KR20020029213A

KR20020029213A - Ｌ-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 ｌ-트레오닌생산방법

Info

Publication number: KR20020029213A
Application number: KR1020000060045A
Authority: KR
Inventors: 황용일; 이만효; 최종수
Original assignee: 요헨 카르크, 안드레아스 비베르바흐; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: WO2002031172A2; WO2002031172A3; AU2002218232A1; KR100389580B1

Abstract

본 발명은 L-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 L-트레오닌 발효생산방법에 관한 것으로, 대장균으로부터 아미노산 요구성 및 아미노산 유사물질 (analogue) 내성 변이주를 유도하여 L-트레오닌 생산 균주인 대장균 MT201 (Thr analogue^r, Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Asp^r, Hom^r)을 획득하고 공시 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831으로부터 정제·회수된 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자를 플라스미드 pTrc99A에 삽입하여 구축한 재조합 플라스미드 pPC를 상기 변이주 MT201에 형질전환법으로 도입하여 L-트레오닌 고효율 생산 재조합 균주인 대장균 MT201/pPC을 획득하고 이 균주를 트레오닌 생산용 배지에 탄소원인 포도당과 나트륨 사이트레이트 (sodium citrate)를 일정비율로 혼합첨가하여 발효배양함으로써 L-트레오닌 생산량과 균주 생육이 월등히 향상된 재조합 균주 및 발효조를 이용한 유가배양으로 L-트레오닌을 생산하는 획기적인 발효생산방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｌ-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 Ｌ-트레오닌 생산방법 {E.coli variety producing L-threonine and producing method of L-threonine using thereof}

본 발명은 L-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 L-트레오닌 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 공지 대장균으로부터 아미노산 요구성 및 아미노산 유사물질에 내성을 가지는 변이주를 획득하고 공시균주로부터 획득한 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자를 공시 플라스미드에 삽입하여 구축한 재조합 플라스미드를 상기 변이주에 도입하여 필수아미노산인 L-트레오닌 고효율 생산 재조합 형질전환체를 제조한 후 이 균주를 이용하여 L-트레오닌을 고효율로 생산하는 발효생산방법에 관한 것이다.

트레오닌 (threonine)은 2개의 부재탄소를 가지며 4종류의 입체 이성질체가 존재하는 화학물질인데 이들 중에서 L-트레오닌은 필수 아미노산으로서 우리의 몸에 없어서는 안 될 중요한 아미노산이다. L-트레오닌은 동물 사료 및 식품의 첨가제로 널리 사용되며 의약용 (예를 들면, 아미노산 제제 등)으로 수액제, 의약품의 합성 및 생산원료로 사용되고 있다. 그러나, 자연계에서 L-형 트레오닌만을 화학적으로 분리한다는 것은 쉽지 않다. 발효법으로 생산되는 아미노산은 모두 L형이며, 특히 특정 아미노산을 값싼 원료로부터 단순한 공정에 의해서 높은 수득률로 생성, 축적시킬 수 있고 분리도 간단하게 되므로 공업적인 아미노산 제조법으로 널리 이용되고 있다.

α-아미노-β-하이드록시발레릭산 (α-amino-β-hydroxyvaleric acid, 이하 AHV)은 세균의 생장을 억제하는 L-트레오닌 유사물질 (analogue)이다. AHV는 L-트레오닌과 구조적으로 유사하여 과잉 축적된 L-트레오닌에 의하여 피드백 저해를 받는 효소들은 AHV에 의해서도 활성이 저해된다. 결과적으로, AHV의 존재하에서 세포 성장은 이러한 경로를 통해 저해된다. AHV에 대한 내성 변이주는 대장균 (Escherichia coli),브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속과 같은 미생물들로부터 분리되는데 이런 내성 변이주는 L-트레오닌의 축적에 의한 피드백 저해가 해제되는 특징이 있다.

L-트레오닌 대량생산을 위하여 통상적으로 유전자 재조합법을 이용하여 L-트레오닌 합성에 상관하는 효소군의 구조 유전자를 대량으로 발현시키는 방법 [미국특허 4,278,765.(1981), 일본공개특허 소61-70983, 유럽특허 제0,131,171호, Appl. Microbiol. biotechnol., 34. 617-622 (1991)] 등도 보고되고 있으나 이러한 방법들은 L-트레오닌의 대량생산을 위한 배양 중에 제작된 플라스미드들의 안정성이 크게 저하되는 문제점이 있었다. 이의 보완을 위하여 L-트레오닌 오페론 함유 플라스미드의 안정성을 높이기 위하여 여러 방법 [미국특허 제4,278,765.(1981), Gene, 31.275-277.(1984), 대한민국특허 제107376호]이 공지되어 있으며, 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여 대용량 발효 (large-scale fermentation)시 항생제를 첨가시키는 등의 방법도 사용되었다. 그렇지만, 위에서 언급된 방법들에 의하여 만들어진 플라스미드들은 L-트레오닌의 대량생산을 위한 발효공정에서는 제품 원가 측면 및 안정성 측면에서 바람직하지 못한 측면을 보이고 있다.

본 발명자들은 이를 개선하기 위하여 L-트레오닌의 대량생산을 시도하였다. L-트레오닌의 생산을 위해 포도당 대사계에 변화를 주어 L-트레오닌의 효율적 대량생산계를 이룩하고자 하였다. 먼저, 본 발명에서는 L-트레오닌 대량생산을 위하여 아미노산 영양요구성 및 아미노산 유사물질에 내성을 가지는 인공변이주를 유도하였다. 그리고, L-트레오닌의 대량생산을 위해서는 전구 물질인 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)의 과량합성이 필요하므로 (도 1) 이를 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831로부터 얻어진 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자를 피루베이트 카르복실라제 구조 유전자가발현되는 플라스미드 pTrc99A에 삽입시켰다. 피루베이트 카르복실라제의 구조유전자가 발현되는 재조합 플라스미드 pPC를 대장균 MT201균주에 형질전환시켜 도입합으로써 L-트레오닌 고효율생산 균주를 얻었다. 재조합 균주를 이용한 L-트레오닌의 생산성 향상을 위해서는 균주의 생육이 필수적이므로 사이트레이트 (citrate)의 충분한 공급을 위하여 포도당과 사이트레이트를 일정한 비율로 첨가하면서 L-트레오닌의 생산성을 검토하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아미노산 영양요구성 및 아미노산 유사물질에 내성을 가지는 L-트레오닌 생산 대장균 MT201을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 피루베이트 카르복실라제 유전자를 pTrc99A에 삽입하여 구축한 재조합 벡터 pPC를 상기 본 발명 대장균 MT201에 도입하여 제조한 L-트레오닌 생산력 및 균주 생육이 향상된 재조합 대장균 MT201/pPC를 이용하여 재조합 L-트레오닌을 고효율로 생산하는 발효배양방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 L-트레오닌의 생산량 향상을 위한 변이주를 획득하기 위하여 대장균 ATCC 21148, 대장균 ATCC 21151 등을 이용하여 Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r,Asp^r, Hom^r의 특성을 가진 본 발명 인공변이주 대장균 MT201을 획득한 후, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831 유래의 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자를 획득하고이 유전자를 플라스미드 pTrc99A에 삽입하여 재조합 벡터 pPC를 구축한 후 이 재조합 벡터 pPC를 상기 본 발명 인공변이주 대장균 MT201에 도입하여 L-트레오닌 고생산 재조합 대장균 MT201/pPC를 제조한 다음 이 균주의 배지 성분에 탄소원인 포도당 및 나트륨 사이트레이트 (sodium citrate)를 첨가하여 발효배양한 결과 L-트레오닌을 고효율로 생산함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명 트레오닌의 생성과정을 보여주는 TCA 회로 (cycle)이다.

도 2는 공지 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831으로부터 회수 및 정제된 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자를 플라스미드 pTrc99A에 삽입시켜 구축한 재조합 플라스미드 pPC의 개열지도를 나타낸다.

본 발명은 L-트레오닌 생산량을 향상시키기 위한 아미노산 영양 요구성 및 아미노산 유사물질에 내성을 가지는 변이주를 얻기 위하여 대장균 ATCC 21148 (Met^-, DAP^-)과 대장균 ATCC 21151 (Ile^-, DAP^-) 균주를 세포간 형질도입에 의해 교배시켜 Met^-, Ile^-, DAP^-특성을 나타내는 대장균 HT101 균주를 획득하고, 상기 대장균 HT101 균주에 돌연변이원 NTG를 처리하여 AHV에 내성을 가지는 L-트레오닌 생산균주인 대장균 HT201 (Met^-, Ile^-, DAP^-, Thr analogue^r)을 선발한 후 상기 선발된 대장균 HT201 균주를 이소루이신 및 DAP가 첨가되지 않은 배지에 희석 및 도말하여 생육이 느린 변이주 MT101 (Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r)을 선발하고 상기 대장균 MT101를 고농도의 아스파테이트 (aspartate)와 호모세린 (homoserine)이 함유된 배지에서 생육시켜 고농도의 아스파테이트 (aspartate) 및 호모세린(homoserine) 내성 변이주인 본 발명 대장균 MT201 (Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r,Asp^r, Hom^r)을 선발하는 단계; 해당계의 피루베이트 (pyruvate)로부터 직접 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)를 생성하는 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자를 공시 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831으로부터 획득하는 단계; 플라스미드 pTrc99A를 NcoⅠ 및 HindⅢ 제한효소로 절단한 후 상기 피루베이트 카르복실라제 유전자를 라이게이션시켜 피루베이트 카르복실라제 발현용 재조합 플라스미드 pPC를 구축하는 단계; 상기 본 발명 변이주 대장균 MT201 (Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r,Asp^r, Hom^r) 균주에 상기 재조합 플라스미드 pPC를 전기장 형질전환법으로 도입시켜 L-트레오닌 고효율생산 대장균 MT201/pPC를 제조하는 단계; 상기 변이주 대장균 MT201과 재조합 대장균 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산 및 균주의 생육 정도를 비교하기 위하여 단일 탄소원인 포도당이 첨가된 발효조 배양을 실시한 후 L-트레오닌의 생산량 측정 및 정량 분석을 실시하는 단계; 상기 변이주 대장균 MT201 및 재조합 균주 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산과 균주 생육에 미치는 사이트레이트 화합물의 영향을 알아보기 위하여 사이트레이트 및 포도당 첨가 플라스크 발효 배양을 실시한 후 L-트레오닌의 생산량 측정 및 정량 분석을 실시하는 단계; 포도당과 나트륨 사이트레이트의 첨가비에 따른 상기 변이주 대장균 MT201 및 재조합 균주 MT201/pPC의 L-트레오닌의 생산량 및 균주 생육 변화를 알아보는 단계 및 재조합 균주 MT201/pPC의 유가배양에서의 L-트레오닌 생산량 및 균주 생률을 조사하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명 아스파테이트 (aspartate)계 대사 변이주 MT201의 획득

L-트레오닌의 생산량을 향상시키기 위한 아스파테이트 (aspartate)계 대사 변이주를 얻기 위하여 대장균 (Escherichia coli)을 다음과 같은 순서로 변이유도처리하여 대장균 MT201 변이주를 획득하였다. 대장균은 37℃에서 LB 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 포도당)를 이용하여 일반배양하였다.

대장균 ATCC 21148 (Met^-, DAP^-)과 대장균 ATCC 21151 (Ile^-, DAP^-) 균주를 세포간 형질도입에 의한 교배를 실시하여 Met^-, Ile^-, DAP^-특성을 나타내는 균주 중에 가장 우수한 대장균 HT101 균주를 획득하였다. 상기 대장균 HT101 균주에 돌연변이원 NTG를 처리하여 트레오닌 유사물질 (analogue)인 AHV에 대해 내성을 가지는 350 균주 중에 L-트레오닌 생산능력이 가장 우수한 균주인 HT201 (Met^-, Ile^-, DAP^-, Thr analogue^r) 균주를 선발하였다. 상기 선발된 HT201 균주를 이소루이신 및 DAP가 첨가되지 않은 배지에서 반복하여 희석 및 도말하여 계대배양 중 생육이 느린 변이주 MT101 (Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r)을 선발하였다. 또한, 상기 변이주MT101을 고농도의 아스파테이트 (aspartate)와 호모세린 (homoserine)이 함유된 배지에서 생육시켜 고농도의 아스파테이트 (aspartate)와 호모세린 (homoserine)에 대해 내성을 가지는 본 발명 변이주를 획득하고 이를 대장균 MT201 (Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r,Asp^r, Hom^r)이라 명명하였다. L-트레오닌 생산을 위해 사용된 상기 균주의 특성을 표 1에 나타내었다.

본 발명에 사용된 균주의 특성

균주	특성	생산량 (g/L)
대장균 ACTT21148	Met^-, DAP^-	12.3
대장균 ACTT21151	Ile^-, DAP^-	10.2
대장균 HT101	Met^-, Ile^-, DAP^-	13.4
대장균 HT201	Met^-, Ile^-, DAP^-, Thr analogue^r
대장균 MT101	Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r	19.0
대장균 MT201	Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Thr analogue^r, Asp^rHom^r	24.0
대장균 JM109	recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi△(lac-proAB)

상기 변이유도된 아스파테이트계 대사 변이주 MT201을 생명공학연구소내 유전자은행에 2000년 10월 6일자로 기탁번호 KCTC 18048P로 기탁하였다.

실시예 2 : L-트레오닌 고효율 생산 균주의 제조를 위한 플라스미드의 제작 및 형질전환체의 제조

L-트레오닌의 대량생산을 위해서는 전구물질인 옥살로아세테이트 (oxaloace -tate)의 과량 생성이 필요하다 (도 1). 이를 위하여 해당계의 피루베이트 (pyruva-te)로부터 직접 옥살로아세테이트를 생산하는 기능의 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase)의 과량생산을 위한 발현용 플라스미드를 제작하였다.

제1단계. 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자의 분리 및 정제

피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자는 공지 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831으로부터 프라이머를 이용한 PCR법으로 획득하였다. 피루베이트 카르복실라제 유전자pyc에 대한 상세정보로 Koffas 등과 Peters-Wendisch 등의 논문 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 50(3), 346 -352, (1998), Microbiology, 144 (Pt 4), 915-927, (1998)]을 참조하여 양 말단에HindIII 제한효소부위를 지니는 프라이머를 각각 제작하였다. 피루베이트 카르복실라제 유전자의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 회수 정제된 염색체 DNA로부터 상기의 프라이머를 이용하여 Takara LA Taq kit (Takara사, 일본)를 이용하여 Delta Cycler II system (Ericomp사, 미국)으로 Takara사의 실험법에 따라 실시하여 피루베이트 카르복실라제 유전자를 포함하는 약 3.4 kb의 단편을 획득하였다. 이들 DNA단편을 제한효소HindIII로 처리하여 양 말단을HindIII절단부위를 지니는 DNA로 단편화한 결과, 피루베이트 카르복실라제 구조 유전자를 획득할 수 있었다.

제2단계. 상기 피루베이트 카르복실라제 유전자를 삽입시킨 재조합 벡터 pPC의 구축

대장균에서 피루베이트 카르복실라제 구조 유전자를 발현시키는 분자량 4.2 kb의 플라스미드 pTrc99A를 먼저 제한효소 NcoI으로 절단하여 평활화시킨 후에HindIII 링커를 부착하여 최종적으로 제한효소HindIII로 절단한 후 이 부위에 상기 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자를 포함하는 3.4 kb의 DNA 단편을 연결하여 7.5 kb의 발현용 재조합 플라스미드 pPC를 구축하고 그 개열지도를 도 2에 나타내었다. 상기 플라스미드들의 특성을 표 2에 나타내었다.

본 발명에 사용된 플라스미드의 특성

플라스미드	특성
pTrc99A	Ptrc, Amp^r, 4.2kb
pPC	pyruvate carboxylase gene, Ptrc, Amp^r, 7.5kb

제3단계. 상기 재조합 플라스미드 pPC를 도입시킨 형질전환체 MT201/pPC의 제조

L-트레오닌의 생산량 증대를 목적으로 상기 제 2단계의 피루베이트 카르복실라제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pPC를 본 발명 변이주 대장균 MT201에전기장 형질전환법 (electroporation)으로 도입시켜 형질전환 재조합 대장균 MT201 /pPC를 제조하였다. 전기장 형질전환법은 아래와 같다.

먼저, 상기 본 발명 변이주 대장균 MT201를 LB배지에서 하룻밤 전배양하여 10㎖의 LB배지에 0.01㎖ 접종하여 흡광도 (OD_600nm)가 0.8 정도가 될 때까지 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체만을 모아서 5㎖의 빙냉 살균그리세롤용액 (10% 그리세롤, 90% 초순수)으로 현탁하여 다시 원심분리를 실시하였다. 상기 조작을 반복한 후 얻어진 침전 균체에 0.1㎖의 빙냉 살균그리세롤용액을 첨가한 후 현탁하고 그 중 0.04㎖만을 취하여 형질전환에 이용하였다. 얻어진 균체 현탁액에 0.1㎍의 상기 재조합 플라스미드 pPC를 가하여 잘 섞은 후 ElectroporatorⅡ (Invitrogen, USA)를 이용하여 전압 1,500V, 전류 25mA, 저항 150Ω하에서 1회의 전기충격을 가하였다. 그 즉시 이들 균체 용액을 1㎖의 SOC 배지 (2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 20mM 포도당)에 넣어 잘 섞은 후 37^oC에서 1시간동안 배양하였다. 이 배양액의 적당량을 앰피실린이 첨가된 LB평판배지에 도말한 후 자라난 형질전환체를 선별하여 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPc를 획득하였다.

실시예 3 : L-트레오닌 생산 변이주 대장균 MT201 및 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산량 측정

L-트레오닌의 정량방법으로 닌하이드린 (ninhydrin) 시험법을 이용하였다. 닌하이드린 용액 1.75㎖, 나트륨 사이트레이트 (Sodium citrate)-HCl 완충용액 (pH 3.0) 0.25㎖, 원심분리한 배양 상징액 0.3㎖를 각각 취하여 증류수에 100배 희석한 다음 70℃에서 8분간 반응시킨 후 OD_576nm에서 측정하였다. 필요에 따라 아미노산 분석기로 동시에 측정하였다.

제1단계. 발효조 배양에서 단일 탄소원하에서의 MT201과 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산량 비교

단일 탄소원인 포도당 첨가 배지하에서 본 발명 L-트레오닌 생산 변이주 대장균 MT201과 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산량을 측정하여 비교하였다.

발효조 배양을 위한 종균 배지로는 리터당 포도당 10g, 트립톤 10g, 효모엑기스 7g, (NH₄)₂SO₄1g, NaCl10g, KH₂PO₄2g을 첨가하여 사용하였으며 30℃에서 500-700rpm으로 실시하였다.

탄소원으로 포도당 (glucose)만이 함유된 5L 발효조에서 L-트레오닌 생산균주인 변이주 대장균 MT201를 이용해 유가식 배양을 실시한 결과 L-트레오닌 최대생산량은 81 g/L이었다 (표 3). L-트레오닌 생산량 증대를 목적으로 본 발명 변이균주인 대장균 MT201에 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 유전자를 함유하는 상기 실시예 2의 재조합 플라스미드 pPC를 형질전환방법으로 도입시켜 제조한 상기 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC를 포도당만이 탄소원으로 첨가된 상기 배지에서 유가배양하여 본 결과 48.9 g/L의 L-트레오닌 생산량을 얻을 수 있었다 (표 3). 따라서, 대장균 MT201/pPC는 단일 탄소원인 포도당하에서 본 발명 대장균 MT210보다 생육 및 L-트레오닌 생산량 모두가 감소하였음을 알 수 있다.

균 주	생 육 (OD_660nm)	생산량 (g/L)
대장균 MT201	53.5	81.0
대장균 MT201/pPC	41.6	48.9

제2단계. 플라스크 배양에서 L-트레오닌 생산과 생육에 미치는 사이트레이트 (citrate) 화합물의 영향

변이주인 본 발명 대장균 MT201과 재조합 균주인 대장균 MT201/pPC는 탄소원으로 포도당만을 공급할 때 세포성장이 감소하였음을 제 1단계에서 확인할 수 있었다 (표 3). 이는 포도당이 해당과정을 거쳐 TCA 회로를 회전하면서 생육에 필요한 탄소골격을 공급해 주어야 하는데 피루베이트 카르복실라제에 의해 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)로의 공급은 활발하나 미생물 생육에 필요한 탄소골격의 공급이 모자라는데 기인한다 (도 1). 따라서, 이를 해결하기 위해 TCA 회로의 중간대사 산물인 시트르산 (citric acid)을 염의 형태로 첨가하였다. 이 때, 배양은 리터당 포도당 70g, 효모엑기스 2g, (NH₄)₂SO₄20g, MgSO₄1g, KH₂PO₄1.5g, FeSO₄10mg, CaCO₃30g, MnSO₄10mg을 첨가한 플라스크용 배지에서 실시하였다. 플라스크용 배지의 탄소원은 포도당 (5%) 또는 포도당 (3%) + 사이트레이트 (2%)를 이용하였다.

사이트레이트 (citrate)의 첨가없이 포도당만을 첨가한 경우와 포도당과 사이트레이트 (sodium citrate 또는 ammonium citrate)를 함께 첨가한 플라스크 배양에서 L-트레오닌의 생산량을 조사하였다. 본 발명 변이주 대장균 MT201 및 재조합 대장균 MT201/pPC를 LB 및 LBAmp 평판배지에서 하룻밤 키운 뒤 한 백금이를 60㎖의 상기 플라스크 발효배지를 넣은 500㎖ 삼각플라스크에 접종하여 30℃에서 180-200 rpm의 호기적 조건에서 배양하여 L-트레오닌을 생산하였다. 필요한 경우에는 앰피실린을 50mg/L 농도로 첨가하였다. 발효가 종료된 후 L-트레오닌 농도를 정량 분석하였다.

그 실험결과를 표 4에 나타내었다.

	포도당 (glucose)첨가
처리	무처리	암모늄 사이트레이트	나트륨 사이트레이트
균 주	생육	생산량	생육	생산량	생육	생산량
대장균MT201	3.0	24.0	0.3	4.0	8.8	28.5
대장균MT201/pPC	2.7	14.5	0.5	5.0	8.9	32.7
[주] 생육 (OD_660nm)생산량 (g/L)

이를 통하여, 플라스크 배양에서 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC 균주에 탄소원인 포도당과 나트륨 사이트레이트를 첨가한 배지가 L-트레오닌 생산 및 균주의 생육에 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다.

제3단계. 포도당과 나트륨 사이트레이트의 첨가비에 따른 L-트레오닌 생산량 변화

L-트레오닌 생산량에 영향을 미치는 나트륨 사이트레이트의 최적 농도를 알아보기 위하여 플라스크용 배지에 단일 탄소원인 포도당 및 나트륨 사이트레이트를 일정한 비율에 따라 전체 5%가 되게 조정하여 MT201 및 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산량을 각각 비교 실험하였다. 재조합 대장균 MT201/pPC를 LB 및 LBAmp 평판배지에서 하룻밤 키운 뒤 그 균주 한 백금이를 상기 제 2단계의 플라스크 발효배지 60㎖를 넣은 500㎖ 삼각플라스크에 접종하여 30℃에서 180-200rpm의 호기적 조건에서배양하여 L-트레오닌을 생산하였다. 필요한 경우에는 앰피실린을 50mg/L 농도로 첨가하였다. 발효가 종료된 후 L-트레오닌 농도를 정량분석하였다.

그 실험결과를 표 5에 나타내었다.

균 주	대장균 MT201/pPC
포도당:나트륨사이트레이트 첨가비	2.0:3.0	2.5:2.5	3.0:2.0	3.5:1.5	4.0:1.0	5.0:0.0
생산량 (g/L)	30.5	31.0	32.5	43.5	24.8	14.5

포도당과 나트륨 사이트레이트의 첨가비에 따라 재조합 대장균 MT201/pPC의 L-트레오닌 생산량은 효율적으로 증가되었으며 L-트레오닌 생산을 위한 최적 탄소원 첨가비는 포도당:나트륨 사이트레이트=3.5:1.5임을 알 수 있다.

제4단계. 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC를 이용한 유가배양에서의 L-트레오닌 생산

배지에 포도당과 나트륨 사이트레이트를 상기 제 3단계에서 얻어진 탄소원 및 나트륨 사이트레이트의 최적 첨가비 (포도당:나트륨 사이트레이트=3.5:1.5)대로 첨가한 후 재조합 균주 대장균 MT201/pPC를 접종하고 5L 발효조에서 유가배양으로 배양하여 L-트레오닌을 생산하였다. 본 배양은 리터당 포도당 50g, 효모엑기스 2.5g, (NH₄)₂SO₄10g, MgSO₄1g, KH₂PO₄2g_,FeSO₄10mg, MnSO₄5mg의 배지를 이용하였으며 배양 중 포도당, 메티오닌, KH₂PO₄을 추가 공급하였다. 필요한 경우에는 아미노산을 50∼100mg/L 또는 앰피실린을 50mg/L의 농도로 첨가하였다.

재조합 대장균 MT201/pPC를 LBAmp 평판배지에서 하룻밤 키운 뒤 종균배지를 60㎖씩 함유한 500㎖ 삼각플라스크에 한 백금이 접종하여 30℃에서 180-200rpm에서 충분하게 진탕배양한 후 상기 본 배양 배지 2L를 함유한 5L 발효조에 본 배양 배지의 5-10%에 상응하는 양을 접종하여 30℃, pH 6.8으로 하면서 조절용으로 암모니아수를 공급, 통기량 1vvm으로 유지하여 배양하였다. 배양 중 포도당의 소비에 따라서 포도당, 메티오닌, KH₂PO₄을 추가 공급하는 유가식 발효법으로 배양한 후 최종배양액을 분석하여 L-트레오닌의 생산량으로 표시하였다. 상기의 조건으로 실시한 결과 과량의 L-트레오닌을 생산하는 우수한 재조합 균주를 제작하였으며 그 생산량도 획기적인 105g/L을 얻을 수 있었다.

그 실험결과를 표 6에 나타내었다.

균 주	탄소원	생 육 (OD_660nm)	생산량 (g/L)
대장균MT201	포도당	53.5	81
대장균MT201/pPC	포도당	41.6	49
대장균MT201/pPC	포도당, 나트륨 사이트레이트	35.0	105

이와 같이, L-트레오닌의 대량생산을 위하여 아미노산 요구성 및 유도물질 내성 변이주를 유도하여 제조한 L-트레오닌 생산 변이균주인 본 발명 대장균 MT201에 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자가 삽입된 플라스미드 pPC를 도입하여 제조한 형질전환 재조합 대장균 MT201/pPC는 배지에 탄소원 포도당:나트륨 사이트레이트가 3.5:1.5로 포함되어 있을 때 L-트레오닌의 생산량과균주의 생육이 월등히 향상됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명 아미노산 요구성 및 아미노산 유사물질 내성 변이주인 대장균 MT201에 다양한 대사 물질의 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 도입시킴으로써 상기 실시예 2에서의 L-트레오닌 고효율 생산 균주와 같은 유용 균주를 생산할 수 있다. 본 발명에서는 L-트레오닌 생산 균주 MT201/pPC만을 실시예를 들어 설명하였으나 본 발명의 권리 범위는 이에만 한정하는 것은 아니다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 아스파테이트계 대사 변이주를 획득하기 위하여 대장균을 이용해 아미노산 요구성 및 AHV 등의 유사물질 (analogue) 내성 변이주, 즉 L-트레오닌 생산 균주인 대장균 MT201 (Thr analogue^r, Met^-, Ile^leaky, DAP^leaky, Asp^r, Hom^r)를 획득하고, 공시 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (C.glutamicum) ATCC 31831으로부터 정제 및 회수된 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase) 구조 유전자를 플라스미드 pTrc99A에 도입하여 재조합 플라스미드 pPC를 구축한 후 L-트레오닌의 대량생산을 위하여 상기 변이주 MT201에 재조합 플라스미드 pPC를 형질전환법으로 도입함으로써 과량의 L-트레오닌을 생산하는 우수한 재조합 균주인 대장균 MT201/pPC을 획득하고 이 균주를 발효조를 이용하여 포도당과 나트륨 사이트레이트를 첨가한 배지에서 유가배양을 실시한 결과, L-트레오닌 생산 변이주 MT201 및 L-트레오닌 생산량 및 균주 생육이 월등히향상된 재조합 균주 MT201/pPC를 이용한 L-트레오닌의 발효생산방법을 제공함으로써 동물 사료, 식품 첨가제 및 의료용 제제 등으로 이용될 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 축산업, 식품가공업 및 의약품 제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

대장균 ATCC 21148과 대장균 ATCC 21151를 세포간 형질도입에 의해 교배시켜 대장균 HT101를 획득하는 단계;

상기 대장균 HT101에 돌연변이원 NTG를 처리하여 AHV에 내성을 가지는 대장균 HT201를 선발하는 단계;

상기 선발된 대장균 HT201 를 이소루이신 및 DAP가 첨가되지 않은 배지에 희석 및 도말하여 생육이 느린 대장균 변이주 MT101을 선발하는 단계; 및

상기 대장균 MT101을 고농도의 아스파테이트 및 호모세린이 함유된 배지에서 생육하는 단계를 거쳐 획득함을 특징으로 하는 L-트레오닌 생산 변이주 대장균 MT201 (Escherichia coliMT201)(KCTC 18048P).
공시 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 31831 유래의 피루베이트 카르복실라제 유전자를 플라스미드 pTrc99A에 삽입하여 구축한 재조합 플라스미드 pPC를 상기 제 1항 기재의 아스파테이트계 대사 변이주 대장균 MT201에 도입하여 제조한 L-트레오닌 생산 재조합 대장균 MT201/pPC을 포도당 및 나트륨 사이트레이트를 혼합첨가한 배지에서 유가발효배양하여 L-트레오닌을 생산함을 특징으로 하는 L-트레오닌 발효생산방법.