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KR20020023733A - 선천성 부신성기 증후군의 진단 방법 및올리고뉴클레오타이드 칩 - Google Patents

선천성 부신성기 증후군의 진단 방법 및올리고뉴클레오타이드 칩 Download PDF

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KR20020023733A
KR20020023733A KR1020010079019A KR20010079019A KR20020023733A KR 20020023733 A KR20020023733 A KR 20020023733A KR 1020010079019 A KR1020010079019 A KR 1020010079019A KR 20010079019 A KR20010079019 A KR 20010079019A KR 20020023733 A KR20020023733 A KR 20020023733A
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kctc
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진동규
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진동규
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Publication date
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Abstract

본 발명은 부신성기 증후군의 21-하이드록실라제 유전자의 돌연변이 및 정상 유전자(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)의 탠덤 cDNA의 단편 7개 세트를 고체 기판 위에 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계 ; 진단하려는 사람의 21-하이드록실라제 게놈 유전자의 일부(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)를 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시키는 단계 ; 상기 증폭된 유전자와 올리고뉴클레오타이드 칩위에 고착시킨 7개 세트의 탠덤 cDNA 유전자 단편과 하이브리디제이션을 수행하는 단계 ; 및 상기 하이브리디제이션 여부를 검색하는 단계로 구성된 부신성기 증후군의 진단방법에 관한 것이다.

Description

선천성 부신성기 증후군의 진단 방법 및 올리고뉴클레오타이드 칩{Method for diagnosis of congenital adrenal hyperplasia and oligonucleotide chip}
본 발명은 선천성 부신성기 증후군 (congenital adrenal hyperplasia, 이하 'CAH'로 약칭함)의 새로운 진단 방법, 올리고뉴클레오타이드 칩에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 (1) CAH의 특이적 돌연변이 서열을 기질에 부착하는 단계; (2) 진단 환자의 염색체 상의 돌연변이 서열 부위를 증폭시키는 단계; (3) 유전자 하이브리디제이션을 수행하는 단계; (4) 상기 결과를 비교 검색하는 단계로 구성되는 CAH를 간단하게 진단할 수 있는 진단 방법 그리고 올리고뉴클레오타이드 칩에 관한 것이다.
선천성 부신성기 증후군 (congenital adrenal hyperplasia)은 코티솔(cortisol) 생합성의 이상으로 발생하는 유전병이다. 코티솔 합성을 위하여는 스타 단백질 (StAR protein), 17-하이드록실라제, 3β-HSD, 21-하이드록실라제 (21- hyperdroxylase), 11β-하이드록실라제의 5개의 효소가 필요하지만 부신성기 증후군 환자의 90% 이상이 21-하이드록실라제가 결핍되거나 기능이 손상되어 있다. 그 결과, 부신성기 증후군 환자는 부신에서 필수적인 코티솔 및 알도스테론의 생합성이 감소한 결과 다양한 증상을 보이게 된다.
21-하이드록실라제 유전자는 염색체 상에서 6번 염색체 HLA 그룹Ⅲ 유전자 부위에 위치해 있으며 고도의 변이성과 함께 복잡한 구조를 가지고 있다. 활성형 유전자인 CYP21B는 불활성 유사유전자(pseudogene)인 CYP21A와 매우 상동성이 크고, 이들 두 유전자는 각각 보체의 4번째 요소를 코딩하는 두 개의 유전자 C4A와 C4B의 3' 부위에 위치하여 반복 배열 단위 (repeated tandem unit)인 C4/21OH를 형성한다.
선천성 부신성기 증후군은 신생아 10,000 명에 한 명 꼴로 발생하는 비교적 흔한 질병이다. 따라서, 그 진단방법이 종래부터 개발되어 왔으며, 그 중 전통적인 방법은 21-하이드록실라제의 기질인 17-OH 프로게스테론을 혈청에서 측정하는 것이다. 그러나 이러한 방법과는 달리, 염색체 상의 돌연변이를 직접 진단하는 방법이 근래에 개발되기 시작했다. 염색체 상의 돌연변이를 진단하는 방법으로는 서던 블럿 분석(southern blot analysis)이나 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 흔히 이용하며, 이러한 진단 방법은 상기 전통적인 방법보다 간편하고 저렴하면서 더 민감한 진단방법을 제공한다. 그러나 이러한 방법 역시 21-하이드록실라제 유전자의 복잡한 구조, 즉 유사유전자의 존재로 인해 정확한 분석이 어려운 실정이며, 이를 극복하기 위한 방법으로 돌연변이를 한꺼번에 검색하여 정확성을 높이는 진단 방법 및 진단 키트의 개발이 시급하게 요구되고 있다.
이에 본 발명자는 CAH를 효과적으로 진단하기 위하여 연구를 계속한 결과, P30L(엑손 1), 스플라이싱 변이(A/C655G, 인트론 2)와 I172N(엑손 4)의 3가지 공통적인 21-하이드록실라제 돌연변이를 이용하여 상기 특이적 돌연변이 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 제작한 다음 이를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 칩을 제조하고 이를 통해 21-하이드록실라제 결핍에 의한 CAH를 정확하게 진단 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 신생아 대사이상 선별검사에 이용될 수 있는 특이적 돌연변이 서열을 이용한 선천성 부신성기 증후군의 진단 방법, 그의 진단을 위한 올리고뉴클레오타이드 칩을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 선천성 부신성기 증후군 진단에 이용되는 7개의 탠덤(tandem)하게 조립된 플라스미드 벡터의 조립도를 나타낸 도면이다.
따라서, 본 발명의 목적은 부신성기 증후군의 21-하이드록실라제 유전자의 돌연변이 및 정상 유전자(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)의 탠덤 cDNA의 단편 7개의 세트를 고체 기판 위에 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계 ; 진단하려는 사람의 21-하이드록실라제 게놈 유전자의 일부(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)를 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시키는 단계 ; 상기 증폭된 유전자와 올리고뉴클레오타이드 칩위에 고착시킨 7개 세트의 탠덤 cDNA 유전자 단편과 하이브리디제이션을 수행하는 단계 ; 및 상기 하이브리디제이션 여부를 검색하는 단계로 구성된 부신성기 증후군의 진단방법을 제공하는 것이다.
한편, 상기 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계는 ⅰ) pCAH-I2N (KCTC 0759BP), pCAH-I2N2 (KCTC 0760BP), pCAH-I2P (KCTC 0761BP), pCAH-E1N (KCTC 0758BP), pCAH-E1P (KCTC 0592BP), pCAH-E4N (KCTC 0762BP), pCAH-E4P (KCTC 0763BP)의 7 세트의 조립벡터를 준비하고, ⅱ) 상기 7 세트의 조립벡터내의 탠덤cDNA 단편을 서열번호 26과 서열번호 27의 두 개의 라벨된 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하고, ⅲ) 상기 증폭된 7 세트의 탠덤 cDNA 단편을 커플링 반응을 통해 고체기판 위에 고착시키는 단계를 포함한다.
한편, 본 발명은 ⅰ) 부신성기 증후군의 21-하이드록실라제 유전자의 돌연변이 및 정상 유전자(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)의 탠덤 cDNA의 단편 7개 세트를 고체 기판위에 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩 ; ⅱ) 진단하려는 사람의 21-하이드록실라제 게놈 유전자의 일부(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)를 PCR 증폭하기 위한 표지된 프라이머; ⅲ) 중합효소 연쇄반응을 위한 효소와 완충용액 ; ⅳ) 하이브리디제이션을 위한 완충용액 등으로 구성된 부신성기 증후군 진단용 올리고뉴클레오타이드 칩 키트를 제공하는 것이다. 이 때, 상기 표지는32P 방사선 동위원소 표지 또는 플루오레슨스 표지임을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 피검자로부터 부신성기 증후군 여부를 진단하고자 하는 방법을 제공하는 것으로, 이러한 진단방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것이다. ⅰ) 검체로부터 게놈DNA를 함유하는 샘플을 취득하는 단계 ⅱ) 정상 또는 비정상인의 21-하이드록실라제 유전자 부위인(엑손1, 인트론2, 엑손4)를 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계 ⅲ) 정상인 또는 비정상인의 21-하이드록실라제 유전자의 탠덤 cDNA 단편 7세트가 고체기판위에 고착화 되어있는 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계 ⅳ) 정상 유무를 판독하기 위해 상기 증폭된 검체 유전자와 올리고뉴클레오타이드 칩위의 탠덤 cDNA와의 하이브리디제이션을 행하여 그 결과를 확인하는 단계 등으로 구성되는 것이다.
1. 검체 유전자의 증폭
본 발명에서는 CAH 환자의 21-하이드록실라제 유전자에서 공통적으로 나타나는 특이적 돌연변이 부위인 P30L(엑손 1), 스플라이싱 변이(A/C655G, 인트론 2)와 I172N(엑손 4)을 이용하는 데, P30L은 서열번호 1의 정상 스테로이드 21-하이드록실라제 유전자의 염기 서열에서 212번째 염기인 C가 T로 점 돌연변이가 일어나서 30번째 아미노산 잔기인 프롤린(Pro)이 루이신(Leu)으로 발현되어 스테로이드 21-하이드록실라제가 불활성화된다.
두 번째 인트론에서 655번 염기(서열 1에서는 778번 염기)인 A나 C가 G로 점 돌연변이가 일어나는 A/C655G는 전사 후 스플라이싱 과정에서 변이가 일어나 프레임쉬프트(frameshift)가 발생되어 절단형(truncated) 단백질이 생성된다. 또한 4번째 엑손에서 나타나는 점 돌연변이인 I172N은 172번째 아미노산 잔기인 아르기닌(Arg)이 트립토판(Trp)으로 발현되어 스테로이드 21-하이드록실라제가 불활성화된다.
본 발명의 진단방법 및 올리고뉴클레오타이드 칩 키트에서 진단환자의 21-하이드록실라제 유전자의 특이적 돌연변이 서열을 증폭시키기 위하여, 환자로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고 CAH의 원인이 되는 돌연변이 서열을 증폭할 수 있는 프라이머로 중합효소 연쇄반응을 수행한다.
구체적으로 본 발명에서는 진단하고자 하는 검체로부터 얻은 게놈DNA를 주형으로 하고 P1 프라이머(서열번호 2), P2 프라이머(서열번호 3)를 이용하여 21-하이드록실라제 유전자의 1번째 엑손과 2번째 인트론 부위를 증폭한 다음 다시 E1TS 프라이머(서열번호 4), E1TAS 프라이머(서열번호 5)를 이용하여 1번째 엑손의 P30L 돌연변이 부위를 증폭하고, I2TS 프라이머(서열번호 6), I2TAS 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 2번째 인트론의 A/C655G 돌연변이 부위를 증폭한다.
또한 4번째 엑손의 I172N 돌연변이 부위는 진단하고자 하는 환자에서 얻은 DNA를 주형으로 하고 P3 프라이머(서열번호 8),P4 프라이머(서열번호 9)를 이용하여 1번째 PCR을 수행한 다음 E4TS 프라이머(서열번호 10), E4TAS 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 두 번째 PCR을 수행하여 증폭시킨다.
상기 과정에서 프라이머는 방사성 동위원소 또는 형광물질 등으로 표지하여 사용한다.
2. 올리고뉴클레오타이드 칩 제조
본 발명에서는 P30L 돌연변이 서열을 포함하는 DNA 단편을 고안하여 올리고뉴클레오타이드 칩 제조에 이용하고, A/C655G 돌연변이 서열을 포함하는 DNA 단편을 고안하여 올리고뉴클레오타이드 칩 제조에 이용하며 또한 I172N 돌연변이 서열을 포함하는 DNA 단편을 고안하여 올리고뉴클레오타이드 칩 제조에 이용한다.
구체적으로 본 발명에서는 상기 특이적 돌연변이 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 제조하여 특이적 돌연변이 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 칩 제조용 DNA 단편을 제조한다. 또한 본 발명에서는 특이적 돌연변이 서열 양쪽에 제한효소SfiⅠ 인식부위를 포함하여 이를 이용하여 고안한 DNA 단편을 제조한다.
제한효소SfiⅠ는 절단하고 남은 유전자 절편의 말단이 각각 CAT 및 GTA의 염기서열을 가지므로 다른 제한효소와는 달리 자가 라이게이션 (self ligation)이 되지 않고 일정 방향 (unidirection)으로 유전자 절편이 삽입되게 하는 특징이 있어, 이를 이용하면 특이적 돌연변이 서열을 포함하는 유전자를 플라스미드 벡터 내에 나란히 반복 배열시킬 수 있다.
이 때 플라스미드 벡터로 단일가닥 DNA(single-stranded DNA, ssDNA)를 생산하는 파아지미드 벡터(phagemid vector)를 이용하면 올리고뉴클레오타이드 칩에 필요한 DNA 단편을 쉽게 제조할 수 있다.
본 발명에서는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 벡터 등을 제조하였으며 본 발명의 플라스미드 벡터는 CAH에서 나타나는 특이적 돌연변이 서열이 나란히 반복되어 여러 사본수로 포함하므로 유전자 검색의 민감도가 향상되어 질환을 효율적으로 진단할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 칩을 제조할 수 있다.
본 발명은 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-I2P, pCAH-E1N, pCAH-E1P, pCAH-E4N, pCAH-E4P의 7종의 플라스미드 벡터를 올리고뉴클레오타이드 칩 제조를 위해 준비하였다. 더욱 상세히는 상기 pCAH-I2N 벡터는 15개의 탠덤 카피인 서열12의 센스 서열 및 서열13의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-I2N2 벡터는 23개의 탠덤 카피인 서열14의 센스 서열 및 서열15의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-I2P 벡터는 25개의 탠덤 카피인 서열 16의 센스 서열 및 서열 17의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E1N 벡터는 7개의 탠덤 카피인 서열18의 센스 서열 및 서열 19의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E1P 벡터는 10개의 탠덤 카피인 서열 20의 센스 서열 및 서열21의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E4N 벡터는 12개의 탠덤 카피인 서열22의 센스 서열 및 서열 23의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E4P 벡터는 19개의 탠덤 카피인 서열 24의 센스 서열 및 서열25의 안티센스 서열을 지니고, 상기 서열은 제한효소ShiⅠ 인식부위를 이용하여 나란히 반복 배열시킬 수 있다.
또한 상기 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-I2P, pCAH-E1N, pCAH-E1P, pCAH-E4N, pCAH-E4P의 7종의 플라스미드 벡터는 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는 생명공학연구원내 유전자은행에 부다페스트 조약에 따라 국제기탁하였다. 상기 벡터들의 국제기탁번호는 각각 다음과 같다.
pCAH-I2N은 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0759BP호로 기탁하였으며, pCAH-I2N2는 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0760BP호로 기탁하였고, pCAH-I2P는 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0761BP호로 기탁하였고, pCAH-E1N은 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0758BP호로 기탁하였고, pCAH-E1P는 1999년 3월 19일 기탁번호 제KCTC-0592BP호로 기탁하였고, pCAH-E4N은 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0762BP호로 기탁하였고, pCAH-E4P는 2000년 3월 23일 기탁번호 제KCTC-0763BP호로 기탁하였다.
상기 기탁된 7종의 벡터 속에 삽입된 탠덤 cDNA 단편 7개 세트를 표지된 프라이머에 의해 PCR 증폭하였다. 이 때, 프라이머로는 관능기가 표지된 서열번호 26의 프라이머와 서열번호 27의 프라이머를 사용하였다. 이러한 프라이머 등은 상기 기탁된 벡터에 특이성을 지닌 것으로 탠덤 cDNA 단편만을 증폭하는데 사용된다. 또한, 7종의 벡터의 탠덤 cDNA 단편 증폭에 사용되는 프라이머의 서열은 모두 동일한 것이다.
증폭된 7종의 탠덤 cDNA 단편 등은 프라이머의 말단에 표지된 알코올, 아민 또는 티올과 같은 뉴클레오필릭 관능기에 의해 이들을 고착화하려는 고체기판 위에 붙어있는 관능기와 서로 커플링 결합한다. 이러한 커플링 결합을 통해 증폭된 7종의 탠덤 cDNA 단편이 고체 기판위에 고착화되고 이에 따라 cDNA 단편을 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩이 제조되는 것이다.
3. 하이브리디제이션
증폭된 피검자의 게놈DNA 단편을 올리고뉴클레오타이드 칩 내의 DNA 단편들과 하이브리디제이션 여부를 검사한다. 올리고뉴클레오타이드 칩의 하이브리디제이션은 형광물질 등을 이용하여 형광 마이크로스코프 또는 CCD 카메라를 이용하여 관측가능하다.
구체적으로 본 발명에서는 하이브리디제이션 분석 결과 정상 유전자의 경우에는 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-E1N, pCAH-E4N로부터 증폭하여 제조된 DNA 단편과 하이브리디제이션되는 시그날을 확인할 수 있었으며, 돌연변이를 포함한 환자 유전자의 경우에는 특이적 돌연변이 서열을 pCAH-I2P, pCAH-E1P, pCAH-E4P로부터 증폭하여 제조된 DNA 단편과 하이브리디제이션되는 시그날을 관측할 수 있었다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 검체 게놈DNA의 중합효소 연쇄 반응을 통한 증폭
(1-1) 중합효소 연쇄반응 및 산물의 정제
진단하고자 하는 환자에서 얻은 DNA를 주형으로 하고 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 CAH의 특이적 돌연변이 부위를 증폭시켰다. 중합효소 연쇄반응은 게놈 DNA 100 ng, 각 프라이머 10 pmole, 2.5 mM dNTP 혼합액 및 20 mM 트리스-염산(pH 8.0), 100 mM 염화칼륨, 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.5%트윈 20, 0.5% 노니뎃 P-40 (Nonidet P-40), 50% 글리세롤, 1.25 유니트의 중합효소(Takara Shuzo사)의 조성으로 반응 혼합액을 부피 100㎕가 되도록 하여 퍼킨-엘머 DNA 더말 사이클러 480(Perkin-Elner Cetus)에서 수행하였다.
상기의 반응 혼합액을 98℃에서 1분 동안 변성 (denature)시킨 다음 94℃에서 20초 동안 변성하고, 표 2에 표시된 온도에서 1분 동안 어닐링(annealing)의 사이클을 35회 반복하였다. 다음으로 시료를 72℃에서 10분 동안 배양하고 젯솝 PCR 정제키트(GENOMED)에서 정제하였다.
(1-2) 엑손 1의 증폭
엑손 1의 증폭에는 서열번호 2와 서열번호 3의 두 개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 첫 단계로 실시한다. 얻어진 PCR 산물의 크기는 1339bp 였다. 두 번째 단계로 서열번호 4 및 서열번호 5의 두 개의 프라이머를 이용하여 첫번째 단계에서 얻어진 PCR 산물을 다시 중합효소 연쇄반응으로 엑손 1을 증폭시킨 산물을 얻는다.
(1-3) 엑손 2 및 엑손 4의 증폭
엑손 2의 증폭에는 상기 중합효소 연쇄반응 첫 단계에서 얻어진 1339bp PCR 산물에 서열번호 6과 서열번호 7의 두 개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한다. 얻어진 PCR 산물의 크기는 104bp 였다. 엑손 4의 증폭에는 상기 중합효소 연쇄반응 첫 단계에서 얻어진 1339bp PCR 산물에 서열번호 8 및 서열번호 9의 두 개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 엑손 4를 증폭시킨 산물을 얻는다.
(1-4) PCR 산물의 표지(labeling)
1㎕의 PCR 산물을 5× 상기 반응 완충용액, 150㎕ Ci [γ-32P]-dATP, 20U T4폴리뉴클레오타이드 키나제(GibcoBRL)에 혼합하고 반응 혼합액을 부피 50㎕가 되도록 하여 반응을 37℃에서 30분-1시간 수행하였다. 다음에 세파덱스 G-50 미니컬럼(Phamacia Biotech)을 사용하여 반응하지 않은 [γ-32P]ATP를 말단 표지된PCR 산물로부터 걸러내었다.
(실시예 2) cDNA 단편 수득용 벡터의 제조
(2-1) 상보적 올리고 뉴클레오타이드의 합성
본 발명에서는 올리고뉴클레오타이드 칩에 사용되는 DNA 단편을 제조하기 위해 사용될 플라스미드 벡터를 제작하고, 이를 위해 우선 상보적 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
(2-2) 플라스미드 벡터의 제작
상기 (2-1)에서 제작한 상보적 올리고뉴클레오타이드를 각각 0.7㎍씩 40㎕의 1× 어닐링(annealing) 완충용액(ph7.5, 25mM 트리스염산, 300mM NaCl, 1mM EDTA)과 혼합하여 95℃에서 3분 동안 및 65℃에서 30분 동안 가열한 후 점차 식힌다. 상보적 인산화 올리고뉴클레오타이드 단편을 얻기 위하여, DNA 재수화용액(10mM 트리스, 1mM EDTA)에 담긴 8% 비변성 폴리아크릴아마이드 겔상에서 하룻밤동안 4℃ 전기영동을 수행하여 정제하고 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo사)를 이용하여 16℃에서 30분간 자가 라이게이션(self ligation)이 일어나게 한다. 다음으로 상기 단편 1㎍을 클로닝 벡터인 pBluescript ks(+/-)-ShiⅠ 10ng(Stratagene)과 혼합하여 20㎕의 완충용액에 섞고 DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결시킨다.
7종의 벡터의 DNA 단편 인서트를 살펴보면 다음과 같다.
즉, pCAH-I2N 벡터는 15개의 탠덤 카피인 서열12의 센스 서열 및 서열13의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-I2N2 벡터는 23개의 탠덤 카피인 서열14의 센스 서열 및 서열15의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-I2P 벡터는 25개의 탠덤 카피인 서열 16의 센스 서열 및 서열 17의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E1N 벡터는 7개의 탠덤 카피인 서열18의 센스 서열 및 서열 19의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E1P 벡터는 10개의 탠덤 카피인 서열 20의 센스 서열 및 서열21의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E4N 벡터는 12개의 탠덤 카피인 서열22의 센스 서열 및 서열 23의 안티센스 서열을 지니고, 상기 pCAH-E4P 벡터는 19개의 탠덤 카피인 서열 24의 센스 서열 및 서열25의 안티센스 서열을 지닌다.
상기 고안된 단편을 포함하는 플라스미드 벡터를 대장균 Top10F' 균주에 형질전환시킨 다음 이를 배양하여 플라스미드 DNA를 분리하였다.
또한, 상기 플라스미드 벡터를 제한효소EcoRⅠ 및SfiⅠ으로 절단하여 삽입된 유전자 DNA 의 크기를 1% 아가로스 젤 전기영동으로 확인하고, 그 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 I2N, I2N2, I2P, E1N, E1P, E4N, E4P 등의 특이적 돌연변이 서열이 나란히 반복배열되어 포함된 플라스미드 벡터 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-I2P, pCAH-E1N, pCAH-E1P, pCAH-E4N, pCAH-E4P 등을 확인하였다.
(실시예 3) 올리고뉴클레오타이드 칩의 제조
(3-1) cDNA 단편을 얻기 위한 중합효소 연쇄반응
실시예 2에서 얻어진 7종의 벡터 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-I2P, pCAH-E1N, pCAH-E1P, pCAH-E4N, pCAH-E4P를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 27의 관능기가 표지된 두 개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이 때, 200ng의 플라스미드에 20pmole의 관능기가 표지된 두 개의 프라이머, 4 μL의 2.5 mM dNTP, 및 1μL의 Taq polymerase (5 unit/μL)를 하기 완충액에 가한다. 이 때, 완충액 (20 mM of Tris-HCl pH 8.0, 10 mM 의 염화칼륨, 0.1 mM 의 EDTA)을 0.2 ml tube에 넣어 최종볼륨을 49 μL로 한다. 이 혼합액 튜브를 서머 사이클러에 이송시키고, 94℃에서 5분간 변성시킨다. 이 때, 중합효소 연쇄반응은 35회 서머 사이클을 지니고, 변성온도는 94℃에서 1분간이며, 어닐링 온도는 60℃에서 1분간이다. PCR 산물을 10분간 72℃에서 유지시키고 4℃로 냉각시킨다. 최종 표지인자가 라벨된 PCR 산물을 얻는다.
(3-2) 올리고뉴클레오타이드 칩의 제조
얻어진 증폭된 7종의 cDNA 단편들을 cDNA 단편에 연결된 관능기와 고체기판 위에 코팅된 물질간에 에스테르, 아마이드 또는 티오에스테르 결합을 통해 고체기판 위에 cDNA 단편을 고착화시킨다. 이와 같이, 증폭된 7종의 cDNA 단편을 고체기판위에 고착화시킴으로써, 올리고뉴클레오타이드 칩을 제조한다. 이 때, 고체기판으로 사용될 수 있는 것은 폴리스틸렌, 실리카겔, 폴리아크릴아마이드, 폴리아크릴레이트, 폴리아마이드, 하이드록시에틸 또는 메타크릴레이트 등을 쓸 수 있다.
(실시예 4) 올리고뉴클레오타이드 칩에서의 하이브리디제이션
(4-1) 검체의 제조
실시예 1에 방법으로 얻어진 형광물질이 표지된 PCR 산물을 검체로 사용한다. 올리고뉴클레오타이드 칩에 검체를 놓기 전에 하이브리디제이션 완충액(2.5×SSC)을 사용하여 검체를 녹인다. 형광물질은 통액 검체와 올리고뉴클레오타이드 칩 위에 cDNA 단편이 하이브리디제이션 될 경우, 형광 마이크로스코프를 통해 이를 관측할 수 있다.
(4-2) 하이브리디제이션 방법
하이브리디제이션을 위해 검체를 올리고뉴클레오타이드 칩 위에 스포팅하고 이를 다시 세척한 후, 최종적으로 하이브리디제이션 된 올리고뉴클레오타이드 칩 위의 DNA 단편과 검체의 DNA 단편을 검측한다. 이러한 관측은 통상 GSI 스캔어레이 방법에 의해 이미지를 알 수 있다. 또한, 이러한 하이브리디제이션들을 형광 마이크로스코피와 CCD 카메라를 통해 관측할 수 있다.
정상 검체의 경우 pCAH-I2N, pCAH-I2N2, pCAH-E1N, pCAH-E4N로부터 증폭시켜얻어진 DNA 단편과 하이브리디제이션을 형성하고 비정상 검체의 경우 pCAH-I2P, pCAH-E1P, pCAH-E4P로부터 증폭시켜 얻어진 DNA 단편과 하이브리디제이션을 형성한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 21-하이드록실라제 유전자의 특이적 돌연변이 서열을 이용한 올리고뉴클레오타이드 칩을 제조하여 이를 통해 검체의 유전자 증폭물과 하이브리디제이션시킨 후, 이를 통해 돌연변이 유무를 조사함으로써 CAH를 효과적으로 진단 및 치료할 수 있다.
특히 본 발명의 진단 방법 및 올리고뉴클레오타이드 칩은 특이적 돌연변이 서열을 여러 사본수로 포함하고 있어 검색시 민감도가 탁월하고, 3종의 특이적 돌연변이 서열을 한번에 검색할 수 있어 정확한 진단이 가능하다.

Claims (4)

  1. 부신성기 증후군의 21-하이드록실라제 유전자의 돌연변이 및 정상 유전자(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)의 탠덤 cDNA의 단편 7개 세트를 고체 기판위에 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계 ; 진단하려는 사람의 21-하이드록실라제 게놈 유전자의 일부(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)를 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시키는 단계 ; 상기 증폭된 유전자와 올리고뉴클레오타이드 칩위에 고착시킨 7개 세트의 탠덤 cDNA 유전자 단편과 하이브리디제이션을 수행하는 단계 ; 및 상기 하이브리디제이션 여부를 검색하는 단계로 구성된 부신성기 증후군의 진단방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 칩을 준비하는 단계는 ⅰ) pCAH-I2N (KCTC 0759BP), pCAH-I2N2 (KCTC 0760BP), pCAH-I2P (KCTC 0761BP), pCAH-E1N (KCTC 0758BP), pCAH-E1P (KCTC 0592BP), pCAH-E4N (KCTC 0762BP), pCAH-E4P (KCTC 0763BP)의 7 세트의 조립벡터를 준비하고, ⅱ) 상기 7 세트의 조립벡터내의 탠덤 cDNA 단편을 서열번호 26과 서열번호 27의 두 개의 라벨된 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하고, ⅲ) 상기 증폭된 7 세트의 탠덤 cDNA 단편을 커플링 반응을 통해 고체기판 위에 고착시키는 단계를 포함하여 제조됨을 특징으로 하는 부신성기 증후군의 진단방법
  3. ⅰ) 부신성기 증후군의 21-하이드록실라제 유전자의 돌연변이 및 정상 유전자(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)의 탠덤 cDNA의 단편 7개 세트를 고체 기판위에 고착화시킨 올리고뉴클레오타이드 칩 ; ⅱ) 진단하려는 사람의 21-하이드록실라제 게놈 유전자의 일부(엑손 1, 인트론 2, 엑손 4)를 PCR 증폭하기 위한 표지된 프라이머; ⅲ) 중합효소 연쇄반응을 위한 효소와 완충용액 ; ⅳ) 하이브리디제이션을 위한 완충용액 등으로 구성된 부신성기 증후군 진단용 올리고뉴클레오타이드 칩 키트
  4. 제 3항에 있어서, 상기 표지는32P 방사선 동위원소 표지 또는 플루오레슨스 표지임을 특징으로 하는 키트
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