KR20020031893A

KR20020031893A - 고분자 결합을 이용한 췌장소도 막의 표면개질 방법

Info

Publication number: KR20020031893A
Application number: KR1020000062667A
Authority: KR
Inventors: 변영로; 양경욱; 이동윤
Original assignee: 윤동진; 주식회사 메디프렉스
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2002-05-03
Anticipated expiration: 2020-10-24
Also published as: US20070207118A1; AU2001211768A1; KR100380569B1; WO2002034306A1

Abstract

본 발명은 고분자 (polymer)를 이용한 췌장소도 (pancreatic islet) 막의 표면개질 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 췌장소도를 캡슐봉입 (encapsulation)하는 대신에 다양한 고분자 결합 (polymeric grafting)을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 사슬을 췌장소도의 글리코겐 막 (glycogen membrane) 표면에 결합시켜 막 표면을 개질하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 표면개질 방법에 의해 막 표면이 변형된 췌장소도는 이식시 면역 반응을 최소화하면서 산소나 영양소가 원활히 확산될 수 있어 췌장소도의 효율과 생존 기간을 연장시킬 뿐 아니라 이식에 필요한 췌장소도의 전체 부피를 줄일 수 있어 제제화에 따른 문제점을 극복할 수 있다.

Description

고분자 결합을 이용한 췌장소도 막의 표면개질 방법{Surface modification of islet membranes by polymeric grafting methods}

본 발명은 고분자 (polymer)를 이용한 췌장소도 (pancreatic islet) 막의 표면개질 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 췌장소도를 캡슐봉입 (encapsulation)하는 대신에 다양한 고분자 결합 (polymeric grafting)을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 사슬을 췌장소도의 글리코겐 막 (glycogen membrane) 표면에 결합시켜 막 표면을 개질하는 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍에 따른 고혈당과 이에 수반되는 여러 가지 대상 장애를 특징으로 하는 질병이다. 인슐린을 분비하는 췌장소도 (islet) 내의 베타세포 (β-cell)의 대량 파괴에 의한 제 1 형 (인슐린 의존성, insulin-dependent) 당뇨병은 물론이고 제 2 형 (인슐린 비의존성, insulin-independent) 당뇨병의 경우에도 포도당 자극에 대한 인슐린 분비반응의 결함이 발견되는데, 이와 같은 분비반응의 이상기전에 대해서는 현재까지 확실하게 밝혀지지 않고 있다.

제 1 형 당뇨병의 근본적인 치료법으로 제시된 췌장소도 이식술 (islet transplantation)은 인슐린의 정맥주사 방법과는 달리 혈액 내의 혈당 변화에 따라 인슐린을 분비하거나 글루카곤을 분비하여 혈당량을 일정하게 유지하는 기능을 수행하며 필요한 효소를 분비함으로써 인슐린 의존형 당뇨병 말기환자에 있어서의 유일한 완치방법으로 제시되어 왔다. 하지만, 췌장소도를 이식하는 방법에 있어서 자가 이식 (Auto-transplantation)인 경우에는 이식된 췌장소도의 파괴 정도는 적은 장점이 있지만 이식할 수 있는 췌장소도의 구입이 극히 제한되어 있다는 점과 이식 후에 나타나는 면역반응이 가장 큰 걸림돌이 되어 왔다.

이식 후 나타나는 면역반응은 이식된 췌장소도가 면역세포에 의하여 파괴되는 것을 말하는데, 이는 면역반응을 유도하지 않는 췌장소도를 개발함으로써 해결될 수 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위하여, 타인의 췌장소도를 이식하는 타가이식 (allo-transplantation) 및 이종이식 (Xeno-transplantation) 기술이 개발되었는데, 이종이식 기술을 예로 들면 돼지 등의 췌장소도를 사람에게 이식시키는 방법으로써 충분한 췌장소도를 확보할 수 있다는 장점은 있으나, 거부반응이 심하여 이식 후 2주 이내에 췌장소도가 파괴되는 것으로 보고되었다. 따라서, 이종이식 기술과 같이 면역반응을 유발하지 않는 췌장소도의 개발은 췌장소도의 이식기술에 있어서 가장 핵심이 되는 기술이라고 할 수 있다.

췌장소도의 이식 후에 나타나는 면역반응을 억제하기 위해서 여러 가지의 방법들이 제안되었다. 예를 들면 혈관 내 장치 (intravascular device), 마이크로캡슐봉입 (microencapsulation) 방법, 마크로캡슐봉입 (macrocapsulation) 방법 등이 개발되었는데, 이들 방법들은 면역반응을 상당수준 억제하는 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있으나 췌장소도 이식에 있어서 또 다른 근본적인 문제점을 갖고 있다. 근본적인 문제점이란, 첫째 상기 장치 내에 포집되어 있는 췌장소도의 생존성 (viability)에 관한 문제와, 둘째 이식해야 할 췌장소도 및 장치의 부피에 관한 문제이다.

췌장소도의 생존성에 관련된 문제점은 췌장소도의 생존에 필수적인 산소 및 영양분의 공급과 관련된 것이다. 췌장소도를 캡슐봉입 (encapsuation)하는 방법의 경우, 췌장소도에서 주위의 혈관까지의 거리가 멀기 때문에 영양분 및 산소의 공급이 원할하지 못하고, 이로 인해 체내 혈당변화에 따라 민감하게 반응할 수 없으므로 췌장소도에서 인슐린이 효과적으로 분비되기 어렵다. 정상적인 췌장 내의 췌장소도에는 미세혈관이 존재하기 때문에 췌장소도 내의 세포와 혈관사이는 수십 마이크로미터의 거리에 불과하나, 마이크로캡슐로 봉입되는 경우에는 상기의 거리가 수백 마이크로미터를 유지하고 있어서 이식된 췌장소도의 생존률이 급격히 감소하게 되고 인슐린 분비 기능도 저하되는 문제점이 있다.

또한, 췌장소도를 캡슐로 봉입한 장치의 부피에 관한 문제점은 임상적으로 췌장소도 이식의 한계점을 갖게 한다. 즉, 인체 내 췌장소도의 부피는 약 10 ㎖ 정도이지만, 췌장소도를 마이크로캡슐로 봉입하여 제제화하면 그 부피는 10배 이상으로 증가하게 되고 이로 인해 적정량의 췌장소도를 이식하는 데는 상당한 제한이 따르기 마련이다.

췌장소도 이식술을 성공적으로 이행하기 위하여 면역반응으로부터 췌장소도를 방어하기 위한 연구의 일환으로서, 손상된 췌장을 대체하기 위한 서로 다른 두종류의 면역분리 장치 (immunoisolation devices)가 개발되었다. 이들은 혈관 내 (intravascular) 장치와 혈관 외 (extravascular) 장치로 구분되는데, 혈관 외 장치는 보다 구체적으로 마크로캡슐 (macrocapsule)과 마이크로캡슐 (microcapsule)로 나뉜다. 혈관 내 장치는 피하조직 (subcutaneous tissue) 내 혹은 복강 (peritoneal cavity)과 같은 체내 공간에 이식되어 진다.

(1) 혈관 내 장치 (Intravascular device)

췌장은 매우 치밀하게 혈관화된 구조를 구성하고 있는 조직으로서, 췌장소도는 췌장 내 혈관을 통해 영양분과 산소를 공급받기 때문에 췌장소도의 효율적인 이식을 위해서는 균형잡힌 혈관 시스템을 갖춘 장치의 개발이 요구된다. 일반적으로, 혈관 내 장치는 막성 튜브 (membrane tube)로 만들어지며 췌장소도를 둘러싸게 되는데, 혈액은 췌장소도에 영양분과 산소를 공급하고 췌장소도로부터 분비되는 노폐물을 제거하면서 막성 튜브 내를 흐르게 된다. 또한, 췌장소도를 둘러싸고 있는 막은 혈관 내 장치로 면역세포 (immune cell)가 침투하는 것을 방지하는 역할을 수행한다.

하지만, 상기 장치는 생체 내로 이식될 경우 혈전증 (thrombosis)을 유발하는 문제점이 있는데, 이와 같이 유발된 혈전이 혈관 내 장치의 막성 튜브를 통한 혈액의 흐름을 저해하고 이로 인해 유동속도가 감소하여 영양분과 산소의 공급 및 노페물의 제거가 어렵게 된다. 췌장소도의 면역분리에 중요한 역할을 수행하는 막은 혈전증을 유발할 뿐 아니라 혈액 내 유동적인 글루코오즈 (glucose)의 농도에대한 췌장소도의 조절반응을 저해한다고 알려져 있다. 이러한 문제점 이외에도, 외과적 수술시의 어려움이 상기 혈관 내 장치를 이용한 이식의 또 다른 문제점으로 제기되고 있는 실정이다.

(2) 혈관 외 장치 (Extravascular device)

(2-1) 마이크로캡슐 (Microcapsule)

췌장소도의 마이크로캡슐봉입 (microencapsulation)에 가장 널리 사용되고 있는 방법은 췌장소도 표면에 반투과성 막 (semipermeable membrane)을 형성하기 위하여 고분자 코팅 (polymer coatings)을 수행한 후 친수성 알긴산염 겔 (hydrophilic alginate gel)을 사용하여 췌장소도를 봉입 (envelopment)하는 방법이다. 췌장소도의 봉입에 사용되는 알긴산염 용액은 2가 양이온 (divalent cations)을 포함하는 수용액 상에 주입된 상태로 이용된다. 췌장소도의 마이크로캡슐봉입은 일반적으로 사용되는 다른 췌장소도의 면역분리 장치에 비하여 세포의 생존능력을 증가시킨다. 마크로캡슐과 비교할 때, 췌장소도를 둘러싼 마이크로캡슐 막의 두께는 마크로캡슐 막의 두께보다 훨씬 얇기 때문에 마크로캡슐로 봉입하는 경우 보다 산소나 영양분이 훨씬 용이하게 췌장소도 내로 확산될 수 있다. 또한, 마이크로캡슐은 높은 확산속도 (diffusion rate)를 가질 뿐 아니라, 마이크로캡슐 외부로부터 캡슐 내의 췌장소도로 확산되는 거리가 짧기 때문에 마크로캡슐 보다 훨씬 빠르게 글루코오즈의 농도 변화에 대해 반응할 수 있다.

이러한 특징들로 인하여 췌장소도의 마이크로캡슐봉입 방법은 면역 시스템으로부터 췌장소도를 분리하는데 매우 유용한 방법으로 제시되고 있다. 하지만, 상기 방법에도 해결해야 할 몇가지 문제점이 있다. 마이크로캡슐 내에서의 췌장소도의 응괴 (aggregation)는 응괴된 췌장소도 덩어리의 중앙에 위치한 세포에 영양분 및 산소가 확산되는 것을 방해하게 되어 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. 마이크로캡슐을 제거하는데 있어서의 어려움은 또 다른 문제점을 유발하는데, 마이크로캡슐 내의 췌장소도는 장기간에 걸쳐 괴사 (necrosis)로 인해 사멸되기 때문에 이로 인한 더 이상의 면역 반응이 유발되는 것을 방지하기 위해서는 부가적인 외과적 수술에 의해 마이크로캡슐을 제거해야만 한다.

(2-2) 마크로캡슐 (Macrocapsule)

마크로캡슐봉입은 면역분리를 위하여 대량의 세포 혹은 조직을 봉입하는 방법으로서 췌장소도의 큰 덩어리를 둘러싸는 막은 혈관 내 시스템과 비슷하다. 상기 막은 림프구 (lymphocytes) 및 대식세포 (macrophages)와 같은 식세포 (phagocytic cells)가 침투하는 것을 방지하여 면역반응을 유발하지 않으면서 작은 분자들, 예를 들면 글루코오즈 또는 산소가 확산되는 것은 허용하여 영양분 및 산소의 공급은 원활하게 해주는 장점을 갖는다. 또한, 상기 막은 공동 섬유 (hollow fiber), 시트 (sheet) 또는 디스크 (disc) 형태의 모양을 갖고 있어 다양한 세포 및 조직에의 응용이 가능하다.

마크로캡슐의 가장 주된 장점은 모든 췌장소도가 중앙의 공간 내에 모이기 때문에 외과적 수술이 용이하고 제거하는데 있어서 최소한의 외과적 위험을 가진다는 것이다. 하지만, 상기 막은 얇고 손상되기 쉬워 찢어지기 쉽다는 단점을 가지며 일단 막이 한번 찢어지게 되면 막 주변의 조각 또는 반흔이 면역반응을 촉발할 수 있는 위험을 내포하고 있다. 따라서, 상기 막은 기계적 결함을 방지하기 위하여 어떠한 응력도 견딜 수 있는 저항성을 가져야 한다. 또 다른 문제점은 마이크로캡슐보다 산소 또는 영양분의 공급이 제한적이고 캡슐 내에 노폐물이 축적된다는 것이다.

신생혈관이 잘 발달되어 있더라도 마크로캡슐은 췌장소도의 큰 덩어리를 둘러싸기 때문에 췌장소도의 생존을 위해 요구되는 영양분과 산소의 공급이 마크로캡슐 중앙에 위치한 췌장소도까지 효과적으로 제공될 수 없으며, 한정된 공간안에서의 췌장소도의 응괴는 췌장소도의 괴사를 가속화시키는 결과를 초래하게 된다. 당뇨병 (diabetes mellitus) 치료를 위하여 마크로캡슐로 봉입된 췌장소도 덩어리가 이식된다 하더라도 이식된 췌장소도가 항상 정상적인 수준의 인슐린을 분비하는 것은 아니기 때문에 이와 같은 낮은 인슐린 분비를 보충하기 위해서는 이식되는 췌장소도 덩어리의 전체 부피가 증가되어야 하는 문제점이 있다.

본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위하여 췌장소도를 고분자로 코팅하는 대신 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, 이하 "PEG"라고 약칭함)과 같은 고분자 사슬을 췌장소도 표면에 결합시켜 면역반응에 의한 췌장소도의 파괴를 방지할 뿐만 아니라 고분자 사슬에 의해 생긴 공간으로 산소와 영양분이 충분히 전달되도록 하여 췌장소도의 효율과 생존 기간을 늘리는 방법을 개발하였다.

PEG는 생체의학 뿐 아니라 약학적 응용 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용되고 있는 고분자 물질이다. PEG는 수용성 환경에서 최소한의 접촉 에너지 (interfacial energy)를 가지기 때문에 PEG 사슬은 고도의 유동성을 가지며 수화된 상태로 존재한다. 표면에 부착된 PEG 사슬은 다른 입자 혹은 단백질들의 접근에 의해 압축되는데, 이러한 PEG 사슬의 압축은 엔트로피 (entropy)의 손실을 가져온다. 따라서, 이러한 엔트로피의 손실을 보충하기 위해서는 PEG 사슬에 접근하는 물질들을 밖으로 밀어낼 수 있는 탄력성 (elastic property)을 유지해야 한다. 이러한 탄력성 이외에도 PEG는 매우 큰 제한적 용량을 가지고 있어 상기 물질들의 접근을 피하도록 도와준다. PEG의 이러한 특징은 고분자 표면에 생체적합성 (biocompatibility)을 부여하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, PEG는 단백질, 약물 또는 리포좀 (liposome) 등에 결합할 수 있으며, 이와 같이 PEG가 결합된 단백질이나 약물은 식작용 (phagocytosis)을 피할 수 있고 그로 인해 체내 순환 기간 (circulating time)과 반감기 (half-life)를 오래 유지할 수 있다고 알려져 있다. 이와 같이, 단백질 또는 약리 활성을 가진 분자를 합성 고분자와 결합시키는 것은 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (in vitro) 적용 시에 많은 이점을 제공할 수 있다. 생리활성 분자에 대한 고분자의 공유결합은 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시킬 수 있으며, 물 또는 유기용매에 대한 용해성을 증가시킬 수 있다. 또한, 생체적합성을 증가시키고 면역 반응성을 감소시키며, 생체 내에서의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 장관 시스템, 신장 (kidney), 비장(spleen) 또는 간 (liver)에 의한 소실 (clearance)을 감소시킬 수 있다. 따라서, 펩타이드에 고분자를 수식하는 것은 용액 내에서의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 펩타이드의 내인성 (intrinsic) 표면 특성을 효과적으로 보호할 수 있어 비특이적 단백질 흡착을 방지할 수 있다.

미국 특허 제4179337호는 펩타이드와 폴리펩타이드 (polypeptide)를 분자량이 500 ~ 20,000정도의 PEG 또는 수용성 폴리머 (polymer)에 결합시켜 생물학적 활성을 유지하면서 항원성과 항면역성이 감소된 펩타이드-고분자 결합체에 대해 언급하였다. 또한, 미국 특허 제4301144호는 헤모글로빈 (hemoglobin)을 PEG나 수용성 폴리머와 결합하였을 때 산소 운반능이 증가됨을 기재하고 있다.

아부초스키 등 (Abuchowskiet al.,Cancer Biochem. Biophys., 7, 175-186, 1984)은 PEG와 결합된 여러 가지 단백질들이 혈장에서 체내 반감기가 증가되고 면역원성이 감소됨을 증명하였으며, 또한 데비스 등 (Daviset al.,Lancet, 2, 281-283, 1981)은 유리카제 (uricase)가 PEG와 결합시에 체내 반감기가 증가되고 요산의 대사시 부작용이 감소됨을 증명하였다.

이러한 결과로부터 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드나 단백질 물질에 대한 PEG 결합은 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며 체내에서의 면역반응을 감소시키는 효과를 가져올 수 있음이 확인되었다.

폴리펩타이드에 PEG를 결합시키는 방법으로 가장 많이 사용되는 방법은 폴리펩타이드의 아미노 (amino) 잔기에 활성화된 PEG를 반응시키는 방법이다.

폴리펩타이드의 아미노 잔기로는 라이신 (lysine)기와 N-말단을 들 수 있으며, PEG를 활성화시키는 방법은 다음과 같다. PEG의 한쪽 하이드록시기 (hydroxy group)를 메틸에테르기 (methyl ether group)로 치환시키고, 나머지 한쪽 하이드록시기에는 친전자성 물질 (electrophile)을 함유한 기능기를 결합시킨다 (Abuchowski, A. and Davis, F.F. (1981), inEnzymes as Drugs(Holsenberg, J. and Roberts, J., eds)). 활성화된 고분자의 예로는 아마이드 결합 (amide bond)을 가진 PEG-N-하이드록시숙시니미드-활성화 에스테르 (PEG-N-Hydroxysuccinimide-

activated esters), 알킬 결합을 가진 (alkyl bond) PEG-에폭사이드 (epoxide)와 PEG-트레실레이트 (tresylate), 우레탄 결합 (urethane bond)을 가진 PEG-카보닐 이미다졸 (carbonyl imidazole)과 PEG-니트로페닐 카보네이트 (nitrophenyl carbonates), N-말단에 쉬프 베이스 (Schiff's base)를 가진 PEG-알데하이드 (aldehyde) 등이 있다.

폴리펩타이드에는 라이신기가 무작위적으로 존재하므로 아미노기에 반응하는 PEG를 사용하게 되면 PEG가 비특이적으로 결합하게 되어 불균일한 혼합물이 된다. 따라서, 최근에는 균일한 PEG 결합체를 만들기 위해 폴리펩타이드의 시스테인 (cysteine)기, 올리고당 (oligo sugar), 하이드록시기, 아르기닌 (arginine)기 등 목적하는 특정부위에 PEG를 결합시키는 방법들이 시도되고 있다.

폴리펩타이드의 시스테인기에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 PEG-비닐 설폰 (vinyl sulphone), PEG-아이오도아세트아마이드 (iodoacetamide), PEG-말레이미드 (maleimide), PEG-오르소피리딜 디설파이드 (orthopyridyl disulfide) 등이있으며, 주로 말레이미드 (maleimide)를 함유한 PEG를 이용하는 방법이 많이 쓰이고 있다. PEG-비닐 설폰은 수용액 상에서 안정성이 가장 좋으며, PEG-오르소피리딜 디설파이드는 디설파이드 결합을 가지고 있어 가역적으로 체내에서 분해될 수 있다. 이러한 유도체들을 이용한 펩타이드의 예로는 인터루킨-3 (interleukin-3) 및 인터루킨-2 (interleukin-2) 등이 있다.

폴리펩타이드의 올리고당에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 알데하이드 (aldehyde)를 함유한 물질과 반응하여 비교적 안정한 히드라존 (hydrazone) 결합을 형성할 수 있는 PEG-히드라자이드 (hydrazide)를 들 수 있다. PEG-히드라자이드는 특히 당단백질 (glycoprotein)의 당부위에 특이적으로 결합하는 특징을 가지고 있어 특정부위 결합을 위한 목적으로 많이 쓰인다.

폴리펩타이드의 하이드록시기에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 PEG-이소시아네이트 (isocyanate)를 들 수 있으며, 폴리펩타이드의 아르기닌기에 PEG를 결합시킬 때는 구아니디노 (guanidino)기에 잘 반응하는 페닐글리옥살 (phenylglyoxal)을 함유한 PEG 유도체가 사용된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, PEG와 같은 고분자는 생리활성 분자에 결합하여 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시키고 생체적합성을 증가시키며, 면역 반응성을 감소시킬 뿐 아니라 생체 내에서의 안정성을 증가시키는 특징을 나타내므로, 본 발명자들은 이를 이용하여 PEG와 같은 고분자를 췌장소도의 막 표면에 결합시켜 막 표면을 개발하는 방법을 개발하였고, 본 발명의 표면개질 방법에 의해 막 표면이변형된 췌장소도는 이식시 면역 반응을 최소화하면서 산소나 영양소가 원활히 확산될 수 있어 췌장소도의 효율과 생존 기간을 연장시킬 뿐 아니라 이식에 필요한 췌장소도의 전체 부피를 줄일 수 있어 제제화에 따른 문제점을 극복할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 췌장소도의 표면에 PEG와 같은 고분자 사슬을 결합시켜 면역반응에 의한 췌장소도의 파괴를 막을 뿐만 아니라 고분자 사슬에 의해 생긴 공간으로 산소와 영양분이 충분히 전달되도록 하여 췌장소도의 효율과 생존기간을 늘리는 췌장소도 막의 표면개질 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (Monomethoxy polyethylene glycol, 이하 "mPEG"라고 약칭함)-5000의 말단기(-OH)를 -COOH기로 치환하는 과정을 나타낸 것이고,

도 2는 말단기가 -COOH로 치환된 mPEG의 활성화 과정을 나타낸 것이고,

도 3a는 PEG와 췌장소도의 결합에 의한 췌장소도의 형태적인 변화를 반응시간에 따라 나타낸 것으로 반응시간 0시간 경과 후이고,

도 3b는 PEG와 췌장소도의 결합에 의한 췌장소도의 형태적인 변화를 반응시간에 따라 나타낸 것으로 반응시간 1시간 경과 후이고,

도 3c는 PEG와 췌장소도의 결합에 의한 췌장소도의 형태적인 변화를 반응시간에 따라 나타낸 것으로 반응시간 2시간 경과 후이고,

도 3d는 PEG와 췌장소도의 결합에 의한 췌장소도의 형태적인 변화를 반응시간에 따라 나타낸 것으로 반응시간 3시간 경과 후이고,

도 3e는 PEG와 췌장소도의 결합에 의한 췌장소도의 형태적인 변화를 반응시간에 따라 나타낸 것으로 반응시간 4시간 경과 후이고,

도 4a는 PEG가 결합된 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 (confocal scanning) 이미지를 반응시간 1시간 경과 후 나타낸 것이고,

도 4b는 PEG가 결합된 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 (confocal scanning) 이미지를 반응시간 2시간 경과 후 나타낸 것이고,

도 4c는 PEG가 결합된 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 (confocal scanning) 이미지를 반응시간 3시간 경과 후 나타낸 것이고,

도 4d는 PEG가 결합된 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 (confocal scanning) 이미지를 반응시간 4시간 경과 후 나타낸 것이고,

도 5a는 반복적인 PEG 결합 반응에 따른 췌장소도의 형태적인 변화를 나타낸 것으로 대조군 췌장소도이고,

도 5b는 반복적인 PEG 결합 반응에 따른 췌장소도의 형태적인 변화를 나타낸 것으로 첫 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 5c는 반복적인 PEG 결합 반응에 따른 췌장소도의 형태적인 변화를 나타낸 것으로 두 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 5d는 반복적인 PEG 결합 반응에 따른 췌장소도의 형태적인 변화를 나타낸 것으로 세 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 6a는 반복적인 PEG 결합반응에 따른 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 이미지를 나타낸 것으로 첫 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 6b는 반복적인 PEG 결합반응에 따른 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 이미지를 나타낸 것으로 두 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 6c는 반복적인 PEG 결합반응에 따른 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 이미지를 나타낸 것으로 세 번째 PEG 결합반응에 의한 췌장소도이고,

도 7은 PEG가 결합된 췌장소도에서 당에 대한 인슐린의 분비반응을 18일 동안 관찰한 결과를 나타낸 것이고,

도 8은 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에서 당에 대한 인슐린의 분비반응을 28일 동안 관찰한 결과를 나타낸 것이고,

도 9는 PEG가 결합된 췌장소도에서 환류된 당의 자극에 대한 인슐린의 분비 반응 곡선을 나타낸 것이고,

도 10은 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에서 환류된 당의 자극에 대한 인슐린의 분비반응 곡선을 나타낸 것이고,

도 11은 당뇨가 유발된 실험동물에서 혈당의 농도변화를 60일 동안 관찰한 결과를 나타낸 것이고,

도 12a는 당뇨가 유발된 실험동물에 PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 후 혈당의 농도변화를 관찰한 것이고,

도 12b는 당뇨가 유발된 실험동물에 PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 후 실험동물의 체중변화를 관찰한 것이고,

도 13은 일반 췌장소도를 이식한 실험동물의 신장막을 H-E 염색 (이식 14일 후)으로 염색한 결과를 나타낸 것이고,

도 14는 PEG가 결합된 췌도를 이식한 실험동물의 신장막을 H-E 염색 (이식 100일 후)으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 결합을 이용하여 고분자 사슬을 췌장소도 막 표면에 결합시키는 췌장소도 막의 표면개질 방법을 제공한다.

본 발명의 췌장소도 막의 표면개질 방법은 합성고분자, 생체고분자 또는 이들의 유도체 및 결합체를 췌장소도의 콜라겐 막 (collagen membrane)에 화학적으로 결합(grafting)시킴으로써 췌장소도의 이식시 면역반응을 억제하는 것이다.

상기 췌장소도 막의 표면개질 방법은

1) 고분자의 말단기를 활성화시키는 단계; 및

2) 상기 활성화 고분자를 췌장소도 막에 결합시키는 단계로 구성된다.

단계 1에서 고분자는 합성고분자, 생체고분자 또는 이들의 유도체 및 결합체가 사용될 수 있으며, 특히 물과의 접촉각이 90도 이하이고 생체적합성이 우수한 친수성 고분자들을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 폴리(아크릴산)계 (poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계 (poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계 (poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계 (poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계 (poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계 (polystryene), 폴리옥사이드계 (polyoxide), 셀룰로오즈계 (cellulose), 전분계 (starch), 폴리다당류계 (polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계 (polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌) (poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈) (poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민 (poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 및 이들의 유도체 또는 혼합체 등이 바람직하며, 소수성인 폴리우레탄 및 실리콘 계통의 고분자로서 폴리(디메틸 실록산) (poly[dimethyl siloxane]) 등도 사용될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로서 친수성 고분자인 PEG를 사용하였다. PEG는 유체역학 용량 (hydrodynamic volume)이 매우 크고 물분자를 포집하고 있는 능력이 매우 높기 때문에 췌장소도의 콜라젠 막에 결합된 PEG는 췌장소도의 막상에 물분자막을 형성함으로써 면역세포에 의하여 항체로써 인식되지 못하도록 하는 기능을 하게 된다. 또한, 식세포가 췌장소도에 침투할 때는 열역학적 기능으로 식세포를 밀어내는 역할을 함으로써 이식된 췌장소도의 면역반응을 억제할 수 있다.PEG의 분자량은 100 내지 1,000,000 달톤인 것이 바람직하며, PEG, 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS (branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드 (succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드 (PEG-aldehyde) 및 이들의 유사체 또는 혼합체 등이 사용될 수 있다.

또한, 고분자에 측쇄 또는 말단에 관능기가 부착된 여러 종류의 고분자 유도체들이 사용될 수 있는데, 예를 들면 고분자에 설폰기를 부가하거나 헤파린과 같은 약제를 결합시키는 방법 등이 사용될 수 있다. 상기 관능기로는 아민기 (amine group), 하이드록실기 (hydroxyl group), 카르복실기 (carboxyl group), 설폰기 (sulfone group) 및 이들의 혼합체 등이 사용될 수 있다. 한편, 상기의 합성고분자와는 달리 생체고분자로서 항혈전성을 갖는 고분자가 사용될 수 있는데, 그 예로서 헤파린 (heparine) 등과 같은 폴리사카라이드 (polysaccharide)나 프로스타글란딘 (prostaglandin, PGI) 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 헤파린은 재조합 헤파린 (recombinant heparin), 헤파린 유도체 (heparin derivative) 및 헤파린과 유사한 특성을 갖는 헤파린 유사체 (heparin analogue) 등이 사용될 수 있다.

단계 1에서는 상기 고분자의 말단기 (-OH)를 반응성이 좋은 말단기 (-COOH)로 치환하기 위하여 카르복실화 반응을 수행한다. 카르복실화된 고분자를 활성화시키는 방법은 고분자의 한쪽 하이드록시기 (hydroxy group)를 메틸에테르기 (methyl ether group)로 치환시키고, 나머지 한쪽 하이드록시기에는 친전자성 물질 (electrophile)을 함유한 기능기를 결합시키는 방법이 사용될 수 있다.

단계 2에서 고분자를 췌장소도의 막에 결합시키기 위하여 췌장소도의 하이드록시기 (hydroxy group), 아민기 (amine group), 카르복실기 (carboxyl group) 등의 관능기를 화학적인 공유결합을 이용하여 이에 상응하는 관능기를 가진 결합시킬 고분자의 말단 또는 측쇄에 결합시킨다. 고분자와 췌장소도 막과의 결합에는 DCC (N,N-dicyclohexylcarbodiimide, Y-K Lee et al., Thromb. Res., 92, 149-156, 1998), EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, D. H. Rich and J. Singh, "The carbodiimde method" in The Peptides: Vol.1, Academic Press, New York, 1979, pp. 241-261), 광반응 (photoreaction) 등의 방법이 사용될 수 있다. 공유결합으로 췌장소도 막에 결합된 고분자는 생체 내에 이식된 후에도 안정적으로 췌장소도에 존재할 수 있으며, 화학적인 공유결합과 함께 물리적으로 췌장소도 막 내에 고분자를 침투시켜 효율을 보다 높일 수 있는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명자들은 바람직한 실시예로서 PEG를 다양한 방법으로 췌장소도의 표면에 결합시켰다. 우선, 분자량 5000인 PEG의 말단기 (-OH)를 반응성이 좋은 말단기 (-COOH)로 치환한 후 (도 1참조) 상기 고분자를 활성화하여 (도 2참조) 미리 분리해 놓은 랫트의 췌장소도에 결합시켰다. 이때, 면역반응의 최소화를 위해 췌장소도에 결합된 PEG 밀도의 최대화를 도모하도록 연속적인 반응을 수행하였다. PEG가 표면에 결합된 것을 컨포컬 스캐닝 현미경 (Confocal Scanning Microscopy)을 이용하여 확인한 결과, PEG는 췌장소도 표면에 효과적으로 결합되어 췌장소도 막을 감싸고 있었으며 일부의 PEG는 막 내부로 확산되기도 하였다 (도 3a내지3e, 4a내지4d, 5a내지5d및도 6a내지6c참조). 이와 같은 현상은 PEG가 췌장소도의 막과 결합하는 반응시간을 변화시키므로써 조절될 수 있었다.

In vitro실험에서는 고분자로 표면처리된 췌장소도의 반응성과 생존성을 정치 배양 (static culture) 및 환류 배양 (perifusion) 방법에 의하여 확인한 결과, PEG로 표면처리된 췌장소도는 처리되지 않은 췌장소도와 동일한 인슐린 분비능을 나타냄을 확인하였다 (도 7, 8, 9및10참조).

In vivo동물실험에서는 PEG가 결합된 췌장소도를 당뇨병이 유발된 실험동물의 신장막에 이식하여 실험동물의 혈당량과 체중을 측정함으로써 이식된 췌장소도의 작용 여부를 확인하였다. 그 결과, PEG가 결합된 췌장소도가 이식된 경우에는 실험동물이 장기간 정상 혈당을 유지하면서 몸무게도 서서히 증가하였다. 하지만, 일반 췌장소도가 이식된 실험동물의 혈당은 이식 후 2주간은 정상 혈당을 유지하였으나 그후에는 고혈당, 즉 당뇨 상태로 복귀하였다. 따라서, 본 발명의 PEG가 결합된 췌장소도는 대조군에 비하여 생존기간도 길어지고 인슐린도 원활하게 분비함을 알 수 있었다 (도 11및도 12참조).

각 실험동물의 이식부위인 신장막을 분리하여 조직검사를 한 결과, PEG가 결합된 췌장소도 주위에는 T 임파구가 일반 췌장소도 주위의 T 임파구보다 현저히 감소하였고 췌장소도 내부로 침투하는 임파구도 발견되지 않았다 (도 13및도 14참조).

결론적으로, 췌장소도에 PEG를 결합시키면 면역반응에 대하여 보호기능을 충실히 실행하면서 췌장소도의 기능도 저하되지 않음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 고분자를 이용한 표면개질 방법에 의하여 표면처리된 췌장소도는 체내에 이식될 때 특정한 장치를 사용하지 않아도 되므로 기존의 면역분리 방법에 따른 췌장소도의 제제화에 따른 이식부피의 증가로 인한 문제점을 극복할 수 있을 뿐 아니라, 췌장소도의 표면처리 이후에도 부피변화가 없고 췌장소도 자체를 이식하기 때문에 주위 혈관으로부터의 영양분 및 산소의 공급이 원할하여 췌장세포의 생존성 및 반응성이 매우 우수하다.

아울러, 본 발명의 고분자를 이용한 췌장소도 막 표면의 개질방법은 췌장소도의 이식방법 이외에도 기존의 모든 방법에 효과적으로 이용될 수 있으며 췌장소도 자체의 응괴현상 (aggregation)을 억제할 수 있는 장점이 있다. 즉, 췌장소도의 표면이 친수성 고분자로 개질되어 있어 췌장소도 끼리 서로 엉기지 않기 때문에 마이크로캡슐봉입 방법이나 마크로캡슐봉입 방법에 사용될 때 췌장소도의 엉김현상을 억제함으로써 췌장소도의 생존성을 높일 수 있다.

이외에도 본 발명자들은 다양한 분자량을 갖는 mPEG를 췌장소도 막에 반복적으로 융합시키기 위하여, 분자량 5000의 활성화 PEG, 분자량 2000의 활성화 PEG 및 분자량 600의 활성화 PEG를 반복적으로 췌장소도 막에 반응시킨다 (도 17a참조). 이와 같이 다양한 분자량의 PEG가 결합된 췌장소도는 단일 분자량의 PEG로 표면 개질된 경우보다 밀도가 증가하여 훨씬 더 촘촘하게 PEG가 췌장소도 막에 결합될 수 있어 이식시 면역 반응을 최소화하면서 산소나 영양소가 보다 원활히 확산될 수 있도록 해준다.

또한 본 발명자들은 췌장소도 막에 PEG 결합을 최대화하기 위하여, 췌장소도 막에 존재하는 2 종류의 관능기인 하이드록실기 (hydroxyl group) 및 아민기 (amine group) 등에 PEG를 융합시킨다. 구체적으로 췌장소도 막에 존재하는 아민기에 PEG를 결합시키기 위해서는 PEG를 DCC 방법으로 활성화시키며, 하이드록실기에 PEG를 결합시키기 위해서는 PEG 작용기 말단을 디페닐메탄 디이소시아네이트 (4,4'-diphenylmethane diisocyanate, MDI) 또는 톨루엔 디이소시아네이트 (toluene diisocyanate, TDI)를 처리하여 시아노기 (NCO group)을 붙여준 후 결합반응을 수행한다.

아울러, 본 발명자들은 췌장소도 막에의 PEG를 증폭화시키기 위하여 폴리아크릴산 (polyacrylic acid, PAA) 및 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol, PVA)을 이용한 PEG의 증폭화 반응을 수행한다 (도 17b참조). 구체적으로, 분자량이 5000인 폴리아크릴산에 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride), N-하이드로숙시니미드 (N-hydrosucciinimide) 및 1,3-디사이클로헥실카보니미드 (1,3-dicyclohexylcarbo-

diimide)를 처리하여 수득한 활성화된 PAA를 췌장소도 막에의 PEG 증폭화에 사용한다. 또한, 폴리비닐알콜은 소디움 페리오데이트 (sodium periodate, NaIO₄)와 반응시켜서 PVA에 존재하는 하이드록실기 (-OH group)를 모두 알데히드기 (-CH group)로 바꾸어 주어 이로부터 얻은 활성화 PVA를 췌장소도 막에의 PEG 증폭화에 사용한다.

이외에도 본 발명자들은 췌장소도 막에 관능성 (functional) PEG를 결합시키기 위하여, PEG의 양말단에 아미노기와 하이드록실기를 가지는 경우 (HO-PEG-NH₂)에는 PEG에 설폰화 반응 (sulfonation)을 유도한 후 췌장소도 막에 결합시킨다 (도 17c참조). 이를 위하여, 테트라하이드로퓨란 (tetrahydrofuran, THF) 용매하에서 PEG에 프로판 슐톤 (propanr sultone)을 적하하여 PEG의 아미노기를 설폰기 (sulfonyl group)로 바꾸어 준다. 또는 PEG의 하이드록실기 (-OH group)를 카르복실기 (-COOH group)로 바꾸기 위해서는 PEG에 톨루엔을 첨가한 후 고온에서 순수 아르곤 (pure Ar)을 계속 순환시키면서 PEG 중탕을 수행한다. 이때, 톨루엔과 PEG의 축합반응에 의한 상분리가 발생하는데, 불투명한 부분의 물을 제거하고 여기에 칼륨부톡사이드 (potassium butoxide) 및 에틸-3-브로모프로피온산 (ethyl-3-bromopionate)을 첨가하여 반응시킨다. 이로부터 얻은 PEG는 양말단에 설폰기 및 카르복실기를 가지고 있어 PEG 한쪽 말단의 카르복실기는 췌장소도 막에 결합하게 되고 나머지 다른 한쪽 말단의 설폰기는 수용액 상태에서 전해되어 음전하를 가지게 됨으로써, 설폰기의 음전하에 의한 반발력 때문에 여러 면역물질의 접근을 피할수 있어 이식된 췌장소도를 안정적으로 장기간 보호할 수 있다.

또한, PEG의 양말단에 카르복실기를 가지는 경우 (HOOC-PEG-COOH)에는 먼저 두 개의 카르복실기 (-COOH group)을 갖고 있는 PEG에 메틸렌 클로라이드, N-하이드로숙니니미드 및 1,3-디사이클로헥실카보디이미드를 첨가하여 활성화시킨다. 이로부터 얻은 PEG 한쪽 말단의 활성화된 카르복실기는 췌장소도 막과 결합하게 되고 나머지 다른 한쪽 말단의 카르복실기는 수용액 상태에서 전해되어 음전하를 가지게 됨으로써, 설폰기의 음전하에 의한 반발력 때문에 여러 면역물질의 접근을 피할 수 있어 이식된 췌장소도를 안정적으로 장기간 보호할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 췌장소도 막에의 PEG 결합

<1-1> mPEG의 카르복실화 반응 단계

mPEG-5000 45 g을 500 ㎖ 3-목 플라스크 (3-neck flask)에 넣고 450 ㎖의 톨루엔 (toluene anhydrous)을 첨가하여 용해시켰다. PEG 중탕으로 온도를 120℃로 유지하면서 순수 아르곤 (pure Ar)을 계속 순환시켰다. 톨루엔과 mPEG를 혼합한 용액이 끓어서 축합반응 (condensation)이 일어나면 상분리가 발생하는데, 이때 불투명한 부분인 물을 제거한 후 온도를 실온으로 낮추었다. 상기 혼합용액에 칼륨부톡사이드 (potassium butoxide)를 첨가하고 24시간 동안 70℃에서 반응시키고 온도를 다시 실온으로 낮춘 후 에틸-3-브로모프로피온산염 (ethyl-3-bromopropionate)를 첨가하여 하루 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 혼합용액을 여과하여 칼륨브로마이드 (potassium bromide, KBr)를 걸러낸 후 에테르 (ether)를 첨가하여 침전시켰다. 상기 침전용액을 냉동실에 2 내지 3시간 동안 보관하였다가 다시 여과하여 건조시켰다. 약 200 내지 300 ㎖의 1 M NaOH를 건조된 PEG와 혼합하여 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 NaCl 15g을 첨가하고 6 M HCl을 이용하여 pH를 3까지 조절하였다. 여기에 클로로포름 (chloroform)을 첨가하여 상분리를 수행한 후 클로로포름 층만을 제거한 후 MgSO₄를 첨가하여 여분의 수분을 제거하였다. 상기 용액을 여과하고 에테르에 침전시킨 후 다시 여과하여 하루 동안 감압건조시켜서 반응물을 습득하였다 (도 1).

<1-2> 카르복실화 mPEG의 활성화 단계

mPEG를 췌장소도 표면에 존재하는 아민기와 반응시키기 위하여 하기 실험을 통하여 활성화시켰다. 먼저, 2-목 플라스크 (2-neck flask)에 mPEG-COOH를 첨가하고 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride)를 부어 용해시켰다. N-하이드로숙시니미드 (N-hydrosuccinimide)를 첨가하여 완전히 용해시킨 후 얼음 수조에서 1,3-디클로로카보디이미드 (1,3-dicyclohexylcarbodiimide)를 첨가하고 하루 동안 반응시켜서 여과하였다. 메틸렌 클로라이드를 증발시키고 벤젠 (benzene)을 약 50 내지 100 ㎖ 정도 가하여 6시간 정도 유지하였다가 다시 여과하였다. 상기 여과액을 에테르에 침전시켜 다시 여과하여 반응물을 습득하였다 (도 2).

<1-3> 췌장소도의 분리

췌장소도를 분리하기 하루 전부터 금식시킨 체중 250 내지 300 g의 SD 랫트 (대한실험동물센터, 한국)를 케타민 (ketamine)과 자일라진 (xylazine)의 혼합용액으로 피하주사 (subcutaneous injection)하여 마취시켰다. 복강을 개복한 후 췌장을 부풀리기 위해 HBSS (Hanks' Balance Salt Solution; 0.14 g CaCl₂, 0.4 g KCl, 0.06 g KH₂PO4, 0.098 g MgSO₄, 8.0 g NaCl, 0.048 g Na₂HPO4, 1.0 g Glucose, NaHCO₃0.35 g, 1 % penicillin-streptomycin [10 ㎖])를 담즙관 (bile duct)을 통해 주입하였고, 주입이 끝남과 동시에 즉시 부풀려진 췌장을 적출하였다. 적출한 췌장을 가위로 잘게 부수고, 지방을 제거하기 위해 여러 번 세척하였다. 조직 1 g당 콜라게네이즈 (collagenase) 5 ㎎을 2 ㎖ HBSS에 용해시켜 37℃ 수조 내에서 흔들어주면서 분해시킨 후 더 이상의 분해를 막기 위하여 냉각된 HBSS를 첨가하였다. 분해된 췌장 조직을 채로 거른 후 여러 번 세척하였다. 이를 약 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하고, 27, 23, 20 및 11%의 피콜 (ficoll) 농도 구배를 준 후 약 2200 rpm에서 23분간 원심분리를 실시하였다. 27%와 23% 층 사이 및 23%와 20% 층 사이에 존재하는 췌도를 모아 세척한 후 RPMI-1640 배양액이 첨가된 배양접시로 옮겨 37℃, 5% CO₂를 공급하면서 배양하였다. 배양액은 이틀에한 번씩 새것으로 교체해 주었고 이로부터 췌장소도를 분리하였다.

<1-4> 췌장소도 막에 활성화 mPEG의 결합 단계

상기 실시예 <1-3>에서 분리한 췌장소도를 3일간 RPMI-1640 배양액에서 배양한 후에 실시예 <1-2>의 PEG와 결합시켰다. PEG에 췌장소도가 잘 결합할 수 있도록 췌장소도에 묻어 있는 배양액을 HBSS로 씻어준 후 23 ㎎의 활성화 PEG를 용해시킨 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기 내(5% 이산화탄소, 95% 산소, 37℃)에서 시간별(0.5, 1, 2, 3, 4hr)로 췌장소도와 PEG를 반응시켰다. PEG 결합반응 (PEGylation) 후, 더 이상의 반응을 막기 위해 췌장소도를 배양액으로 세척하였다. 췌장소도 표면에 반응된 PEG의 양을 정량하기 위하여 활성화된 PEG 대신 형광물질이 표지된 FITC-PEG를 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 췌장소도 표면에 융합된 FITC-PEG를 컨포컬 스캐닝 현미경 (Confocal Scanning Microscopy)으로 측정하여 반응된 PEG의 정도를 확인하였다.

도 3a내지3e에 나타낸 바와 같이, 각각의 반응시간에 따라 췌장소도의 형태적인 변화를 광학현미경으로 관찰한 결과, PEG 결합반응 시간이 2시간일 경우에는 췌장소도의 형태가 일정하게 유지되었으나 4시간 반응한 경우에는 췌장소도 막의 형태가 변화되어 있음을 확인하였다. 또한, 각각의 반응시간에 따라 FITC-PEG와 반응한 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 이미지를 관찰한 결과, PEG 결합반응이 1시간 이상 지속되면 PEG가 췌장소도 막에 결합되는 것이 확인되었으며, 반응시간이 길어질수록 PEG가 췌장소도 내부로 확산되어 들어가는 것이 관찰되었다 (도 4a내지4d).

<실시예 2> 반복적인 결합반응에 의한 췌장소도 막에의 mPEG 융합

상기 실시예 1의 결과를 바탕으로 췌장소도와 PEG와의 결합반응 시간을 1시간으로 결정하여 상기와 동일한 방법으로 하루에 한번씩 3일간 반응시켜 반복적으로 PEG를 췌장소도에 융합시켰다. PEG가 췌장소도 표면에 반복적으로 결합하는 동안의 형태적인 변화를 각각의 반응시간에 따라 전자현미경으로 관찰하였으며, 췌장소도 표면에 결합된 PEG의 밀도를 확인하기 위하여 FITC-PEG를 췌장소도 표면에 반복적으로 결합시켜 반복적인 PEG 결합반응에 대한 밀도의 증가를 확인하였다.

도 5a내지5d는 반복적인 PEG 결합 반응에서의 췌장소도의 형태변화를 보여주는 결과로서, PEG 결합반응을 반복적으로 수행하여도 췌장소도의 형태에는 변화가 없었다. 또한, 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도의 컨포컬 스캐닝 이미지를 관찰한 결과, PEG가 췌장소도 막에 결합되었음을 확인하였으며, PEG 결합반응을 반복적으로 수행할수록 췌장소도 막에 결합된 PEG 농도 역시 증가함을 알 수 있었다 (도 6내지6c).

<실시예 3> 반복적인 결합반응에 의한 췌장소도 막에의 다양한 분자량을 갖는 mPEG 융합

본 발명자들은 췌장소도 막에 다양한 분자량의 mPEG를 반복적으로 융합시키기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하루에 한번씩 3일 동안 반응시켜 반복적으로 PEG를 췌장소도에 융합시켰다. 먼저, 상기 실시예 <1-3>과 같이 분리된 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 두번 세척한 후 23 ㎎의 활성화 PEG가 용된 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 첨가하여 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응용액을 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 하루 동안 배양하였다. 2일째, 상기 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 두번 세척한 후 분자량이 2000인 활성화 PEG가 23 ㎎ 용해된 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 첨가하여 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양하였다. 3일째, 다시 이 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 두번 세척한 후 분자량이 600인 활성화 PEG가 23 ㎎ 용해된 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 첨가하여 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 다시 췌장소도를 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양하였다.

<실시예 4> 췌장소도 막의 다양한 반응기와 PEG와의 결합반응

본 발명자들은 췌장소도 막에 PEG 결합을 최대화하기 위하여, 췌장소도 막에 존재하는 2 종류의 관능기인 하이드록실기 (hydroxyl group) 및 아민기 (amine group) 등에 PEG를 융합시켰다.

아민기와의 결합반응은 상기 실시예 1과 동일한 DCC 방법으로 PEG를 활성화시킨 후 하기와 같은 실험을 수행하였다. 우선, 췌장소도 막에 존재하는 하이드록실기에 PEG를 결합시키기 위하여 PEG 작용기 말단을 디페닐메탄 디이소시아네이트(4,4'-diphenylmethane diisocyanate, MDI) 또는 톨루엔 디이소시아네이트 (toluene diisocyanate, TDI)를 처리하여 시아노기 (NCO group)을 붙여준 후 결합반응을 수행하였다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 우선 분자량이 5000인 mPEG 5 g을 톨루엔 (toluene anhydrous) 용매에 용해시킨 후 여기에 PEG에 존재하는 하이드록실기와 MDI 또는 TDI에 존재하는 시아노기의 몰 농도비가 1:5가 되도록 해당하는 질량의 MDI를 넣고 반응시켰다. 상기 반응물에 에테르 (ether)를 첨가하여 침전시킨 후 다시 여과하여 하루 동안 감압 건조시켜서 최종 반응물로 PEG-NCO를 얻었다. 한편, 실시예 <1-3>과 같이 분리된 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 세척한 후 23 ㎎의 활성화 PEG를 용해시킨 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 상기 췌장소도에 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후 RPMI-1640 배양액으로 췌장소도를 두번 세척한 후 상기와 같이 준비된 PEG-NCO 23 ㎎이 용해된 HBSS 완충용액 15 ㎖을 넣고 췌장소도 막과 반응시켰다. 이를 다시 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양하였다.

<실시예 5> 췌장소도 막에의 PEG 증폭화 반응 (amplification)

<5-1> 폴리아크릴산을 이용한 췌장소도 막에의 PEG 증폭화 반응

분자량이 5000인 폴리아크릴산 (polyacrylic acid, PAA) 50 g에 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride)를 첨가하여 용해시켰다. 상기 반응용액에 N-하이드로숙시니미드 (N-hydrosucciinimide)를 첨가하여 완전히 용해시킨 후 얼음 수조에서 1,3-디사이클로헥실카보니미드 (1,3-dicyclohexylcarbodiimide)를 첨가하고 하루 동안 반응시켜서 여과하였다. 상기 여과액으로부터 메틸렌 클로라이드를 증발시킨 후 벤젠 (benzene)을 약 50 ㎖ 정도 첨가하여 6시간 동안 유지하였다가 다시 여과하였다. 이로부터 얻은 여과액을 다시 에테르에 침전시켜고 여과하여 반응물로 활성화된 PAA를 얻었다.

이와 ??이 준비된 활성화 PAA를 췌장소도 막에 증폭화시키기 위하여, 먼저 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 두번 세척한 후 25 ㎎의 활성화 PAA가 용해된 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 두번 더 세척한 후 분자량이 5000인 메톡시-PEG-NH₂(methoxy-PEG-NH₂) 50 ㎎이 용해된 후 15 ㎖ HBSS 완충용액을 첨가하고 다시 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 췌장소도를 다시 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양시켰다.

<5-2> 폴리비닐알콜을 이용한 췌장소도 막에의 PEG 증폭화

먼저, 분자량이 5000인 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol, PVA) 50 g을 소디움 페리오데이트 (sodium periodate, NaIO₄)와 반응시켜서 PVA에 존재하는 하이드록실기 (-OH group)를 모두 알데히드기 (-CH group)로 바꾸어 주어 PVA를 활성화시켰다. HBSS 완충용액으로 두번 세척한 췌장소도에 30 ㎎의 활성화 PVA가 용해된 HBSS 완충용액 15 ㎖을 넣고 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 활성화된 PVA가 결합된 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 한번 세척한 후 분자량이 5000인 메톡시-PEG-NH₂50 ㎎이 용해된 15 ㎖ HBSS 완충용액을 첨가하고 다시 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 췌장소도를 다시 RPMI-1640 배양액으로 두 번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양시켰다.

<실시예 6> 췌장소도 막에의 관능성 (functional) PEG의 결합반응

<6-1> HO-PEG-NH ₂ 의 설폰화 반응 (sulfonation) 및 췌장소도 막에의 결합반응

우선, 테트라하이드로퓨란 (tetrahydrofuran, THF) 용매하에서 10% 농도의 HO-PEG-NH₂에 10% 농도의 프로판 슐톤 (propanr sultone)을 적하한 후 50℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 그 후 상기 반응물을 THF에서 침전시킨 후 여과하여 얻은 침전물을 다시 차가운 THF 용매로 세척하였다. 이러한 반응에 의해 HO-PEG-NH₂의 아미노기가 설폰기 (sulfonyl group)로 바뀌게 된다. 그 후 HO-PEG-NH₂의 나머지 하이드록실기 (-OH group)를 카르복실기 (-COOH group)로 바꾸기 위하여 상기 반응물 40 g을 450 ㎖의 톨루엔에 첨가하여 용해시켰다. 온도를 120℃로 유지하면서 순수 아르곤 (pure Ar)을 계속 순환시키면서 PEG 중탕을 수행하였다. 톨루엔과 mPEG를 혼합한 용액이 끓게되면 축합반응에 의한 상분리가 발생하는데, 이때 불투명한 부분의 물을 제거한 후 온도를 낮추어 주었다. 상기 혼합용액에 칼륨부톡사이드 (potassium butoxide)를 첨가하여 24시간 동안 70℃에서 반응시키고 온도를 다시 실온으로 낮춘 후 에틸-3-브로모프로피온산 (ethyl-3-bromopionate)을 첨가하여 하루 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 혼합용액을 여과하여 KBr을 걸러낸 후 에테르를 첨가하여 침전시켰고 이로부터 얻은 침전용액을 냉동실에 2 내지 3시간 동안 보관하였다가 다시 여과하여 건조시켰다. 이와 같이 준비된 건조된 PEG에 약 200 내지 300 ㎖의 1 M NaOH를 혼합하여 2시간 동안 교반한 후 NaCl 15 g을 첨가하고 6 M HCl을 이용하여 pH를 3까지 조절하였다. 여기에 클로로포름 (chloroform)을 첨가하여 상분리가 발생하면 클로로포름 층만을 제거한 후 MgSO₄을 첨가하여 여분의 수분을 제거하였다. 상기 용액을 여과하고 에테르에 침전시킨 후 다시 여과하여 하루 동안 감압 건조시켜서 반응물을 습득하였다.

상기 반응물을 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride)에 첨가하여 용해시킨 후 여기에 N-하이드로숙시니미드를 첨가하여 완전히 용해시켰고 얼음 수조에서 1,3-디사이클로헥실카보디이미드를 첨가하고 하루 동안 반응시킨 후 여과하였다. 상기 여과액으로부터 메틸렌 클로라이드를 증발시키고 벤젠을 약 50 ㎖ 정도 가하여 6시간 정도 유지하였다가 다시 여과하였다. 이로부터 얻은 여과액을 에테르에 침전시키고 다시 여과하여 반응물을 습득한 후 이를 하기와 같은 췌장소도 막과의 결합반응에 사용하였다.

HBSS 완충용액으로 두번 세척한 췌장소도에 상기 반응물이 30 ㎎ 용해된 HBSS 완충용액을 첨가하고 세포배양기 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양하였다. 이러한 방법에 의해서 PEG 한쪽 말단은 췌장소도 막에 결합하게 되고 나머지 다른 한쪽 말단의 설폰기는 수용액 상태에서 전해되어 음전하를 가지게 된다. 이렇게 되면 설폰기의 음전하에 의한 반발력 때문에 여러 면역물질의 접근을 피할 수 있어 이식된 췌장소도가 장기간 보호될 수 있다.

<6-2> HOOC-PEG-COOH의 활성화 및 췌장소도 막에의 결합반응

먼저 두 개의 카르복실기 (-COOH group)을 갖고 있는 PEG 50 g을 메틸렌 클로라이드에 첨가하여 용해시켰다. N-하이드로숙니니미드를 첨가하여 완전히 용해시킨 후 얼음 수조에서 1,3-디사이클로헥실카보디이미드를 한 개의 카르복실기를 활성화시킬 정도의 몰 비율로 첨가하고 하루 동안 반응시켜서 여과하였다. 상기 여과액으로부터 메틸렌 클로라이드를 증발시키고 벤젠을 약 50 ㎖ 정도 가하여 6시간 동안 유지하였다가 다시 여과하였다. 이로부터 얻은 여과액을 에테르에 침전시키고 다시 여과하여 반응물을 습득하였다.

HBSS 완충용액으로 세척한 췌장소도에 상기 반응물 23 ㎎이 용해된 HBSS 완충용액 15 ㎖을 첨가하고 1시간 동안 세포배양기에서 반응시켰다. 그 후 RPMI-1640 배양액으로 두번 세척한 후 동일한 배양액을 첨가하여 배양시켰다. 이러한 방법에 의해서 PEG 한쪽 말단의 활성화된 카르복실기는 췌장소도 막과 결합하게 되고 나머지 다른 한쪽 말단의 카르복실기는 수용액 상태에서 전해되어 음전하를 가지게 된다. 이렇게 되면 설폰기의 음전하에 의한 반발력 때문에 여러 면역물질의 접근을 피할 수 있어 이식된 췌장소도가 장기간 보호될 수 있다.

<실시예 7> In vitro 상에서 PEG-결합 췌장소도의 생존성 측정

<7-1> In vitro 정치배양 (Static Culture)

in vitro상에서 PEG-결합 췌장소도의 생존성을 측정하기 위하여, PEG가 결합된 췌장소도를 장기간 배양하면서 인슐린의 분비를 관찰하였다. 20개의 PEG-결합 췌장소도를 배양 플레이트 (culture plate) 내에 첨가한 후 배양 플레이트 삽입기 (inserts)를 넣고 삽입기에 젤라틴 스폰지 (gelatin sponge)를 넣어 췌장소도의 응괴현상 (aggregation)을 방지하였다. 배양액은 FBS가 10% 포함된 M199 (Gibco BRL Co., 5.5 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 6 mM HEPES, 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin)를 사용하였고, 이틀에 한 번씩 배양액을 갈아주면서 시료를 채취하였다. 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 이틀에 한번씩 채취한 시료로부터 RIA 방법 (insulin radioimmunoassay, Linco Research Inc.)을 이용하여 인슐린의 분비량을 측정하였다.

도 7은 PEG가 결합된 췌장소도와 PEG가 결합되지 않은 대조군 췌장소도에서 18일 동안 각각의 반응시간 별로 당에 대한 인슐린의 분비 반응곡선을 나타낸 것이다.도 7에 나타난 바와 같이, 췌장소도에 PEG를 결합하여도 인슐린을 분비하는 췌장소도의 기능은 저하되지 않았다.도 8은 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에서 4주 동안의 당에 대한 인슐린의 분비 반응곡선을 나타낸 것으로서, 상기도 7의 결과와 동일하게 PEG의 반복적인 결합으로 인한 인슐린을 분비하는 췌장소도의 기능에는 아무런 변화도 나타나지 않았다.

<7-2> In vitro 확산 실험 (Perfusion Test)

당의 자극에 대한 PEG-결합 췌장소도의 생존성을 확인하기 위하여, 짧은 시간 동안 환류시킨 서로 다른 농도의 당의 자극에 대한 췌장소도의 인슐린 분비 반응을 관찰하였다. 각각의 반응시간에 따라 PEG가 결합된 췌장소도와 대조군 췌장소도를 각각 50개씩 환류 실험기 (perfusion tester)의 췌장소도 배양기 (chamber) 내에 넣은 후 서로 다른 농도의 당을 포함한 KRBB 배양액 (3.469 g NaCl, 0.175 g KCl, 0.160 g MgSO₄7H₂O, 0.0816 g KH₂PO4, 0.1054 g CaCl₂, 1.05 g NaHCO₃, 1.19 g HEPES, 0.025g BSA, 1 ℓwater)을 37℃에서 5% CO₂를 공급하면서 환류시켰다. 먼저, 당 농도가 60 ㎎/dl 농도인 배양액을 30분 동안 환류시키면서 매 5분 마다 시료를 채취한 후 당의 농도를 갑자기 300 ㎎/dl로 급격하게 증가시킨 배양액을 환류시키면서 매 3분 마다 시료를 채취하였다. 마지막으로, 다시 당의 농도를 60 ㎎/dl로 낮춘 배양액을 환류시키면서 매 5분 마다 시료를 채취하였다. 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 상기와 같이 채취된 모든 시료들의 인슐린 농도는 RIA로써 측정하였다.

도 9는 PEG가 결합된 췌장소도와 대조군 췌장소도에서 각각의 반응시간에 따라 환류된 당의 자극에 대한 인슐린의 분비반응 곡선을 나타낸 것이다.도 9에 나타낸 바와 같이, PEG가 결합된 췌장소도는 대조군 췌장소도와 동일하게 당의 자극에 대하여 인슐린을 정상적으로 분비하였다.도 10은 반복적으로 PEG가 결합된 췌장소도에서 환류된 당의 자극에 대한 인슐린의 분비 반응곡선을 나타낸 것으로서, 이 경우에도 PEG가 반복적으로 결합된 췌장소도는 대조군 췌장소도와 동일하게 당의 자극에 대하여 인슐린을 정상적으로 분비하였다.

<실시예 8> PEG-결합 췌장소도의 이식, in vivo

<8-1> PEG-결합 췌장소도의 이식

200 내지 250 g의 SD 랫트에 60 ㎎/㎏ 스트렙토조토신 (streptozotocin)을 주사하여 당뇨를 유발하였다. 혈당 농도가 400 ㎎/dl 이상인 실험동물을 당뇨가 유발된 것으로 선별하여 췌장소도 이식의 수혜자 (recipient)로 사용하였다.도 11은 당뇨가 유발된 것으로 선별된 실험동물에서 60일 동안 혈당의 농도변화를 나타내는 것으로 당뇨가 유발된 실험동물은 400 내지 600 ㎎/dL의 혈당을 지속적으로 유지하였다. 당뇨가 유발된 실험동물에 대조군 췌장소도와 PEG가 결합된 췌장소도를 각각 1,000개와 2,000개씩 신장막에 이식하여 혈당의 변화와 실험동물의 체중을 관찰하였다.

도 12는 당뇨가 유발된 실험동물에 PEG-결합 췌장소도를 이식한 후의 혈당 농도변화와 체중변화를 나타내는 것으로서, PEG가 결합되지 않은 췌장소도를 이식한 실험동물은 2주 후 혈당이 500 ㎎/dL 이상으로 증가하였으나, PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 실험동물은 100일이 경과할 때까지 정상치의 혈당을 유지하였고 체중도 정상적으로 증가하였다.

<8-2> 조직검사(Histology)

PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 실험동물의 신장을 적출한 후 신장과 이식한 췌장소도의 조직검사를 실시하였다. 적출한 신장을 10% 포르말린 (formalin) 용액으로 고정시키고, 파라핀 (paraffin)에 조직 시료를 담근 후 마이크로톰 (microtome)을 이용하여 5 ㎛의 두께로 잘라서 슬라이드 글래스 (slide glass)에 위치시켰다. 잘게 잘려진 조직 시료를 자일렌 (xylene) 용액에 담가 파라핀을 제거하고 H&E 염색을 실시하였다. 세포의 핵은 짙은 푸른색으로 염색되고 세포질은 붉은색으로 염색되었다. 또한, 적출한 신장과 이식된 췌장소도의 인슐린 함유 유무를 확인하기 위하여 면역염색 (immuno staining)을 실시하였다. 염색과정은 상시 H&E 염색과 동일하고, 염색제로서 LSAB kit (DAKO Co.)을 사용하였다.

도 13은 대조군 췌장소도를 이식한 실험동물에서 이식 후 14일 경과 후의 신장막의 H-E 염색 결과를 나타낸 것이고,도 14는 PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 실험동물에서 이식 후 100일 경과 후의 신장막의 H-E 염색 결과를 나타내는 것이다. 이로 부터, PEG가 결합된 췌장소도의 경우에 임파구 (lymphocytes)의 침입 (infiltration)이 현저하게 낮음을 확인하였다.

<실시예 9> PEG-결합 췌장소도의 마이크로캡슐봉입

<9-1> PEG-결합 췌장소도의 마이크로캡슐봉입

막 표면에 생체고분자 PEG가 결합된 췌장소도를 마이크로캡슐로 봉입하기 위하여, 3000 개/㎖ 농도의 PEG-결합 췌장소도를 정제된 1.5% (w/v) 알긴산염 나트륨용액 (sodium aginate solution)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 10 ㎖ 주사기에 담은 후 공기-분사 (air-jet)하에서 주사기 펌프를 이용하여 100 mM CaCl₂용액에 적하하여 알긴산염 마이크로캡슐을 제조하였다. PEG-결합 췌장소도가 담긴 상기 마이크로캡슐을 50 mM CaCl₂용액으로 세척한 후 다시 25 mM CaCl₂용액으로 세척하고 마지막으로 150 mM 생리식염수 용액으로 세척하였다. 세척이 끝난 상기 마이크로캡슐을 0.05% (w/v) 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine, 2000 Mr) 용액에 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후 5 mM 2-N-싸이클로헥실아미노(에탄설폰산) (2-N-cyclohexylamino)ethanesulfonic acid, pH 7.4)으로 세척하고 다시 150 mM 생리식염수 용액으로 3분 동안 세척하였다. 이 후, 상기 마이크로캡슐을 0.15% 알긴산염 나트륨 용액에 4 내지 5분 동안 현탁시킨 후 55 mM 구연산염 나트륨 (sodium citrate) 용액으로 마이크로캡슐을 4분 동안 세척하여 캡슐 안쪽의 알긴산염 겔을 액화시켰다. 마지막으로, 상기 마이크로캡슐을 생리식염수 용액으로 세척하고 다시 RPMI-1640 배양액으로 세척한 후 동일한 배양액에 옮겨서 배양하였다 (도 15).

<9-2> 마이크로캡슐봉입된 PEG-결합 췌장소도의 이식

상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 당뇨가 유발된 실험동물에 대조군 췌장소도와 마이크로캡슐봉입된 PEG-결합 췌장소도를 각각 1,000개와 2,000개씩 신장막에 이식하여 혈당의 변화와 실험동물의 체중을 관찰하였다.

그 결과, PEG가 결합되지 않은 췌장소도를 이식한 실험동물은 2주 후 혈당이500 ㎎/dL 이상으로 증가하였으나, 마이크로캡슐로 봉입된 PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 실험동물은 100일이 경과할 때까지 정상치의 혈당을 유지하였고 체중도 정상적으로 증가하였다.

<실시예 10> PEG-결합 췌장소도의 마크로캡슐봉입

<10-1> PEG-결합 췌장소도의 마크로캡슐봉입

막 표면에 생체고분자 PEG가 결합된 췌장소도를 마크로캡슐로 봉입하기 위하여 하기와 같은 장치를 이용하였다. 마크로캡슐 봉입 장치는 세 개의 폴리테트라플루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene, PTFE) 링으로 이루어져 있는 지름 10 ㎜, 두께 1 ㎜의 막 지지체, 신장 투석 (renal dialysis)에 이용되는 막으로 69% 아크릴로나이트릴 (acrylonitrile)과 31% 메탈리 설폰산염 나트륨 (sodium methally sulfonate)으로 구성된 두께 20 ㎛의 AN69 막 및 췌장소도들이 뭉치는 것을 방지하기 위한 콜라겐 타입 Ⅰ 매트릭스 (collagen type Ⅰ matrix)로 구성되어 있다. 상기 콜라겐 타입 Ⅰ 매트릭스는 랫트의 꼬리 아킬레스 건으로부터 채취하여 멸균된 아세트산 용액 (1/1000 v/v)에 용해시킨 후 이 용액을 16000 ×g, 4℃ 조건에서 1시가 동안 원심분리를 수행하였다. 이로부터 얻은 상층액을 4℃에 보관하였다. 콜라겐 겔은 상기에서 준비한 냉각된 콜라겐 용액, 배양배지, 0.14 mM 바이카본산염 나트륨 (sodium bicarbonate) 용액을 각각 7 : 1 : 2의 부피 비율로 혼합한 후 겔화 (gelation)를 방지하기 위하여 상기 혼합액을 바로 얼음 수조에 넣어 냉각시켰다. 냉각된 혼합액에 적당한 수의 PEG-결합 췌장소도를 현탁시킨 후 췌장소도를 마크로캡??로 봉입하기 위하여 상기 현탁액 40 ㎕를 파이펫을 이용하여 상기 마크로캡슐봉입 장치에 채웠다. AN69 막으로 챔버를 막기 전에 37℃에서 10분 동안 굳혔다 (도 16).

<10-2> 마크로캡슐봉입된 PEG-결합 췌장소도의 이식

상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 당뇨가 유발된 실험동물에 대조군 췌장소도와 마크로캡슐봉입된 PEG-결합 췌장소도를 각각 1,000개와 2,000개씩 신장막에 이식하여 혈당의 변화와 실험동물의 체중을 관찰하였다.

그 결과, PEG가 결합되지 않은 췌장소도를 이식한 실험동물은 2주 후 혈당이 500 ㎎/dL 이상으로 증가하였으나, 마이크로캡슐로 봉입된 PEG가 결합된 췌장소도를 이식한 실험동물은 100일이 경과할 때까지 정상치의 혈당을 유지하였고 체중도 정상적으로 증가하였다.

따라서, 본 발명의 고분자를 이용한 췌장소도 막 표면의 개질방법은 췌장소도의 막 표면을 친수성 고분자로 변형시켜 췌장소도 끼리 서로 엉기지 않게 함으로써 마이크로캡슐봉입 방법이나 마크로캡슐봉입 방법에 사용될 때 췌장소도의 응괴현상을 억제하여 췌장소도의 생존성을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 다양한 고분자 결합을 이용하여 PEG와 같은 고분자 사슬을 췌장소도의 글리코겐 막 표면에 결합시키는 췌장소도 막의 표면개질 방법은 췌장소도의 이식시 면역 반응을 최소화하면서 산소나 영양소가 원활히 확산될 수 있도록 하여 췌장소도의 효율과 생존 기간을 연장시킬 뿐 아니라 이식에 필요한 췌장소도의 전체 부피를 줄일 수 있어 제제화에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

고분자 (polymer)를 췌장소도 (islet) 막에 결합시키는 췌장소도 막의 표면개질 방법.
제 1항에 있어서,

1) 고분자를 활성화시키는 단계; 및

2) 상기 활성화 고분자를 췌장소도 막에 결합시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 2항에 있어서, 단계 1의 고분자는 친수성 고분자인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 3항에 있어서, 친수성 고분자는 물과의 접촉각이 90도 이하인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 3항에 있어서, 친수성 고분자는 폴리(아크릴산)계 (poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계 (poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계 (poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계 (poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계 (poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계 (polystryene), 폴리옥사이드계 (polyoxide), 셀룰로오즈계 (cellulose), 전분계 (starch), 폴리다당류계 (polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계 (polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌) (poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈) (poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민 (poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 및 이들의 유도체 또는 혼합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 5항에 있어서, PEG는 PEG, 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS (branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드 (succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG nitrophenylcarbonates), PEG-알데히드 (PEG-aldehyde) 및 이들의 유사체 또는 혼합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 5항에 있어서, PEG의 분자량은 100 내지 1,000,000 달톤인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 3항에 있어서, 고분자는 측쇄 또는 말단에 관능기가 부착된 고분자인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 8항에 있어서, 관능기는 아민기 (amine group), 하이드록실기 (hydroxyl group), 카르복실기 (carboxyl group), 설폰기 (sulfone group) 및 이들의 혼합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 3항에 있어서, 고분자는 항혈전성을 갖는 고분자인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 10항에 있어서, 항혈전성을 갖는 고분자는 헤파린, 재조합 헤파린 (recombinant heparin), 헤파린 유도체 (heparin derivative) 및 헤파린과 유사한 특성을 갖는 헤파린 유사체 (heparin analogue)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 2항에 있어서, 단계 2에서 고분자를 췌장소도 막에 결합하는 방법은 화학적 공유결합인 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 12항에 있어서, 화학적 공유 결합방법은 췌장소도의 아민기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기 (thiol group) 및 아지드기 (azide group)로 구성된 군으로부터 선택되는 반응기를 이용하는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 1항에 있어서, 췌장소도 막에 고분자를 1회 또는 반복적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 1항에 있어서, 췌장소도 막에 다양한 분자량의 고분자를 반복적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 1항에 있어서, 췌장소도 막에 증폭화 반응 (amplification)을 거친 고분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 16항에 있어서, 증폭화 반응 (amplification)은 다관능성 고분자, 비닐계 고분자 및 티올계 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자를 췌장소도 막에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 췌장소도 막에 관능성 (functional) 고분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.
제 18항에 있어서, 고분자의 관능기는 설폰기 및 카르복실기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면개질 방법.