KR20020035462A - 동결 융해된 배아로부터 유래한 인간 배아 간 세포로부터특정 세포 분화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동결보존된 인간 배아로부터 유래한 인간 배아 간 세포로부터 특정 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (a) 동결보존된 인간 포배기 배아를 융해하는 단계, (b) 상기 배아의 일부 또는 전부를 미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 배양하여 미분화된 인간 배아 간 세포를 확립하는 단계 및 (c) 상기 배아 간 세포를 염기성 배양 성분 및 1종 이상의 성장 인자를 포함하는 배양 배지 중에서 분화시키는 단계를 포함하는, 인간 배아 간 세포의 분화 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 수득한 배아 간 세포로부터 분화된 특정 세포는 의약의 개발, 질병의 치료, 이식 치료학 등에 널리 이용될 수 있다.

Description

동결 융해된 배아로부터 유래한 인간 배아 간 세포로부터 특정 세포 분화 방법{Method for Differentiation of Specific Cells from Human Embryonic Stem Cells Derived From Frozen-Thawed Embryo}

본 발명은 일반적으로 동결 융해된 인간 배아로부터 유래한 미분화된 인간 배아 간 세포(ES) 및 상기 미분화된 배아 간 세포를 배양하고 증식시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 동결 융해된 인간 배아로부터 유래한 미분화된 인간 배아 간 세포로부터 특정 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.

사실상, 간 세포는 미분화된 세포로 신경 세포로부터 근육 세포에 이르는 범위의 여러가지 기능의 성숙 세포로 분화할 수 있다. 배아 간 세포(이후 "ES"세포라 함)는 배아로부터 유도되고 사실상 다능성이다. ES 세포는 이들이 받는 자극 유형에 따라 특정 세포, 조직, 심지어 기관 유형으로 분화할 수 있다.

마우스 ES 세포의 발생은 1981년에 문헌{Evans et al.,Nature292 : 151-156; Martin,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.78:7634-7638}에 보고되었으며 마우스 기형암에 대한 연구와 연관되어 있었다. 기형암 연구는 1970년대에 광범위하게 발전하였으며, EC(배아 암종) 간 세포의 바탕 발생 능력과 연관하여 포유류 세포, 조직 및 기관 분화 연구에 대한 모델로서 EC 세포에 대한 연구에 이르게 되었다. 그러나, EC 세포는 종양성이며 이들은 여러 가지 조직 유형으로 분화할 수 있는 능력을 제한시키는 염색체 이상을 반드시 포함한다.

기형암은 포배 이식편으로 전위적(傳位的)으로 유도할 수 있으며, 다능성 세포주는 종양 대신에 포배로부터 직접 발생시킬 수 있는 것으로 가정되었다. 마우스 ES 세포의 발생이 각각 마틴(Martin) 및 에반스(Evans) 등에 의해 1981년도에 보고되었다. 이 결과는 모든 성인 조직 유형을 발생시킬 수 있는 것으로 일컬어지는 안정한 이배체 세포주였다. 또한 기형암은 마우스의 원시 생식 세포 및 원시 생식 세포의 전위성 이식으로부터 발생하는 것으로 보고되었다. 1992년에, 맷수이(Matsui) 등은 마우스 원시 생식 세포로부터 EG 세포(배아 생식 세포)의 획득을 보고하였다(Cell70:841-847). EG 세포는 ES 세포와 매우 유사한 발생 능력을 가진다. 쥐의 ES 세포는 어떠한 체액성 세포 유형으로도 분화할 수 있기 때문에, 특정 세포 또는 조직의 분화를 조절하는 기작을 연구하기 위해 마우스 ES 세포를 시험관내에서 사용할 수 있다. 마우스 ES 세포에 대한 연구는 포유류 세포 및 조직의 일반적인 분화에 대한 이해를 제공하지만, 영장류 및 마우스의 발생 및 특정 세포 계열에서의 차이 때문에 인간 발달 연구 모델로서의 마우스 ES 세포 사용은 제한되었다.

또한 다능성 세포주가 고환암으로부터 유도되었으며(Andrews et al., 1984,Lab. Invest.50:147-162), 시험관내에서 신경 및 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 인간 기형암으로부터 클로닝된 세포주의 유도가 보고되었다. 또한 모든 세 종류의 배아 생식 세포층의 대표적인 조직으로 분화할 수 있는 세포주가 발생하였다(Pera et al., 1988,Differentiation39:139-149). 인간 세포 발달에 대한 이러한 연구는 이들 유도체가 이수성이고, 체세포 조직으로의 자발적인 분화에 대해 제한된 능력을 가지며, 마우스 ES 또는 EC 세포의 표현형과 상이하다는 것을 보여준다.

붉은 털 원숭이 및 비단 원숭이의 포배로부터 영장류 ES 세포의 발생이 공개되었다(Thomson et al., 1995,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:7844-7844, 1996,Biol. Reprod.55:254-259). 이러한 영장류 세포주는 이배체이지만, 이들은 다른 점에서는 인간 EC 세포와 매우 닮았다. 원숭이 세포에 대한 이들 연구는 인간 EC 세포를 포함한 영장류에 대한 연구가 마우스 ES 세포와는 표현형에서 상이하고, 인간 포배로부터 유도할 수 있는 다능성 간 세포와 관련되어 있다는 것을 보여준다.

봉소(Bonso) 등은 시험관내에서 수정된 인간 배아로부터의 세포의 단기 배양및 유지를 보고하였다 (Human. Reprod.1994, 9:2110-2117). 분리된 세포는 다능성 간 세포로부터 예측되는 형태를 가지나, 이들 초기 연구는 영양 세포 지지체를 사용하지 않았으며, 또한 배양을 장기간 유지하는 것이 불가능하였다. 톰슨 등(1998,Science282:1145-1147)은 면역절제술로 영양외배엽을 제거하여 인간 포배로부터 ES 세포를 유도한 후, 마우스 배아 섬유아세포 영양 세포층(feeder cell layer) 위에 내부 세포괴를 깔고, 잠시 동안 부착 및 확장시키고, 형성된 외향생장물을 분해하고 다른 영양 세포층 상에 다시 깔았다. 생성된 세포의 표현형은 상기 페라(Pera) 등에 의해 보고된 인간 EC 세포와 유사하다.

영장류 ES 세포에 대한 톰슨 등의 연구는 이들 세포가 시험관내에서 체세포 분화능을 가진다는 어떠한 증거도 보여 주지 않았다. 시험관내 분화에 대한 유일한 증거는 인간 융모성 성선 자극호르몬 알파태아단백 생성과 같은 영양막 및 내배엽 형성의 특이적인 표지의 제한된 발현이다. 알파태아단백질을 생산하는 세포가배아밖 또는 배아 내배엽을 구성하는 것에 상당하다는 것을 실증하는 것은 곤란하다.

5 내지 9 주된 유산된 태아로부터 미분화된 원시 생식 세포를 배양하여 ES 세포를 확립하는 방법이 문헌에 기술되어 있다(Shamblott et al., 1998,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:13726). 그러나, 이 방법은 높은 품질의 ES 세포 또는 장기간 보존되고, 동결된 배아로부터 유래한 ES 세포를 특정 세포로 분화시키는 방법을 제공하지 못한다.

루비노프(Reubinoff) 등은 수정 후 6일이 지난, 비교적 신생 포배기의 배아로부터 유래한 ES 세포에 관한 논문을 발표하였다(2000,Nature18:399-404). 루비노프는 미분화된 인간 ES 세포의 증식 및 분화된 체세포를 생산할 수 있는 인간 ES 세포의 생산에 대해 보고하고 있다. 그러나, 이 방법은 장기간 보존된, 냉동 배아로부터 높은 품질의 ES 세포를 생산하는 효과적인 방법을 제공하지 못했다.

인간 EC 세포는 누드 마우스에서 다수의 배아 종양 계통의 유도체를 가진 기형암을 형성할 것이다. 그러나, 이들 인간 EC 세포의 분화 범위는 마우스 ES 세포로 얻어진 분화 범위와 비교했을 때 제한되어 있으며, 모든 유도된 EC 세포주는 이배수체이다(Andrew et al., 1987, 상기 참조). 반면에, ES 세포는 기형암 환경의 선택압 없이 시험관내에서 정상적인 배아 세포로부터 유도되었기 때문에, 더 큰 발생 잠재력을 가진다. 진정한 ES 세포는 (i) 미분화된 상태로 시험관내에서 무한 증식할 수 있어야 하며, (ii) 장기간 배양을 통해 정상 핵형을 유지해야 하며, (iii) 장기간 배양 후에도 세 종류의 모든 배아 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 유도체로 분화할 수 있는 잠재력을 유지해야 한다.

인간 ES 세포주가 초기 인간 발생의 연구를 용이하게 할 것이므로 인간 ES 세포의 생산을 허용하는 어떠한 방법이라도 바람직하고, 또한 이러한 인간 ES 세포주를 사용하여 이식, 생약학적 제품의 제조 및 생물학에 기초한 감지기의 개발을 위한 세포 배양법을 개발할 수 있을 것이다. 중요하게는, 대량의 인간 세포 생산 능력은 현재로는 인간이 아닌 공급원 또는 공여체로부터 얻어야 하는 인슐린 또는 VIII 인자와 같은 물질의 제조; 파킨슨씨 병과 같은 질환을 치료하기 위한 체내이식; 이식편으로 사용하기 위한 조직; 및 약품 및 독소의 스크리닝에 대한 중요한실용적인 응용성을 가진다.

본 발명의 목적은 상기한 바와 같은, 종래 기술에 의한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 수정 후 5 내지 6일된 인간의 포배기 배아를 동결하여 저장된 후, 일정 시간이 지나서 폐기 처분되어야 하는 인간 배아로부터 간 세포를 확립하는 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 동결시킨 후 융해시킨 인간 포배기 배아의 현미경 사진(X200),

도 2는 동결 융해된 인간 포배기 배아가 배양 후 재팽창된 상태의 현미경 사진(X200),

도 3은 프로나제 처리로 투명대가 제거된 인간 포배기 배아의 현미경 사진(X200),

도 4는 면역절제술에 의해 영양외배엽이 괴사된 상태의 인간 포배기 배아의 현미경 사진(X200),

도 5 및 6은 영양외배엽을 완전히 제거한 후 잔류 포배기 배아로부터의 내부세포괴(ICM) 의 현미경 사진(X200),

도 7은 ICM 세포를 STO 세포 상에 올려놓은 상태의 현미경 사진(X400),

도 8은 최초 플레이팅하고 7일 후에 형성한 ICM 콜로니의 현미경 사진 (X300),

도 9는 상기 도 8의 ICM 콜로니를 다시 플레이팅하고 13일 후에 형성한 ICM 콜로니의 현미경 사진(X80),

도 10은 기계적으로 분리하고 배양한 ICM 세포의 현미경 사진(X150),

도 11은 5주간 배양된 인간 ES 세포의 한 콜로니의 현미경 사진(X200),

도 12는 상기 도 11의 콜로니를 확대한 현미경 사진(X400),

도 13은 알칼라인 포스파타아제 활성 측정 결과 염색이 되지 않은 분화된 세포의 현미경 사진(X 80),

도 14는 알칼라인 포스파타아제 활성 측정 결과 염색이 된 인간 ES 세포의 현미경 사진(X300),

도 15는 심근 세포로 분화하고 있는 배아 간 세포 콜로니의 현미경 사진(X40),

도 16은 본 발명의 방법에 따른 심근 세포의 형성을 나타내는 현미경 사진(X60),

도 17은 본 발명의 방법에 따라 분화되어 박동 중인 심근 세포의 현미경 사진(X100),

도 18은 전형적인 뉴우런의 현미경 사진(X100),

도 19는 200kDa의 항-신경미세섬유 단백질로 염색된 신경 세포의 현미경 사진(X40),

도 20은 항-미세소관 결합 단백질 2로 염색된 신경 세포의 현미경 사진(X600),

도 21은 항-β튜불린으로 염색된 신경 세포의 현미경 사진(X600),

도 22는 전형적인 아교 세포의 현미경 사진(X100),

도 23은 항-신경교원섬유산 단백질로 염색된 아교 세포의 현미경 사진(X100)

도 24는 항-갈락토셀레브로시드(galactocelebrocide)로 염색된 아교 세포의 현미경 사진(X200),

도 25 및 도 26은 항-근육 액틴으로 염색된 근육 세포의 현미경 사진(X400),

도 27은 유배아체(embryoid body; EB) 및 ES 세포 콜로니에서의 Oct-4 발현 정도를 비교하기 위한 전기 영동의 결과,

도 28은 ES 세포와 분화된 ES 세포의 콜로니에서의 Oct-4b의 발현 수준을 비교하기 위한 전기 영동의 결과,

도 29는 본 발명의 방법에 따라 제조한 동결-융해시킨 인간 ES 세포의 현미경 사진(X60),

도 30은 중기 전개(spread),

도 31은 인간 ES 세포주의 핵형.

본 발명은 미분화된 인간 배아 간(이후 "ES"라고 함) 세포를 확립하는 방법 및 이들로부터 형성된 미분화된 인간 ES 세포주에 관한 것이다.

본 발명의 일면으로, 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 방법을 제공하며, 이 방법은 동결보존된 인간 배아를 융해하는 단계, 및 미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 배아의 일부 또는 전부를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 일면으로, ES 세포는 동결 융해된 인간 포배기 배아로부터 유래한다. 이 방법은 동결보존된 인간 포배 배아를 융해하는 단계 및 미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 상기 배아의 일부 또는 전부를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 방법을 제공하며, 이는 발생의 포배기 중의 동결 보존된 인간 배아의 개체군(population)을 획득하는 단계, 하나 이상의 배아를 융해하는 단계 및 미분화된 ES 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 융해된 각각의 배아의 일부 또는 전부를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 일면으로, 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 방법은 인간 난포액(이후 "hFF"라 함)을 포함하는 용액 중에서 동결보존된 인간 배아를 융해하는 단계 및 융해된 인간 배아를 hFF 및 동해방지제를 포함한 둘 이상의 용액 중에서 처리하는 연속 단계를 포함하는 방법이란 점에 특징이 있다.

본 발명의 다른 일면으로, 본 발명의 방법은 항 인간 림프구 항체를 사용하여 배아로부터 영양외배엽을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 바람직한 방법에서, 배아 부분은 내부 세포괴(이후 "ICM"이라 함)를 포함한다.

또한 본 발명은 항 인간 림프구 항체로 배아를 처리하는 단계를 포함하는 인간 포배 배아로부터 ICM을 분리하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, ICM을 분리하는 방법은 인간 포배기 배아를 추가로 포함하고, 이는 동결보존되고 융해된 것이다.

본 발명의 다른 일면에서, 인간 ES 세포를 분화시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 방법에서 얻어진 ES 세포를 성장 인자를 포함하는 배양 배지 중에서 분화시키는 단계를 포함한다.

이들 특징은 첨부된 도면과 함께 기술될 것이다.

본 발명은 동결 융해된 배아로부터 미분화된 인간 배아 간(ES) 세포를 확립하는 방법 및 이러한 세포로부터 형성된 미분화된 인간 ES 세포주를 제공한다. 특히, 본 발명은 동결 융해된 인간 포배기 배아로부터 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 방법을 제공한다.

추가로 본 발명은 인간 ES 세포를 특정 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

세포주로 유지될 수 있는 ES 세포 배양법의 개발은 이들 세포의 생화학적 및 세포적 특성과 이들의 세포적, 화학적 환경에서의 역동적인 상호작용에 관한 근본적인 의문에 대한 연구를 허용한다. 또한, 본 발명의 인간 ES 세포를 사용하여 유용한 조직 및 물질을 생산할 수 있다.

본 발명의 중요 특징은 동결 융해된 배아를 사용하는 것이다. 대부분의 선행 기술에서는 시험관내 수정(IVF)에서 얻은 신선한 수정란을 사용하였다. 일반적으로 불임 클리닉에서는, 수정란을 냉동시키고 추후에 다시 착상하기 위해 동결된 상태로 유지하므로, 연구목적으로의 이러한 수정란의 사용에 대해 부모로부터 동의를 얻기 어렵다. 그러나, 본 발명의 특징은 일정 기간 냉동된, 바람직하게는 착상하지 않고 수년간 동결 저장된 후 폐기될 수정란을 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명은 더 이상 필요없거나 또는 폐기될 동결된 수정란을 사용하기 때문에, 본 발명은 ES 세포 제조를 위해 많은 수의 수정란을 사용하는 것을 가능하게 한다. 또한, 폐기될 것이 아니더라도 부모의 동의를 얻어 동결된 수정란을 사용할 수 있다. 아울러, 불필요하거나 또는 폐기될 수정란을 사용할 수 있으므로, 윤리적인 문제를 회피하는 데 있어 큰 어려움 없이 보다 자유롭게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 가장 유익한 특징은 장기간 보존된 동결된 배아, 특히 불필요하거나 또는 폐기될 배아로부터 ES 세포를 성공적으로 유도하는 것이다.

본 발명의 다른 특징은 동결된 포배기 배아의 사용이다. 많은 수의 수정란(즉, 배아들)이 수정란 발생의 초기 단계, 특히 수정 후 약 2 내지 3일 이내의 배아 단계에서 사멸한다. 이 배아 발생 시기는 특히 일반적으로 난할 전기 및 상실배기를 포함한다. 따라서, 2-3일된 배아를 사용하는 경우 생존 배아의 수는 매우 제한되어 있다. 반면, 포배기 배아는 보다 생존성이 높다. 따라서, 포배기까지 배양된 동결된 배아로부터 ES 세포를 확립할 가능성은 본원에 인용 문헌으로 삽입된 톰슨의 미국 특허 제6200806호에서 기술된 것과 같은 포배기 배아까지 배양되지 않은 2 내지 3일된 수정란을 사용하는 것보다 훨씬 더 높다. 이렇게 함으로써, ES 세포를 확립하기 위한 시간 및 비용을 상당히 절약할 수 있다.

본 발명의 추가의 특징은 배아의 면역절제술에서 항 인간 림프구 항체를 사용하는 것이다. 본 발명의 발명자들은 항 인간 혈청 항체와 같이 흔히 사용되는 다른 항체에 비해, 항 인간 림프구 항체가 포배기 배아로부터 영양외배엽을 제거하는 데 보다 효과적이라는 것을 발견하였다.

정의

하기 용어는 달리 언급되지 않았다면 제시된 것과 같이 정의된다. 본원에서 사용된 다른 모든 용어는 달리 지시되지 않았다면, 관련된 특정 분야에 사용되는 의미와 관련하여 정의된다.

본원에서 정의된 "배아"란 용어는 수정 후 기관과 기관 시스템이 발생하기시작하는 임신후 3개월 개시 시점까지의 배아를 의미한다.

"포배 배아"란 용어는 외부 세포층, 액체 충전강 및 내부 세포괴를 가진 세포의 볼(ball) 또는 구로 구성된 착상 전의 배아를 지칭한다. 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자가 알 수 있듯이, 이러한 구는 이상적인 기하학적인 구일 필요는 없으나, 그 대신 세포의 구형 형태이어야 한다. 일반적으로, 포배 배아는 수정 후 약 5 내지 6일 경과한 기간의 배아일 것이다.

"내부 세포괴(ICM)"란 용어는 배아를 발생시키고, 영양외배엽을 제외한 배아 및 배아밖의 모든 조직을 잠재적으로 형성할 수 있는, 포유류 포배에서 발견되는 일군의 세포를 말한다. 일반적으로, 내부 세포괴는 인간 ES 세포가 유래하는 포배 안의 세포 집단일 것이다.

또한 본원에서 사용된 "세포"란 용어는 개별적인 세포, 세포주 또는 이러한 세포 또는 세포주로부터 유래한 배양 세포들을 의미한다. 본원에서 사용된 "세포주"란 용어는 시험관내 배양에서 유지되는 것과 같은 ES 세포 또는 ES 세포로부터 유래한 세포를 말한다. 일반적으로, 본 발명의 세포 또는 세포주 또는 본 발명의 방법에서 사용된 세포 또는 세포주는 인간 세포 또는 인간 세포주이다.

"인간 ES 세포"란 용어는 하기에서 정의된 것과 같은 다능성 표현형을 나타내는 인간 배아로부터 유래한 세포를 말한다.

"다능성"이란 용어는 분화된 세포 유형의 범위로 분화할 수 있는 발생 잠재력을 보유한 세포 또는 세포들을 말한다. 바람직하게는, 다능성 세포는 배아 생식층의 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세 종류 모두의 유도체로 분화할 수 있는 잠재력을 가진다.

"배지"란 용어는 미분화된 ES 세포를 유지할 수 있는 적합한 배지를 의미한다. 유사하게, "미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지"란 ES 세포가 증식할 수 있고, 정상적인 핵형을 유지할 수 있고, 다능성을 유지할 수 있는 조성물을 말한다. 다양한 이 같은 배지가 당해 업계에서 알려져 있고, 하기에서 기술된다.

"난포액"이란 용어는 난포 성장 중 생성되는, 혈장으로부터 영양분의 이동을 용이하게 하여 난자에 영양분을 공급하는 액체를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 난포액은 인간 난포액이다(이후 "hFF"라 함).

일면으로, 본 발명은 시험관내에서 증식할 수 있는 미분화된 인간 ES 세포 및 이러한 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 미분화된 ES 세포를 생산하는 방법은 동결보존된 인간 배아를 융해하는 단계 및 미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 상기 배아의 일부 또는 전부를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 융해 단계에서 사용하기에 바람직한 동결된 인간 배아는 포배기에서 동결보존된 배아이다. 시험관내 수정 후 약 5 내지 6일 후 동결보존된 포배기 배아가 가장 바람직하다. 본 발명에서는, 또한 수 년 이상 동결 저장된 인간 포배기 배아를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서 사용되는 인간 접합체(즉, 수정란 또는 배아)는, 시험관내 수정(인간 IVF-ET)가 수행된 후 4년 이상 보관된 후 일반적으로는 폐기되는 포배기 배아이다. 일반적으로, 불임 클리닉에서 여분의 접합체는 후속 착상을 위해 동결 보관된다. 그러나, 현재 많은 불임 클리닉의 정책은 부모로부터 추가의 착상 요구가 없거나 부모로부터 더 이상의 연락이 없을 경우, 일정기간 경과 후 극저온 보존되고 저장된 접합체를 폐기하는 것이다. 본 발명의 중요한 특징은 일정 기간 후 보통은 폐기되는 동결보존된 접합체를 이용하는 것이다. 더 이상 필요하지 않게 된 접합체를 폐기하는 시기는 정책 또는 불임 클리닉이 적용하는 내규에 의존한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 난포액을 포함한 용액 중에 동결보존된 인간 포배기 배아를 난포액, 바람직하게는 hFF 및 동해방지제를 포함한 제1 용액으로 처리하는 제1 단계; 제1 용액에 비해 낮은 농도의 동해 방지제를 포함한 제2 용액으로 동결 보존된 인간 포배 배아를 처리하는 후속 제2 단계에 의해, 동결보존된 인간 배아를 융해하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 제2 용액은 또한 난포액을 포함한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 약 5-6일된 포배기 배아를 난포액, 바람직하게는 hFF를 포함한 용액에 노출시키고, 이어서 배아가 손상되는 것을 막고 적당한 삼투압을 유지하기 위해 글리세롤 또는 수크로오즈와 같은 동해방지제를 포함한 용액에 노출시킨다. 바람직한 실시태양에서, 동해방지제 용액도 난포액, 바람직하게는 hff를 포함한다. 이후, 배아를 동결하고 액체 질소 중에서 극저온에 보존한다. 일정 기간 후, 바람직하게는 동결된 수정란을 수 년간 저장 후, 본 발명의 방법은 배아로부터 ES 세포를 확립하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법은 4년 이상 극저온 보존된 배아로부터 ES 세포를 확립하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 방법은 포배기 발생 중의 동결보존된 인간 배아의 개체군을 획득하는 단계; 하나 이상의 배아를 융해시키는 단계; 및 미분화된 ES 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 융해된 배아 각각의 일부 또는 전부를 배양하는 단계를 포함한다. 이 실시태양에서, 개체군이란 둘 이상의 배아, 특히 포배 단계에 있는 둘 이상의 배아의 집합을 말한다. 본원에서 개시된대로, 포배 배아는 발생 초기 단계의 배아보다 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 데 있어서 보다 높은 성공 가능성을 가진다. 따라서, 본 발명은 저장된 배아의 대부분 또는 전부, 바람직하게는 저장된 배아 전부가 포배기에 있는 방법에서 유용하다.

인간 배아의 융해시에, 배아를 보호하기 위해 동해방지제를 제거하여야 한다. 본 발명은 동해방지제의 농도를 여러 단계에서 감소시키고 또한 난포액을 처리하여 동결보존된 배아로부터 동해방지제를 효율적으로 제거하는 것을 가능하게 하는 방법이라는 것을 특징으로 한다. 바람직한 실시태양에서, 동해방지제를 제거하는 과정 전체를 통해 배아는 난포액 중에서 유지된다. 생존한 배아만을 세포 배양에서 배양시킨다. 이 단계는 종전에 존재하는 기술, 예를 들어 메네조 등의 방법(Menezo et al., 1995)을 변형한 개선된 것이며, 적절한 삼투압을 유지하는 반면, 동해방지제를 효율적으로 제거하여 높은 안정성을 획득한다.

동결된 수정란을 용해할 때, 여러가지 방법, 예를 들어 메네조에 의해 보고된 방법등을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명에 인용 문헌으로 삽입된 문헌[Menezo Y.J.R. et al., 1992,Human Reproduction7:101-106; Kaufnmann R et al., 1995,Fert. Steril.,64:1125-1129; Menezo Y.J.R. et al., 1996,Abstract ASRM 52nd Annual Meeting]에 보고되어 있다. 본 발명의 융해 방법은 처리 단계의횟수와 시간 측면에서 메네조 방법에 비해 매우 간단하고, 용이하고 효율적이다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 융해 방법은 5 단계와 17분이 필요한 반면, 메네조 방법은 7 단계와 최소 38분이 필요하다. 융해를 위한 처리 단계 및 시간의 감소는 시험관내 환경 노출로부터 불필요한 배아 손상을 방지한다.

본 발명에 따라, 서로 다른 농도의 동해방지제를 포함한 둘 이상의 용액을 사용하여 융해가 일어난다. 따라서, 융해 방법은 2 단계, 3 단계, 4 단계, 5 단계 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 융해 방법은 5 단계 이하를 요구할 것이다. 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자가 알 수 있듯이, 융해 방법에서의 단계 횟수는 융해된 배아의 목적 생존률에 따라 최적화될 수 있다. 또한 각 단계의 지속 시간은 목적 생존률에 따라 변화할 수 있으며, 짧은 시간(즉, 약 2분 미만)부터 장시간(약 10분 이상)에 걸쳐 변화할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 단계가 약 2 내지 10분간, 보다 바람직하게는 약 4 내지 6분간, 일반적으로는 약 5분간 지속될 것이다.

본 발명의 융해 방법에서 사용된 동해방지제는 동결 온도에서 물의 결정 형성을 억제하는 것으로 알려진 어떠한 화합물도 될 수 있으며, 특히 배아의 생존률을 심각하게 감소시키지 않는 화합물이다. "심각하게 감소시키는"것이란 30% 이상, 바람직하게는 20% 이상 생존률을 감소시키는 것을 의미한다. 이러한 동해방지제는 당해 업계에서 알려져 있으며, 수크로오즈, 포도당 등의 당류와 같은 다양한 화합물; 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리올; 및 에틸렌 글리콜, 메틸 펜탄디올, 글리세롤 등의 다양한 유기물을 포함한다. 사용된 동해방지제의 농도는 배아를 동결하는 데 사용된 방법에 일부 의존한다. 예를 들어, 느린 동결 방법이 수행되었다면, 상대적으로 적은 양의 동해방지제가 사용된다. 따라서, 배아를 융해시킬 때, 그에 따른 적은 양의 동해방지제가 일반적으로 사용될 것이다. 만약, 동결 방법이 상대적으로 많은 양의 동해방지제를 사용하였다면, 융해 방법에서 사용되는 동해방지제의 농도는 보다 클 것이다. 일반적으로, 동해방지제의 농도는 배아의 동결보존에서 사용된 동결 방법에 따라 약 10 내지 50%의 범위 내일 것이다. 본 발명에서는, 바람직하게는 융해 단계에서 사용된 동해방지제의 농도는 30% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하, 가장 바람직하게는 10% 이하일 것이다. 예를 들어, 글리세롤은 9%의 농도로, 수크로오즈는 0.4M(약 14%)로 사용될 수 있다.

일반적인 배아를 느리게 동결하는 방법 및 빠르게 동결하는 방법이 당해 업계에서 알려져 있다. 이들 방법은 문헌[Rall, W.F. and Fahy, G. M., 1985, Nature, 313:573-575; Gordts S. et al., 1990, Fertility Sterility 53(3):469-472;Fahning, M. L. and Garcia, M. A., 1992, Cryobiology, 29:1-18;Abbeel van den E. et al., 1997, Human Reproduction, 12(7):1554-1560]에 보고되어 있다. 따라서, 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자는 본 발명의 교시에 따라 당해 업계에서 알려진 방법을 변형하여 배아의 동결 및 융해의 개선된 방법, 및 미분화된 인간 ES 세포를 확립하는 개선된 방법에 도달할 수 있을 것이다.

연속 동해방지제 용액은 일반적으로 감소하는 양의 동해방지제를 가진다. 예를 들어, 글리세롤 함유 용액은 연속 용액 당 약 2%씩 농도가 감소할 수 있다. 수크로오즈 함유 용액은 연속 용액 당 약 0.2M(약 7%)씩 감소할 수 있다. 상기에서 언급한 예의 범위를 넘어서, 추가적인 어떠한 변화도 존재할 수 있고, 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.

또한 한 용액에서 다수의 동해방지제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 용액이 글리세롤 및 수크로오즈 모두를 포함할 수 있다. 일반적으로 동해방지제를 합한 농도는 약 30%를 넘지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 용액은 약 5% 글리세롤 및 약 0.4 M 수크로오즈를 포함한다. 연속 용액에서 오직 하나의 동해방지제, 둘 이상의 동해방지제 또는 모든 동해방지제의 농도가 감소할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 융해된 수정란 또는 배아의 융해시에 인간 난포액을 사용하는 것을 특징으로 한다. 난포액은 인간 배아 또는 수정란이 성장하도록 모든 필수적인 영양성분 및(또는) 환경 조건을 포함하고, 또한 배아가 생존하는 데 필요한 성장 및 억제 인자를 포함한다. 따라서, 융해 과정에서의 hFF의 사용은 배아의 후속 배양 단계, 예를 들어 ES 세포를 확립하기 위한 배아의 배양에서 배아 성존률의 향상이라는 이점을 제공한다.

바람직한 실시태양에서, 동결보존된 인간 배아를 융해하는 방법은 hFF 및 동해방지제를 포함한 둘 이상의 용액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 둘 이상의 용액은 약 15-25 부피%의 hFF를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 인간 배아의 융해는 각각 약 4-6 부피%의 글리세롤, 약 2-4 부피%의 글리세롤 및 약 0.1-2 부피%의 글리세롤과 추가로 각각 hFF를 포함하는 세 용액의 연속적인 사용을 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 연속적인 단계는 약 4-6분 동안 수행된다. 이후, 처리된 배아를 바람직하게는 15-25 부피%의 hFF를 포함하는 하나 이상의 용액으로 추가로 세척한다.

배아로부터 ES 세포를 형성하는 방법에서, 투명대 또는 이들의 일부를 제거하기 위해 융해된 인간 배아를 효소 분해한다. 포배로부터 투명대 또는 이들의 일부를 분해하기 위해 어떠한 단백질 효소라도 사용할 수 있다. 프로나제 및 산 타이로드(Tyrodes) 용액을 포함하여 당해 업계에서 이러한 분해 단계에 유용한 것으로 알려진 다양한 방법 및 효소를 사용할 수 있다. 바람직하게는 프로나제를 사용한다. 투명대를 분해하기 위해서, 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있는, 투명대를 제거하기에 충분한 시간 동안 프로나제를 사용한다. 투명대를 용해시키고 프로나제 독성을 제거하기 위해 효소 처리된 배아를 추가로 배양한다. 투명대 제거는 영양외배엽 및 내부세포괴(ICM)를 노출시킨다.

본 발명의 방법에 따라, 영양외배엽은 ICM으로부터 분리되고, 바람직하게는 면역절제술로 배아를 처리하는 과정에서 분리된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 신규한 면역절제술이 제공된다. 특히 항 인간 림프구 항체(이후"AHLS"라 함)의 사용은 영양외배엽을 제거하기 위한 본 발명의 다른 특징이다. 따라서, 동결 융해된 포배기 배아로부터 인간 ES 세포를 효과적으로 확립하기 위해, 면역절제술 과정에서 AHLS를 사용할 수 있다.

본 발명 이전에는 영양외배엽을 제거하기 위해 일반적으로 항 인간 혈청 항체를 사용하였다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 항 인간 혈청 항체로는 ICM으로부터 영양외배엽을 완전히 제거할 수 없다는 것을 인식하였다. ICM으로부터 미분화된 ES 세포의 확립은 ICM으로부터 영양외배엽의 완전한 제거에 크게 의존한다.따라서, 본 발명의 방법에 따른 AHLS의 사용은 ICM으로부터 미분화된 ES 세포를 확립하는 효율을 증가시킨다.

이론에 의해 제한되기를 원치 않지만, AHLS는 림프구의 특성에 근거하여 항 인간 혈청 항체보다 보다 효과적인 것으로 생각된다. 림프구는 특정 항원과만 반응하도록 사전 예정되어 있는 항원 특이성을 가진 세포이다. 림프구는 배아 세포와 유사한 부착 비의존성 세포 특징을 가진다. 따라서, 두 세포형은 유사한 세포 표면 항원을 가진다. 유사한 특성을 가진 AHLS을 사용하여, 배아에 대해 높은 항원-항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 AHLS를 사용하여 영양외배엽을 분해하는 별개의 방법을 제시하고, 이는 다른 사용 가능한 항체보다 면역절제술에서 영양외배엽을 분해하는 데 보다 효과적인 것으로 발혀졌다. 따라서, 본 발명에서 내부 세포괴(ICM)를 선택적으로 얻기 위해서 면역절제술을 위한 AHLS를 특별히 고안하였다.

당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자들이 알 수 있듯이, AHLS는 마우스, 래트 및 항체를 생산하는 것으로 알려진 다른 동물을 포함한 다양한 동물로부터 얻을 수 있으며, 이에 대해 목적하는 항체를 획득하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, AHLS를 인간 혈액으로부터 분리하고, 면역 보강제 또는 프로인트(Freund's) 보강제와 혼합된 인간 림프구를 토끼에 주사하여 얻을 수 있다. 인간 림프구가 항원으로 사용된다는 것 외에는, 관련된 산업계에서 사용 가능한 일반적인 방법을 사용하여 토끼로부터 목적하는 항체를 얻을 수 있다.

면역절제술 이전에, AHLS의 가열에 의한 보체 불활성화가 바람직하다. 보체불활성화된 AHLS의 노출이 배아의 급속한 파열을 제공한다. 혈청 불활성화 프로토콜에서 추천되는 온도는 약 45℃ 내지 약 62℃의 범위이고, 시간은 약 15 내지 약 60분 범위이다. 가장 흔히 사용되는 방법은 혈청을 약 56℃에서 약 30분 동안 처리하는 것이다. 면역절제술에서 항체 및 보체의 적절한 처리 농도 및 시간이 ES 세포를 확립하는 데 있어서 매우 중요하다. 통상적인 면역절제술에서는, 일반적으로 약 10% 농도의 항체 및 약 20% 농도의 보체가 사용되지만, 본 발명에서는, 바람직하게는 약 2-5% 농도의 항체를 약 30분 내지 1 시간 동안 처리할 수 있고, 약 5 내지 12% 농도의 보체를 약 40-60초 동안 처리할 수 있다.

따라서, ES 세포를 확립하는 단계는 융해된 배아에서 투명대의 제거 및 면역절제술을 포함한다. 투명대를 제거하기 위해 융해된 배아를 프로나제로 처리하고, 이어서 프로나제 독성을 제거하기 위해 일정 시간 동안 배양한다. 그 후, 항원-항체 반응을 유도하기 위해 배양물을 AHLS에 노출시키고, 영양외배엽을 완전히 분해하기 위해 보체로 추가 처리한다. 보체는 전체 혈청에서 얻었으며, 그 유형이 중요하다. 일반적으로, 토끼 혈청은 독성이 있을 수 있으므로 선호되지 않으며, 기니아 피그 혈청 또는 래트 혈청이 보다 선호된다. 보체 처리 후의 ICM의 생존률에 따라 당해 업계에서 숙련된 기술을 가진 자는 다른 보체를 사용할 수 있다.

따라서, 인간 ES 세포를 확립하기 위한 본 방법의 하나의 실시태양은 배아의 ICM을 얻기 위해 AHLS를 사용하여 배아 또는 그 일부의 영양외배엽을 제거하기 위해 처리하는 단계 및 미분화된 ES 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 ICM의 최소 일부를 배양하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 상기에서 언급된 AHLS 면역절제술 방법에 따라 ICM을 분리하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, ICM을 분리하는 방법은 동결보존되고 융해된 인간 포배기 배아를 추가로 포함한다.

또한 본 발명의 방법은 상기에서 언급된 본 발명의 AHLS 면역절제술 방법을 사용하여 형성된 인간 포배의 분리된 ICM을 포함한다.

ICM의 배양은 섬유아세포 영양 세포층 상에서의 ICM 배양을 포함한, 당해 업계에서 알려진 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 배양물로부터 ES 세포를 분리하기 위해, 배양 조건은 분화를 유도하지 않아야 하고, 세포를 증식 상태로 유지여야 한다. 이러한 목적을 위해, 여러가지 분화 억제 인자를 추가적으로 첨가해야 한다. 예를 들어, ES 세포를 다능성 간 세포로 유지하는 것을 돕기 위해 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포를 ES 세포 배양을 위한 영양층으로 사용할 수 있다. MEF 영양 세포에 의한 ES 세포의 분화 억제는 백혈병 억제 인자(LIF)(Williams et al., 1988)의 생산에 의한 것으로 보인다. MEF 세포는 마우스 배아(14일 내지 16일된 배아)로부터 직접 분리되거나 또는 미리 제조된 제품(STO 세포)으로 공급될 수 있다. 추가적으로, ICM을 배양하기 위해 STO 세포 외에 LIF를 첨가하는 것이 바람직하다. STO 세포(#CRL-1503)은 ATCC(American Type Culture Coollection, U.S.A.)으로부터 구입할 수 있다. STO 세포는 이틀마다 계대 배양한다. 영양 세포의 체세포 분열을 불활성화하기 위해서 마이토마이신-C로 처리한 후 회수된 세포를 드롭(drop)으로 제조하는 것이 바람직하다.

분리된 ICM은 플레이트되고, 인간 간 세포에 적합한 배양 조건 중에서 성장할 수 있다. 시험관내에서의 증식은 장기간의 세포 배양을 포함할 수 있다. 세포는 미분화된 상태에서 실질적으로 유지된다. 바람직하게는, 세포는 세포 사멸 또는 배자밖 분화를 유도하지 않는 조건하에서 유지된다. 또한 바람직하게는, 이들은 바람직하게는 분화시키지 않는 조건하에서 섬유아세포 영양층 상에서 배양되었을 때, 미분화된 상태를 유지할 수 있다. ES 세포를 유지하는 것으로 당해 업계에서 알려진 어떠한 배지라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 미분화된 ES 세포를 유지하기 위한 바람직한 배지는 20% 우태아 혈청(FBS), 1mM 글루타민, 0.1mM β-멀캅토에탄올, 1% 리보뉴클레오사이드, 1% 비필수 아미노산 및 0.1% 인간 LIF(2000 units/ml)이 보충된 80% 둘베코 개질된 이글스 배지(DMEM, 피부르산 나트륨 무첨가, 고농도의 포도당 제제)로 구성된다. 최초 플레이팅 후 7 내지 10일 후에, ICM 유도된 외향성장을 기계적으로 분리하고 신선한 영양세포층에 다시 플레이트하였다. 생성된 확대된 콜로니를 약 7일마다 기계적으로 분리하고, 50-100 세포 수의 덩어리로 잘라내었다.

바람직한 실시태양에서, 분화 조건에 노출하였을 때, 세포는 시험관내에서 분화할 수 있는 능력을 가진다. 가장 바람직하게는, 세포는 시험관내에서 넓은 범위의 체세포계로 분화할 수 있는 능력을 가진다.

미분화된 ES 세포는 특징적인 형태 관찰에 의해 확인할 수 있다. 이러한 특징의 확인은 당해 업계에서 알려진 다양한 방법에 의해서도 가능하다. 현미경을 이용한 형태의 검사 또는 알칼라인 포스파타제 활성 측정과 같은 방법을 사용할 수 있다. ES 세포의 형태학적 특징이 당해 업계에 잘 공지되어 있으며 제임스 톰슨등에 의한 논문(Science, 282:1145-1147), 루비노프 등에 의한 논문(Nature, 18:399-404) 및 기어하트 등의 국제 특허 출원 공개 제WO 98/43679호를 참고할 수 있다. 톰슨 및 기어하트 등은 우수한 영장류 ES 세포주는 정상적인 핵형 및 높은 수준의 세포내 알칼라인 포스파타제(AP), 및 다능성 간 세포에 특징적이나 특이적이지는 않은 특정 세포 표면 당지질 및 당단백질의 제시와 같은 여러가지 형태학적 특징을 가진다고 보고하고 있다. 다른 중요한 특징은 다세포 콜로니로서의 성장, 정상적이고 안정한 핵형, 연속적으로 계대될 수 있는 능력 및 세 가지 종류 모두의 배아 생식 세포층으로부터 유래한 세포로 분화할 수 있는 능력을 포함한다. "정상적인 핵형"이란 중기의 염색체의 수, 크기 및 형태면에서 세포의 염색체 구성이 그 종에서 정상적인 특징을 가진 것을 의미한다.

보다 정확한 ES 세포의 확인을 위해, 형태학적 연구와 함께 알칼라인 포스파타제 활성을 측정하는 것이 보다 바람직하다. 이 방법은 염색 정도를 관찰함으로써 ES 세포를 확인하는 것을 가능하게 한다. 미분화된 ES 세포만이 염색되고 분화된 세포는 염색되지 않는다. 도 13은 염색되지 않은 분화된 세포를 보여주고, 도 14는 염색된 ES 세포를 보여준다.

Oct-4의 상이한 발현을 미분화된 ES 세포와 분화된 세포를 확인하는 데 사용할 수 있다. Oct-4는 초기 배아와 생식선 및 배아 간 세포에서 특정적으로 강하게 발현되며, 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 Oct-4a 및 Oct-4b로 존재한다. ES 세포에서는 Oct-4b가 Oct-4a보다 강하게 발현된다(도 27). 아울러, Oct-4b는 ES 세포 콜로니에서는 발현되지만(B, C 및 D; 레인 4 내지 11)(도27), 유배아체(EB)(A; 레인 1 내지 3)(도 27) 또는 분화된 콜로니(도 28)에서는 발현되지 않는다. 도 27은 유배아체(EB) 및 ES 세포 콜로니에서의 Oct-4의 상이한 발현 수준을 나타내는 전기영동 결과를 보여준다. 도 27의 레인 A는 유배아체를 나타내고, 레인 B 내지 D는 ES 세포를 나타낸다. 도 28은 ES 세포(S1, S2)와 분화된 ES 콜로니(D1, D2)에서의 Oct-4의 상이한 발현 수준을 나타내는 전기 영동 결과를 보여준다. 도 28에서 도시된 바와 같이, Oct-4b는 분화된 ES 세포에서는 발현되지 않으나, Oct-4b는 미분화된 ES 세포에서 발현된다. 따라서, Oct-4의 발현은 미분화된 ES 세포의 존재를 나타내는 강력한 표지가 될 것이다.

ES 세포의 특정 세포로의 분화는 다양한 방법에 의해 유도될 수 있다. 시험관내 ES 세포의 분화는 STO 영양세포 및 LIF가 존재하지 않는 현탁 배지 중에서 세포가 응집할 수 있게 되었을 때 일어난다. ES 세포의 응집체는 심근 세포, 뉴우런 및 다른 세포를 포함한 다양한 세포 유형을 포함한 유배아체로 더 분화한다. 또한, 영양세포층을 교체하지 않고 고농도로 장시간 성장시킨 ES 세포는 다양한 유형의 분화된 세포가 발견되는 응집체 및 소포성 구조를 형성한다. 성장 인자가 없을 때, 세포는 자발적으로 많은 다양한 유형의 콜로니로 자발적으로 분화할 수 있는 반면, 성장 인자의 첨가는 보다 성숙한 세포 형태를 생산할 수 있다. 성장 인자로 처리된 배양물은 보다 균일하고, 배양물의 절반 이상이 하나 또는 두 종류의 세포 유형을 포함할 수 있다(액티비딘-A 처리된 세포에서 근육 유사 신시티움(syncitiums), RA 처리된 배양물에서 뉴우런 유사 세포, 및 BMP-4 처리된 배양물에서 섬유아세포 유사 세포 등). 또한, 다능성 간 세포는 넓은 범위의 성장인자 수용체를 발현하고, 특정 인자에 의해 시험관내에서 다수의 인간 세포 유형을 농후화시킬 수 있다(Shuldiner et al., 2000)

추후 사용을 위한 세포의 연속 저장을 허용하므로 ES 세포의 효과적인 보존이 매우 중요하다. 세포주의 동결보존을 위해 흔히 사용되는 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 배아의 동결보존에 효율적인 방법이 이 목적을 위해 가장 적절하다. 본 발명에 따라, 10% DMSO를 첨가한 ES 배양 배지를 사용하여 콜로니를 초급속 냉동시킬 수 있다. 한 실시태양에서, 세포 내의 얼음 결정의 형성을 방지하게 위해서, 세포를 서서히 냉각시켜야 한다는 점이 중요할 수 있다. 예를 들어, 세포를 -20℃에서 1시간 동안 동결한 후, 밤새 -70℃ 영역으로 이동한 후, 다음 날, 이들을 액체 질소로 이동시킬 수 있다.

최근 생물학 및 의약 분야에서의 간 세포의 잠재적인 응용성에 대해 많은 관심이 주어져 왔다. 다능성 및 불멸성이 ES 세포에 특이적이며, 이러한 특성이 연구자들이 인간 생물학 및 의약에서의 많은 문제점들에 대해 접근하는 것을 최초로 가능하게 하였다. ES 세포는 잠재적으로 이식 과정에서의 사용을 위한 공여 조직의 부족, 특히 요구되는 수임간세포(committed stem cell)의 성장을 지지할 수 있는 대체 배양 시스템 부재의 문제를 처리할 수 있다. ES 세포는 인간 의약품, 발생학 연구, 기능 유전학, 신규 성장 인자의 확인 및 신약 발견 및 독성학과 같은 분야에서 매우 넓은 범위의 응용성을 가진다.

본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 상세히 기술될 것이고, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않았다.

세포, 조성물, 시약, 방법 또는 용도는 당연히 변화 가능하므로 본 발명은 기술된 세포, 조성물, 시약, 방법 또는 용도에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시태양만을 기술하기 위한 것이며, 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않았다. 명세서 전체를 통해, 제시한 바람직한 실시태양 및 실시예는 본 발명을 제한하는 것이라기보다는 실시예로서만 생각되어야 한다. 이들 모두는, 본 개시의 이점을 유지한 후, 당해 기술 분야에서 숙련된 기술을 가진 자들에게 명백할 것이다.

실시예

실시예 1:포배기 배아의 동결보존

마리아 병원의 인간 시험관 아기 프로그램으로부터 생산된 여분의 5 내지 6일된 포배기의 배아를 20% 인간 난포액(hFF)이 함유된 용액에 10분간 노출시킨 후, 20% hFF와 5 부피% 글리세롤을 함유한 용액으로 다시 10분간 처리하였다. 그 후, 20% hFF, 9 부피% 글리세롤 및 0.2M 수크로오즈를 함유한 용액으로 배아를 10분간 처리하였다. 프로그램화된 생물학적 동결기(Planar Kryo: T.S. Scientific, Perkasie, PA)를 사용하여 -1℃/분의 속도로 22℃에서 -7℃까지 프로그램화된 동결 곡선을 선정하였다. 30초 지연시킨 후, 손으로 시딩(seeding)하였다. 시딩 후, 배아를 -0.3℃/분의 속도로 -7℃에서 -40℃로 서서히 냉각하였다. 이후, 액체 질소에 침지하였다.

실시예 2: 동결된 포배기 배아의 융해

상기와 같이 처리되고 4년 이상 동결보존된 동결 배아를 융해한 후, 융해된배아를 20% hFF, 5 부피% 글리세롤 및 0.4M 수크로오즈를 함유한 용액으로 처리한 후, 20% hFF, 3 부피% 글리세롤 및 0.2M 수크로오즈를 함유한 용액으로 5분간 처리하였다. 그 후에 다시 20% hFF, 1 부피% 글리세롤 및 0.2M 수크로오즈를 함유한 용액으로 5분간 처리한 후, 20% hFF 및 0.2M 수크로오즈를 함유한 용액에 2분간 노출시켰다. 이후, 배아를 20% hFF를 함유한 용액으로 5분간 처리한 후(도 1), 생존한 배아를 배양 배지에서 24시간 배양하였다(도 2).

실시예 3: 토끼의 항-인간 림프구 항체(AHLS)의 제조

연구용 등급의 피콜 플라크(Ficoll plaque)(에머샴 파마시아 바이오텍 아베사(Amersham Pharmacia Biotech AB)) 처리로부터 회수한 인간 림프구(>4 ×10⁸세포)를 RIBI 보강제(R-700, RIBI 임뮤노켐 리서치(Immunochem Research, Inc.)로부터 구입) 또는 프로인트 보강제와 혼합하고, 토끼에 이를 2주 간격으로 총 4회 주사하였다. 마지막 주사일로부터 10일이 지난 후에 토끼의 심장으로부터 혈액에 둘러싸인 AHLS를 회수하였다.

실시예 4: 면역절제술을 이용한 ICM의 분리

면역절제술 이전에, AHLS를 56℃에서 30분간 가열 보체 불활성화하였다. 보체를 아가로즈로 흡수하고, -70℃에서 보존하여 사용 직전에 융해시켰다. 세포부에 작용하는 보체는 항원-항체 반응을 유도하여 작용을 차단하였다. 5% 농도의 항체를 30분간 처리하고, 10% 농도의 보체를 40-60초간 처리하였다. 0.25% 프로나제를 포함한 TL-헤페스(TL-Hepes) 용액으로 투명대를 분해한 후(도 3), 5% 토끼의항-인간 림프구 항체(AHLS)에 15분간 노출시키고, 10% 기니아 피그 보체에 1 내지 2분간 노출시켜서 ICM을 분리하였다(도 4).

실시예 5: STO 세포의 준비

내부 세포괴와 공동 배양하기 위해서 STO 세포(마우스 배아 섬유아세포, ATCC)를 준비하였다. 동결된 STO 세포를 20초간 공기에 노출시키고, 세포가 완전히 융해될 때까지 따뜻한 물(36.5℃)에 넣었다. 9ml의 따뜻한 HBSS 또는 STO 배양 배지를 첨가하고 혼합하였다. 1000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 침전물을 10% FBS가 첨가된 3ml의 따뜻한 DMEM(둘베코스 개질된 이글스 배지) 중에 재현탁하고 25-T 배양 플라스크에서 배양하였다. 생성된 배양물을 2일에 한 번씩 계대 배양하였다.

실시예 6: 분리된 STO 세포로부터 영양 드롭(feeder drop) 세포의 제조

배양 플라스크에서 STO 세포의 컨플루언스(confluence)를 확인한 후, PBS 용액으로 세척하고, 10㎍/ml의 마이토마이신 C가 첨가된 DMEM으로 약 2시간 30분간 처리한 후, PBS 용액으로 3회 세척하고, 이어서 1X 트립신-EDTA으로 처리하였다. 생성된 세포를 따뜻한 5ml의 HBSS 용액으로 세척시키고 1000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물을 5ml의 HBSS 용액에 재현탁하였다. 이 용액을 다시 1000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 침전물을 1ml의 DMEM-LIF 용액에 재현탁하였다. 그 후, 세포의 일부를 트립판 블루(trypan blue)(1:1) 및 헤마토사이토미터 계수 챔버를 이용하여 세포를 계수하고, 나머지 세포를 재현탁한 후 배양 플레이트에 접종(250,000 세포/ml)하였다.

실시예 7: ICM 세포의 배양 및 계대 배양

분리된 ICM 세포를 마이크로 피펫을 이용하여 STO 세포 영양층 위에 깔고(도 7), 2000 유닛/ml의 LIF를 함유한 신선한 DMEM 용액으로 매일 교체하면서 연속 배양하였다. 형성된 ICM 덩어리는 새로운 STO 영양층 위에 다시 깔아서 연속 배양하였다. ICM 덩어리를 기계적으로 분리하여 여러 하부 콜로니로 나누고, 약 7일에 한 번 정도 새로운 STO 영양층 상에서 배양하였다.

실시예 8: ES 세포의 특성 확인

제임스 에이 톰슨 등(1998, Science 282:1145-1147) 및 벤자민 루비노프 등(2000, Nature 18:399-404)에 의해 공개된 방법에 따라, 현미경을 이용한 형태학적 관찰을 통해 ES 세포를 확인하였다. 또한 ES 세포를 4%의 포름알데히드로 15분간 고정시키고 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 시그마사(Sigma, St.Louis, MO)로부터 구입한 Fast Red TR/Naphtol AS-MX 용액을 이용하여 15 내지 30분간 염색한 후, 그 염색 정도를 관찰하였다.

별법으로, 대부분 간 세포로 구성된 콜로니에 대해 RT-PCR을 수행하여 Oct-4의 발현을 측정하였다. mRNA를 전체 세포 추출 과정을 통해 분리하고, 역전사에 의해 cDNA 합성을 수행하였다. PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머는 5'-CCACATCGGCCTGTGTATAT-3' (Oct-4a 및 Oct-4b에 대한 안티센스 프라이머) 및 5'-CTCCTGGAGGGCCAGGAATC-3' (Oct-4a에 대한 센스 프라이머), 5'-ATGCATGAGTCAGTGAACAG-3' (Oct-4b에 대한 센스 프라이머)이다. PCR 증폭은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분씩 35회 실시하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화한 후, 이미지 분석기(Biorad)로 조사하였다. 이 방법으로 Oct-4a 및 Oct-4b의 발현 정도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 1에 정리하였다.

융해된 포배기 배아의 수	6
융해 후 생존한 포배기 배아의 수	5
면역절제술의 대상이 된 포배기 배아의 수	4
배지에 플레이팅된 ICM의 수	4
배지에 부착된 ICM의 수	2
ICM으로부터 형성된 콜로니의 수	2
5-6회 계대 배양 후 형성된 콜로니의 수	2

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 면역절제술에 이용될 수 있는 4개의 포배기 배아를 얻었고, 4 개의 ICM으로부터 2개의 콜로니가 형성되었다. 이 2개의 콜로니를 여러 개의 하부 콜로니로 나누었으며, 대부분의 ICM은 5 내지 6회 계대 배양되는 동안(면역절제술 후 45 내지 50일) 분화되지 않고 계속 증식하였다. 아울러, 동결 융해된 인간 배아로부터 유래한 세포 배양물의 핵형을 조사하였다. 염색체 분석을 위해, 10 내지 15 세대의 인간 ES 콜로니를 STO 영양층 없이 3 내지 5일간 접시에서 배양하였다. 5%의 콜세미드를 처리하고 수집된 세포를 표준 G-밴드 기술로 염색하였다. 중기 전개(spread) 및 핵형을 사이토비젼 프로그램(어플라이드 이미지사(Applied Imaging Co. 도 30 및 31)으로 조사하였다. 또한 알카라인 포스파타제 활성을 측정하였다. 알칼라인 포스파타제 활성은 분화된 콜로니에서는 검출되지 않았으나(도 13), 미분화된 콜로니에서는 강력한 포스파타제 활성이 있었다(도 14). 아울러, Oct-4의 발현은 Oct-4b가 ES 세포에서 발현되지만 분화된 세포 유형인 유배아체 및 분화된 콜로니에서는 발현되지 않음을 확인하였다(도 27 및28).

실시예 9: 인간 ES 세포의 특정 세포로의 분화

상기에서 배아 간 세포로 확인된 세포에, 분화를 유도하기 위해서 성장 인자 및 기본적인 배양 배지(L-글루타민, 비필수 아미노산 및 20% FBS)를 첨가하였다. 심근 세포로 분화시키기 위해, 분화 과정 중에 있는 콜로니에 1μM의 레티노산(RA)를 첨가하였다. 그 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다. 신경 세포로의 분화를 유도하기 위해서, 유배아체 또는 분화 과정 중에 있는 콜로니에 1μM의 레티노산(RA), 10ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장인자(b-FGF), 100ng/ml의 신경 성장인자(NGF)를 첨가하였다. 배양액은 매일 교체해 주었다. 또한 근육 세포로의 분화를 상기 심근 세포로의 분화 조건에서 확인하였다.

실시예 10: 특정 세포로의 분화 확인

ES 세포로부터 특정 세포로의 분화는 1차적으로 이들의 특징적인 형태적 특성으로 확인되었다. 심근 세포로 분화하는 경우에, 도 17에 나타난 바와 같이, 규칙적인 심박수(routine heart-beat)를 보이는 형태적 특징이 관찰되었다. 추가적으로, 분화된 세포를 면역세포화학적 방법으로 확인하였다. 신경 세포임을 확인하기 위해, 특정 모노클로날 항체를 사용하여 200kDa의 신경미세섬유 단백질(NF200)(Sigma), 미세소관 결합 단백질 2(MAP2) (Sigma) 및 β-튜불린 (Sigma)을 검출하였다. 이 결과를 도 19 내지 도 21에 나타내었다. 또한 아교 세포를 확인하기 위해서, 폴리클로날 항체를 이용하여 신경교원섬유산 단백질(GFAP) 및 갈락토셀레브로시드(GalC)를 검출하였다. 그 결과를 도 22 내지 도 24에 나타내었다. 근육 세포는 근육 액틴(Sigma)에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체로 확인하였다(도 25 및 도 26). 각각의 항체에 대한 반응 정도를 확인하기 위해서, FITC가 붙은 2차 항체를 준비하였다. 염색을 위한 전과정은 4℃에서 실행하였다. 이 방법은 루비노프 등의 방법에 근거하였다.

실시예 11: 인간 ES 세포의 동결보존 및 융해

인간 ES 세포의 장기간 저장이 가능한지 확인하기 위하여 동결보존을 시도하였다. ES 세포 배지에 10% DMSO를 첨가하여 ES 세포의 동결보존을 위한 동해방지제를 제조하고 여과 후 사용하였다. 동해방지제의 독성을 감소시키기 위해, ES 세포의 콜로니를 동해방지제가 들어있는 동결 튜브에 직접 도입하고, -20℃에서 2시간 동안 놓았다. 그후, 동결된 세포를 -70℃에서 10개월간 저장하였다.

동결 튜브를 36℃ 수조에서 완전히 융해시키고, 튜브 안의 내용물을 ES 배양 배지에 넣어 동해방지제를 제거하였다. 분리된 ES 세포 덩어리를 재빨리 배양 용기에 놓고, 생존도를 조사하였다. 본 발명에 의해 제조된 ES 세포는 동결 융해 후에도 생존할 수 있는 것으로 나타났다. 도 29는 이 결과를 보여준다.

비록 본 발명이 상기와 같이 기술되었으나, 당해 기술 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에게 본 개시의 유리한 점을 유지하면서도 다수의 다른 변형 및 개질이 가능하다는 것이 명백할 것이다. 이러한 모든 변형 및 개질은 본 발명의 범위 및 정신의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.

본 발명에 의하여 수득한 배아 간 세포로부터 분화된 특정 세포는 의약의 개발, 질병의 치료, 이식 치료학 등에 널리 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. (a) 동결보존된 인간 포배기 배아를 융해하는 단계,

   (b) 상기 배아의 일부 또는 전부를 미분화된 배아 간 세포를 유지할 수 있는 배지 상에서 배양하여 미분화된 인간 배아 간 세포를 확립하는 단계 및

   (c) 상기 배아 간 세포를 염기성 배양 성분 및 1종 이상의 성장 인자를 포함하는 배양 배지 중에서 분화시키는 단계

   를 포함하는, 인간 배아 간 세포의 분화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 분화된 세포가 심근 세포인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 분화된 세포가 근육 세포인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 분화된 세포가 신경 세포인 방법.
5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 분화된 세포.