IL-3-의존성 세포는 렙틴을 측정하는데 사용할 수 있는데, 상기 렙틴은 세포 증식을 촉진한다. 따라서, 렙틴에 대한 노출직후에 상기 세포는 증식하는데, 이들의 증식은 MTT 염색으로 또는 방사성표지된 티미딘의 통합으로 확인할 수 있다(Verploegen SA, et al, 1997,FEBS Lett. 405, 237). 이런 분석 시스템은 신뢰할 수 있고, 렙틴을 측정하는데 유용하고, 고성능으로 스크리닝할 수 있다. 하지만, 이런 분석에 기초한 고성능 스크리닝에 의해 선별된 분자는 렙틴을 전혀 모방하지 않을 수도 있다. 예로써, 고성능 스크리닝에 의해 발견된 실제 인슐린-모방 약물은 인슐린 수용체의 세포질 도메인과 상호작용하여 기능하는 것으로 밝혀졌다(Zhang B., et al, 1999, Science 284, 974). 따라서, 상기 렙틴-IL-3 수용체 키메라와 같은 키메라 수용체에 의해 선별되는 분자는 상기 키메라의 세포질 IL-3-유래된 도메인과 상호작용하고, 따라서 렙틴 모방체보다는 오히려 IL-3 모방체일 가능성이 높다. 그러므로, 이런 분석은 렙틴-모방 약물의 스크리닝에 바람직하지 않다.

비만 유전자의 산물인 렙틴은 지방세포에서 발현되는데, 이는 시상하부 수용체 OB-Rb를 통하여 음식 섭취와 에너지 대사를 조절한다. ob/ob 생쥐에서처럼 렙틴이 결핍되거나, 또는 db/db 생쥐에서처럼 OB-Rb가 결핍되면 병적인 비만이 유발된다. 하지만, 가장 일반적인 사람 비만 유형은 렙틴 결핍과 무관하다. 사실, 혈청 렙틴은 체질량 지수와 연관하고, 따라서 비만인 개체는 높은 수준의 혈청 렙틴을 보유한다. 이런 상관관계는 비만이 일정 유형의 렙틴 저항성과 연관한다는 개념으로 이어졌다. 실제로, 렙틴을 뇌심실내에 투여하는 경우, 렙틴을 말초 경로에 투여한 경우에 비하여 설치류의 지방조직중량이 훨씬 효과적으로 감소되었다.

뇌혈관장벽을 가로지를 수 있는 렙틴-모방 약물의 개발은 렙틴 저항성의 문제를 해결할 수 있다. 이를 위해, 렙틴-모방 활성을 보이는 개별 약물을 확인하기 위한 저분자량 약물로 구성되는 라이브러리를 스크리닝하는 것이 바람직하다. 이런 스크리닝은 렙틴 활성의 간단하고 특이적인 생물분석을 필요로 한다. 이런 분석은 성가시고, 따라서 수백만개의 상이한 물질로 구성되는 라이브러리를 스크리닝하는데 부적합하다. 몇몇 시험관내 분석이 언급되었지만, 이들은 렙틴에 특이적이지 않다. 따라서, 용이하게 자동화할 수 있는 렙틴 활성의 간단하고 특이적인 분석을 확립하는 것은 여전히 필요하다.

본 발명의 요약

따라서, 본 발명은 렙틴 또는 렙틴-모방 약물의 존재를 확인하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 렙틴에 반응하여 Ang-2를 발현하는 세포 또는 세포주와 샘플을 접촉시키고, 배양배지상의 Ang-2, Ang-2를 인코드하는 세포 mRNA, 또는 Ang-2 프로모터의 활성화를 측정하는 것으로 구성된다.

바람직하게는, 진핵 세포 또는 세포주, 좀더 바람직하게는 포유동물 세포 또는 세포주를 이용한다.

적합한 세포주는 분화된 뮤린 지방세포주, 예를 들면 Swiss 3T3 F442A 뮤린 지방전구세포 또는 사람 세포주, 예를 들면 사람 골수 간질 세포주 hMS2-12이다.

본 발명에 따라, Ang-2는 Ang-2에 대한 단클론항체와 다클론항체로 구성되는 배양배지에서 효소-결합 면역흡착법(ELISA)으로 통상적으로 측정한다.

이런 ELISA는 고성능 스크리닝과 같은 현재의 스크리닝 방법에 맞도록 조절할 수 있다.

Ang-2 RNA의 존재는 배양된 세포 또는 세포주에서 통상적인 방식의 역-전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 확인한다.

본 발명에 따라, ANG-2 프로모터의 활성화는 프로모터와 한가지이상의 렙틴 반응 요소를 보유하는 Ang-2 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동적으로 결합된 리포터 유전자로 구성되는 구조체를 적합한 벡터에 작제하고, 렙틴에 반응하여 Ang-2를 발현하는 숙주세포를 상기 벡터로 트랜스펙션시키고, 샘플과 함께 배양하고, 통상적인 방식으로 리포터 유전자 발현을 측정하여 감지한다.

또한, 본 발명은 프로모터와 한가지이상의 렙틴 반응 요소를 보유하는 Ang-2 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동적으로 결합된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 벡터를 제공한다.

본 발명은 렙틴 활성을 측정하는 분석 시스템에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 렙틴 또는 렙틴의 생리활성을 모방하는 약물(이후, 렙틴-모방 약물)에 대한 시험관내 분석법에 관한다. 상기 분석은 예로써 분자 라이브러리의 고성능 스크리닝에 사용하기 적합하다.

본 발명에 따라, 렙틴의 시험관내 분석을 위한 방법을 개시한다. 이런 방법은 렙틴-모방 약물의 고성능 스크리닝에 적합하다. 렙틴은 배양된 지방세포에서 안지오포에틴-2 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. 렙틴-모방 약물의 고성능 스크리닝은 효소 결합 면역흡착법(ELISA)으로 렙틴-유도 분비된 안지오포에틴-2의 수준을 측정하여 달성한다. 대안으로, 렙틴 활성은 리포터 유전자에 결합되고 배양된 지방세포에 삽입된 안지오포에틴-2 프로모터의 활성화를 측정하여 평가할 수 있다.

본 발명에 따라, 렙틴의 시험관내 분석을 위한 방법을 개시한다. 이런 방법은 또한, 렙틴-모방 약물의 고성능 스크리닝에 적합하다. 1999년 9월 5일 제출된 이스라엘 출원 No. 131739는 렙틴이 배양된 지방세포에서 안지오포에틴-2 유전자의 발현을 특이적으로 유도한다는 것을 개시한다. 렙틴의 부재시, 안지오포에틴-2는 배양된 지방세포에서 발현되지 않는데, 렙틴에 의한 안지오포에틴-2의 유도는 매우 강력하고 특이적이다. 따라서, 다양한 용량의 렙틴 또는 렙틴-모방 약물로 적당한 진핵 세포를 처리하고, 배양배지상의 안지오포에틴-2, 안지오포에틴-2를 인코드하는 세포 mRNA, 또는 안지오포에틴-2 프로모터의 활성화를 측정하여 렙틴 또는 렙틴-모방 활성을 확인할 수 있다. 상기 적합한 포유동물 세포는 렙틴 처리에 반응하여 안지오포에틴-2를 발현하는 임의의 세포 또는 세포주다. 일반적으로, 바람직한 숙주는 용이하게 배양되는 진핵세포, 특히 포유동물 세포이고, 적절한 구체예에서, 이는 분화된 생쥐 지방세포다. 가장 바람직한 세포주는 Swiss 3T3 F442A 뮤린 지방전구세포로서(Green, H., and Kehinde. O., 1975, Cell 5, 19), 이는 10% 우태아혈청(FBS)으로 보충한 배지에서 융합성 세포를 6일동안 유지함으로써 성숙 지방세포로 분화된다. 다른 가장 바람직한 세포주는 사람 골수 간질 세포주, hMS2-12로서, 이는 렙틴 수용체를 발현하고 지방세포로 분화되도록 유도할 수 있다(Thomas T., et al, 1999, Endocrinology 140, 1630).

당업자는 배양배지상의 안지오포에틴-2, 안지오포에틴-2를 인코드하는 세포 mRNA, 또는 안지오포에틴-2 프로모터의 활성화를 측정하기 위하여 일반적으로 가용한 다양한 방법을 적용할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 뮤린 안지오포에틴-2의 정량적 측정을 위한 효소 결합 면역흡착법(ELISA)을 개발한다. 이런 ELISA는ELISA 평판에 안지오포에틴-2를 포획하기 위한 생쥐 단클론항체의 개발을 필요로 한다. 정제된 단클론항체는 배양 상층액으로부터 Ang-2를 포획하기 위한 ELISA 평판의 제1 피복으로 사용된다. 숙주 동물(예, 토끼)에서 안지오포에틴-2에 대한 다클론항체를 유도한다. 항체 개발에 사용되는 안지오포에틴-2는 렙틴에 의한 유도에 사용되는 세포주와 동일한 종으로부터 기원해야 한다. 이런 분석을 실시하기 위하여, 렙틴 처리에 반응하여 안지오포에틴-2를 발현하는 세포는 예로써 96-웰 평판에서 성장시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 배양은 24-96시간동안 지속한다. 이후, 배양배지의 분취량을 떼어내고, 안지오포에틴-2에 대하여 특이적인 상기 포획된 단클론항체로 사전-피복된 ELISA 평판으로 옮긴다. ELISA 평판은 1-16시간동안 배양하고 세척하고, 안지오포에틴-2에 대한 다클론항체를 첨가한다. ELISA 평판은 1-16시간동안 배양하고 세척하고, 효소-항체 공액체를 첨가한다. 전형적인 공액체는 과산화효소 또는 알칼린 포스파타제에 공액된 염소-안티 토끼 면역글로불린이다. ELISA 평판은 1-16시간동안 배양하고 세척하고 적당한 기질을 첨가하여 발색시킨다. 상기 ELISA는 자동화된 고성능 스크리닝에 적합하다.

본 발명의 다른 구체예에서, 안지오포에틴-2 mRNA는 렙틴 또는 렙틴-모방 약물로 처리된 상기 배양된 세포에서 측정한다. 특이적인 뮤린 안지오포에틴-2 mRNA는 역-전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 측정할 수 있다. 고성능 RT-PCR은 예로써 특이적인 "분자 표지"(Research Genetics, Huntsville Alabama, USA)를 이용하여 발명할 수 있다. 이들은 각각, 5'말단과 3'말단에 형광 염료와소광(quencher) 염료를 보유하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드다. 상기 올리고뉴클레오티드는 안지오포에틴-2 cDNA의 서열과 상보적인 헤어핀 루프 서열을 포함하도록 디자인한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 분자 표지가 PCR-증폭된 안지오포에틴-2 cDNA에 결합하지 않는 경우에 형광단이 에너지 전달로 소광 염료에 의해 급냉되고 형광이 발생하지 않도록 하는 헤어핀 스템 구조를 포함하도록 디자인한다. 하지만, PCR-증폭된 안지오포에틴-2 cDNA를 첨가하는 경우에, 분자 표지의 상보성 루프는 상기 스템 구조에 비하여 표적 PCR 산물과 좀더 강한 결합을 형성한다. 이런 하이브리드형성은 스템을 강제로 찢는 형태적 변화 및 형광을 초래한다(Tyagi S., and Kumar F.R., 1996, Nature Biotech., 16 49).

이런 분석을 실시하기 위하여, 렙틴 처리에 반응하여 안지오포에틴-2를 발현하는 세포는 예로써 96 웰 평판에 성장시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 배양은 24-96시간동안 지속한다. 평판은 세척하고, 전체 RNA는 세포 단층으로부터 추출한다. RNA는 랜덤 프라이머로 역-전사시키고, 생성된 cDNA는 특이적인 뮤린 안지오포에틴-2 프라이머로 정량 PCR한다. 안지오포에틴-2 mRNA의 함량은 표적 PCR 산물의 함량에 반영되고, 상기 표적 PCR 산물의 함량은 분자 표지로 측정한다. 이런 분석의 모든 단계는 자동화된 고성능 스크리닝에 적합하다.

다른 적절한 구체예에서, 사람 또는 뮤린 안지오포에틴-2 프로모터는 당분야에 공지된 방법으로 게놈 DNA로부터 동정하고 클론한다. 상기 프로모터와 리포터 유전자는 가급적, 복제가능한 포유동물 발현벡터에 나란히 결합시킨다. 하지만,안지오포에틴-2 프로모터의 기능을 방해하지 않도록 중간 서열이 존재할 수도 있다. 리포터 유전자는 쉽게 감지되는 또는 전사와 번역의 용이한 감지를 가능하게 하는 펩티드를 인코드하는 임의의 유전자이다. 이는 일반적으로, 숙주 세포에서는 자연적으로 생성되지 않는 또는 숙주 세포에 의해 극히 소량 생성되는 단백질을 인코드한다. 공지된 리포터 유전자의 예로는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 루시페라제(박테리아 또는 개똥벌레) 및 다른 효소-기초한 검출 시스템(예, 베타-갈락토시다제, 알칼린 포스파타제등)을 들 수 있다. 특히 적절한 구체예에서, 리포터 유전자는 루시페라제다.

리포터 유전자 구조체는 a) 프로모터와 한가지이상의 렙틴 반응 요소를 보유하는 안지오포에틴-2 프로모터 영역 및 b) 상기 프로모터 영역에 작동적으로 결합된 리포터 유전자로 구성된다. 이것은 가급적, 숙주 세포를 트랜스펙션시키는데 적합한 벡터에 위치시킨다. 벡터는 선택된 숙주 세포에서 기능할 수 있는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스 벡터를 비롯한 임의의 공지된 벡터일 수 있다. 이런 벡터는 본 발명의 또 다른 특징이다. 숙주 세포는 렙틴 처리에 반응하여 안지오포에틴-2를 발현하는 임의 세포 또는 세포주일 수 있다. 이런 세포는 상기 리포터 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙션시킨다. 일반적으로, 숙주 세포는 용이하게 배양되는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 좀더 바람직하게는 분화된 생쥐 지방세포다. 가장 바람직한 세포주는 Swiss 3T3 F442A 뮤린 전구지방세포로서(Green, H., and Kehinde, O., 1975, Cell 5, 19), 이는 10% 우태아혈청(FBS)으로 보충한 배지에서 융합성 세포를 6일동안 유지함으로써 성숙지방세포로 분화된다.

이런 분석을 실시하기 위하여, 렙틴 처리에 반응하여 안지오포에틴-2를 발현하는 세포 또는 세포주는 상기 리포터 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙션시킨다. 상기 세포는 96 웰 평판에서 성장시키고 분화시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 계속 배양한다. 리포터 유전자 산물의 수준은 24-96시간이후에 웰에서 측정한다. 이런 분석에서, 안지오포에틴-2 프로모터의 활성화는 상기 리포터 유전자 구조체의 유전자 산물을 측정하여 확인한다. 따라서, 유전자 산물의 수준은 렙틴 또는 렙틴 또는 렙틴-모방 약물의 수준에 상응한다.

본 발명은 다음의 실시예로 추가적으로 설명하지만, 상기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 명세서를 읽은 이후에 본 발명의 개념 및/또는 첨부된 청구항의 범위를 벗어나지 않는 다양한 구체예, 개변 및 균등물을 실시할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 1: 안지오포에틴-2의 ELISA에 의한 렙틴과 렙틴-모방 약물의 분석

뮤린 Swiss 3T3 F442A 세포는 96 웰 평판에서 성장시키고 분화시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 1㎍/㎖의 최종농도로 배양액에 첨가하고, 배양은 24시간동안 지속한다. 이후, 렙틴-유도된 또는 렙틴-모방 약물-유도된 배양배지의 분취량을 떼어내고, 뮤린 안지오포에틴-2에 특이적인 포획된 단클론항체로 사전-피복된 ELISA 평판으로 옮긴다. 마이크로역가평판(Dynatech 또는 Maxisorb, by Nunc)은 하룻밤동안 4℃에서 안티-생쥐 안지오포에틴-2 단클론항체(무혈청 하이브리도마 상층액 또는 심막액 면역글로불린)로 피복한다. 평판은 BSA(0.5%)와 Tween 20(0.05%)을 함유하는 PBS로 세척하고, 37℃에서 적어도 2시간동안 동일 용액에 밀폐한다. 이후, 렙틴-유도된 또는 렙틴-모방 약물-유도된 배양배지의 분취량을 떼어내고, 37℃에서 4시간동안 ELISA 평판(100㎕/웰)에 옮긴다. 그 다음, 평판은 Tween 20(0.05%)을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 이후 추가 배양을 위하여 하룻밤동안 4℃에서 토기 안티-생쥐 안지오포에틴-2 혈청(1:1000, 100㎕/웰)을 첨가한다. 평판은 3회 세척하고, 실온에서 2시간동안 염소-안티-토끼 양고추냉이 과산화효소(HRP, Jackson Labs, 1:10,000, 100㎖/웰)의 공액체를 첨가한다. 평판은 4회 세척하고, H₂O₂를 기질로 하여 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산, Sigma)로 발색시킨다. 평판은 ELISA 자동판독기로 측정한다.

실시예 2: 안지오포에틴-2의 RT-PCR에 의한 렙틴과 렙틴-모방 약물의 분석

뮤린 Swiss 3T3 F442A 세포는 96 웰 평판에서 성장시키고 분화시킨다. 세포는 렙틴으로 자극하기에 앞서, 16시간동안 저혈청(0.5%)에 유지시킨다. 렙틴(1㎍/㎖, 양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 배양은 24시간동안 지속한다. 평판은 물기를 제거하고, 전체 RNA는 TRI 시약 키트(Molecular Research Center Inc.)로 분리한다. 역전사는 1㎍(N)₆랜덤 프라이머(New England Biolabs, USA)로 RNase H- 역전사효소(SuperScript II, GIBCO-BRL,USA)를 이용하여 20㎕ 부피에서 실시한다. 역전사 산물의 분취량(2㎕)은 VENT DNA 중합효소(New England Biolabs) 및 센스와 안티센스 프라이머: 변이된 안지오포에틴-2 mRNA, AF4326.gb_ro, 각각 뉴클레오티드 637-657과 1147-1167을 활용한 PCR에 사용한다. PCR 반응은 포화이전에 종결시킨다. PCR 산물은 분리하고 72℃에서 1M NaCl을 첨가하여 변성시키고 52℃에서 분자 표지에 혼성화시키는데, 상기 분자 표지의 구조는 다음과 같다: 5'로다민-GCTGAG-CTGGAGAAGAAGCTGGTGACA-CTCAGC-3'-다브실(dabcyl).

루프는 뮤린 안지오포에틴-2 mRNA, Gebebank Accession No. AF004326의 뉴클레오티드 898-918에 상응하고, 스템-루프-구조의 Tm은 61.6℃이다. 형광 샘플은 안지오포에틴-2 mRNA를 발현함으로써 렙틴에 반응하는 배양액을 나타낸다.

실시예 3: 리포터 벡터에 의한 렙틴과 렙틴-모방 약물의 분석

뮤린 Swiss 3T3 F442A 전구지방세포는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자 앞에 뮤린 안지오포에틴-2의 전체 프로모터 영역을 보유하는 리포터 벡터로 안정적으로 트랜스펙션시킨다. 세포는 96 웰 평판에서 성장시키고 분화시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 계속 배양한다. 녹색 형광의 발생은 세포 배양액이 렙틴 또는 렙틴-모방 약물에 노출되었다는 것을 시사한다.

실시예 4: 수용체 벡터에 의한 렙틴 또는 렙틴-모방 약물의 분석

사람 hMS2-12 간질 전구지방세포는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자 앞에 사람 안지오포에틴-2의 전체 프로모터 영역을 보유하는 리포터 벡터로 안정적으로 트랜스펙션시킨다. 세포는 96 웰 평판에서 성장시키고 분화시킨다. 렙틴(양성 대조군) 또는 추정 렙틴-모방 약물의 샘플은 배양액에 첨가하고, 계속 배양한다. 녹색 형광의 발생은 세포 배양액이 렙틴 또는 렙틴-모방 약물에 노출되었다는 것을 시사한다.

Claims (14)

1. 렙틴 또는 렙틴-모방 약물의 존재를 확인하는 방법에 있어서, 렙틴에 반응하여 Ang-2를 발현하는 세포 또는 세포주와 샘플을 접촉시키고, 배양배지상의 Ang-2, Ang-2를 인코드하는 세포 mRNA, 또는 Ang-2 프로모터의 활성화를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 진핵 세포 또는 세포주를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 진핵 세포 또는 세포주는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 세포주는 분화된 뮤린 지방세포주에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 세포주는 뮤린 Swiss 3T3 F442A 전구지방세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3항에 있어서, 세포주는 사람 세포주에서 선택되는 것을 특징으로 하는방법.
7. 제 6항에 있어서, 세포주는 사람 골수 간질 세포주 hMS2-12인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, Ang-2는 배양배지에서 통상적인 방식의 면역분석으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, Ang-2는 Ang-2에 대한 단클론항체와 다클론항체를 포함하는 효소 결합 면역흡착법(ELISA)으로 배양배지에서 통상적인 방식으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8항 또는 9항에 있어서, 고성능 스크리닝에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항 내지 7항중 어느 한 항에 있어서, Ang-2 RNA의 존재는 배양된 세포 또는 세포주에서 통상적인 방식의 역-전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항 내지 7항중 어느 한 항에 있어서, Ang-2 프로모터의 활성화는 프로모터와 한가지이상의 렙틴 반응 요소를 포함하는 Ang-2 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동적으로 결합된 리포터 유전자를 포함하는 벡터를 작제하고, 렙틴에 반응하여 Ang-2를 발현하는 숙주세포를 상기 벡터로 트랜스펙션시키고, 샘플과 함께 배양하고, 통상적인 방식으로 리포터 유전자 발현을 측정하여 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 프로모터와 한가지이상의 렙틴 반응 요소를 포함하는 Ang-2 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동적으로 결합된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
14. 전술한 항중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위한 분석 키트.