KR20020024958A

KR20020024958A - 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자 및그를 이용한 말라리아 검출방법

Info

Publication number: KR20020024958A
Application number: KR1020000056819A
Authority: KR
Inventors: 임채승
Original assignee: 임채승
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2002-04-03

Abstract

본 발명은 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP) 유전자 및 그를 이용한 말라리아 검출방법에 관한 것으로, 삼일열 말라리아에 감염된 환자의 혈액을 채혈하여 혈중 원충의 DNA를 추출하고 그 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 분석한 후 그 유전자가 도입된 재조합 벡터를 구축하고 그 벡터가 도입된 형질전환체를 제조한 후 그로부터 유래한 유전자 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 이용하여 말라리아에 감염된 환자의 혈액을 반응시켜 본 결과, 정확하고 감도높고 신속한 삼일열 말라리아 검출 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자 및 그를 이용한 말라리아 검출방법 {DBP gene of Plasmodium viviax and the detection method of malaria using that}

본 발명은 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자 (DBP) 및 그를 이용한 말라리아 검출방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 삼일열 말라리아 (Plasmodium vivax)의 표면에서 발현되는 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 코딩하는 유전자, 아미노산, 상기 유전자를 삽입시켜 구축한 재조합 벡터, 그 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체 및 그로부터 발현된 유전자 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질과 이를 이용하여 정확하고 신속하게 말라리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.

말라리아는 고대부터 존재하던 인류 최대의 질환으로 20세기 이후 인간의 적혈구에서 처음으로 원충이 발견된 이후 많은 노력에도 불구하고 오늘날까지도 사라지지 않고 약화되지 않는 인류의 주 관심대상이 되는 전염병이며, 지구 전체 특히 개발도상국의 건강 문제로 등장하고 있는 실정이고, 불행하게도 60년대 이후 한국을 포함하여 말라리아 유행이 사라진 지역에서도 재등장이 보고되고 있다.

말라리아는 적혈구나 간세포 내에 포자충강 (class Sporozoa)의Plasmodium속에 속하는 원충이 일으키는 질병으로서 인간에게서 발생하는 말라리아로는 열대열 말라리아 (Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아 (Plasmodium vivax), 사일열 말라리아 (Plasmodium malariae)와 난형 말라리아 (Plasmodium ovale)의 네 종류가 있는데, 이 네 가지 말라리아 중 전자 두 종류가 전 세계에서 발병하는 말라리아 환자의 95% 이상을 차지하며, 특히 열대열 원충이 주로 그 원인이 되는 반면 우리나라에서 발병하는 말라리아는 온대, 아열대 및 열대지방에 분포하는 지리적분포가 가장 넓은 삼일열 말라리아이다.

우리나라에서는 10년 이상 사라졌던 토착성 삼일열 말라리아 환자 발생율이 1993년에 첫 환자가 발생한 이후 계속적으로 증가 추세에 있다. 말라리아는 모기를 종숙주로 하고 인체를 중간숙주로 하여 전염되는데, 모기가 사람을 물 때 모기의 침샘에 있던 포자소체가 주입되어 인체에 감염되는 것이 가장 보편적이다. 증상으로는 발열, 빈혈, 비장증대의 3가지 증상을 보이며 오한기, 고열기, 하열기 등의 발열특징을 나타낸다. 혈중 원충수는 낮은 편이고 흔히 혈소판 감소증이 나타난다. 감염된 시점으로부터 임상증세가 처음 나타날 때까지의 잠복기는 평균 14일 정도로 긴 편이고 특히 삼일열 원충은 간장조직 내에서 수개월 내지 2-3년 간 남아 조직형으로 재발 (relapse)의 원인이 되고 있고 근치 요법을 받지 않았거나 또는 불충분한 치료를 받았을 때에는 1-3년까지 모기에 대해 감염원이 되기도 한다. 이러한 긴 잠복기의 특성으로 말미암아 유행 지역에서 먼 지역으로 이동하여 발병할 수 있고, 혈중 원충수가 낮아 진단이 어려울 수 있다. 이러한 말라리아의 예방 및 치료를 위하여 클로로퀸 (chloroquine)과 프리마퀸 (primaquine) 등의 약제를 투약하고 있다. 그러나, 이들 약제는 말라리아에 대한 내성만 증가시켜 질병을 더욱 증가시킬 우려가 있으므로 말라리아에 대해 효과적인 백신을 재발하는 것이 필요하다.

말라리아의 생태는 특이적인데, 생체가 말라리아에 자연 감염된 후 생체는 말라리아에 대한 항체를 생성하며 중화능력을 나타내고 그 결과, 체액성 면역을 유발시키지만, 그의 항체 생성에 따른 중화능력은 습관성 면역으로서 지속되지 않고 몇 번이라도 감염을 허용하는 등의 방어면역으로서는 작용하지 않는다. 다시 말하면, 체액성 면역은 유발하지만, 세포성 면역에 의한 방어기전은 일어나지 않는다. 그 이유는 원충의 단백질이 보호 반응의 발달에 적당한 항원을 가지지 않거나 그 원충이 숙주의 면역체계를 피하는 메커니즘을 발전시켰기 때문이라고 생각된다.

기존 말라리아 감염의 진단은 혈액 도말 검사를 통한 혈중 원충 발견으로 이루어진다. 말라리아는 풍토지역에서 모든 발열환자의 혈액을 대상으로 검사되어야 하고, 열대지방을 단 몇 시간 경유하는 경우에라도 발열이 난다면 말라리아를 의심해 보아야 한다. 임상적인 증상으로 말라리아가 의심됨에도 불구하고 혈액 도말 검사를 할 시설이 없거나 즉시 검사결과를 알 수 없을 때에는 임시로 약제를 투여할 수 있다. 그러나, 이 경우에도 감염의 확인을 위하여 치료 전에 혈액 도말 검체를 확보해 두어야 한다. 말라리아 약제를 투여하여도 발열이 조절되지 않는다면 다른 발열 원인을 생각해야 하며, 아프리카의 말라리아 풍토병 지역에서는 임상적 증상으로 말라리아가 의심되지만 현미경 검사상 원충을 확인할 수 없는 경우가 거의 절반에 이르는데, 이는 감염이 적어 혈중의 원충 농도가 낮은 경우이다.

이외에 말라리아에 대한 간접형광항체검사 (Indirect Fluorescent Antibody Test : IFAT)가 개발되었는데 이 방법은 과거에 있었던 말라리아 감염과 함께 적은 감염도 확인할 수 있는 검사방법으로서 역학 조사목적으로 이용되며 말라리아 비장비대증의 진단과 혈액의 말라리아 선별검사에도 이용된다. IFAT에서 사용하는 균질 항원은 사람, 원숭이, 실험적 혈액배양에서 얻는 적혈구 스키존트 (schizont)에서 얻는다. 먼저 IFAT 검사 슬라이드에 항원, 항-인간 글로불린과 형광 이소티오시아네이트가 있고 거기에 희석된 검체를 반응시켜 항체가 반응한 결과를 형광현미경으로 확인하는 것이다. 이 검사는 말라리아의 면역반응 결과를 확인하는 것이지 반드시 말라리아 원충이 있어야 하는 것은 아니다. 역가 (titer)가 1:200 이상이면 최근 감염이 의심되며, 1:20 이상이면 양성으로 간주된다.

이상과 같은 환자의 항체를 이용한 말라리아 검출방법 (IFAT)은 다음과 같은 문제점을 갖고 있다. 먼저 말초혈액 도말 검사는 말초혈액 도말을 환자에게 실시하여 염색을 한 후 현미경으로 검사하는 방법으로, 고가의 형광현미경을 사용해야 하고 검사 시간이 많이 소모될 뿐만 아니라 판독에 객관적인 기준이 없어 검사결과를 숙련된 의사에 의해서 확인해야 하는 번거로움이 있고, 대량의 검사에는 적당하지 않다. 또한, 말라리아 원충이 적은 경우는 확인이 어렵고 말라리아의 과거 감염 여부를 확인 할 수 없어 말라리아 감염 후 휴지기 (hypnotic) 상태의 불현성 감염을 알 수가 없다. 더구나, 말라리아 균종 간에 형태학적으로 유사성이 높아 이들 균종을 서로 구분하기 어려운 문제점도 있고 원숭이가 아닌 사람의 감염 혈액으로 항원을 제조하는 경우 위 양성율이 높아 검사의 정확성에 문제점이 있었다.

상기의 사실들에 감안하여, 한국형 말라리아의 표면 단백질 (surface protein)의 유전자형을 밝혀낸다면 이 유전자로 유전공학적 기법을 이용하여 재조합 단백질을 제조할 수 있고, 이 유전자는 말라리아의 예방을 위한 진단시약, 특히 간편한 방법인 효소면역검사를 할 수 있는 원료 항원이 될 수 있을 것이다. 또한, 이 항원을 이용하여 말라리아 백신을 개발할 수 있으므로 말라리아의 간단한 진단 및 예방, 역학적 연구에 결정적인 역할을 할 수 있다. 이 개발된 말라리아 항원을 이용하여 진단시약과 백신을 제조하려면 이 유전자를 기초로 한 단백질 발현 과정이 필요하다.

본 발명은 인체에 침입한 말라리아가 증식하면서 인접 적혈구를 침입할 때 가장 중요한 기능을 수행하는 더피 (duffy) 혈액형 부착 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자, 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 관한 것으로, 이 단백질은 인체가 말라리아에 대해 저항하는 면역기능을 형성하는데 중요한 기능을 하고 있다. 따라서, 이 단백질을 항원으로 이용하여 말라리아 검출용 면역 효소검사시약 및 말라리아 백신을 개발할 수 있다.

또한, 본 발명의 한국 삼일열 말라리아의 독특한 유전자는 외국의 삼일열 말라리아 유전자와 달라서 이 유전자를 기초로 진단 시약을 제조하거나 백신을 제조하는 경우 그 효과가 외국에서 들여오는 시약에 비하여 높은 예민도와 효과를 보일 수 있어 말라리아 예방에 도움이 된다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기의 사실들을 감안하여 한국산 삼일열 말라리아의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 염기서열을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 pQE30 플라스미드에 삽입시켜 제조한 재조합 벡터 KPV DBP-1 및 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체와 그로부터 발현되는 유전자 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체의 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자에 의하여 코딩되는 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 이용하여 보다 정확하고, 감도높고, 신속한 삼일열 말라리아 검출 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 혈액 도말 검사를 실시하여 혈중 원충의 존재가 확진된 말라리아 환자의 혈액을 추출하여 그 원충의 DNA를 추출한 다음, 추출한 DNA의 증폭을 위하여 재조합 프라이머를 구축하고 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행한 후 중합효소연쇄반응 결과 증폭된 산물을 전기영동시켜 염기 띠를 확인하고 DNA 및 아미노산의 염기서열 결과를 판독한 후 상기 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP) 유전자 및 아미노산의 염기서열 유래의 유전자 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 생산하고 이를 이용하여 말라리아를 손쉽게 검출함으로써 달성되었다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명 삼일열 말라리아 (plasmodium vivax)의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자를 분리하여 검체와 반응시킨 전기영동 결과를 나타낸다.

도 2는 본 발명 삼일열 말라리아의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸다.

도 3은 본 발명 삼일열 말라리아의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자로부터 유추한 아미노산 서열을 나타낸다.

도 4는 본 발명 삼일열 말라리아의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 유전자를 pQE30 벡터에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 KPV DBP-1의 개열지도를 나타낸다.

본 발명은 말라리아의 임상증상을 나타내는 환자를 대상군으로 설정하고 혈액 도말 검사를 실시하여 혈중 원충의 존재가 확진된 환자의 혈액을 추출하는 단계; 상기 대상군의 혈중 말라리아 원충의 형태학적 진단 및 혈중농도를 측정하고 대상군의 특성을 조사하는 단계; 상기 혈중 말라리아 원충의 DNA를 추출하기 위하여 감염 환자로부터 채혈된 전혈로부터 원심분리, 볼텍스, 히트 블록 등의 과정을 거쳐 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA의 증폭을 위하여 재조합 프라이머를 구축하고 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행한 후 PCR 결과산물을 전기영동시켜 염기 띠를 확인하는 단계; 상기 증폭된 DNA를 ABI PRISM(TM) Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) 및 열 사이클러 등을 이용하여 다시 증폭시킨 후 분리하고 ABI PRISM^TM377 DNA Sequencer을 사용하여 유전자 및 아미노산의 염기서열 결과를 판독하는 단계; 상기 DBP 유전자와 pQE30 플라스미드를 BamHⅠ 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고 라이게이션하여 상기 DBP 유전자가 도입된 재조합 벡터 KPV DBP-1를 구축하는 단계; JM109 및 M15 숙주세포에 상기 재조합 벡터 KPV DBP-1를 도입하여 형질전환체를 제조하고 선별하는 단계; 상기 형질전환된 균주로부터 발현된 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 전기영동 및 염색법으로 확인하고 그 분자량을 측정하는 단계; 상기 재조합 DBP 생산 형질전환체를 초음파분쇄기로 분쇄한 후 원심분리하여 상층액을 회수하고 컬럼에 통과시켜 재조합 DBP를 정제하는 단계; DBP에 특이적인 환자의 혈정과 상기 재조합 DBP을 반응시키는 웨스턴 블럿팅을 수행한 후, HRP-conjugated Anti-human secondary Ab를 반응시키고 HRP에 대한 기질인 4-Chloro-1-naphthol을 가하여 발색시키는 단계; 정제된 상기 재조합 DBP를 소 혈청 알부민을 표준단백질로 하여 검체를 반응시킨 후 goat anti-human IgG와 horse radish peroxidase 접합체액을 반응시키고 TMB를 첨가하여 발색시킨 후 흡광도를 조사하여 말라리아를 검출하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명 대상군의 선정 및 역학 조사

제1단계. 본 발명 대상군의 선정 및 임상 진단

1996년에서 1997년 사이 말라리아의 특징적인 임상증상을 보여 국군수도병원과 고려대학교 임상병리과학 교실에 내원하거나 검체가 의뢰된 환자 50명을 대상으로 혈액도말검사를 실시하여 원충의 존재를 확진한 뒤 개별적인 면담을 통해 증상의 발명일시, 근무장소, 발열양상 및 간격, 해외여행 여부 등의 병력조사를 하여 국내발생 말라리아로 추정되는 예를 대상군으로 선정하고 혈액검사 등을 통해 혈중의 원충 농도와 발생환자의 역학적인 상황을 조사하였다.

제2단계. 상기 본 발명 대상군의 말라리아 원충의 형태학적 진단 및 원충의 혈중농도 계산

말라리아의 형태학적 진단은 EDTA가 들어 있는 진공채혈관 (Becton- Dickinson, 미국)을 사용하여 전박 주정맥에서 4-5㎖의 정맥혈을 채혈한 뒤, 유리 슬라이드에 박층 혈액 도말 (thin blood smear)과 후층 혈액 도말 (thick blood smear)을 동시에 준비한 후 Wright-Giemsa 염색법과 Giemsa 염색법으로 말초 혈액 도말 검사를 실시하였다. 원충의 존재는 말라리아의 원충 단계에 따른 그 존재 유무를 표기하였으며, 자동 혈구 분석기 (Celldyne 3000, U.S.A)로 측정한 백혈구 수를 이용하여 현미경 검경시 계수된 백혈구 수 대비 말라리아 원충의 수로 환산하였다. 자세한 계산 방식은 아래와 같다.

말라리아 혈중 원충농도 (Parasite/㎕)

=백혈구 100개당 원충 수 × 단위 용적당 백혈구 수 (/㎕)/100

제3단계. 본 발명 대상군의 특성

1996년 8월 초부터 1997년 말까지 국군수도병원 및 고려대학교 임상병리과학 교실로 의뢰된 상기 대상 중 그 혈액에 말라리아 원충이 존재하는 것으로 밝혀진 대상군 27명의 특성을 조사하였다.

지역별 분포는 파주 지역이 12명 (48%), 연천 지역이 9명 (36%)이었다. 성별로는 남자환자가 25명 중 24명 (96%), 여자환자는 25명 중 1명 (4%)이었다.

환자의 직업으로는 현역 군인이 20명 (80%)으로 가장 많았고, 군 제대자가 3명 (12%), 그리고 운전기사와 학생은 각각 1명이 존재하였다. 연령은 주로 20대로서 평균 연령은 23세 (12-45)였다.

검사시기는 96년이 23명, 97년이 2명이었으며 대상 검체의 월 발생 빈도는 6월이 8명 (32%)으로 가장 많았고 다음이 9월 (28%), 10월이 4명 (12%)순이었다.

확진된 환자 27명은 모두 병력 조사상 외국 여행을 한 적이 없었으며 수혈받은 병력도 없는 국내 거주자이므로 국내 발생 삼일열 말라리아 (Plasmodium vivax)에 감염된 환자로 볼 수 있다. 대상군 환자 혈중 원충의 농도는 최저 23개/㎕에서 최고 15,330개/㎕의 농도로 평균 2,040개/㎕ 였다 (표 1).

삼일열 말라리아에 감염된 환자들의 특성

환자번호	성별/연령	PCR 결과	말라리아 갯수/㎕	거주 지역
1	F/12	+	12,000	파주시
2	M/21	+	2,600	강화군
3	M/21	+	15,330	파주시
4	M/21	+	1,941	강화군
5	M/22	-	56	파주시
6	M/22	-	6,840	연천군
7	M/22	W⁺	520	파주시
8	M/23	-	340	파주시
9	M/23	-	983	연천군
10	M/22	+	329	고양시
11	M/22	-	127	연천군
12	M/23	W⁺	23	포천군
13	M/25	-	525	연천군
14	M/22	-	217	연천군
15	M/22	+	1,000	연천군
16	M/20	+	166	철원군
17	M/23	W⁺	32	연천군
18	M/23	+	1,320	파주시
19	M/23	+	1,320	연천군
20	M/22	-	341	파주시
21	M/22	+	70	연천군
22	M/23	W⁺	250	철원군
23	M/25	+	3,400	파주시
24	M/24	+	2,750	파주시
25	M/24	+	970	파주시
26	M/24	W⁺	300	파주시
27	M/45	-	1,320	철원군
평균	23		2,040
최고치	45		15,330
최저치	12		23
[주] PCR 결과 중에서 W⁺는 약한 양성 반응을 나타낸다.

실시예 2 : 상기 대상군 말라리아 원충 DNA의 추출 및 염기서열의 결정

제1단계. 말라리아 원충 DNA의 추출

상기 말라리아 감염 환자로부터 채혈된 전혈로부터 DNA 추출 키트 (InstaGene^TMMatrix)를 사용하여 말라리아 원충의 DNA를 추출하였다. DNA 추출방법은 증류수 1㎖에 전혈 10㎕를 더한 후 실온에서 30분간 방치한 다음 12,000RPM에서 3분간 원침한 후 20㎕의 상층액만 남기고 조심스럽게 따라버린다. 남은 침전물에 DNA 추출용액 (InstaGene^TMMatrix) 200㎕를 가한 후 56℃ 히트 블록 (heat block)에 30분간 둔 다음 10초간 볼텍스로 강하게 진탕한 뒤 100℃ 히트 블록에 8분간 둔다. 다시 볼텍스로 10초간 강하게 진탕한 뒤 12,000 RPM으로 3분간 원심분리하여 침전시키면 보유액에 DNA가 추출된다.

제2단계. 상기 추출된 DNA의 중합효소연쇄반응 (PCR)에 의한 증폭

추출된 DNA의 증폭은 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, 미국)을 이용한 중합효소연쇄반응 (PCR)에 의해 수행하였다. 공지된 Salvador I strain (Gene bank M61095, PFADUFR) 을 바탕으로 유전자의 PCR을 위한 재조합 프라이머를 구축하여 그 특성을 표 2에 나타내었다.

추출된 DNA의 PCR 증폭을 실시하기 위한 프라이머

	프라이머 1	프라이머 2
길이	22 base pair	22 base pair
타입	핵산	핵산
쇄의 수	1본쇄	1본쇄
토폴로지	선형	선형
분자의 타입	DNA	DNA
서열	TGGGACTGTA ACACTAAGAA GG	TTCATTCTCA AAAGCCACCT CG

표 2의 프라이머는 각각 약 7OObp의 반응산물을 만들도록 상기 공지된 Salvador I strain을 바탕으로 본 발명자가 고안한 것이다. 중합효소연쇄반응시 반응 검체의 혼합 조건은 프라이머의 농도를 각각 1 μmol/㎕, MgCl₂의 농도는 약 20 μmol/㎕로 조절하였다.

중합효소연쇄반응은 95℃에서 1분간 열 변성을 시킨 뒤 53℃에서 1분간 결합시키고 72℃에서 3분간 중합 반응을 시켜 30주기를 반응시켰으며 반응산물의 검출 및 확인은 중합연쇄반응의 반응 산물 10㎕를 2% 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후 그 겔을 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색한 후 방사선 조사하여 염기 띠를 확인하였다 (도 1).

제3단계. 상기 DNA의 염기서열 결정

상기 증폭된 DNA의 염기서열 결정은 ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer)를 사용하여 반응액 20㎕당 종결 반응 혼합물 (Terminator Ready Reaction Mix) 8㎕, 1μM의 상기 프라이머 3.2㎕와 30ng의 주형 (template)을 첨가하고 광유를 가하여 열 사이클러 (thermal cycler)로 25주기를 증폭하였다. 증폭 각 주기에 따른 조건은 96℃ 30초, 50℃ 15초, 60℃ 4분이며 첫 번째 주기는 96℃ 5분을 채택하였다. 증폭 종료 후에는 반응액을 3M 초산나트륨 (pH 4,6) 2㎕, 95% 에탄올 50㎕와 혼합하여 얼음 위에 1분간 방치한 뒤 11000rpm에서 20분간 원심분리하고 침전물을 70% 에탄올 250㎕로 세척한 후 진공건조 시킨 뒤 6㎕ 주입 완충액 [loading buffer, 탈이온화 포름아미드 5㎕, 50mg/㎖ 블루 덱스트란 1㎕를 함유하는 25mM EDTA (pH 8.0)]에 용해시켰다. 주입 직전에 90℃에서 2분간 변성시킨 후 1.5㎕ 씩을 4% 폴리아크릴 아미드 시퀀싱 겔에서 3000V로 전기영동하고 ABI PRISM^TM377 DNA Sequencer로 DNA 염기서열 및 아미노산 서열 결과를 판독하여 말라리아의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)의 유전자를 분리하고 그 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하였다 (도 2 및 도 3).

실시예 4 : 상기 삼일열 말라리아 더피 (duffy) 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP) 유전자를 이용한 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질의 제조 및 정제

제1단계. 말라리아 DBP DNA의 추출, 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

상기 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP) 유전자를 1.2 % 아가로스 겔 (agarose gel)에서 전기영동하여 확인한 후, QIAEXⅡ 겔 추출 키트 (gel extraction kit)를 사용하여 상기 아가로스 겔로부터 유전자를 추출하여 사용하였다. 상기 PCR 산물인 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자와 플라스미드 pQE 30을 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ를 사용하여 37℃에서 절단하고 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 밴드 크기를 확인한 후, 다시 겔로부터 추출하여 얻은 삽입물과 플라스미드 벡터에 1 ㎕의 10 x 박테리오파아지 (bacteriophage) T4 DNA 리가아제 완충제 (ligase buffer)와 1 ㎕의 T4 DNA 리가아제 (ligase, 1wU)를 가한 후 최종 부피가 10 ㎕이 되도록 멸균수를 가하여 16℃에서 overnight 반응시켜 상기 DBP 유전자가 플라스미드 pQE30에 도입되도록 하여 재조합 벡터 KPV DBP-1을 제조하였다. 그 개열지도를 도 4에 나타내었다.

숙주세포인 JM109과 M15 (pREP4)를 37℃에서 16시간 배양하여 20㎖의 새배지에 500 ㎕씩 접종한 후 2000 x g, 4℃에서 5분간 원심분리하여, 세포 펠렛 (cell pellet)에 1㎖의 1 x TSS [85% LB media, 10% PEG 8,000 (w/v), 5% DMSO (v/v), 50mM MgCl₂]를 가하여 잘 섞어준 후 100 ㎕씩 분주하여 형질전환에 사용하기 위해 준비하였다.

상기 재조합 벡터의 라이게이션 혼합물 (ligation mixture) 3 ㎕와 상기 숙주세포 JM109, M15 콤페턴트 세포 (competent cells) 100 ㎕를 섞어 얼음에서 30분간 방치시킨 후, 42℃에서 90초간 열충격 (heat shock)을 가하고, 즉시 냉각시킨 후, LB 900 ㎕를 가하여 37℃에서 1시간 배양하여 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제조하였다. 이것을 LB/Amp (100 ㎍/㎖) 플레이트에 도말한 후 37℃에서 16시간 배양하여 얻은 콜로니를 5 ㎖ 배양하여 이로부터 재조합 플라스미드 ( recombinant plasmid)를 추출한 다음 이 재조합 플라스미드를 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ로 각각 절단하여 DBP 유전자를 함유하고 있는지 확인하였으며, ORF (Open reading frame)이 정확한지 조사하기 위해 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정은 위에서 기술한 바와 같이 Perkin-Elmer ABI 377 automatic sequencer를 사용하였다.

상기 DBP 유전자가 삽입된 형질전환균주를 미생물기탁기관에 기탁하였다.

제2단계. small-scale 배양을 통한 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질의 발현 및 확인

형질전환된 상기 균주의 단일 콜로니를 10 ㎖의 LB [100 ㎍/㎖ 앰피실린 (ampicillin), 25 ㎍/㎖ 카나마이신 (kanamycin)]에 접종하여 overnight 배양한 후, 새 배지에 500 ㎕를 접종하여 37℃에서 A₆₀₀이 0.7-0.9에 도달할 때까지 약 1시간 가량 배양한 후, IPTG (최종농도 1 mM)를 가하여, 같은 온도에서 2 시간과 4 시간씩 키운 후 그중 각각 1 ㎖을 취하여 8000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 그 상층액을 제거한 후 30 ㎕의 2 x SDS-PAGE 샘플 버퍼 (sample buffer)를 첨가하여 100℃에서 5분간 끓인 후 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 12% SDS-PAGE를 수행하였다. 비유도체 대조구 (Uninduced control)로는 동일한 조건에서 IPTG만 넣지 않은 것을 사용하였다.

발현 확인을 위하여 각 시료를 1 ㎖씩 취하여 2 × 샘플 버퍼 (0.125 M Tris-HCl, pH 6.2, 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 머캅토에탄올)에서 현탁한 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔 (polyacrylamide gel)에서 150 V로 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 겔은 코마시 블루 (Commassie blue)로 염색하여, 상기 유전자로부터 발현된 27 KDa의 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)임을 확인하였다.

제3단계. 재조합 단백질의 정제

재조합 DBP를 발현하는 상기 형질전환 대장균을 융해 완충액 [10 mM 인산나트륨 (sodium phosphate), 30 mM 염화나트륨 (NaCl), 10 mM 머캅토에탄올 (mercaptoethanol), 10 mM EDTA, pH 7.2]으로 부유하였다. 라이소자임 (Lysozyme ,1 mg/㎖)을 혼합한 후 얼음속에서 30분간 방치하여 대장균을 융해시켰다. 초음파분쇄기로 최대 출력의 50%에서 5분간 3회 분쇄한 후 4℃에서 8000 rpm, 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액에 컬럼 버퍼 (column buffer)를 동량 첨가하여 정제에 사용하였다. 아밀로즈 수지 (Amylose resin, NEB사, USA)을 3.2 X 10.3 cm 컬럼에 채운후 컬럼 버퍼 (10 mM 인산나트륨, 0.2 M 염화나트륨, 10 mM 머캅토에탄올, 10 mM EDTA, pH 7.2)로 컬럼 부피의 3배 양으로 세척한다. 대장균 용해액을 1 ㎖/min의 속도로 통과시킨 후 컬럼 완충액으로 세척하고 10 mM 말토즈가 함유된 컬럼 완충액으로 단백질을 용출하여 5 ㎖씩 분획을 수집하였다. 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 확인하였다.

실시예 5 : 상기 재조합 DBP를 이용한 말라리아의 검출

제1단계. 재조합 DBP의 Immunoblotting

발현이 확인되고 정제된 상기 재조합 DBP의 말라리아 환자의 혈청 인식여부를 조사하기 위해 웨스턴 블럿팅 (Western blotting)을 수행하였다. DBP에 특이적인 99-23, 96-73등 세 종류의 혈청을 각각 50 ㎕씩 사용하였다. 실시예 4의 제 3단계에서와 같이 비유도체 대조구 (uninduced control), 2시간, 4시간에서 각각 발현이 유도된 재조합 단백질을 SDS-PAGE을 통하여 분리한 후 PVDF 막에서 일정전압 60 V로 3시간동안 옮긴 다음, 10 ㎖의 블러킹 완충액 (blocking buffer, 5% non-fat dry milk in TTBS)에 담가 overnight하였다. TTBS (20 mM Tris-Cl, 137 mM 염화나트륨, 0.1% Tween 20, pH 7.6)로 15분간 한번, 5분간 세 번 세척한 후, 99-23, 96-73등 세 종류의 환자 혈청을 50 ㎕씩 5 ㎖의 TTBS내로 넣어 상온에서 천천히 흔들면서 1시간동안 반응시켰다. TTBS로 15분 한 번과 5분 세 번 세척한 후 HRP-conjugated Anti-human secondary Ab (Sigma, U.S.A)를 1:1000로 희석하여 TTBS 5 ㎖내에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, 동일한 세척 과정을 거친 후 HRP에 대한 기질인 4-클로로-1-나프톨 (4-Chloro-1-naphthol)을 4 ㎖가하고 천천히 흔들면서 발색시켰다.

제2단계. ELISA에 의한 재조합 DBP의 항원 활성 측정 및 결과 분석

정제된 상기 DBP 단백질을 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 표준 단백질로 하여 Bradford법에 의하여 595 nm에서 비색 정량하여 10㎍/㎖이 되게 50 mM 탄산염 완충액 (carbonate buffer, pH 9.6)에 섞어 100㎕을 microtiter well (Nunc-Immuno Module, Denmark)에 넣고 25℃에서 16시간 방치하였다. 그리고 카제인으로 2시간동안 봉쇄한 후 검체를 인산염-카제인 완충액으로 1/20로 희석하여 100㎕를 넣은 후 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 인산염 완충액으로 5회 세척하고 goat anti-human IgG와 horse radish peroxidase 접합체액을 37℃, 30분간 반응시키고 세척 후 트리메틸벤지다인 (Trimethylbenzidine, TMB)을 첨가하여 발색시키고1.6 N 황산용액으로 반응을 정지시킨 후 96 well plate autoreader를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 상기 반응에 사용된 검체의 57% (15/27)가 정상혈청의 OD와 두두러진 차이 (2SD)를 보이는 양성으로 나타났다.

전체 27명의 환자 중 24명 (85%)이 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 이용한 중합 효소 연쇄 반응에서 양성의 소견을 보였으며 상기 실시예 2의 제 2단계에서의 전기영동결과 750bp 근처에서 DNA 분획을 확인할 수 있었다 (도 1).

말라리아 중합 효소 반응 양성예의 말초혈액상 원충의 농도는 최저 23개/㎕에서 최고 15,330개/㎕이었으며 평균 2,630개/㎕의 소견을 보였다. 말초도말 소견에서는 양성이나 말라리아 중합 효소 반응에서는 음성인 예에서는 최저 56개/㎕에서 최고 1,320개/㎕의 넓은 분포를 보였으나 평균 원충 농도는 양성예에 비해 현저하게 낮았다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 말라리아가 증식하면서 인체 적혈구를 침입할 때 가장 중요한 기능을 수행하는 삼일열 말라리아 (plasmodium vivax)의 더피 (duffy) 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 분리하고 그 유전자 및 아미노산의 염기서열을 분석한 후 그 유전자를 도입시킨 재조합 벡터 및 형질전환체를 구축 및 제조하고 그로부터 유래한 유전자 재조합 단백질을 분리 및 정제한 후 이용함으로써 삼일열 말라리아를 정확하고 간편하며 감도높게 검출하는 방법을 제공할 수 있고, 더 나아가 상기 유전자를 이용하여 재조합 더피 형액형 부착 표면 단백질을 제조할 수 있으며 이 항원을 이용하여 말라리아의 예방을 위한 진단 시약 및 백신을 개발할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 국민건강증진 및 의약품 제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

삼일열 말라리아 (Plasmodium vivax)의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 코딩하는 하기의 유전자 염기서열.
삼일열 말라리아 (Plasmodium vivax)의 더피 혈액형 부착 표면 단백질 (DBP)을 구성하는 하기의 아미노산 서열.
상기 제 1항 기재의 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자를 pQE30에 도입시켜 구축한 재조합 벡터 KPV DBP-1.
삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 유전자를 포함하는 상기 제 3항 기재의 재조합 벡터 KPV DBP-1를 JM109 및 M15 숙주세포에 도입시킨 것을 특징으로 하는 재조합 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 생산 형질전환체.
제 4항 기재의 재조합 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 생산 형질전환체로부터 발현되는 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질.
제 4항 기재의 재조합 삼일열 말라리아 더피 혈액형 부착 표면 단백질 생산 형질전환체를 분쇄하여 원심분리한 후 상층액을 회수하여 컬럼 크로마토그래피하여 정제한 재조합 더피 혈액형 부착 표면 단백질을 소 혈청 알부민을 표준단백질로 하여 검체와 반응시킨 후 goat anti-human IgG와 horse radish peroxidase 접합체액을 반응시키고 TMB를 첨가하여 발색시킨 후 흡광도를 조사하여 말라리아를 검출하는 단계로 구성되는 말라리아 검출방법.