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KR20020031392A - 접합체, 이의 제조방법 및 분자를 생물학적 막을 통해수송하기 위한 이의 용도 - Google Patents

접합체, 이의 제조방법 및 분자를 생물학적 막을 통해수송하기 위한 이의 용도 Download PDF

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KR20020031392A
KR20020031392A KR1020027001122A KR20027001122A KR20020031392A KR 20020031392 A KR20020031392 A KR 20020031392A KR 1020027001122 A KR1020027001122 A KR 1020027001122A KR 20027001122 A KR20027001122 A KR 20027001122A KR 20020031392 A KR20020031392 A KR 20020031392A
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그라이너베아테
운거에버하르트
고테기슬린데
슈베르델마르크
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로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트
아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 접합체, 이의 제조방법 및 저분자량 화합물 및 거대분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한, 특히 분자를 세포내로 수송하기 위한 상기 접합체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 접합체가 존재하거나 도입된 의약, 진단제 및 시험 키트에 관한 것이다.

Description

접합체, 이의 제조방법 및 분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한 이의 용도{Conjugates and methods for the production thereof, and their use for transporting molecules via biological membranes}
흔히, 표적이 세포내에 존재하는 분자의 치료학적 이용에 대한 제한 인자는 이의 불만족스러운 세포 흡수 및 바람직하지 않은 세포내 분포이다. 통상의 예는 거대분자, 예를 들어, 세포 DNA 또는 RNA에 서열 특이적 방식으로 결합하여 유전자 발현을 억제하는 핵산이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통해 상보적 mRNA에 결합하는 일본쇄 핵산인데, 이때 mRNA의 상응하는 단백질로의 해독은 억제된다. 삼중-형성 올리고뉴클레오타이드는, 이른바 "후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍을 통해 DNA 이중 나선의 깊은 그루브에 결합하여 삼중나선을 형성시킴으로써 서열 특이적 방식으로 유전자의 전사를 억제한다. 세포내 작용하는 기타 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 전사 인자에 대한 결합 영역을 모사하는 이른바 "디코이(decoy)" 올리고뉴클레오타이드이다. 디코이 올리고뉴클레오타이드로 처리함으로써 특정 전사 인자를 서열 특이적 방식으로 차단하여 전사 활성을 억제할 수 있다. 세포내 작용 올리고뉴클레오타이드의 추가 그룹인, 키메라플라스트(chimeraplasts)가 표적화된 유전자 교정용으로 사용된다[참조 문헌: Cole-Strauss et al., Science 273 (1996) 1386-1389]. 이러한 유전자 교정을 위해서는 키메라플라스트 올리고뉴클레오타이드의 세포내로의 흡수가 또한 필수적이다. 추가의 세포내 작용 핵산의 예는 세포 효소, 특히 텔로머라제와 상호작용하는 핵산이다[참조 문헌: Norton et al. Nat. Biotechen. (1996) 14, 615]. 추가 부류의 핵산, 바람직하게는 이본쇄 DNA는 유전자 치료요법의 취지로서 세포내 발현되는 특정 단백질을 암호화할 수 있다.
예를 들어, 시험관내에서 예를 들어 세포 항온처리 배지에 올리고뉴클레오타이드를 단순히 첨가함으로써 세포내로 올리고뉴클레오타를 흡수시키는 것은, 오직 첨가된 올리고뉴클레오타이드의 작은 비율만이 세포내로 실질적으로 흡수되기 때문에 상대적으로 비효율적인 과정이다. 흡수 과정은 많은 시간이 소요되며, 대부분의 경우 단지 8 내지 16시간 후에 편평기에 도달한다. 올리고뉴클레오타이드는 엔도사이토시스 유사 방법으로 흡수되는 것으로 예상된다. 그러나, 엔도사이토시스를 통한 흡수의 일반적 문제는 큰 비율의 올리고뉴클레오타이드가 세포질내에서 유리되지 않은 상태로 존재할뿐 아니라, 특정 세포 구조, 즉 리소좀 및 엔도좀내에봉입된 상태로 존재한다는 것이다. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 경우, 게다가 이러한 국재화된 분포는 형광 현미경에 의해 관찰할 수 있다. 이러한 소포성 국재화로 인해, mRNA와 실질적으로 하이브리드화할 수 있는 유리 올리로뉴클레오타이드의 농도는 현저하게 감소된다. 또한, 세포 유형 및 당면 조건에 따라서, 우선 특정 분획의 세포만이 올리고뉴클레오타이드를 흡수한다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효율적 사용을 위해, 침투 증강제, 예를 들어, 양이온성 지질[참조 문헌: Bennett et al. Mol. Pharmacol. 41 (1992) 1023]과의 혼합물을 통상적으로 사용한다.
본 발명은 접합체, 이의 제조방법 및 저분자량 화합물 및 거대분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한, 특히 세포내로 분자를 수송하기 위한 상기 접합체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 접합체가 존재하거나 사용되는 의약 및 진단제 및 시험 키트를 제공한다.
도 1: 도 1은 화학식 Ⅰ의 아릴 라디칼의 예를 도시한다.
도 2a 및 도 2b: 도 2a 및 2b는 화학식 Ⅱ의 아릴 라디칼의 예를 도시한다.
도 3: 도 3은 수송될 분자(여기서는, 올리고뉴클레오타이드)와 화학식 Ⅰ의 아릴 라디칼 사이의 접합의 상이한 예(A, B, C, D, E, F 및 G)를 도시한다. "R"은 화학식 Ⅰ의 라디칼이고, "B"는 헤테로사이클릭 염기이다.
도 4: 도 4는 본 발명에 따르는 접합체(여기서는, FDA-이소티오시아네이트 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어짐)의 제조 가능성을 도시한다.
도 5: 도 5는 접합체 CO_5가 시간에 따라서 배지로부터 REH 세포내로 흡수되는 것을 도시하며, 이때 한가지 경우에 혈청을 함유하지 않는 배지(◆)를 사용하고, 다른 경우에서는 혈청을 함유하는 배지(■)를 사용한다. 세포내로의 흡수는 FACS를 보조로하여 측정한다.
도 6: 도 6은 FACS 측정에 의해 CO_1(FDA 접합체: ◆) 및 CO_2(FITC 올리고머: ▲)가 세포 내로 흡수되는 것을 측정한 모식도이다. 세포외 올리고뉴클레오타이드 접합체의 초기 농도는 1μM이고, Ｏ 및 ?은 대조군이다.
도 7: 도 7은 길이의 함수로서의 REH 세포에서의 FDA-접합된 폴리A-뉴클레오타이드의 형질감염.
도 8: 플루오레세인 디아세테이트와 플루오레세인 디피발레이트 올리고뉴클레오타이드 접합체의 세포내로의 흡수 비교
K39: 실시예 15의 카복시플루오레세인 디아세테이트(F3은 FDS와 동일함)
K41: 실시예 10의 카복시플루오레세인 디피발레이트(F2)
도 9: 형광 현미경을 사용한, REH와 함께 항온처리하는 동안의 이중 표지된 Cy3 올리고뉴클레오타이드 F3 접합체[1μM]의 세포내로의 흡수 조사. 4시간 후 흡수. 좌측: 형광성 표지; 중앙: 시아닌 염색, 우측: 상 대조 사진; 상단: 올리고뉴클레오타이드 K33; 하단: 올리고뉴클레오타이드 K34.
본 발명의 목적은 분자, 특히 거대분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수를 개선시키는 것이다.
올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수의 조사는 통상적으로 방사성 표지되거나 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행한다. 올리고뉴클레오타이드의 형광 표지화는, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 아미노 작용 그룹과 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 반응시켜 수행한다. 플루오레세인은, 예를 들어 시판되는 플루오레세인-유도화 고체상 지지체를 통해 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단으로 도입하거나, 시판되는 플루오레세인 포스피틸화 시약을 통해 5' 말단으로 도입할 수 있다. 모든 경우에서 올리고뉴클레오타이드-결합된 플루오레세인은 카복실산 작용 그룹으로 인해, 강하게 형광성인 음으로 하전된 구조 요소로서 존재한다.
플루오레세인과 달리, 플루오레세인 디아세테이트(FDA)는 2개의 에스테르 그룹이 제거되고 락톤 환이 개방된 후에만 형광성 플루오레세인으로 전환되나, 락톤 형태인 경우에는 형광성이 아닌 중성 생체 염료이다.
FDA(이후에는 "F3"로서 또한 지칭함)가 중성 비형광성 분자로서 수동 확산을 통해 생 세포에 의해 흡수되고 에스테라제에 의해 세포내 절단되어 형광성 플루오레세인을 생성한다는 사실은 공지되어 있다[참조 문헌: Breeuwer et al. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 1614; Maeda et al. Cell Stuct. Funct. (1982) 7, 177). 이제까지는, 기술한 FDA 유도체만이 아민-반응성 그룹, 예를 들어, 이소티오시아네이트를 함유하는 것이였으며, 이들 FDA 유도체는 세포내 단백질 또는 세포 성분의 염색용으로 사용된다. 이제까지는 FDA와 기타 분자의 접합체를 기술하지 않았으며, 마찬가지로 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드(FDA와 올리고뉴클레오타이드의 접합체)도 기술하지 않았다.
세포질내에서, FDA는 에스테라제에 의해 절단되므로, 따라서 올리고뉴클레오타이드를 FDA로 표지하여, 소포내에 존재하여 하이브리드화할 수 없는 올리고뉴클레오타이드("포획된" 올리고뉴클레오타이드)의 비율에 대한 "유리" 올리고뉴클레오타이드의 비율, 즉 세포질내에 존재하며 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 양을 측정할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 음전하의 총수가 높으며 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드 및 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드는 동일한 경우)가 단지 하나의 유효 전하만이 상이하다는 사실로 인해, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드 및 플루오레세인-표지된 뉴클레오타이드가 매우 유사한 세포 흡수 및 분포를 나타낸다는 것을 예상할 수 있다.
그러나, 놀랍게도, 본 발명에 이르러, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드 및 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드는 세포내로의 이들의 흡수, 즉 올리고뉴클레오타이드의 생존기간 및 흡수 효율 둘다 및 이에 따른 흡수된 올리고뉴클레오타이드의 세포 국재화에 대해서는 상당히 상이하다는 것이 밝혀졌다. FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드는 상응하는 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드보다 매우 빠르게 세포에 의해 흡수된다. 방사성 표지된 올리고뉴클레오타이드 및 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수가 수시간을 요하는 반면에, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드는 단지 단순한 항온처리 후, 예를 들어, 사람 세포의 경우에는 단지 5분 후에 세포내 검출된다. 또한 놀랍게도, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드가 거의 모든 세포(세포의 90% 초과)내로 흡수되는 반면에, 이제까지 기술한, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 수송하는 방법에서의 흡수율은 일반적으로 상당해 낮으며, 후자의 경우, 흔히 세포의 30 내지 60%만이 올리고뉴클레오타이드를 흡수한다. 또한, 잇점은 보다 균일한, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드의 세포내 분포이다. 이러한 보다 균일한 분포는 올리고뉴클레오타이드가 상기 기술한 바와 같이 소포(예: 엔도솜 및 리소좀)내에 주로 봉입되어 있지 않을뿐 아니라, 전체 세포, 즉 세포질 및 핵내에 분포되어 있음을 나타내며, 이는 큰 분획의 "유리" 올리고뉴클레오타이드가 존재함을 나타낸다. 상기 "유리" 올리고뉴클레오타이드만이 표적(표적 분자, 표적 핵산)에 결합할 수 있거나 활성 화합물로서 결합할 수 있다. 추가의 잇점은, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우에는 세포의 손상이 관찰되지 않는다는 사실이며, 이와 달리 지질양이온성(lipocationic) 침투 증가제는 흔히 세포 막의 손상을 야기한다. 이러한 예측하지 못한 성질의 결과로서, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드는, 이제까지 기술한 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 도입하는 방법과 비교하여 세포내로 보다 효율적으로 도입할 수 있으며, 또한 보다 유용하다는 결정적인 잇점을 갖는다. 이러한 이유 때문에, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드는 현저하게 개선된 생물학적 활성을 갖는다. 개선된 생물학적 활성으로 인해, 보다 적은 양의 올리고뉴클레오타이드가 사용될 것이다. 이러한 이유 및 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드가 양 및 시간에 대해서는 보다 효율적으로 세포내로 흡수되다는 사실로 인해, (독성)부작용이 감소된다.
놀랍게도, 유리한 성질은 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드로 국한되지 않을뿐 아니라, 거의 모든 세포가 FDA-표지화를 보조로하여, 즉 수송될 분자를 FDA에 커플링시키거나 결합시켜("FDA 접합체") 세포내로 효율적으로 도입되거나 생물학적 막을 통해 수송될 수 있다. 또한, 본 원리가 FDA 접합체로 국한되는 것이 아니라 모든 특정 화학적 구조의 모든 아릴 에스테르 접합체에 적용된다. 따라서, 본 발명은 생물학적 막을 통해 분자를 수송하기 위한 신규한 원리이다. 이들 화합물은 한가지의 예외를 제외하고는 지금까지 선행 분야에서 기술된 바가 없기 때문에, 마찬가지로 상응하는 접합체-수송될 분자가 특정 화학 구조의 아릴 에스테르에 커플링되거나 접합된것-가 본 발명의 주제를 구성한다. 이들 접합체는 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 없기 때문에, 본 발명은 또한 접합체의 제조방법을 제공한다.
올리고뉴클레오타이드의 전구약물로서 보고된 바 있는 생가역성(bioreversible) O-아실아릴 접합체[참조 문헌: Iyer et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 7 (1997) 871-876]가 공지되어 있다. 상기 화합물의 화학적 구조는 아릴 라디칼이 방향족 6원 환인 경우 본 발명에 따르는 접합체의 화학적 구조와 유사하다. 그러나, 생가역성 O-아실아릴 접합체의 경우, 에스테르의 가수분해는 아릴 라디칼과 올리고뉴클레오타이드의 포스포트디에스테르 사이의 결합을 불안정화시키기 때문에, 생가역성 O-아실아릴 접합체가 이의 구성성분, 즉 유리 올리고뉴클레오타이드 및 O-아실아릴 라디칼로 절단된다. 이러한 전구약물 개념은 뉴클레오타이드내 포스페이트 브릿지의 음전하를 차폐하여 올리고뉴클레오타이드가 세포내로 흡수되는 것을 용이하게하는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명에 따르는 접합체와는 달리, 상기 전구약물의 경우에는 올리고뉴클레오타이드의 흡수가 가속화되지 않으며, 마찬가지로 올리고뉴클레오타이드의 세포내 분포도 변하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 또한, 올리고뉴클레오타이드가 기타 기관으로 흡수된다는 것은 보고된 바가 없다. 이와 달리, 본 발명에 따르는 접합체에서, 아릴 라디칼과 올리고뉴클레오타이드 사이의 공유 결합은 세포내로 흡수되는 동안에 보존되며, 아릴라디칼과 올리고뉴클레오타이드 사이의 공유 결합은 예를 들어, FDA의 경우와 같이 방향족 단위가 에스테르의 분해 후 오직 형광성인 경우에 형광 현미경으로 용이하게 관찰할 수 있다.
본 발명은, 하나 이상의 수송될 분자 및 하나 이상의 하기 화학식 Ⅰ의 아릴 라디칼을 포함하는 접합체로서, 당해 아릴 라디칼이 수송될 분자에 화학 결합을 통해 직접 결합되어 있거나 화학 그룹을 통해 간접적으로 연결되어 있으며, 이때 화학 그룹은 당해 결합이 수송될 분자의 뉴클레오타이드내 포스포디에스테르 결합을 통해 이루어질 경우 CH2-S 그룹이 아닌 접합체를 제공한다.
상기 화학식에서,
아릴은 방향족 특성을 갖는 하나 이상의 환을 함유하는 그룹이고,
X는 O 또는 N, 바람직하게는 X는 0이고,
Y는 O, S 또는 NH-R2이고, 바람직하게는 Y는 O이며,
R1은 직쇄 또는 측쇄일 수 있으며 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 함유할 수 있는 치환되거나 비치환된 C1-C23알킬 라디칼(예: 아릴알킬 라디칼)이며,
R2는 직쇄 또는 측쇄일 수 있으며 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 함유할 수있는 치환되거나 비치환된 C1-C18이고,
n은 1보다 크거나 1과 동일한 정수이다,
수송될 분자는 모든 분자일 수 있다. 수송될 분자는 바람직하게는 350달톤 이상의 분자량을 갖는다. 본 발명의 하나의 양태는 수송될 분자가 예를 들어 500달톤 이상, 바람직하게는 1000달톤 초과, 특히 바람직하게는 2000달톤 이상의 분자량을 갖는 거대분자가다. 수송될 분자는 또한, 예를 들어 500달톤 미만, 바람직하게는 350 내지 500달톤의 분자량을 갖는 저분자량 화합물일 수 있다. 저분자량 화합물은 모노뉴클레오타이드일 수 있다. 수송될 분자는 다양한 화학 물질 부류에 속할 수 있으며, 예를 들어, 생물중합체, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질, 펩타이드-핵산(PNA), 또는 3개의 방향족 환 이미다졸, 피롤 및 하이드록시피롤[참조 문헌: Kielkopf et al, Science 282, 111-115(1998)]을 포함하는 폴리아미드 또는 폴리사카라이드, 바람직하게는 올리고사카라이드, 또는 언급한 화합물의 유도체일 수 있다. 수송될 분자는 펩타이드 모사체일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 모노뉴클레오타이드는 천연 발생 핵산 또는 이의 공지된 유도체이다. 유도체는 본원에서 접합체 또는 수송될 분자로부터 유도된 염, 특히 생리학적으로 허용되는 이의 염, 및 예를 들어 개질되거나 안정화된 핵산을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 수송될 분자는 전사 인자의 억제제(예: NF-κB, c-fos 또는 c-jun), 세포 주기 단백질(예: 사이클린 D), 키나제(예: c-Src, 티로신 또는 MAP키나제), 세포내 이온 채널, 이뮤노필린(예: FK506 결합 단백질), 프롤릴-4-하이드록실라제, 토포이소머라제, 바이러스성 프로테아제, 복합 약물 저항 단백질, 포스포타제(예: 단백질 티로신 포스파타제)일 수 있다. 수송될 분자는 하나 이상의 아릴 라디칼, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개 이상의 아릴 라디칼과 결합될 수 있다. 아릴 라디칼("아릴 라디칼"은 특히 화학식 Ⅰ의 아릴 라디칼 및/또는 화학식 Ⅱ의 아릴 라디칼임)은 결합이 아릴 라디칼의 다른 위치에 국재화될 수 있는 경우 수송될 분자에 단독으로 또는 1회 이상 결합될 수 있다. 다수의 아릴 라디칼이 수송될 분자에 결합될 경우, 이들 라디칼은 동일하거나 상이할 수 있다. 아릴 라디칼은 아릴 그룹(화학식 Ⅰ 및 Ⅱ에서 "아릴"로서 지칭함)을 함유할 수 있으며, 아릴 그룹은 환중의 하나 이상이 방향족 특성을 갖는 하나 이상의 환을 포함할 수 있다. 또한 아릴 그룹은 방향족 특성을 갖거나 갖지않을 수 있는 헤테로사이클릭 환을 포함할 수도 있다. 아릴 그룹은, 예를 들어 1개 내지 8개 이상의 환("환 시스템"으로서 또한 지칭함), 바람직하게는 1 내지 8개의 환을 함유할 수 있다. 각각의 환은 3개 내지 7개, 바람직하게는 5개 내지 6개의 환 원자를 가질 수 있다. 환 시스템의 예는 페닐 환, 피리디닐 환, 피리미디닐 환, 피롤릴 환, 푸라닐 환, 티오페닐 환, 5원의 락톤, 6원의 락톤, 스피로락톤, 벤조퀴논, 사이클로헥사디에닐 환 및 사이클로헥세닐 환이다. 이들 환 시스템, 아릴 그룹 또는 아릴 그룹의 각각의 환은 일치환 또는 다치환될 수 있다. 바람직하게는, 아릴 그룹의 환 중의 하나 이상은 아실 라디칼을 가진다.
아릴 그룹은, 예를 들어 화학식 F1', F2', F3', F4', F5', F6', F7', F8',F9', F10' 또는 F11' 중의 하나의 화학식을 가질 수 있다. 이들 화학식을 도 1에 나타낸다.
아릴 라디칼은 직접 또는 화학 그룹을 통해 수송될 분자에 결합될 수 있다. 본 발명은 화학 그룹이 아릴 라디칼과 함께 하기 화학식 Ⅱ를 가지는 접합체를 제공한다.
상기 화학식에서,
아릴, X, Y 및 R1은 상기 정의한 바와 같으며,
R3은 화학 그룹으로, 예를 들어 -C(=O) 그룹 또는 -NH-C(=S) 그룹이다.
화학식 Ⅱ의 아릴 라디칼의 예는 화학식 F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 및 F11의 아릴 라디칼이며, 이들 화학식은 도 2 및 도 2b에 나타낸다.
특정 양태에서, 수송될 분자는 올리고뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 뉴클레오타이드 아데노신 포스페이트, 구아노신 포스페이트, 이노신 포스페이트, 시티딘 포스페이트, 우리딘 포스페이트 및 티미딘 포스페이트로 완전히 구성될 수 있다. 본 발명은 하나의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 경우에 따라서 하나 이상의 개질, 예를 들어, 화학적 개질을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 다수의 동일하고/하거나 상이한 개질을 가질 수 있다. 화학적 개질의 예는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조 문헌: E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Review 90 (1990) 543 and "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Hymana Press, Totowa, USA 1993 and J. Hunziker and C. Leumann 'Nucleic Acid Analog: Sythesis and Properties' in Modern Synthetic Methods (Ed. Best Ernst and C. Leumann), Verlag Helvetica Chimica Acata, Basle, pp. 331-417]에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오타이드의 화학적 개질은, 예를 들어
(a) 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR1R1'-포스포아미데이트(여기서, R1및 R1'는 서로 독립적으로, 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴-(C1-C18)-알킬, 바람직하게는 수소, (C1-C8)-알킬 및/또는 메톡시에틸, 특히 바람직하게는 수소, (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, R1및 R1'는 이들을 가지는 질소 원자와 함께, O, S 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 헤테로 원자를 추가로 함유할 수 있는 5- 내지 6-원 헤테로사이클릭 환이다), 보라노포스페이트, 포스페이트 (C1-C21)-O-알킬 에스테르, 포스페이트 [(C6-C12)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스테르, (C1-C8)알킬-포스포테이트 및/또는 (C6-C12)-아릴포스포네이트에 의한 포스포디에스테르 브릿지의 완전한 또는 부분적 치환,
(b) "데소프소" 브릿지(예를 들어 문헌[참조 문헌: Uhlmann E. and Peyman A. A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, 355ff.]에 기재되어 있음), 예를 들어, 포름아세탈, 3'-티오프롬아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸하이드라조, 디메틸렌설폰 및/또는 실릴 그룹에 의한 3'- 및/또는 5'-포스포디에스테르 브릿지의 완전한 또는 부분적 치환,
(c) 예를 들어, "모르폴리노" 올리고머(예를 들어, 문헌[참조 문헌: E. P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129 and in J. Summerton and D. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195]에 기재되어 있음) 및/또는 폴리아미드 핵산("PNAs")(예를 들어, 문헌[참조 문헌: P. E. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3]에 기재되어 있음) 및/또는 포스폰산 모노에스테르 핵산("PHONAs")(예를 들어, 문헌[참조 문헌: Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638]에 기재되어 있음))에 의한 당 포스페이트 골격의 완전한 또는 부분적 치환,
(d) 예를 들어, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-O-(C1-C6)-알킬-리보스, 2'-O-(C2-C6)-알케닐-리보스, 2'-[O-(C1-C6)-알킬-O-(C1-C6)-알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-크실로푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소피라노스, 입체형태적으로 제한된 당 유사체(예: LAN, 록트 핵산; 참조 문헌: Singh et al., Chem. Commun. 4(1998) 455; Singh et al. Chem. Commun. 12(1998) 1247) 및 카보사이클릭[참조 문헌: Froehler, J.Am. Chem.Soc. 114 (1992) 8320] 및/또는 개방쇄 당 유사체[참조 문헌: Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223] 및/또는 이환식 당 유사체[참조 문헌: M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481]에 의한 β-D-2'-데옥시리보스 단위의 완전한 및/또는 부분적 치환 또는
(e) 예를 들어, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 슈도이소시토신, 디하이드로우라실, 5-(C1-C6)-알킬-우라실, 5-(C2-C6)-알케닐-우라실, 5-(C2-C6)-알키닐-우라실-, 5-(C1-C6)-알킬-시토신, 5-(C2-C6)-알케닐-시토신, 5-(C2-C6)-알키닐-시토신, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신 또는 7-데아자-7-치환된 푸린에 의한 천연 뉴클레오사이드 염기의 개질 및/또는 완전한 또는 부분적 치환을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 화학적 개질은, 올리고뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드의 특정 성질에 미치는 선호 효과(예: 뉴클레아제에 대한 안정성, 표적 서열에 대한 친화도 및 약력학)를 갖는 하나 이상의 추가 분자에 결합, 예를 들어, 개질된 올리고뉴클레오타이드가 표적 서열과 하이브리드화하는 동안 표적 서열에 결합 및/또는 가교를 포함한다. 이러한 추가 분자의 예는 폴리리신, 삽입제(예: 피렌, 아크리딘, 페나진 또는 페난트리딘), 형광 화합물(예: 플루오레세인), 가교제(예: 프소랄렌 또는 아지도프로플라빈), 친지성 분자(예: (C12-C20)-알킬 그룹, 바람직하게는 (C12-C20)-알킬 그룹), 지질(예: 1,2-디헥사데실-rac-글리세롤), 스테로이드(예: 콜레스테롤 또는 테스토스테론), 비타민(예: 비타민 E), 폴리- 또는 올리고에틸렌 글리콜, (C12-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르, 바람직하게는 (C14-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르 및 -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬 그룹, 바람직하게는 O-CH2-CH(OH)-O-(CH12-C16)-알킬 그룹이다. 이러한 추가 분자는 5'- 및/또는 3'-말단에 및/또는 서열 이내에서, 예를 들어 뉴클레오베이스에 접합될 수 있다. 이러한 개질된 올리고뉴클레오타이드의 제조방법은 당해 분야의 숙련가에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조 문헌: Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 및/또는 M. Manoharan in "Antisense Research and Application", Crooke and Lebteu, Eds, CRC Press, Boca Raton, 1993, Chapter 17, p. 303ff. 및/또는 EP-A 0 552 766]에 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 3'- 및/또는 5'-말단에서 3'-3' 및/또는 5'-5' 역위될 수 있다. 이러한 유형의 화학적 개질은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조 문헌: M. Koga et al., J. Org. Chem. 58 (1991) 3757]에 기재되어 있다.
하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 및 하나 이상의 아릴 라디칼, 바람직하게는 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 아릴 라디칼로 이루어진 접합체에서, 올리고뉴클레오타이드에 아릴 라디칼의 접합은, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단(A), 3'-말단(F), 헤테로사이클릭 염기(E 및 G), 당(C), 또는 뉴클레오사이드 브릿지(B)에서 발생할 수 있다. 그러나, 접합은, 예를 들어 비뉴클레오타이드 빌딩 블록, 예를 들어, (D)의 경우에 또한 발생할 수 있다. 상기 예를 도 3에 나타낸다.
물론, 언급한 의약을 또한 상대적으로 긴 폴리뉴클레오타이드, 경우에 따라서는 모노- 또는 디뉴클레오타이드 또는 -뉴클레오사이드에 상응하게 적용할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 8 내지 50개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 20개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 그러나, 예를 들어 50 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이의 보다 긴 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드를 갖고 경우에 따라서 이본쇄로서 존재하기도 하는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적합하다.
올리고뉴클레오타이드는 모든 서열을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 서열은 선택된 표적에 따라서, 즉 표적이 핵산인 경우에는 이의 서열에 따라서, 표적이 단백질인 경우에는 이러한 표적 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 따라서 선택 또는 디자인한다. 예를 들어, 표적이 바이러스, 예를 들어, CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, 인플루엔자, VSV, 간염 B 또는 파필로마 바이러스인 경우, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 다음 서열 중의 하나를 갖는다:
(a) CMV에 대하여
서열 12 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG
(b) HIV에 대하여, 예를 들어
서열 13 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' 또는
서열 14 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' 또는
(c) HSV-1, 예를 들어
서열 15 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3'.
표적은, 예를 들어 암의 형성에서 관련되거나 암을 성장시킬 수 있는 단백질일 수 있다. 이러한 표적의 예는 다음과 같다:
(1) 핵 종양단백질, 예를 들어, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA 및 p120,
(2) 세포질/막-결합된 종양단백질, 예를 들어, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl 및 c-ets,
(3) 세포 수용체, 예를 들어, EGF 수용체, Her-2, c-erbA, VEGF 수용체(KDR-1), 레티노이드 수용체, 단백질 키나제의 조절 서브유닛, c-fms, Tie-2, c-raf-1 키나제, PKC-알파 및 단백질 키나제 A(R1 알파) 및
(4) 사이토킨, 성장 인자, 세포외 기질, 예를 들어, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, 미엘로블라스틴 및 피브로넥틴.
이러한 표적에 대해 지시된 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 다음의 염기 서열을 가진다:
(a) c-Ha-ras에 대해, 예를 들어,
서열 16 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' 또는
서열 17 5'-TATTCCGTCAT-3' 또는
서열 18 5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3'
(b) bFGF, 예를 들어,
서열 19 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3'
(c) c-myc, 예를 들어,
서열 20 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3'
서열 21 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'
(d) c-myb, 예를 들어,
서열 22 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'
(e) c-fos, 예를 들어,
서열 23 5'-CGAGAACATCATCGTGG-3'
서열 24 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3'
서열 25 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3'
서열 26 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3'
(f) p120, 예를 들어,
서열 27 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3'
(g) EGF 수용체, 예를 들어,
서열 28 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3'
서열 29 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3'
(h) p53 종양 억제제, 예를 들어,
서열 30 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3'
서열 31 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3'
(i) bcl-2
서열 32 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'
(k) VEGF
서열 33 5'-GCGCTGATAGACATCCATG
서열 34 3'-CCAGCCCGGAGG-5', 5'-GGAGGCCCGACC-3'
서열 35 3'-CGGAGGCTTTGG-5', 5'-GGTTTCGGAGGC-3'
서열 36 3'-GATGGAGGTGGT-5', 5'-TGGTGGAGGTAG-3'
서열 37 3'-GGAGGTGGTACG-5', 5'-GCATGGTGGAGG-3'
서열 38 3'-GGTGGTACGGTT-5', 5'-TTGGCATGGTGG-3'
서열 39 3'-CACCAGGGTCCG-5', 5'-GCCTGGGACCAC-3'
서열 40 3'-CCAGGGTCCGAC-5', 5'-CAGCCTGGGACC-3'
서열 41 3'-AGGGTCCGACGT-5', 5'-TGCAGCCTGGGA-3'
서열 42 3'-GGGTCCGACGTG-5', 5'-GTGCAGCCTGGG-3'
서열 43 3'-GGTCCGACGTGG-5', 5'-GGTGCAGCCTGG-3'
서열 44 3'-CCGACGTGGGTA-5', 5'-ATGGGTGCAGCC-3'
서열 45 3'-GTAGAAGTTCGG-5', 5'-GGCTTGAAGATG-3'
서열 46 3'-ACGCCCCCGACG-5', 5'-GCAGCCCCCGCA-3' 또는
서열 47 3'-CCCCCGACGACG-5', 5'-GCAGCAGCCCCC-3'
(l) c-raf 키나제
서열 48 5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT
(m) PKC-알파
서열 49 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA
(n) 단백질 키나제 A
서열 50 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC
표적이 인테그린 또는 세포-세포 점착 수용체, 예를 들어, VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM 또는 ELAM인 경우, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 다음 서열 중의 하나를 가질 수 있다:
(a) VLA-4, 예를 들어,
서열 51 5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3' 또는
(b) ICAM-1, 예를 들어,
서열 52 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA
서열 53 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3'
서열 54 5'-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3'
서열 55 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3'
(c) ELAM-1, 예를 들어,
서열 56 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCCAGG-3'
서열 57 5'-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3'
(d) 인테그린 알파(Ⅴ)
서열 58 5'-GCGGCGGAAAAGCCATCG
표적이, 증식 또는 이동을 야기하는 단백질이거나 이들/이러한 과정(들), 예를 들어,
(1) 핵 트랜스활성화인자(transactivator) 단백질 및 사이클린, 예를 들어, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, 사이클린 및 cdc2 키나제,
(2) 유사분열 유발인자 또는 성장 인자, 예를 들어, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF 및 TGF-β,
(3) 세포 수용체, 예를 들어, bFGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체인 경우, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 다음 염기 서열 중의 하나를 가질 수 있다:
(a) c-myb
서열 59 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'
(b) c-myc
서열 60 5'-CACGTTGAGGGGCAT-3'
(c) cdc2 키나제
서열 61 5'-GTCTTCCATAGTTACTCA-3'
(d) PCNA(랫트의 증식 세포 핵 항원)
서열 62 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'.
표적은 예를 들어 아데노신 A1 수용체, 아데노신 A3 수용체, 브라디키닌(bradikinin) 수용체 또는 IL-13, 다음의 염기 서열일 수 있다.
서열 63 5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG
다음 올리고뉴클레오타이드(5'→3')를 제조한다:
ON1; 5'-d(G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G) 서열 1
ON2: 5'-d(C*GAC*GC*CAT*G*A*C) 서열 2
ON3: 5'-d(A*T*GAC*GGAA*T*T*C) 서열 3
ON4: 5'-d(TATTCCGTCAT) 서열 4
ON5: 5'-(dA)20서열 5
ON6: 5'-(dA)50서열 6
ON7: 5'-(dA)80서열 7
ON8:5'-T*T*CC*AT*GG*TG*G*C 서열 8
ON9: 5'-T*T*CA*CT*GT*GG*G*C 서열 9
ON10: 5'-T*G*GC*GC*CG*GG*C*C 서열 10
ON11: 5'-T*G*CC*GG*CC*GG*G*C 서열 11
여기서, *는 포스포디에스테르 브릿지가 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드내 브릿지에 의해 치환된 위치를 지시한다.
이들 서열은 다음 접합체(CO)로 전환된다:
CO_1: F3-Li1-ON1
CO_2: F0-Li1-ON1
CO_3: F3-Li1-ON2
CO_4: F0-Li1-ON2
CO_5: F3-Li1-ON3
CO_6: F9-Li1-ON3
CO_7: F2-Li1-ON3
CO_8: F0-Li1-ON3
CO_9: F3-Li1-ON3-로다민
CO_10: F9-Li1-ON3-로다민
CO_11: F6-Li1-ON3-로다민
CO_12: F0-Li1-ON3-로다민
CO_13: F3-Li1-ON4
CO_14: F3-Li1-ON5
CO_15: F3-Li1-ON6
CO_16: F3-Li1-ON7
CO_17: F3-Li1-ON8
CO_18: F3-Li1-ON9
CO_19: F3-Li1-ON10
CO_20: F3-Li1-ON11
CO_21: F7-Li1-ON3
여기서, "F1 내지 F11"은 화학식 F1 내지 F11(예: 도 2)의 아릴 라디칼이고,
"Li1"은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 결합된 6-아미노헥실 포스페이트 라디칼(예를 들어, 도 4 참조)이며,
"ON1 내지 ON11"은 서열 1 내지 서열 11의 기술된 올리고뉴클레오타이드이고,
"로다민"은 플루오레세인 이외에 검출가능한, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에서의 로다민 수준이다.
본 발명은 본 발명에 따르는 접합체의 제조방법을 또한 제공한다. 본 발명은 (a) 아릴 라디칼이 존재하는 위치에 반응성 작용 그룹을 함유하는 수송될 분자를 제조하는 단계, (b) 아릴 라디칼을 제조하는 단계 및 (c) 수송될 분자를 알리 라디칼과 반응시켜 접합체를 수득하는 단계를 포함하는, 수송될 분자 및 바람직하게는 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 하나 이상의 아릴 라디칼을 포함하는 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
반응성 작용 그룹은 바람직하게는 아미노 그룹, 머캅토 그룹, 클로로아세틸 그룹, 이소시아네이트 그룹, 이소티오시아네이트 그룹, 카복실산 그룹, N-하이드록시석신이미드 그룹 또는 카보닐 클로라이드 그룹이다. 수송될 분자와 아릴 라디칼의 반응은 7.5 이하의 pH, 바람직하게는 7.3 이하의 pH, 특히 바람직하게는 7.0 이하의 pH, 예를 들어, 7 미만, 바람직하게는 6.5 이하의 pH에서 수생한다. 이러한 커플링 반응에서, 모든 기타 반응성 그룹은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 보호그룹을 사용하여 반응 전에 보호되어야 한다. 특정 양태의 방법에서, 수송될 분자는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 모노뉴클레오타이드이다.
제조방법은 제1 단계에서 수송될 분자의 제조를 포함한다. 상기 범주에서, 본 발명은 또한 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 문헌[참조 문헌: Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and Analogues, A Practical APPROACH", IRL Press, Oxford]에 기재되어 있는 공지된 다양한 화학적 방법을 보조로하여 제조할 수 있다. 또한, 올리고뉴크렐오타이드는 경우에 따라서 하나 이상의 효소적 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 접합체의 제조는, 일반적으로 문헌[참조 문헌: J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; S. Beaucage and R. lyer, Tetrahedron 49 91993) 1925; S. Agrawal Methods in Molecular Biology Vol. 26 "Protocols for oligonucleotide conjugates" (1994) Humana Press]기재되어 있는 바와 같다.
그러나, 화학식 Ⅰ에 따르는 올리고뉴클레오타이드 접합체를 합성하는 경우, 이들 올리고뉴클레오타이드 접합체가 알칼리성 배지에서 분해될 수 있다는 사실에 주목해야 한다. 따라서, FDA 그룹의 에스테르 그룹은 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드를 절단하고 헤테로사이클릭 염기의 아미노 보호 그룹을 절단하는데 필요한 암모니아로 처리하는 동안 가수분해되기 때문에, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 합성기에서 통상의 방법을 사용하여 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것은 불가능하다. 그러므로, 올리고뉴클레오타이드를 초기에는 탈보호된 형태의 전구체로서 제조하고 최후 단계에서는 화학식 Ⅰ의 그룹과 융합시킨다(도 5).올리고뉴클레오타이드 전구체는, 후속적으로 당해 분야의 숙련가에 공지된 방법을 사용하여 본 발명에 따르는 화학식 Ⅰ의 그룹을 함유하는 시약을 사용하여 유도체화하는 반응성 또는 활성가능한 작용 그룹을 갖는다. 적합한 반응성 또는 활성가능한 작용 그룹은, 예를 들어 아미노, 머캅토, 클로로아세틸, 이소(티오)시아네이트 및 카복실산 작용 그룹이다. 이른바 아미노 링커를 시판되는 시약을 보조로 하여 올리고뉴클레오타이드내로 도입하는 것이 특히 용이하다. 이어서 아미노-링커 올리고뉴클레오타이드와 화학식 Ⅰ의 그룹을 함유하는 반응 시약을 반응시킨다. 이러한 반응 시약은, 예를 들어 상응하는 이소티오시아네이트이다. 이러한 경우에 화학식 Ⅰ의 그룹은 티오우레아 작용 그룹(도 4)을 통해 결합된다. 기타 반응 시약은, 예를 들어 카보닐 클로라이드이다. 약한 반응 시약은, 예를 들어 상응하는 카복실산의 N-하이드록시석신이미드이다. 활성 시약은, 예를 들어 HBTU, TBTU 또는 TOTU와 같은 펩타이드 커플링 시약과 커플링될 수 있는 상응하는 카복실산이다. 상기 경우에 화학식 Ⅰ의 그룹은 아미드 작용 그룹을 통하여 결합된다. 원칙적으로, 본 발명에 따르는 화학식 Ⅰ의 그룹은 올리고뉴클레오타이드의 모든 위치로 도입시킬 수 있다. 도 3에 나타낸 위치가 바람직하다.
개질된 올리고뉴클레오타이드는 표준 방법, 예를 들어 포스포아미디트 방법에 의한 고체상 합성, 및 예를 들어 유로젠텍(Eurogentec, Seraing, Belgium)으로부터 시판되는 5'-아미노-개질제 C6를 사용한 5'-말단의 유도체화에 의해 올릭뉴클레오타이드 쇄를 작제하여 합성한다.
5'-아미노-개질제 C6(Mmt=4-모노메톡시트리틸)
올리고뉴뉴클로에타이드 유도체를 지지체로부터 절단하고 모든 염기-불안정성 보호 그룹을 암모니아로 처리하여 탈보호시킨 후, 실온에서 80%의 아세트산으로 처리하여 모노메톡시트리틸 그룹을 제거한다. 이는 5'-아미노헥실-포스페이트-개질된 올리고뉴클레오타이드를 생성시킨다. 이어서 상기 올리고뉴클레오타이드 유도체의 아미노 작용 그룹을 0.2M 중탄산 트리에틸암모늄 완충액(TBK 완충액)PH7/DMF 속에서 FDA-이소티오시아네이트와 반응시킨다. 단지 2시간 내지 3시간 후에 아미노-링커 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 FDA 유도체로 완전히 전환되었다(도 4). 플루오레세인 이소티오시아네트와의 반응은 통상적으로 pH8에서 수행한다. 그러나, 상기 pH에서 FDA 그룹의 디아세테이트는 가수분해된다. 물론, 기타 아미노-링커 시약, 예를 들어 5'아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 5 또는 5'-티오-개질제 C6(모두 유로젠텍으로부터 입수 가능함)와 같은 기타 아미노-링커 시약도 사용할 수 있다.
3'-아미노-개질제 고체상, 예를 들어, 3'-아미노-개질제 C3 CPG(제조원: 유로젠텍)를 사용하여, 후속적으로 FDA-이소티오시아네이트와 반응하는 3'-아미노알킬 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유도체를 제조할 수 있다. 이는 3'-말단에결합된, 본 발명에 따르는 화학식 Ⅰ의 그룹을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 생성시킨다.
3'-아미노-개질제 C3 CPG(Fmoc=플루오레닐메톡시카보닐)
뉴클레오사이드의 헤테로사이클릭 염기에 접합체를 도입하기 위해, 합성시 일반적인 포스포아미디트 빌딩 블록 대신에 티미딘으로부터 유도된 상응하는 아미노-개질제 C6 dT(제조원: 유로젠텍)를 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성의 종결 단계에서, 트리플루오로아세틸 보호 그룹을 암모니아로 처리하여 제거하고 유리 아미노 작용 그룹을 용액속에서 FDA-이소티오아시아네이트와 반응시킨다.
유사한 방식으로, 본 발명에 따르는 화학식 Ⅰ의 그룹을 올리고뉴클레오타이드의 모든 위치에 도입할 수 있다. 심지어 동일하거나 상이한 그룹을 여러번 도입할 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다.
수송될 분자가 펩타이드 핵산(PNAs)인 접합체의 제조방법에서, 아미노 에틸 그룹의 1급 아미노 작용 그룹을 FDA-이소티오시아네이트와 반응시킬 수 있다. 수송될 분자가 펩타이드 핵산(PNAs)인 접합체의 제조방법에서, FDA-이소티오시아네이트와의 반응을 위해, 예를 들어 폴리펩타이드의 아미노 말단 또는 라이신 측쇄의 아미노 작용 그룹을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 접합체의 용도, 특히 상기 기술한 접합체의 유리한 성질에 기반한 용도를 제공한다. 본 발명의 특정 양태는 분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한 접합체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 생물학적 막을 통해 분자를 수송하기 위해 아릴 라디칼에 결합된 상기 분자를 수송하기 위한 아릴 라디칼, 바람직하게는 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 아릴 라디칼의 용도에 관한 것이다. 생물학적 막은 바람직하게는 세포, 소포체 또는 소기관의 성분이다.
또한, 본 발명은 (a) 수송될 분자가 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 하나 이상의 아릴 라디칼과 결합된 접합체를 제조하고,(b) 상기 접합체를 막과 함께 항온처리하는, 분자를 막을 통해 수송하는 방법을 제공한다.
특히, (a) 수송될 분자가 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 하나 이상의 아릴 라디칼에 결합된 접합체를 제조하고, (b) 상기 접합체를 세포와 함께 항온처리하고, 이어서 (c) 접합체를 아릴 라디칼의 절단 없이 세포내로 수송하는, 분자를 세포내로 수송하는 방법을 제공한다.
이는, 특히 세포가 진핵 또는 원핵 세포, 예를 들어, 세균 세포 또는 포유동물 세포, 특히 사람 세포인 방법을 지칭한다. 특정 양태에서, 세포는 병리학적으로 변형된 세포, 예를 들면, 종양 세포이다.
접합체의 개선된 세포 흡수는 포유동물의 세포에서 관찰될뿐 아니라 기타 진핵 세포 및 심지어 원핵 세포의 경우에도 입증되었다.
본 발명에 따르는 접합체는 살아있는 세포내로의 흡수에 대하여 현미경적으로 조사한다. 먼저, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드를 세포로 출입하는 CO_1 및 CO_3의 능력에 대한여 조사한다. 사응하는 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_2 및 CO_4 를 선행 분야로부터 공지된 화합물로서 사용한다. 연구한 모든 생체 동물 세포 항온처리물은 5 내지 10분 이내에 CO_1 및 CO_3을 흡수한 반면, 생체 세포에서 상기와 같은 시간 후에 CO_2 및 CO_4(플루오레세인 접합체)를 검출할 수 없다(표 1).
세균 및 효모내로의 흡수가 포유동물 세포에서의 흡수보다 현저히 낮지만, 세포의 일부는 2시간 후에 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드를 흡수한 반면, 일반적인 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드는 상기 조건하에 흡수되지 않는다. 놀랍게도, 원칙적으로 이제까지 연구한 모든 유기체는 공지된 올리고뉴클레오타이드 유도체보다 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드를 많이 흡수하였다. 상기 유기체는, 특히 동물 세포, 편모충, 효모, 진균 및 세균을 포함된다(표 3).
또한, 암 세포가 올리고뉴클레오타이드를 특히 잘 흡수한다는 것이 밝혀졌다. 따라서 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드의 용도는 암 요법에 적합하다. eg5에 대해 지시된, FDA-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 CO_1은 단순히 이를 배지에 첨가한 경우 A549의 증식을 억제하나, 상응하는 비개질된 안티센스ON 1 및 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_2는 오직 CellFectin과 같은 침투 증강제와 제형화한 후에 암 세포의 증식을 억제한다.
본 발명은 수송될 분자가 일본쇄 및/또는 이본쇄 핵산, 예를 들어, DNA(예: 유전자 및 cDNA) 및/또는 RNA(예: 프리-mRNA 및 RNA)와의 하이브리드화용 올리고뉴클레오타이드인 접합체의 용도에 관한 것이다. 이들 접합체는 또한 효소, 예를 들어, 폴리머라제 또는 텔로머라제와 같은 세포내 단백질 또는 전사 인자에 서열 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명은 또한 특정 표적 유전자 발현의 조절 및 완전 또는 부분적인 억제, 예를 들어, 전사 및/또는 해독의 완저 또는 부분적 억제를 위한 이러한 접합체의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 센스 올리고뉴클레오타이드 삼중 나선-형성 올리고뉴클레오타이드, 키메라플라스트 및/또는 디코이 올리고뉴클레오타이드로서의 이러한 접합체의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 접합체를 분자생물학에서 보조제로서 사용할 수 있다.
추가로, 본 발명은 의약 및/또는 진단제로서의 올리고뉴클레오타이드의 용도 및 의약 및/또는 진단제 제조용 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 특히, 올리고뉴클레오타이드를 특정 유전자의 발현 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료하기 위해 의약에서 사용할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 이러한 질병을 진단하거나 초기에 검출할 수 있다. 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드의 세포 출입 능력은 매우 양호하며, 이를 생체내 진단용, 예를 들어, 전체 기관 또는 온전한 유기체에서의 반응계 하이브리드화용으로 사용할수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 하나 이상의 접합체를 포함하는 의약을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 하나 이상의 접합체를 포함하는 진단제를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 하나 이상의 접합체를 포함하는 시험 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 및 이의 유사체의 검출, 분리 및 증폭용 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 접합체는 세포, 특히 살아있는 세포내에서 핵산을 검출하는데 특히 적합하다. 상기 세포는 사람 또는 동물 기원일 수 있다. 접합체는 또한 표 3에 기재한 유기체, 특히 병원성 유기체를 검출하는데 특히 적합하다. 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드는 핵산을 증폭시키는 공지된 기술적 변형법, 특히 LMPCR(연결 매개된 폴리머라제 연쇄 반응), "Invader Assay"(상품명, 제조원: Third Wave Technologies, Inc., Wisconsin), TaqMan System(상품명) 및 다양한 유전형에서 사용할 수 있다. 또한, 잇점은 증폭을 실시간으로 측정할 수 있도록 하는 광-사이클러를 보조로 하여 핵산 증폭시키기 위한 본 올리고뉴클레오타이드의 용도이다. 형광 염료가 결합되지 않는 경우에는 올리고머의 2차 그룹에 의해 억제되기 때문에 형광성이지 않다는, 분자 "지표(beacons)" 원리에 의한 검출은 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 추가의 가능성이다. 예를 들어, FDA 유도체(예를 들어, 올리고 뉴클레오타이드의 5'-말단에 접합됨)를, 심지어 FDA 유도체가 플루오레세인 유도체로 전환된 후에도 결합되지 않은 상태에서는 형광 시그널을 억제하는 답실(Dabcyl) 라디칼(예를 들어, 3'-말단에 접합됨)과 결합시킬 수 있다. 이러한 FDA-개질된 지표는 오직 세포내로 흡수되어 지표 mRNA와 하이브리드화한 후에만 형광 시그널을 방출한다. 본 발명은 또한 한정된 유전자의 과발현에 의해 유발되거나 이와 관련된 질병의 치료용 올리고뉴클레오타이드의 용도 또는 이러한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 의약에 관한 것이다. 본 발명의 의약은, 예를 들어, 바이러스(예: CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, 인플루엔자, VSV, 간염 B 또는 파필로마 바이러스)에 의해 유발되는 질환 치료용으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약은, 예를 들어 암을 치료하는데 적합하다. 추가로 본 발명의 의약은 인테그린 또는 세포-세포 접착 수용체, 예를 들어, VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM 또는 ELAM에 의해 발병되는 질환 치료용으로 사용할 수 있다. 본 발명의 의약은, 예를 들어 재발협착증을 예방하고, 백반증 및 (예를 들어 피부, 두발 또는 눈의) 기타 색소탈실 질병 또는 색소탈실 질환, 예를 들어, 백색증 및 건선을 치료하는데 또한 적합하다.
본 의약은, (a) 예를 들어 정제, 당 제피된 정제, 경지 또는 연질 젤라틴 캡술제, 액제, 유제 또는 현탁제 형태로 경구 투여, (b) 예를 들어 좌제 형태로 직장내 투여 또는 (c) 예를 들어 주사용 액제 형태로 비경구 투여될 수 있는 약제학적 제제에 관한 것이다. 의약을 제조하기 위해, 접합체를 예를 들어 치료학적 불활성 유기 및/또는 무기 담체 속에서 가공할 수 있으며, 정제, 당 제피된 정제 및 경질 젤라틴 캡슐제에 적합한 담체는, 예를 들어 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 수지 및 스테아르산 또는 이의 염이다. 액제용으로 적합한 담체는 물, 폴리올, 전환 당 및 글루코스이고, 주사용 액제용으로는 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤및 식물성 오일이고, 좌제용으로는 식물성 및 수소화 오일, 왁스, 지방 및 반액체 폴리올이다. 본 의약은 방부제, 용매, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압 전환용 염, 완충액, 제피제, 항산화제, 및 경우에 따라서 기타 치료적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 의약은 바람직하게는 카테터를 보조로하거나 흡입하거나 주사 또는 주입에 의해 투여하여 국소 적용한다. 주사의 경우, 접합체를 액체 용액, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 행크스액 또는 링거액으로 제형화한다. 그러나, 접합체는 고체형태도 제형화하여 사용전에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 전신성 투여에 바람직한 투여량은 1일당 약 0.01 내지 약 50mg/체중 1kg이다. 접합체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은, 의약으로서 동물, 바람직하게는 포유동물 및 특히, 사람에게 그 자체로, 서로와의 혼합물로서, 또는 국소, 경피, 비경구 또는 장관용으로 사용할 수 있으며 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 첨가제 이외에 활성 성분으로서 유효량의 하나 이상의 접합체를 포함하는 약제학적 제제의 형태로서 투여할 수 있다. 본 제제는 통상적으로 치료적 활성 화합물의 약 0.1 내지 90중량%를 포함한다. 피부 질환, 예를 들어 건선 또는 백반증의 치료를 위해, 예를 들어 연고, 로션 또는 팅크제, 유제, 현탁로서 국소 사용하는 것이 바람직하다. 의약은 불활성 무기 및/또는 유기 담체를 사용하여 공지된 방법[참조 문헌: Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.]으로 제조한다. 환제, 정제, 당 제피된 정제 및 경질 젤라틴 캡슐제를 제조하기 위해, 예를 들어 락토스, 옥수수 전분 및/또는 이의 유도체, 활성, 스테아르산 및/또는 이의염 등을 사용할 수 있다. 연질젤라틴 캡슐제 및/또는 좌제용으로 적합한 담체는, 예를 들어 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 쳔연 및/또는 수소화 오일 등이다. 액제 및/또는 시럽제의 제조에 적합한 담체는 물, 슈크로즈, 전환당, 글루코스, 폴리올 등이다. 주사용 액제에 적합한 담체는 물, 알콜, 글리세롤, 폴리올, 식물성 오일 등이다. 마이크로캡슐, 이식물 및/또는 봉재에 적합한 담체는 글리콜산과 락트산의 혼합된 중합체이다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 리포좀 제형[참조 문헌: N. Weiner, Drug Deveop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag (1992)], 예를 들어 HVJ 리포좀[참조: Hayashi, Gene Therapy 3(1996) 878]이 또한 바람직하다.
활성 물질 및 담체 이외에, 의약은 첨가제, 예를 들어, 충전제, 증량제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 방부제, 감미제, 착색제, 풍미제 또는 방향제, 증점제, 희석액, 완충 물질를 포함하며, 추가로 용매 및/또는 안정화제 및/또는 저장 효과 달성용 제제, 및 삼투압 변환용 염, 제피제 및/또는 항산화제를 포함한다. 상기 의약은 또한 2개 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 포함하며, 추가로 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 이외에, 하나 이상의 기타 치료적 활성 물질을 포함한다. 투여량은 광범위한 범위내에서 다양할 수 있으며, 각각의 경우 개별적 환경에 따라서 조정해야한다.
실시예 1: 올리고뉴클레오타이드 합성
자동화 DNA 합성기(Applied Biosystems Model 380B 또는 394)상에서 표준 포스포아미디트 화학을 사용하고 요오드로 산화시켜 올리고뉴클레오타이드를 합성한다[참조 문헌: F. Eckstein, Ed "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991]. 혼합된 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 속에서 포스포로티오에이트 브릿지를 도입하기 위해, 요오드 대신에 TETD(테트라에틸티우람 디설파이드) 또는 보케이지 시약을 사용하여 산화시킨다. 고체 담체(CPG 또는 Tentagel)로부터 절단하고 55℃에서 18시간 동안 농축된 NH3로 보호 그룹을 제거한 후, 올리고뉴클레오타이드를 먼저 부탄올로 침전시켜 정제한다[참조 문헌: Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 674]. 상기 올리고뉴클레오타이드를 예비 겔 전기영동 또는 FPLC에 의해 정제한다. 이어서 에탄올 2.5용적부를 사용하여 0.5M NaCl로부터 침전시켜 나트륨 염을 수득한다.
올리고뉴클레오타이드를
(a) 20% 아크릴아미드에서의 분석적 겔 전기영동, 8M 요소, 454M 트리스-보레이트 완충액, pH7.0 및/또는
(b) HPLC 분석: Waters GenPak FAX, CH3CN(400㎖), H2O(1.61ℓ), NaH2PO4(3.1g), NaCl(11.7g), pH6.8(0.1M의 NaCl) 내지 CH3CN(400㎖), H2O(1.6ℓ), NaH2PO4(3.1g), NaCl(175.3g), pH 6.8(1.5M의 NaCl) 및/또는
(c) 모세관 겔 전기영동 베크만(Beckmann) 모세관 eCAPTM, U100P 겔 컬럼, 길이 65cm, I.D. 100mm, 창: 한 말단으로부터 15cm, 완충액 140μM 트리스, 360mM 붕산, 7M 요소 및/또는
(d) 전기분무 질량 분광계에 의해 분석한다.
올리고뉴클레오타이드의 분석은 후자가 각각의 경우에 90% 이상의 순도로 존재하며 대부분의 경우에 95% 이상의 순도로 존재함을 나타낸다.
실시예 2: 올리고뉴클레오타이드로의 5'-아미노-링커의 도입
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성한다. 최종 뉴클레오타이드를 커플링시킨 후, 5'-말단의 디메톡시트리틸 그룹을 절단한다. 유리 하이드록실 그룹과 시판되는 5'-아미노-개질제 C6(제조원: Eurogentic, Seraing, Belgium)를 테트라졸 촉매하에 반응시키고 요오드수로 산화시킨다. 이어서 올리고뉴클레오타이드를 50℃에서 농축된 암모니아로 밤새 처리하여 담체로부터 절단하고, 뉴클레오사이드내 그룹의 모든 염기-불안정 보호 그룹 및 헤테로사이클릭 염기의 아미노 작용 그룹을 절단한다. 최종 단계에서, 모노메톡시트리틸 보호 그룹을 실온에서 3시간 동안 80% 농도의 아세트산으로 처리하여 절단한다. 수득되는 올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 분석한다.
실시예 3: 아미노-링커 올리고뉴클레오타이드와 FDA-이소티오시아테이트와의 접합
실시예 2로부터의 10 OD(260)의 5'-아미노-링커 올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 중탄산 트리에틸암모늄(TBK) 완충액 16㎕ 속에 용해시키고 디메틸포름아미드(DMF) 125㎕와 혼화시킨다. FDA 이소티오시아네이트 1.5mg를 상기 혼합물에 첨가한 다음, 혼합물을 광 배제하에 3시간 동안 진탕한다. 반응 수득물을 HPLC에 의해 조사한 다음, 농축된 아세트산 2㎕를 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축시킨다. 이어서 당해 생성물을 부탄올로 침전시켜 정제한다. ESI 질량 분광계를 사용하여 정확한 질량을 측정한다. 방향족 에스테르가 가수분해되는 것을 피하기 위해, 샘플을 항상 7 미만의 pH에서 보관한다.
실시예 4: CO_1(5'-F3-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'; F3=FDA)
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 데옥시구아노신 1μmol이 3'-말단을 통해 결합된 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다. *로 표시된 위치를 보케이지 시약으로 산화시켜 포스포로티오에이트 브릿지를 도입한다. 이어서, 실시예 2에서 기술한 바와 같이 5'-아미노-개질된 C6과 커플링시킨다. 농축된 암모니아 및 80% 아세트산으로 탈보호시켜 96 OD(260)의 5'-아미노-링커-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'을 수득한다. 이어서 10 OD(260)의 5'-아미노-링커 올리고뉴클레오타이드를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 FDA 이소티오시아네이트와 반응시킨다. 부탄올로 침전시켜 8.4 OD(260)의 목적하는 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드를 수득한다. 이나트륨 염에 대한 ESI-MA는 5395.93(이나트륨에 대하여 산정시 5395.09)이다.
실시예 5: CO_13(5'-F3-TATTCCGTCAT-3')의 합성
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 티미딘 1μmol이 3'-말단을 통해 결합된 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다. 모든 산화는 요오드수를 사용하여 수행한다. 이어서 실시예 2에서 기술한 바와 같이 5'-아미노-개질제 C6와 커플링시킨다. 농축된 암모니아 및 80%의 아세트산으로 탈보호시켜 72 OD(260)의 5'-아미노-링커-TATTCCGTCAT-3'을 수득한다. 예비 폴리아크릴아미드 겔에서 정제하여 43 OD(260)를 수득한다. 이어서 10 OD(260)의 5'-아미노-링커 올리고뉴클레오타이드를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 FDA 이소티오시아네트와 반응시킨다. 부탄올로 침전시켜 9.1 OD(260)의 목적하는 FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드를 수득한다. ESI-MS: 3934.1(산정된 MW 3933.8).
실시예 6: CO_21(5'-F7-A*T*GAC*GGAA*T*T*C)의 합성
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 N6-벤조일시티딘 1μmol이 3'-말단을 통해 결합된 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다. 모든 산화는 요오드수를 사용하여 수행한다. 이어서 실시예 2에서 기술한 바와 같이, 5'-아미노-개질제 C6와 커플링시킨다. 농축된 암모니아 및 80%의 아세트산으로 탈보호시켜 145 OD(260)의 5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'을 수득한다. 10 OD(260)의 5'-아미노-링커 올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 16㎕ 및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 미리 제조한 p-아세톡시벤조산의 활성화 에스테르 30㎕과 반응시킨다. 상기 활성 에스테르는 각 경우 DMF중의 0.2M p-아세톡시벤조산 50㎕과 0.3M TBTU 50㎕를 혼합한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시켜 제조한다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 활성화 에스테르와 4시간 동안 반응시킨 후, 반농축된 아세트산 2㎕를 첨가하고, 혼합물을 감압하에 농축시킨다. 과량의 시약을 부탄올로 침전시켜 제거한다. 이렇게 하여 10.7 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 접합체를 수득한다. ESI-MS:4109.2(산정된 MW: 4108.2).
실시예 7: 올리고뉴클레오타이드 접합체의 세포 흡수의 조사
세포 흡수를 조사하기 위해, 세포 현탁액 1㎕를 현미경적 조절하에 배코퍼(Bachofer) 챔버내에서 항온처리 배지에서 올리고뉴클레오타이드 접합체의 1μ몰농도 용액 1㎕와 혼화시키는데, 혼합은 피펫을 사용하고 챔버를 진탕함으로써수행한다. 상-대비 모드에서 Zeiss Axiovert 135 TV 기구(100×Plan-Neofluar)를 보조로하여 현미경 검사를 수행한다. 사용되는 형광 필터는 09(450-490/FT10/LP 520)/HBO 59W 필터이다. 사용되는 참조는 아세톤/PBS 완충액(1: 1000; v:v)중의 2.4μM의 FDA 용액(Aldrich Chem. Co., 제조원, FW.416.39)이고, 에스테르 절단에 의해 형성된 플루오레세인 리간드의 고유 형광은 흡수후에 모니터링할 수 있다. 아세톡시나프탈렌카복실산과 같은 비형광 리간드의 경우, 적합한 플루오레세인 표지(FITC, 로다민, 시아닌 염료 Dy3 또는 Dy5)를 올리고뉴클레오타이드에 추가로 결합시킨다. CO_9와 같은 이중 표지를 사용하여 FDA가 올리고뉴클레오타이드로부터 절단되지 않았음을 입증한다. 별도의 샘플을 올리고뉴클레오타이드 접합체를 첨가하고 2 내지 120분 후에 평가한다. REH 세포의 경우, 형광은 5 내지 10분 후에 뚜렷하게 명백하며, K562 및 점착성 세포 및 곤충 세포의 경우, 첨가하고 60분 후까지 증가된다. 독립생활의 원생동물의 경우, 1시간 까지 흡수한다. 효모의 경우, 흡수는 오직 시간을 연장시킨 후에 발생하며 모든 세포에서 균일하지 않다. FDA 올리고뉴클레오타이드 접합체의 진균 포자내로의 흡수는 하이픈(hyphen) 세포보다 우수하다. 결과는 표 1 내지 3에 요약한다.
실시예 8: 올리고뉴클레오타이드 접합체의 항증식 활성 조사
REH 세포(사람 프리-B 세포 백혈병, DSM ACC 22) 또는 A549 종양 세포를 5% CO2하에 37℃에서 10% 태아 소 혈청(FCS; GIBCO-BRL)과 함께 OptiMEM에서 항온처리한다. 시험 하루 전에, 세포를 아배양하여 세포 농도가 24시간 후에 약 1×106/㎖가 되도록 한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 접합체를 증류수속에 용해시켜 1mM의 스톡 용액을 수득하고 -20℃의 냉동고에서 보관한다. 세포를 24웰 플레이트(10% FCS를 함유한 OptiMEM중의 1×106세포/㎖)에 접종한다. 조사를 위해, 올리고뉴클레오타이드 유도체를 (FCS를 함유하지 않는 OptiMEM속에서) 2μM로 희석한다. 세포당, 올리고뉴클레오타이드 용액 100㎕ 및 세포 현탁액 100㎕을 혼합한다(전체 용적 200㎕/웰; 올리고뉴클레오타이드 농도 1μM, 혈청 농도 5% FCS, 세포 농도 0.5×106세포/㎖). 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 항온처리한 후, OptiMEM 800㎕를 11% FCS와 함께 웰당 첨가하고(이때 세포 농도는 1×105세포/㎕이고, 혈청 농도는 10% FCS임) 항온처리를 지속한다. 37℃ 및 5% CO2에서 96시간 후, 세포 농도를 Casy 1(제조원: Scharfe)을 사용하여 측정한다. 이를 위해, 각각의 웰 중의 세포를 1000㎕들이 피펫내로 흡입시키고 사출시키는 것을 각각 10회 반복함으로써 혼합하고, 즉시 Casyton으로 1:100(보다 강한 세포 생장의 경우는 1:100임)으로 희석한다. 세포 밀도의 평균 수치를 각각의 경우에 한 배치의 3개의 동일한 샘플로부터 측정한다.
실시예 9: 5'-F4'(CO-NH)-A*T*GAC*GGAA*T*T*C의 합성
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 데옥시구아노신 1μmol이 3'-말단을 통해 결합된 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다. 포스포로티오에이트 라디칼(*가 서열내에 존재하는 경우)을 도입하기 위해, 요오드수 또는 보케이지 시약을 사용하여 산화시킨다. 이어서 실시예 2에서 기술한 바와 같이 5'-아미노-개질제 C6와 커플링시킨다. 농축된 암모니아 및 80% 아세트산으로 탈보호 시켜 145 OD(260)의 5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'을 수득한다. 10 OD의 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 16㎕ 및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 카복시플루오레세인 디피발레이트 하이드록시석신이미드(MW:626.36)와 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드와 하이드록시석신이미드를 3시간 동안 반응시킨 후, 반농축된 아세트산 2㎕를 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 2.8 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 디클로로플루오레세인 디아세테이트 접합체를 수득한다. ESI-MA:4403.3(산정된 MW: 4403.2)
실시예 10: 5'-F2'-(CO-NH)-A*T*GAC*GGAA*T*T*C의 합성
5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' 올리고머를 실시예 9에서 기술한 바와 같이 제조한다. 10 OD(260)의 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK완충액 16㎕ 및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 카복시플루오레세인 디피발레이트 하이드록시석신이미드(MW: 641.64) 12.5㎕와 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드와 하이드록시석신이미드를 2시간 동안 반응시킨 후, 하이드록시석신이미드의 나머지 12.5㎕를 첨가하고, 반응을 2시간 동안 추가로 지속시킨다. 이어서 반농축된 아세트산 2㎕를 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 8.1 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 플루오레세인 디피발레이트 접합체를 수득한다. ESI-MA:4472.9(산정된 MW: 4471.6)
실시예 11: 5'-F9-A*T*GAC*GGAA*T*T*C의 합성
5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C 올리고머를 실시예 9에서 기술한 바와 같이 제조한다. 10 OD(260)의 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 16㎕및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 아세톡시나프틸카복실산의 활성화 에스테르 25㎕와 반응시킨다. 상기 활성화 에스테르는 0.2M의 아세톡시나프틸카복실산 12.5㎕(DMF 50㎕중의 2.5mg)과 TBTU 12.5㎕(DMF 50㎕중의 4mg)을 혼합한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 활성화 에스테르와 17시간 동안 반응시킨 후, 반농축된 아세트산 2㎕을 첨가하고, 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음,부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 8.5 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 아세톡시나프틸 접합체를 수득한다. ESI-MS: 4158.2(산정된 MW: 4157.2).
실시예 12: 5'-F8-A*T*GAC*GGAA*T*T*C의 합성
5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' 올리고머를 실시예 9에서 기술한 바와 같이 제조한다. 10 OD(260)의 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 16㎕및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 아세톡시코우마린카복실산의 활성화 에스테르 25㎕와 반응시킨다. 상기 활성화 에스테르는 0.2M의 아세톡시코우마린카복실산 12.5㎕(DMF 50㎕중의 2.7mg)과 TBTU 12.5㎕(DMF 50㎕중의 4mg)을 혼합한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 활성화 에스테르와 17시간 동안 반응시킨 후, 반농축된 아세트산 2㎕을 첨가하고, 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 8.0 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 아세톡시나프틸 접합체를 수득한다. ESI-MS: 4178.5(산정된 MW: 4175.2).
실시예 13: 5'-F3-(dA)ndA*dA*dA(n= 17, 47 및 77; F3=FDA)의 합성
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 N6-벤조일-2'-데옥시구아노신으로 3'-말단을 통해 유도체화시킨 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다.산화는, 먼저 2회 커플링시킨 후 보케이지 시약을 사용하여 수행하여 포스포로티오에이트 라디칼(서열내에서 *로 표시됨)을 도입하고, 모든 나머지 산화는 요오드수를 사용하여 수행한다. 이어서 실시예 2에서 기술한 바와 같이 5'-아미노-개질제 C6와 커플링시킨다. 농축된 암모니아 및 80% 아세트산으로 탈보호시키고 예비 폴리아크릴아드 겔에서 정제하여 2.95 OD(260)의 5'-아미노-링커-(dA)17dA*dA*dA, 4.9 OD(260)의 5'-아미노-링커-(dA)47dA*dA*dA 및 5 OD(260)의 5'-아미노-링커-(dA)77dA*dA*dA를 수득한다. 각각의 경우, 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 8㎕및 DMF 62㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 FDA 이소티오시아네이트 1.6㎕와 반응시킨다. 3시간 동안 반응시킨 후, 추가의 FDA 이소티오시아네이트를 첨가하고, 반응을 2시간 동안 지속시킨다. 이어서 반농축된 아세트산 2㎕을 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 1.5 OD(260)의 5'-F3-(dA)77dA*dA*dA, 2.2 OD(260)의 5'-F3-(dA)47dA*dA*dA 및 0.9D(260)의 5'-F3-(dA)77dA*dA*dA를 수득한다.
실시예 14: 이중 표지된 올리고뉴클레오타이드 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3; F3=FDA의 합성
올리고뉴클레오타이드를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 3'-말단에 C6-아미노-링커를 도입하도록 하는 CPG 담체로부터 출발하여 합성한다[참조 문헌: Petri et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3, 85-87]. 요오드수 또는 보케이지 시약을 사용하여 산화시켜 포스포로티오에이트 라디칼(*가 서열내에 존재하는 경우)를 도입한다. 최종 디메톡시트리틸 보호 그룹을 절단한 후, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단을 Cy3-CE 포스포아미디트(제조원: Glen Research, Sterlin, VA; Catalog No. 10-5913-xx)과 반응시키고 요오드수로 산화시킨다. 농축된 암모니아로 (70℃에서 2시간 동안) 탈보호시켜 64 OD(260)의 조 생성물을 수득한다. 예비 폴리아크릴아미드 겔에서 정제하여 3.8 OD의 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-아미노-링커-3'를 수득하고 3.5 OD(260)의 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-아미노-링커-3'를 0.2M TBK 완충액 8㎕ 및 DMF 62㎕ 속에 용해시키고 FDA 이소티오시아네이트 1.6μmol과 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 하이드록시석신이미드와 3.5시간 동안 반응시킨 후, 반농축된 아세트산 1㎕를 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 3.5 OD(260)의 목적하는 이중 표지된 올리고뉴클레오타이드 5'-Cy3-A*T*G AC*GGAA*T*T*C-C6-F3를 수득한다. ESI-MS: 4926.2(산정된 MW: 4927.1).
실시예 15: 5'-F3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C; F3=FDA의 합성
5'-아미노-링커-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' 올리고머를 실시예 9에서 기술한 바와같이 제조한다. 10 OD(260)의 5'-아미노-링커-올리고뉴클레오타이드를 0.2M의 TBK 완충액 16㎕및 DMF 95㎕ 속에 용해시키고, 혼합물을 FDA 이소티오시아네이트 25㎕(DMF 100㎕중의 5mg)와 반응시킨다. 아미노-링커-올리고뉴클레오타이드와 이소티오시아네이트를 3시간 동안 반응시킨 후, 추가의 이소티오시아네이트 5㎕를 첨가하고 반응을 추가로 2시간 동안 지속시킨다. 이어서 반농축된 아세트산 2㎕를 첨가하고, 혼합물을 감압하에 농축시킨다. NAP 컬럼TM(제조원: Pharmacia)에서 탈염한 다음, 부탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 8.5 OD(260)의 목적하는 올리고뉴클레오타이드 플루오레세인 디아세테이트 접합체를 수득한다. ESI-MS: 4418.4(산정된 MW: 4418.5).
실시예 16: 상이한 길이의 5'-F3-(dA)ndA*dA*dA(n= 17, 47 및 77; F3=FDA) 접합체의 세포 흡수의 비교
실시예 12의 상이한 길이 및 분자량의 접합체의 세포 흡수는 일반적으로 실시예 7에서 기술한 바와 같이 REH 세포를 사용하여 수행한다. 유량 세포계측법을 보조로하여 정량한다. 60분 후, 5'-F3(dA)17dA*dA*dA("A20")에 대한 상대적 형광시그널은 49이고, 5'-F3(dA)47dA*dA*dA("A50")에 대한 상대적 형광 시그널은 34이고, 5'-F3-(dA)77dA*dA*dA("A80")에 대한 형광 시그널은 91이다. 놀랍게도, 총 80개의 뉴클레오타이드를 포함하는 가장 큰 올리고뉴클레오타이드 잔기를 갖는 FDA 접합체의 흡수는 REH 세포에 의해 가장 효율적으로 이루어진다.
실시예 17: 상이하게 유도체화된 올리고뉴클레오타이드 접합체의 세포 흡수의 비교
플루오레세인 디피발레이트는 에스테르 그룹의 안정성이 증가된 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 관련 화합물이다. 상응하는 올리고뉴클레오타이드 접합체를 유량 세포계측법을 사용하여 흡수에 대하여 조사한다. 알칼리 및 에스테라제에 대한 피발레이트의 안정성 증가는 상응하는 올리고뉴클레오타이드 접합체의 흡수를 감소시킨다. 따라서, 플루오레세인 디아세테이트 접합체에 대하여 측정한 상대적 형광성은 60분 후에 195이 반면, 상응하는 플루오레세인 디피발레이트 접합체에 대한 형광성은 단지 55이다.
실시예 18: 실시예 13의 이중 표지된 올리고뉴클레오타이드 접합체 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-FDA의 세포 흡수 조사
FACScan은 Cy3 올리고뉴클레오타이드 F3 접합체가 REH 세포에 이해 신속하게흡수된다는 것을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드 접합체/Cellfectin 접합체를 사용한 세포 치료는 유사하나 거의 균일하지 않은 흡수를 야기한다. FDA 접합체의 효과는 Cellfectin 올리고뉴클레오타이드 복합체의 효과를 현저하게 방해한다.
또한, 세포와 함께 항온처리시 올리로뉴클레오타이드상의 2개의 상이한 마커 그룹의 동시국재화(colocalization)를 조사하는데, 측정된 형광성이 오직 절단된 FDA 또는 플루오레세인에만 기초할 확률은 제외한다. Cy3 올리고뉴클레오타이드 F3 접합체는 5'-말단에 공유 결합된 시아닌 염료 및 3'-말단에 공유 결합된 FDA를 갖는다. 도 9는 REH 세포와 Cy3 올리고뉴클레오타이드 F3 접합체를 4시간 동안 항온처리한 후의 녹색 및 적색 형광을 나타낸다. 세포내의 2개의 마커의 동시국재화를 관찰할 수 있기 때문에, 올리고뉴클레오타이드가 완전한 형태로 흡수되는 것으로 예상된다. 비형광 FDA 라디칼이 명백하게 형광성 플루오레세인 라디칼로 전환되기 때문에, 가정상 FDA 잔기의 아세틸 그룹만이 에스테라제에 의해 가수분해된다. 2개의 마커가 첨가한지 단지 7분 후에 검출되기 때문에 Cy3/FDA 접합체는 매우 신속하게 흡수된다.
실시예 4의 4가지 농도의 올리고뉴클레오타이드 FDA 접합체 CO_1를 A549 종양 세포에서 항증식 활성에 대하여 조사한다. 침투 증강제의 첨가 없이 접합체는 증식을 억제한다. F3 접합체(ON1)를 갖지 않는 상응하는 올리고뉴클레오타이드는 침투 증강제(CellFectin, 제조원: Gibco-BRL)와 복합체를 형성한 후에만 증식을 억제한다. 이 결과를 표 4에 나타낸다.
평광 현미경을 사용한, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드(접합체 올리고뉴클레오타이드-FDA)의 포유동물 세포내로의 흡수 조사
포유동물 세포:세포주의 명칭 5분후의 형광A B 20분 후의 형광A B 60분후의 형광A B 120분 후의 형광A B
REHK562Lu 18KB3-1Ptk 2 + - +(+) - +++(+)+(+) - ++++++ *
A: FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_1 및 CO_3과 함께 항온처리B: 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_2 및 CO_4와 함께 항온처리(+) 약한 흡수+ 보통의 흡수++ 매우 강한 흡수- 흡수하지 않음* 손상된 세포내로만 흡수
현광 현미경을 사용한, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드의 곤충 세포내로의 흡수 조사(주석은 표 1 참조)
곤충 세포 20분후의 형광A B 60분 후A B 120분 후A B
SF9 세포 + - ++ - ++ -
현광 현미경을 사용한, FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드의 다양한 유기체내로의 흡수 조사
유기체 20분 후의 형광A B 60분 후의 형광A B 120분 후의 형광A B
바실러스 서브틸러스(6633)# - - - - + -
락토바실러스 불가리쿠스# - - + - + -
이.콜라이(K12)# - - + - + -
야로위아 리폴리티카#(야생형 H222) - - - - + -
사카로마이세스 세레비시애# - - - - + -
푸사리움 쿨모룸 포자(JP15, 진균) (+) - + - + -
레티쿨모믹사 필로사 낭(담수 아메바) - - 특히 핵내에서++ - ++ -
해마토코커스 플루비알리스(녹조류, 편모충) - - + - + -
클로로고늄 아종(녹조류, 편모충) - - + - + -
두날리엘라 살리나(바다 규조류) - - + - + -
A: FDA-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_1 및 CO_3와 함께 항온처리B: 플루오레세인-표지된 올리고뉴클레오타이드 CO_2 및 CO_4와 함께 항온처리(평가에 대한 주석은 표 1을 참조)#는 빠르게 분열하는 상기 유기체의 일부 세포내로만 흡수된다.
실시예 8의 결과
물질 세포 밀도 억제율(%)
없음 5.96 -
FDA 6.05 -1.5
100nM CO_1 5.65 5.2
200nM CO_1 5.3 11.1
500nM CO_1 5.03 15.6
1000nM CO_1 4.16 30.2
길이의 함수로서의 FDA 접합체의 형질감염(실시예 15의 A20, A50, A80)
시간[분] 형광 형광 형광
A20 A50 A80
0 0.0103 0.0103 0.0103
10 11.71 8.9 43.31
20 39.68 28.06 88.36
30 48.59 34.38 91.28
40 54.7 38.75 92.35
50 58.66 41.64 93.19
60 62.13 44.33 93.62
플루오레세인 디아세테이트 및 플루오레세인 디피발레이트 올리고뉴클레오타이드 접합체의 세포 흡수의 비교(실시예 16, 도 8)
시간[분] 형광 형광
K39 K41
0 2.66 2.75
10 72.37 8.49
20 112.34 18.17
30 142.97 28.67
40 164.64 38.34
50 184.96 46.62
60 195.57 55.26
70
80 218.12 68.02
90
100 231.04 83.7
110
120 253.84 97

Claims (26)

  1. 수송될 분자 및 하나 이상의 화학식 Ⅰ의 라디칼을 포함하는 접합체로서, 당해 아릴 라디칼이 수송될 분자에 화학 결합을 통해 직접 결합되어 있거나 화학 그룹을 통해 간접적으로 연결되어 있으며, 이때 화학 그룹은 결합이 수송될 분자의 뉴클레오타이드내 포스포디에스테르 결합을 통한 것일 경우 CH2-S 그룹이 아닌 접합체.
    화학식 Ⅰ
    상기 화학식에서,
    아릴은 방향족 특성을 갖는 하나 이상의 환을 함유하는 그룹이고,
    X는 O 또는 N이며,
    Y는 O, S 또는 NH-R2이고,
    R1은 직쇄 또는 측쇄일 수 있으며 이중 및/또는 삼중 결합을 함유할 수 있는 치환되거나 비치환된 C1-C23알킬 라디칼이며,
    R2는 직쇄 또는 측쇄일수 있으며 이중 및/또는 삼중 결합을 함유할 수 있는치환되거나 비치환된 C1-C18알킬이며,
    n은 1보다 큰 정수이거나 1과 동일하다.
  2. 제1항에 있어서, 수송될 분자가 500달톤 초과의 분자량을 갖는 거대분자인 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수송될 분자가 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 폴리사카라이드인 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 수송될 분자가 올리고뉴클레오타이드인 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 개질되는 접합체.
  6. 제1항에 있어서, 수송될 분자가 500달톤 미만의 분자량을 갖는 저분자량 화합물인 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 저분자량 화합물이 모노뉴클레오타이드인 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학 그룹이 아릴 라디칼과 함께 화학식 Ⅱ를 갖는 접합체.
    화학식 Ⅱ
    상기 화학식에서,
    아릴은 방향족 특성을 갖는 하나 이상의 환을 함유하는 그룹이고,
    X는 O 또는 N이며,
    Y는 O, S 또는 NH-R2이고,
    R1은 직쇄 또는 측쇄일 수 있으며 이중 및/또는 삼중 결합을 함유할 수 있는 치환되거나 비치환된 C1-C23알킬 라디칼이며,
    R3은 화학 그룹이고, 바람직하게는 -C(=O) 그룹 또는 -NH-C(=S) 그룹이다.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학 그룹 및 아릴 라디칼이함께, 화학식 F1 내지 화학식 F11 중의 하나를 갖는 접합체.
  10. (a) 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 모노뉴클레오타이드 및
    (b) 하나 이상의 화학식 Ⅰ의 라디칼을 포함하는 접합체로서, 당해 아릴 라디칼이 5' 말단 및/또는 3' 말단 및/또는 하나 이상의 뉴클레오베이스 및/또는 하나 이상의 당 라디칼 및/또는 하나 이상의 뉴클레오사이드내 결합에 화학 결합을 통해 직접 결합되어 있거나 화학 그룹을 통해 간접적으로 결합되어 있으며, 결합이 뉴클레오타이드내 포스포디에스테르 결합을 통해 이루어지지 않는 경우에 화학 그룹이 CH2-S 그룹인 접합체.
  11. (a) 아릴 라디칼이 결합될 위치에 반응성 작용 그룹을 갖는, 수송될 분자를제조하는 단계,
    (b) 아릴 라디칼을 제조하는 단계 및
    (c) 수송될 분자를 아릴 라디칼과 반응시켜 접합체를 수득하는 단계를 포함하는, 수송될 분자 및 하나 이상의 아릴 라디칼을 포함하는, 접합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 반응성 작용 그룹이 아미노 그룹, 머캅토 그룹, 클로로아세틸 그룹, 이소시아네이트 그룹, 이소티오시아네이트 그룹, 카복실산 그룹, N-하이드록시석신이미드 그룹 또는 카보닐 클로라이드 그룹인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 수송될 분자와 아릴 라디칼의 반응이 7.5 이하의 pH에서 수행되는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 수송될 분자와 아릴 라디칼의 반응이 pH 7.0에서 수행되는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 수송될 분자가 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 모노뉴클레오타이드인 방법.
  16. 수송될 분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한 당해 분자에 결합된 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 아릴 라디칼의 용도.
  17. (a) 수송될 분자가 하나 이상의 화학식 Ⅰ또는 Ⅱ의 아릴 라디칼에 결합된 접합체를 제조하는 단계 및
    (b) 접합체를 막과 함께 항온처리하는 단계를 포함하여, 분자를 막을 통해 수송하는 방법.
  18. (a) 수송될 분자가 하나 이상의 화학식 Ⅰ또는 Ⅱ의 아릴 라디칼에 결합된 접합체를 제조하는 단계,
    (b) 접합체를 세포와 함께 항온처리하는 단계 및
    (c) 접합체를 아릴 라디칼의 절단 없이 세포내로 수송하는 단계를 포함하여,
    분자를 세포내로 수송하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 진핵 또는 원핵 세포인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 세포가 세균 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 사람 세포인 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 종양 세포인 방법.
  23. (a) 아릴 라디칼이 결합될 위치에 하나 이상의 반응성 작용 그룹을 함유하는 약제학적 활성 화합물 또는 이의 유도체를 제조하는 단계,
    (b) 화학식 I 또는 II의 아릴 라디칼을 제조하는 단계,
    (c) 약제학적 활성 화합물 또는 이의 유도체를 당해 아릴 라디칼과 반응시켜 접합체를 수득하는 단계 및
    (d) 경우에 따라서, 접합체를 추가의 첨가제 및/또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 의약의 제조방법.
  24. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 접합체를 포함하는 의약.
  25. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 접합체를 포함하는 진단 보조제.
  26. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 접합체를 포함하는 시험 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100690199B1 (ko) * 2006-04-20 2007-03-12 이화여자대학교 산학협력단 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7026166B2 (en) * 2002-01-22 2006-04-11 Chiron Corporation Fluorogenic dyes
US7704756B2 (en) 2003-01-21 2010-04-27 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Fluorogenic dyes
US20070167388A1 (en) * 2003-09-11 2007-07-19 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
EP1645288A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-12 CTG Pharma S.r.l. New nuclear transcription factors regulators
RU2010112771A (ru) * 2007-10-09 2011-11-20 Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки
CN103282503B (zh) * 2010-12-29 2015-12-02 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于细胞内递送核酸的小分子缀合物
SG10202004611SA (en) * 2014-05-23 2020-06-29 Genzyme Corp Multiple oligonucleotide moieties on peptide carrier
US20180036312A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 ISI Life Sciences Inc. Novel Scaffolds for Intracellular Compound Delivery for the Detection of Cancer Cells
WO2018026965A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Isi Life Sciences, Inc. Compositions and methods for detecting cancer cells in a tissue sample
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
US10539567B2 (en) * 2017-05-15 2020-01-21 Indicator Systems International, Inc. Biopsy methods and devices
KR20230096856A (ko) 2021-12-22 2023-06-30 한국과학기술연구원 신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
WO1995006659A1 (en) * 1992-07-01 1995-03-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6228982B1 (en) 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
IL104461A (en) 1992-01-22 2001-05-20 Hoechst Ag Oligonucleotide analogs, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6033909A (en) 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
US5633360A (en) * 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
RU2094059C1 (ru) * 1993-08-30 1997-10-27 Московский государственный университет, химический факультет Способ транспорта нейротропных препаратов в мозг
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
RU2127606C1 (ru) * 1994-12-23 1999-03-20 Санкт-Петербургский государственный университет Способ получения растворимых ковалентных конъюгатов
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5698411A (en) 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
AU7737196A (en) * 1996-11-14 1998-06-03 Brigham And Women's Hospital Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
GB9809084D0 (en) 1998-04-28 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
DE19824535A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Roche Diagnostics Gmbh Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6080580A (en) 1998-10-05 2000-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression
WO2000078791A2 (en) 1999-06-17 2000-12-28 Universiteit Gent FUNCTIONAL POLY-α-AMINOACID DERIVATIVES USEFUL FOR THE MODIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIALS AND THEIR APPLICATION

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100690199B1 (ko) * 2006-04-20 2007-03-12 이화여자대학교 산학협력단 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN1227035C (zh) 2005-11-16
IL147527A (en) 2006-08-01
AR029385A1 (es) 2003-06-25
MEP56408A (en) 2011-05-10
RS51447B (sr) 2011-04-30
AU776114B2 (en) 2004-08-26
TR200706709T2 (tr) 2008-02-21
EP1204430A2 (de) 2002-05-15
CN1360507A (zh) 2002-07-24
TR200200222T2 (tr) 2002-07-22
PL202881B1 (pl) 2009-07-31
CA2377977A1 (en) 2001-02-08
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