KR20020013477A - 염색체 17ｐ 연관된 전립선암 감수성 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 인간 유전학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는 그의 일부 돌연변이 대립유전자가 암, 특히 전립선암에 대한 감수성을 야기하는 인간 전립선암 소인 유전자(HPC2)를 단리 및 검출하는데 사용되는 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로는 HPC2 유전자의 생식세포 돌연변이 및 전립선암의 소인 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HPC2 유전자의 유해한 대립유전자를 운반하는 개인의 진단전 치료법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 전립선암에 있어서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간 전립선암의 진단 및 예후 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 기타 인간 암에 있어서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간의 암의 진단 및 예후 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 치료법, 단백질 대체 치료법, 단백질 유사체 치료법 및 저해제를 포함하여, HPC2 유전자에 돌연변이를 갖는 인간의 암 치료법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 치료용 약물의 스크리닝에 관한 것이기도 하다. 마지막으로, 본 발명은 HPC2 유전자를 돌연변이 여부에 관해 스크리닝 하는 것으로, 이는 전립선암에 대한 소인을 진단하는데 유용하다.

Description

염색체 17ｐ 연관된 전립선암 감수성 유전자{Chromosome 17p-Linked Prostate Cancer Susceptibility Gene}

본 발명의 배경을 설명하기 위해 본 명세서에 인용된 간행물, 기타 자료, 특히 당분야 실무에 관한 추가의 상세한 사항을 제공하는 문헌 등은 여기에 언급 됨으로써 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것이며, 편의상 하기 명세서 부분 및 참고문헌 리스트에서 저자 및 발행일로 표시되어 있다.

암의 유전학은 매우 복잡하며, 다음과 같이 대략적으로 정해지는 세 부류의 유전자의 기능과 관련이 있다: (1)형질발현된 상태의 우성적, 양성적 조절자(종양 유발 유전자); (2)형질발현된 상태의 열성적, 음성적 조절자(종양 억제 유전자); 및 (3)형질발현된 세포의 생물학에 직접적인 역할을 하지 않으면서 위험도를 조절하는 유전자(위험도 조절자).

특정 종양 유발 유전자 및 종양 억제 유전자의 특정 생식세포계 대립유전자는 일반적으로 암의 소인과 관련이 있다. 이러한 일련의 유전자를 종양 소인 유전자라 한다. 클로닝되고 특성화된 종양 예후 유전자중의 일부는 1)망막아세포종 (RB1); 2)빌름의 종양(Wilm's tumor, WY1); 3)리-프라우메니 (Li-Fraumeni, TP 53); 4)가족성 선종양성 폴립증 (APC); 5)신경섬유종 타입 1 (NF1); 6)신경섬유종타입 2(NF2); 7) 폰-히펠 린다우 증후군(von Hippel Lindau syndrome, VHL); 8) 다발성 내분비계 종양 타입 2A (MEN2A); 9) 흑색종(CDKN2, CDK4); 10)유방 및 난소암(BRCA1, BRCA2); 11) 카우덴 질병 (MMAC1); 12)다발성 내분비계 종양 타입 (MEN1); 13) 모반 기저세포 종양 증후군 (PCT); 14) 결절상 경화증 2 (TSC2); 15) 색소성 건피증(뉴클레오티드 절단 복구에 관련된 유전자); 16) 유전성 비폴립성 결장직장암(미스매치 복구에 관련된 뉴클레오티드)에 대한 감수성에 영향을 미친다.

특정 위험도 조절 유전자의 특정 생식세포 대립유전자가 또한 암의 소인과 관련이 있으나, 증가된 위험은 대부분 이것이 어떤 환경적, 섭생적 또는 기타 요인과 결합되는 경우에만 확실하게 나타난다. 알콜 데하이드로게나제(ADH)는 에탄올을 아세트알데히드로 산화시키는데, 아세트알데히드는 실험실 동물에서 돌연변이 및 암을 유발시키는 화학물질이다. ADH3¹대립유전자에 의해 코딩되는 효소는 에탄올을 비교적 빨리 산화시키는 반면, ADH3²대립유전자에 의해 코딩되는 효소는 에탄올을 비교적 느리게 산화시킨다. ADH3¹동형접합체는 아세트알데히드의 합성능이 높은 것으로 추측되며, 음주량이 많은 사람은 똑같은 정도로 음주하며 ADH3²동형접합체를 갖고 있는 사람에 비해 구강암, 식도암, 여성의 경우에는 유방암 발생의 위험이 더 클 것이다(Harty et al., 1997; Hori et al., 1997; Shields, 1997). N-아세틸트랜스퍼라제 1 (NAT1) 및 N-아세틸트랜스퍼라제 2 (NAT2)에 의해 코딩되는 아세틸트랜스퍼라제는 연기상의 담배 생성물로 부터 유래하는 방향족 아민 암 유발원을 포함하여 각종 외래생물질의 아세틸화를 촉매한다. 다량 흡연자인 동시에 NAT2의 서서히 아세틸화시키는 형태에 대해 동형접합성인 사람은 같은 정도로 흡연하지만 NAT2의 급속히 아세틸화시키는 형태에 대해 동형접합성인 사람에 비해 폐암, 방광암 및 여성에 있어서는 유방암 발생의 위험이 더 클 것이다(Shields, 1997; Bouchardy et al., 1998).

유방암이나 전립선암과 같이 호르몬과 관련이 있는 암은 에스트로젠이나 안드로젠 대사작용에 역할이 있는 효소의 대립유전자 변형체, 또는 에스트로젠이나 안드로젠의 생물학적 효과를 조절하는 단백질의 변형체를 이용하여 그 발생의 위험을 조절할 수 있다. 인간 안드로젠 수용체 유전자 중의 다형성 CAG 반복단위는 단백질의 아미노 말단 부근의 다형성 폴리글루타민 트랙트를 코딩한다. 폴리글루타민 트랙트의 길이는 안드로젠 수용체의 전사 활성화 활성과 반비례 관계에 있으므로 안드로젠에 대한 생물학적 반응의 한 측면이 된다. 안드로젠 수용체가 비교적 짧은 길이의 폴리글루타민 트랙트를 함유하는 남자는 그의 안드로젠 수용체가 비교적 긴 길이의 폴리글루타민 트랙트를 함유하는 남자보다 전립선암, 특히 고도의 단계 및 고도의 조직학적 전립선암에 걸릴 확률이 훨씬 크다(Giovannucci et al., 1997).

전립선암은 여러 서구 국가에서 남성에게 제일 빈번히 발생하는 암으로서, 남성의 암으로 인한 사망율에 있어서는 두번째이다. 미국에서는 연간 40,000명 이상이 전립선암으로 사망한다. 금후 10 내지 15년에 결쳐 사망자수는 계속적으로 증가할 것이다. 미국에서는 전립선암으로 인해 직접적 의료비용으로 연간 약 15억 달러가 소비되고 있다. 단지 환자 고통의 부담이 아니라 공중건강상의 주요 문제점으로 떠오르고 있다. 많은 연구가 전립선암의 가족성에 대해 증명하고 있으며, 이는 가족력이 이 질병의 주요 위험 인자가 됨을 의미하는 것이다(Cannon et al., 1982; Steinberg et al., 1990; Carter et al., 1993).

전립선암은 부분적으로는 가족성 질환이라고 오래전부터 인식되어 왔다. 많은 연구자들이 이의 유전성에 대한 증거를 조사하여 왔으며, 얻어진 데이타는 주요 감수성 좌위에 있어서의 우성 유전과 일치한다는 결론에 이르게 되었다. 울프(Woolf)는 유타주에서 사망신고서 데이터를 이용하여 전립선암 환자 직계(1촌) 가족에 있어서 전립선암이 유발될 상대적 위험도가 3.0이라 하였다. 전립선암 환자 직계(1촌) 가족에 대해 3 내지 11의 상대 위험도가 보고된 바 있다(Cannon et al., 1982; Woolf, 1960; Fincham et al., 1990; Meikle et al., 1985; Krain 1974; Morganti et al., 1956; Goldgar et al., 1994). 카터(Carter, 1992) 등은 단일 전립선암 프로밴드에 의해서 증명된 가족에 대해 분리 분석을 수행하였다. 분석은 가족의 소단위 군에 있어서 희소한(q= 0.003) 고위험 대립유전자의 ㄱ상염색체 우성 유전을 통한 멘델의 유전을 암시하고 있으며, 보유자에 대해 측정된 전립선암 누적 위험도는 85세 까지 88%인 것으로 보고하고 있다. 유전된 전립선암 감수성은 상당 비율의 조기 유발 질환을 설명할 수 있으며, 전체적으로는 85세까지 유발된 전립선암의 9% 정도의 원인이 되고 있다. 최근의 결과는 전립선암 뿐만 아니라 기타의 암에 대한 감수성을 전달하는 적어도 4개의 좌위가 존재함을 입증하고 있다. 이들 좌위는 염색체 1q 상의 HPC1(Smith et al., 1996), 염색체 17p 상의 HPC2(본 발명, 실시예 1), 염색체 Xp 상의 HPCX(Xu et al., 1998) 및 지도화되지 않은 잔여부에 해당하는 하나 이상의 좌위이다.

염색체의 한정된 단편이 전립선암의 감수성과 유전적 연관이 있다는 것을 검출하기 위해서는 상기 염색체 단편 내의 DNA 서열 변이체가 암에 대한 감수성을 부여해야 한다. 이는 우연한 서열 변이체가 1종 이상의 연관 유전자의 발현을 변화시키거나 1종 이상의 연관 유전자의 기능을 변화시킨다는 의미를 갖는다. 그러나, 유전적 연관의 검출이 어떤 종류의 유전자(즉, 종양 억제 인자, 종양 유전자 또는 위험 조절 인자)가 우연한 서열 변이체에 의해 영향을 받았는지에 대한 증거를 반드시 제공하는 것은 아니다.

17p 연관된 전립선암 소인 유전자(HPC2)를 찾아내기 위해 염색체 17p에 대한 전립선암 감수성의 유전적 연관으로부터 진행되는 대부분의 전략은, 우연한 서열 변이체가 매핑(mapping)되어야 하는 염색체 내의 개별 단편을 한정하기 위한 정확한 유전적 위치 확인 연구(genetic localization study)를 필요로 한다. 정확한 유전적 위치 확인을 기초로 하는 유전자 확인 프로젝트는 위치 클로닝 프로젝트(positional cloning project)라 불리운다. 위치 클로닝의 일반적인 전략은 유전적으로 한정된 영역 내에 위치하는 모든 유전자를 찾아내고, 상기 유전자 내부 또는 주변의 서열 변이체를 확인한 후, 상기 서열 변이체가 1종(또는 그 이상)의 관련 유전자의 발현 또는 기능을 변화시키는지 측정하는 것이다. 또한, 연관된 유전자 부류에서 질병과 관련된 상기 서열 변이체를 분리하는 것도 설명되어야 한다. 본 발명자들은 염색체 17p의 HPC2 영역에 대해 위치 클로닝 프로젝트를 수행하여, 개체에 전립선암의 소양을 나타내는 생식세포 돌연변이인, 본원에서 HPC2로 명명된 유전자를 찾아냈다.

<발명의 요약>

본 발명은 통상 인간 유전학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 몇몇 대립 유전자가 암(특히, 전립선암)에 대한 감수성을 유발하는 인간 전립선암소인 유전자(HPC2)를 단리 및 검출하기 위해 사용되는 방법 및 재료에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 HPC2 유전자의 생식세포 돌연변이 및 전립선 암에 대한 소양을 진단하는데 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유해한 HPC2 대립 유전자를 지닌 개체의 증상전 요법(presymptomatic therapy)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 전립선암에서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간 전립선암의 진단 및 예후에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 인간의 다른 암에서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간 암의 진단 및 예후에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPC2 유전자에 돌연변이가 있는 인간 암의 치료 요법(유전자 요법, 단백질 대체 요법, 단백질 모방체 및 억제제 포함)에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 암 치료 요법을 위한 약물의 스크리닝에 관한 것이다. 결국, 본 발명은 전립선암에 대한 소양을 진단하는데 유용한, HPC2 유전자의 돌연변이 스크리닝에 관한 것이다. HPC2 유전자는 HPC2 유전자 좌위(locus)에 대한 마커 및 전립선암에 대한 마커로서 유용하다.

본 발명은 일반적으로 인간 유전학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는 그의 일부 돌연변이 대립유전자가 암, 특히 전립선암에 대한 감수성을 야기하는 인간 전립선암 소인 유전자(HPC2)를 단리 및 검출하는데 사용되는 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로는 HPC2 유전자의 생식세포 돌연변이 및 전립선암의 소인 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 전립선암에 있어서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간 전립선암의 진단 및 예후 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HPC2 유전자의 생식세포 돌연변이 및 인간의 다른 암의 진단 및 예후 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 기타 암에 있어서 HPC2 유전자의 체세포 돌연변이 및 인간의 암의 진단 및 예후 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 치료법, 단백질 대체 치료법 및 단백질 유사체 치료법을 포함하여, HPC2 유전자에 돌연변이를 갖는 인간의 암 치료법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 치료용 약물의 스크리닝에 관한 것이기도 하다. 마지막으로, 본 발명은 HPC2 유전자를 돌연변이 여부에 관해 스크리닝 하는 것으로, 이는 전립선암에 대한 소인을 진단하는데 유용하다.

도 1은 염색체 17p 마커에 대한 HPC2 전립선암 감수성 유전자 좌위의 연관을 암시적으로 증명하는, 4 부류의 다점(multipoint) 연관 분석을 나타낸 것이다.

도 2A-B는 유전자 마커의 순서 및 HPC2에 이웃한 재조합 경계의 순서를 나타내는 모식도, HPC2 영역에 걸쳐있는 BAC 클론의 모식적 지도, HPC2 영역 내 전사 단위의 모식적 지도, 및 HPC2가 매핑되는 BAC 클론에 대한 HPC2 엑손의 위치와 서로에 대한 HPC2 엑손의 위치를 나타내는 HPC2 전사 단위의 2개의 모식도이다. 개개의 엑손에 번호를 부여하였다.

도 3은 인간 HPC2 유전자의 엑손 1 서열을 생쥐 HPC2 유전자의 엑손 1 서열과 정렬한 것이다. 또한, 이 도면은 인간 HPC2 유전자의 엑손 1에 의해 코딩되는 펩티드 서열을 생쥐 HPC2 유전자의 엑손 1에 의해 코딩되는 펩티드 서열과 정렬한 것이다. 인간 DNA 서열은 서열번호 210이고, 인간 아미노산 서열은 서열번호 211이며, 생쥐 DNA 서열은 서열번호 212이고, 생쥐 아미노산 서열은 서열번호 213이다.

<표의 간단한 설명>

표 1은 HPC2 영역에서의 마커에 대한 2-위치 LOD 스코어를 작성한 것이다.

표 2는 인간 HPC2 유전자의 임시적 부분 cDNA 서열을 어셈블리하기 위해 사용된 인간 EST 서열의 고유번호 목록이다.

표 3은 인간 HPC2 유전자의 개시 코돈 및 5' UTR의 일부를 포함하는 5' RACE 생성물을 얻기 위해 사용된 프라이머, 전장의 인간 HPC2 발현 구조물을 제조하기 위해 사용된 프라이머, 및 상기 구조물의 서열을 검사하기 위해 사용된 프라이머의 목록이다.

표 4는 생쥐 HPC2 유전자의 임시적 부분 cDNA 서열을 어셈블리하기 위해 사용된 생쥐 EST 서열의 고유번호 목록이다.

표 5는 생쥐 HPC2 유전자의 개시 코돈 및 5' UTR의 일부를 함유하는 5' RACE 생성물을 얻기 위해 사용된 프라이머, 전장의 생쥐 HPC2 발현 구조물을 제조하기 위해 사용된 프라이머, 및 상기 구조물의 서열을 검사하기 위해 사용된 프라이머의목록이다.

표 6은 게놈 DNA로부터 인간 HPC2 유전자의 돌연변이 스크리닝을 위해 사용된 프라이머의 목록이다.

표 7은 인간 HPC2 유전자의 생식세포 서열 변이체를 요약한 것이다.

<서열목록의 요약>

서열번호 1은 인간 HPC2 cDNA의 개시 코돈에서 정지 코돈까지의 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 2는 인간 HPC2 단백질의 아미노산 서열이다. 서열번호 3은 HPC2 cDNA의 개시 코돈 이전 50 bp에서 3' UTR 말단까지의 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 4 내지 서열번호 27은 인간 HPC2 유전자의 엑손 1 내지 엑손 24의 서열이다. 서열번호 28은 인간 HPC2 유전자의 게놈 서열이다. 서열번호 29 내지 190은 인간 및(또는) 생쥐 HPC2 유전자를 확인하거나 돌연변이를 스크리닝하는데 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 191 내지 209는 다양한 서열 변이체의 주변 및 상기 변이체를 포함하는 HPC2의 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 210은 인간 HPC2 엑손 1의 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 211은 상응하는 아미노산 서열이다. 서열번호 212는 생쥐 HPC2 엑손 1의 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 213은 상응하는 아미노산 서열이다.

본 발명은 HPC2 유전자 좌위 또는 돌연변이 HPC2 유전자 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는, 바람직하게는 길이가 8 bp 이상이고 27 kb 이하인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드일수 있다. 또한, 본 발명은 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 구조물, 예를 들면 형질전환된 숙주세포에서의 발현에 적합한 재조합 구조물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HPC2 유전자 좌위의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법 또는 분석물 중의 발현 생성물을 제공한다. 이러한 방법은 HPC2 유전자 좌위의 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 HPC2 유전자 좌위의 일부를 증폭시키기 위한 프라이머인 폴리뉴클레오티드 집합을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 암에 대한 소양의 진단, 또는 암의 진단이나 예후에 유용하다. HPC2 유전자는 HPC2 유전자 좌위에 대한 마커 및 전립선암에 대한 마커로서 유용하다.

또한, 본 발명은 HPC2 유전자 좌위에 의해 코딩되는 아미노산 잔기 5개 이상을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 분석물 중에서 HPC2 유전자 좌위의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 키트를 제공하며, 이 키트에는 적합한 용기에 포장된, HPC2 유전자 좌위의 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 그의 사용에 대한 지침서가 포함되어 있다.

추가로, 본 발명은 HPC2 유전자 좌위의 연속적인 뉴클레오티드 8개 이상을 포함하는 서열을 수득하기 위해 뉴클레오티드를 중합시키는 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법, 및 HPC2 유전자 좌위 내에서 코딩되는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 서열을 수득하기 위해 아미노산 중합시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 돌연변이를 확인하기 위해 HPC2 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 HPC2 유전자 좌위의 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 HPC2 유전자 좌위의 일부를 증폭시키기 위한 프라이머인 폴리뉴클레오티드 집합을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이 방법은 HPC2의 서열에 의해 한정되는 짧은 폴리뉴클레오티드의 완벽한 집합 또는 그 집합의 분리된 일부분, HPC2 서열의 1-, 2-, 3- 또는 4-염기가 결실된 모든 서열 또는 그 서열의 분리된 일부분, 및 HPC2 서열의 1-, 2-, 3- 또는 4-염기가 삽입된 모든 서열 또는 그 서열의 분리된 일부분을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 암에 대한 소양의 진단, 또는 암의 진단이나 예후에 유용하다.

추가로, 본 발명은 의심되는 HPC2 돌연변이 대립 유전자를 스크리닝하여 HPC2 유전자의 돌연변이를 확인하는 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항암 요법으로서 HPC2 유전자 생성물의 기능을 억제 또는 회복시키기 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

결국, 본 발명은 암세포에 관한 유전자 기초의 치료 요법을 개발하는데 필수적인 수단을 제공한다. 이들 치료제는 적합한 벡터 중에 삽입되거나 HPC2 단백질의 기능이 재구성되도록 하는 좀더 직접적인 방식으로 표적 세포에 전달되는 HPC2 유전자 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 형태를 취할 수 있다. 또한, 치료제는 HPC2 단백질 서열의 일부 또는 전부를 기초로 하는 폴리펩티드의 형태를 취할 수도 있다. 이들은 생체내에서 HPC2의 활성을 기능적으로 대체할 수 있다.

개체를 전립선암에 걸리기 쉽게 하는 HPC2 좌위가, 공개적으로 이용가능한 단백질 또는 cDNA 서열과 동일하지 않은 것으로 밝혀진, HPC2 단백질을 코딩하는 유전자라는 것이 본 발명의 발견이다. 이 유전자는 본원에서 HPC2라고 말한다. 생식세포의 HPC2 좌위에 있는 돌연변이가 전립선암에 걸리기 쉬운 경향의 표시라는 것이 본 발명의 발견이다. 최종적으로, HPC2 좌위에 있는 생식세포 돌연변이가 전립선암 및 다른 유형의 암과 관련되어 있다는 것이 본 발명의 발견이다. HPC2 좌위의 돌연변이에는 코딩 서열 및 비코딩 서열 내의 결실, 삽입 및 뉴클레오티드 치환이 포함될 수 있다.

유용한 진단 기술

본 발명의 진단 및 예후 방법에 따라 야생형 HPC2 좌위의 변이를 검출한다. 또한, 야생형 HPC2 좌위를 검출하고 HPC2 좌위에서 암에 걸리기 쉬운 경향이 없음을 확인함으로써 상기 방법을 수행할 수 있다. "야생형 유전자의 변이"는 코딩 및 비코딩 영역에 있는 결실, 삽입 및 점돌연변이를 비롯한 모든 유형의 돌연변이를 포함한다. 결실은 유전자 전체, 또는 유전자 일부만의 결실일 수 있다. 점돌연변이는 정지 코돈, 프레임시프트 돌연변이 또는 아미노산 치환을 초래할 수 있다. 체세포 돌연변이는 일부 조직, 예를 들면 종양 조직에서만 일어나고 생식세포로 유전되지 않는 돌연변이이다. 생식세포 돌연변이는 임의의 체조직에서 발견될 수 있고 유전된다. 만약 단일 대립유전자만이 체세포 돌연변이되면, 초기 종양성 상태임을 표시한다. 그러나, 두 개의 대립유전자가 체세포 돌연변이되면, 후기 종양성 상태임을 표시한다. 따라서, HPC2 돌연변이의 발견은 진단 및 예후 정보를 제공한다. 결실되지 않은 HPC2 대립유전자 (예를 들어, HPC2 결실을 수반하는 시스터 염색체 내지 한 개의 염색체 상에서 발견된 것)는 스크리닝하여 삽입, 소규모 결실 및 점돌연변이와 같은 다른 돌연변이를 찾는다. 종양 조직에서 발견된 많은 돌연변이가 HPC2 유전자 생성물의 발현을 감소시키는 돌연변이일 것으로 생각된다. 그러나, 비기능성 유전자 생성물을 초래하는 돌연변이도 종양성 상태를 일으킬 수 있다. 점돌연변이는 유전자의 프로모터와 같은 조절 영역에서 일어나 mRNA의 발현 상실 및 감소를 초래할 수 있다. 또한, 점돌연변이는 적당한 RNA 프로세싱이 일어나지 않게 하여 HPC2 유전자 생성물의 발현 감소 또는 상실, 변형된 HPC2 유전자 생성물의 발현, 또는 mRNA 안정성 또는 번역 효율의 감소를 초래할 수 있다.

유용한 진단 기술에는 하기에 상세히 논의한 바와 같이 원위치 혼성화 (FISH), 직접 DNA 서열 분석, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일 가닥 구조 분석 (SSCA), RNase 보호 검정법, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO), 돗 블롯 분석, 금 나노입자로 변형된 핵산을 이용한 혼성화 및 PCR-SSCP가 포함되나, 여기에 제한되지 않는다. 또한, 최근에 개발된 DNA 마이크로칩 기술도 유용하다.

전립선암 및 본원에서 확인된 다른 암과 같은 암에 걸리기 쉬운 경향은 HPC2 유전자의 돌연변이에 대해 인간의 임의의 조직을 시험함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 생식세포 HPC2 돌연변이를 유전받은 사람은 암이 발달되기 쉬울 수 있다. 이것은 사람 몸의 임의의 조직으로부터 얻은 DNA를 시험함으로써 결정될 수있다. 가장 간단하게, 혈액을 채취하여 이 혈액의 세포로부터 DNA를 추출할 수 있다. 또한, HPC2 유전자의 돌연변이에 대해 태아세포, 태반세포 또는 양막세포를 시험함으로써 산전 진단을 할 수 있다. 예를 들어, 점돌연변이에 의한 것이든지 결실에 의한 것이든지 야생형 HPC2 대립유전자의 변이를 본원에 논의된 임의의 방법으로 검출할 수 있다.

DNA 서열 변이를 검출하는 데 사용될 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 수동 서열 분석 또는 자동 형광 서열 분석을 이용한 직접 DNA 서열 분석으로 변이를 검출할 수 있다. HPC2 만큼 큰 유전자를 서열 분석하기 위해서는 수동 서열 분석이 매우 노동 집약적이지만, 최적 조건 하에서 한 유전자의 코딩 서열에 있는 돌연변이를 거의 놓치지 않는다. 또다른 방법으로는 단일 가닥 구조 다형성 검정법 (SSCA) (Orita et al., 1989)이 있다. 이 방법은 특히 DNA 단편의 크기가 200 bp보다 더 크면 모든 서열 변이를 검출하지 못하지만, 대부분의 DNA 서열 변이를 검출할 수 있도록 최적화될 수 있다. 감소된 검출 민감도가 단점이지만, SSCA로 가능한 처리량이 증가되었다는 점이 연구 기초 상의 돌연변이 검출을 위한 직접적인 서열 분석에 대한 존립 가능한 흥미로운 대안이 되게 한다. 그 다음으로, SSCA 겔 상의 운동성이 바뀐 단편을 서열 분석하여 DNA 서열 변이의 정확한 성질을 결정한다. 두 개의 상보적인 DNA 가닥 사이의 불일치의 검출을 기초로 하는 다른 방법으로는 클램프 변형 겔 전기영동 (CDGE) (Sheffield et al., 1991), 헤테로듀플렉스 분석 (HA) (White et al., 1992) 및 화학적 불일치 절단 (CMC) (Grompe et al., 1989)가 있다. 상기 방법들 중 어는 것도 대규모 결실, 중복 또는 삽입, 그리고단백질의 전사 및 번역에 영향을 주는 조절 돌연변이를 검출하지 못할 것이다. 단백질 트런케이션 분석 또는 비대칭 분석과 같이 이러한 종류의 돌연변이를 검출할 수 있는 다른 방법은 특정한 유형의 돌연변이만을 검출하고 미스센스 돌연변이는 검출하지 못한다. DNA 서열 변이를 검출하는 현재 이용가능한 방법은 리센트 뷰 (Grompe, 1993)에서 찾을 수 있다. 일단 한 돌연변이가 알려지면, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 혼성화와 같은 대립유전자 특이적 검출 방법은 알려진 돌연변이와 동일한 돌연변이에 대해 다수의 다른 샘플을 신속히 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 이러한 기술은 가시적인 색을 나타내는 금 나노입자로 표지된 프로브를 이용할 수 있다. (Elghanian).

조직에서 야생형 HPC2 유전자의 변이를 검출하기 위해서는, 주변 정상 조직으로부터 떨어져 있는 조직을 단리하는 것이 좋다. 종양 세포용 조직 표본을 증폭시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직은 파라핀 또는 초냉동박절기 절편으로부터 단리할 수 있다. 또한, 암세포는 유속 세포분석법으로 정상세포로부터 분리할 수 있다. 이들 기술 뿐만 아니라 정상세포로부터 종양세포를 분리하는 다른 기술은 당분야에 잘 공지되어 있다. 종양조직이 정상세포로 많이 오염되어 있다면, 돌연변이의 검출은 더욱 어렵다.

점돌연변이의 검출은 HPC2 대립유전자의 분자학적 클로닝, 및 당분야에 잘 공지되어 있는 기술을 이용한 대립유전자의 서열 분석으로 달성할 수 있다. 별법으로, 유전자 서열은 공지된 기술을 이용하여 종양조직으로부터 얻은 게놈 DNA 표본으로부터 직접적으로 증폭할 수 있다. 그 다음으로, 증폭된 서열의 DNA 서열을결정할 수 있다.

감수성 대립유전자의 존재를 확인하는, 보다 완전하지만 여전히 간접적인 시험을 위한 6종의 잘 공지된 방법이 있다: 1) 단일 가닥 구조 분석 (SSCA) (Orita et al., 1989); 2) 변형 구배 겔 전기영동 (DGGE) (Wartell et al., 1990; sheffield et al., 1989); 3) RNase 보호 검정법 (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) (Conner et al., 1983); 5) 대장균의 mutS 단백질 (Modrich, 1991)과 같은 뉴클레오티드 불일치를 인식하는 단백질의 이용; 및 6) 대립유전자 특이적 PCR (Ruano and Kidd, 1989). 대립유전자 특이적 PCR을 위해서는, 특정한 HPC2 돌연변이와 3' 말단에서 혼성화하는 프라이머를 이용한다. 특정한 HPC2 돌연변이가 존재하지 않으면 증폭 생성물을 관찰하지 못한다. 유럽 특허 출원 공개 제0332435호 및 뉴톤 등 (1989)의 문헌에 개시되어 있는 바와 같이 증폭 불응성 돌연변이계 (ARMS) 역시 이용할 수 있다. 유전자의 삽입 및 결실은 클로닝, 서열 분석 및 증폭으로 검출할 수도 있다. 또한, 유전자 또는 주변 마커 유전자용 제한효소 단편 길이 다형성 (RFLP)는 다형성 단편에서 한 대립 유전자의 변이, 또는 삽입을 기록하는 데 이용할 수 있다. 이러한 방법은 병에 걸린 개체에서 발견된 HPC2 돌연변이의 존재에 대해 상기 개체의 친척을 스크리닝하는 데 특히 유용하다. 당분야에 공지된, 삽입 또는 결실을 검출하는 다른 기술도 이용가능하다.

처음 세 가지 방법 (SSCA, DGGE 및 RNase 보호 분석법)에서 새로운 전기영동 밴드가 나타난다. SSCA에서는 서열 변화가 단일쇄 분자간 염기쌍 형성에 차이를유발하기 때문에 구별되게 이동하는 밴드가 검출된다. RNase 보호 분석법에서는 돌연변이 폴리뉴클레오티드가 둘 이상의 더 작은 단편으로 절단된다. DGGE는 변성 그래디언트 겔을 이용하여 야생형 서열에 대비한 돌연변이 서열의 이동 속도의 차이를 검출하는 것이다. 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 분석법에서는 특정한 서열을 검출하는 올리고뉴클레오티드를 설계하고 혼성화 신호의 존재 여부를 검출함으로써 분석을 행한다. mutS 분석법에서는 돌연변이 서열과 야생형 서열이 형성한 이종 이중쇄에 뉴클레오티드 미스매치가 들어있는 서열에만 단백질이 결합한다.

본 발명에 따르면 미스매치는 두 스트랜드가 100% 상보적이 아닌, 혼성화된 핵산 이중쇄이다. 전적인 상동성이 결여되는 것은 결실, 삽입, 전위 또는 치환 때문일 수 있다. 미스매치 검출은 유전자 또는 그의 mRNA 산물에 존재하는 점 돌연변이를 검출하는 데 이용될 수 있다. 이들 기법은 서열결정보다 감도가 낮기는 하지만 많은 수의 종양 샘플을 대상으로 실행하기에는 더 간단하다. 미스매치 절단 기법의 한 예는 RNase 보호 방법이다. 본 발명을 실시할 때, 이 방법에서는 사람 야생형 HPC2 유전자 코딩 서열에 상보적인 표지된 리보프로브를 사용하게 된다. 이 리보프로브와 종양 조직에서 단리한 mRNA 또는 DNA를 어닐링(혼성화)시키고 이어서 이중쇄 RNA 구조에 존재하는 일부 미스매치를 인식할 수 있는 효소 RNase A로 절단한다. 미스매치가 RNase A에 의해 인식되면 이 효소는 미스매치 위치를 절단한다. 따라서, 어닐링된 RNA 제제를 전기영동 겔 매트릭스 상에서 분리하면, 미스매치가 RNase A에 의해 인식되고 절단된 경우에는 리보프로브와 상기 mRNA 또는DNA에 대응하는 전장 이중쇄 RNA보다 크기가 작은 RNA 산물이 보일 것이다. 리보프로브는 HPC2 mRNA 또는 유전자의 전장일 필요는 없으며 그 중 하나의 부분 영역일 수 있다. 리보프로브가 HPC2 mRNA 또는 유전자의 부분 영역만을 포함하는 경우, 미스매치에 대해 전체 mRNA 서열을 스크리닝하는 데 이러한 프로브를 여러 가지 사용하는 것이 바람직할 것이다.

유사한 방식으로, DNA 프로브를 사용하여 효소에 의한 절단이나 화학적 절단을 통해 미스매치를 검출할 수 있다. 문헌[Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986 등] 참조. 별법으로, 미스매치는 매치된 이중쇄에 대비한 미스매치된 이중쇄의 전기영동 이동성의 변화에 의해 검출할 수도 있다. 문헌[Cariello, 1988 등] 참조. 리보프로브와 DNA 프로브 중 어느 것을 사용하는 경우에도 돌연변이를 함유할지도 모르는 세포 mRNA 또는 DNA는 혼성화에 앞서 PCR (하기 참조)을 이용하여 증폭시킬 수 있다. HPC2 유전자의 DNA 변화는, 변화가 결실이나 삽입과 같은 전체적인 재배열인 경우에는 특히, 서던 혼성화법을 이용해서도 검출할 수 있다.

PCR을 이용하여 증폭된 HPC2 유전자의 DNA 서열은 대립유전자 특이적 프로브를 사용하여 스크리닝할 수도 있다. 이러한 프로브는 각각이 HPC2 유전자 서열의 한 부위를 포함하며 기지의 돌연변이를 지니고 있는 핵산 올리고머이다. 예컨대, 한 올리고머는 HPC2 유전자 서열의 일부분에 해당하고 길이가 30 뉴클레오티드 정도일 수 있다 (당업자에게 숙지된 대로 더 짧거나 더 긴 올리고머 역시 사용할 수 있음). 이러한 대립유전자 특이적 프로브 한 벌을 사용함으로써 PCR 증폭 생성물을 스크리닝하여 HPC2 유전자 중의 기존에 동정된 돌연변이의 존재를 확인할 수 있다. 대립유전자 특이적 프로브와 증폭된 HPC2 서열의 혼성화는 예컨대 나일론 필터 상에서 수행할 수 있다. 고엄격도 혼성화 조건 하에서 특정한 프로브에 대한 혼성화는 그 대립유전자 특이적 프로브에 있는 것과 동일한 돌연변이가 종양 조직에 존재하는 것을 나타낸다.

새로 개발된, 마이크로칩 기술을 이용한 핵산 분석 기술 역시 본 발명에 응용할 수 있다. 이 기술에서는 문자 그대로 수천개의 서로 다른 올리고뉴클레오티드 프로브가 실리콘칩 상에 열을 지어 집적되어 있다. 분석할 핵산을 형광으로 표지하고 칩 상의 프로브에 혼성화시킨다. 이러한 핵산 마이크로칩을 이용하여 핵산-단백질 상호작용을 연구할 수도 있다. 이 기술을 이용하면, 돌연변이의 존재를 판정하거나 심지어 분석 대상 핵산을 서열결정할 수도 있고, 주목하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수도 있다. 이 방법은 다수의, 심지어 수천 개의 프로브를 한 번에 병렬적으로 처리하는 것이며 분석 속도를 엄청나게 향상시킬 수 있다. 이 기술을 이용하는 논문이 몇 개 출판된 바 있다. 예, 문헌[Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Chee et al., 1996; Lockhart et al., 1996; DeRisi et al., 1996; Lipshutz et al., 1995]. 이 방법은 유방암 유전자 BRCA1의 돌연변이에 대해 사람들을 스크리닝하는 데 이미 사용된 바 있다 [Hacia et al., 1996]. 이 신기술은 문헌[Chemical and Engineering News (Borman, 1996)]의 뉴스 기사에서 검토되었으며, 문헌[Nature Genetics, 1996]의 사설 주제가 되기도 했다. 또한, 문헌[Fodor, 1997] 참조.

예상 후보 배좌 중의 돌연변이에 대한 가장 결정적인 시험법은 암환자에게서 얻은 게놈 HPC2 서열을 대조군에서 얻은 것과 직접 비교하는 것이다. 다른 방법으로는, mRNA를 PCR 등으로 증폭한 후에 서열결정하여 후보 유전자의 엑손 구조를 결정해야 할 필요성을 배제할 수 있다.

암환자에게서 나타나는, HPC2 코딩 영역 밖에 해당하는 돌연변이는 인트론 및 HPC2 유전자에 근접하거나 그 안에 있는 조절 서열 등의 비코딩 영역을 검사함으로써 검출할 수 있다. 암환자에게서 대조군의 개인에 비해 크기나 존재량이 비정상적인 mRNA 분자를 드러내는 노던 블롯 실험에서 비코딩 영역에 있는 돌연변이가 중요하다는 초기 암시를 찾을 수도 있다.

HPC2 mRNA 발현의 변화는 당업계에 공지된 임의의 기술로 검출할 수 있다. 여기에는 노던 블롯 분석법, PCR 증폭 및 RNase 보호법 등이 있다. mRNA 발현의 감소는 야생형 HPC2 유전자의 변경을 지시한다. 야생형 HPC2 유전자의 변경은 야생형 HPC2 단백질의 변경에 대한 스크리닝에 의해서도 검출할 수 있다. 예를 들면, HPC2에 대해 면역반응성인 모노클로날 항체를 사용하여 조직을 스크리닝할 수 있다. 코그네이트 항원 (cognate antigen)의 부족은 HPC2 돌연변이를 나타낼 것이다. 돌연변이 HPC2 유전자 산물을 검출하기 위해 돌연변이 대립 유전자 산물에 대해 특이적인 항체를 사용할 수도 있다. 이러한 면역학적 분석법은 당업계에 공지되어 있는 임의의 편리한 구성으로 수행될 수 있다. 이러한 분석법에는 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 분석법 및 ELISA 분석법이 있다. 야생형 HPC2 유전자의 변경을 검출하기 위해 변경된 HPC2 단백질을 검출하는 임의의 방법을 사용할 수 있다.단백질 결합 측정과 같은 기능적인 분석법을 사용할 수 있다. 또한, HPC2 생화학적 기능을 검출하는 분석법들도 사용할 수 있다. 돌연변이 HPC2 유전자 산물의 발견은 야생형 HPC2 유전자의 변경을 나타낸다.

돌연변이 HPC2 유전자 또는 유전자 산물을 기타 인체 샘플, 예컨대 혈청, 대변, 소변 및 타액에서 검출할 수도 있다. 조직에서의 돌연변이 HPC2 유전자 또는 유전자 산물 검출에 대해 상기에서 논의한 동일한 기술을 기타 인체 샘플에도 적용할 수 있다. 암세포를 종양에서 벗겨내면 이러한 인체 샘플에서 보이게 된다. 또한, HPC2 유전자 산물 자체가 세포외 공간으로 분비되서 암세포가 없는 인체 샘플에서도 발견될 수 있다. 이러한 인체 샘플을 스크리닝하여 여러 종류의 암에 대해 간단한 초기 진단을 할 수 있다. 또한, 돌연변이 HPC2 유전자 또는 유전자 산물에 대해 이러한 인체 샘플을 시험하여 화학치료법 또는 방사선치료법의 진행을 보다 용이하게 모니터링할 수 있다.

본 발명의 진단 방법은 HPC2가 종양형성에 어떠한 역할을 하는 임의의 종양에 적용할 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 임상의가 적당한 치료 과정을 결정하는 데 유용하다.

본 발명의 프라이머 쌍은 PCR을 이용하는 특정 HPC2 대립 유전자의 뉴클레오티드 서열 결정에 유용하다. HPC2 유전자 자체의 증폭 DNA 합성을 촉진하기 위해 단일 스트랜디드 DNA 프라이머 쌍을 HPC2 유전자 또는 17번 염색체 내에 있거나 주변에 있는 서열에 어닐링할 수 있다. 완전한 집합의 이들 프라이머가 HPC2 유전자 코딩 서열, 즉, 엑손의 모든 뉴클레오티드의 합성을 가능하게 한다. 프라이머 집합이 인트론 및 엑손 서열 모두의 합성을 가능하게 하는 것이 바람직하다. 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용할 수도 있다. 이러한 프라이머는 특정 HPC2 돌연변이 대립 유전자에만 어닐링하므로 주형으로서의 돌연변이 대립 유전자의 존재하에서만 생성물을 증폭시킬 것이다.

증폭된 서열의 후속적인 클로닝을 용이하게 하기 위해 프라이머는 그들의 5' 말단에 부가되어 있는 제한 효소 부위 서열을 가질 수 있다. 따라서, 제한 효소 부위를 형성시키는 데 필요한 몇몇 뉴클레오티드를 제외하고는 프라이머의 모든 뉴클레오티드는 HPC2 서열 또는 HPC2에 인접한 서열로부터 유도된다. 이러한 효소 및 부위는 당업계에 잘 알려져 있다. 프라이머 자체는 당업계에 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일반적으로, 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 프라이머를 제조할 수 있다. 서열 1 및 3에 제시되어 있는 HPC2 오픈 리딩 프레임의 서열이 주어져 있으므로, 당업계의 숙련자들은 특정 프라이머를 잘 설계할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 핵산 프로브는 여러 목적에 있어서 유용하다. 이들은 게놈 DNA의 서던 혼성화 및 이미 상기에서 논의한 점 돌연변이를 검출하기 위한 RNase 보호 방법에 사용될 수 있다. 이 프로브를 PCR 증폭 생성물을 검출하는 데 사용할 수 있다. 다른 기술을 이용하여 HPC2 유전자 또는 mRNA와의 미스매치를 검출하는데도 이들을 사용할 수 있다.

야생형 HPC2 유전자를 갖는 개인은 HPC2 대립 유전자가 원인이 되는 암에 걸리지 않는다는 것이 밝혀졌다. 그러나, HPC2 단백질의 기능을 방해하는 돌연변이는 암의 발병과 관련이 있다. 따라서, 기능이 손실되거나 변경된 단백질을 생산하는 변경된 (또는 돌연변이) HPC2 유전자의 존재가 암 발생 위험의 증가와 직접 관련이 있다. HPC2 유전자 돌연변이를 검출하기 위해, 생물학적 샘플을 준비하고, 분석될 HPC2 대립 유전자의 서열과 야생형 HPC2 대립 유전자 서열간의 차이점을 분석한다. 돌연변이 HPC2 대립 유전자는 상기한 기술 중 임의의 기술에 의해 초기에 확인할 수 있다. 그후, 그 돌연변이 대립 유전자를 서열 결정하여 특정 돌연변이 대립 유전자의 특이적 돌연변이를 확인한다. 별법으로, 통상적인 기술을 사용하여 돌연변이 (변경된) HPC2 단백질을 확인함으로써 돌연변이 HPC2 대립 유전자를 초기에 확인할 수 있다. 그후, 그 돌연변이 대립 유전자를 서열 결정하여 각 대립 유전자에 대한 특이적 돌연변이를 확인한다. 그런 후, 돌연변이, 특히 HPC2 단백질의 기능을 변경시키는 돌연변이를 본 발명의 진단 및 예후 방법에 사용한다.

정의

본 발명은 다음의 정의들을 사용한다.

"폴리뉴클레오티드의 증폭"은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 라이게이션 증폭 (또는 라이게이즈 연쇄 반응, LCR) 및 Q-베타 레플리카아제의 사용을 기초로 하는 증폭 방법과 같은 방법을 이용한다. 스트랜드 치환 증폭 (SDA), 호열성 SDA 및 핵산 서열을 기초로 하는 증폭 (3SR 또는 NASBA)도 유용하다. 이러한 방법들은 잘 알려져 있으며 당업계에서 폭넓게 실시된다. 예를 들어, (PCR에 대해서는) 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 및 문헌 [Innis 외, 1990]; (LCR에 대해서는) 문헌 [Wu 및 Wallace, 1989]; (SDA에 대해서는) 미국 특허 제5,270,184호 및제5,455,166호 및 문헌 [Walker 외, 1992]; (호열성 SDA에 대해서는) 문헌 [Spargo 외, 1996] 및 미국 특허 제5,409,818호; (3SR 및 NASBA에 대해서는) 문헌 [Fahy 외, 1991 및 Compton, 1991]을 참조한다. PCR을 수행하기 위한 시약 및 하드웨어가 시판되고 있다. HPC2 영역으로부터의 서열을 증폭시키기에 유용한 프라이머는 바람직하게는 HPC2 영역에 있는 서열 또는 여기에서 표적 영역을 측면으로 공격하는 영역에 있는 서열에 상보적이며 특이적으로 혼성화한다. 증폭에 의해 생성된 HPC2 서열을 직접 서열 결정할 수 있다. 덜 바람직하지만 별법으로, 서열 분석 전에 증폭된 서열을 클로닝할 수 있다. 효소적으로 증폭된 게놈 시그먼트의 직접 클로닝 및 서열 분석 방법이 문헌 [Scharf, 1986]에 기재되었다.

"분석물 폴리뉴클레오티드" 및 "분석물 스트랜드"란 표적 서열을 함유할 것이라고 생각되며, 생물학적 샘플을 비롯한 여러 형태의 샘플에 존재할 수 있는 단일 또는 이중 스트랜디드 폴리뉴클레오디드를 말한다.

"항체". 본 발명은 또한 HPC2 폴리펩티드 및 그의 단편에 또는 HPC2 영역, 특히 HPC2 유전자좌 또는 그의 일부로부터의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 및(또는) 모노클로날 항체 및 그의 단편, 및 그의 면역학적 결합 동등물을 제공한다. "항체"란 용어는 단일 분자물, 또는 다수의 여러 분자물로 구성되는 혈청 생성물과 같은 혼합물을 의미하는 데에 모두 사용된다. 폴리펩티드는 펩티드 합성장치에서 합성법으로 제조해서 담체 분자 (예, 키홀 림펫 헤모시아닌)와 커플링시켜 수개월에 걸쳐 래빗에게 주입할 수 있다. HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 면역반응성을 래빗 혈청으로 시험한다. 모노클로날항체는 마우스에게 단백질 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 그의 단편을 주입하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 ELISA에 의해 스크리닝하고, HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편을 사용하여 특이적 면역반응성을 시험한다. 문헌 [Harlow 및 Lane, 1988]을 참조한다. 이들 항체는 분석 뿐 아니라 제약에도 유용할 것이다.

충분량의 소정 폴리펩티드가 일단 얻어지면, 이를 여러 목적에 사용할 수 있다. 통상적인 용도는 결합에 특이적인 항체를 제조하는 것이다. 이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있는 시험관내 또는 생체내 기술에 의해 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체를 제조하는 경우, 적당한 표적 면역계, 통상적으로는 마우스 또는 래빗을 선택한다. 실질적으로 정제된 항원을 동물에게 적당한 방법으로, 면역학자에게 잘 알려져 있는 기타 파라미터에 의해 결정되는 방식으로 면역계에 제공한다. 통상적으로는 족척, 근육내, 복강내 또는 피내로 주입한다. 물론, 마우스나 래빗을 다른 종으로 대체할 수도 있다. 그후, 폴리클로날 항체를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 정제하고, 원하는 특이성을 조절한다.

면역학적 반응은 보통 면역분석법으로 분석한다. 보통, 이러한 면역 분석은 동일한 세포에 의해 항원과 동일한 방식으로 제조되는 항원의 원료를 일부 정제하는 것이 포함된다. 다양한 면역 분석 방법이 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Harlow 및 Lane, 1988, 또는 Goding, 1986]을 참조한다.

10^-8M^-1, 바람직하게는 10^-9내지 10^-10M^-1, 또는 보다 강한 친화도를 갖는 모노클로날 항체가 통상적으로 문헌 [Harlow 및 Lane, 1988 및 Goding, 1986] 등에 기재되어 있는 표준 방법에 의해 제조된다. 간단하게는, 적당한 동물을 선택하고, 원하는 면역화 프로토콜을 수행한다. 적당한 기간 후, 이러한 동물의 비장을 절제하고, 각각의 비장 세포를 통상적으로 적당한 선택 조건하에서 영구 골수종 세포와 융합시킨다. 그후, 세포들을 클론으로 분리하고, 각 클론의 상등액을 항원의 소정 영역에 대해 특이적인 적당한 항체의 제조에 대해 시험하였다.

다른 적합한 기술은 림프구를 항원성 폴리펩티드에, 또는 다르게는 대식세포나 유사한 벡터에 있는 소정의 항체 라이브러리에 시험관내 노출시키는 것을 포함한다. 문헌 [Huse 외, 1989]를 참조한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 개질하여, 또는 개질하지 않고 사용할 수 있다. 종종, 폴리펩티드 및 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 공유결합적 또는 비공유결합적으로 결합시켜 표지한다. 매우 다양한 표지 및 콘쥬게이션 기술이 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌 모두에 광범위하게 보고되어 있다. 적합한 표지 물질에는 방사핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제제, 형광제, 화학발광제, 자성 입자 등이 있다. 이러한 표지 물질의 사용이 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호 등의 특허 문헌에 교시되어 있다. 또한, 재조합 면역글로블린을 제조할 수 있다 (미국 특허 제4,816,567호 참조).

"결합 파트너"란 리간드 분자를 특이성이 높게 결합할 수 있는 분자, 예컨대 항원 및 항원-특이적 항체 또는 효소 및 그의 억제제를 말한다. 일반적으로, 특이적 결합 파트너는 단리 조건하에서 (폴리뉴클레오티드 혼성화의 경우) 분석물 복제본/상보 스트랜드 이중쇄를 고정하기에 충분한 친화도로 결합해야 한다. 특이적 결합 파트너가 당업계에 공지되어 있으며, 예로는 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, IgG 및 단백질 A, 공지되어 있는 많은 수용체-리간드 커플 및 상보적 폴리뉴클레오티드 스트랜드가 있다. 상보적 폴리뉴클레오티드 결합 파트너의 경우, 파트너는 보통 약 15개 이상의 염기 길이이며, 40개 이상의 염기 길이일 수 있다. 당업계의 숙련자들은 15개 미만 (예를 들어, 염기 8개), 15 내지 40개 및 40개 초과의 염기 길이도 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 합성 뉴클레오티드 동족체로 구성될 수 있다. 추가의 결합 파트너는 본원에 기재되어 있는 2-하이브리드 이스트 스크리닝 분석법을 이용하여 확인할 수 있다.

"생물학적 샘플"은 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 부분, 기도, 장관, 요생식로, 눈물, 타액, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직 및 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 비롯한 개체로부터의 분석물인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유하는 것으로 짐작되는 조직 또는 유체의 샘플을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 종양 형성의 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "진단" 또는 "예후"는 1) 병변을 종양 형성으로서 분류하거나, 2) 종양 형성의 심각성을 결정하거나, 또는 3) 치료 전 후에서 질병 진행의 모니터링을 표시하는데 사용된다.

"코딩하다". 폴리뉴클레오티드가 천연 상태, 또는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 조작된 상태로 전사되고(되거나) 번역되어 mRNA 및(또는) 폴리펩티드 또는그의 단편이 제조될 수 있다면 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 "코딩"한다고 여겨진다. 안티센스 스트랜드는 이러한 핵산의 상보체이고, 코딩하는 서열은 그로부터 추론될 수 있다.

"단리된" 또는 "실질적으로 순수한". "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 핵산 (예, RNA, DNA 또는 혼합된 중합체)는 천연 사람 서열 또는 단백질, 예를 들어 리보솜, 폴리머라아제, 많은 다른 사람 게놈 서열 및 단백질을 수반하는 다른 세포 성분으로부터 실질적으로 분리된다. 이 용어는 그의 천연 발생 환경으로부터 제거된 핵산 서열 또는 단백질을 포함하고, 재조합 또는 클로닝 DNA 분리체 및 화학적으로 합성된 유사체, 또는 이형 시스템에 의해 생물적으로 합성된 유사체를 포함한다.

"HPC2 대립 유전자"는 HPC2 유전자좌의 정상 대립 유전자 뿐만 아니라 개체에 전립선 암을 발달시키기 쉬운 변이체 포함 대립 유전자를 의미한다. 이러한 소인성 대립 유전자는 또한 "HPC2 감수성 대립 유전자"라고도 한다.

"HPC2 유전자좌", "HPC2 유전자", "HPC2 핵산" 또는 "HPC2 폴리뉴클레오티드"는 각각 폴리뉴클레오티드를 의미하고, 이들 모두는 HPC2 영역에 있고, 이들은 정상 조직에서 발현되기 적합하고, 이들중 어떤 대립 유전자는 개체에 전립선 암을 발달시키기 쉽다. HPC2 유전자좌에서 돌연변이는 다른 유형의 종양의 개시 및(또는) 진행에 포함될 수 있다. 유전자좌는 개체에 암을 발달시키기 쉬운 돌연변이에 의해 부분적으로 표시된다. 이러한 돌연변이는 하기에 기재된 HPC2 영역내에 포함된다. HPC2 유전자좌는 코딩 서열, 중재 서열 및 전사 및(또는) 번역을 통제하는조절 요소를 포함하는 것을 의미한다. HPC2 유전자좌는 DNA 서열의 모든 대립 유전자 변이체를 포함하는 것을 의미한다.

이러한 용어를 핵산에 적용할 경우, HPC2 폴리펩티드, 단편, 상동물 또는 변이체 (예를 들어, 단백질 융합물 또는 결실물을 포함)를 코딩하는 핵산을 의미한다. 본 발명의 핵산은 천연 HPC2-코딩 유전자 또는 천연 HPC2-코딩 유전자 또는 그 일부와 실질적으로 상동성이 있는 것으로부터 유도되거나, 이와 실질적으로 유사한 서열을 가질 것이다.

HPC2 유전자 또는 핵산은 HPC2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 잠재성 대립 유전자 뿐만 아니라, 그의 작용에 실질적으로 영향을 주지 않는 HPC2 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 야기하는 대립 유전자를 포함하는 HPC2 유전자의 정상 대립 유전자를 포함한다. 이러한 용어는 또한 HPC2 폴리펩티드의 작용에 불리하게 영향을 주는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 대립 유전자를 포함한다. 돌연변이는 HPC2 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 결실성 변화를 생성하여 HPC2 작용의 부분적이거나 완전한 손실을 야기하는 HPC2 핵산 서열의 변화일 수 있거나, 또는 효과적인 HPC2 발현의 손실 또는 HPC2 폴리펩티드의 이상 형태 생성을 야기하는 핵산 서열의 변화일 수 있다.

HPC2 핵산은 서열 1, 3 또는 28에 도시된 것일 수 있거나, 또는 상기 기재된 대립 유전자, 또는 도시된 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 삽입, 결실 및 치환 중 하나 이상인 변화에 의해 도시된 것과 상이한 변이체 또는 유도체일 수 있다. 뉴클레오티드 서열로의 변화는 유전자 코드에 의해 결정되거나 결정되지 않는 바와 같은 단백질 수준에서의 아미노산 변화를 야기할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 핵산은 서열 1, 3 또는 28에 도시된 서열과는 상이하지만, 서열 1에 도시된 동일한 아미노산 서열로 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산은 유전자 코드의 결과로서 변성되는 서열을 포함한다. 한편, 코딩된 폴리펩티드는 서열 2에 도시된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열 2에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 변이체, 유도체 또는 대립 유전자인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산도 또한 본 발명에 의해 제공된다.

HPC2 유전자는 또한 (a) (i) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열의 상보체로 매우 엄격한 조건하에서 혼성화되고 (문헌 [Ausubel et al, 1992]), (ii) HPC2와 관능적으로 동등한 유전자 생성물을 코딩하는 임의의 DNA 서열, 또는 (b) (i) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열의 상보체로 덜 엄격한 조건, 예를 들어 알맞게 엄격한 조건하에서 혼성화되고 (문헌 [Ausubel et al, 1992]), (ii) HPC2와 관능적으로 동등한 유전자 생성물을 코딩하는 임의의 DNA 서열을 의미한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 서열의 상보체인 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태, 및 혼합된 중합체, 센스 및 안티센스 스트랜드 모두를 포함하고, 화학적으로 또는 생물학적으로 개질되거나 비-천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있고, 이는 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 개질은 예를 들어 라벨, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 비하전된 결합 (예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카바메이트 등), 하전된 결합 (예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에티트 등), 펜던트 잔기 (예, 폴리펩티드), 삽입물 (예, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트물, 알킬화물 및 개질 결합 (예, 알파 변성 핵산 등)과 같은 뉴클레오티드내 개질을 포함한다. 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정 서열에 결합하는 능력에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 또한 포함된다. 이러한 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 분자의 골격에서 펩티드 결합이 포스페이트를 치환한 것이 있다.

본 발명은 HPC2 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 재조합 핵산을 제공한다. 재조합 작제물은 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다. 다르게는, 재조합 작제물은 숙주 세포의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 그의 기원 또는 조작에 의해 게놈, cDNA, 반-합성 또는 합성 기원의 폴리펩티드를 포함하고, 이는 1) 천연에서는 회합되지 않은 폴리뉴클레오티드의 모두 및 부분과 회합되지 않고, 2) 천연에서 결합된 것 이외에 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 3) 천연에서 발생되지 않는다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함하는 경우, 이는 도시된 서열을 참조하여 T가 U로 치환된 RNA 동등물을 참조한다고 해석되어야 한다.

따라서, 서열을 포함하는 재조합 핵산이 천연적으로 발생하지 않을 경우에는 본 발명에 의해 제공된다. 야생형 서열을 사용할 경우에도, 예를 들어 결실, 치환 또는 삽입에 의해 종종 변경될 것이다.

cDNA 또는 다양한 유형의 게놈 라이브러리는 본 발명 핵산의 천연원으로서 스크리닝될 수 있거나, 또는 이러한 핵산은 게놈 DNA 또는 다른 천연원에 존재하는 서열의 증폭, 예를 들어 PCR에 의해 제공될 수 있다. cDNA 라이브러리의 선택은 목적 단백질에 대한 mRNA에 풍부한 조직원에 보통 상응한다. 파지 라이브러리가 보통 바람직하지만, 다른 유형의 라이브러리가 사용될 수 있다. 라이브러리의 클론을 플레이트에 스프레딩하고, 기질로 옮겨 스크리닝하고, 변성시키고 목적 서열의 존재를 프로빙한다.

본 발명에 사용된 DNA 서열은 보통 약 5개의 코돈 (15개의 뉴클레오티드), 더욱 보통은 약 7 내지 15개의 코돈, 및 가장 바람직하게 약 35개 이상의 코돈을 포함할 것이다. 하나 이상의 인트론도 또한 존재할 수 있다. 보통 이러한 갯수의 뉴클레오티드는 HPC2-코딩 서열과 특이적으로 혼성화되는 성공적인 프로브에 필요한 최소 길이이다. 본원에서, 8 개의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로 8 내지 17개의 뉴클레오티드만큼 낮은 올리고머는 특히 칩 공학과 관련된 프로브에 사용될 수 있다.

핵산 조작을 위한 기술은 일반적으로, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al, 1992]에 기재되어 있다. 이러한 기술을 적용하는데 유용한 제한 효소 등과 같은 시약은 당업계에 널리 공지되어 있고, 뉴 잉글랜드 바이오랩즈 (New England BioLabs), 보에링거 만하임 (Boehringer Mannheim), 아메르삼 (Amersham), 프로메가 바이오텍 (Promega Biotec), 유. 에스. 바이오케미칼즈 (U. S. Biochemicals), 뉴 잉글랜드 뉴클리어 (New England Nuclear)와 같은 판매원 및수많은 다른 판매원으로부터 시판된다. 본 발명의 융합 단백질을 제조하는데 사용된 재조합 핵산 서열은 천연 또는 합성 서열로부터 유도될 수 있다. 많은 천연 유전자 서열은 적절한 프로브를 사용하여 다양한 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 문헌 [GenBank, National Institutes of Health]를 참조한다.

"HPC2 영역"은 표지 D17S947 및 D17S799에 의해 결합된 사람 염색체 17의 부분을 의미한다. 이러한 영역은 HPC2 유전자를 비롯한 HPC2 유전자좌를 함유한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "HPC2 유전자좌", "HPC2 대립유전자" 및 "HPC2 영역"은 모두 유전자좌, 대립유전자 또는 영역을 포함하는 이중 가닥 DNA 뿐만 아니라 유전자좌, 대립유전자 또는 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중 어느 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, HPC2 유전자좌 또는 영역 또는 대립유전자의 "부분"은 최소 크기가 약 8개 이상의 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 약 15개의 뉴클레오티드, 또는 보다 바람직하게는 약 25개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 것으로 정의되며, 최소 크기가 약 40개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 이 정의는 크기가 8 내지 40개의 뉴클레오티드뿐만 아니라 40개를 초과하는 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 상기 정의는 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500개의 뉴클레오티드를 갖는 핵산, 또는 이들 범위 내에 있는 임의의 개수의 뉴클레오티드 (예, 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121개 등의 뉴클레오티드)를 갖는 핵산, 또는 500개를 초과하는 뉴클레오티드를 갖는 핵산을 포함한다. 본 발명은 서열 번호 1 또는 3 내지 28 중 임의의 것, 그의 상보체 또는 기능적으로동등한 핵산 서열로부터 유도된 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 신규 핵산을 포함한다. 본 발명은 선행 기술에 존재하는 핵산은 포함하지 않는다. 즉, 본 발명은 서열 번호 1 또는 3 내지 28 중 임의의 것으로부터 유도된 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 핵산을 포함하되, 선행 기술에 존재하는 핵산은 포함하지 않는다.

"HPC2 단백질" 또는 "HPC2 폴리펩티드"는 HPC2 유전자좌, 그의 변이체 또는 단편에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 아미노산 및 그의 등가물의 중합체를 의미하고, 특정 길이의 생성물을 의미하지 않으며, 따라서 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의에 속한다. 상기 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등의 폴리펩티드의 변형을 의미하지 않거나 배제하지 않는다. 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예, 인공 아미노산 등)를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 연결기를 갖는 폴리펩티드뿐 아니라 자연적으로, 또한 비자연적으로 발생하는 당업계에 공지된 다른 변형이 정의 내에 포함된다. 일반적으로, 그러한 폴리펩티드는 천연 HPC2 서열과의 상동성이 약 50% 이상, 바람직하게는 약 90%를 초과하고, 보다 바람직하게는 약 95% 이상이다. 또한, 고엄격 또는 저엄격 조건하에 혼성화하는 DNA에 의해 HPC2-코딩 핵산 및 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 코딩된 단백질, 또는 HPC2 단백질로 항혈청에 의해 회복된 단백질도 포함된다.

HPC2 폴리펩티드는 자연적으로 회합되는 물질이 없거나 실질적으로 없고, 단리되고(거나) 정제된 형태일 수 있는 본 명세서에 기재된 임의의 엑손으로부터 유도된 것일 수 있다. 원핵세포 중에서 발현에 의해 생성되거나 합성에 의해 생성되는 경우, 폴리펩티드는 글리코실화와 같은 자연적인 후-번역 과정이 부족할 수 있다. 별법으로, 본 발명은 또한 HPC2 폴리펩티드의 서열 변이체, 대립유전자 또는 유도체인 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 첨가, 치환, 삭제 또는 삽입함으로써, 본 명세서에 기재된 임의의 엑손으로부터 유도된 것과는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러한 바람직한 폴리펩티드는 HPC2 기능을 갖고 있다.

치환 변이체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산과 교환되어 있으며, 다른 기능 또는 특성은 손실되지 않으면서, 폴리펩티드의 한 가지 이상의 특성, 예를 들어 단백질 분해에 대한 안정성을 조정하도록 설계될 수 있다. 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및(또는) 양쪽성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 바람직한 치환은 보존된 것, 즉 하나의 아미노산이 유사한 형태 및 전하의 것으로 대체된 것이다. 보존 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 전형적으로 다음 군: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파라긴산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 티로신, 페닐알라닌 내에서의 치환을 포함한다.

항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위, 또는 HPC2 폴리펩티드와 상호 작용하는 단백질 상의 결합 부위와 같은 구조와의 상호작용 결합 능력에 있어서의 상당한 손실 없이 단백질 구조 내에 다른 아미노산에 대해 특정 아미노산이 치환될 수 있다. 그것이 상호 작용 능력 및 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하는 단백질의 성질이므로, 특정 아미노산의 치환은 단백질 서열, 및 그의 내재하는 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있으며, 그럼에도 유사한 특성을 갖는 단백질을 얻는다. 그러한 변화를 시키는 데 있어서, 아미노산의 수치료법(hydropathic) 지수를 고려할 수 있다. 단백질에 대한 상호적인 생물학적 기능을 논의하는 데 있어서의 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 이해된다 (Kyte 및 Doolittle, 1982). 별법으로, 유사한 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 효과적으로 이루어질 수 있다. 단백질에 대한 상호적인 생물학적 기능을 논의하는 데 있어서의 친수성의 중요성은 일반적으로 당업계에 이해된다 (미국 특허 제4,554,101호). 폴리펩티드를 설계하는 데 있어서, 소수성 지수 또는 친수성을 이용하는 것은 미국 특허 제5,691,198호에 더욱 논의되어 있다.

상동성을 위해 비교되는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 이상의 아미노산, 일반적으로 약 20개 이상의 잔기, 보다 일반적으로는 약 24개 이상의 잔기, 전형적으로는 약 28개 이상의 잔기, 및 바람직하게는 약 35개 이상의 잔기이다.

"작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병치를 의미한다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미칠 경우, 프로모터는 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다.

용어 펩티드 의사체 또는 의사체는 HPC2 폴리펩티드의 필수적인 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미하도록 의도된다. 펩티드 의사체는 단백질 2차 구조의 성분을 모방하는 펩티드-함유 분자일 수 있다 (Johnson et al., 1993). 펩티드 의사체를 사용하는 데 있어서의 기본적인 이론적 근거는, 분자 상호 작용, 예를 들어 항체와 항원, 효소와 기질 또는 스캐폴딩(scaffolding) 단백질의 상호 작용을 촉진시키는 방식으로, 단백질의 펩티드 주쇄가 아미노산 측쇄를 배열하도록 주로 존재한다는 것이다. 펩티드 의사체는 천연 분자와 유사한 분자 상호 작용을 하도록 설계된다. 의사체는 전혀 펩티드가 아닐 수 있지만, 천연 HPC2 폴리펩티드의 필수적인 생물학적 활성을 보유한다.

"프로브". 특정 암을 일으키는 경향이 있거나, 대부분의 암과 관련이 있는 HPC2 대립유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드 다형성은 매우 엄격한 조건 내지 중간 정도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 표적 서열의 것을 갖는 안정한 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼성화함으로써 검출된다. 프로브가 표적 서열에 완전하게 상보적일 것으로 예상된다면, 고엄격 조건을 이용한다. 약간의 미스매치가 예상되는 경우, 예를 들어, 프로브가 완전히 상보적이지 않는 결과를 갖는 변이체가 예상되는 경우에는 혼성화 엄격도는 줄어들 수 있다. 조건은 비특이적/우발적 결합을 배제하도록, 즉 노이즈를 최소화하도록 선택된다. (이러한 기재를 통해, 간단히 "엄격" 조건이 이용되는 것으로 언급되면, "고엄격" 조건이 이용되는 것으로 해석해야 한다는 점을 유의해야 한다.) 상기 지표로 중성 DNA 다형성뿐만 아니라 돌연변이를 확인하기 때문에, HPC2 감수성 대립유전자의 검출을 입증하기 위해서는 이러한 지표를 추가로 분석해야 할 필요가 있다. 고엄격 조건의 예는 65 ℃에서 0.5 M NaHPO₄, 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 1 mM EDTA 중 파일러에 결합된 DNA에 혼성화하고, 0.1×SSC/0.1% SDS 중 68 ℃에서 세척하는 것이다 (Ausubel et al., 1992). 덜 엄격한 조건, 예를 들어 중간 정도로 엄격한 조건은 0.2×SSC/0.1% SDS 중 42℃에서 세척하는 것을 제외하고는 상기에 정의된 바와 같다.

HPC2 대립유전자를 위한 프로브는 HPC2 영역의 서열, 그의 cDNA, 기능적으로 동등한 서열, 또는 그의 상보체로부터 유도될 수 있다. 프로브는 HPC2 영역의 전체 또는 일부 길이이고, HPC2 영역에 특이적 혼성화할 수 있는 임의의 적절한 길이일 수 있다. 표적 서열이 프로브와 동일한 서열을 포함하는 경우, 하이브리드는 고엄격 조건에서도 비교적 안정하기 때문에, 프로브는 예를 들어 약 8 내지 30개의 염기쌍으로 짧을 수 있다. 프로브에서 어느 정도의 미스매치가 예상되는 경우, 즉, 프로브가 변이 영역에 혼성화할 것으로 의심되는 경우에는, 필요한 특이성을 갖는 표적 서열에 혼성화하는 더 긴 프로브를 도입할 수 있다.

프로브는 표지 또는 리포터 분자에 결합되어 있는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 표준 방법에 의해, 서열 유사성이 있는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 단리시키는 데 사용될 수 있다. 프로브의 제조 및 표지 기술은 문헌 [Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1992]를 참조한다. 기타 유사한 폴리뉴클레오티드는 상동성 폴리뉴클레오티드를 사용하여 선택될 수 있다. 별법으로, 이들 또는 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성되거나 유전 코드에서의여분을 이용하여 선택할 수 있다. 사일런트 체인지(silent change)에 의하거나 (이것에 의해 다양한 제한 부위를 생성함), 또는 특정 시스템의 발현을 최적화함으로써 다양한 코돈 치환이 도입될 수 있다. 돌연변이는 폴리펩티드의 특성을 변형시키하도록, 아마도 리간드-결합 친화성, 사슬간 친화성, 또는 폴리펩티드 분해 또는 전환율을 변화시키도록 도입될 수 있다.

본 발명의 합성 올리고뉴클레오티드 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브는 자연 발생하거나 재조합 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터 유도되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 프로브는 또한 닉(nick) 번역, 클레나우(Klenow) 필-인(fill-in) 반응 또는 당업계에 공지된 다른 방법으로 표지될 수 있다.

약 8개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖고, HPC2 코딩 폴리뉴클레오티드 서열로부터 약 9 kb 이하, 일반적으로 약 1.0 kb 이하인 폴리뉴클레오티드 서열의 부분이 프로브로 바람직하다. 따라서 이러한 정의는 크기가 8 내지 9000개의 뉴클레오티드인 프로브를 포함한다. 따라서 상기 정의는 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드를 갖는 프로브, 또는 이들 범위 내에 있는 임의의 개수의 뉴클레오티드 (예, 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121개 등의 뉴클레오티드)를 갖는 프로브, 또는 500개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 프로브를 포함한다. 프로브는 또한 HPC2 코딩 mRNA가 세포 또는 조직 내에 존재하는 지를 결정하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명은 서열 번호 1 또는 3 내지 28 중 임의의 것, 그의 상보체 또는 기능적으로동등한 핵산 서열로부터 유도된 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 신규 프로브를 포함한다. 본 발명은 선행 기술에 존재하는 프로브는 포함하지 않는다. 즉, 본 발명은 서열 1 또는 3 내지 28 중 임의의 것으로부터 유도된 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 프로브를 포함하되, 선행 기술에 존재하는 프로브는 포함하지 않는다.

비슷한 고려 및 뉴클레오티드 길이를 또한 HPC2 유전자의 전체 또는 일부의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머에도 적용 가능하다. 따라서, 프라이머의 정의는 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500개의 뉴클레오티드를 갖는 프라이머, 또는 이들 범위 내에 있는 임의의 개수의 뉴클레오티드(예, 9, 10 ,11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121개 등의 뉴클레오티드)를 갖는 프라이머, 또는 500개를 넘는 뉴클레오티드 또는 500 내지 9000 사이의 임의 개수의 뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 포함한다. 프라이머는 또한 HPC2 코딩 mRNA가 세포 또는 조직 내에 존재하는 지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 HPC2 유전자를 증폭시키는 HPC2 유전자좌, 그의 상보체 또는 기능적으로 동등한 핵산 서열로부터 유도된 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 신규 프라이머를 포함한다. 본 발명은 선행 기술에 존재하는 프라이머는 포함하지 않는다. 즉, 본 발명은 8개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 모든 프라이머를 포함하되, 선행 기술에 존재하는 프라이머는 포함하지 않는다.

"단백질 변형 또는 단편"은 제1 구조 서열과 실질적으로 상동성이나, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내 화학적 및 생화학적 변형을 포함하거나 비정상 아미노산을 포함하는 HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대하여 본 발명에 의하여 제공된다. 그러한 변형은 당업계의 숙련자들에게 쉽게 이해되는 바와 같은, 예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 포스포릴화, 글리코실화, 유비퀴틴화, 표지 (예를 들어, 방사뉴클리드로의 표지) 및 다양한 효소에 의한 변형을 포함한다. 폴리펩티드를 표지하는 다양한 방법 및 상기 목적으로 유용한 각종 치환기 또는 표지가 당업계에 공지되어 있으며, 이는 32P와 같은 방사성 동위원소, 표지된 항리간드 (예를 들어, 항체)와 결합한 리간드, 형광형성물질, 화학형광제, 효소 및 표지된 리간드에 대한 특이적 결합쌍 구성원으로서 작용할 수 있는 항리간드를 포함한다. 표지의 선택은 요구되는 민감도, 프라이머와의 용이한 접합, 안정성 필요 조건, 및 이용가능한 수단에 의존한다. 폴리펩티드의 표지 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992] 참조.

실질적으로 전장 폴리펩티드 이외에도, 본 발명은 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편을 제공한다. 상당한 생물학적 활성은 HPC2 폴리펩티드에 특유한 리간드-결합, 면역 활성 및 다른 생물학적 활성을 포함한다. 면역 활성은 표적 면역계에 있어서 면역원 기능 뿐 아니라 결합에 대한 면역 에피토프의 공유, HPC2 단백질의 에피토프에 대한 경쟁자 또는 치환 항원으로서의 작용을 포함한다. 본원에서 사용된 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정자(determinant)를 말한다. 에피토프는 에피토프에 대해 유일한 공간적 형태로 3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 5개 이상의 상기 아미노산으로 이루어지고, 보다 일반적으로는 8-10개 이상의 상기 아미노산으로 이루어진다. 상기 아미노산의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

면역 목적상, 종렬반복 폴리펩티드 분절은 면역원으로 사용될 수 있으며, 이로인해 항원 단백질을 많이 생성한다. 별법으로, 그러한 폴리펩티드는 특이 결합에 대해 매우 효율적인 경쟁자로 작용한다. HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대해 특이적인 항체의 제조는 하기에 기술한다.

또한, 본 발명은 HPC2 폴리펩티드 및 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 상동성 폴리펩티드들은 2개 이상의 HPC2 폴리펩티드 서열간의 또는 HPC2과 관련 단백질의 서열들간의 융합체일 수 있다. 마찬가지로, 유도 단백질들의 조합적 성질 또는 활성을 나타내는 이종 융합체가 구성될 수 있다. 예를 들어, 리간드-결합 또는 다른 도메인은 상이한 새로운 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에서 "맞바꿀" 수 있다. 그러한 상동성 또는 이종 융합 폴리펩티드는 예를 들어, 결합의 변경된 강도 또는 특이성을 나타낼 수 있다. 융합 파트너는 면역글로불린, 세균성 β-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, 알파 아밀라제, 알콜 탈수소화제 및 이스트 알파 접합 인자를 포함한다. 문헌 [Godowski et al., 1988] 참조.

융합 단백질은 전형적으로 하기에 기술된 바와 같이 재조합 핵산 방법에 의해서 제조되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 폴리펩티드의 합성 기술은 예를 들어, 문헌 [Merrifield, 1963]에 기술되어 있다.

"단백질 정제"는 HPC2 폴리펩티드를 다른 생물학적 재료, 예를 들어 HPC2를 코딩하는 재조합 핵산으로 형질감염시킨 세포로부터 단리시키는 다양한 방법을 말하며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 본 발명에서 제공되는 항체 등을 사용하는 면역친화 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이는 문헌 [Deutscher, 1990 and Scopes, 1982]에 개시되어 있는 것을 포함한다.

용어 "단리된", "실질적으로 순수한" 및 "실질적으로 상동성"은 자연 상태에서 이를 수반하는 성분으로부터 분리된 단백질 또는 폴리펩티드를 기술하는 데 교환가능하게 사용된다. 단량체 단백질은 적어도 약 60 내지 75%의 샘플이 단일 폴리펩티드 서열을 나타낼 때 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 단백질은 전형적으로 약 60 내지 90% W/W의 단백질 샘플, 보다 일반적으로 약 95%를 포함하고, 바람직하게는 약 99% 이상의 순도일 수 있다. 단백질 순도 또는 상동성은 당업계에 공지된 다수의 방법, 예를 들어 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 이후 겔을 염색하는 단일 폴리펩티드 밴드를 가시화함으로써 나타낼 수 있다. 특정 목적상, 고 분할은 정제에 사용되는 당업계에 공지된 HPLC 또는 다른 방법을 사용하여 제공될 수 있다.

HPC2 단백질은 자연 상태에서 이에 수반되는 자연 오염물로부터 분리될 때 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 함유되어 있지 않다. 이에, 화학적으로 합성되거나 자연적으로 기원한 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리펩티드는 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 없을 수 있다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여, 단리에 의하여 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 없게 될 수 있다.

단리되고 조작된 유전자 서열의 발현 생성물로서 제조되는 폴리펩티드는 상동성 세포형에서 발현되는 경우에서도, 본원에서 사용되는 "단리된 폴리펩티드"이다. 이종 세포에 의해 발현되는, 합성적으로 제조된 형태 또는 분자는 고유적으로 단리된 분자이다.

"재조합 핵산"은 자연적으로 발생하지 않거나, 또는 인공적으로 조합하지 않았다면 분리되어 있을 두개의 서열 분절을 인공적으로 조합하여 만들어진 핵산이다. 이러한 인공 조합은 종종 화학 합성 방법 또는 핵산의 단리된 분절의 인공적인 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기술로써 달성된다. 일반적으로 코돈을 이를 코딩하는 여분의 코돈 또는 보존적 아미노산으로 치환시키면서, 전형적으로 서열 인식 부위를 도입하거나 제거하였다. 별법으로, 원하는 기능의 핵산 분절과 함께 결합하여 원하는 기능의 조합을 생성하는 것이 수행된다.

"조절 서열"은 일반적으로 유전자의 발현에 영향을 주는(유전자의 전사 및 메신저 RNA의 번역, 스플라이싱, 안정성 등을 포함) 유전자좌 (locus)의 100 kb의 코딩 영역내의 서열을 말하나, 코딩 영역으로부터 보다 떨어져 있을 수 있다 .

"실질적인 상동성 또는 유사성". 핵산 또는 그의 단편은 다른 핵산 (또는 그의 상보 가닥)과 최적으로 정렬될 때 (적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 삭제) 약 60% 이상의 뉴클레오티드 염기, 일반적으로는 약 70% 이상, 보다 일반적으로는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 95-98% 이상의 뉴클레오티드 염기에 있어서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있는 경우, 서로 "실질적으로 상동성" ("또는 실질적으로 유사함")이다.

동일성은 서열들 사이의 두개의 스트링 사이의 매치의 동일성으로 결정되는두개의 폴리펩티드 또는 두개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관계의 정도를 의미한다. 동일성은 쉽게 계산될 수 있다. 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성을 측정하는 많은 방법들이 존재하며, 용어 "동일성"은 숙련자들에게 공지되어 있다 (문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith. D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds,. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991). 일반적으로 두개의 서열 사이의 동일성을 측정하는 데 사용되는 방법들은 문헌 [Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed,. Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipman, D. (1988)]에 개시된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 두개의 서열 사이의 가장 긴 매치를 제공하도록 설계된다. 그러한 방법은 컴퓨터 프로그램으로 코드화된다. 두개의 서열 사이의 동일성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(문헌 [Devereux et al. (1984), BLASTP, BLASTIN, FASTA (Altschul et al, (1990); Altschul et al. (1997)])를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

별법으로, 실질적인 상동성 또는 유사성은 핵산 또는 그의 단편이 선택적인 혼성화 조건하에 다른 핵산 (또는 그의 상보 가닥), 가닥 또는 그의 상보체로 혼성화될 때 존재한다. 혼성화의 선별성은 전체적인 특이성 결여보다 실질적으로 더 선택적인 혼성화가 일어날 때 존재한다. 전형적으로, 선택적인 혼성화는 약 14개 이상의 뉴클레오티드의 스트레치 상에서 약 55% 이상의 상동성, 바람직하게는 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 약 75% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상일 때 발생한다 (문헌 [Kanehisa, 1984] 참조). 기술된 바와 같이 상동성 비교 기장은 스트레치보다 더 길 수 있으며, 특정 실시양태에 있어서 약 9개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 약 36개 이상의 뉴클레오티드의 스트레치 일 수 있다.

핵산 혼성화는 당업계의 숙련자들에게 쉽게 이해될 수 있는 염기 조성물, 상보체 가닥의 기장, 및 혼성화 핵산 사이의 뉴클레오티드 염기 미스매치의 개수 이외에, 염 농도, 온도 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향받을 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 30 ℃ 이상의 온도, 전형적으로는 37 ℃ 이상, 및 바람직하게는 45 ℃ 이상의 온도를 포함할 수 있다. 엄격한 염 조건은 일반적으로 1000 mM 미만, 전형적으로 500 mM 미만, 바람직하게는 200 mM 미만이다. 그러나, 파라미터들의 조합은 임의의 단일 파라미터의 척도보다 더 중요하다. 문헌 [Wetmur and Davidson, 1968] 참조.

또한, 프로브 서열은 특정 조건 하에서 이중쇄 DNA에 특이적으로 혼성화하여 삼중 또는 다른 고도의 DNA 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 프로브의 제조와 적합한 혼성화 조건은 당업계에 널리 알려져 있다.

"실질적인 상동성" 또는 "실질적인 동일성"이란 용어는, 폴리펩티드에 관련하여 사용되는 경우 해당 폴리펩티드 또는 단백질이 전체의 자연 발생 단백질 또는 그의 일부와 약 30% 이상의 동일성을, 보통은 약 70% 이상의 동일성을, 보다 일반적으로는 약 80% 이상의 동일성을, 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 나타냄을 의미한다.

폴리펩티드의 경우 상동성은 통상 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 예를 들어, 서열 분석 소프트웨어 팩키지(the Genetics computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705) 및 핵산 상동성과 관련하여 앞서 언급된 소프트웨어를 참고. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 지정되어 있는 상동성 척도를 이용하여 유사한 서열들을 매치시킨다. 보존적 치환에는 통상 하기 군들 안에서의 치환, 즉 글리신과 알라닌; 발린, 이소루신과 루신; 아스파라긴산과 글루탐산; 아스파라긴과 글루타민; 세린과 트레오닌; 리신과 아르기닌; 및 페닐알라닌과 티로신이 포함된다.

"실질적으로 유사한 기능"이란 야생형 HPC2 핵산 또는 야생형 HPC2 폴리펩티드에 관련하여 변형된 핵산 또는 변형된 단백질의 기능을 말한다. 이러한 변형된 폴리펩티드는 야생형 HPC2 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이고 실질적으로 동일한 기능을 갖는 것이다. 변형된 폴리펩티드는 변경된 아미노산 서열을 가지고(가지거나) 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 기능의 유사성 이외에도, 변형된 폴리펩티드는 길어진 반감기와 같은 다른 유용한 특성을 가질 수 있다. 변형된 폴리펩티드의 기능(활성)의 유사성은 야생형 HPC2 폴리펩티드의 활성과 실질적으로 동일한 것일 수 있다. 또는, 변형된 폴리펩티드의 기능 (활성)의 유사성은 야생형 HPC2 폴리펩티드의 활성보다 더 높을 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 통상의 기술을 이용하여 합성하거나, 통상의 기술을 이용하여 변형된 핵산을 코딩하여 생산한다. 변형된 핵산은 통상의 기술로 제조한다. 야생형 HPC2 유전자 기능과 실질적으로 유사한 기능을 지닌 핵산은 상기 언급한 변형된 단백질을 생산하게 된다.

폴리펩티드 "단편", "일부", 또는 "세그먼트"란 약 5 내지 7개 이상의 인접 아미노산, 흔히 약 7 내지 9개 이상의 인접 아미노산, 통상적으로는 약 9 내지 13개 이상의 인접 아미노산, 가장 바람직하게는 약 20 내지 30개 이상의 인접 아미노산의 아미노산 잔기로 된 연속부이다.

본 발명의 폴리펩티드는, 가용성인 경우 고상 지지체 (예를 들어, 니트로셀룰로스, 나일론, 컬럼 충전재 (예, 세파로스 비드), 자성 비드, 유리솜, 플라스틱, 금속, 고분자겔, 셀, 또는 다른 기질에 결합되어 있을 수 있다. 이러한 지지체는 예를 들어 비드, 웰, 딥스틱 또는 멤브레인 등의 형태를 취할 수 있다.

"표적 영역"이란 증폭 및(또는) 검출하고자 하는 핵산의 영역을 말한다. 용어 "표적 서열"이란 프로브 또는 프라이머가 특정 조건하에서 그와 안정한 하이브리드를 형성하게 되는 서열을 말한다.

본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않는 한 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 유전학 및 면역학 분야의 통상의 기술을 이용한다. 예를 들어,문헌[Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991] 참조. 인간 염색체 1의 맵핑을 비롯한 인간 유전자 맵핑에 관한 기술과 재료에 대한 전체적인 논의는 예컨대 문헌[White and Lalouel, 1988]에 있다.

재조합 또는 화학적으로 합성된 핵산, 벡터, 형질전환체, 숙주세포의 제조

본 발명의 폴리펩티드를 적당한 숙주세포에서 복제함으로써 대량 생산할 수 있다. 목적하는 단편을 코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편을, 원핵 또는 진핵 세포에 들어가 복제할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물, 보통 DNA 작제물에 도입시킨다. 보통, 폴리뉴클레오티드 작제물은 효모나 박테리아와 같은 단세포 숙주에서의 복제에 적합하며, 배양한 포유동물 또는 식물이나 다른 진핵 세포주에 도입할 수도 있다(게놈 내에 통합될 수도 되지 않을 수도 있음). 본 발명의 방법에 의해 생산한 핵산의 정제 방법은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 1989 or Ausube et al., 1992]에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, Beaucage 및 Caruthers (1981)가 기술한 포스포라미디트법 또는 Matteucci 및 Caruthers (1981)의 트리에스테르 방법과 같은 화학적 방법에 의해 제조할 수 있고 시판되는 자동 올리뉴클레오티드 합성 장치로 합성할 수도 있다. 이중쇄 단편은 화학적 합성에 의한 단일쇄로부터, 상보쇄를 합성하여 적당한 조건 하에서 쇄들을 함께 어닐링함으로써 또는 상보쇄를 DNA 폴리머라제를 사용하여 적당한 프라이머 서열과 함께 부가함으로써 수득할 수 있다.

원핵 또는 진핵 숙주에 도입하기 위해 작제한 폴리뉴클레오티드 작제물은 목적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 의도한 폴리뉴클레오티드 단편을 비롯하여 숙주가 인식하는 복제계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩티드 코딩 세그먼트에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 개시 조절 서열을 포함할 것이다. 발현 벡터는 예를 들어 복제 개시점 또는 자동적 복제 서열 (ARS) 및 발현제어 서열, 즉 프로모터, 인핸서 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜-결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 종결 서열 및 mRNA 안정화 서열을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 천연 HPC2 단백질로부터든, 다른 수용체로부터든, 또는 동일 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터든, 단백질이 세포막을 통과하고(하거나) 그에 담지되어 국소적 기능을 갖게되거나, 세포로부터 분비되게 하는 분비 신호도 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al. 1992]에 논의되어 있고 당업계에 널리 알려진 표준 재조합 기술로 제조할 수 있다.

적합한 프로모터 및 다른 필요 벡터 서열은 숙주 내에서 기능하도록 선택하고, 경우에 따라서는 HPC2 유전자와 원래 관련되어 있는 서열을 포함할 수도 있다. 세포주와 발현 벡터의 작용가능한 조합예들은 문헌[Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1992; Metzger et al., 1988]에 기재되어 있다. 당업계에는 유용한 벡터가 많이 알려져 있고 스트라젠사, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 프로메가 바이오텍사 등의 공급업체로부터 구할 수 있다. trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당분해 효소 프로모터와 같은 프로모터는 원핵 숙주의 경우에 사용할 수있다. 유용한 효모 프로모터에는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소 (예, 에놀라제 또는 글리세르알데히드-3-프포스페이트 데하이드로게나제), 말토오즈 및 갈락토즈 이용에 기여하는 효소의 프로모터 영역들이 포함된다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 히쯔맨 등의 EP 73,675A 에 기재되어 있다. 적합한 비천연 포유동물 프로모터에는 SV40 (Fiers et al., 1978)로부터의 초기 및 후기 프로모터, 또는 멀로니 백혈병 바이러스, 마우스 종양 바이러스, 조류 육아종 바이러스, 아데노바이러스 II, 소의 유두종바이러스, 및 폴리오마로부터 유래한 프로모터가 포함되어야 한다. 또한, 다수개의 유전자 카피가 만들어지도록 증폭성 유전자(예, DHFR)에 작제물을 결합할 수도 있다. 적합한 인핸서 및 다른 발현 제어 서열로는, 문헌[Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983)] 참조. 또한 예를 들어 미국 특허 제5,691,198호; 동 제5,735,500호; 제5,747,469호 및 제5,436,146호 참조.

이러한 발현 벡터들은 자발적으로 복제할 수 있으며, 또한 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 삽입하여 복제할 수도 있다.

발현 및 클로닝 벡터도 마찬가지로 선택 마커, 즉 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 증식을 위해 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. 이러한 유전자가 있어야지만 삽입체를 발현하는 숙주 세포들만이 증식하게 된다. 통상의 선택 유전자는 a) 항생물질이나 다른 독성 물질(예, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 등)에 대한 내성을 부여하거나, b) 영양 요구성 결함을 보완하거나, c) 복합 배지에 없는 중요한 영양소(예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)를 공급하는 단백질을 코딩한다. 적당한 선택 마커의 선택은 숙주 세포에 따라 결정되며, 여러 숙주에 대한 적합한 마커는 당업계에 널리 알려져 있다.

목적하는 핵산을 함유하는 벡터를 생체외에서 전사시키고 결과의 RNA를 공지의 방법으로, 예를 들어 주입 (Kubo et al., 1988 참조)에 의해 숙주 세포 내로 도입하거나, 숙주를 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 직접 도입할 수 있는데, 이러한 방법에는 세포 숙주의 유형에 따라 결정되며 일렉트로포레이션법, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 이용하는 형질감염 (transfection)법, 마이크로프로젝타일 충격법, 리포펙틴법, 감염법 (벡터가 레트로바이러스 게놈과 같이 감염성 인자인 경우) 등이 포함된다. 일반적으로, 문헌[Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1992] 참조. 당업계에 공지된 임의 방법으로 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것은, 특히 상기 언급된 것들을 포함하여 "형질전환"이라 칭한다. 상기 기재된, 핵산이 도입되어 있는 세포란 그 세포의 자손도 포함하는 의미이다.

본 발명의 핵산 및 폴리뉴클레오티드는, 벡터 또는 다른 발현 비히클 중의 HPC2 핵산 또는 그의 일부를 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시킴으로써 대량 생산할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 원핵 숙주는 에쉬리키아 콜리 균주이고, 다른 바실러스 섭틸러스나 슈도모나스와 같은 원핵 균주도 사용할 수 있다.

포유동물 또는 다른 진핵 숙주 세포 (예, 효모, 편모성 곰팡이, 식물, 곤충 또는 수륙양서동물 또는 조류종의 숙주 세포)도 본 발명의 단백질 생산에 유용하다. 배지에서 포유동물 세포를 증식시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌[Jakoby and Pastan, 1979] 참조. 일반적으로 사용되는 포유동물 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 오버리 (CHO)세포, 및 WI38, BHK 및 COS 세포주가 있고, 당업계의 숙련자라면 다른 세포주, 예를 들어 고도의 발현, 원하는 글리코실화 패턴 또는 다른 특징을 제공하는 다른 세포주도 적합함을 알 것이다. 일반적으로 사용되는 곤충 세포주의 예는 SF9이다.

벡터 작제 방식에 따라 마커를 사용하여 클론을 선택한다. 마커는 동일 또는 상이한 DNA 분자, 바람직하게는 동일한 DNA 분자일 수 있다. 원핵 숙주의 경우, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린 또는 다른 항생물질에 대한 내성에 의해 형질전환체를 선택할 수 있다. 특정 생성물을 온도 민감성에 기초해 생산하는 것도 적당한 마커로서 기능할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 원핵 또는 진핵 세포는 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드의 생산뿐만 아니라, 또한 예를 들어 HPC2 폴리펩티드의 특성 연구에도 유용하다.

또한, HPC2 유전자 산물을 형질전환 동물에서 발현시킬 수도 있다. 마우스, 랫트, 토끼, 기니 피그, 마이크로-피그, 염소 및 비인간 영장류 (예, 비비, 원숭이 및 침팬지)를 비롯한 임의 동물종을 사용하여 HPC2 형질전환 동물을 만들 수 있다.

당업계에 공지된 임의 기술을 사용하여 HPC2 유전자를 동물에 유전자 도입시켜 형질전환 동물의 파운더 라인(founder line)을 생산할 수 있다. 이러한 기술에는 전구핵 미세주입법 (미국 특허 제4,873,191호), 레트로바이러스-매개의 배선에로의 유전자 전달법 (Van der Putten et al., 1985), 배아 간세포로의 유전자 표적화법 (Thompson et al., 1989), 배아 일렉트로포레이션법 (Lo, 1983), 및 정자-매개 유전자 전달법 (Lavitrano et al., 1989) 등이 포함된다. 이러한 기술에 대한 검토는, 거명을 통해 전문이 본 명세서에 포함되는 Gordon (1989)의 문헌 참조.

본 발명은 모든 세포 내에 HPC2 형질전환체를 담지한 형질전환 동물뿐 아니라, 세포 전부가 아니라 몇몇 세포중에 형질전환체를 담지하고 있는 동물, 즉 모자이크 동물을 제공한다. 형질전환체는 단일 형질전환체로 또는 컨캐터머(concatamer), 즉, 헤드-투-헤드 연결체 또는 헤드-투-테일 연결체로 통합될 수 있다. 또한 형질전환체는 예를 들어 Lasko et al.의 가르침에 따라 특정 세포형에 선택적으로 도입하여 활성화할 수도 있다. 이러한 세포형 특이적 활성화에 필요한 조절 서열은 해당 특정 세포형에 따라 결정되며, 당업자에게는 자명한 것이다. HPC2 유전자 형질전환체를 내인성 HPC2 유전자의 염색체 부위에 통합하고자 하는 경우에는, 유전자 표적화법이 바람직하다. 요컨대, 이러한 기술을 활용할 때는, 내인성 HPC2 유전자와 상동성인 수개의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터를, 내인성 HPC2 유전자의 뉴클레오티드 서열 내로 염색체 서열과의 동종 재조합에 의해 통합하고 내인성 HPC2 유전자 뉴클레오티드의 기능은 혼란시키도록 설계한다. 또한, 형질전환체를 특정 세포형에 선택적으로 도입하여 내인성 HPC2 유전자를, 예를 들어 Gu et al.(1994)의 가르침에 따라 그 세포형에서만 실활화시킬 수 있다.이러한 세포형 특이적 실활화에 필요한 조절 서열은 목적하는 특정 세포형에 따라 결정되며 당업자에게는 명확할 것이다.

형질전환 동물을 만든 후에는, 표준 기술을 이용하여 재조합 HPC2 유전자의 발현 여부를 분석할 수 있다. 동물 조직을 분석하여 형질전환체의 통합이 수행되었는지 분석하는 서던 블롯 분석법 또는 PCR 기술을 이용하여 초기 스크리닝을 수행할 수 있다. 형질전환 동물의 조직중 형질전환체의 mRNA 발현 수준은 또한 동물로부터 얻은 조직 샘플의 노던 블롯 분석법, in situ hybridization 분석법 및 RT-PCR을 비롯한 기술들을 이용하여 구할 수 있다. 또한, HPC2 형질전환체 산물에 특이적인 항체를 이용하여 HPC2 유전자-발현 조직의 샘플을 면역세포화학적으로 평가할 수 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드 서열은 당업자가 알고 있듯이 HPC2 유전자좌의 발현을 막거나 감소시키는데 유용하다. 예를 들어, HPC2 유전자좌 또는 HPC2 영역으로부터의 다른 서열(특히 HPC2 유전자좌의 양측에 있는 서열)의 전부 또는 일부를 함유하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 프로모터의 제어하에 안티센스 배향으로 놓고 세포에 도입시킬 수 있다. 이러한 안티센스 작제물의 세포내 발현은 HPC2 전사 및(또는) 번역 및(또는) 복제를 방해할 것이다.

본 명세서에 기재된 HPC2 유전자 서열을 토대로 한 프로브 및 프라이머를 사용하여 다른 종에서의 상동성 HPC2 유전자 서열 및 단백질을 확인할 수 있다. 이들 HPC2 유전자 서열 및 단백질은 본 명세서에 기재된 진단/예후 (prognostic) 스크리닝법, 치료적 스크리닝법 및 약물 스크리닝 방법에 사용된다.

이용 방법: 핵산 진단 및 진단 키트

암을 유발하는 HPC2 대립유전자의 존재 유무를 검출하기 위하여, 혈액과 같은 생물 샘플을 준비하고 이환성 HPC2 대립유전자의 존재 여부를 분석한다. 신생물의 존재 여부를 검출하기 위하여서는, 전구 병변의 악성 종양으로의 진행, 또는 예후 지표로서 병변의 생물 샘플을 준비하여 HPC2 돌연변이 대립유전자의 존재 여부를 분석한다. 이 시험 결과와 해석 자료를 시험받은 사람과의 연락을 위해 건강 관리자에게 돌려보낸다. 이러한 진단은 진단 실험실에서 수행하거나, 또는 진단 키트를 제조하여 건강 관리자에게 판매하거나 개인이 자가진단할 수 있게 한다.

먼저, 스크리닝 방법에는 관련 HPC2 서열의 증폭이 수반된다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태로, 스크리닝 방법에 비-PCR계 방법을 이용한다. 이러한 스크리닝 방법에는 당업계에 공지되어 있는 2단계 표지 증폭 방법이 포함된다. PCR 및 비-PCR계 스크리닝 방법 모두로 민감성있는 고도의 표적 서열 검출이 가능하다.

오늘날 가장 일반적으로 사용되는 방법은 표적 증폭법이다. 여기서, 표적 핵산 서열은 폴리머라제로 증폭한다. 폴리머라제-지시 증폭법을 이용한 한가지 특히 바람직한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)이다. 이 폴리머라제 연쇄 반응법 및 다른 폴리머라제-지시 증폭 분석법은 폴리머라제-지시 증폭 사이클을 통해 백만배 이상의 카피수 증가가 가능하다. 증폭한 후에는, 결과의 핵산을 서열 결정하거나 DNA 프로브의 기질로 사용한다.

프로브를 표적 서열의 존재 여부 검출에 사용하는 경우(예를 들어, 암 이환성의 스크리닝에서), 혈액 또는 혈청과 같은 분석할 생물 샘플을, 경우에 따라 핵산을 추출 처리를 한다. 이 샘플 핵산은 표적 서열의 검출을 용이하게 하는 다양한 방식, 예를 들어 변성, 제한 절단, 전기영동 또는 도트 블롯팅으로 조제할 수 있다. 분석 핵산의 표적이 되는 영역은 보통 적어도 일부가 단일쇄이어서 프로브의 표적화 서열과 하이브리드를 형성해야 한다. 서열이 자연적으로 단일쇄라면, 변성이 필요없다. 그러나, 서열이 이중쇄인 경우는 아마도 서열을 변성시켜야 할 것이다. 변성은 당업계에 공지된 다양한 기술로 수행할 수 있다.

분석 핵산 및 프로브를 프로브 중의 표적 서열이 분석물중의 추정상 타켓이 되는 서열과 안정한 하이브리드를 형성하도록 하는 조건 하에서 인큐베이션한다. 분석물과 결합하는데 사용된 프로브의 영역은 인간 염색체 17의 표적이 되는 영역과 완전히 상보적인 것으로 만든다. 따라서, 오류 양성 결과를 방지하기 위해서는 고 엄격도 조건이 바람직하다. 그러나, 프로브가 게놈 내의 독특한 염색체의 영역에 상보적인 경우에만 고 엄격도 조건을 사용한다. 혼성화의 엄격도는, 온도, 이온 세기, 기본 조성, 프로브 길이 및 포름아미드의 농도를 비롯한 혼성화 및 세척 과정 중의 다수의 인자에 의해 결정된다. 이들 인자는 예를 들면 문헌 [Maniatis et al., 1982 and Sambrook et al., 1989]에 개괄되어 있다. 특정 환경하에서는, 표적 서열의 검출 수단을 제공하기 위하여 고도의 하이브리드, 예를 들어 삼중쇄, 사중쇄 등을 형성하는 것이 바람직하기도 하다.

필요에 따라, 결과의 하이브리드를 보통, 표지된 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 또는, 프로브를 표지하지 않되, 표지된 리간드와의 특이적 결합을 통해직접 또는 간접적으로 검출할 수 있다. 적당한 표지, 및 프로브 및 리간드의 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 공지의 방법(예, 닉 번역, 랜덤 프라이밍, 또는 키나징)에 의해 포함된 방사활성 표지, 바이오틴, 형광성 원자단, 화학발광성 원자단 (예를 들어, 디옥세탄, 특히 트리거 함유 디옥세탄), 효소, 항체, 골드 나노파티클 등이 있다. 이러한 기본 방법에 대한 변형법도 당업계에 공지되어 있고, 다른 물질들로부터 검출할 하이브리드의 분리를 용이하게 하거나(하고) 표지된 잔기로부터의 신호를 증폭시키는 변형법들이 있다. 다수의 이러한 변형법들이 예를 들어 문헌[Matthews and Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mifflin, 1989], 미국 특허 제4,868,105호 및 유럽 공고 제225,807호에 기재되어 있다.

상기 언급한 바와 같이, 비-PCR계 스크리닝 분석법도 본 발명에서 고려할 수 있다. 이 절차는 핵산 프로브 (또는 정상의 포스포디에스테르를 대체한 메틸포스포네이트 주쇄와 같은 동족체)를 낮은 수준의 DNA 표적에 혼성화하는 것이다. 이 프로브는 프로브에 공유 결합된 효소를 공유 결합이 혼성화의 특이성을 방해하지 않는 정도로는 지닐 수 있다. 이 효소-프러브-접합-표적 핵산 복합체를 자유 프로브 효소 접합체로부터 단리시키고 효소 검출을 위해 기질을 첨가한다. 효소 활성은 발색 또는 형광 검출량의 변화 (감도의 10³내지 10⁶이 증가됨)로서 구한다. 올리고데옥시뉴클레오티드-알칼리성 포스포타제 접합체의 제조 및 혼성화 프로브로서 그의 이용에 관한 예로서 문헌[Jablonski et al., 1986] 참조.

2단계 표지 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이 분석은 작은 리간드 (디곡시게닌, 바이오틴 등)이 HPC2와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브에 부착하는 원리하에 이루어진다. 대립유전자 특이적 프로브도 또한 이 예의 범위에 포함되며 대립유전자 특이적 프로브의 예에는 본 출원의 표 8에 요약된 유발 또는 잠재적 유발 돌연변이를 포괄하는 프로브가 포함된다.

일례로, 핵산 프로브에 부착된 작은 리간드는 항체-효소 접합체에 의해 특이적으로 인식된다. 이 예의 한 실시양태로, 디곡시게닌이 핵산 프로브에 부착된다. 혼성화는 화학발광성 기질에 부착되어 있는 항체-알칼리성 포스파타제 접합체에 의해 검출된다. 이 실시양태에 따른 핵산 프로브의 표지 방법의 예는 Martin et al (1990) 참조. 두번째 예로서, 작은 리간드는 제1 리간드에 특이적으로 복합체를 형성할 수 있는 제2 리간드-효소 접합체에 의해 인식된다. 이 예의 널리 알려진 실시양태는 상호작용에 의한 바이오틴-아비딘형이다. 핵산 프로브의 표지 방법 및 바이오틴-아비딘계 분석법에서의 이들의 이용 방법은 Rigby et al.,(1977) 및 Nguyen et al., (1992) 참조.

또한, 본 발명의 핵산 프로브 분석이 HPC2를 검출할 수 있는 핵산 프로브의 칵테일을 사용하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 세포 샘플 중의 HPC2 존재를 검출하는 한 예로서, HPC2에 상보적인 하나 이상의 프로브를 사용하고 특히 다른 프로브의 개수는 2, 3, 또는 5개의 핵산 프로브 서열이다. 또다른 예로, 환자에서 HPC2 유전자 서열의 돌연변이 여부를 검출하기 위해서는 HPC2에 상보적인 하나 이상의 프로브를 사용하는데, 칵테일은 HPC2에 변형이 있는 환자군에서 동정된 대립유전자-특이적 돌연변이체에 결합할 수 있는 프로브를 포함한다. 이실시양태에서, 임의 수의 프로브를 사용할 수 있으며, 전립선 암의 유발원으로 확인된 주요 유전자 돌연변이에 대응하는 프로브를 포함하는 것이 바람직하다.

이용 방법: 펩티드 진단 및 진단 키트

신생물 질환의 병변을 야생형 HPC2 폴리펩티드의 변경 여부에 기초하여 검출할 수 있다. 이러한 변경은 통상의 기술에 따라 서열 분석하여 결정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 항체 (폴리클로날 또는 모노클로날)을 사용하여 HPC2 펩티드의 상이성 또는 그의 부재를 검출할 수 있다. 항체는 상기 "항체"란에 기재되어 있고 실시예 9 및 10에 제시된 대로 제조할 수 있다. 항체를 야기하고 정제하는 다른 기술들도 당업계에 널리 알려져 있고, 임의 이러한 기술을 선택하여 본 발명에 청구된 조제물들을 만들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태로, 항체는 용액 중에서 HPC2 단백질을 면역침강시킬뿐더러 웨스턴 또는 폴리아크릴아미드 겔의 임뮤노블롯에서 HPC2 단백질과 반응한다. 또다른 바람직한 실시양태로, 면역세포화학적 기술을 이용하여 항체로 파라핀 또는 동결 조직 절편 중의 HPC2 단백질을 검출한다.

HPC2 또는 그의 돌연변이를 검출하는 방법에 관련된 바람직한 실시양태에는 효소 연결 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사면역분석법 (RIA), 면역방사측정분석법 (IRMA) 및 면역효소 분석법 (IEMA) (모노클로날 및(또는) 폴리클로날 항체의 이용을 포함하는 샌드위치 분석법)이 포함된다. 샌드위치 분석법의 예는, 본 명세서에 거명을 통해 포함되며 실시에 12에 예시되어 있는 David et al.의 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호에 기재되어 있다.

이용 방법: 약물 스크리닝

본 발명은 다양한 약물 스크리닝 기술에서 HPC2 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 이용하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다.

이러한 시험법에 사용되는 HPC2 폴리펩티드 또는 단편은 용액중에 자유 상태이거나 고상 지지체에 부착된 상태이거나, 또는 세포 표면에 담지된 상태일 수 있다. 한가지 약물 스크리닝 방법으로, 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 바람직하게는 경쟁적 결합 분석법에 사용한다. 자유 또는 고정 형태의 세포를 표준 결합 분석법에 사용할 수 있다. 예를 들어 HPC2 폴리펩티드 또는 단편과 시험 물질 사이의 복합체 형성 여부를 측정하거나, HPC2 폴리펩티드 또는 단편과 공지된 리간드 사이의 복합체 형성이 시험 물질에 의해 방해되는 정도를 조사할 수 있다.

이렇듯, 본 발명은 시험 물질을 HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계 및 (i) 그 물질과 HPC2 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체 존재 여부 또는 (ii) HPC2 폴리펩티드 또는 단편과 리간드 사이의 복합체 존재 여부를 공지된 방법에 의해 분석하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 경쟁적 결합 분석법에서, HPC2 폴리펩티드 또는 단편은 통상적으로 표지를 한다. 자유 HPC2 폴리펩티드 또는 단편은 단백질:단백질 복합체로 존재하는 것과 분리하고, 자유 (즉, 복합체를 형성하지 않은) 표지의 양이 시험 물질의 HPC2에 대한 결합도 또는 시험 물질의 HPC2:리간드 결합에 대한 방해도의 척도가 된다. 또한, 자유 HPC2가 아니라 결합 HPC2의 양을 측정할 수도 있다. 또한, HPC2가 아니라 리간드를 표지하여 시험 약물의 존재 또는 부재 하에 HPC2에 결합된 리간드 양을 측정할 수도 있다.

또다른 약물 스크리닝 기술로는 HPC2 폴리펩티드에 대한 적당한 결합 친화도를 가지는 화합물의 대량 스크리닝법을 제공하며 이는 Geysen (PCT WO 84/03564)에 상세히 기술되어 있다. 요약하면, 다량의 상이한 소형 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇가지 다른 표면과 같은 고상 기질 상에서 합성하는 것이다. 펩티드 시험 화합물을 HPC2 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 그 다음, 결합 HPC2 폴리펩티드를 당업계에 널리 공지된 방법으로 검출한다.

정제된 HPC2가 상기 약물 스크리닝 기법에 사용되기 위해 플레이트 상에 직접적으로 코팅될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드에 대한 비-중화 항체는 고체상에 HPC2 폴리펩티드를 고정화하기 위한 항체를 포획하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 HPC2 폴리펩티드를 특이 결합할 수 있는 중화 항체가, HPC2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하기 위한 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 사용을 고려해본다. 이 방법에서, 항체는 HPC2 폴리펩티드의 1종 이상의 항원성 결정 부위를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

약물 스크리닝의 또다른 기법은 비기능성 HPC2 유전자를 갖는 숙주 진핵 세포주 또는 세포들(상기 기재)의 사용을 포함한다. 이들 숙주 세포주 또는 세포들은 HPC2 폴리펩티드 수준에 결함이 있다. 숙주 세포주 또는 세포들은 약물 화합물의 존재 하에 증식한다. 숙주 세포들의 증식 속도는 화합물이 HPC2 결함 세포의증식을 조절할 수 있는지를 결정하기 위해 측정된다.

간략히, 폴리펩티드의 활성을 조정하는 물질에 대한 스크리닝 방법은 1종 이상의 시험 물질과 폴리펩티드를 적절한 반응 배지 중에서 접촉시키고, 처리된 폴리펩티드의 활성을 시험하고, 이 활성을 시험 물질(들)로 처리되지 않은 비교가능한 반응 배지 중의 폴리펩티드의 활성과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 처리된 폴리펩티드와 처리되지 않은 폴리펩티드 간의 활성 차이는 관련 시험 물질(들)의 조정 효과를 나타낸다.

활성의 조정에 대해 스크리닝되기 전에, 또는 스크리닝될 뿐만 아니라, 시험 물질들은 예컨대, 효모 2-하이브리드 시스템 중에서 폴리펩티드와 상호작용하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다 (예, Bartel et al., 1993; Fields and Song, 1989; Chevray and Nathans, 1992; Lee et al., 1995). 이 시스템은 폴리펩티드의 활성을 조정하는 실제 능력에 대한 물질을 시험하기 전에 대략적인 스크리닝으로서 사용될 수 있다. 이와는 달리, 스크린이 HPC2 특이 결합 파트너에 결합하는 시험 물질을 스크리닝하는 데에, 또는 HPC2 폴리펩티드의 모방체를 찾는 데에 사용될 수 있다.

사용 방법: 합리적인 약물 디자인

합리적인 약물 디자인의 목적은, 예를 들면 더욱 활성이거나 또는 안정한 형태의 폴리펩티드이거나, 또는 생체 내에서 폴리펩티드의 기능을 강화 또는 간섭하는 약물을 제조하기 위해, 목적하는 생물학적 활성 폴리펩티드 또는 이들과 상호작용하는 소 분자(예, 아고니스트, 길항제, 억제제)의 구조적 유사체를 제조하는 것이다 (예를 들면, Hodgson, 1991 참고). 하나의 접근법으로, 우선 목적하는 단백질 (예, HPC2 폴리펩티드) 또는 예를 들면, HPC2-수용체 또는 리간드 복합체의 3차원 구조를 x-선 결정학, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로 이들의 조합에 의해 결정한다. 이보다는 덜하지만, 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보가 상동성 단백질의 구조에 기초한 모델링에 의해 수득될 수 있다. 합리적인 약물 디자인의 일례로는 HIV 프로테아제 억제제의 개발이 있다 (Erickson et al., 1990). 또한, 펩티드 (예, HPC2 폴리펩티드)는 알라닌 스캔에 의해 분석된다 (Wells, 1991). 이 기법에서는, 아미노산 잔기가 Ala로 대체되고, 펩티드 활성에 대한 그 효과가 측정된다. 펩티드의 각 아미노산 잔기가 이러한 방법으로 분석되어 펩티드의 중요한 영역이 결정된다.

기능 분석법에 의해 선택된 표적-특이 항체를 단리한 다음 그 결정 구조를 해석하는 것 또한 가능하다. 원칙상, 이러한 접근법은 후속 약물 디자인이 기초할 수 있는 파마코어(pharmacore)를 생성한다. 항-이디오프형 항체 (안티-이드, anti-ids)를 생성함으로써, 단백질 결정학이 전체적으로 기능적이고 제약적 활성인 항체로 우회할 수 있다. 거울상의 거울상으로서 안티-이드의 결합 부위가 원래의 수용체의 유사체인 것으로 기대될 것이다. 이어서, 안티-이드는 화학적 또는 생물학적으로 생성된 펩티드 뱅크의 뱅크로부터 펩티드를 확인 및 단리하는 데 사용될 수 있다. 선택된 펩티드는 이어서, 파마코어로서 작용할 것이다.

따라서, 예컨대 개선된 HPC2 폴리펩티드 활성 또는 안정성을 갖거나, 또는 HPC2 폴리펩티드 활성의 억제제, 아고니스트, 길항제 등으로서 작용하는 약물을 디자인할 수 있다. 클로닝된 HPC2 서열의 이용가능성 때문에, 충분한 양의 HPC2 폴리펩티드가 x-선 결정학과 같은 분석적 연구를 수행하는 데 이용될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공된 HPC2 단백질 서열의 지식은 x-선 결정학 대신에 또는 그 외에 컴퓨터 모델링 기법을 사용하는 것들을 다룰 수 있다.

폴리펩티드 활성을 조정하거나 이에 영향을 미치는 물질이 확인된 후, 더 조사될 수 있다. 또한, 약제, 제약 조성물 또는 약물과 같은 조성물, 또는 제제, 즉 제품 또는 제형을 제조하고(하거나) 이에 사용될 수 있다. 이들은 또한 개체에게 투여될 수 있다.

즉, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 바에 따라 폴리펩티드 활성의 조정제로서 핵산 분자를 사용하여 확인된 물질 뿐만 아니라, 상기 물질을 포함하는 제약 조성물, 약제, 약물 또는 기타 조성물, 상기 물질을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 방법, 예를 들면, 전립선암의 치료를 위해 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법, 예를 들면, 전립선암의 치료를 위한 투여용 조성물 제조시 상기 물질의 용도, 및 상기 물질과 제약적으로 허용가능한 부형제, 비히클 또는 캐리어 및 임의의 기타 성분들을 혼합하는 것을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법까지 다양한 양태로 확대된다.

폴리펩티드 기능 조정제로서 확인된 물질은 본질상 펩티드 또는 비-펩티드일 수 있다. 비-펩티드 "소 분자"는 종종 많은 생체 내 제약적 용도에 바람직하다. 따라서, 상기 물질(특히 펩티드)의 모방체 또는 모조체가 제약적 용도를 위해 디자인될 수 있다.

공지된 제약적 활성 화합물에 대한 모방체의 디자인은 "리드(lead)" 화합물에 기초한 제약의 개발에 대한 공지된 접근법이다. 이는 활성 화합물을 합성하는 것이 어렵거나 또는 고가인 경우, 또는 특정 투여 방법에 적절하지 않은 경우(예를 들면 순수한 펩티드는 소화관에서 프로테아제에 의해 급속히 분해되는 경향이 있기 때문에 경구 조성물을 위한 활성제로서 적절하지 않음)에 바람직하다. 모방체 디자인, 합성 및 시험은 표적 특성에 대해 다수의 분자를 무작위로 스크리닝하는 것을 피하기 위해 일반적으로 사용된다.

주어진 표적 특성을 갖는 화합물로부터 모방체의 고안시 통상 몇 가지 단계가 취해진다. 우선, 표적 특성을 측정하기에 결정적이고(이거나) 중요한 화합물의 특정 부분이 측정된다. 펩티드의 경우, 이는 펩티드의 아미노산 잔기를 체계적으로 변화시킴으로써, 예컨대 각 잔기를 차례로 치환함으로써 이루어질 수 있다. 펩티드의 알라닌 스캔은 통상 이러한 펩티드 모티프(motif)를 정제하는 데 사용된다. 화합물의 활성 영역을 구성하는 이들 부분 또는 잔기들은 그것의 "파마코포어 (pharmacophore)"로서 공지되어 있다.

일단 파마코포어가 발견되면, 그 구조는 그 물리적 특성, 예컨대 입체화학성, 결합, 크기 및(또는) 전하에 따라, 기초 자료 범위로부터의 데이터, 예를 들면, 분광법, x-선 회절 데이터 및 NMR을 사용하여 모델링된다. 컴퓨터사용 분석, 유사성 지도화(원자들간의 결합보다는 파마코포어의 전하 및(또는) 부피를 모델링함) 및 기타 기법이 상기 모델링 공정에 사용될 수 있다.

이 접근법의 변형으로, 리간드 및 그 결합 파트너의 3차원 구조가 모델링된다. 이는 리간드 및(또는) 결합 파트너가 결합 상의 구조를 변경하여, 모델이 모방체의 디자인에서 이것을 인식하도록 하는 데 특히 유용할 수 있다.

이어서, 파마코포어를 모방하는 화학적 기가 이식될 수 있는 주형 분자가 선택된다. 주형 분자 및 거기에 이식된 화학적 기는, 리드 화합물의 생물학적 활성은 유지하면서, 모방체가 합성하기 쉽고, 제약적으로 허용가능하고, 생체 내에서 분해되지 않도록 용이하게 선택될 수 있다. 이와는 달리, 모방체가 펩티드-기재인 경우, 펩티드를 고리화함으로써 그 강직성을 증가시켜 추가의 안정성이 성취될 수 있다. 이 접근법에 의해 발견된 모방체(들)은 이들이 표적 특성을 갖고 있는지 여부를 조사하기 위해, 또는 이들이 특성을 어느 정도까지 나타내는지를 조사하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 추가의 최적화 또는 변형이 생체내 또는 임상 시험을 위한 1종 이상의 최종 모방체에 도달하도록 수행될 수 있다.

사용 방법: 유전자 치료요법

본 발명에 따라서, 돌연변이 HPC2 대립유전자를 가진 세포로 야생형 HPC2 기능을 공급하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 기능을 공급하는 것은 수용 세포의 신생물 성장을 억제해야 한다. 야생형 HPC2 유전자 또는 그 유전자의 부분은 벡터로 세포내로 도입되어 유전자가 염색체외에 남아 있도록 할 수 있다. 이러한 상황에서, 유전자는 염색체외 위치로부터 세포에 의해 발현될 것이다. 유전자 단편이 돌연변이 HPC2 대립유전자를 가진 세포내로 도입되고 발현된다면, 유전자 단편은 세포의 비신생물 성장에 필요한 HPC2 단백질의 부분을 코딩해야 한다. 더 바람직하게는, 세포내에 존재하는 내생성 돌연변이 HPC2 유전자와 재조합되는 방법으로야생형 HPC2 유전자 또는 그의 부분이 돌연변이 세포내로 도입된다. 이러한 재조합은 HPC2 유전자 돌연변이를 바로잡는 이중 재조합을 필요로 한다. 재조합 및 염색체외 유지 모두를 위한 유전자 도입용 벡터는 당분야에 공지되어 있으며, 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 전기천공법, 인산칼슘 공침전 및 바이러스 형질도입과 같은 세포내로의 DNA 도입 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 방법의 선택은 실행자의 능력내에 있다. 야생형 HPC2 유전자에 의해 형질전환된 세포는 암 관해 및 이러한 관해를 촉진하는 약물 치료를 연구하기 위한 모델 시스템으로서 사용될 수 있다.

일반적으로 위에서 언급한 바와 같이 HPC2 유전자 또는 단편은 암 세포에 존재하는 이러한 유전자의 발현 생성물의 양을 증가시키기 위해 유전자 치료요법 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 유전자 치료요법은 특히 암성 및 예비암성 세포 모두에 사용하기에 적절하며, 여기서 HPC2 폴리펩티드는 존재하지 않거나, 또는 그의 수준은 정상 세포와 비교하여 감소되어 있다. 이는 또한 돌연변이 유전자가 "정상" 수준으로 발현된 종양 세포에서 주어진 HPC2 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 유용할 수 있으나, 유전자 생성물은 충분히 기능하지 않는다.

유전자 치료요법은 일반적으로 허용되는 방법, 예를 들어 프리드만 (Friedman, 1991) 또는 쿨버 (Culver, 1996)에 의해 기재된 바에 따라서 수행될 것이다. 환자의 종양으로부터 얻은 세포는 먼저 상기 기재된 진단 방법에 의해 분석되어 종양 세포에서 HPC2 폴리펩티드의 생성을 확인할 것이다. 조절 요소를 발현시키는 것과 관련된 HPC2 유전자의 복사본을 함유하고 종양 세포 내부에서 복제될수 있는 바이러스 또는 플라스미드 벡터 (하기 더 상세히 기재된 것을 참조)가 제조된다. 이와는 달리, 벡터는 복제하기 부적당할 수 있으며, 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 헬퍼 세포에서 복제된다. 적합한 벡터는 미국 특허 제5,252,479호 및 PCT 공개 출원 WO 93/07282호 및 미국 특허 제5,691,198호; 제5,747,469호; 제5,436,146호 및 제5,753,500호에 기재된 바와 같이 공지되어 있다. 그 후, 벡터는 환자에게 종양 부위에 국소적으로 또는 (다른 부위로 전이될 수 있는 임의의 종양 세포에 도달하기 위해) 전신적으로 주사된다. 형질감염된 유전자가 영구히 표적 종양 세포 각각의 게놈내로 혼입되지 않는다면 치료는 정기적으로 반복되어야 할 것이다.

당분야에 공지된 유전자 전달 시스템은 본 발명의 유전자 치료요법 방법의 실행에 유용할 수 있다. 이들에는 바이러스 및 비바이러스 전달 방법이 포함된다. 파포바바이러스, 예를 들어 SV40 (Madzak et al., 1992), 아데노바이러스 (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson and Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998), 백시니아 바이러스 (Moss, 1992; Moss, 1996), 아데노-관련 바이러스 (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell and Hirata, 1998), HSV 및 EBV를 포함하는 헤르페스 바이러스 (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield and Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996), 렌티바이러스 (Naldini et al., 1996), 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스 (Sindbis and SemlikiForest virus) (Berglund et al., 1993), 및 아비안 (avian)의 레트로바이러스 (Bandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), 마우스 (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988), 및 인간 유래 (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992) 바이러스를 포함하는 많은 바이러스가 유전자 전달 벡터로서 사용되어 왔다. 대부분의 인간 유전자 치료요법 프로토콜은 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스가 또한 사용되고 있지만, 무능력 마우스 레트로바이러스에 기초하고 있다.

당분야에 공지된 비바이러스 유전자 전달 방법에는 인산칼슘 공침전과 같은 화학적 기법 (Graham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); 기계적 기법, 예를 들어 미세주사 (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Costantini and Lacy; 1981); 리포솜을 통한 막융합-매개 전달 (Felgner et al., 1987; Wang and Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991); 및 직접 DNA 흡수 및 수용체-매개 DNA 전달 (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992)이 포함된다. 바이러스-매개 유전자 전달은 리포솜 전달법을 이용하여 생체 내 직접 유전자 전달 후, 둘러싸고 있는 비분할 세포내로가 아닌 종양 세포로 바이러스 벡터를 직접 전달하는 것과 동시에 행해질 수 있다. 이와는 달리, 레트로바이러스 벡터 생산 세포주는 종양내로 주사될 수 있다 (Culver et al., 1992). 그 후, 생산 세포의 주사는 벡터 입자의 계속적 공급원을 제공할 것이다. 이 기법은 수술불가능한 뇌 종양이 있는 사람에게 사용되도록 승인되었다.

생물학적 및 물리적 유전자 전달 방법을 조합한 접근법에서, 임의의 크기의 플리스미드 DNA는 아데노바이러스 헥손 단백질에 특이적인 폴리리신-접합 항체와 합쳐지며, 생성된 복합체는 아데노바이러스 벡터와 결합한다. 그 후, 3분자 복합체는 세포를 감염시키는 데 사용된다. 아데노바이러스 벡터는 커플링된 DNA가 손상되기 전에 엔도솜의 효과적 결합, 내부화 및 분해를 허용한다. 벡터 기재 아데노바이러스 전달을 위한 다른 기법은 문헌 [Schneider et al., 1998] 및 미국 특허 제5,691,198호; 5,747,469호; 제5,436,146호 및 제5,753,500호를 참조한다.

리포솜/DNA 복합체는 생체 내 직접 유전자 전달을 매개할 수 있는 것으로 나타났다. 표준 리포솜 제조에서 유전자 전달 방법은 비특이적인 반면, 국소화 생체 내 흡수 및 발현은 예를 들어 하기 그 위치에서의 직접 투여 후 종양 침전물에 보고되어 있다 (Nabel, 1992).

본 명세서의 유전자 치료요법에서 발현 벡터는 그 안에 클로닝되어 있는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기에 충분한 서열을 함유하는 제작물을 포함하는 것을 의미한다. 바이러스 발현 벡터에서, 제작물은 제작물의 패키징을 지지하기에 충분한 바이러스 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 HPC2를 코딩한다면 발현되어 HPC2를 생성할 것이다. 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임을 코딩한다면 발현되어 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임을 생성할것이다. 따라서, 여기에서 발현은 단백질 생성물이 합성되는 것을 필요로 하지 않는다. 발현 벡터내로 클로닝된 폴리뉴클레오티드외에, 벡터는 또한 진핵세포에서 기능하는 프로모터를 포함한다. 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열은 이 프로모터의 조절하에 있다. 적합한 진핵세포 프로모터에는 상기 기재되어 있는 것들이 있다. 발현 벡터는 또한 선택적 마커와 같은 서열 및 본 명세서에 기재된 다른 서열을 포함한다.

전립선 조직, 예를 들어 전립선의 상피 세포에 직접 DNA를 표적화하는 유전자 전달 기법이 바람직하다. 예를 들어, 수용체-매개 유전자 전달은 폴리리신을 통한 단백질 리간드로의 DNA의 접합 (대개 공유결합으로 닫힌 슈퍼코일 플라스미드의 형태)에 의해 성취된다. 리간드는 표적 세포/조직 유형의 세포 표면상에 상응하는 리간드 수용체의 존재에 기초하여 선택된다. 적절한 수용체/리간드 쌍중 하나에는 에스트로겐 수용체 및 그의 리간드인 에스트로겐 (및 에스트로겐 유사체)이 포함될 수 있다. 이들 리간드-DNA 접합체는 필요하다면 혈액중에 직접 주사될 수 있으며, DNA-단백질 복합체의 수용체 결합 및 내부화가 일어나는 표적 조직에 직접 주사될 수 있다. DNA의 세포내 붕괴의 문제점을 극복하기 위해, 아데노바이러스에 의한 공감염에는 엔도솜 기능을 방해하는 것이 포함될 수 있다.

치료요법은 단독으로 또는 함께 수행될 수 있는 두 단계를 포함한다. 제1 단계에서, HPC2 감수성 대립유전자를 가진 사춘기전 여성은 유전자 전달 비히클로 처리되어 그의 유선관 상피세포 전구체 세포의 일부 또는 모두가 기능적 정상 HPC2 대립유전자의 하나 이상의 추가 복사본을 받는다. 이 단계에서, 처리된 개체는 감수성 대립유전자의 영향이 정상 대립유전자의 존재에 의해 배제되는 정도로 전립선 암의 위험을 감소시켰다. 예방 치료요법의 제2 단계에서, 소인(素因)성 젊은 여성, 특히 제안된 유전자 치료학적 처리를 받는 여성은 전체 임신 기간중의 전립선에 대한 영향을 모방하기 위해 호르몬 치료요법을 받는다.

사용 방법: 펩티드 치료요법

HPC2 활성이 있는 펩티드는 돌연변이체 또는 결손 HPC2 대립유전자를 가진 세포에 공급될 수 있다. 단백질은 세균에서 cDNA 서열의 발현에 의해, 예를 들어 공지된 발현 벡터를 이용하여 생성될 수 있다. 이와는 달리, HPC2 폴리펩티드는 HPC2-생성 포유동물 세포로부터 추출될 수 있다. 또한, 합성 화학의 기법이 HPC2 단백질을 합성하는 데 이용될 수 있다. 이러한 임의의 기법은 HPC2 단백질을 포함하는 본 발명의 제조를 제공할 수 있다. 제조에는 실질적으로 다른 인간 단백질이 없다. 이는 가장 쉽게는 미생물 또는 시험관 내에서 합성함으로써 성취된다.

활성 HPC2 분자는 미세주사에 의해 또는 예를 들어 리포솜을 사용함으로써 세포내로 도입될 수 있다. 이와는 달리, 몇몇 활성 분자는 능동적으로 또는 확산에 의해 세포에 의해 흡수될 수 있다. HPC2 유전자 생성물의 세포외 적용은 종양 성장에 영향을 주기에 충분할 수 있다. HPC2 활성이 있는 분자를 제공하는 것은 신생물 상태의 부분적 반전을 유도해야 한다. HPC2 활성이 있는 다른 분자 (예, 펩티드, 약물 또는 유기 화합물)는 또한 이러한 반전에 영향을 주는 데 사용될 수 있다. 실질적으로 유사한 기능을 가진 변형된 폴리펩티드가 또한 펩티드 치료요법에 사용된다.

이용 방법: 형질전환된 숙주

유사하게, HPC2 대립유전자를 갖고 있는 세포 및 동물을 치료제로서 가능성이 있는 물질을 연구하고 시험하기 위한 모델계로서 이용할 수 있다. 이 세포는 전형적으로 배양된 상피 세포이다. 이들은 HPC2 돌연변이를 갖는 개체로부터 체세포 또는 생식세포에서 단리할 수 있다. 별법으로, 세포주를 상기한 바와 같이 HPC2 대립유전자에서 돌연변이를 갖도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 시험 물질을 세포에 도포한 후에, 세포의 종양성으로 형질전환된 표현형을 결정하였다. 앵커리지-비의존성 성장, 누드마우스에서의 종양형성, 세포의 침습성 및 성장 인자 의존성을 포함한, 종양성으로 형질전환된 세포의 임의의 속성을 평가할 수 있다. 이러한 각 속성에 대한 분석은 당업계에 공지되어 있다.

치료제 시험용 동물은 전체 동물의 돌연변이 유발 후 또는 생식세포 또는 자이고트의 처리 후 선택할 수 있다. 이러한 처리는 일반적으로 제2 동물종으로부터의 돌연변이체 HPC2 대립유전자의 삽입 뿐만 아니라, 파괴된 상동 유전자의 삽입을 포함한다. 별법으로, 동물의 내인성 HPC2 유전자(들)는 삽입 또는 결손 돌연변이나, 통상의 기술[Capecchi, 1989; Valancius and Smithies, 1991; Hasty 등, 1991; Shinkai 등, 1992; Mombaerts 등, 1992; Philpott 등, 1992; Snouwaert 등, 1992; Donehower 등, 1992]을 이용하는 다른 유전자 변형에 의해 파괴되어 넉아웃 또는 자리이동 동물을 생산할 수 있다. 자리이동은 내인성 유전자가 치환되기 때문에 넉아웃과 유사하지만, 자리이동의 경우에 있어서 치환은 동일한 유전자의 또다른 버전에 의한 것이다. 시험 물질을 동물에게 투여한 후, 종양의 성장을 평가해야한다. 시험 물질이 종양의 성장을 방지하거나 억제하면, 이 시험 물질은 본원에서 확인된 암 치료용의 후보 치료제이다. 이들 동물 모델은 잠재적인 치료 제품을 위한 매우 중요한 시험 비히클을 제공한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 기능성 HPC2 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 코딩하는 기능성 형질전환체를 함유하는 형질전환 동물을 생산한다.HPC2형질전환체를 발현하는 형질전환 동물, 이러한 동물로부터 유도된 재조합 세포주 및 형질전환 배아는 HPC2의 기능을 유발하거나 억제하는 약제를 스크리닝하고 확인하는 방법에 유용할 것이다. 본 발명의 형질전환 동물은 또한 질병과 같은 징후를 연구하기 위한 모델로서 사용할 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서,HPC2형질전환체를 비-인간 숙주에 도입시켜 인간 또는 쥐HPC2유전자를 발현하는 형질전환 동물을 제공한다. 형질전환 동물은 형질전환체의 발현을 허용하는 방식으로 형질전환체를 게놈으로 통합시켜 생산한다. 형질전환 동물을 생산하는 방법은 일반적으로 바그너(Wagner)와 호프(Hoppe) [미국 특허 제4,873,191호; 본원에서 참고자료로 포함함], 브린스터(Brinster) 등[1985; 본원에서 전체를 참고자료로 포함함] 및 문헌["Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual" 2판 (eds., Hogan, Beddington, Costantimi and Long, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; 본원에서 전체를 참고자료로 포함함)]에 의해 기술되었다.

내인성HPC2를 형질전환체와 내인성 유전자 사이의 동종 재조합에 의해 치환하거나; 또는 내인성 유전자를 "넉-아웃" 동물의 제조에서와 같이 결손에 의해 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 통상적으로, 게놈 서열에 의해 플랭킹된HPC2유전자는 마이크로주입에 의해 수정란으로 전달한다. 마이크로주입된 수정란을 암컷 숙주에게 이식하고, 자손을 형질전환체의 발현에 대해 스크리닝한다. 형질전환 동물은 파충류, 양서류, 조류, 포유류 및 어류을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 동물의 수정란으로부터 생산할 수 있다. 특히 바람직한 실시태양 내에서, HPC2를 과발현하거나 또는 폴리펩티드의 돌연변이체형을 발현하는 형질전환 마우스를 생성한다. 별법으로, "넉-아웃" 마우스에서HPC2의 부재는 생체내 세포에 대해 HPC2 단백질의 손실이 갖는 영향의 연구를 가능하게 한다. 넉-아웃 마우스는 또한 HPC2-관련 암의 진전의 모델을 제공한다.

넉아웃 동물을 생산하는 방법은 일반적으로 샤스트리(Shastry, 1995, 1998) 및 오스테리더(Osterrieder)와 울프(Wolf)(1998)의 문헌에 기재되어 있다.목적하는 시간에 넉아웃될 때까지는 유전자가 활성인 조건화 넉아웃 동물의 생산은 일반적으로 페일(Feil) 등(1996), 제네튼(Gagneten) 등(1997), 및 로브(Lobe)와 내기(Nagy) (1998)의 문헌에 기재되어 있다. 이들 각 참고문헌은 본원에서 참고자료로 포함한다.

상기한 바와 같이, 형질전환 동물과 이러한 동물에서 유도된 세포주는 특정 시험 실험에서 사용할 수 있다. 이 점에서, 야생형 또는 돌연변이체HPC2를 발현할 수 있는 형질전환 동물과 세포주를 시험 물질에 노출시킬 수 있다. 이들 시험 물질은 야생형HPC2의 과발현을 감소시키거나 또는 돌연변이체HPC2의 발현 또는 기능을 손상시키는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다.

제약 조성물 및 투여 경로

본 발명의 HPC2 폴리펩티드, 항체, 펩티드 및 핵산은 통상의 제약 조제 기술에 따라 제조되는 제약 조성물로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA)]을 참조하시오. 조성물은 활성제 또는 활성제의 제약학상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 활성 물질들 중 하나 이외에 제약학상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업계에 잘 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 저해해서는 안된다. 담체는 예를 들어 정맥내, 경구, 척수강내, 신경궁 또는 비경구 등의 투여에 적합한 제제형에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다.

경구 투여용으로, 상기 화합물을 캡슐제, 환약, 정제, 로젠지제, 용해물, 분말제, 현탁액제 또는 에멀젼제와 같은 고상 또는 액상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여형 조성물을 제조하는데 있어서, 경구 액상 제제 (예를 들어, 현탁액제, 엘릭시르제 및 용액제)의 경우에는 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 방부제, 착색제, 현탁제 등과 같은 통상의 제약학적 매질 중 임의의 것을 사용할 수 있거나; 또는 경구 고상 제제 (예를 들어, 분말제, 캡슐제 및 정제)의 경우에는 녹말, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체를 사용할 수 있다. 투여의 용이함 때문에 정제 및 캡슐제가 가장 유리한 경구 투여 단위형이며, 이 경우 고상 제약학적 담체를 명백하게 사용한다. 필요에 따라, 정제는 표준 기술에 의해 당 코팅하거나 또는 장용피 코팅할 수 있다. 활성제는 안정한 상태로위장관을 통해 통과하는 동시에 혈액 뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 캡슐화시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 제96/11698호를 참조하시오.

비경구 투여용으로, 상기 화합물을 제약학적 담체 중에 용해시켜 용액제 또는 현탁액제로서 투여할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 물, 염수, 덱스트로스 용액, 프룩토오스 용액, 에탄올, 또는 동물성유, 식물성유 또는 합성유 등의 오일이 있다. 상기 담체는 또한 예를 들어 방부제, 현탁제, 용해제, 완충제 등과 같은 다른 성분들을 포함할 수 있다. 상기 화합물을 척수강 내로 투여하는 경우, 화합물을 또한 뇌척수액 중에 용해시킬 수 있다.

활성제는 바람직하게는 치료 유효량으로 투여한다. 실제 투여량과 투여 속도 및 투여 경과 시간은 치료할 질환의 특성과 심각도에 따라 좌우된다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약량, 시기 등에 대한 결정은 일반 개업의나 전문의의 책임 하에 있으며, 전형적으로 치료하고자 하는 장애, 환자 개인의 상태, 수송 부위, 투여 방법과 개업의에게 공지된 그 외의 요인을 고려하여 이루어진다. 기술과 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.

별법으로, 항체 또는 세포 특이적 리간드와 같은 표적계를 사용함으로써 상기 활성제를 특정 유형의 세포에 보다 특이적으로 수송하는 표적 치료 요법이 사용될 수 있다. 표적법은 많은 이유에서, 예를 들어 약제가 허용불가능하게 유독성이거나, 또는 달리 너무 많은 투약량을 필요로 하거나, 또는 달리 표적 세포 내로 들어갈 수 없는 경우에 바람직할 수 있다.

이들 약제를 직접 투여하는 대신, 표적 세포 내에서, 예를 들면 상기한 바와같은 바이러스 벡터에서 또는 환자에게 이식하도록 고안된 미국 특허 제5,550,050호와 PCT 특허 출원 공개 제92/19195호, 동 제94/25503호, 동 제95/01203호, 동 제95/05452호, 동 제96/02286호, 동 제96/02646호, 동 제96/40871호, 동 제96/40959호 및 동 제97/12635호에 기재된 바와 같은 세포 기재 수송계에서 생산시킬 수 있다. 상기 벡터는 치료하고자 하는 특정 세포에 표적화시킬 수 있거나, 또는 표적 세포에 대하여 보다 조직 특이적인 조절 성분을 함유할 수 있다. 세포 기재 수송계는 환자의 체내에 원하는 표적 부위에 이식되도록 고안되며, 활성제에 대한 코딩 서열을 함유한다. 별법으로, 상기 약제는 치료하려는 세포 내에서 생산되거나 이 세포로 표적화된 활성제에 의해 활성형으로 전환되도록 전구체 형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제425,731A호와 국제 특허 공개 제90/07936호를 참조하시오.

HPC2 유전자 돌연변이와 전립선 암 사이의 연관성을 확인함으로써 전립선 암의 발병 위험이 있는지 확인하기 위해 개체를 일찍 증상발현전에 스크리닝할 수 있게 되었다. 이러한 개체를 확인하기 위해, HPC2 대립유전자를 돌연변이에 대해 직접 또는 대립유전자를 클로닝한 후 스크리닝한다. 이들 대립유전자를 정상 대립유전자와의 핵산 서열 차이의 존재에 대해 하기 방법들 중 하나를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 기술을 이용하여 시험한다: 형광 적소 혼성화 (fluorescentin situhybridization; FISH), 직접 DNA 시퀀싱, PFGE 분석법, 서던 블롯(Southern blot) 분석법, 단쇄 형태 분석법(single stranded conformation analysis; SSCP), 결합 분석법, RNase 보호 분석법, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO), 도트 블롯(dot blot) 분석법과 PCR-SSCP 분석법. 최근에 개발된 기술인 DNA 마이크로칩 기술도 또한 유용하다. 예를 들어, (1) 클로닝된 대립유전자 및 정상 HPC2 유전자 또는 적절한 단편 (코딩 서열 또는 게놈 서열) 모두의 뉴클레오티드 서열을 결정한 후 비교하거나, 또는 (2) HPC2 유전자 또는 유전자 단편의 RNA 전사체를 검사하고자 하는 개체로부터 얻은 단쇄의 전체 게놈 DNA에 혼성화시키고, 이렇게 하여 얻은 헤테로듀플렉스를 리보뉴클레아제 A (RNase A)로 처리하고 변성 겔 상에서 전개시켜 임의의 미스매치 위치를 검출한다. 이들 두 방법은 하기 절차에 따라 수행할 수 있다.

시험하고자 하는 개체에서 HPC2 유전자의 대립유전자를 통상의 기술을 이용하여 클로닝한다. 예를 들어, 개체로부터 혈액 샘플을 취한다. 이 샘플 내의 세포에서 단리한 게놈 DNA를 평균 단편 크기가 대략 20 kb가 되도록 부분적으로 소화시킨다. 18 내지 21 kb 범위의 단편이 단리된다. 이렇게 하여 얻은 단편을 적절한 벡터 내에 결찰시킨다. 이어서 클론의 서열을 결정하고 정상HPC2유전자와 비교한다.

별법으로,HPC2유전자의 5 구역 또는 엑손에 대한 프라이머 쌍을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCRs)을 수행한다. PCR은 또한 정상HPC2유전자의 임의의 서열에 기초한 프라이머 쌍을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 인트론 중 하나에 대한 프라이머 쌍을 제조하여 사용할 수 있다. 마지막으로, mRNA에 대해 RT-PCR을 또한 수행할 수 있다. 이어서 증폭된 산물을 임의의 차이를 확인하기 위해 종래의 기술을 이용하여 단쇄 형태 다형성(SSCP)에 의해 분석한 다음, 이들을 시퀀싱하여 정상 유전자 서열과 비교하였다.

개체들을, 적합한 프라이머 쌍을 사용하여 개체의 DNA를 증폭시키고 증폭 산물을 예를 들면 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 도트-블롯 혼성화에 의해 분석함으로써 통상의HPC2유전자 변이체에 대해 신속하게 스크리닝할 수 있다.

제2법에서는 정상HPC2유전자와 불완전 유전자 사이의 차이를 검출하는 것을 돕기위해 RNase A를 사용한다. 이러한 비교는 프로브로서HPC2유전자의 작은 (∼500 bp) 제한 단편을 사용하여 단계별로 수행한다. 먼저,HPC2유전자를 유전자 서열을 대략 500 bp의 단편으로 절단시키는 제한 효소(들)로 소화시킨다. 이들 단편을 전기영동 겔 상에서 분리하고 겔로부터 정제하여 개별적으로 SP6 벡터 (예를 들면 pSP64 또는 pSP65) 내로 양 방향으로 모두 클로닝시킨다.HPC2유전자 단편의 인서트를 함유하는 SP6-기재 플라스미드를 [α-³²P]GTP의 존재 하에 당업계에 잘 알려진 SP6 전사계를 이용하여 시험관 내에서 전사시켜, 유전자의 양 스트랜드 모두의 방사선표지 RNA 전사체를 생산한다.

개별적으로, 이들 RNA 전사체를 사용하여 종래의 기술을 이용하여 대립유전자 DNA와의 헤테로듀플렉스를 형성한다.HPC2단편과 개체로부터의HPC2대립유전자 서브클론 사이의 서열 차이로 인해 RNA:DNA 헤테로듀플렉스에서 발생하는 미스매치 때문에 RNase A로 처리하면 RNA 스트랜드가 절단된다. 이러한 미스매치는 개체의 대립유전자 내에서의 위치 지정 돌연변이 또는 약간의 결손의 결과일 수 있다. RNA 스트랜드의 절단으로 2개 이상의 작은 RNA 단편들이 형성되고, 이들은 변성 겔 상에서 RNA 프로브 자체보다 더 빨리 전개될 것이다.

발견된 임의의 차이는 개체가HPC2의 분자 변이체를 갖는 것으로 확인할 것이다. 이들 변이체는 많은 형태를 취할 수 있다. 가장 심한 형태는 유전자가 비정상 단백질을 코딩하도록 하거나, 또는 단백질 발현을 유의하게 변형시킬 수 있는 프레임시프트 돌연변이 또는 대규모 결손일 것이다. 보다 덜 심한 파괴적 돌연변이는 생산된 단백질에 유의한 영향을 끼칠 수 있는 소규모 프레임내 결손 및 비보존적 염기쌍 치환, 예를 들면 시스테인 잔기로의 변화 또는 그로부터의 변화, 염기성 아미노산에서 산성 아미노산으로의 변화 또는 그 반대, 소수성 아미노산에서 친수성 아미노산으로의 변화 또는 그 반대, 또는 2차 또는 3차 단백질 구조에 악영향을 끼칠 다른 돌연변이를 포함할 것이다. 침묵 돌연변이나 보존적 아미노산 치환을 일으키는 돌연변이는 일반적으로 단백질 기능을 파괴할 것으로 예상되지 않을 것이다.

유전학적 시험은 당업자가 개체들이 출생시 또는 심지어 출생 이전에 전립선암의 위험이 있는지 확인할 수 있게 할 것이다. 이들 간질의 증상발현전 진단은 이들 장애의 예방을 가능하게 할 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱더 상세히 설명되는데, 이 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하지 않는다. 당해 분야에 잘 알려진 표준 기법 또는 하기에 구체적으로 기술된 기법을 이용한다.

〈실시예 1〉

HPC2의 유전적 위치결정

전립선 암 감수성 유전자좌의 위치를 결정하기 위해 고 위험 전립선 암 가계 어셈블리를 유타주에서 1990년 이후 수집했다. 1996년 2월, 가계의 하위 집합에 대해 수행한 게놈 스캔으로부터 얻은 데이터를 연관성 분석한 결과 염색체 17 p상에서 마커와의 연관성에 대한 증거를 인식했다. 더 큰 가계에서 염색체 17p의 영역에서 더 많은 마커의 후속 분석은 감수성 유전자에 대한 강력한 연관성에 대한 증거를 유도했다.

염색체 17p 2지점 연관성 증거
마커	17 지도 위치	불균질성 로드 점수
D17S786	20.0	4.21
Myr0022	25.5	3.99
Myr0088	27.0	3.46
DI7S947	31.6	2.32
Myr0084	31.9	3.02
Myr0079	32.0	0.99
D17S805	43.6	2.25

염색체 17p에 대해 강력한 연관성 증거를 가진 특정 가계에 대한 연구로부터 가계에서 전립선암 케이스에 의해 공유된 염색체 17p의 최소 유전 조각을 확인함으로써 감수성 유전자좌에 대한 가장 가능성있는 영역을 정의할 수 있다. 최소한의 유전공학적으로 정의된 영역은 가계 4325에서 텔로머성 재조합 및 가계 4320에서 센트로머성 재어셈블리를 기초로 한다. 가계 4325는 초기 개시 전립선 암 케이스의 동포군으로부터 확인되었다. 이 가계에 6명의 감염된 형제가 있으며, 그중 한명은 아들이 감염되었다. 6명의 감염된 형제중 5명, 및 감염된 아들은 모두 마커 myr0065 밑의 어느 곳에서부터 아래로 마커 D17S805를 포함하는 곳까지 염색체 17p의 동일한 조각을 공유했다. 가계 4320도 또한 초기 개시 전립선 암 케이스의 동포군으로부터 확인되었다. 상기 가계에서 3명의 감염된 형제 및 감염된 조카는 D17S786으로부터 myr0084를 포함하는 곳까지 염색체 17p의 조각을 공유한다. 함께, 가계 4325 및 가계 4320 재조합체는 약 1 메가염기의 최소 영역을 한정한다(도 2A 참조). 이 위치는 양 방향으로 더 큰 재조합 집합에 의해 잘 지지된다.

〈실시예 2〉

최소한의 유전공학적으로 정의된 HPC2 영역에서 콘티그 어셈블리 및 게놈 서열화

콘티그 어셈블리(contig assembly). 감수분열 재조합에 의해 연결된 유전공학적으로 정의된 인터벌이 주어지면, 상기 인터벌에 걸쳐있는 게놈 클론의 콘티그를 생성하는 것이 필요하다. 인간 게놈의 화이트헤드 집적 지도(예를 들면, WICGR Chr 17 지도)와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 원료는 유전자 마커의 정렬된 염색체 지도, 다른 서열 태그된 부위(STSs), 방사선 하이브리드 지도 데이터, 및 CEPH 효모 인공 염색체(YAC) 클론을 제공한다.

인터벌에 위치한 마커에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍들을 합성하여 세균성 인공 염색체(BACs)의 라이브러리를 스크리닝하여 그 영역에 있는 BACs를 확인했다. 사용된 마커의 초기 조합은 D17S969, WI-2437, WI-2335, D17S947 및 D17S799(도 2A 참조)였다. 이들 마커로 확인된 BACs는 말단이 서열화되었다. 이들 말단 서열로부터 설계된 PCR 프라이머를 마커로 사용하여 초기 BACs를 콘티그에 배열했다. 각각의 콘티그로부터의 최외각 마커는 연속 횟수의 BAC 라이브러리 스크리닝에 사용되어 궁극적으로 유전공학적으로 정의된 인터벌에 걸쳐있는 BAC 클론 콘티그의 완결을 보장한다. 이어서, 이러한 인터벌에 결쳐있는 중첩되었으나 과다하지 않은 BAC 클론의 조합(도 2A 참조)을 유전자 서열화와 같은 후속 분자 클로닝 프로토콜에 사용하기 위해 선택하였다.

게놈 서열화. 정의된 인터벌에 걸쳐서 BAC 클론의 타일링 통로가 주어질 경우, 하나의 유용한 유전자 발견 전략은 상기 인터벌의 거의 완전한 게놈 서열을 산출하는 것이다. 두 유형의 불규칙한 게놈 클론 서브라이브러리, 즉 5 내지 8 kb 크기 범위에서 삽입체가 있는 사우(Sau) 3A 부분 소화 라이브러리, 및 1.0 내지 1.5 kb 크기 범위에서 삽입체가 있는 불규칙 전단 라이브러리를 타일링 통로 상에서 각각의 BAC로부터 제조하였다. 오토겐(Autogen) 로보틱 플라스미드 제조기(인티그레이티드 세퍼레이션 시스템스(Integrated Separation Systems)를 사용하여 각 BAC의 평균 1x 과잉 서열을 산출하기에 충분한 갯수의 사우 3A 서브라이브러리로부터의 개별 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 각 BAC의 평균 5x 과잉 서열을 산출하기에 충분한 갯수의 불규칙 전단 서브라이브러리로부터의 개별 클론으로부터 삽입체 DNA를 각 개별 클론의 박테리아 배양의 분취액으로부터 직접 얻은 벡터 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 생성된 DNA 주형을 ABI 377 서열분석기 상에서 M13 전방향 또는 역방향 형광 염료 표지된 프라이머로 양 말단으로부터 DNA 서열화하였다.

이들 서열을 프로그램 아켐.블리(Acem.bly)를 사용하여 서열 콘티그로 어셈블리하였다(티에리-미에그(Thierry-Mieg) 등, 1995; 두빈(Durbin) 및 티에리-미에그, 1991). 게놈 서열 콘티그를 후속적인 유사성 검색을 위해 제네틱 데이타 인바이런먼트(Genetic Data Environment) (GDE) (스미스(Smith) 등, 1994) 로컬 데이타베이스에 위치시켰다. 게놈 DNA 서열과 젠뱅크(GenBank) 등록목록(DNA 및 단백질 둘다) 사이의 유사성을 BLAST (알췰 (Altshul 등, 1990)를 사용하여 확인하였다. DNA 서열은 또한 짧은 주기 반복 서열, CpG 함량 및 긴 오픈 리딩 플레임(open reading frame)을 특징으로 했다.

<실시예 3>

인간 HPC2 유전자의 서열 어셈블리

db EST에 대한 BAC 31k12로부터의 게놈 서열의 BLAST 검색은 BAC 31k12 게놈 서열을 따라 분석하였을 때 두 개별 멀티-엑손 후보 유전자, 04CG09 및 HPC2 유전자의 존재를 나타내는 인간 EST의 두 개별 집합을 확인하였다. HPC2에 배당된 EST 서열의 하위집합(표 2)를 어셈블리하여 유전자에 대한 임시 부분 cDNA 서열을 생성하였다.

임시 부분 인간 HPC2 cDNA 서열을 어셈블리하는데 사용된 인간 EST
EST 고유 번호	엑손 전장
AA679618	1→6
Z17886	4→8
W37591	7→12
AA310236	12→16
R55841	15→19
T34216	18→21
AA634909	20→24
AA504412	23→24
R42795	24→폴리A

인간 HPC2 유전자의 개별 액손은 BAC 31k12 게놈 서열을 교차하는 상기 임시 cDNA 서열을 분석함으로써 확인되었다(도 2D 및 2E에서 도식 참조). 본 발명자들은 HPC2 유전자를 확인한 후, MIT 게놈 서열화를 통해 HPC2의 엑손(젠뱅크 고유 번호 AC005277) 모두를 또한 함유하는 또다른 BAC, 597m12를 완전히 서열화하였다. 인간 HPC2 유전자의 서열을 BAC 31k12 및 BAC 597m12의 해당 게놈 서열로의 임시 cDNA 어셈블리과 개별 엑손의 서열을 비교함으로써, 그리고 인간 게놈 DNA의 집합으로부터 유전자를 돌연변이 스크리닝함으로써 정정하였다(도 5 참조).

원래의 임시적인 사람 HPC2 cDNA 서열은 출발 코돈도 어떠한 5'UTR도 함유하지 않았다. 이러한 것은 5'RACE에 의해 얻어졌다. 간략히 언급하면, 비오티닐화된 역 프라이머인 CA4cg07.BR2를 사람 HPC2 유전자의 제3 엑손 서열로부터 설계하였고, cDNA 분자의 5' 말단이 서열 5tagl로 고정되도록 제조된 사람 태아 간의 cDNA로부터 제1회의 PCR 증폭에 앵커 프라이머 5ampA와 함께 사용하였다. 생성된 PCR 생성물을 스트렙트아비딘 상자성 입자(디날(Dynal))상에 포획하고, 세척하여 제2회의 PCR 증폭에 주형으로서 사용하였다. 포스포릴화된 역 프라이머인 CA4cg07.PR2를 사람 HPC2 서열의 제2 엑손 서열로부터 설계하고, 제2회 PCR 증폭을 위해 네스팅(nesting)된 포스포릴화 앵커 프라이머 5ampB와 함께 사용하였다. 생성된 5' RACE 생성물을 겔 정제하고, 염료 종결제 화학 및 ABI 377 서열 분석기를 이용하여 프라이머 CA4cg07.PR2로 서열화하였다. 이러한 5'RACE 생성물의 서열 분석을 통해 출발 코돈과 인프레임(in-frame) 정지 코돈을 포함하는 5'UTR의 일부 모두를 수득하였다(도 3). 5'RACE에 사용되는 프라이머의 서열을 하기 표 4에 기재하였다.

전체 길이의 사람 HPC2 cDNA를 프라이머 CA4cg7.ATG 및 CA4cg7.TGA를 사용하여 사람 머리 및 목 cDNA로부터 증폭하였다. cDNA를 벡터 pGEM-T Easy(프로메가(Promega))중으로 라이게이션시키고, 이.콜라이로 형질변환시켰다. cDNA 클론의 서열을 ABI 377 서열 분석기상에서 염료 종결제 서열화에 의해 확인하였다. cDNA 구조를 증폭시키며 cDNA 클론의 서열을 확인하는데 사용되는 프라이머의 서열을 또한 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 4>

마우스 HPC2 유전자의 서열 어셈블리

HPC2의 매우 유사한 유전자인 마우스 정형(定型) 유전자(ortholog) Mm.HPC2로부터 유도되며 dbEST 확인된 5개의 마우스 EST에 대해 어셈블리된 HPC2 cDNA 서열의 블래스트(BLAST) 조사 및 그의 접수 번호를 하기 표 4에 기재하였다.

임시 부분 Mm.HPC2 cDNA 서열을 어셈블리하는데 사용된 마우스 EST
EST 접수 번호	엑손 길이
AA563096	1→15
AA518169	8→14
AI132016	16→17
AA184645	19→24
AA174437	24→24

원래의 부분 Mm.HPC2 cDNA 서열은 출발 코돈을 함유했으나 5'UTR을 거의 함유하지 않았다. 더욱 확장된 5'UTR 서열을 5' RACE에 의해 수득하였다. 간략히 언급하면, 비오티닐화된 역 프라이머인 m04cg07BR1을 마우스 HPC2 유전자의 제4 엑손 서열로부터 설계하였고, cDNA 분자의 5' 말단이 서열 5tagl로 고정되도록 제조된 마우스 태아 cDNA로부터 제1회의 PCR 증폭을 위해 앵커 프라이머 5ampA와 함께 사용하였다. 생성된 PCR 생성물을 스트렙트아비딘 상자성 입자(디날)상에 포획하고, 세척하여 제2회의 PCR 증폭에 주형으로서 사용하였다. 포스포릴화된 역 프라이머인 m04cg07PR1을 마우스 HPC2 서열의 제3 엑손 서열로부터 설계하고, 제2회 PCR 증폭을 위해 네스팅된 포스포릴화 앵커 프라이머 5ampB와 함께 사용하였다. 생성된 5' RACE 생성물을 겔 정제하고, 염료 종결제 화학 및 ABI 377 서열 분석기를 이용하여 프라이머 m04cg07PR1 및 m04cg07 엑손2 rev로 서열화하였다. 이러한 5' RACE 생성물의 서열 분석을 통해 출발 코돈과 인프레임 정지 코돈을 포함하는5'UTR의 일부 모두를 수득하였다(도 3). 5'RACE에 사용되는 프라이머의 서열을 하기 표 5에 기재하였다.

프로모터로부터 유래될 수 있는 서열인 더욱 확장된 5'UTR 서열, 및 마우스 HPC2 유전자의 인트론 1과 인트론 2의 서열을 게놈 서열화에 의해 수득하였다. BAC 428n12를 마우스 HPC2 cDNA 서열의 엑손 11로부터 유도된 한쌍의 프라이머(04CG7.m11f1 및 04CG7.m11r1, 표 5)를 사용하여 PCR에 의해 마우스 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 라이브러리로부터 수득하였다. BAC 428n12의 SP6 말단 서열로부터 유도된 프라이머 한 쌍(428n12.S6.F1 및 428n12.S6.F1, 표 5)을 사용하여 PCR에 의해 마우스 BAC 라이브러리를 스크리닝하였고, BAC 199n11을 포함하여 여러개의 중복 BAC를 확인하였다. BAC 428n12 및 199n11을 염료 종결제 화학 및 ABI 377 서열 분석기를 사용하여 마우스 HPC2 cDNA로부터 유도된 일련의 13개 서열화 프라이머(mcg7f1 내지 mcg7r7, 표 5)로 서열화하였다. 이러한 서열의 하위 집합을 엑손 1의 ATG 출발 코돈의 280 bp 상위스트림으로부터 엑손 3으로 연장하는 게놈 서열 콘티그로 어셈블리하였다.

전체 길이의 마우스 HPC2 cDNA를 마우스 태아, 태반 또는 태아 뇌 cDNA로부터 프라이머 msCA4cg7.f out 및 msCA4cg7.r out를 사용하여 증폭하였다. cDNA를 프라이머 msCA4cg7.ATG 및 msCA4cg7.TGA를 사용하여 재증폭하였다. 생성된 PCR 생성물을 겔 정제하고, 벡터 pGEM-T Easy(프로메가)중으로 라이게이션시키고, 이.콜라이로 형질변환시켰다. cDNA 클론의 서열을 ABI 377 서열 분석기상에서 염료 종결제 서열화에 의해 확인하였다. cDNA 구조를 증폭시키는데 사용되는 프라이머의서열을 또한 하기 표 5에 나타내었다.

<실시예 5>

인간 HPC2 유전자의 변이 스크리닝

전립선 동종 세포, 전립선암 감염 세포 및 종양 세포주로부터의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 네스티드(nested) PCR 증폭을 수행하여, HPC2 유전자의 변이를 스크린하기 위한 PCR 생성물을 생성하여 하였다. 하기 표 6에 열거된 프라이머를 사용하여 HPC2 유전자의 단편을 증폭하였다. 각각의 엠플리콘에 대한 외부 프라이머 쌍(1A-1P, 즉, 엠플리콘 1의 전방향 A 및 역방향 P)을 사용하여, 게놈 DNA 10 내지 20 ng을 25 주기 동안 1차 증폭시킨 후, PCR 생성물을 45배로 희석하고, 네스티드 M13-테일드 (tailed) 프라이머(1B-1Q, 1C-1R, 즉, 엠플리콘 1의 네스티드 전방향 B 및 네스티드 역방향 Q 또는 엠플리콘 1의 전방향 C 및 네스티드 역방향 R)를 사용하여 추가로 23 주기 동안 재증폭하였다. 일반적으로, 샘플을 태그 플래티넘(Tag Platinum) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) DNA 폴리머라아제를 사용하여 증폭하였다(주기 매개 변수는 95 ℃에서 3분 동안의 초기 변성 단계, 이어서 96 ℃(12 초)에서의 변성 주기, 55 ℃(15 초)에서의 어닐링 및 72 ℃(30 내지 60 초)에서의 확장을 포함함). PCR 반응 후, 과량의 프라이머 및 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 엑소뉴클레아제 I(United States Bioichemicals) 및 슈림프 알칼리성 포스파타아제(Amersham)를 사용하여 다이제스팅하였다 (digest). PCR 생성물을 M13 정방향 또는 역방향 형광(Big Dye, ABI) 염료-분류 프라이머를 사용하여 ABI 377 서열분석기 상에서 서열분석하였다. 크로마토그램은 매킨토시 프로그램 시퀀처 (Sequencher) 또는 자바 프로그램 무트스크린 (Mutscreen) (유전자 코드)에서 다형성 또는 서열 이상의 존재에 대해 분석하였다.

연관된 가계 동족 세포 중 전립선 암에 감염된 세포로부터 수집된 임파구 DNA로부터의 HPC2에 대한 변이 스크리닝 과정에서, 가계 4102의 두 명의 감염된 형제에게서 프레임시프트 변이(1641insG)가 검출되었다. 51세에 전립선암으로 진단된 개인 4102.001, 및 46세에 전립선암으로 진단된 그의 형제 4102.013 모두는 프레임시프트를 보유하였다. 이 가계에서의 추가적인 변이 스크리닝을 통해 그들의 모친인 4102.002가 프레임시프트를 보유함을 밝혀내었다. 또한, 75세에 전립선암으로 진단되고 76세에 사망한 그녀의 외삼촌 4102.053 또한 프레임시프트를 보유하였다.

1641insG 프레임시프트는 프레임으로부터의 HPC2 번역에 이상을 주어 아미노산 루신 547이 HPC2을 대신하였다. HPC2 단백질은 서열이E. coli elaC단백질로서 진화적으로 거리가 먼 상동 단백질과 상당한 서열 유사성을 공유하고, 공유된 서열 유사성 부위는 루신 547의 하류의 180 개 이상의 아미노산 구획에 걸쳐 연장될 수 있기 때문에, 1641insG 프레임시프트가 HPC2 단백질의 기능에 유해하다는 데에는 의심의 여지가 없다.

위와 같은 사실로부터, 프레임시프트 HPC2 1641insG는 가계 4102의 3세대에 걸친 전립선암과 구별되었다는 관찰, 및 프레임시프트 HPC2 1641insG가 HPC2 단백질의 기능에 유해할 것임에 틀림 없다는 공유 서열 유사성으로부터의 추론에 의해, HPC2 유전자에 유해한 게르믈린 (germline) 변이가 전립선 암을 의심케 한다는 것이 수립된다.

<실시예 6>

2종의 수화물 분석에 의한 HPC2-상호작용 단백질의 동정

HPC2의 모두 또는 일부를 인코딩하는 DNA 분획은 pGBT.C와 같은 2종의 수화물 DNA-결합 도메인 벡터를 리게이션시켜HPC2의 코딩 서열을 Gal4p DNA-결합 도메인에 대한 코딩 서열과 인프레임시켰다. DNA-결합 도메인 융합을 HPC2의 분획에 인코드시키는 플라스미드를 활성 도메인에 융합된 cDNA의 라이브러리와 함께 호모 리포터 스트레인 (예컨대, J692)에 도입시켰다. 형질변형체를 선택적 매질, 예컨대 루신, 트립토판 및 히스티딘이 결여되고 25 mM 3-아미노-1,2,4-트리아졸을 함유하는 효모 최소 매질의 20 내지 150 mm 평판에 펼쳤다. 30 ℃에서 1주일간 인큐베이션시킨 후, 효모 콜로니를 베타-갈락토시다아제 필터 분석에 의해 lacZ 리포터유전자의 발현에 대해 평가하였다. 히스티딘의 부재하에 모두 성장하고 베타-갈락토시다제의 생성에 대해 양성인 콜로니를 추가의 특징으로 선택하였다.

활성화 도메인 플라스미드는 스마쉬-앤드-그랩 (smash-and-grab) 기술에 의해 양성 콜로니로부터 정제하였다. 이들 플라스미드를 일렉트로포레이션에 의해이. 콜리(예컨대, DH10B (Gibco BRL))에 도입시키고, 알칼리성 라이시스 (lysis) 방법에 의해이. 콜리로부터 정제하였다. 상호작용의 특이성에 대한 시험을 위해, 특이 활성화 도메인 플라스미드를, 각종 DNA-결합 도메인 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 함께 스트레인 J692로 공형질변형시켰다 (HPC2 및 인간 라민 C의 단편으로의 융합을 포함함). 이들 실험으로부터 생성된 형질변형체를HIS3및lacZ리포터 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 라민 C 제작물이 아닌Hs.HPC2제작물을 갖는 리포터 유전자를 나타내는 양성 콜로니는 보나 피드 (bona fide) HPC-2 상호작용 단백질을 인코딩하였다. 이들 단백질은 적절한 활성화 도메인 플라스미드의 삽입 대한 서열 분석에 의해 동정되고 이를 특징으로 하였다.

<실시예 7>

인간 HPC2 유전자의 오르토로그의 동정

현재 지구상에 생존해 있는 모든 종들은 35억 내지 40억 이전 아주 먼 과거로부터 생존했었던 단일 공통 조상으로부터 진화되 온 것으로 여겨진다. 이는 종들의 임의의 쌍이 과거 얼마간의 시간 동안 생존했었던 공통 조상을 공유해야 함을 의미한다. 이러한 관점은 분명히 다소 극단적인데, 그 이유는 예를 들어, 진핵생물의 핵 게놈 및 미토콘드리아 게놈이 원핵생물 조상에 의존하는 것으로 여겨지기때문이다. 조상 종이 2 종 이상의 현존하는 자손 종으로 진화하는 도중, 조상 종의 게놈에 존재하는 유전자는 자손 종의 게놈에 존재하는 유전자로 진화된다. 자손 종에 존재하는 유전자의 진화 내력은 뉴클레오티드 치환(nucleotide substitution), 삽입(insertion), 결실(deletion), 유전자 복제(gene duplication), 유전자 변환(gene conversion), 측전이(lateral transfer) 등을 비롯한 각종 집합의 진화 과정을 통해 개별 유전자가 진화될 수 있기 때문에 상당히 복잡할 수 있다. 그러나, 관련 유기체에서의 진화 내력은 특히 종의 쌍/집합이 비교적 근래의 공통 조상을 공유하거나, 또는 분석할 유전자가 주로 뉴클레오티드 치환 및(또는) 적의 수의 삽입 및(또는) 결실로 진화되고 유전자 복제 또는 유전자 전환으로는 진화되지 않는 경우 종종 분류할 수 있다. 분석시, 한 종에서의 단일 유전자 및 다른 종에서의 단일 유전자가 공통 조상 종의 단일 유전자로부터 진화된 경우, 이 유전자는 오르토로그(ortholog)로 명명된다.

질병 관련 인간 유전자에 오르토로그한 유전자를 확인하는 이론은 종종 상당히 유용하다.

<실시예 8>

HPC2 유전자의 구조 및 기능은 다음 방법에 따라 결정하였다.

생물학적 연구

HPC2 cDNA를 갖는 포유동물 발현 벡터를 구축하고, 유전자에 병변이 있는 적절한 전립선 암종 세포로 형질감염시켰다. 야생형 HPC2 cDNA와 변이 HPC2 cDNA를 사용하였다. 변이 HPC2 cDNA는 변이 HPC2 대립유전자로부터 수득하거나 하기와 같이 제조할 수 있다. 배양액에서의 표현형 복귀(예를 들어, 세포 형태학, 앵커리지 의존적 생장) 및 동물에서의 표현형을 조사하였다. 유전자의 야생형 및 돌연변이형 모두에 대해 연구하였다.

분자 유전학 연구

결실 돌연변이체 및 미스센스(missense) 돌연변이체를 구축하기 위해 (개별 코돈에서의 단일 염기쌍 치환 및 알라닌 스케닝 돌연변이 유발에 의해) 생체외 돌연변이 유발을 수행하였다. 돌연변이체를 생물학적, 생화학적 및 생물리학적 연구에 이용하였다.

메카니즘 연구

공지 및 비공지된 DNA 서열에 결합하는 HPC2 유전자의 능력을 조사하였다. 트랜스작용 프로모터에 대한 능력은 포유동물 세포에서 단기적 리포터 발현 시스템으로 분석하였다. 임의의 기능적 피트너를 발견하고 확인하기 위해 미립자-포획 (particle-capture) 및 효모 2 혼성화계(yeast two-hybrid system)와 같은 통상의 절차를 이용하였다. 파트너의 특징 및 기능을 특성화하였다. 이 파트너는 또한 약물 발견을 위한 표적이다.

구조적 연구

재조합 단백질을 E. coli, 효모, 곤충 및(또는) 포유동물 세포에서 제조하고, 결정학 및 NMR 연구에 이용하였다. 이 단백질의 분자 모델링도 이용하였다. 이들 연구는 분자로 유도되는 약물 디자인을 촉진시킨다.

<실시예 9>

HPC2에 대한 폴리클로날 항체의 발생

HPC2 코딩 서열의 세그먼트를 E. coli에서 융합 단백질로서 발현시켰다. 과발현된 단백질을 겔 용출시켜 정제하고, 하를로우 및 레인(Harlow and Lane, 1988)의 문헌에 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 토끼 및 생쥐를 면역화하였다. 이 절차에 의해 각종 다른 단백질에 대한 항체를 발생시키는 것으로 나타났다. (예를 들어, 카레머(Kraemer) 등의 1993년 문헌 참조)

간단히 말해, HPC2 코딩 서열의 스트레치를 플라스미드 PET5A(미국 위스콘신주 매니슨 소재 Novagen, Inc.)에서 융합 단백질로서 클로닝하였다. HPC2가 혼입된 서열은 서열 1, 3 또는 28 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. IPTG로 유도시킨후, 예상 분자량을 갖는 융합 단백질의 과발현을 SDS/PAGE로 검증하였다. 융합 단백질을 전기용출시켜 겔로부터 정제하였다. HPC2 융합 생성물로서의 단백질에 대한 확인은 N-말단에서의 단백질 서열화로 검증하였다. 이어서, 정제된 단백질을 토끼에서 면역원으로 사용하였다. 토끼를 완전 프레운드 애주반트중의 단백질 100 ㎍으로 면역화하고, 처음에는 완전 프레운드 애주반트중의 면역원 100 ㎍에 이어서 PBS중의 면역원 100 ㎍을 사용하여 3 주 간격으로 촉진시켰다. 2 주 후, 항체 함유 혈청을 모았다.

상기 절차를 반복하여 HPC2 단백질의 돌연변이형에 대한 항체를 발생시킬 수 있다. 상기 항체와 야생형 HPC2에 대한 항체를 각종 조직 및 생물학적 유체에서 돌연변이형의 존재 및 상대적 농도를 검출하는데 사용하였다.

<실시예 10>

HPC2에 특이적인 모노클로날 항체의 발생

다음 프로토콜에 따라 모노클로날 항체를 발생시켰다. 당업계에 잘 공지된 바와 같이 글루타르알데히드 또는 EDC를 사용하여 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 콘쥬게이션된 무손상 HPC2 또는 HPC2 펩티드(야생형 또는 돌연변이형)를 포함하는 면역원으로 생쥐를 면역화하였다.

면역원을 애쥬반트와 혼합하였다. 생쥐 각각에 면역원 10 내지 100 ㎍을 4 회 주사한 후, 4 번째 주사시에 혈액 샘플을 생쥐로부터 채취하여 혈청이 면역원에 대한 항체를 함유하는지의 여부를 결정하였다. 혈청 역가를 ELISA 또는 RIA로 측정하였다. 면역원에 대한 항체가 존재함을 지시하는 혈청을 함유하는 생쥐를 하이브리도마 제조를 위해 선별하였다.

비장을 면역 생쥐로부터 제거해내고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. (하를로우 및 레인, 1988 문헌 참조) 세포 융합은 기본적으로 콜러 및 밀스테인(Kohler and Milstein, 1975) 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해, 하를로우 및 레인의 1988년 문헌에 기재된 바와 같이, P3.65.3 골수종 세포(미국 메릴랜드주 락빌 소재 American Type Culture Colection)를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 면역원 비장 세포와 융합하였다. 세포는 96 웰 조직 배양 플레이트에서 웰 당 2 x 10⁵세포수의 밀도로 플레이팅하였다. 개별 세포를 생장에 대해 조사하고, 생장 세포의 상등액을 야생형 또는 돌연변이형 HPC2 표적 단백질을 사용하여 ELISA 또는 RIA로 HPC2 특이적 항체의 존재를 시험하였다. 양성 웰에서 세포를 증식시키고, 서브클로닝하고, 모노클로날 항체를 확립하였다.

목적하는 특이성을 가진 클론을 증식시키고, 생쥐에서의 복수로서 또는 공섬유계에서 생장시켜 특성화 및 진화 분석에 충분한 양의 항체를 생성시켰다.

<실시예 11>

HPC2 결합 펩티드의 단리

HPC2 유전자 생성물에 결합하는 펩티드를 다음과 같이 화학적 및 파지 제시된 랜덤 펩티드 라이브러리로부터 단리하였다.

HPC2 유전자 생성물의 단편을 E. coli 및 SF9 세포에서 GST과 His-tag의 융합 단백질로서 발현시켰다. 융합 단백질을 글루타티온 매트릭스(GST 융합 단백질용) 또는 니켈 킬레이트화 매트릭스(His-tag 융합 단백질용)를 사용하여 단리하였다. 이 표적 융합 단백질 제조물을 하기과 같이 직접 스크리닝하거나, 또는 글루타티온 또는 이미다졸로 용출시켰다. 표적 단백질을 폴리스티렌과 같은 표면, 또는 아가로스와 같은 수지, 또는 고체 지지체에 직접 흡착, 글루타르알데히드와 같은 공유 결합제 또는 바이오틴-아비딘과 같은 결합제를 사용하여 고정화하였다.

길이가 다양한 2 종류의 랜덤 펩티드 라이브러리를 발생시켰다. 즉, 예를 들어, 인산화 또는 미리스틸화에 의해 유도체화된 잔기를 가질 수 있는 합성 펩티드 라이브러리 및 인산화될 수 있는 파지 제시된 펩티드 라이브러리이다. 이들 라이브러리를 고정화된 HPC1 유전자 생성물과 각종 생물학적 완충액에서 배양하였다. 이어서, 비결합된 펩티드는 반복 세척하여 제거하고, 결합된 펩티드는 각종 용출제, 예를 들어, pH가 낮거나 높은 강 변성제, 글르타티온 또는 이미다졸으로 회수하였다. 회수된 합성 펩티드 혼합물을 펩티드 미세서열분석용 상업 장치로 옮겨 풍부 잔기를 확인하였다. 회수된 파지를 증폭시키고, 재스크리닝하고, 플라크를 정제하고, 이어서 제시된 펩티드 본질을 결정하기 위해 서열화하였다.

HPC1 결합 펩티드의 용도

상기 스크리닝하여 확인된 펩티드를 바이오틴 컨쥬게이트로서 상업 장치를 이용하여 대량으로 합성하였다. 이 펩티드를 HPC1과의 고체 및 용액 상 경쟁 분석에서 사용하고, 상호작용 파트너를 효모 2-혼성화 스크린에서 확인하였다. 막 투과성 모티프에 융합된 이 펩티드의 변형물들(린(Lin) 등의 1995년 문헌; 로쟈(Rojas) 등의 1996년 문헌)은 화학 합성하고, 배양 세포에 가하고, 생장, 애팝토시스, 분화, 보조인자 반응 및 내부 변화에 대한 영향을 분석한다.

<실시예 12>

HPC2의 샌드위치 분석법

모노클로날 항체를 플레이트, 시험관, 비드 또는 입자와 같은 고체 표면에 부착시켰다. 바람직하게, 항체는 96웰 ELISA 플레이트의 웰 표면에 부착시켰다. HPC2 펩티드/단백질 (야생형 또는 변이형)을 함유하는 시료 (예, 혈청, 뇨, 조직 세포질) 100 ㎕를 고상의 항체에 첨가하였다. 시료를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 시료액을 따라내고 고상을 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하였다. 제 2 모노클로날 항체 (HPC2 펩티드/단백질 상의 상이한 결정인자에 대한 항체) 100 ㎕를 고상에 첨가하였다. 이 항체를 검출 분자 (예, 125-I, 효소, 플루오로포어, 발색단)로 표지하고 제2 항체와 고상을 실온에서 2시간동안 인큐베이션하였다. 제2 항체를 따라내고 고상을 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하였다.

시료 내에 존재하는 HPC2 펩티드/단백질량에 비례하는 결합된 표지량을 정량하였다. 야생형 HPC2에 특이적인 모노클로날 항체 및 HPC2에서 확인된 각 변이체에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 별개의 분석을 수행하였다.

<실시예 13>

HPC2와 상호작용하는 단백질을 동정하기 위한 투 하이브리드 (two-hybrid) 분석법

HPC2의 전체 또는 일부분을 코딩하는 서열을 HPC2 코딩서열이 GAL4p DNA 결합 도메인의 코딩 서열과 프레임이 일치하게 pAS2-1 (클론테크(Clontech))와 라이게이션시켰다. 이 플라스미드 구조물을 효모 리포터 균주 Y190으로 형질전환에 의해 도입하였다. 이어서, 인간 전립선 cDNA (클론테크)로부터 제조된 활성화 도메인 융합 플라스미드 라이브러리를 pAS2-1 기재 융합 구조물을 갖는 균주 Y190으로 도입하였다. 형질전환체를 루이신, 트립토판 및 히스티딘이 결여되고, 25 mM 3-아미노-1,2,4-트리아졸을 함유하는 효모 최소 배지의 20 내지 150 mm 플레이트 상에 도말하였다. 30℃에서 1주일간 인큐베이션한 후, 효모 콜로니를 lacZ 리포터 유전자의 발현에 대해 β-갈락토시다제 필터 분석법에 의해 분석하였다. 히스티딘 부재하에서 성장하고 β-갈락토시다제 생산에 양성인 콜로니를 선별하여 추가로 특징을 조사하였다.

활성화 도메인 플라스미드를 스매쉬-앤-그랩 (smash-and-grap)법에 의해 양성 콜로니로부터 정제하였다. 이 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 이. 콜라이 (E. coli) DH5α로 도입시키고, 알칼리 용균법에 의해 이. 콜라이로부터 정제하였다. 상호작용의 특이성을 시험하기 위해, 특정 활성화 도메인 플라스미드를 HPC2 및 인간 라민 C와의 융합체를 포함한 여러 가지 DNA 결합 도메인 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 균주 Y190으로 동시형질전환시켰다. 이 실험의 형질전환체를 HIS3 및 lacZ 리포터 유전자의 발현을 분석하였다. HPC2 구조물과 리포터 유전자를 발현하는 양성 형질전환체는 HPC2 상호작용하는 단백질을 코딩하였으나 라민 C 플라스미드는 코딩하지 않았다. 이러한 단백질을 동정하여 적합한 활성화 도메인 플라스미드의 삽입체의 서열 분석에 의해 특징을 조사하였다.

상기 과정은 HPC2 유전자의 변이형에 반복하여 오로지 변이 단백질과 상호작용하는 단백질을 동정하거나, HPC2 단백질의 변이형이 야생형의 HPC-2와 상호작용하는 것으로 공지된 단백질과 상호작용할 수 있는 지를 결정하였다.

본 발명의 바람직한 실시태양의 상세한 내용을 언급하여 본 출원 명세서에 발명을 개시하였으나, 발명의 취지와 첨부된 청구범위의 범위 내에서 당업자에 의해 변형될 수 있다는 것을 고려할 때, 개시 내용은 제한적 의미가 아닌 예시하고자 하는 것으로 이해된다.

인용 문헌

Claims (60)

1. 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HPC2 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 동등한 변형된 형태를 코딩하는 단리된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 (a) 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열, (b) 이의 상보체, (c) 상응하는 RNA, 또는 (d) 엄격한 조건에서 상기 (a), (b), (c) 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 단리된 핵산.
3. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 서열 3, 서열 28에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 상보체를 갖는 것인 단리된 핵산.
4. 제1항에 있어서, 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체를 포함하는 DNA, 이의 상보체 또는 상응하는 RNA인 단리된 핵산.
5. 제1항에 있어서, 서열 2에 기재된 HPC2 폴리펩티드의 돌연변이 형태를 코딩하는 단리된 핵산.
6. 제5항에 있어서, 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 형태를 포함하는 DNA, 이의 상보체 또는 상응하는 RNA인 단리된 핵산.
7. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이가 결실 돌연변이, 논센스 (nonsense) 돌연변이, 삽입 돌연변이, 프레임시프트 (frameshift) 돌연변이 및 미스센스 (missense) 돌연변이로 구성된 군에서 선택된 것인 단리된 핵산.
8. (a) 서열 4 내지 27, (b) 이들의 상보체, (c) 이들에 상응하는 RNA 및 (d) 엄격한 조건하에서 상기 (a), (b), (c) 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
9. 샘플 중에서 (i) 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 대립유전자 변이체 및 이의 돌연변이 형태 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 (ii) 이 DNA에 상응하는 RNA, 또는 (iii) 엄격한 조건하에서 상기 (i) 또는 (ii)의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 검출하는 혼성화 프로브로서 사용하기에 적합하며, 제1 내지 8항 중 어느 한 항의 핵산의 15 개 이상의 인접 뉴클레오티드들을 갖는 단리된 핵산.
10. 제1 내지 8항 중 어느 한 항의 핵산의 8 개 이상의 인접 뉴클레오티드들을 포함하는 각 핵산 프로브들의 집합(set)으로서, 상기 핵산의 일부 또는 전부를 포괄하는, 마이크로칩 분석에 사용하기 위한 핵산 프로브 집합.
11. 제1 내지 10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
12. 제1 내지 10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하며, 숙주 세포 내에서 HPC2 폴리펩티드 또는 이의 변형된 형태의 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 적절한 조절 서열에 상기 코딩 서열이 작동가능하게 연결된 발현 벡터.
13. 제11 또는 12항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
14. (i) 제1항에 정의된 바와 같은 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 HPC2 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 변형된 형태인 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 제13항의 숙주 세포를 상기 HPC2 폴리펩티드의 생성에 적절한 조건하에서 배양하고, (ii) 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는,

    제1항에 정의된 바와 같은 서열 2의 아미노산 서열 갖는 HPC2 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 변형된 형태인 폴리펩티드의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 회수된 폴리펩티드를 표지하는 것을 더 포함하는 방법.
16. 다른 인간 단백질이 실질적으로 없는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 HPC2 폴리펩티드의 제제.
17. 아미노산 서열이 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 야생형 HPC2 폴리펩티드와 실질적인 서열 상동성이 있으며 야생형 HPC2 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 기능을 갖는 인간 HPC2 폴리펩티드의, 다른 인간 단백질이 실질적으로 없는 제제.
18. 서열 2에 기재된 핵산 서열의 돌연변이 형태의 발현에 의해 얻을 수 있는 돌연변이된 인간 HPC2 폴리펩티드의, 다른 단백질이 실질적으로 없는 제제.
19. 제16 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 표지된 것인 제제.
20. 제16 내지 18항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 하나 이상에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
21. 제20항의 항체를 얻기 위한 면역원으로 사용하기에 적절한, 제16 내지 18항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드의 항원성 단편.
22. 융합 단백질 형태의 제16 내지 18항 및 제21항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드.
23. 제16 내지 18항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드의 항체 생성용 면역유발원으로서의 용도.
24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 항체 생성물이 후속적으로 표지되거나 또는 고체 지지체에 결합되는 것인 용도.
25. 프라이머의 서열이 HPC2의 게놈 클론으로부터 유래된 것이며, 이들 프라이머가 핵산 증폭 반응에 사용되어 HPC2 유전자의 서열 전부 또는 일부에 상응하는 DNA 또는 RNA의 합성을 일으키는 것인, 핵산 증폭 반응을 통해 HPC2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 단일가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍.
26. 제25항에 있어서, 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 대립유전자 변이체 또는 이의 돌연변이 형태를 갖는 HPC2 유전자의 서열의 전부 또는 일부를 결정하기 위한 프라이머쌍.
27. 추정되는 돌연변이체 HPC2 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 야생형 HPC2 뉴클레오티드 서열과 비교하는 것을 포함하며, 상기 추정되는 돌연변이체 서열과 야생형 서열 간의 차이가 돌연변이체 HPC2 뉴클레오티드 서열을 확인시키는 것인, 상기 추정되는 돌연변이체 HPC2 대립유전자 중 돌연변이체 HPC2 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
28. 인간의 조직으로부터의 HPC2 유전자 또는 HPC2 유전자 발현 생성물을 분석하는 것을 포함하며, HPC2 내의 변화가 상기 인간의 암과 관련된 것이고, 이 변화가 배선(胚線) 내에 있는 경우, 이는 상기 암의 소인과 관련되며, 상기 변화가 체조직내에 있는 경우 상기 체조직이 암성(癌性)임을 지시하는 것인, HPC2 내의 변화를 검출하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 샘플 중의 HPC2 유전자의 서열을 서열 1의 서열 및 이의 야생형 대립유전자 변이체 중에서 선택된 하나 이상의 야생형 HPC2 유전자 서열의 서열과 비교하는 방법.
30. 제28항에 있어서, 상기 발현 생성물이 HPC2 유전자의 mRNA 및 HPC2 유전자에 의해 코딩되는 HPC2 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
31. 제28 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서,

    (a) 상기 샘플로부터 얻은 단일가닥 DNA의 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동 이동도에 있어서의 변동을 관찰하는 것,

    (b) HPC2 유전자 프로브가 HPC2 유전자에 혼성화되기 적절한 조건하에서, 상기 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 HPC2 유전자 프로브를 혼성화시키는 것,

    (c) 상기 샘플로부터 얻은 게놈 DNA와 대립유전자 특이적 프로브와의 혼성화를 확인하는 것,

    (d) 상기 샘플로부터의 HPC2 유전자의 전부 또는 일부를 증폭시켜, 증폭된 서열을 제조하고 증폭된 서열을 서열분석하는 것,

    (e) 핵산 증폭을 통해 상기 샘플 중의 특이적 HPC2 돌연변이체 대립유전자의 존재를 확인하는 것,

    (f) 상기 샘플로부터의 HPC2 유전자의 전부 또는 일부를 분자적으로 클로닝하여 클로닝된 서열을 제조하고 클로닝된 서열을 서열분석하는 것,

    (g) (1) 상기 샘플로부터 단리된 HPC2 유전자 게놈 DNA 또는 HPC2 mRNA와 (2) 인간 야생형 HPC2 유전자 DNA에 상보적인 핵산 프로브를 서로 혼성화시켜 2중 가닥을 형성시켰을 때 분자 (1)과 (2) 간의 미스매치(mismatch)가 있는가 여부를 확인하는 것,

    (h) 상기 샘플 중의 HPC2 유전자 서열을 증폭시키고, 이 증폭된 서열을 야생형 HPC2 유전자 서열을 포함하는 핵산 프로브와 혼성화시키는 것,

    (i) 상기 조직 중의 HPC2 유전자 서열을 증폭시키고, 이 증폭된 서열을 돌연변이체 HPC2 유전자 서열을 포함하는 핵산 프로브에 혼성화시키는 것,

    (j) 결실 돌연변이를 스크리닝하는 것,

    (k) 점 돌연변이를 스크리닝하는 것,

    (l) 삽입 돌연변이를 스크리닝하는 것,

    (m) HPC2 유전자 서열 또는 돌연변이체 HPC2 유전자 서열을 포함하는 하나이상의 핵산 프로브와 상기 샘플 중의 HPC2 유전자의 계내 혼성화 (in situhybridization)를 확인하는 것,

    (n) 면역블롯팅하는 것,

    (o) 면역세포화학 분석을 수행하는 것,

    (p) 상기 조직으로부터 단리된 HPC2 단백질와 HPC2 돌연변이체 대립유전자의 폴리펩티드 발현 생성물에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 및(또는) 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 HPC2 폴리펩티드를 위한 결합 파트너 사이의 결합 상호작용에 대해 분석하는 것, 및

    (q) 상기 결합 파트너의 생화학적 활성의 억제율을 분석하는 것

    중 하나 이상의 절차를 수행하는 방법.
32. 자신의 게놈 내에 변화된 HPC2 대립유전자를 보유한 비인간 동물.
33. 자신의 천연 HPC2 대립유전자가 제2의 동물로부터 얻은 HPC2 대립유전자로 대체된 비인간 동물.
34. 자신의 천연 HPC2 대립유전자가 파괴 또는 결실된 비인간 동물.
35. 자신의 천연 HPC2 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두가 (a) 이들 대립유전자를 조건에 따라 녹아웃(knockout)하는 DNA계를 포함하도록 변형되었거나 (b) 이들대립유전자를 조건에 따라 녹아웃하는 DNA계를 포함하도록 변형된 제2의 동물로부터 얻은 HPC2 대립유전자에 의해 대체된 비인간 동물.
36. 제32 내지 35항 중 어느 한 항의 비인간 동물로부터 단리한 세포주.
37. 야생형 HPC2와 복합체를 형성하는 야생형 결합 파트너와 복합체를 형성할 수 없는 단리된 돌연변이체 HPC2.
38. HPC2 및 이의 결합 파트너를 포함하는 단리된 단백질 복합체.
39. HPC2의 단편 및 HPC2의 결합 파트너의 단편을 포함하는 단백질 복합체.
40. 제38 또는 39항의 단백질 복합체와의 면역반응성이 있는 단리된 항체.
41. 제40항에 있어서, 상기 항체가 순수한 HPC2 또는 순수한 HPC2 결합 파트너와의 면역반응성이 없는 항체.
42. 제40 또는 41항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
43. HPC2 유전자에서의 돌연변이로 인해 HPC2 유전자 기능을 상실했거나 이 유전자 기능이 변화된 세포 내로, 이 세포 내에서 HPC2 기능을 복원하는 핵산을 도입하는 것을 포함하며, 이 핵산이 야생형 HPC2 유전자 핵산 또는 야생형 HPC2 유전자 핵산과 실질적으로 상동성인 핵산 중에서 선택된 것이어서 상기 세포에서 발현되는 것인, 세포에 야생형 HPC2 유전자 기능 또는 이 야생형 기능과 실질적으로 유사한 HPC2 기능을 제공하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 핵산이 야생형 HPC2 유전자의 일부이며, 이 유전자의 일부가 생물학적으로 기능성인 야생형 HPC2 유전자 폴리펩티드 일부를 코딩하는 것인 방법.
45. HPC2 유전자에서의 돌연변이로 인해 HPC2 유전자 기능을 상실했거나 이 유전자 기능이 변화된 세포 내로, 이 세포 내에서 HPC2 기능을 복원하는 분자를 도입하는 것을 포함하며, 이 분자가 생물학적으로 기능성인 야생형 HPC2 폴리펩티드 전부 또는 일부, 야생형 HPC2 폴리펩티드와 실질적으로 상동성인 폴리펩티드 및 상기 야생형 HPC2 폴리펩티드의 기능을 모방하는 분자로 구성된 군에서 선택된 것인, 상기 세포에 야생형 HPC2 유전자 기능 또는 야생형과 실질적으로 유사한 HPC2 기능을 제공하는 방법.
46. 인간으로부터 얻은 HPC2 또는 HPC2 단편이 야생형 HPC2가 결합하는 결합 파트너와 복합체를 형성할 수 있는가에 대해 분석하는 것을 포함하며, 이 때 이 복합체를 형성할 수 없는 것이 암의 소인을 지시하는 것인 인간에게서 암의 소인을 진단하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 분석이 효모 2-하이브리드 분석을 포함하는 것인 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 분석이 상기 결합 파트너와 상기 인간으로부터 정제된 HPC2를 혼합함으로써 형성된 복합체를 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 방법.
49. 제46항에 있어서, 상기 분석이 HPC2와 상기 인간으로부터 정제된 결합 파트너를 혼합함으로써 형성된 복합체를 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 방법.
50. 제46항에 있어서, 상기 복합체가 HPC2-상기 결합 파트너 복합체에 특이적인 항체와 결합함으로써 측정되는 것인 방법.
51. 제46항에 있어서, 상기 분석이 HPC2-상기 결합 파트너 복합체에 특이적인 항체와 상기 인간으로부터 얻은 조직 추출물을 혼합하는 것을 포함하는 것이며, 이 때 상기 항체와 상기 조직 추출물 사이에서 HPC2-상기 결합 파트너-항체 복합체가 형성되지 않는 것이 암의 소인을 지시하는 것인 방법.
52. 돌연변이가 있는 HPC2를 야생형 HPC2가 결합하는 결합 파트너와 결합시키고 복합체의 형성 여부를 확인하는 것을 포함하며, 이 때 복합체의 부재가 상기 돌연변이가 암의 소인인 것임을 지시하는 것인, HPC2에서의 돌연변이가 암의 소인인가 여부를 확인하는 방법.
53. 약물의 존재 및 부재하에, 야생형 HPC2가 결합하는 야생형 결합 파트너와 돌연변이체 HPC2를 혼합하고, 이 돌연변이체 HPC2가 상기 야생형 결합 파트너와 결합하는 양을 측정하는 것을 포함하며, 이 때 결합량이 상기 약물의 부재시보다 존재시에 더 크다면 상기 약물이 HPC2에서의 상기 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료용 약물 후보물질인, HPC2에서의 돌연변이로 인해 발생하는 암을 치료하는 데 유용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 돌연변이체 HPC2가 융합 단백질이고(이거나) 상기 야생형 단백질이 융합 단백질인 방법.
55. 약물의 존재 및 부재하에, 야생형 HPC2가 결합하는 야생형 결합 파트너와 돌연변이체 HPC2를 혼합하고, 이 돌연변이체 HPC2가 상기 야생형 결합 파트너와 결합하는 양을 측정하는 것을 포함하며, 이 때 결합량이 상기 약물의 부재시보다 존재시에 더 작다면, 상기 약물이 HPC2에서의 상기 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료용 약물 후보물질인, HPC2에서의 돌연변이로 인해 발생하는 암을 치료하는 데 유용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 야생형 HPC2가 융합 단백질이고(이거나) 상기 야생형 결합 파트너가 융합 단백질인 방법.
57. 돌연변이를 포함하는 HPC2에 대해 동형접합형 (homozygous)인 동물을 약물로 치료하는 것을 포함하며, 이 때 동물에게서 암이 발생하지 않은 경우, 상기 약물이 HPC2에서의 상기 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료용 약물 후보물질인, HPC2에서의 돌연변이로 인해 발생하는 암을 치료하는 데 유용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법.
58. 돌연변이를 포함하는 HPC2에 대해 동형접합형이며 종양이 있는 동물을 약물로 치료하는 것을 포함하며, 이 때 상기 종양이 퇴행되는 경우 상기 약물이 HPC2에서의 상기 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료용 약물 후보물질인, HPC2에서의 돌연변이로 인해 발생하는 암을 치료하는 데 유용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법.
59. 제57 또는 58항에 있어서, 상기 동물이 상기 돌연변이를 포함하는 HPC2에 대해 형질전환 (transgenic)된 것인 방법.
60. (a) 약물의 존재하에 돌연변이를 포함하는 HPC2에 대해 동형접합형인 세포의 세포 배양물을 증식시키는 단계,

    (b) 야생형 HPC2 유전자를 포함하는 세포의 세포 배양물을 증식시키는 단계, 및

    (c) 상기 약물의 부재하에 상기 돌연변이를 포함하는 HPC2에 대해 동형접합형인 세포의 세포 배양물을 증식시키는 단계를 포함하며,

    이 때 단계 (a)의 세포가 단계 (c)의 세포보다는 단계 (b)의 세포와 더 유사하게 행동한다면, 상기 약물이 HPC2에서의 상기 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료용 약물 후보물질인,

    HPC2에서의 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료에 유용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법.