KR20020023471A

KR20020023471A - 성장률이 향상된 유전자전환 식물 및 식물 세포와 이에관련된 방법

Info

Publication number: KR20020023471A
Application number: KR1020000055727A
Authority: KR
Inventors: 강정구; 윤주; 송필순; 박충모
Original assignee: 박찬구; 금호석유화학 주식회사
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2002-03-29
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: US20030131384A1; US6946294B2; US20020104127A1; KR100411702B1; US6545202B2

Abstract

본 발명은 특히 종자 발아에서부터 어린 식물에 이르기까지의 초기 성장 단계에서, 성장 단계에 의존하는 방식으로 성장률을 향상시키기 위하여 식물의 TCTP 단백질로 형질전환시킨 유전자전환 고등 식물 및 그의 유전자전환 식물 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 식물이 다른 형질전환 벡터 구성물로 더 효율적으로 형질전환될 수 있도록 고등식물을 제조하는 방법을 제공한다. 게다가, 본 발명은 유전자전환 식물 및 그의 세포를 산출하기 위하여 사용한 TCTP 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는 TCTP 발현 벡터를 제공한다.

Description

성장률이 향상된 유전자전환 식물 및 식물 세포와 이에 관련된 방법{Transgenic Plants and Plant Cells with Improved Growth Rate and Related Methods}

본 발명은 번역 조절 종양 단백질(translationally controlled tumor protein; TCTP)을 암호화하는 유전자로 형질전환된 유전자전환 식물 세포 및 유전자전환 고등 식물에 관한 것이다. 유전자전환 고등식물은 초기의 성장단계 동안 모체 식물보다 약 30%정도 빨리 성장한다. 게다가, 본 발명은 모체 식물보다 더 용이하게 아그로박테리아 세포(Agrobecterial cells)에 감염시킬 수 있고 조직 배양에서 더 많은 칼리(calli)가 유도되는 고등 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물의 성장과 발달은 식물 성장 호르몬과 같은 내인성 발달 프로그램과 여러 가지 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다. 식물은 고착되어 있기 때문에, 주위의 환경 조건에 잘 적응하고 성장 및 발달을 최적으로 하도록 정교한 시스템이 발달되었다. 빛은 식물의 성장에 있어서 유일한 에너지의 원천일 뿐만 아니라, 종자의 발아에서부터 꽃의 발달까지의 여러 가지 식물 광형태형성 반응을 조절하기 때문에 가장 중요한 환경 요인 중의 하나이다(Kendrick et al. 1994). 따라서, 식물은 광신호를 파장, 강도, 방향 및 지속성의 형태에 따라 정확하게 감지하기 위해 분화된 광수용체 단백질을 가진다. 현재 서로 다른 생리학적 역할을 수행하는 몇몇의 광수용체들이 밝혀져 있다. 이러한 광수용체는 적색광 및 원적외광을 흡수하는 피토크롬(Botto et al. 1996; Chory et al. 1996), 청색광을 흡수하는 크립토크롬(Ahmad et al. 1998; Christie et al. 1998; Cashmore et al. 1997)및 자외선을 흡수하는 UVA/B 광수용체(Christie et al. 1996)를 포함한다. 상기 광수용체 중에서, 피토크롬이 가장 중요한 특징을 가진다. 피토크롬은 적색광을 흡수하는 Pr형 및 원적외광을 흡수하는 Pfr형의 두 가지 다른 분광형태가 상호전환되는 분자 광 스위치이다(Braslavsky et al. 1997; Song et al. 1996; Terry et al. 1995). 피토크롬에 의해 감지된 광신호는 그 다음으로 G-단백질, Ca²⁺/칼모듈린, 단백질 인산화효소/탈인산화효소, cAMP/cGMP 및 식물호르몬과 같은 일련의 하류 신호전달 요소를 통해 전달되며 마지막으로 식물의 광형태형성 반응에 관련된 유전자를 조절한다(Neuhaus et al. 1997; Wu et al. 1997; Bowler et al. 1994a; Bowler et al. 1994b).

피토크롬 광수용체의 가장 주된 역할은 줄기 및 잎의 성장, 클로로필 생합성 및 음지 기피와 같은 초기 성장단계에서의 식물의 성장 및 발달 과정을 조절하는 것이다. 그러나, 이러한 성장 단계에서의 식물은 대부분 줄기와 잎이 약하기 때문에, 환경적 손상 및 병원적 손상으로 매우 상처받기 쉽다. 이것은 특히 농경식물을 밀집하여 재배할 때, 매우 큰 경제적 손실을 가져올 수 있다.

광수용체에 의해 감지된 빛이 생리학적 변화를 하기까지의 분자 신호전달 경로는 대부분 알려져 있지 않지만, 상기 신호전달 경로에 관련된 많은 유전자들이 분리되었고 분자 생물학적 특징이 밝혀졌다. 번역 조절 종양 단백질(TCTP)은 최근 확인된 식물의 성장에 관련된 단백질 중의 하나이다. TCTP 단백질은 인간, 동물, 식물 및 효모를 포함하는 여러 가지의 유기체들 사이에서 고도로 보전된 세포질 단백질이다(Woo et al. 1997). TCTP 단백질은 본래 암에 걸린 동물의 조직과 세포 증식에서 조절 역할을 하는 식물의 정상의 줄기 및 잎과 같이 빨리 성장하는 식물 기관 및 캘러스(callus) 조직에서 분리하였다(Woo et al. 1997; MacDonald et al. 1995; Hughes et al. 1993). 그러나, 그 뒤로 TCTP 단백질이 건강한 동물 조직에서도 발현한다는 사실과 그 발현은 전사 수준 및 후전사 수준에서 칼슘이온에 의해 조절된다는 것이 밝혀졌다(Wu et al. 1999; Sanchez et al. 1997). 이와 같은 사실에 따르면, TCTP는 Ca²⁺결합 활성을 가진다는 것을 주목할 수 있다(Sanchez et al. 1997). TCTP 단백질은 α-튜뷸린 및 β-튜뷸린과 관련하여 세포골격의 미세관식 망(Gachet et al. 1999; Gachet et al. 1997)에 위치한다. 강한 산성의 단백질인 TCTP가 튜뷸린과 물리적으로 상호작용하는 C-말단 영역에 약 50개의 아미노산으로 이루어진 염기성 도메인을 가진다는 것은 흥미로운 사실이다(Gachet et al. 1999). 일괄해 보면, 이러한 관찰은 TCTP 단백질이 세포의 성장과 분화의 조절에 있어서 하우스키핑 역할을 한다는 것을 나타낸다.

TCTP 유전자는 여러 가지 식물들에서 분리되었다(Sage-Ono et al. 1998; Tamaoki et al. 1997; Woo et al. 1997). 그러나, 소수의 경우를 제외하고 유전자 및 유전자 단편의 서열이 상세한 분자 생물학적 분석 및 기능적 분석 없이 데이터베이스만 기탁되었다. 완두의 TCTP 유전자는 뿌리의 정상(cap)으로부터 급속히 분화하는 세포에서 활성적으로 발현된다(Woo et al. 1997). 단일 식물인 일본 나팔꽃에 있어서, TCTP mRNA는 어두운 곳에서 성장할 때 높은 수준으로 축적되지만, 빛을 받으면 그 발현 수준은 감지되지 않을 정도로 감소한다(Sage-Ono et al. 1998).

식물의 성장과 발달에 있어서, TCTP의 생리학적 역할(들)을 연구하기 위하여, 담배(Nicotiana tabacum)로부터 TCTP 유전자 상동물(homolog)을 분리하였다. 담배 TCTP(본 명세서에서 ntTCTP로 언급됨) 단백질은 완두(Pisum sativum)로부터 분리한 랩-유사(Rab-like) GTPase인 Pra3 스몰(small) GTPase와 물리적으로 상호 작용한다(Yoshida et al. 1993; Nagano et al. 1995). ntTCTP와 Pra3의 상호작용은 GTP에 의존한다. ntTCTP는 오직 본질적 활성을 가진 GTP 결합 Pra3와 결합하며, 비활성형(dominant negative) GDP 결합 Pra3와는 결합하지 않는다. ntTCTP 유전자는 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃의 기관 따위의 모든 테스트 식물 기관에서 발현된다. 일본 나팔꽃 식물에서 관찰된 것과는 달리 빛은 ntTCTP에 대해 중요한 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 유전자전환 고등 식물은 초기 성장 단계동안 모체 식물보다 더 빨리 성장한다. 그들은 짧은 시간 내에(대략 30% 정도 빨리) 성체 단계에 이르게 되며, 따라서, 잠재적으로 모체 식물에 비해 환경 요인에 의해 손상될 기회가 적어지게 된다. 게다가, 유전자전환 식물은 더욱 신속히 재생하며 조직 배양액에서 아그로박테리아의 감염으로부터 더 많은 칼리를 유도한다. 흥미롭게도, pra3 스몰 GTPase 유전자를 가지는 유전자전환 식물은 본질적으로 특이적인 Pra3와 ntTCTP의 상호작용을 돕는 ntTCTP 유전자를 가지는 유전자전환 식물과 동일한 표현형을 가진다.

식물의 조직 배양 및 유전자 조작에 관한 최근 기술의 진보와 더불어, 생산성 및 품질을 향상시키기 위하여 바람직한 식물에 새로운 유전자를 도입하는 것은 현재 통상적으로 행해지는 실험 기술이다. 예를 들어, 채소들은 다른 표현형을 취하지 않고 모체 식물보다 더 빠르거나 또는 느리게 성장하도록 조작할 수 있다. 본 발명에 의하면, TCTP 유전자는 식물의 성장률의 유전자 조작을 위한 좋은 수단이 될 수 있다.

여기에 사용되는 고등식물이란 용어는 광합성 능력이 있는 다세포의 분화된 유기체를 언급한 것이다. 따라서, 고등식물은 박테리아 및 균류와 같은 미생물을 포함하지 않는다. 고등식물 세포는 캘러스(callus) 및 식물 종자와 같은 미분화된 조직을 포함하는 식물로부터 파생된 임의의 세포를 포함한다.

본 발명은 TCTP 유전자로 고등식물의 세포를 형질전환 함으로써 고등 식물의 성장률을 촉진하는 새로운 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 그러한 유전자 전환 식물은 여러 가지 바람직한 작물학의 표현형을 나타낸다. 이러한 유전자전환 식물은 종자 발아에서부터 성체 식물에 이르기까지의 성장 시간이 감소되기 때문에, 병원균 및 환경적 스트레스에 덜 노출된다. 이것은 경제적으로 중요한 식물의 생산성을 상당히 향상시킬 수 있는 중대한 농경법의 특성이다. 또한, 유전자전환 식물은 그 모체 식물보다 빨리 시장화될 수 있기 때문에 높은 상업적 가치를 가진다.

본 발명의 실시예를 이행하는데 있어서 임의의 농경 식물에 이러한 조작을 실시하였지만, 바람직한 식물은 양배추, 당근, 양상치, 시금치, 양파, 골파, 오이,토마토, 감자, 무, 담배, 벼, 꽃양배추, 멜론 및 수박을 포함한다. 또한, 나무 식물은 이러한 조작이 행해질 수 있는 대상이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 아그로박테리움에 의해 매개되는 형질전환을 더욱 용이하게 이행할 수 있는 유전자전환 고등 식물을 제공한다. 동일한 실험 조건하에서 유전자전환 담배 식물에서는 그 모체 식물보다 적어도 2배 이상의 칼리가 유도된다. 게다가, 재생률도 더욱 빠르다. 이러한 특성은 TCTP 유전자를 가지는 고등 식물의 세포를 더 쉽고 효율적으로 다른 유용한 유전자를 포함하는 형질전환 벡터로 형질전환하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 고등 식물의 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있는 ntTCTP 발현 벡터, 재조합 DNA 구성물에 직접 결합할 수 있는 핵산 단편 및 ntTCTP 단백질을 암호화하는 연속된 유전자 서열을 포함한다.

본 발명은 TCTP 폴리펩타이드를 중요한 단백질에 융합시킴으로써 재조합 단백질의 안정성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 많은 재조합 단백질은 재조합 발현 시스템으로부터 과발현되거나 정제될 때 불안정해지며, 종종 재조합 DNA 기술에 영향을 끼치는 어려움으로 인해 분해되는 경향이 있다. 대장균에서 발현된 재조합 ntTCTP 단백질은 열, 염 및 pH에 대해 매우 안정하며, 심한 분해와 집합(aggregation)의 문제없이 실온에서 용이하게 처리할 수 있다.

도 1a는 ntTCTP 단백질을 암호화하는 담배 cDNA 클론의 핵산염기 서열을 나타내며(유전자은행 승인 번호 AF107842), CKII-의존적 인산화되는 서열은 한줄로 밑줄 친 것이고 PKC-의존적 인산화되는 서열은 굵게 인쇄된 것을 나타낸다. 튜뷸린과의 상호작용에 관련된 도메인은 두 줄로 밑줄 친 것이다. 별표는 종결 코돈을 나타낸다.

도 1b는 TCTP 단백질의 도메인 구조를 나타낸다. ntTCTP 단백질에서 세 개의 도메인이 각각의 pI 값과 함께 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 나타내었다. 염기성 도메인 Ⅱ의 아미노산 서열에서 라이신(lysine) 잔기들이 굵은 활자로 나타나 있다.

도 2는 동물, 효모 및 식물의 TCTP 단백질들의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸 것이다. 그 서열들은 유전자은행에서 인용한 것이거나(하기에서 G로 표기함) 또는 EST Clone들로부터 모아서 정리한 것이다(하기에서 E로 표기함). 갭(gap)은 서열 상동성을 극대화시킨다. PIMA 1.4 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 정렬하였다(Baylor College of Medicine, Houston TX). 정렬된 서열의 순서는 각 서열 사이의 상동성의 정도를 나타낸다. TCTP 단백질은 그들의 상대적 서열 상동성에 기초하여 세 개의 그룹; 식물 TCTPs, 동물 TCTPs 및 효모 TCTPs로 분류할 수 있다. 튜뷸린과 상호작용하는 염기성 도메인은 박스로 표시되어 있다. 정렬된 TCTP 단백질은 자주개자리(Alfalfa; G, P28014), 애기장대풀(Arabidopsis; G, AF215897), 닭(Chicken, P43347), 분열 효모(Fission yeast; Q10344), 인간(Human; G, NP 003286), 쥐(Mouse; G, P14701), 완두(Pea; G, P50906), 일본나팔꽃(Pharbitis; G, AB007759), 소나무(Pine; E, AA739699+AA556254), 감자(Potato; G, P43349), 토끼(Rabbit; P43348), 벼(Rice; G, P35681), 담배(Tobacco) 및 효모(Yeast; NP 012867)이다.

도 3은 ntTCTP와 pra3 스몰 GTPase의 특이적 상호작용을 나타낸다. 효모의 동시발현 분석에서 야생형(Pra3WT), 본질적 활성형(Pra3QL) 및 비활성혈(dominant negative)(Pra3SA)이 베이트(bait)로 사용되었다. Pra3QL 및 Pra3SA는 각각 생체내 GTP 및 GDP와 결합하는 것으로 추정된다. 패널 a는 20mM의 아미노트리아졸이 존재하는 상태에서의 상호작용 분석을 나타내며, 패널 b는 아미노트리아졸이 존재하지 않는 상태에서의 상호작용 분석을 나타낸다. 1은 Pra3QL와 ntTCTP, 2는 Pra3SA와 ntTCTP, 3은 Pra3WT, 4는 Pra3QL, 5는 Pra3SA을 나타낸다.

도 4는 pBI-TCTP 발현 벡터의 물리적 지도를 나타낸다. 완전한 길이의 ntTCTP 유전자를 35S에 기초한 벡터에 결합시켜 발현 벡터를 제조하였다(Clonetech, Palo Alto, CA). ntTCTP 유전자를 양방향(S(센스) 및 AS(항-센스)로 언급됨)으로 각각 삽입하였다. Pra3의 발현을 위하여, ntTCTP 유전자의 삽입과 같은 방법으로 완두 pra3 ORF를 벡터내에 결합시켜 pBI-Pra3를 산출하였다. 벡터내 ntTCTP 및 Pra3 유전자를 클로닝하기 위하여 BamHⅠ과 SacⅠ 제한 부위가 사용되었다.

도 5는 ntTCTP 유전자를 과발현하는 유전자전환 담배 식물을 나타낸다. 식물은 발아 후에 2주 동안 빛을 비추어 성장시켰다. S는 센스 방향, AS는 항-센스 방향, C는 원래의 벡터만을 형질전환시킨 대조군 식물을 나타낸다. 유전자전환 식물의 잎이 어두운 녹색을 띈다는 것에 유념하여야 한다.

도 6은 완두 pra3 유전자를 과발현하는 유전자전환 담배 식물을 나타낸다. 식물은 발아 후 12일 또는 40일 동안 빛을 비추어 성장시켰다. 도 5에서 사용한 것과 같이, S는 센스 방향, AS는 항-센스 방향, C는 대조군 식물을 나타낸다.

도 7은 ntTCTP 유전자의 조직 특이적인 발현 및 그에 대한 빛의 영향을 나타내는 노던 블랏(Northern Blot) 분석도면으로서, 도 7a는 조직 특이적 발현에 관한 분석결과이다. F는 꽃의 조직, L과 S는 잎과 줄기, aL과 aS는 정상의 잎과 줄기에 관한 것이고, 도 7b는 빛의 영향에 관한 도면이다. 빛의 영향을 실험하기 위하여, 식물을 3주 동안 빛을 비추어 성장시켜 두 그룹으로 나누었다. 두 그룹을 7일 동안 어두운 곳에서(D) 또는 7일 동안 빛을 비추어(L) 더 성장시켰다. 도 7a와 도 7b의 아래 패널은 내부의 대조군으로 사용된 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide)로 염색된 rRNA 밴드를 나타낸다. 각각의 레인은 전체 RNA중 10㎍를 포함한다.

도 8은 ntTCTP mRNA의 축적에 대해 외인적으로 작용하는 식물 성장 호르몬의 영향을 나타내는 노던 블랏 분석이다. 처음, 식물을 MS 한천배지에서 10일 동안 성장시킨 다음, MS 한천배지가 든 병에 옮겨 18일 동안 더 성장시켰다. 그 다음,식물을 적당한 호르몬을 포함하는 액상 배지에 담구어 식물 재료를 채취하기 전에 24시간 동안 부드럽게 섞어 주었다. C는 미 처리된 것, G는 GA3, P는 PEG, I는 IAA, K는 카이네틴, A는 ABA를 나타낸다. 15%의 PEG와 각각의 호르몬 2μM를 사용하였다. 도 7에서 사용한 것과 같이, 아래 패널은 에티듐 브로마이드로 염색된 rRNA 밴드를 나타낸다.

도 9는 대장균에서 발현되고 글루타치온-친화 크로마토그래피로 정제된 재조합 ntTCTP 단백질을 나타낸다(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). 도 9a는 ntTCTP의 발현 및 정제에 대한 개략적 과정을 나타낸다. 글루타치온-s-전이 효소(GST)를 ntTCTP의 N-말단에 융합한 다음, 융합 단백질을 대장균 변종 BL 21에서 발현하였다. 도 9b는 12% SDS-PAGE로 분석한 ntTCTP 프리퍼레이션(preparation)을 나타낸다. 겔은 0.25% 쿠마시 브릴리안트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R250 염색에 의해 가시화하였다. 도 7a에 도시한 바와 같이, 첫째로 글루타치온-친화 크로마토그래피에 의해서 조추출물로부터 GST-TCTP 융합 단백질(Fu)을 정제하였다. 도 7b에 도시한 바와 같이, 그 다음 정제된 GST-TCTP 융합 단백질은 10μM의 Ca²⁺가 존재하거나(Ca) 또는 존재하지 않는(-) 상태로 상이한 온도에서 트롬빈 분해를 수행하였다. GST-TCTP는 융합 단백질, TCTP 및 GST는 각각 트롬빈 분해 후의 TCTP와 GST의 폴리펩타이드를 나타낸다. 분자량 마커(Sm)는 왼쪽에 킬로달톤(kDa)으로 표시하였다.

본 발명은 TCTP 단백질에 대해 연속된 코딩 서열을 포함하는 핵산 단편을 도입함으로써 중요 식물 종에서 세포내 TCTP 수준을 상향 또는 하향조절하는 방법을제공한다.

우선, TCTP 코딩 서열의 발현을 촉진시키는 유전자 서열 및 그에 적합한 RNA 프로세싱에 대해 폴리아데닐레이션 신호를 조절하는 다핵산염기 서열에 핵산 단편을 융합시킴으로써 바람직한 식물종에서 기능적으로 작동하도록 조작하였다. 이와 같이 결합된 핵산 단편을 중요 식물에 도입하였을 때 TCTP의 발현이 상향- 또는 하향- 조절되었다. 이와 같은 현상은 초기 성장 단계에서 성장률이 가속화되고 잎이 어두운 녹색을 띠며 줄기가 튼튼한 것과 같이 식물 성장 및 발달의 특징에 변화를 초래한다. 종자발아에서부터 어린 식물에 이르기까지의 성장 단계동안 식물은 환경적 스트레스와 병원균의 감염으로 인해 매우 상처받기 쉽기 때문에 이러한 농경법의 특성은 농업에 있어서 가치가 매우 크다. 유전자 전환 식물이 초기 성장 단계에서 더 빠르고 건강하게 성장할 수 있도록 여러 가지 농경 식물을 제조하는데 TCTP가 사용된다. 게다가, 유전자전환 식물은 식물의 재배에 필요한 노동력 및 시간을 효율적으로 줄이기 때문에 그 모체 식물보다 더 빨리 시장화될 수 있다.

또한, 본 발명은 TCTP 코딩 서열을 이러한 식물에 도입함으로써 과학적 중요성을 가지는 바람직한 식물의 재생률과 형질전환의 효율성을 향상시키는 방법을 제공한다. 이러한 특성은 특히 유전공학에서 다루기 힘든 식물을 형질전환할 때 더욱 중요하다. TCTP 유전자로 형질전환된 고등식물은 두 번째의 형질전환에서 모체식물보다 더 효율적으로 형질전환된다. 게다가, 더 많은 칼리가 유도되며, 그 칼리는 더 빨리 성장한다. 이러한 특징은 많은 수의 유전자전환 식물을 단일의 형질전환으로부터 재생시켜야할 때, 특히 변이 종자군이 T-DNA 삽입 방법이나(Hayashiet al. 1992) 또는 활성화 태깅(tagging) 방법(Walden et al. 1994)에 의해서 수집되었을 때 매우 유용하다. 다른 유용한 식물에 TCTP 유전자를 도입하는 것은 유전 공학에 더 접근하기 쉽게 되는 것이다.

본 발명은 담배(Nicotiana tabacum)의 TCTP 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 동정하는 방법 및 농업적 가치와 상업적 가치를 향상시키기 위해 성장 및 발달의 특성을 변화시키도록 상기 핵산 단편을 유전학적으로 처리된 식물에 도입하는 방법을 제공한다. Pra3 스몰 GTPase와 상호작용하는 단백질로 효모의 투-하이브리드(two-hybrid) 스크리닝을 실시여 완두 TCTP 단백질(본 명세서에서 psTCTP로 언급됨)을 확인하였다. 담배 식물에서 TCTP와 Pra3의 상호작용을 더 조직적으로 연구하기 위하여, 담배의 mRNA와 5'- 및 3'-특이적 프라이머 쌍을 사용하여 역 전사효소-폴리메라제 사슬 반응(RT-PCR)을 실시하고 완전한 길이의 ntTCTP cDNA 코딩 서열을 분리하였다. 모두 잘 알려진 식물 TCTP 유전자 서열을 정렬하여 PCR 프라이머를 디자인하였다. ntTCTP 유전자는 504 bp로 구성되어 있고 18.7 kDa의 분자량을 가지는 168개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다. ntTCTP 단백질을 대장균 세포에서 GST 융합으로 발현시켰다. ntTCTP는 GTP에 의존적인 방법으로 Pra3 스몰 GTPase와 물리적으로 상호작용하였다. 추측된 ntTCTP 폴리펩타이드는 동물과 식물의 상이한 TCTP 단백질과 같이 계산된 등전점(pI)이 4.36인 강한 산성의 단백질이다.

주형으로 mRNA를 사용하는 종래의 RT-PCR 방법 또는 가능하다면 탐침으로 부분적인 cDNA 단편을 사용하는 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 TCTP 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산단편을 완전한 길이의 cDNA 클론으로 분리할 수 있다. 식물 TCTP 유전자는 고도로 보전되기 때문에(식물 TCTP 유전자들 사이의 70-75%의 상동성), ntTCTP 유전자를 분리하기 위해 RT-PCR방법을 사용할 수 있다. RT-PCR 방법에 있어서, 우선 프라이머로 올리고(dT)_16-18및 역전사효소를 사용하여 본래의 cDNA내에 폴리(A)⁺mRNA를 전환하였으며, 그 결과 본 기술분야에서 잘 알려진 분자생물학적 기술인 한쌍의 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의해 연속적 2중 가닥의 cDNA를 합성하였다.

RNA 또는 DNA 분자인 방사성 동위원소로 표지된 TCTP 다핵산염기 분자와 하이브리디제이션함으로써 TCTP 유전자의 발현 양상을 실험하였다. 본 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 SP6 또는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사시킴으로써 DNA 주형으로부터 RNA 탐침을 합성하였다. 기질 이용성, 기질의 크기 및 바람직한 탐침의 특이성 등에 따라 말단-표지법, 니크(nick) 번역 및 랜덤 프라임 표지법(random prime labeling system)과 같은 여러 가지 다른 방법으로 DNA 탐침을 합성하였다. 본 발명에서 사용된 탐침은 완전한 길이의 TCTP cDNA 분자로부터 합성된 랜덤 프라임 표지된 탐침이다. 노던 하이브리디제이션에 있어서, 여러 가지 많은 표준 방법들 중 한 가지 방법을 이용하여 다른 식물 조직으로부터 전제 RNA를 분리하여 변성 한천 겔 전기영동을 실시하였다. 겔 상의 RNA를 나일론 또는 나이트로셀룰로오즈 막으로 이동, 고정시킨 후 적절한 방사능라벨링한 탐침으로 검출하였다.

또한, 노던 하이브리디제이션은 TCTP 유전자 발현에 대한 성장 호르몬 및 빛의 영향을 연구하기 위해 사용되었다. 이를 이행하기 위하여, 상이한 식물 성장 호르몬이 생리적 농도로 첨가된 MS 배지에서 식물을 성장시키고 식물 조직에서 전체 RNA를 분리하여 상기에 설명한 대로 처리하였다. ntTCTP 유전자의 발현은 외인적으로 작용하는 식물 성장 호르몬에 의해 영향을 받지 않으나, 건조 스트레스의 조건을 만들기 위해 15% PEG를 처리함으로써 발현이 현저하게 유도되었다(7∼8배 증가). 그러나, 그 발현은 빛에 의한 영향은 크게 받지 않는다.

본 발명에 따르면, 분자의 클로닝 - 실험실의 매뉴얼에 일반적으로 기재되어 있는 방법과 같은 재조합 DNA 기술로 ntTCTP 폴리펩타이드를 제조하였다(Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). TCTP의 발현 및 DNA 조작에 적합한 방법을 하기의 실시예에서 상세히 설명하였다. 도1에 나타낸 ntTCTP 다핵산염기 분자를 적절한 발현 벡터에서 클로닝하고 진핵생물, 효모 또는 곤충 세포와 같은 재조합 발현 시스템에서 발현할 수 있다. 또한, 재조합 단백질의 효율적 회수, 용해성 및 가수 분해에 대한 안정성을 향상시키기 위해 유전자 융합 방법을 사용할 수 있다. 융합 태그가 특이적인 리간드에 대해 친화성을 가진다면 융합 단백질의 회수가 간단해 질 수 있다. 예를 들어, HIS 태그/ Ni²⁺, 연쇄상 구균의(Strep) 태그/ 스트렙타비딘, MBP/ 아밀로오즈, GST/ 글루타치온 및 CBP/ 키틴이 종종 재조합 DNA 기술에서 융합 파트너/리간드 쌍으로 사용된다(Nygren et al. 1994). 본 발명에서 글루타치온 S-전이효소(GST) 폴리펩타이드를 ntTCTP 폴리펩타이드의 N-말단에융합시켰다. 재조합 GST-ntTCTP 융합 단백질을 대장균 변종 BL21에서 발현시키고 글루타치온 세파로즈 4B(Glutathione Sepharose)를 사용하여 정제하였다. 본 발명에 있어서, 대장균의 적합한 발현 벡터 시스템 중의 하나는 ntTCTP 유전자를 결합시킨 pGEX-4T-2(Amersham Pharmacia)이며, 발현 벡터를 대장균 변종 BL21내에 도입하였다.

ntTCTP 폴리펩타이드는 대장균에서 높은 수준(1L의 배양액당 25-30 ㎎)까지 효율적으로 발현되었고, 발현 단백질의 90%이상이 용해된 형태로 회수되었다. 재조합 ntTCTP 폴리펩타이드는 정제단계를 통하여 안정해지며 단백질 가수 분해에 대해 저항성을 가진다. 이러한 특성은 재조합 발현 시스템에서 발현되는 재조합 단백질을 안정화하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 완전한 길이 또는 부분적 길이를 갖는 서열로 ntTCTP 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 유전자 서열 구조에 융합하였다. 이러한 유전자 융합은 대장균에서 발현될 때, 발현 수준, 용해성 및 안정성이 현저하게 향상된 융합 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용된 대부분의 재조합 DNA 기술은 본 기술분야에서는 공지된 것이다. 본 발명은 다음의 실시예에서 더 상세히 설명하였다. 이러한 실시예는 단지 예를 들어 상세히 설명하기 위하여 제공된 것이며 본 발명의 권리를 제한하지는 않는다.

(실시예)

식물 재료

담배(Nicotiana tabacum) 종자를 70%의 에탄올에서 15초 동안 표면 살균하고20% 클로록스(clorox) 용액에 10분 동안 담가두었다. 그 다음, 종자를 10회 이상 멸균한 증류수로 완전히 세척하였다. 1.5% 자당(sucrose)이 첨가된 0.5 X 무라쉬게 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 염을 포함하는 0.8% 파이토아가(phytoagar; Duchefa, Haarlem, The Netherlands) 배지에 상기 살균된 종자를 접종하여 16시간의 광주기를 가지는 25℃의 배양실에서 성장시켰다. 호르몬 처리를 위하여, 우선 식물에 빛을 비추어 MS 한천배지에서 10일 동안 성장시키고, 한천이 든 병에 옮겨서 18일 동안 더 성장시켰다. 그 다음, 식물 조직을 회수하기 전에 24시간 동안 적당한 농도의 상이한 호르몬을 포함하는 액체 배지에 어린 식물을 담가두었다. 각각의 호르몬은 최종 농도가 2μM이 되도록 사용되었으며, PEG는 15%(w/v)로 사용되었다. 이 실시예에서 테스트된 호르몬은 지베렐산(giberellic acid; GA3), 인돌-3-아세트산(indole-3-acetic acid; IAA), 카이네틴 및 앱시스산(abscisic acid; ABA)을 포함한다. 광처리를 위하여, 표준 상태의 광 조건하에서 식물을 3주 동안 성장시키고 두 그룹으로 분리한 후, 빛을 비추거나 어두운 조건에서 7일 동안 더 성장시켰다.

DNA의 효소 처리

마니아티스(Maniatis; 1994) 등에 따라서, 필요에 따른 변경을 가하여 일상적인 DNA 조작을 수행하였다. DNA 1㎍당 1-5 유니트의 효소가 함유된 20㎕의 반응 부피에서 1∼2 시간동안 배양하였다. 각각의 제한 분해는 대개 1-3㎍의 플라스미드 DNA를 포함하였다. 사용된 효소 분해 완충용액은 명세서에 기재하지 않는 한각각의 특정한 효소 제조업자에 의해 제공된 것이다. 결합 반응을 위하여, 우선 분해 혼합물 또는 PCR 생성물인 DNA 단편을 0.8-1.5%의 아가로스 겔에서 관련된 DNA 단편의 길이에 따라 분리하였다. 진클린 Ⅱ 키트(GENECLEAN Ⅱ Kit ; BIO 101, Vista USA) 또는 겔 추출 키트(Gel Extraction Kit ; Omefa Biotek, Doraville, USA)를 사용하여 겔 조각으로부터 바람직한 DNA 단편을 정제하였다. 제조업자에 의해 제공된 완충용액을 사용하여 10㎕의 부피에 1:1∼1:3의 몰비율로 벡터와 삽입 단편을 혼합하고, 그 혼합물을 5시간(스티키(sticky)-말단 결합을 위하여) 또는 15시간(블런트(blunt)-말단 결합을 위하여) 동안 13-16℃에서 배양하였다. T4 DNA 리가아제 및 그에 상응하는 리가아제 완충용액(NEB, Beverly, USA)은 반응액 10㎕의 부피당 5-10 유니트의 리가아제를 사용하였다. 결합에 앞서 DNA 단편의 블런트 말단이 되도록 T4 DNA 중합효소 및 그에 상응하는 완충용액(NEB)을 사용하였다. 그 혼합물을 25℃에서 15분 동안 배양하고 효소를 불활성화시키기 위해 65℃에서 10분 동안 가열하였으며, DNA 단편을 상기에 설명된 대로 겔을 위해 정제하였다.

대장균의 형질전환

플라스미드 DNAs를 형질전환하기 위한 숙주세포로 대장균을 사용하였다. 설명된 바와 같이 실험실에 적당한 세포를 준비하였다(Hanahan 1985). 100-200㎕의 적당한 세포를 형질전환하기 위해, 1-5㎕의 결합 혼합물을 사용하였다. 그 혼합물을 얼음 속에서 20분 동안 배양한 후, 42℃에서 2분 동안 열 충격을 가하고, 1㎖의SOC 배지를 첨가하였다. 그 다음, 손상으로부터 세포를 회복시키기 위해 그 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 부드럽게 교반하고 100-200㎕를 적합한 항생물질(autibiotic)이 포함된 LB배지에 도말하였다. 그 배지를 37℃에서 밤새 배양하거나 또는 양성의 콜로니가 관찰될 때까지 배양하였다.

플라스미드의 분리 및 정제

대장균 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위하여 알칼라인 -SDS 방법을 사용하였다(Kraft rt al. 1988). 플라스미드 DNA를 소규모 정제하기 위하여 3㎖(하이 카피 넘버 플라스미드) 또는 20㎖(로우 카피 넘버 플라스미드)의 LB 배양액을 제조하였다. 적합한 항생물질이 첨가된 LB 액체 배지에 단일 콜로니를 접종하여 37℃에서 밤새 강하게 현탁배양하였다. 많은 양의 플라스미드 DNA가 필요할 때는, LB 배지 대신 TB 배지(테리픽 브로스(Terrific broth), 47.6g의 TB 믹스/ℓ, Difco, Detroit, USA)를 사용하였다. 에펜돌프 원심분리기에서 10초 동안 원심분리하여 세포를 얻었으며 세포가 용해되기 전에 세포 덩어리를 증류수로 세척하였다. DNA 염기서열 및 아그로박테리움 형질전환을 위한 플라스미드 DNA를 준비하기 위해, 플라스미드 미니프렙 키트 Ⅱ(Plasmid Miniprep Kit Ⅱ; Omega Biotek)를 사용하여 정제하였다. 대규모의 정제를 위하여 500㎖이하의 대장균 배양액을 준비하였다.

효모의 2-하이브리드 스크리닝

매치메이커 2-하이브리드 시스템(MATCHMAKER Two-Hybrid System; Clonetech)을 사용하여 효모의 2-하이브리드 스크리닝을 수행하였다. 완두의 pra3 유전자를 바이트 플라스미드 pGBT9에 클로닝하여 pGB-pra3을 얻었다. 이러한 벡터에서 GAL4 DNA 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열 구조에 pra3 유전자를 융합한 다음, 알코올 탈수소효소 유전자(ADH1) 프로모터의 조절하에서 융합 단백질을 발현시켰다. 5일 동안 빛이 없이 성장한 식물로부터 완두의 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 우선 1㎖ PVP 및 1㎖의 10% 사르코실(Sarcosyl)이 첨가된 20㎖의 GTC 완충용액(4M GTC, 50mM 트리스.C1, pH7.5, 10mM EDTA, 5mM 소듐 아세테이트, 0.1 M 2-메르캅토데탄올)에서 10g의 식물 재료를 균질화하였다. 균질화된 재료를 두 개의 펠콘(Falcon) 시험관에 나눈 후, 각각의 시험관에 0.1 부피의 2M 소듐 아세테이트를 첨가하였다. 1 부피의 페놀:클로로폼:아이소아밀 알코올(25:24:1)을 격렬하게 교반한 후, 20℃에서 15분 동안 10,000 X g으로 원심분리하였다. 상등액을 최종농도가 2M이 되도록 염화나트륨과 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양하였고, 0.8 부피의 냉동 아이소프로판올로 20℃에서 밤새 RNA를 침전시켰다. 원심분리하여 RNA를 회수하고 4M LiCl로 3회 재침전시켰다. 전체 RNA 덩어리를 70% 에탄올로 2회 세척하고 건조하였다. 키아젠(Qiagen)사의 올리고텍스 mRNA 스핀 컬럼(Oligaotex mRNA Spin Column)을 사용하여 전체 RNA에서 폴리(A)⁺mRNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트(Stratagene, La Jolla, USA)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 하이브리잽-2.1 2-하이브리드 전분해 벡터/기가팩 플로닝 키트(HybriZAP-2.1 Two-Hybrid PredigestedVector/ Gigapack Cloning Kit; Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 pAD-GAL4-2/파지미드 벡터내에 클로닝 하였다. cDNA 삽입물의 평균 크기는 약 1.5 kbp이며, 초기의 라이브러리 크기는 1.25 X 10⁶pfu 이었다. 우선 리튬아세테이트(LiAc) 방법을 이용하여 pGB-pra3 베이트 플라스미드를 효모 변종 HF7c에 형질전환한 후, 선택된 형질전환체를 cDNA 라이브러리 플라스미드로 형질전환하였다. 잘못된 양성을 제거하기 위하여 20mM 아미노트리아졸의 존재하에서 루신/트립토판/히스티딘이 결여된 최소 영양배지에서 최종 형질전환체를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 증폭하기 위해 플라스미드를 양성의 클론에서 분리하여 대장균 변종 HB101내에 일렉트로포레이션(electroporate)하였다.

완두 및 담배 식물에서 완전한 길이의 TCTP cDNAs의 분리

우선 완두 TCTP(pcTCTP) 단백질의 C-말단 영역을 암호화하는 cDNA 단편을 효모의 2-하이브리드 스크리닝을 통해 확인하였다. 그 다음, 빛이 없이 성장한 완두 종자에서 합성된 완두의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 완전한 길이의 cDNA 클론을 분리하기 위해 cDNA 단편을 탐침으로 사용하였다. 또한, RT-PCR 방법으로 담배 TCTP 상동물 유전자를 분리하였다. 우선 확실한 개시 코돈을 가지는 담배 TCTP 유전자의 5 서열 영역을 포함하는 발현된 서열 태그(EST)의 데이터베이스에서 담배 TCTP cDNA 서열(GenBank accession no. AB001558)을 확인하였다. 핵산염기 서열에 기초하여, 5′프라이머를 (5′-CGCGGA TCCATG TTG GTT TAT CAG GAT C-3)로 디자인하였으며 굵은 활자가 BamHI 제한 부위이다. 담배 폴리(A)⁺mRNA의 역전사를 위하여 우선 올리고(dT)₁₈를 프라이머로 사용하였다. 그 다음, 5′프라이머와 올리고(dT)₁₈프라이머 쌍 및 교정 활성을 가지는 스트라타진사의(Stratagene) Pfu터보(PfuTurbo) 폴리메라아제를 사용하여 PCR 증폭을 위해 초기의 cDNA를 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분, 60℃에서 1분을 각각 25 주기로 실시하며, 72℃에서 10분 동안 1회 실시하였다. DNA 염기서열 및 조작을 위하여 PCR 생성물을 SmaI의 분해된 pGEM-3Z(+) 벡터(Promega, Madison, USA) 내에 클로닝하였다.

DNA 염기서열 및 서열 분석

완전한 크기의 cDNA 단편과 부분적 cDNA 단편 및 발현 벡터의 접합점을 양 가닥에 대한 DNA 염기서열로 확인하였다. ABI 프리즘 310 유전자 분석기(Perkin Elmer, Foster City, USA)를 사용하여 DNA 염기서열을 수행하였다. 각각의 염기서열을 실행하기 위하여, 약 500ng의 플라스미드 DNA와 2-4 피코몰의 15-17mer 염기서열 프라이머를 사용하였다. 블라스트(BLAST) 프로그램(NCBI, USA)을 사용하여 컴퓨터-보조 서열 분석을 수행하였다.

시험관내 변이유발

완두 pra3 유전자의 시험관내 돌연변이 유발을 실시하기 위하여 퀵체인지 TM 키트(QuickChangeTM kit; Stratagene)를 사용하였다. 한 쌍의 pra3에 특이적인 보완성 변이 프라이머를 각각의 치환을 위하여 사용하였다. S31A 치환을 위해 사용한 두 개의 상보적 프라이머(a dominant negative form)는 5′-CCG CCG TGG GGA AAG CAC AGA TAC TAG CTA-3′(+ 가닥) 및 5′-CTA GCT AGT ATC TGT GCT TTC CCC ACG GCG G-3′(- 가닥)이다. 두 개의 변이 프라이머는 치환된 염기들을 포함하여 서로 상보적이다. 본래의 TCA 코돈(Ser)을 GCA 코돈(Ala)으로 변이시켰다(굵은 활자). Q76L 치환을 위한 변이적 프라이머는(구성적인 활성형태) 5′-CTG GGA TAC CGC TGG TCT AGA ACG ATA TAG AGC AG-3′(+ 가닥) 및 5′-CTG CTC TAT ATC GTT CTA GAC CAG CGG TAT CCC AG-3′(- 가닥)이다. 본래의 CAA 코돈(Gln)을 CTA(Leu)로 변이시켰다. 이중사슬에 대한 DNA 염기서열에 의해 서열에 의해 변이된 서열이 확인되었다.

RNA 분리 및 노던 블랏 분석

제조업자에 의해 제공된 방법에 따라 키아젠사(Qiagen)의 알엔이지(Rneasy) 식물 전체 RNA 분리 키트(Rneasy Plant Total RNA Isolation Kit)를 사용하여 적합한 식물 조직으로부터 전체 RNA 시료를 분리하였다. 대부분의 노던 겔에서, 10-20㎍의 전체 RNA를 각각의 레인에 로딩하였다. 50%(v/v) 포름아미드 및 2.2M 포름알데히드가 첨가된 MOPS 완충액(20mM MOPS, 8mM 소듐 아세테이트, 1mM EDTA)에서 RNA 시료를 65℃에서 10분 동안 변성시키고, 시료를 변성시키기 위하여 사용한 동일한 완충용액에 준비된 1% 아가로스겔에서 분리하였다. 그 다음 밤새 20 X SSC 완충용액에서 겔을 하이본드-N 나일론 막(Amersham)에 옮겼다. 200㎍/1㎖의 변성된 송아지의 흉선(thymus) DNA를 포함하는 퀵하이브 용액(QuickHyb soulution; Stratagene)에 65℃에서 1.5시간 동안 상기막을 전-하이브디제이션하였다. 방사선 동위원소 존재하에서 랜덤 프라이밍(random priming)에 의해 산출한 P³²로 표지된 유전자 단편을 탐침으로 하였다. 방사능 표지된 탐침을 첨가하고, 용액속에서 막을 65℃에서 18시간 동안 더 배양하였다. 그 다음, 2 X SSC/0.1% SDS에서 실온에서 2번, 65℃에서 15분 동안 1 X SSC/0.5% SDS 및 65℃에서 15분 동안 0.5 X SSC/0.1% SDS에서 또는 배경 활성이 부족하지 않을 때까지 막을 세척하였다. 그 막을 필터의 방사능 카운팅에 따라, 2-16시간동안 X-ray 필름에 노출시켰다.

대장균에서 제조합 ntTCTP의 발현 및 정제

GST 유전자 융합 시스템(Amersham-Pharmacia)을 사용하여 TCTP 단백질을 발현하였다. pGEM-T 이지(easy) 벡터로부터 완전한 길이의 pcTCTP 및 ntTCTP 유전자를 PCR에 의해 재증폭하였다. 5′PCR 프라이머는 양유전자에 대한 5′-CGCGGA TCCATG TTG GTT TAT CAG GAT C-3′로 구성되며, BamHI 부위를 가진다(굵은 활자). 3′PCR 프라이머는 psTCT에 대한 5′-CTCGTC GACGCA CTT GAT CTC CTT CAA AG-3′및 ntTCTP에 대한 5′-CTCGTC GACACA CTT GAC CTC CTT GAG-3′이며 SalI 부위를 가진다(굵은 활자). PCR 생성물은 BamHⅠ과 SalⅠ에 의해 이중으로 분해되었으며 pGEX-4T-2 대장균 발현 벡터 내에 결합하여 pG-pcTCTP 및 pG-ntTCTP를 얻었다. 이러한 발현 구성물에서, TCTP 유전자 서열을 N-말단에서 글루타치온S-전이효소(GST) 서열에 구조적으로 융합하였다. 벡터를 대장균 변종 BL21내에 형질전환하고, 형질전환체를 100㎍/㎖ 암피실린으로 선발하였다. 유도를 위하여 LB 배지보다는 RB 배지를 사용하였다(Lamparter et al. 1997). 암피실린이 첨가된 250㎖의 RB(0.5% yeast extract, 1% tryptone, 0.5% NaCl, 0.2% glucose, pH 7.5 with NaOH)에 새롭게 성장한 세포 배양액의 3㎖을 접종하고 0.6의 OD₆₀₀에 대해 250rpm으로 교반하면서 30℃에서 배양하였다. IPTG(1μM)을 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 더 교반함으로써 발현을 유도하였다. 5000 X g에서 5분 동안 원심분리한 후, 냉장된 1 X 인산-완충된 살린(PBS, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH7.3)에 세포 덩어리를 세척하였다. 그 다음, 세포를 5㎖의 1 X PBS에 재현탁하고 얼음위에서 초음파 분사를 반복함으로써(4-5의 출력으로, 30초 X 4회) 분해하였다. 균질물을 100,000 X g로 30분동안 초원심분리하여 정화하였다. 아이콘 마이크로필터(Centriprep YM 30, Milipore)를 사용하여 3000 X g로 2-4시간 동안 원심분리하여 조추출물을 5(배)로 농축하였다. 프로메가사(Promega)의 글루타치온 세파로오즈 4B 친화 컬럼을 사용하여 GST-TCTP 융합 단백질을 정제하였다. 그 다음, GST 태그를 제거하기 위하여 정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하였다. 융합 단백질 1㎎당 10㎕의 트롬빈 용액(1 분열 유니트/㎕)을 첨가하고, 그 혼합물을 10μM Ca²⁺이 존재하거나 또는 존재하지 않는 상태에서 15시간동안 -37℃로 배양하였다. 마지막으로 글루타치온 세파로오즈 4B 친화 컬럼을 두 번째 실행함으로써 GST 태그로부터 TCTP 단백질을 분리하였다.

DNA와 단백질의 겔 전기영동

0.8-1.5% 범위의 농도로 겔을 사용하여 DNA의 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. TAE 완충액(40 mM Tris-acetste, 1 mM EDTA, pH8.0)을 사용하여 분석하는 DNA 단편의 크기에 따라 바람직한 시간 또는 DNA 단편이 잘 분리될 때까지 웰상에 로딩된 DNA의 양에 따라 50-200 전압 범위에서 전기영동을 실시하였다. 겔을 UV 투과기(transilluminator)에서 가시화되는 0.5㎍/1㎖ 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하고 필요에 따라 사진을 찍었다.

호퍼 마이티 스몰 Ⅱ 시스템(Hoefer Mighty Small Ⅱ system ; Amersham Pharmacia)을 사용하여 12-15% SDS-PAGE겔에 의해 모든 단백질 조제 및 정제 단계를 추적하였다. 전기영동을 바람직한 시간동안 80-120 볼트의 범위로 일정한 전압 세트에서 수행하였다. 0.25% 쿠마시 브릴리안트 블루 R250으로 겔을 가시화하기 위하여 염색하였다.

식물 발현 벡터의 구성

pG-pcTCTP 및 pG-ntTCTP의 TCTP 서열을 BamHI과 SalI로 이중분해하였다. 또한, 같은 방법으로 pBI121(Clonetech, Palo Alto, USA)을 이중 분해하였다. 그 다음, DNA 단편을 T4 DNA 중합효소(NEB)로 블런트-말단으로 만들고 T4 DNA 리가아제(NEB)를 사용하여 결합시켜 pBI-ntTCTP-S(센스방향) 및 pBI-ntTCTP-AS(항-센스방향)을 얻었다. 알칼라인 탈인산효소(NEB)를 사용하여 결합하기 전에 벡터단편을 탈인산화(dephosphorylate)하였다. 또한, pra3 유전자를 동일한 방법으로 pBI121 벡터내에 클로닝하였다.

식물 형질전환

잎 디스크의 아그로박테리움 튜메파시엔스 감염에 의해 식물 발현 벡터를 담배 식물내에 형질전환하였다(Horsch et al. 1985). 간략히 기술하면 다음과 같다. 살균한 페이퍼 펀치를 사용하여 무균의 조건에서 성장한 어린 식물로부터 7mm 직경의 잎 디스크를 잘라냈다. 1ℓ당 1.5% 자당, 0.1㎖의 1㎎/㎖ NAA 및 1㎖의 1㎎/㎖ BAP이 첨가된 MS 한천배지(0.8%의 한천, pH5.8)에 잎 디스크를 넣고, 플라스미드를 운반하는 아그로박테리아 세포로 접종하여 25℃로 세트된 성장 항온기에서 형광과 흰빛이 혼합된 조건하에서 3일 동안 배양하였다. 그 다음, 아그로박테리움 감염에 사용된 것과 동일한 조성에 200㎎/㎖ 가나마이신 및 500㎎/㎖ 세포타심을 추가로 첨가한 새로운 MS 아가 플레이트에 잎 디스크를 옮겨서, 작은 식물의 발아가 발달될 때까지 3-4주 동안 배양하였다. 작은 식물의 발아(small shoots)를 살균한 외과용 메스로 절제하고, 1.5% 자당 및 200㎎/㎖ 가나마이신이 첨가된 호르몬이 없는 MS 한천배지가 든 병에 심었다. 2-3주 내에 이 배지에서 뿌리를 내릴 수 있는 발아를 선택하고 토양에서 성장시켰다. 가나마이신 선택을 반복함으로써 각각의 유전자전환 식물에서 호모지고틱 라인(Homozygotic line)을 분리하였다.

(결과)

식물 TCTP: 스몰 GTPase 상호작용 단백질

분자량이 작은 GTPases(small GTPases)는 다양한 라스 슈퍼패밀리(Ras superfamily) GTP 결합 단백질의 하나이다. 스몰 GTPases는 그들의 분자 메커니즘이 대부분의 경우에 아직 완전히 명백하게 설명되지는 않았지만 여러 가지 세포 신호 전달(Marshall 1993; Hall 1990), 사이토스케탈(cytosketal) 조직 (Hall 1970) 및 소낭성의 운반에서 온/오프 분자 스위치의 기능을 수행한다. 식물에서 스몰 GTPases의 기능에 대한 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위하여, 베이트로 Pra3 스몰 GTPase를 사용하고 어둠에서 성장한 종자로부터 구성된 완두 cDNA 라이브러리를 사용하여 효모 2-하이브리드 스크리닝을 수행하였다.

26개의 양성의 콜로니 중에서, 7개의 콜로니가 완두 TCTP 유전자 서열을 포함하였다. 완두 TCTP 코딩 영역의 결정된 핵산염기 서열(pcTCTP로 언급됨)을 유전자은행 데이터베이스에 등록하기 위해 잘 확인하였다(accession no. L47968). pcTCTP의 아미노산 서열을 다른 TCTP 단백질과 배열하여 도 2에 나타내었다. 피토크롬으로 매개된 광 신호 전달에 있어서의 Pra3의 관련 및 세포 증식에 있어서의 TCTP의 제안된 역할과 함께(Gachet et al. 1999), 피토크롬으로 매개되는 광 신호가 Pra3를 거쳐서 TCTP 단백질에 전달되며 식물 성장 및 발달을 조절한다는 사실은 연관되어 있다.

담배 TCTP cDNA의 분리

대부분의 식물에서 식물 TCTP 단백질은 단일-카피 유전자에 의해 암호화되는것으로 여겨진다(Woo et al. 1997). 또한, 유전자은행의 데이터베이스에서 발견된 식물 TCTP 유전자 및 유전자 단편의 서열 분석도 상기의 견해를 지지한다. 단일 식물 종의 데이터베이스에 기탁된 모든 TCTP 다핵산염기 서열은 동일하다. 따라서, 형질전환 및 조직 배양 시스템이 잘 실시된 담배식물의 TCTP 유전자 상동물은 동일한 것으로 결정하였다. 데이터베이스 내의 담배 TCTP 유전자 서열에 대한 연구로 개시 코돈을 포함하는 추정 담배 TCTP의 N-말단 영역을 암호화하는 발현된 서열 단편을 확인하였다. 서열 정보로부터 5' PCR 프라이머를 디자인한 후, 완전한 길이의 담배 TCTP cDNA 클론을 분리하기 위해 암실에서 성장한 담배 식물로부터 분리한 전체 RNA와 5' 및 올리고(dT)₁₈프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR을 실시하여 3' 비번역 배열을 포함하는 703 bp의 단일 우성 밴드를 증폭하였다. 결정된 염기서열과 예견된 아미노산 서열이 도 1a에 나타나 있으며 유전자은행 데이터베이스에 기탁되었다. (accession no. AF107842). 컴퓨터로 실시한 서열 분석으로 그 서열이 진성의 담배 TCTP를 암호화하는 것을 확인하였다. 서던 블랏 분석 결과는 담배 게놈이 단일-카피 TCTP 유전자를 포함한다는 것을 나타낸다(데이타는 나타나 있지 않음). 또한, 완두 식물로부터 동일한 서던 블랏 결과를 얻었다. 완두 TCTP 유전자에 인지 서열이 존재하지 않는 제한효소로 분해하여 제조한 게놈의 DNA를 사용한 서던 블랏 분석에서 단일 밴드를 검출하였다. 또한, 이러한 결과는 일본 나팔 꽃 식물(Woo et al. 1997)을 이용한 이전의 연구결과와 일치할 뿐만 아니라, 대부분의 식물이 단일-카피 TCTP 유전자를 가진다는 사실을 지지한다.

ntTCTP 단백질의 도메인 구조

담배 TCTP 코딩 서열(ntTCTP 유전자로 언급됨)은 개시 코돈을 포함하여 507 bp로 구성되며, 18.7kDa의 계산된 분자량을 가지는 168개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다(도 1a). ntTCTP는 동물, 효모 및 식물의 다른 TCTP 단백질과 약 50∼70% 정도 동일한 단백질 서열을 가지며, 모두 고도로 보전된 TCTP-특이적인 구조 모티브를 포함한다. ntTCTP는 벼 및 일본 나팔꽃의 TCTP와 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 가진다(도 2). 도 1b에 나타난 것과 같이, ntTCTP의 한가지 구조적 특성은 각각 도메인의 계산된 등전점(pI)에 기초한 세 개의 도메인 조직이라는 것이다. 도메인 Ⅰ과 도메인 Ⅲ는 각각 3.6 및 4.6 의 pI 값을 가지는 강한 산성이다. 반대로, 도메인 Ⅱ는 9.4의 pI 값을 가지는 강한 염기성이다. ntTCTP의 도메인 Ⅱ에 상응하는 쥐의 TCTP의 염기성 도메인은 튜뷸린에 결합하는 것으로 나타났다(Gachet et al. 1999). TCTP 단백질은 다른 유기체 사이에 고도로 보전되며, 다른 공지된 단백질 또는 보전된 모티브에 감지될 정도의 유사성을 나타내지 않는다. TCTP 단백질은 세 그룹; 식물로부터의 한 그룹, 동물로부터의 두 번째 그룹, 효모로부터의 세 번째 그룹으로 분리할 수 있다는 것을 알 수 있다. 각각의 그룹에서 단백질 서열 상동성이 80% 이상까지 증가한다. 각각의 그룹은 그 그룹내에 고도로 보전된 동일한 도메인을 가지고 있지만, 35-45, 77-90 및 104-135의 아미노산 영역과 같이 다른 그룹의 영역으로부터 다소 다양한 영역을 가진다. 또한, 세 가지 TCTP 서브그룹은 77-90 및 104-135의 아미노산 영역을 포함하는 도메인 Ⅱ에서 가장 다양하게 나타난다는 사실이 특히 흥미롭다. TCTP 단백질은 다른 유기체에서 공통된 역할을 가지는 것으로 나타났지만, 이러한 구조적 특성은 도메인 Ⅱ가 문(phylum)-특이성의 결정에 관련될 수 있다는 것을 나타낸다. 종합해 볼 때, 이러한 결과는 TCTP 단백질이 같은 조상에서 진화되었으며 다른 유기체에서 동일하거나 유사한 생리학적 기능을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.

ntTCTP와 Pra3 스몰 GTPase의 상호작용

우선 효모 2-하이브리드 스크린을 통하여 psTCTP가 Pra3 상호작용 단백질이라는 것을 확인하였다. 또한, ntTCTP가 Pra3와 상호 작용하는지의 여부를 조사하기 위하여, Pra3의 두 가지 변이형을 산출하여 효모 조발현 분석에 의해 ntTCTP-Pra3 상호 작용을 실험하였다. Pra3의 Ser-31을 Ala로 치환하여 비활성 Pra3(GDP 결합형)를 산출하였다. Gln-76을 Leu로 치환하여 구성적 활성이 있는 Pra3(GTP 결합형)를 산출하였다. ntTCTP 유전자를 pGBT9 벡터내 GAL4 DNA-결합 도메인에 융합하고, pra3 유전자를 pGAD424 벡터내 GAL4 활성 도메인에 융합하였다. 다음에, 그 벡터 쌍을 효모 변종 HF7C내에 조형질전환하였다. 자가-활성을 최소화 하기 위해서, 20mM의 3-아미노-,2,4-트리아졸을 최소영양배지에 첨가하였다. 한 가지의 결과가 도 3에 나타나 있다.

ntTCTP는 비활성형(Pra3-S31A)보다 본질적 활성형 Pra3(Pra3-Q76L)과 더 강하게 상호작용한다. TCTP-Pra3의 상호작용은 모든 식물에서 기능적이긴 하지만 완두 식물에 대해 동일하지 않다는 것을 나타낸 유사한 분석에서 PSTCTP와 Pra3 단백질 사이의 동일한 상호작용 패턴이 관찰되었다.

ntTCTP 유전자를 과발현하는 유전자전환 식물

식물 TCTP의 생리학적 역할을 연구하기 위하여, ntTCTP 유전자를 pBI에 기초한 식물 발현 벡터내에 양방향으로 결합시키고(도 4), 기능적 구성물을 담배 식물에 도입하였다. 가나마이신 선발을 반복함으로써 상동성 유전자전환 주를 분리하였다. 또한, 대조군에는 ntTCTP 유전자를 삽입하지 않은 벡터가 포함되었다.

성체 유전자전환 식물은 식물의 키, 크기와 형태의 조건에 있어서 그 모체 식물과 구별되지 않는다. 성체 유전자전환 식물은 어떤 표현형의 변화도 나타내지 않는다. 하지만, 유전자전환 식물의 성장 단계를 통한 자세한 연구 결과, 유전자전환 식물은 현저하게 다른 성장 운동성(kinetic)을 가진다는 것이 입증되었다. 유전자전환 식물은 종자발아에서부터 어린 식물에 이르는 초기 성장 단계에서 그 모체 식물보다 약 30% 정도 빨리 성장하였다(도 5). 이것은 모체 식물에 비해 유전자전환 식물은 성체 단계에 이르는 변환기가 짧아졌다는 것을 나타낸다. 게다가, 잎은 어두운 녹색을 띠며, 줄기는 모체 식물의 줄기보다 더 굵다. 종자나 어린 식물은 환경적 변화와 병원균 감염에 매우 약해서 수율에 큰 손실이 따르기 때문에, 상기와 같은 특성은 중요한 농경적 요소가 된다. 센스 및 항-센스의 두 가지 유전자전환 식물은 유사한 표현형을 나타낸다. 노던 블랏 분석 결과, 센스 유전자전환 식물의 조억제성(cosuppression) 때문에 센스 유전자전화 식물에서 변환유전자의 전사 수준이 현저히 낮은 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 ntTCTP가 세포증식을 저하시킨다는 것을 나타낸다. 이것은 동물의 세포증식에서의 TCTP 단백질의 역할과는 완전히 반대의 결과이다.

또한, ntTCTP 유전자를 포함하는 아그로박테리아 세포로 담배잎 디스크를 감염시켰을 때 흥미로운 현상이 관찰되었다. 다른 유전자를 포함하는 아그로박테리아 세포보다 ntTCTP 유전자를 포함하는 아그로박테리아 세포로 감염시켰을 때 더 많은 칼리가 유도되었다. 이러한 관찰을 확인하기 위하여, 모체 식물과 유전자전환 식물로부터 동일한 조건하에서 캘러스 유도를 실시하였다. 세 번의 반복된 실험으로 증가된 성장률을 가지는 ntTCTP를 포함하는 유전자전환 식물로부터 적어도 2-3배 더 많은 칼리가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 특성은 많은 수의 유전자전환 식물 또는 종자 풀(pool)이 필요할 때 중요한 이점이 될 수 있다. 예를 들어, ntTCTP 유전자를 가지는 식물은 다른 유용한 유전자를 포함하는 아그로박테리아 세포로 더 쉽게 감염시킬 수 있다.

ntTCTP는 특히 pra3 유전자를 가지는 유전자전환 식물은 유사한 표현형 변화를 나타낸다는 것을 의미하는 구성적인 활성형의 Pra3와 상호작용한다. 도 6은 pra3 유전자를 과발현하는 유전자전환 담배 식물을 나타낸다. ntTCTP의 유전자전환 식물에 대한 유사한 카이네틱(kinetic) 및 성장률에서 센스 유전자전환 식물은 모체 식물보다 더 빨리 성장하였다. 이러한 관찰은 TCTP와 Pra3의 상호작용이 식물의 초기 성장 단계에서의 성장 조절과 관련되었다는 사실을 지지한다. 항-센스 유전자전환 식물은 그러한 표현형의 변화를 나타내지 않았다. 이것은 pra3 유전자의 고유 발현 양상에 관련될 수 있다. Pra3는 어둠 속에서 고도로 발현되나, 발현수준은 빛에서 기초 수준으로 철저하게 억제된다(Yoshida et al. 1995).

ntTCTP 유전자의 발현 벡터

어둠 속에서 성장한 식물의 한 가지 중요한 특성은 피토크롬으로 매개되는 그림자 기피 현상에 의한 급속한 종자의 성장이다(Mazzella et al. 1997; Botto et al. 1996; Shinomura et al. 1996). 피토크롬 A와 Pra3는 모두 빛이 없이 성장한 식물에서 고도로 발현되나, 빛에 의해서 억제된다. 게다가, 일본 나팔꽃 식물에서의 TCTP의 발현은 또한 어둠에서 유도된 발현을 보인다는 것이 최근 밝혀졌다(sage-Ono et al. 1998). 이러한 결과는 TCTP 단백질이 피토크롬으로 매개되는 광신호 전달에서 역할을 가진다는 것을 나타낸다. ntTCTP 유전자의 발현 패턴을 연구하기 위하여, 빛 또는 어둠에서 성장한 담배 식물로부터 분리한 전체 RNA를 사용하여 연속된 RNA 겔 블랏 분석을 시행하였다. ntTCTP 유전자의 전사 수준은 빛에서 성장한 식물과 어둠에서 성장한 식물의 다른 식물부분 보다 줄기에서 적어도 5배 이상 높다(도 7). 그러나, 빛의 영향은 일본 나팔꽃 식물에서 관찰된 것만큼 현저하지 않다(sage-Ono et al. 1998). 또한, 완두 식물과 유사한 발현 프로필이 관찰되었다. 이러한 불일치한 결과에 대한 원인은 현재 불분명하나, 단일 식물과 장일 식물 사이의 생리학적 차이를 반영할 수 있다.

ntTCTP 발현에 대한 호르몬의 영향

ntTCTP 발현에 대한 식물 성장 호르몬의 영향을 연구하기 위하여, 담배 식물을 여러 가지 성장 호르몬으로 처리하고, 다른 식물 부분에서의 ntTCTP의 전사 수준을 도 8에 나타낸 것과 같이 실험하였다. IAA와 카이네틴으로 처리하였을 때 줄기에서 약간의 유도가 관찰되었지만 성장 호르몬은 모든 테스트 식물 부분에서의 ntTCTP 발현에 대해 중요한 영향을 나타내지 않는다. 그러나, 물이 불충분한 조건을 만들기 위한 15% PEG처리는 잎과 뿌리에서 7-8배의 ntTCTP 전사를 증가시켰다. 줄기에서 나타나는 영향은 뿌리와 잎에서처럼 나타나지 않았다. 이러한 결과는 TCTP가 세포 증식에 대한 조절 매커니즘과의 상호작용에 의해서 또는 그 자체에 의해서 가뭄의 스트레스에서 몇 가지의 조절역할을 가진다는 것을 나타낸다. TCTP는 광신호 전달에서 직접적인 매개체는 아니나, 스트레스 신호전달에 관련되어 있다. 이것으로 뿌리 끝이 손상 받았을 때 뿌리 캡에서 psTCTP 유전자의 발현이 유도되는 이유를 설명할 수 있다.

재조합 TCTP 단백질

ntTCTP 단백질의 생화확적 특성을 연구하기 위하여, ntTCTP 단백질을 대장균 재조합 발현 시스템에서 과발현시키고 GTS 융합으로 분리하였다(도 9a). ntTCTP는 대장균에서 효율적으로 발현하였으며(25-30mg/배양액L), 대부분의 발현 단백질(90% 이상)은 용해된 형태로 회수하였다(도 9b-a). 정제 단계동안 감지될만한 집합(aggregation)이 관찰되지 않았다. 열-안정성을 실험하기 위하여, 정제된 GST-ntTCTP 융합물을 Ca²⁺이온이 존재하거나 존재하지 않는 상태로 24시간 이상 여러 온도에서 배양하였다. 동물 TCTP 단백질은 Ca²⁺이온에 결합하며(Sanchez et al. 1997) Ca²⁺결합은 TCTP 단백질에서 몇 가지 구조적인 변화를 유도하기 때문에 Ca²⁺이온을 분석에 포함하였다. 37℃에서 24시간 후에도, 분해와 뭉침현상이 검출되지 않았다(도 9b). 칼슘 이온은 열-안정성에 대해 눈에 띨만한 영향을 미치지 않는다. 그러나, 트롬빈으로 융합단백질을 가수분해하는데 영향을 미쳤다. GST-TCTP 융합물은 트롬빈 분해에 대해 매우 저항력이 있었다. 그러나, 10μM의 Ca²⁺을 첨가하였더니, 특히 저온에서의 분해 효율성이 현저하게 증가하였다(도 9b). 칼슘 결합은 융합물의 TCTP 도메인에 구조적 변화를 유도하고 접합점의 펩타이드 영역을 트림빈 분자에 더 접근하기 쉽게 하였다. 또한, 재조합 GST-TCTP 융합물은 pH 범위가 5-9인 용액에서 안정하였다(데이터는 나타내지 않음).

상기에 설명된 바와 같이, 본 발명에 의하면 번역 조절 종양 단백질(translationally controlled tumor protein; TCTP)을 암호화하는 유전자로 형질전환된 유전자전환 식물 세포 및 유전자전환 고등 식물을 제공하며, 그 유전자전환 고등식물은 초기의 성장단계 동안 모체 식물보다 약 30%정도 빨리 성장하는 이점이 있다. 게다가, 본 발명은 모체 식물보다 더 용이하게 아그로박테리아 세포(Agrobecterial cells)에 감염시킬 수 있고 조직 배양에서 더 많은 칼리(calli)가 유도되는 고등 식물을 제조하는 방법을 제공한다.

Claims

번역 조절 종양 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환되고 그 유전자를 발현하는 유전자전환 식물 세포 또는 상기 세포의 자손.
제 1항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물 세포.
제 1항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물 세포.
번역 조절 종양 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 유전자전환 식물 또는 상기 식물의 자손.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물.
번역 조절 종양 단백질을 암호화하는 유전자를 가지는 상기 식물을 형질전환함으로써 고등 식물의 성장률을 향상시키는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물.
제 7항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 종인 것을 특징으로 하는 유전자전환 식물.
담배의 번역 조절 종양 단백질 ntTCTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제 10항에 있어서, 상기 핵산 분자는 메신저 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 10항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 12항에 있어서, 상기 DNA 분자는 cDNA 분자인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 13항에 있어서, 상기 cDNA 분자는 서열 목록(서열 번호 1)에 나타나 있는 핵산염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
ntTCTP 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 pG-ntTCTP에 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로닝 벡터.
상기 유전자는 플라스미드 pBI-ntTCTP에서 양방향으로 35S 프로모터에 융합되는 것을 특징으로 하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
야생형 식물에 관련된 번역 조절 종양 단백질을 과발현하는 유전자전환 담배 식물(KCTC 0808BP).