KR20020042694A - 써모모노스포라 푸스카 기원의 에스테르 그룹 절단 효소 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 임의로 유도인자의 존재하에 적합한 영양 배지에서 미생물 써모모노스포라 푸스카를 배양하여 수득할 수 있는 에스테르 그룹 절단 효소에 관한 것이다.
Description
본 발명은 써모모노스포라 푸스카 기원의 에스테르 그룹 절단 효소(이후부터 EGC 효소로 언급됨), 이의 제조 방법, 및 에스테르 그룹 함유 중합체 및 저분자량의 화합물을 분해시키고 처리하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
생물학적 분해가 제어받기 쉬운 중합체 및 거대분자 기재가 최근에 날로 중요해지고 있다. 다수의 이러한 제품은 이미 산업적 규모로 시판되고 있다. 이들 신규 제품중에, 에스테르 그룹 함유 중합체(예: 폴리에스테르, 폴리에스테르우레탄, 폴리에스테르아미드)가 중요한 역할을 한다. 생분해성 폴리에스테르계 플라스틱의 예는 예를 들어, 폴리(β-하이드록시부티레이트-코-β-하이드록시발러레이트), 폴리(ε-카프롤락톤) 및 폴리(부틸렌 석시네이트)이다.
중합체는 이의 분자 크기 때문에 미생물 세포의 외막을 통과할 수 없기 때문에 일반적으로 분해 속도를 결정하는 분해의 제1 단계는 세포외 효소에 의해 분자량을 감소(탈중합화)시키는 것이다. 따라서 폴리에스테르는 에스테르 결합이 이러한 세포외 가수분해 효소의 기본 공격 지점을 구성하기 때문에 강력하게 생분해될 수 있다.
지방족 폴리에스테르의 경우, 이러한 가수분해 효소(예: 리파제, PHB 데폴리머라제)를 사용한 생물학적 분해에 대한 연구가 오랫동안 진행되어 왔다[문헌참조: Tokiwa et al., Polym. Mater. Sci. Eng. 62(1990), 988-992][Jendrossek et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46(1996), 451-4631]. 적합한 조건하에서, 상응하는 효소와 함께 기재를 항온처리하고 주변 배지에 절단된 생성물이 형성되거나 샘플의 중량이 감소함에 의해 분해를 측정된다. 천연 폴리하이드록시알카노에이트의 경우에는, 일반적으로 상기 목적을 위해 특별히 분리된 하이드롤라제(PHB 데폴리머라제)를 사용하는 반면에 합성 폴리에스테르를 분해시키는 경우에는, 시판되는 리파제 등을 사용하여 중합체를 분해시키기 위한 목적으로 특별히 분리하지 않는다.
많은 지방족 폴리에스테르가 기본적으로 생물학적 공격에 민감한 것으로 입증된 반면에 방향족 폴리에스테르[예: 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(프로필렌 테레프탈레이트), 폴리부틸렌 테레프탈레이트)]는 생물학적으로 내성이 있는 것으로 공지되어 있다. 지방족 폴리에스테르의 가공성 및 응용성보다 우수한 방향족 구조의 가공성 및 응용성을 활용하기 위해, 최근에, 생분해성 지방족-방향족 코폴리에스테르가 개발되었고 산업적 규모로 제조되고 있다[문헌참조: Press information from BASF AG, Ludwigshafen, for the K' 98 Trade Fair in Dusseldorf, of 17.03.98].
그러나 방향족 성분을 도입한 결과로서 생물학적 분해율이 상당히 감소되었다[문헌참조: Muller et al., Polym. Degrad. Stab. 59(1998), p. 203-208]. 따라서, 예를 들어, 문헌[참조: Jun et al., J. Environ., Polym. Degrad. 2(1)(1994), p. 9-18]에서는 PET 및 PCL의 코폴리에스테르가 리파제(예: 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 리파제)에 대해 강력하게 공격 받지 않는다는 결론을 내리게 되었다.
특히 다양하게 통상적으로 시판되는 리파제를 사용한 폴리에스테르아미드의 분해는 최근에 기술적 측면에서 기술되었다[문헌참조: WO 98/36086]. 상기 특허 문헌이 또한 부탄디올, 테레프탈레이트(40몰%) 및 아디페이트(60몰%)의 코폴리에스테르의 분해를 기술하고 있다. 기술적 응용에 적합하도록 조작된 반응은 예를 들어, 효소(캔디다 안타르티카(Candida antarctica) 기원의 리파제) 50mg을 필름 또는 평판 형태의 폴리에스테르아미드 0.3 내지 1.8g에 첨가함으로써 성취된다. 수득된 분해율은 주(week)당 600mg이 분해되는 범위이다. 지방족-방향족 코폴리에스테르를 분해시키기 위해서는 효소 1%(완충액 100ml중)의 양이 코폴리에스테르의 미세 분말에 첨가되어야만 한다. 입자 크기가 작아 적용되는 표면적이 상당히 크다 할지라도 주당 230mg만이 분해된다.
최근에, 지방족-방향족 코폴리에스테르가 액티노마이세테스(Actinomycetes) 그룹에 속하는 미생물 균주에 의해 분해될 수 있다는 것이 밝혀졌다[문헌참조: Kleeberg et al., Appl. Environ. Polym. Degrad. 64(5), (1998), 1731-1735].
그럼에도 불구하고, 폴리에스테르계 중합체를 분해시킬 수 있는 고 활성 에스테르 그룹 절단 효소가 여전히 요구되고 있다.
놀랍게도, 생분해성 폴리에스테르 그룹 함유 중합체, 특히 지방족-방향족 코폴리에스테르가, 하기에 보다 상세하게 기술되는 본 발명에 따른 세포외 효소(액티노마이세테스에 속하는 써모모노스포라 푸스카 미생물, 특히 써모모노스포라 푸스카 DSM 43793 균주 기원)를 단독으로 또는 다른 효소와의 혼합물로 사용시 상당히 높은 분해 속도로 탈중합화되어 저분자량의 단편으로 분해될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 청구의 범위 제1항에 따른 에스테르 그룹 절단 효소, 청구의 범위 제6항에 따른 합성 펩타이드 또는 단백질, 청구의 범위 제7항 또는 제8항에 따른 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 청구의 범위 제9항에 따른 하이브리도마 세포, 청구의 범위 제11항에 따른 에스테르 그룹 절단 조성물 및 청구의 범위 제13항에 따른 에스테르 그룹 절단 조성물의 용도 또는 에스테르 그룹 절단 효소, 합성 펩타이드 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리한 양태가 종속항에 기재되어 있다.
보다 특히, 본 발명은 임의로 유도인자의 존재하에 적합한 영양 배지에서 써모모노스포라 푸스카 미생물을 배양하여 수득할 수 있는 에스테르 그룹 절단 효소에 관한 것이고 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소는 기탁번호 DSM 43793으로 도이첸 삼룽 푸르 미크로오르가니즈멘[저먼 콜렉션 오브 마이크로오거니즘]에 기탁된 써모모노스포라 푸스카 균주로부터 기원한다.
배양은 합성 배지 또는 복합 배지에서 배치, 유가식 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다. 미생물은 유리된 상태로 있거나 고형 담체상에 고정화될 수 있다. 원칙적으로 천연 미생물 및 유전학적으로 변형된 미생물이 적합하다.
효소를 제조하기에 적합한 유도인자는 예를 들어, 기질 자체, 예를 들어, 지방족 폴리에스테르 및/또는 올리고에스테르, 지방족-방향족 코폴리에스테르이다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소는 또한 예를 들어 원심분리에 의해 영양 배지로부터 효소 함유 배양 상등액을 수득하여 영양배지로 부터 분리하고, 예를 들어, 초원심분리 및/또는 황산암모늄 침전에 의해 상등액을 임의로 농축한 다음, 즉시 크로마토그래피, 특히 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 작용 크로마토그래피에 의해 효소를 통상적인 생화학적 정제 방법으로 정제한다.
본 발명에 따른 써모모노스포라 푸스카 DSM 43793 기원의 에스테르 그룹 절단 효소는 하기와 같은 특징을 갖는다:
분자량: 27400d(SDS 겔 전기영동에 의해 측정됨) 또는 28200d(아미노산 서열을 기준으로 계산됨);
최적 온도/범위: 65℃(30 내지 80℃);
온도 안정성: 70℃/30분;
최적 pH/범위: 6 - 7(4 - > 8)
등전점: 6.4.
기질 특이성은 에스테르 그룹 함유 중합체, 트리글리세라이드 및 프탈산 에스테르를 포함한다.
바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 써모모노스포라 푸스카 DSM 43793 기원의 에스테르 그룹 절단 효소는 하기의 아미노산 서열 또는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실로부터 비롯되고 동일기능의 효소를 생성하는 돌연변이된 아미노산 서열을 갖는다:
ANPYERGPNP TDALLEASSG PFSVSEENVS RLSASGFGGG
TIYYPREN NTYGAVAISP GYTGTEASIA WLGERIASHG
FVVITIDTIT TLDQPDSRAE QLNAALNHMI NRASSTVRSR
IDSSRLAVMG HSMGGGGTLR LASQRPDLKA AIPLTPWHLN
KNWSSVTVPT LIIGADLDTI APVATHAKPF YNSLPSSISK
AYLELDGATH FAPNIPNKII GKYSVAWLKR FVDNDTRYTQ
FLCPGPRDGL FGEVEEYRST CPF.
상기 아미노산 서열 또는 이의 일부는 또한 예를 들어, 자동화 펩타이드 합성기를 사용한 통상적인 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 에스테르 절단 효소에 대해 또는 이와 동일한 기능 및/또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 합성 펩타이드 또는 단백질에 대해 특이적으로 지시된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 또한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다. 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 제법 및 후자를 생산하는 하이브리도마의 제법은 오래전부터 공지되어 있고[문헌참조: E. Harlow, D. Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; E. Lidell, I. Weeks, "Antikorper-Techniken",Spektrum Akademischer Verlag, 1996) 추가로 설명할 필요가 없다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 에스테르-그룹-절단 효소 및/또는 이와 동일한 기능 및/또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 합성 펩타이드 또는 단백질 및 임의로 추가의 효소, 안정화제, 적합한 표면 활성 물질 및/또는 적합한 유기 용매를 포함하는 에스테르 그룹 절단 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 추가의 효소는 하이드롤라제, 특히 에스터라제, 프로테아제, 큐티나제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제이다.
특히 바람직하게, 상기 하이드롤라제는 슈도모나스 종, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 캔디다 실린드라세아(Candida cylindracea), 캔디다 안타르티카(Candida antartica), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum), 코마모나스 액시도보란스(Commamonas acidovorans), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus) 및 리조푸스 델라마르(Rhizopus delamar)로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 미생물로부터 기원한다. 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌[참조: WO 98/36086(Bayer AG)]에 기술된 미생물이 특히 적합하다.
본 발명은 또한 에스테르 그룹 함유 저분자량 및/또는 거대 분자 합성 화합물 또는 천연 화합물을 분해시키기 위한 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소 또는 동일한 기능 및/또는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드 또는 단백질 또는 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직하게, 에스테르 그룹 함유 거대분자 화합물은 지방족, 지환족,지방족-방향족, 부분적인 방향족 또는 방향족 폴리에스테르 또는 코폴리에스테르, 폴리에스테르아미드, 폴리에스테르카보네이트 또는 폴리에스테르우레탄이고, 이의 쇄는 연장될 수 있고 측쇄화 또는 가교결합될 수 있다.
에스테르 그룹 함유 거대분자 화합물은 임의의 목적하는 형태로 존재할 수 있고 예를 들어, 또 다른 기재와의 공중합체, 혼합물 및 블렌드, 합성물, 라미네이트 또는 접착 결합물을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소(또는 아미노산 서열로부터 합성적으로 제조된 효소) 또는 이러한 효소를 포함하는 조성물을 사용하여 저분자량 및/또는 거대분자(중합성) 에스테르 그룹 함유 화합물을 분해시키는 방법은 지금까지 공지된 시스템 보다 훨씬 우수하고 에스테르 그룹 함유 중합체를 효소적으로 처리하는 기술적 방법에 유용한 분해속도를 성취할 수 있다. 이것은 특히 경제적으로 매우 중요한 지방족-방향족 코폴리에스테르 및 폴리에스테르 블렌드에 대한 경우이다.
상기 및 하기에 기술된 중합체의 처리에 있어서 및 예를 들어, 필름, 사출성형부, 피막, 라미네이트, 발포체, 입자, 접착 결합물과 같은 기술적으로 적절한 형태로서의 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소(또는 아미노산 서열로부터 합성적으로 제조된 효소) 또는 이러한 효소를 포함하는 조성물은, 미생물에 의한 대사 속도를 증가시키거나 재활용(예를 들어, 접착 결합물을 용해시키거나 피막을 제거하고) 관점에서 제품을 가공하거나, 생분해성 중합체로부터 중합체 빌딩 블록을 회수하거나 폴리에스테르로 제조된 제품의 표면을 변형시키는데 사용될 수 있다.
적합한 효소 제제, 예를 들어, 임의로 농축될 수 있는, 써모모노스포라 푸스카의 조 배양물 상등액 형태, 정제된 효소 또는 합성 효소 또는 이러한 효소를 포함하는 조성물을 사용하여 예를 들어, 수용액 중에서 또는 효소 제제를 중합성 기재에 적용함에 의해 중합체를 처리할 수 있다.
저분자량의 에스테르 화합물은 다양한 중합체에서 첨가제로서 부분적인 역할을 한다. 이러한 화합물은 또한 본 발명에 따른 효소에 의해 절단될 수 있다.
본 발명에 따른 효소(또는 아미노산 서열로부터 합성적으로 제조된 효소) 및/또는 이러한 효소를 포함하는 조성물에 의해 분해될 수 있는 에스테르 그룹 함유 중합체는 이미 상기 언급한 중합체 뿐만 아니라 예를 들어 하기와 같은 중합체를 포함한다:
에스테르 그룹 함유 합성 및 천연 중합체, 특히, 리그닌, 리그노셀룰로스, 쿠틴, 수베린, 특히 지방족 폴리에스테르, 본원에 참조문헌으로서 인용된 문헌[참조: WO 98/36086(Bayer AG)]에 기술된 중합체, 특히, 폴리카프롤락톤, 방향족 또는 부분적으로 방향족인 코폴리에스테르, 특히 문헌[참조: WO 98/36086(Bayer AG)]에 기술된 중합체, 특히, 테레프탈산을 포함하는 중합체, 보다 특히 1,4-부탄디올, 테레프탈산 및 아디프산(BTA)의 코폴리에스테르, 특히 테레프탈산 30 내지 70몰%를 포함하는 코폴리에스테르, 폴리에스테르아미드, 특히 문헌[참조: WO 98/36086(Bayer AG)]에 기술된 폴리에스테르아미드, 우레탄 및 에스테르 그룹을 포함하는 중합체, 즉, 폴리에스테르우레탄 및 분절된 폴리우레탄.
폴리에스테르의 쇄는 연장될 수 있고 폴리에스테르는 측쇄화되거나 가교결합될 수 있다.
특히 바람직한 특정 폴리에스테르는 폴리(프로필렌 석시네이트), 폴리(부틸렌 석시네이트), 폴리(부틸렌 석시네이트-코-에틸렌 석시네이트), 석신산/아디프산/1,2-에탄디올/1,4-부탄디올의 공중합체, 1,4-부탄디올/아디프산/테레프탈산의 공중합체이다.
본 발명에 따른 효소(또는 아미노산 서열로부터 합성적으로 제조된 효소)에 의해 및/또는 이러한 효소를 포함하는 조성물에 의해 분해될 수 있는 에스테르 그룹 함유 중합체는 예를 들어, 2개 이상의 상기 언급된 중합체의 공중합체 또는 혼합물(블렌드), 2개 이상의 상기 언급된 중합체 또는 공중합체의 합성물 또는 라미네이트 또는 이의 블렌드, 천연 또는 변형된 천연 중합성 기재, 특히, 전분 및/또는 셀룰로스(예: 종이)와의 합성물, 라미네이트 또는 접착 결합물, 근본적으로 생분해될 수 없는 또 다른 기재(예: 유리)와의 합성물, 라미네이트 또는 접착 결합물, 통상적인 충진제, 섬유 보강제, 보조제, 안정화제를 포함하는 중합체 제제의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 용도는 입자, 현탁제, 유제, 피복제, 접착 결합제, 필름, 성형제, 섬유 또는 웹, 직물 및 발포체의 형태로 중합체를 처리함을 포함한다. 기재는 비처리되거나 화학적으로, 열적으로 또는 기계적으로 전처리될 수 있다.
효소는 예를 들어, 임의로 pH 값을 조정하면서 완충액 또는 비완충액중에서 사용된다.
예를 들어, 에스테르 그룹 함유 물질을 적합한 효소 용액에 도입하거나 적합한 효소 제제를 상응하는 기재 표면에 도포하여 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 효소의 추가로 가능한 용도는 폐기과정중에 전처리를 목적으로 상기 정의된 기재를 처리하고, 생성물 성분을 분리시킬 목적으로 기재를 처리하며, 각각의 기재 성분 또는 모든 기재 성분을 회수할 목적으로 기재를 처리하고 표면 성질을 개질시킬 목적으로 기재를 처리하는 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지 이를 제한하고자 하는 것이 아니다.
1. 써모모노스포라 푸스카 DSM 43793의 배양
배플이 장착되어 있지 않고 알루미늄 뚜껑으로 밀봉될 수 있는 멸균 배양 플라스크에 멸균 배지(DIN V 54900, 파트 2에 상응함)를 2cm로 채운다. 1,4-부탄디올, 테레프탈산 에스테르 및 아디프산으로부터 합성된 코폴리에스테르 3g/ℓ를 플라스크에 첨가하고 써모모노스포라 푸스카의 전배양물의 접종물 1용량%로 접종한다. 120 회전/분의 회전 진탕기에서 55℃에서 18시간동안 배양한다.
배양을 종료한 후에, 10℃에서 20분동안 8000 x g에서 원심분리하여 고체를 제거한다. 상등액은 에스테르 절단 효소를 포함한다.
2. 배양 상등액중의 써모모노스포라 푸스카를 사용한 지방족-방향족 코폴리에스테르의 분해
써모모노스포라 푸스카 DSM 43793을 무기염 배지(실시예 1 참조)에서 55℃에서 24.8시간동안 배양한다. 유기체 부재 배양 상등액 2ml을 시험관에 도입한다. 부탄디올, 테레프탈산 및 아디프산(산 성분중의 테레프탈산 40몰%)의 코폴리에스테르의 환형 중합체 필름(직경 0.9cm)을 배양 상등액에 첨가하고 55℃에서 24시간동안 배양한 후에, 필름 중량 손실은 2.575mg/cm2표면적이다.
3. 본 발명에 따른 에스테르 절단 효소의 분리
농도:
실시예 1의 배양 상등액을 아미콘 초원심 챔버(용적: 50ml, 여과 표면적: 47mm2)중에서 3bar의 압력에서 10Kd 컷 오프를 갖는 막을 사용하여 본래 용적의 5%로 농축시킨다.
자동화 균등, 자동화 주입 및 용출 기능을 갖는 표준 FPLC 시스템인 "LCC-Plus"(Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 사용하여 추가로 정제한다. 배양 상등액중의 농축 단백질(2.1mg)을 이온 교환 칼럼상에서 제1 단계로 정제한다.
파라미터:
칼럼: UNO-S1 칼럼(칼럼 용적 1.3ml, BioRad, Munich)
출발 완충액: 20mM 시트레이트 완충액(pH 4.0)
용출: 출발 완충액중에서 (선형 농도구배) 1M NaCl
유속: 2ml/분
도 1은 용출 프로필을 보여주고 암색 밴드는 에스테르 그룹 절단 활성을 나타내는 분획물을 나타낸다.
제2 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피로 수득하고 활성을 나타내는 분획물을 소수성 작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 추가로 정제한다.
이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득된 분획물 기원의 단백질 116㎍을 페닐세파로스 칼럼에 적용한다.
칼럼: 페닐세파로스-CL4B 칼럼(칼럼 용적: 1.14ml, Pharmacia. Uppsala Sweden)
출발 완충액: 20mM 인산 완충액(pH 7.1)중의 0.5M 황산암모늄
용출: 20mM 인산 완충액(pH 7.1)중의 (단계적 농도 구배) 30% 이소프로판올
유속: 0.3ml/분
도 2는 용출 프로필을 나타내고 암색 밴드는 에스테르 그룹 절단 활성을 나타내는 분획물을 나타낸다.
배양 상등액의 비활성은 3.3U/mg이다. 이온 교환 크로마토그래피 후에 비활성은 218U/mg이고 HIC 후에 비활성은 360U/mg이다.
본 발명에 따른 효소의 특성 분석
도 3은 스트렙토마이세스 알부스 G 기원의 트리아실글리세롤-리파제 및 스트렙토마이세스 종 M11 기원의 트리아실글리세롤-아실하이드롤라제와 서열을 비교할 목적으로 배열된 본 발명에 따른 효소의 아미노산 서열을 나타낸다. 복수로 배열하기 위해 "PileUp" 프로그램(Wisconsin Package, Version 9.1, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA)을 사용한다. 동일한 위치에서 서로 상이한 아미노산은 음영으로 나타낸다. 암색 테두리 박스는 리파제의 활성 중심 부위 영역 기원의 고도로 보존된 아미노산 서열을 지적한다. 2개의 스트렙토마이세스 균주의 서열은 SP-TREMBL 데이타뱅크(릴리즈 7.0, 08/1998)로부터 기원하는 Q56008(스트렙토마이세스 종 M11), Q59798(스트렙토마이세스 알부스 G)이다.
아미노산 서열 분석을 위해, EGC 효소를 정제후 여전히 잔류하는 외래 단백질로부터 분리한다. 이것은 예비 SDS 겔 전기영동을 사용하여 단백질을 분리시켜 수행하고 웨스턴 블롯팅에 의해 PVDF 막으로 이동시킨다. 단백질 밴드를 염색한후에 효소 밴드를 막으로부터 절단해 내고 서열 분석한다.
전체 서열을 결정하기 위해, 효소를 트립신 및 GIuC로 분해시킨다. 수득한 펩타이드는 HPLC(역상)로 분리한다. BTA-하이드롤라제의 분해물로부터 수득한 N-말단 서열 및 펩타이드 분획물을, 제조업자의 표준 프로그램을 사용하는 어플라이드 바이오시스템 473A 서열분석기(기체상 모드) 또는 494A 프로사이즈 HT 서열분석기(기체상 및 펄스된 액체 모드)에서 에드만 분해법으로 분석한다.
효소의 전체 서열은 서열 오버랩핑 및 EGC 효소의 부분 서열을 2개의 공지된 스트렙토마이세스 리파제의 아미노산 서열과 비교하여 결정한다.
4. 본 발명에 따른 에스테르 그룹 절단 효소를 사용하는 에스테르 그룹 함유 중합체의 분해
시험관중의 멸균 조건하에서, 정제된 효소 용액 1ml(20mM 인산 완충액(pH 7.1)중의 효소 25㎍)을 중합체 필름(d = 0.9cm)에 첨가한다. 시험관을 55℃에서 17시간동안 배양한다. 중합체 필름의 중량 손실은 효소 활성에 대한 평가 수단으로서 사용한다.
지방족-방향족 코폴리에스테르 BTA 40:60(산 성분중의 테레프탈산 40몰%) 및 BTA60:40(산 성분중의 테레프탈산 60몰%) 뿐만 아니라 하기의 폴리에스테르를 분해시킨다: 지방족 폴리에스테르 SP3:13(1,3-프로판디올 및 브라실산으로부터 합성함) 및 시판되는 에스테르 그룹 함유 중합체 바이어 Tir 1874(바이어 아게의 폴리에스테르아미드), 비오놀레(쇼와 하이폴리머의 지방족 폴리에스테르) 및 천연 세균성 폴리에스테르 P(3HB). P(3HB)에 있어서, 에스테르 그룹 절단 효소는 어떠한 식별 가능한 활성을 나타내지 않는다. 바이어 Tir 1874를 미리 완전하게 샘플을 취득한 시점에서 가용화시키고 나타나는 활성은 최소값이다. 결과는 도 4에 나타낸다.
5. 슈도모나스 종의 리파제를 사용한 본 발명에 따른 에스테르 절단 효소의 비교
BTA40:60 필름을 각각 생리학적 염화나트륨 용액(pH 7.0) 6ml에 도입하고 목적하는 효소(본 발명에 따른 에스테르 절단 효소 또는 SIGMA Chemical Co로부터 시판되는 슈도모나스 종의 리파제, EC3.1.1.3) 50㎍을 용액에 첨가한다. 목적하는 효소의 최적 온도에서 배치 배양한다. 분해 과정을, 0.1M NaOH를 사용하여 형성된 유리산을 적정함으로써 검색한다. 결과는 표 5에 나타낸다.
슈도모나스 종 리파제와 비교하여 본 발명에 따른 효소를 사용하는 경우 실질적으로 보다 높은 가수분해율을 수득할 수 있다.
6. 본 발명에 따른 에스테르 절단 효소를 사용하고 슈도모나스 종의 리파제를 사용하는 트리글리세라이드의 절단
에멀젼 용액 5ml(아라비아 고무 1.5g이 첨가된, 증류수 75ml 및 글리세롤(99.5%) 135ml의 혼합물중에 용해된 NaCl 4.475g, KH2PO40.103g, 용액을증류수 250ml로 채움) 및 증류수 4.5ml을 각각의 트리글리세라이드 0.5ml에 첨가한다.
효소 시험을 개시하기전에 기질 용액을 직접 첨가하고 13500 회전/분에서 1분동안 울트라투랙스(Ultraturrax)를 사용하여 균질화시킨다.
이어서 효소 용액을 기질 용액(기질 용액 6ml당 효소 20㎍)에 첨가하고 pH 값을 pH 7.1로 조정하며 0.1M NaOH를 사용하여 적정하여 에스테르 절단을 검색한다. 도 6은 지방산 성분중에 상이한 탄소원자수를 갖는 트리글라이세라이드에 대한 결과를 보여준다.
광범위한 지방산이 절단될 수 있다.
7. 본 발명에 따른 에스테르 절단 효소를 사용하고 슈도모나스 종의 리파제를 사용하는 프탈산 에스테르의 절단
시험 배치는 실시예 6에 상응한다. 상이한 알콜 성분을 갖는 프탈산 에스테르를 트리글리세라이드 대신에 사용한다. 슈도모나스 종 기원의 리파제가 단지 디메틸 및 디에틸 에스테르를 절단할 수 있는 반면에 본 발명에 따른 효소는 또한 보다 긴 쇄의 알콜을 갖는 에스테르를 가수분해시킨다. 가수분해율은 슈도모나스 종 리파제 보다 높다. 결과는 도 7에 나타낸다.
Claims (15)
- 유도인자의 부재 또는 존재하에 적합한 영양 배지에서 써모모노스포라 푸스카(Thermomonospora fusca) 미생물을 배양하여 수득할 수 있는 에스테르 그룹 절단 효소.
- 제1항에 있어서, 미생물이, 수탁번호 DSM 43793으로서 도이첸 삼룽 푸르 미크로오르가니즈멘[저먼 콜렉션 오브 마이크로오거니즘]에 기탁된 써모모노스포라 푸스카 균주인 에스테르 그룹 절단 효소.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 영양 배지로 부터 효소 함유 배양 상등액을 수득하여 당해 상등액을 임의로 농축시킨 다음 크로마토그래피, 특히 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 작용 크로마토그래피에 의해 효소를 정제하여 분리된 에스테르 그룹 절단 효소.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 27400d(SDS 겔 전기영동에 의해 측정됨) 또는 28200d(아미노산 서열을 기준으로 계산됨)이고 최적 온도/ 범위가 65℃(30 내지 80℃)이고 온도 안정성이 70℃/30분이고 최적 pH/범위가 6 내지 7(4- > 8)이고 등전점이 6.4인 파라미터를 특징으로 하는, 에스테르 그룹 절단 효소.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 아미노산 서열, 또는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실로부터 비롯되고 동일기능의 효소를 생성하는 돌연변이체에 의해 특징화되는 에스테르 그룹 절단 효소.ANPYERGPNP TDALLEASSG PFSVSEENVS RLSASGFGGGTIYYPREN NTYGAVAISP GYTGTEASIA WLGERIASHGFVVITIDTIT TLDQPDSRAE QLNAALNHMI NRASSTVRSRIDSSRLAVMG HSMGGGGTLR LASQRPDLKA AIPLTPWHLNKNWSSVTVPT LIIGADLDTI APVATHAKPF YNSLPSSISKAYLELDGATH FAPNIPNKII GKYSVAWLKR FVDNDTRYTQFLCPGPRDGL FGEVEEYRST CPF
- 제5항에 따른 에스테르 그룹 절단 효소의 아미노산 서열 또는 이러한 서열의 일부를 갖는 합성 펩타이드 또는 단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 절단 효소 또는 제6항에 따른 합성 펩타이드 또는 단백질에 대해 특이적으로 지시된 폴리클로날 항체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 절단 효소 또는 제6항에 따른 합성 펩타이드 또는 단백질에 대해 특이적으로 지시된 모노클로날 항체.
- 제8항에 따른 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 그룹 절단 효소 및/또는 제6항에 따른 합성 펩타이드 또는 단백질 및 임의로 추가의 효소, 안정화제, 적합한 표면활성 물질 및/또는 적합한 유기 용매를 포함하는 에스테르 그룹 절단 조성물.
- 제10항에 있어서, 추가의 효소가 하이드롤라제, 특히 에스터라제, 프로테아제, 퀴티나제, 리파제, 포스포리파제 또는 라이소포스포리파제인 에스테르 그룹 절단 조성물.
- 제11항에 있어서, 하이드롤라제가 슈도모나스 종(Pseudomonas sp), 리조무코르 미에헤이(Rizomucor miehei), 캔디다 실린드라세아(Candida cylindracea), 캔디다 안타르티카(Candida antartica), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum), 코마모나스 액시도보란스(Commamonas acidovorans), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus) 및 리조푸스 델라마르(Rhizopus delamar)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 기원하는 에스테르 그룹 절단 조성물.
- 저분자량 및/또는 거대분자의 합성 또는 천연 에스테르 그룹 함유 화합물을 분해시키기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 그룹 절단 효소, 제6항에 따른 합성 펩타이드 또는 단백질, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 그룹 절단 조성물의 용도.
- 제13항에 있어서, 에스테르 그룹 함유 거대분자 화합물이 지방족, 지환족, 지방족-방향족, 부분적인 방향족 또는 방향족 폴리에스테르 또는 코폴리에스테르, 폴리에스테르아미드, 폴리에스테르카보네이트 또는 폴리에스테르우레탄이고 이의 쇄가 연장될 수 있고 측쇄화되거나 가교결합될 수 있는 용도.
- 제14항에 있어서, 에스테르 그룹 함유 거대분자 화합물이 또 다른 기재와 공중합체, 혼합물 및 블렌드, 합성물, 라미네이트 또는 접착 결합물을 형성하는 용도.
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