KR20020001865A - 면역반응을 증강시키기 위한 가용성 공동자극 분자의 용도 - Google Patents

Abstract

공동자극 분자 예를 들어, B7 분자의 가용성 형태가 항원 예를 들어, 종양세포 및 감염성 제제에 대한 면역반응의 증대를 위해 투여되는 면역반응 증강 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 피험자의 예방적 및 치료적 면역화 둘 모두에 유용하다.

Description

면역반응을 증강시키기 위한 가용성 공동자극 분자의 용도 {USE OF SOLUBLE COSTIMULATORY MOLECULES TO ENHANCE IMMUNE RESPONSES}

도 1은 B7-2Ig (100 ㎍)를 공동 투여하거나 투여함 없이 클래스 Ⅱ-제한 펩티드로 면역화시킨 마우스로부터의 세포의 항원 특이적 증식 반응을 도시한다.

도 2는 일차 면역화 시점에서 단일 B7-2Ig 처리 마우스로부터의 세포가, 이차 면역화에 후속하여 B7-2Ig를 수용하지 않은 마우스로부터의 세포 보다 더 많은 증식 반응을 가짐을 도시한다.

도 3은 B7-2Ig의 공동투여가 클래스 I 제한 펩티드를 사용한 면역화에 대해 CTL 반응을 증강시킴을 도시한다.

도 4는 클래스 Ⅱ 제한 펩티드 및 B7-2 Ig 처리의 존재 또는 부재하에 클래스 I 제한 펩티드를 사용하여 면역화시킨 마우스의 CTL 반응을 도시한다.

도 5는 B7-IgG가 시험관내 증대 및 비장세포 (splenocyte)에서의 림포킨의 분비에 대한 공동자극 시그널을 제공함을 도시한다.

도 6은 B7Ig가 예방적 종양 백신 모델에서 보조제로서 유효함을 제시한다.

도 7은 B7-1- 또는 B7-2-IgG와 혼합된 조사된 P815 종양세포를 사용한 마우스의 치료적 백신화가 종양의 퇴화 및 생존성의 연장을 유도함을 도시한다.

도 8은 치료적 조사된 종양세포 백신을 위한 보조제로서 B7-IgG를 사용한 마우스의 백신화가 수개의 다른 마우스 종양 모델에서 효과적임을 제시한다.

도 9는 마우스에서 B7-IgG 단독의 치료적 투여의 항종양 효과가, 백신 보조제로서의 이것의 효과와 필적할 정도임을 제시한다.

도 10은 T 또는 B 세포가 B7-IgG-매개 항종양 활성에 필수적임을 제시한다.

도 11은 CD4+가 아닌 CD8+ T 세포가 B7-IgG 항종양 활성에 필수적임을 제시한다.

도 12는 확립된 종양의 B7-IgG 치료가 숙주 IFN-γ에 독립적임을 제시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 면역반응을 강화시키기 위해 가용성 공동자극 분자 (예를 들어, B7 분자의 세포외 도메인 또는 B7 융합 단백질)를 투여함에 의해 면역반응을 증강시키는 개선된 방법을 제공한다. 가용성 공동자극 분자는 가교제 없이 투여되나 놀랍게도 T 세포 반응을 자극한다. 실제로, 본 출원인들은 본 발명의 방법이 세포 표면상에 발현되는 공동자극 분자 예를 들어, 세포 표면의 공동자극 분자의 증가된 수준을 초래함을 발견하였다.

본 발명의 추가적인 설명 이전에, 명세서, 실시예 및 청구범위에 사용된 특정 용어를 정의한다.

정의

본원에서, "예방적으로"는 공동자극 분자를 면역반응의 전개, 증대, 및/또는 강화를 유발하는 항원에 대해 노출시키기 이전 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다.

본원에서, "치료적으로"는 공동자극 분자를 사용한 처리에 의해 효과를 보는 존재하거나 진행중인 감염 또는 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 또는 세균성 감염)을 치료하기 위한 공동자극 분자의 투여를 포함한다. 치료적 처리를 위해, 공동자극 분자는 면역반응의 전개, 증대, 및/또는 강화를 유발하는 항원에 대한 노출이후에 투여된다. 공동자극 분자를 사용한 치료는 예를 들어, 특정 항원에 대해 특이적인 것이 아니라 피험자의 면역반응에 대한 다른 유리한 효과를 가질 수 있는 것으로 이해된다.

본원에서, "면역세포"는 조혈세포 기원의 세포를 포함하며 면역반응에서 작용한다. 면역세포는 림프구 예컨데, B 세포 및 T 세포; 천연 킬러세포; 골수세포 예컨데, 모노사이트, 대식세포, 호산구, 비만세포, 호염구, 및 과립구를 포함한다.

본원에서, "면역반응"은 T 세포 및/또는 B 세포 반응 즉, 세포성 및/또는 체액성 면역반응을 포함한다. 일 구체예에서, 제안된 방법은 T 헬퍼 세포 반응을 감소시키는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 제안된 방법은 세포독성 T 세포 반응을 감소시키는데 이용될 수 있다. 제안된 방법들은 일차 및 이차 면역반응을 감소시키는데 이용될 수 있다. 피험자 면역반응은 예를 들어, 항체 생성, 면역세포 증대, 사이토카인의 방출, 세포 표면 마커의 발현, 세포독성 등을 분석함에 의해 측정될 수 있다.

본원에서, 활성화된 면역세포와 관련하여 "공동자극"은, 증식 또는 이펙터 기능을 유도하는 제 2의, 비-활성화 수용체 매개 시그널 ("공동자극 시그널")을 제공하는 공동자극 분자의 능력을 포함한다. 예를 들어, 공동자극 시그널은 예를 들어, T 세포-수용체-매개 시그널을 수용한 T 세포에서 사이토카인 분비를 초래할 수 있다. 본원에서, "공동자극 분자"는 T 세포상의 공동자극 수용체 (예를 들어, CD28, CTLA4, ICOS (참고문헌; Hutloff et al. 1999. Nature 397:263), B7h 리간드 (참고문헌: Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423) 및/또는 관련된 분자와 결합하는 항원발현세포 (예를 들어, B7-1, B7-2, B7RP-1 (참고문헌: Yoshinaga et al. 1999. Nature 402:827), B7 (참고문헌: Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423) 및/또는 관련 분자 (예를 들어, 상동체)상에 존재하는 분자를 포함한다. 이들 분자는 또한 총칭하여 "B7 분자"로 본원에서 언급된다.

본원에서, "B7" 또는 "B7 분자"는 자연발생 B7-1 분자, B7-2 분자, B7RP-1 분자 (참고문헌: Yoshinaga et al. 1999. Nature 402:827), B7h 분자 (참고문헌: Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423), 구조적으로 관련된 분자, 이러한 분자의 단편, 및/또는 이것의 기능적 등가물을 포함한다. 용어 "등가물"은 B7 분자의 활성 예를 들어, 면역세포상의 B7의 천연 리간드 예컨데, T 세포상의 CTLA4, ICOS, 및/또는 CD28과의 결합력을 지닌 기능적으로 등가인 공동자극 분자를 엔코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서, "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 연결된 두개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 의미한다. "폴리펩티드"는 통상 펩티드로 언급되는 짧은 사슬, 올리고펩티드 및 올리고머, 및 일반적으로 단백질로 언급되는 보다 더 긴 사슬 둘 모두를 포함한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자 엔코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드"는 자연적 과정 예컨데, 프로세싱 및 다른 번역 이후의 변형에 의한 변형을 포함할 뿐만아니라, 화학적인 변형 기술에 의한 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 기본 교재에 잘 기술되어 있고, 단행본, 및 여러권으로된 연구 문헌에 보다 상세히 기술되어 있으며, 이들은 당업자에게 공지이다. 동일한 형태의 변형이 주어진 폴리펩티드내의 여러부위에 동일하거나 다른 정도로 존재할 수 있다. 변형은 펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드의 어디에서든지 발생할 수 있다. 변형은 예를 들어, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합, 헴 성분의 공유결합, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스포티딜이노시톨의 공유결합, 가교, 고리화, 이황화결합의 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해과정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 글리코실화, 지질 결합, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 t-RNA 매개 부가 예컨데, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다 (참고문헌: Protein Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Compay, New York (1993) and World, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslatonal Covalent Modifications Of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). 폴리펩티드는, 분지되거나, 분지됨 없이 분지되거나 고리일 수 있다. 고리형, 분지된 및 분지된 환상 폴리펩티드는, 번역 후 자연적인 과정에 의해 유발될 수 있으며, 완전히 합성에 의해 제조될 수 있다.

본원에서, "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 단백질"은 세포로부터 단리되거나 재조합된 DNA 기법에 의해 생산되는 경우에는 다른 폴리펩티드, 단백질, 세포성 물질 및 배양 배지가, 화학적으로 합성되는 경우에는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 이것의 부분은, B7 폴리펩티드가 유도되는 조직원으로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염성 폴리펩티드가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것을 의미한다. "세포성 물질이 실질적으로 없는"은 B7 폴리펩티드의 제조물로서, 폴리펩티드가 그것이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포성 성분으로부터 분리되는 경우의 것을 포함한다. 일 구체예에서, 용어 "세포성 물질이 실질적으로 없는"은 비-B7-폴리펩티드 (본원에서, "오염성 폴리펩티드"로 언급됨) 약 30% (건조 중량기준) 미만, 보다 더 바람직하게는 비-B7-폴리펩티드 약 20% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 비-B7-폴리펩티드 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 비-B7-폴리펩티드 약 5% 미만 을 갖는 B7 폴리펩티드의 제조물을 포함한다. B7 폴리펩티드 또는 이것의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합적으로 생성되는 경우, 배양 배지가 실질적으로 없는 것 즉, 배양 배지가 폴리펩티드 중량기준으로 약 20% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 나타내는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 용어 "화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"은 폴리펩티드의 합성중에 포함되는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질로부터 폴리펩티드가 분리된, B7 폴리펩티드의 제조물을 포함한다. 일구체에에서, 용어 "화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"은 화학적 전구물질 또는비-B7 화학물질 약 30% (건조 중량기준) 미만, 보다 더 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-B7 화학물질 약 20% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-B7 화학물질 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-B7 화학물질 약 5% 미만 을 갖는 B7 폴리펩티드의 제조물을 포함한다.

B7 핵산 분자 및 폴리펩티드는 "천연발생"인 것이 바람직하다. 본원에서, "천연발생" 분자는 자연발생하는 누클레오티드 서열을 갖는 B7 분자를 의미한다 (예를 들어, 천연 B7 폴리펩티드를 엔코딩한다). 또한, 미생물내에서 동일한 기능적 활성 예를 들어, 스트레스 및/또는 독력에 대한 적응성을 조절하는 능력을 보유하는, 이들 폴리펩티드 및 핵산 분자의 자연발생 또는 비자연발생 변이체를 의미한다. 이러한 변이체는 예를 들어, 당업계에 공지된 돌연변이 기술을 사용함에 의해 제조될 수 있다. 또한, 변이체는 화학적으로 합성될 수 있다.

본원에서, "변이체"는 본질적인 특성을 보유하나 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드로부터의 서열과는 다른 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체의 누클레오티드 서열의 변화는, 기준 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키거나 변화시키지 아니한다. 누클레오티드의 변화는 하기 기술된 바와 같이, 기준 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합, 및 절단을 가져올 수 있다. 전형적인 폴리펩티드 변이체는 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다르다. 일반적으로, 이러한 차이는 기준 폴리펩티드와 변이체가 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일한 정도로 제한적된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 부가 및/또는 결실의 임의의 조합에 의해 다르게 될 수 있다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 변이체는 예컨데, 대립형질변이체와 같이 자연발생이거나 자연발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 핵산 분자 및 폴리펩티드의 비자연발생 변이체는, 돌연변이 유발기술, 직접 합성, 및 당업자에 공지된 다른 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 B7 폴리펩티드는 또한 이것의 등가물을 포함한다. 이러한 변이체는 예를 들어, 당업계에 공지된 기술을 사용함에 의해 제조될 수 있다. 또한, 변이체는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 기능적으로 등가물인 B7 폴리펩티드의 돌연변이 형태 (예를 들어, CTLA4 및/또는 CD28과 결합할 수 있는 능력을 갖는다)는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 하나의 치환을 일으킬 수 있는 분리된 점 돌연변이, 또는 하나 이상의 결실 또는 삽입에 의한 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 무작위 돌연변이 유발이 이용될 수 있다. 돌연변이는 또한 무작위 돌연변이 유발에 의해 생성되거나 카세트 돌연변이 유발을 이용할 수 있다. 전자의 경우, 분자의 전체 코딩 영역은 수개의 방법 (화학적, PCR, 도핑 올리고누클레오티드 합성)중 어느 하나에 의해 돌연변이 유발되고, 무작위적으로 돌연변이된 분자는 선택 및 스크리닝 공정이 수행된다. 후자의 경우, 정의된 구조적 또는 기능적 결정인자중 하나에 대응하는 폴리펩티드의 분리된 영역은 포화 또는 반-무작위 돌연변이가 수행되고, 이러한 돌연변이된 카세트는 그렇지 않은 경우 야생형인 대립형질의 콘텍스트내로 재도입된다. 일 구체예에서, PCR 돌연변이 유발이 사용될 수 있다. 예를 들어, 메가프리머 PCR이 사용될 수 있다 (참고문헌: O.H. Landt, Gene 96:125-128).

본원에서, "면역반응의 강화"는 제안된 방법을 사용하여 처리함에 의해 T 및/또는 B 세포 반응 즉, 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 증가시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 제안된 방법은 T 헬퍼 세포 반응을 강화시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 제안된 방법은 세포독성 T 세포 반응을 강화시키는 데 사용될 수 있다. 제안된 방법은 일차 및 이차 면역반응 둘 모두를 강화시키기위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 제안된 방법은 미처리한 피험자 또는 청구된 방법을 처리하지 않은 피험자에 의한 면역반응과 비교하는 경우, 피험자에 의한 면역반응을 증가시켰다. 면역반응의 증가는 예를 들어, 제안된 방법으로 처리시에 피험자로부터 항원에 대한 면역세포의 증가된 반응에 의해 제시될 수 있다. 피험자의 면역반응은 생체내 또는 시험관내에서 면역세포 활성화의 측정 예를 들어, 항체의 생성, 면역세포의 증가, 사이토카인의 방출, 세포 표면 마커의 발현, 세포독성 등을 분석함에 의해 측정될 수 있다.

본원에서, "가용성"은 분자 예를 들어, 세포와 관련되지 아니한 공동자극 분자를 포함한다. 가용성 공동자극 분자는 이들이 유도된 세포-관련 분자의 기능을 보유한다. 즉, 이들은 T 세포상의 이들의 동족 리간드와 결합할 수 있으며, T 세포상의 CD28 및/또는 CTLA4 분자를 통해 시그널 유도를 조절할 수 있으나, 이들은 가용성 형태로서 즉, 막에 결합되어 있지 않다. 바람직하게는, 가용성 조성물은 B7 분자의 세포외 도메인을 포함한다.

본원에서, "공동자극 분자의 세포외 도메인"은 공동자극 분자의 세포-관련 형태로서 세포외인 공동자극 분자의 부분을 포함한다. 바람직하게는, 공동자극 분자의 세포외 도메인은 B7 분자의 세포외 도메인을 포함한다. B7 세포외 도메인은 CD28 및/또는 CTLA4와의 결합을 조절하는 공동자극 분자의 부분을 포함한다. 예를 들어, 사람 B7-1 세포외 도메인은 B7-1 (서열번호: 1)의 성숙한 형태의 아미노산 약 1 내지 약 208을 포함하며, 사람 B7-2 세포외 도메인은 B7-2 (서열번호: 2)의 성숙한 형태의 아미노산 약 24 내지 약 245를 포함한다. 일 구체예에서, 가용성 공동자극 분자는 B7 분자의 세포외 도메인 및 추가로 시그널 서열을 포함한다.

본원에서, "클래스 I 제한 항원"은 주요조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 그루브와 결합하고 MHC 클래스 I 분자의 콘텍스트내에서 T 세포로 전달되는 항원을 포함한다. 클래스 I 제한 항원은 주로 CD8+ T 세포를 자극한다. 본원에서, "클래스 Ⅱ 제한 항원"은 주요조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 Ⅱ 그루브와 결합하고 MHC 클래스 Ⅱ 분자의 콘텍스트내에서 T 세포로 전달되는 항원을 포함한다. 클래스 Ⅱ 제한 항원은 주로 CD4+ T 세포를 자극한다.

본원에서, "보조제"는 항원에 대한 면역반응을 강화시키는 항원을 포함한다. 보조제는 공동자극 분자와 결합 투여되어 항원반응을 보다 더 증대시킬 수 있다.

본원에서, "단일특이성"은 단지 하나의 특이성만을 갖는 가용성 공동자극 분자들을 포함하며, 이들은 이들의 동족 리간드 예를 들어, T 세포상의 CD28 또는 CTLA4와 특이적으로 결합한다. 이러한 단일 특이성 제제는 추가의 특이성을 포함하도록 조작되지 않았으며, 따라서 다른 세포 표면 분자와 표적화된 방법으로 결합하지 않는다. 본원에서, "올리고특이성"은 하나 이상의 특이성 예를 들어, B7 리간드 이외의 분자에 대한 특이성 예를 들어, 세포표면 분자 예컨데, 종양세포항원또는 T 세포 수용체에 대한 특이성을 갖는 공동자극 분자를 포함한다. 본원에서, "2가"는 하나의 가용성 공동자극 분자에 대해, 이들의 동족 리간드 예를 들어, CD28 및/또는 CTLA4와 상호작용하기 위한 두개의 결합 부위를 가지는 가용성 공동자극 분자를 포함한다. 본원에서, "이량체"는 동종이량체 즉, 예를 들어 이황화 결합에 의해 상호 결합된 두개의 동일한 서브유닛을 포함하는 하나의 유닛으로서 존재하는 가용성 형태를 포함한다. 본원에서, "다량체"는 두개 이상의 서브유닛을 갖는 가용성 형태를 포함한다.

Ⅱ. 가용성 공동자극 분자

B7 항원은 프로페셔널 항원발현세포 (예를 들어, 모노사이트, 수지상 세포, 랑게르한스 세포)인 B 림프구 및 면역세포에 항원을 제공하는 세포 (예를 들어, 각질세포, 내피세포, 성상세포, 섬유모세포, 히소돌기아교세포)의 표면에서 발견되는 공동자극 분자 계열이다. 이들 공동자극 분자는 T 세포상의 CTLA4, CD28, 및/또는 ICOS와 결합하거나, 면역세포상의 다른 공지이거나 아직 확인되지 아니한 수용체와 결합한다. 이러한 계열의 공동자극 분자의 구성원은 활성화된 T 세포에 공동자극을 제공함에 의해 T 세포 증대 및/또는 사이토카인 분비를 유도한다.

B7 분자에 대한 정제기술은 설립되어 있으며, 또한 B7 유전자 (cDNA)가 사람 및 마우스를 포함하는 다수의 종으로부터 클로닝되었다 (참고문헌: 예를 들어, Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262: 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:2185-2192).

공동자극 분자의 누클레오티드는 당업계에 공지이며 문헌 또는 진뱅크(GenBank)와 같은 데이타베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, B7-2 (참고문헌: Freeman et al. 1993 Science. 262:9090 or GeneBank Accession numbers P42081 or A48754); B7-1 (참고문헌: Freeman et al. J. Exp. Med. 1991. 174:625 or GeneBank Accession numbers P33681 or A45803); CTLA4 (참고문헌: 예를 들어, Ginsberg et al. 1985. Science. 228:1401; or GenBank Accession numbers P16410 or 291929); 및 CD28 (참고문헌: Aruffo and Seed. Proc Natl. Acad. Sci. 84:8573or Genbank Accession number 180091), ICOS (참고문헌: Hutloff et al. 1991. Nature. 397:263; WO 98/38216), 및 관련 서열들을 발견할 수 있다.

공동자극 분자의 자연발생 형태에 부가하여, 용어 "공동자극 분자"는 또한 공동자극 분자의 기능 예를 들어, 동종 카운터 수용체와 결합하는 능력을 보유하는 공동자극 분자의 비자연발생 형태 예를 들어, 변이체 또는 돌연변이 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비공동작극성 분자 유전자와 하이브리다이징되는 것을 피할 수 있는 조건하에서 (예를 들어, 5 X SSC (1 X SSC = 150 mM NaCl/0.15 M Na 시트레이트)내의 65℃와 대등한 조건하에서), B7 분자를 엔코딩하는 DNA와 하이브리다이징할 수 있는 DNA 서열은 항B7 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 공동자극 분자의 기능 예를 들어, 다른 공동자극 분자와의 결합에 중요한 단백질 도메인을 엔코딩하는 핵산 분자의 영역에 대한 서열 동일성을 보유하는 DNA 서열이, 면역원으로 이용될 수 있는 공동자극 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 비자연적으로 발생하는 공동자극 분자는, 자연발생의 공동작극성 분자 세포외 도메인의 아미노산 서열과 상당한 아미노산 동일성을 갖는다 (예를 들어, 70%초과, 바람직하게는 80% 초과 및 보다 더 바람직하게는 90-95%).

공동자극 분자와 이것의 카운터 수용체의 결합에 있어 중요한 것으로 보이는 공동자극 분자의 아미노산 잔기를 결정하기 위해, 다른 종 예를 들어, 마우스 및 사람의 공동자극 분자의 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 정렬될 수 있으며 보존된 (예를 들어, 동일한) 잔기가 주목될 수 있다. 이것은 예를 들어, 임의의 표준 정렬 프로그램 예컨데, Meg-Align (DNA STAR)를 사용함에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 정렬 프로그램은 하기에 보다 더 상세히 기술된다. 이와 같이 보존되거나 동일한 잔기는 공동자극 분자가 이들의 수용체에 결합하는데 필수적인 것으로 보이며, 따라서 변경될 것으로 보이지 않는다.

예를 들어, CD28 및 CTLA4와의 기능적 상호작용을 조절하는데 중요한 B7-1 분자의 영역이 돌연변이에 의해 확인되었다. Y87 잔기를 포함하고, 모든 B7-1 및 B7-2 분자중에 보존된 B7-1의 V형 도메인 내의 2개의 소수성 잔기가 매우 중요한 것으로 밝혀졌다 (참고문헌: Fargeas et al. 1995. J. Exp. Med. 182:667). 이들 또는 유사한 기술을 사용하여, 매우 중요하고 따라서 변경될 수 없는 공동자극 분자의 세포외 도메인의 아미노산 잔기가 결정될 수 있다.

B7 cDNA 분자를 사용하면서, B7 활성을 갖는 펩티드는 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 펩티드를 발현하도록 트랜스펙션된 숙주 세포는 임의의 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 예를 들어, B7 활성을 가지는 펩티드가 세균세포 예컨데, 대장균(E. coli), 곤충 세포 (바쿨로바이러스), 효모, 또는 포유동물세포 예컨데, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 및 NS0 세포 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포 및 발현 벡터가 상기 참고문헌 (Goeddel, 1990)에서 발견될 수 있으며, 이는 당업자에 공지이다.사카로마이세스 세레비재(S. cerivisae)에서의 발현 벡터의 예로는 pYepSec1 (참고문헌: Baldari. et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (참고문헌: Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), 및 pYES2 (참고문헌: Invitrogen Corporation, San Diego, CA)가 포함된다. 배양된 곤충 세포에서의 단백질 발현에 이용될 수 있는 바쿨로바이러스 벡터 (SF 9Cells)는 pAc 계열 (참고문헌: Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 계열 (참고문헌: Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39)를 포함한다. 일반적으로, COS 세포 (Gluzman, Y., (1981) Cell 23:175-182)가 벡터 예컨데, 일시적 증폭/발현을 위한 pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840)와 함께 결합되어 사용되는 반면에, CHO 세포 (dhfr- Chinese Hamster Overy)는 벡터 예컨데, 포유동물 세포에서 안정적인 증폭/발현을 위한 pMT2PC (참고문헌: Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195)와 함게 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 생산에 적합한 바람직한 세포주는 ECACC (목록 #85110503)로부터 입수할 수 있는 NS0 골수종 세포주이며, 문헌 (Galfre, G. 및 Milstein, C. ((1981) Methods in Enzymology 73(13):3-46; and Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y)에 기술되어 있다. 벡터 DNA는 공지의 기술 예를 들어, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙틴, 또는 엘렉트로포레이션을 통해 포유동물 세포내로 도입될 수 있다. 숙주세포의 형질전환에 적합한 방법은 문헌(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989), 및 다른 실험 교재에서 발견될 수 있다. 포유동물 세포가 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스로 부터 유도되며, 가장 흔하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터 유도된다.

B7 활성을 갖는 펩티드가 포유동물세포 내에서 발현되거나, 황산암모늄 침전, 분획 컬럼 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 겔 여과, 전기영동, 친화 크로마토그래피 등) 및 종국적인 결정화 (참고문헌: "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577(1971)를 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 가용성 B7 분자를 제조하기 위한 B7 분자가 임의의 포유동물 종 및 바람직하게는 사람으로부터 유도될 수 있다. 수개의 기원으로부터의 B7 분자의 누클레오티드 서열은 당업계에 공지이다. 사람 B7-1 (CD80)의 완전한 DNA 서열은 진뱅크 번호 제 M27533호를 가지며, 문헌 (Freeman et al. in 1989 in J. Immunol. 143:2714)에 개시되어 있다. 사람 B7-2의 완전한 cDNA 서열은 진뱅크 번호 제 L25259호를 가지며 문헌 (Freeman et al. in Science in 1993. 262;9090 또는 Azuma et al. Nature. 1993. 366;76)에 개시되어 있다. B7-1 및 B7-2 둘 모두의 서열에 대해서는 WO 96/40915를 참고할 수 있다. 사람 B7-1 및 사람 B7-2의 누클레오티드 서열은 또한 서열번호: 1 및 2 (B7-1) 및 서열번호: 3 및 4 (B7-2)에 기술된다. 또한, 이러한 서열은 공지의 예를 들어, 사람 B7 서열에 대해 하이브리다이징되는 서열의 능력에 기초한 목적하는 기원으로부터 B7 핵산 분자를 단리함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, B7 분자는 높거나 낮은 엄격한 조건하에서 이들이 B7 활성을 갖는 펩티드를 엔코딩하는 공지의 핵산 분자와 하이브리다이징하는 능력에 의해 결정될 수 있다. DNA 하이브리다이징을 촉진하는 적합한 엄격한 조건 예를 들어, 약 40℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC) 및 후속하여 50℃에서 2.0 x SSC는 당업자에게 공지이며 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃하 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격한 조건으로부터 50℃하 약 0.2 x SSC의 높은 엄격한 조건까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온또는 낮은 엄격한 조건의 실온, 약 22℃에서부터 높은 엄격한 조건의 약 65℃까지 증가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, B7 분자는 사람 B7 분자이다.

일 구체예에서, 가용성 공동자극 분자는 자연발생의 B7-1 또는 B7-2 분자로부터 유도된다. 본원에 기술된 것으로서, B7 분자 활성을 가지며, 유전자 코드의 변성으로 인하여 자연발생 B7 분자와는 다른 서열을 갖는 폴리펩티드가 가용성 형태로서 발현될 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이와 같은 핵산은 B7과 기능적으로 등가 (예를 들어, B7 활성을 갖는 폴리펩티드)이나 당업계에 공지된 B7-1 또는 B7-2의 서열과는 다른 폴리펩티드를 엔코딩한다. 예를 들어, 수개의 아미노산이 하나 이상의 트리플렛에 의해 고안된다. 동일한 아미노산을 특성화하는 코돈, 또는 시노님 (예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘의 시노님이다)이 유전자 코드중내의 변성에 의해 발생할 수 있다. 일 예로서, B7 분자의 누클레오티드 서열내의 DNA 서열 다형성 (특히, 코돈의 제 3 염기내에서)은 엔코딩된 아미노산에 영향을 주지 않는 "사일런트" 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, B7 항원의 아미노산 서열내의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성은 모집단 중에 존재할 것으로 예상된다. 신규한 B 림프구 항원의 활성을 갖는 펩티드를 엔코딩하는 핵산의 하나 이상의 누클레오티드에서의 이들 변이 (누클레오티드의 약 3-4% 이하)가 자연 대립형질 변이로 인하여 모집단내의 개체중에 존재할 수 있음을 당업자는 예측할 수 있다. 이와 같은 누클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 또한 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 이들은 하나 이상의 이소포옴 (isoform) 또는 관련된 교차반응 B7 분자일 수 있다.

자연발생 대립형질 변이체에 부가하여, 본 발명의 범주에 속하는 B7 분자는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 가용성 공동자극 분자는, B7 공동자극 분자의 기능을 보유하는 즉, 기능적으로 동일한 B7-1 또는 B7-2의 변형된 형태이다. B 림프구 항원의 DNA 서열은 유전자 기술에 의해 변경된 아미노산 서열을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하도록 변형될 수 있다. 이러한 서열은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 간주되며, 여기서 발현된 폴리펩티드는 CTLA4 및/또는 CD28과 결합할 수 있으며, T 세포 매개 면역 반응 및 면역 기능을 조절할 수 있다.

예를 들어, 일 구체예에서, 돌연변이가 단순한 결실 또는 삽입, 전체적 결실, 염기 클러스터의 삽입 또는 치환 또는 단일 염기의 치환을 생성시키기 위한 방법을 포함하는 수개의 방법중의 임의의 하나에 의해 B 림프구 항원 DNA의 변이체 또는 변형된 등가물을 생산하도록 DNA 분자중에 도입될 수 있다. 예를 들어, B7-1 또는 B7-2 cDNA 서열내의 변화 예컨데, 아미노산 치환 또는 결실이 바람직하게는 사이트-디렉티드 돌연변이 유발에 의해 수득될 수 있다. 사이트 디렉티드 돌연변이 유발 시스템은 당업계에 공지이다. 프로토콜 및 시약은 아머샴 인터내셔날 피엘시 (Amersham International PLC, Amersham, U.K.)에 의해 시판된다.

B7 활성 즉, B7 분자의 천연 리간드와 결합는 능력 및 예를 들어, 사이토카인 생산 및/또는 일차 활성화 시스널을 수용한 T 세포에 의한 T 세포의 증대에 의해 입증되는 바와 같은 T 세포 매개 면역반응을 조절하는 능력을 갖는 변형된 폴리펩티드가 본 발명의 범주에 속하는 것으로 간주된다.

B7 분자의 활성을 갖는 펩티드의 변형의 다른 예는, 이황화 결합을 통한 이량체화를 최소화시키기 위해 시스테인 잔기를 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 루이신 또는 글루탐산 잔기와 치환시키는 것이다. 또한, B7 활성을 갖는 아미노산 측쇄가 화학적으로 변형될 수 있다. 다른 변형은 펩티드의 고리화이다.

안정성 및/또는 반응성을 증가시키기 위해, B7 활성을 지닌 폴리펩티드가 임의의 자연 대립형질 변이로부터 초래되는 항원의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 다형성을 통합시키도록 변형될 수 있다. 또한, D-아미노산, 비천연아미노산, 또는 비아미노산 유사체가, 본 발명의 범주내에서 변형된 단백질을 생성시킬 수 있도록 치환되거나 부가될 수 있다. 또한, 펩티드는 A. Sehon 및 공동연구자 (상기 Wieet al.)의 방법에 따라 PEG와 컨쥬게이션된 펩티드를 생성시키도록 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 변형될 수 있다. 또한, PEG는 펩티드의 화학합성중에 첨가될 수 있다. 펩티드의 다른 변형은 환원/알킬화 (참고문헌: Tarr in: Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Silver ed., Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986)); 아실화 (상기 Tarr); 적합한 담체와의 화학결합 (참고문헌: Mishell and Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), U.S. Patent 4,939,239; 또는 온화한 포르말린 처리 (참고문헌: Marsh (1971), Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41:199-215).

바람직한 B7 폴리펩티드는 B7 활성 및 자연 발생 B7 아미노산과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성을 갖는다. B7 활성 및 자연 발생 B7 아미노산과 약 90 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 및 보다 더 바람직하게는 약 98-99% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드가 또한 본 발명의 범주에 속한다. 주어진 위치에서의 아미노산 "동일성"은 펩티드의 아미노산 서열이 정렬되는 경우 대응하는 위치에 동일한 아미노산을 갖는 두개의 펩티드를 언급한다. 비교된 서열내의 어느 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일성이 있다. 서열의 동일성의 정도 (또는 백분율)는 서열들에 의해 합치되거나 동일한 위치의 수의 함수이다.

당업자는 생물학적으로 유의할만한 정렬을 제공하기 위해 두개의 아미노산을 손쉽게 정렬시킬 수 있다. 서열의 비교 및 두개의 서열간의 백분율 동일성의 측정은 수학적인 알고리즘을 사용함에 의해 달성될 수 있다. 일 구체예에서, 두개의아미노산 서열간의 백분율 동일성은, 블로솜 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com으로부터 입수할 수 있다)내의 GAP 프로그램으로 통합된 니들맨 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch) 알고리즘, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 5 또는 4의 갭 웨이트 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 웨이트를 사용함에 의해 측정될 수 있다. 다른 구체예에서, 두개의 아미노산 또는 누클레오티드 사이의 백분율 동일성은 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에 통합된 이. 메이어 (E. Meyers) 및 더블유. 밀러 (W. Miller) (CABIOS, 4:11-17(1989))의 알고리즘을 사용함에 의해, PAM120 웨이트 잔기 테이블, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어, 다른 계열의 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공지의 데이타베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "탐색 서열"로서 이용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 (Altscul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 누클레오티드 검색은, 본 발명의 핵산 분자에 대해 상동인 핵산 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은, 본 발명의 B7 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3로 수행될 수 있다. 비교할 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해서는, 갭 BLAST가 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기술된 바에 따라 이용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어,XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트된 변수가 사용될 수 있다 (참고 인터넷사이트 주소: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

"B7 분자의 세포외 도메인의 일부 이상"은, B7의 세포외 도메인 서열 전부 또는 활성(즉, 면역세포상의 B7의 천연 리간드와의 결합력 예컨데, T 세포상의 CTLA4 및/또는 CD28과의 결합)을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 이것의 일부분을 포함하는 것으로 정의된다. B7 활성을 갖는 펩티드는 CTLA4 및/또는 CD28을 결합하고, T 세포 매개 면역반응을 예를 들어, 이들의 리간드와 결합하거나 실시예에 제시된 바와 같이 일차 활성화 시그널을 수용한 T 세포에 의한 사이토카인의 생성 및/또는 증대를 유도함에 의해 입증되는 바와 같이 조절한다. 바람직한 구체예에서, "B7 분자의 세포외 도메인의 일부 이상"은 CTLA4 및/또는 CD28과 결합하는데 이용될 수 있는 사람 B7 항원의 세포외 부분의 전체 (예를 들어, 대략 B7-1의 서열의 아미노산 잔기 1-208 또는 대략 B7-2의 서열의 아미노산 잔기 24-245)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

단지 자연발생 아미노산만을 포함하는 B7 폴리펩티드에 부가하여, B7 펩티도미메틱스가 또한 제공된다. 약품업계에서는 펩티드 유사체가 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 지닌 비펩티드 약물로서 통상적으로 사용된다. 비펩티드 화합물의 이러한 유형은 "펩티드 미메틱스" 또는 "펩티도미메틱스"로서 명명되며 (참고문헌: 본원에 참고로서 통합된 것으로서, Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Fridinger (1985) TINS p.392; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229), 대개 컴퓨터를 이용한 분자 모델링의 도움으로 개발되었다.

치료적으로 유용한 펩티드와 유사한 구조인 펩티드 미메틱스가 등가의 치료적 또는 예방적 효과를 제공하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱스는 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드) 예컨데, B7과 구조적으로 유사하나, 당업계에 공지된 방법에 의해 CH2NH-, CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-로 구성된 군으로부터 선택된 결합에 의해 임의 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 기지며, 각각이 본원에 참고로서 통합된 문헌 (Spatola, A.F. in "Chemistry and Biochemistry od Amino Acids, Peptides, and Proteins, "B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (general review); Moley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (general review); Hudson, D. et al., Int J Pept PrtRes (1979) 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spotola, A.F. et al., Life Sci (1986) 38:1243-1249 (-CH2-S-); Hann, M.M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almquist, R. G. et al., J Med Chem (1980) 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett (1982) 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M. et al., European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett (1983) 24:4401-4404(-C(OH)CH2-); 및 Hurby, V. J., Life Sci (1982) 31:189-199 (-CH2-S-))에 추가로 기술되어 있다. 특히 바람직한 비펩티드 결합은 -CH2NH-이다.

이와 같은 펩티드 미메틱스는 폴리펩티드 구성체와 비교하여 예를 들어, 경제적으로 보다 더 우수한 생산성, 보다 더 우수한 화학적 안정성, 강화된 약리학적 성질 (반감기, 흡수성, 효능, 효과 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 생물학적 활성의 광 스펙트럼), 감소된 항원성 등을 포함하는 현저한 장점을 갖는다. 펩티도미메틱스의 표지화는 일반적으로, 정량적 구조-활성 데이터 및/또는 분자 모델링에 의해 예측된 펩티도미메틱스 상의 비방해 부위에 대한 직접적인 또는 스페이서 (예를 들어, 아미드 기)를 통한 하나 이상의 표지의 공유결합을 포함한다. 일반적으로, 이러한 비방해 부위는 치료적 효과를 생성시키기 위해 펩티도미메틱스가 결합하게되는 거대분자와 직접적인 접촉을 형성하지 않는 부위이다. 펩티도미메틱스의 유도 (derivatization) (예를 들어, 표지화)가 펩티도미메틱스의 목적하는 생물학적 또는 약리학적 활성을 실질적으로 방해해서는 않된다.

B7 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산과 동일한 유형의 D-아미노산의 계획적인 치환 (예를 들어, L-리신을 대신하여 D-리신)이 보다 더 안정적인 펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, B7 아미노산 서열 또는 실질적으로 동일한 서열 변이를 포함하는 속박된 펩티드가 당업계에 공지된 방법 (참고문헌: Rizo and Gierasch (1992) Ann, Rev.Biochem. 61:387) 예를 들어, 펩티드를 고리화하는 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 가함에 의해 제공될 수 있다.

당업자는 과도한 실험 없이도 B7 펩티드 서열 및 이것의 서열 변이체에 대응하는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 B7 펩티드 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 발현에 의해 원핵 또는 진핵숙주 세포내에서 흔히 보다 더 큰 폴리펩티드의 일부로서 생성될 수 있다. 또한, 이러한 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주내에서 이종성 폴리펩티드의 발현 방법, 폴리펩티드의 화학합성, 및 시험관내 트랜스래이션은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 참고로서 통합되는 문헌 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Technology (1987), Academic Press, Inc., San Die해, Calf.: Merrifield, J. (1969) j. aM. cHEM. sOC. 91:501; cHAIKEN I. m. (1981) crc cRIT. rEV. bIOCHEM. 11:255; kAISER ET AL. (1989) sCIENCE 243: 187; mERIFIELD, b (1986) sCIENCE 232:342; kENT, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wieley Publishing)에 추가로 기술된다.

펩티드는 예를 들어, 직접적인 화학합성에 의헤 생성될 수 있다. 펩티드는 N-말단 및/또는 C-말단과 공유결합에 의해 부착된 비펩티드 부분을 지닌 변형된 펩티드로서 생성될 수 있다. 바람직한 특정 구체예에서, 카르복시 말단 또는 아미노 말단중의 어느 하나 또는 둘 모두가 화학적으로 합성될 수 있다. 말단의 아미노 및 카르복시 기의 가장 일반적인 변형은 각각 아세틸화 및 아미드화이다. 아미노말단 변형 예컨데, 아실화(예를 들어, 아세틸화) 또는 알킬화 (예를 들어, 메틸화) 및 카르복시 말단 변형 예컨데, 아미드화, 및 고리화를 포함하는 다른 말단 변형이 본 발명의 다양한 구체예로 통합될 수 있다. 특정 아미노 말단 및/또는 카르복시말단 변형 및/또는 중심 서열로의 펩티드 신장은, 물리적, 화학적, 생물학적 및 약리학적 성질 예컨데, 증가된 안정성, 증가된 효능 및/또는 효과, 혈청 프로테아제에 대한 내성, 바람직한 약동학적 성질 등의 장점을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 B7 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 본원에서 B7 "키메라 폴리펩티드" 또는 "융합 폴리펩티드"는 비-B7 폴리펩티드와 작동적으로 결합된 B7 폴리펩티드를 포함한다. "B7 폴리펩티드"는 B7 폴리펩티드와 대응사는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하는 반면, "비-B7폴리펩티드"는 B7 폴리펩티드와 실질적으로 상동이 아닌 폴리펩티드 (예를 들어, B7 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드 및 동일하거나 다른 유기체로부터 유도된 폴리펩티드)와 대응하는 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. B7 융합 폴리펩티드내에서, B7 폴리펩티드는 B7 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 대응할 수 있다. 바람직한 구체에에서, B7 융합 폴리펩티드는 B7 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 융합 폴리펩티드내에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 B7 폴리펩티드 및 비-B7 폴리펩티드가 상호 프레임내에서 융합되었음을 지시한다. 비-B7 폴리펩티드는 B7 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있다.

약 40 아미노산 잔기 길이 이상, 바람직하게는 약 80 아미노산 잔기 길이 이상, 보다 더 바람직하게는 약 120 아미노산 잔기 길이 이상의 B7 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있는 핵산 단편이 바람직하다. 약 200 아미노산 잔기 길이 이상인 단편 예를 들어, B7 분자의 전체 세포외 도메인을 포함하는 단편이 특히 바람직하다. 수개의 방법이 단리된 DNA 서열의 단편을 생성시키기 위해 이용될 수 있다. B7-1또는 B7-2단백질을 엔코딩하는 핵산의 작은 서브영역 또는 단편 예를 들어, 1-30 염기길이가 표준 유기화학합성법에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은 또한 B7 DNA의 보다 더 큰 합성 단편의 생성에 사용하기 위한 프라이머의 제조에 유용하다.

B 림프구 항원을 엔코딩하는 유전자의 보다 더 큰 서브영역 또는 단편이 관련된 DNA 조각을 중합효소연쇄반응 (PCR) (참고문헌: Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989))을 사용한 합성, 및 이와 같이 수득된 DNA를 적합한 발현 벡터와 결합시킴에 의해 펩티드로서 발현될 수 있다. PCR을 이용하는 동안, 클로닝된 이중가닥 DNA의 특정 서열이 생성되고 발현벡터로 클론이된 다음, CTLA4/CD28 결합 활성에 대해 분석된다. 예를 들어, PCR을 이용하여 사람 B7-1 또는 B7-2 단백질의 분비된 (가용성) 형태를 발현시키기 위해, 막단백질 및 단백질의 세포질 영역을 엔코딩하지 않는 DNA가 합성될 수 있다. 이러한 DNA 분자는 적합한 발현 벡터로 라이게이션되어 숙주 세포 예컨데 CHO내로 도입될 수 있으며, 여기서 B7 단백질 단편이 합성되고 분비된다. 다음, B7 단백질 단편은 배양 배지로부터 쉽게 수득될 수 있다.

일 구체예에서, B7 분자의 일부 이상 예컨데, 분자의 막단백질 부분이 결핍된 세포외 도메인 부분이 발현 벡터내에 놓이고 숙주 세포에 의해 발현되어, 그 결과 B7 분자가 세포의 표면에서 발현되지 않는다. 예를 들어, B7 분자의 세포외 도메인 엔코딩하는 cDNA는 B7-1 또는 B7-2의 공지 서열로부터 유도된 프라이머를 사용하는 PCR (미국특허 제 4,683,202호)에 의해 합성될 수 있다 (참고문헌: Freeman et al., J. Immunol. 1989. 143:2714 또는 Science. 1993. 262:9090). 생성된cDNA 서열은 원핵 또는 진핵 발현벡터로 수집될 수 있으며, 상기 벡터는 적합한 숙주 예를 들어, COS 또는 CHO 세포에 의해 B7의 세포외 도메인의 합성에 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 발현벡터는 B7 항원 활성을 갖는 펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 제 2 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 포함한다. 상기 제 2 폴리펩티드는 공동자극 분자로부터 유도되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 B7 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 방법에 의해 생성된다. 예를 들어, 다른 폴리펩티드 서열을 코딩하기 위한 DNA 단편은 공지의 방법 예를 들어, 라이게이션을 위한 블런트 말단 또는 스태거 말단, 적합한 말단을 제공하기 위한 제한효소 분해, 적합한 것으로서 접착 (cohesive) 말단의 필링-인, 목적하지 않은 결합을 피하기 위한 알칼리 포스포타아제 처리, 및 효소적 라이게이션을 이용함에 의해 프레임내에 상호 라이게이션될 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 공지 기술에 의해 합성될 수 있다. 또한, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 키메라 유전자 서열을 생성시키기 위해 후속하여 재어닐링 및 재증폭될 수 있는 두개의 연속적 유전자 단편 사이에서 상보적 내물림을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (참고문헌: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausuel ey al. John Wiley & Sons: 1992). 또한, 융합 부분을 엔코딩하는 많은 발현 벡터가 시판중이다 (예를 들어, GST 폴리펩티드). B7-엔코딩 핵산 분자가 이러한 발현 벡터로 코딩됨에 따라 융합 부분이 프레임내에서 B7 단백질과 결합된다. 예를 들어, 헥사-히스티딘이 고정화 금속이온 친화 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 펩티드에 부가될 수 있다 (참고문헌: Hochuli, E. et al., (1988( Bio/Technology 6:1321-1325). 또한, 관련없는 서열이 없는 B 림프구 항원을 단리시키기 위해, 특이적 엔도프로테아제 절단 부위가 융합 부분 및 펩티드의 서열 사이에 도입될 수 있다. 기능성 기를 펩티드에 가하거나 펩티드의 소수성 부위를 제거함에 의해 펩티드의 가용성을 증가시키는 것이 필요할 수 있다.

일 구체예에서, B7 분자 또는 이것의 부분을 엔코딩하는 DNA가 면역반응이 요구되는 항원 예를 들어, 바이러스 항원 또는 종양세포 항원을 엔코딩하는 DNA와 프레임내에서 결합된다.

일 구체예에서, B7 항원의 세포외 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA가 면역글로불린 분자의 불변영역과 대응하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA와 결합된다 (참고문헌: 미국특허 제 5,580,756호 또는 WO 제 97/28267호). 제 2 펩티드는 면역글로불린 불변영역 예를 들어, 사람 Cγ1 도메인 또는 Cγ4 도메인 또는 Cμ또는 이것의 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어, 힌지, 사람 Cγ1 도메인 또는 Cγ4 도메인의 CH2 및 CH3 영역, 본원에 참고로서 통합된 문헌 카폰(Capon) 등의 미국 특허 제 5,116,964호 참조). 생성된 B7Ig 융합 단백질은 변경된 가용성, 결합 친화성, 안정성 및/또는 가 (즉, 분자당 가능한 결합 부위의 수)를 가질 수 있으며, 단백질 정제의 효율이 증가할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 면역글로불린 불변 영역에서의 시스테인 잔기는 보존되어 이황화 결합 및 가용성 이량체 B7Ig 단백질을 형성시킬 수 있다. 일 구체예에서, B7 분자의 부분이 IgM 항체 또는 이것의 부분의 불변 영역으로 융합되어,B7Ig 단백질의 가용성 다량체 형성체를 형성시킬 수 있다.

특히 바람직한 B7Ig 융합 단백질은 면역글로불린 불변영역과 결합된 사람 B7-1 또는 B7-2의 세포외 도메인 부분 또는 가변 영역계열 도메인을 포함한다. 가용성 B7 분자중에 사용된 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 구조에 의해 결정되는 이펙터 활성을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 함유할 수 있다. 에를 들어, B7-1 또는 B7-2의 세포외 부분을 엔코딩하는 DNA, 및 B7-1 또는 B7-2의 가변영역 계열 도메인을 엔코딩하는 DNA 또는 B7-1 또는 B7-2의 불변영역 계열 도메인을 엔코딩하는 DNA가 사이트 디렉티드 돌연변이에 의해 힌지, 사람 Cγ1 도메인 또는 Cγ4 도메인의 CH2 및 CH3 영역을 엔코딩하는 DNA와 결합될 수 있다.

비사람 면역글로불린 불변영역이 사용되는 경우, 불변역역은 인간화 되는 것이 바람직하다. 키메라 또는 인간화된 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지이다 (참고문헌: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S.A. 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496; European Patent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982); PCT publication WO92/06193 and EP 0239400).

B7 항원 및 가용성 B7Ig 분자에 대응하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA를어셈블링하고 발현시키는 방법 예를 들어, 올리고누클레오티드의 합성, PCR, 세포의 형질전화, 벡터의 구성, 발현 시스템 등은 당업계에 공지이다.

재조합 기술에 의해 생성된 B7 융합 단백질 및 폴리펩티드는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 또한, 단백질 또는 펩티드는 세포질에 보유되고 세포는 수거, 용해되어 단백질이 단리될 수 있다. 일반적으로 세포 배양은 숙주 세포, 배지 및 다른 성분을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당업계에 알려져 있다. 단백질 및 폴리펩티드는 세포배양 배지, 숙주세포, 또는 둘 모두로부터 당업계에 공지된 단백질 및 펩티드 정제 기술을 사용하여 단리시킬 수 있다. 숙주 세포를 트랜스펙션시키고 단백질 및 펩티드를 정제하기 위한 기술은 본원에 추가로 기술된다.

Ⅲ. 활성에 대해 구조적으로 관련된 가용성 공동자극 분자의 스크리닝

본원에 기술된 특징적 B 림프구 항원 활성을 보유하는 것에 대해 구조적으로 관련된 B7 분자의 스크리닝은 수개의 다른 분석법중 하나 이상을 사용함에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 이들이 자연 발생 B7 분자와 결합하는 항-B7 모노클로날 항체와의 반응성을 유지함을 제시하도록 스크리닝될 수 있다. 특히, 적합한 세포 예컨데, COS 세포는 시험될 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 사용하여 트랜스펜션될 수 있다. B7의 분비된 형태의 생산은 면역침전검정에서 항-B7 모노클로날 항체 또는 CTLAIg 또는 CD28 융합 단백질을 사용하여 평가될 수 있다. 패닝법에 의해 혈소판상의 CTLA4 또는 CD28과 결합하는 관심있는 펩티드를 발현하는 세포의 능력이 시험될 수 있다. 또한, CD28 또는 CTLA4와 결합에 대한, 시험 펩티드의 자연발생 B7 분자와의 길항이 시험될 수 있다.

보다 더 바람직하게는, 다른 분석법이 B7 항원의 기능적 특성을 시험한다. 상기한 바와 같이, 사이토카인을 합성하는 T 세포의 능력은 항원에 대한 T 세포 수용체의 점유 또는 가교결합 (예를 들어, 항-CD3 또는 "활성화된 T 세포"를 생산하기 위한 포르볼 에스테르 (phorbol ester)에 의해 제공된 "일차 활성화 시그널") 뿐만아니라, 본원의 경우 B 림프구 항원과의 상호작용 예를 들어, B7-1 또는 B7-2와 T 세포상의 CD28 및/또는 CTLA4의 상호작용에 의해 제공된다. B7 분자와 T 세포 수용체를 통해 시그널을 수용한 T 세포상의 이들의 천연 리간드와의 결합은 사이토카인 특히 인터루킨-2의 수준의 증가를 유도하는 T 세포로의 시그널 전달의 효과를 가지며, 이는 또한 T 림프구의 증대를 유도한다. B7 융합에 대한 다른 분석법은 사이토카인 예컨데 인터루킨-2, 인터루킨-4 또는 다른 사이토카인의 합성에 대한 분석, 및/또는 일차 활성화 시그널을 수용한 CD28+ T 세포에 의한 T 세포 증대에 대한 분석을 포함한다.

시험관내에서, T 세포는 이들을 항-T3 모노클로날 항체 (예를 들어, 항-CD3) 또는 포르볼 에스테르와 접촉시킴에 의해, 제 1 또는 일차 활성화 시그널이 제공되도록 할 수 있다. 일차 활성화 시그널을 수용한 T 세포는 본원에서 활성화된 T 세포로 언급된다. B7 기능은 B7의 기원 (예를 들어, B7 활성을 갖는 펩티드를 발현하는 세포 또는 B7의 분비된 형태) 및 일차 활성화 시그널 예컨데, MHC 클래스 Ⅰ 또는 Ⅱ와 결합된 항원을 T 세포 배양물에 가하고, 기능적 결과를 분석함 예를 들어, 인터루킨-2, 감마 인터페론, 또는 다른 공지의 또는 미지의 사이토카인에 대해상층액을 분석함에 의해 분석된다. 예를 들어, 인터루킨-2에 대한 수개의 통상적인 분석법의 어느 하나 예컨데, 관련 부분이 본원에 참고로서 통합된 문헌 (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 86:1333 (1989))에 기술된 분석법이 이용될 수 있다. 인터페론 생산에 대한 분석용 키트는 진자임 코포레이션 (Genzyme Corporation) (Cambridge, MA)으로부터 입수할 수 있다. T 세포의 증대는 하기 실시예에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 본원에 기술된 것으로서 B7 항원의 특성을 보유하는 펩티드가 T세포에 의한 하나의 세포당 증가된 사이토카인 예를 들어, IL-2의 생산을 초래할 수 있고, 공동자극 시그널이 결핍된 음성 대조군과 비교하는 경우 증가된 T 세포의 증대를 초래할 수 있다.

Ⅳ. 가용성 공동자극 분자의 투여 방법

본원에 기술된 주제의 조성물 및/또는 제제가 면역반응을 증진시키는 것이 요구되는 피험자에 투여된다. 일 구체예에서, 가용성 B7 분자는 예방학적으로 예를 들어, 병독소의 감염 이전 또는 암이 없는 피험자에 항원과 함께 투여된다. 다른 구체예에서, 주제의 가용성 B7 분자는 치료적으로 예를 들어, 증강된 공동자극으로부터 유리한 효과를 얻게되는 이미 발병된 질환을 지닌 피험자 예를 들어, 암이 존재하거나 병독소로 감염된 피험자에 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 주제의 공동자극 분자는 항원 제형물과 공동으로 투여된다. 항원은 단백질, 다당류, 지질단백질이거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 항원은 천연 단백질 또는 단백질 단편, 합성 단백질 또는 단백질 단편, 또는 펩티드를 포함하거나; 당단백질, 글리코펩티드, 지단백, 누클레오단백, 누클레오펩티드를 포함하거나; 펩티드-펩티드 컨쥬게이션을 포함하거나; 재조합 핵산 발현 생성물을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 항원성 제조물은 항원의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 조사된 세포 (예를 들어, 종양세포 또는 생감염된 세포), 바이러스 입자, 또는 조제의 균질화물의 형태로 투여될 수 있다. 다른 구체에에서, 항원성 펩티드의 정제된 제형 또는 항원성 펩티드의 재조합된 형태 예를 들어, 바이러스 펩티드 또는 종양 관련 항원이 피험자에 투여된다. 일 구체예에서, 항원 제조물은 MHC 클래스 I 제한 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 항원 제조물은 MHC 클래스 Ⅱ 제한 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 항원 제조물은 피험자에 대한 투여를 위해 클래스 I 제한 펩티드 및 클래스 Ⅱ 제한 펩티드를 포함한다.

일 구체예에서, 항원은 "유전적 면역화"에 의해 투여된다. 일 구체예에서, 목적하는 펩티드를 엔코딩하는 DNA 발현 벡터가 숙주 동물내로 예를 들어, 피험자의 피부 또는 근육내로 주입된다. 유전자 생성물은 정확하게 합성되고 글리코실화되며, 폴딩되고, 피험자에 의해 발현된다. 이러한 방법을 사용하여, 충분한 양 또는 순도로 수득하기 어려운 항원이 투여될 수 있다. 일 구체예에서, DNA가 근육내로 주입되거나 입자 충격투여 장치 즉 "진건 (gene gun)"에 의해 금 입자상에 코팅되어 피부내로 전달된다. 유전적 면역화가 특이적 체액성 반응 및 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 나타났다 (참고문헌: Mor et al., 1995. J. Immunol. 155:2039; Xu and Liew. 1995. Immunology. 84:173; Davis et al. 1994. Vaccine. 12:1503).

가용성 B7 분자의 적정 투여 경로는 처리될 피험자에 따라 다르다. 예를 들어, 가용성 B7 분자는 항원과 함께 투여 및/또는 항원의 투여에 앞서 단독으로 투여되거나, 항원의 투여 후 수일동안 단독으로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 가용성 B7 분자는 가용성 B7 분자 또는 이것의 부분을 엔코딩하는 핵산 분자를 투여함에 의해 "유전적으로" 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 가용성 B7 분자 및 항원은 컨쥬게이션 형태로 투여될 수 있다.

가용성 B7 분자의 투여 용량 섭생법은 각각의 피험자에게 최적의 치료 반응을 제공할 수 있도록 과도한 시험없이 조절될 수 있다. 예를 들어, 항원에 대한 항체역가 또는 항원에 대한 세포성 면역반응 (예를 들어, DTH 반응 (참고문헌: Puccetti et al. 1994. Eur. J. Immunol. 24: 1446)은 피험자가 면역반응을 발생시키고 있는지의 여부 또는 항원에 대한 증강된 면역반응을 나타내고 있는지를 결정하도록 측정될 수 있으며, 용량 섭생법은 이에 따라 조절될 수 있다.

활성제 및 조성물은 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 상기 제제는 예를 들어, 비내, 구강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 점막으로 투여될 수 있다. 분산물이 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 이것의 혼합물 및 오일내에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건에서, 이들 제형은 미생물의 증식을 방지하기 위한 보존제를 함유할 수 있다.

주입에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수성 용액 (수가용성) 또는 멸균 주입 요액 또는 분산물의 일시적 제조를 위한 분산물 또는 멸균 분말을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 특정 투여 경로에 적합하도록 제형될 수 있다. 예를들어, 많은 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 주입, 흡입 또는 통기법 (insufflation) (입 또는 코를 통해), 또는 비내, 점막, 구강, 협측, 비경구, 직장, 근내, 정맥내, 복강내, 및 피하 전달에 적합하게 될 수 있다.

제제 또는 조성물은 멸균된다. 또한, 이들은 제조 및 저장 조건에서 안정적이어야 하며, 미생물 예컨데 세균 및 곰팡이의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산물, 및 이들의 적절한 혼합물일 수 있다. 적절한 유체특성은 예를 들어, 코팅 예컨데, 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항곰팡이제 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 조성물내에 등장제 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨데, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직하다. 주입 조성물의 연장된 흡수는 조성물내에 흡수를 연장시키는 제제 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴에 의해 달성될 수 있다.

멸균 주입 용액은 활성 조성물 또는 제제를 필요한 양만큼 적절한 용매중에, 상기 필요한 것으로서 열거된 성분의 하나 또는 조합물과 함께 통합시키고, 여과 멸균처리함에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물 (예를 들어, 공동자극 분자 및/또는 항원 및 임의의 첨가제)을 염기성 분산 배지 및 상기 열거된 것들 중의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클내로 통합시킴에 의해 제조된다. 멸균 주입 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 활성 성분의 분말 (예를 들어, 제제 또는 조성물)에 더하여 이것의 미리 멸균 여과시킨 용액으로부터의 임의의 부가의 목적하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 동결건조방법이다. 상기 제제 또는 조성물은 예를 들어, 문헌 (Mol Med 1988). 4:109)에 기술된 바늘없는 주입 장치 (당업계에 공지된 것으로서 예를 들어, 미국특허 제 5,383,851호; 제 5,581,198호; 제 5,846,233호)와 사용하기에 적합한 형태로 투여될 수 있다.

활성제 또는 조성물이 상기한 바와 같이 적절히 보호되는 경우, 단백질이 구강으로 예를 들어, 불활성 희석제 또는 흡수성 식용 담체와 함께 투여될 수 있다. 본원에서, "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용액, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등장제 및 흡수 연기제 등을 포함한다. 약학적으로 활성안 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지이다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물내에서의 이것의 사용이 고려된다. 부수적인 활성 화합물이 또한 조성물내로 통합될 수 있다.

투여를 용이하게하고 용량의 통일화를 위해 비경구적 조성물을 용량 유닛 형태로 제형화하는 것은 특히 유리하다. 본원에서 용량 유닛 형태는 처리될 표유동물 피험자에 대한 하나의 용량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 유닛을 의미하며; 각각의 유닛은 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료효과를 생성시키도록 계산된 미리 결정된 활성 화합물의 양을 함유한다. 본 발명의 용량 유닛 형태에대한 상세한 기술은 (a) 활성 화합물의 독창적인 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 치료를 위한 활성제 또는 조성물과 같은 화합물 제조분야에서의 내생적인 제한에 따라 규정되고 직접적으로 의존한다.

본원에서, "약학적으로 허용되는 담체"는 예를 들어, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등장제 및 흡수 연기제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지이다. 추가의 제제가 혼입될 수 있다.

본 발명의 제제는 면역반응을 강화시키기 위해 생체내 투여에 적합한 생물학적으로 양립할 수 있는 형태로 피험자에 투여될 수 있다. "생체내 투여에 적합한 생물학적으로 양립할 수 있는 형태"는 임의의 독성 효과가 제제의 치료 효과에 의해 제거되는 경우에 있어서의 투여되는 단백질의 형태를 의미한다. 피험자는 면역반응이 개시될 수 있는 생존 유기체 예를 들어, 포유동물을 포함하는 것으로 의도된다. 피험자의 예로는, 사람, 사람을 제외한 영장류, 개, 고양이, 마우스, 쥐, 및 이것의 유전자 전이종을 포함한다. 본원에 기술된 것으로서 B7 분자의 활성을 가진 펩티드의 투여는, 가용성 B7 펩티드 단독, 항원과 조합된 가용성 B7 펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 가용성 B7 펩티드를 포함하는 임의의 약리학적 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료적 또는 예방적 활성양은 목적하는 결과를 달성하기에 필요한 용량 및 기간에서의 유효량으로 정의된다. 바람직하게는, 가용성 B7 분자 (항원과 함께 또는 없이)의 투여가 항원 (예를 들어, 바이러스 또는 종양세포항원)에 대한 강화된 면역반응을 초래한다.

피험자에 의한 항원에 대한 면역반응 (예를 들어, 세포성 및/또는 체액성 면역반응)은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다.

항원에 대한 면역 반응의 측정은 체내에서 이루어지거나 시험관내에서 분석될 수 있다. 예를들면, 종양세포에 대한 면역 세포의 반응성은 생검을 실행하고 세포 침윤물을 조사하여 측정될 수 있다. 현장 사이토카인 염색은 감염 부위에서, 종양 부위 근처에서, 또는 배농 (draining) 림프절에서 실행될 수 있다. 세포의 시험관내 배양은 항원(예컨대, 증식 및/또는 항원 존재하의 사이토카인 생성 및/또는 항원에 대한 세포독성 활성)에 대한 세포 반응성에 대해 시험하기 위해 실행될 수 있다. 예컨대, B7 활성을 갖는 폴리펩티드의 치료학적 또는 예방학적 활성 양은 개인의 질병 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 요소, 및 개인에서 원하는 반응을 끌어내는 능력에 따라 다양해질 수 있다. 투여량은 최적의 치료 또는 예방 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예컨대, 투여량이 하루에 여러번으로 분리되어 투여되거나, 사용량은 치료 상황이 요구함에 따라 비례하여 감소될 수 있다.

활성 화합물은 주입 (피하, 정맥 등), 구강 투여, 흡입, 경피 도포 또는 직장 투여에 의한 종래 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 효소, 산의 활성 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연적인 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

본 발명은 본원에 설명된 바와 같이 치료에 사용하기 위한 약제 형태의 활성 화합물에 관한 것이다. 또한 활성 화합물은 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에사용될 수 있다.

V. 추가 약제의 투여

피험자는 면역반응을 추가로 증강시키는 추가 약제를 투여하여 치료될 수 있다. 예컨대, 보조제 (adjuvant) 및/또는 사이토카인이 피험자에게 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 사이토카인, 예컨대 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 10, 및/또는 인터루킨 12가 투여될 수 있다. 인터페론, 예컨대, α, β, 및/또는 감마 인터페론이 또한 투여될 수 있다. 바람직하게, Th1 유형의 T 헬퍼 반응의 전개 및 세포성 면역의 전개를 지지하는 IL-12와 같은 사이토카인이 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 공동자극 신호를 조절하는 추가 제제, 예컨대 항-CD28 항체가 피험자에게 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 공지된 보조제인 제제가 투여될 수 있다. 이때, 사람에게 널리 사용되는 유일한 보조제는 백반 (allum)(알루미늄 포스페이트 또는 수산화 알루미늄)이다. 다른 보조제, 예컨대 사포닌 및 이의 정제된 성분 퀼 에이, 프룬트(Quil A, Freund)의 완전 보조제 및 조사 및 수의학 응용에 사용되는 다른 보조제가 인간 백신에서 잠재적인 용도를 갖는다. 그러나, 무라밀 디펩티드, 모노포스포릴 지질 A, 문헌 (Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147:410-415(1991) 레소르시놀)에 기재된 것과 같은 포스포리피드 컨쥬게이트, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온 계면활성제, 판크레아틱 (pancreatic) 트립신 억제제를 포함하는 효소 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DEP) 및 트라실롤 (trasylol)과 같은 신규한 화학적으로 규정된 제제물이 사용될 수 있다. 항원이 투여되는 구체예에서, 항원은 예컨대 본원에 참고로 인용된 문헌 (Miller et al., J.Exp. Med. 176:1739-1744(1992))에 기재된 프로테오리포좀 내에서 또는 노바솜 TM 지질 소포 (문헌: Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, N.H.)와 같은 지질 소포에서 캡슐화되어 추가로 면역반응을 증강시킬 수 있다.

본 발명은 다른 언급이 없다면 세포 생검, 세포 배양, 분자 생검, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래 기술을 사용할 것이며, 이 기술들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 기술들은 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., ed. by Ausubel, F. et al. (Wiley, NY(1995)); DNA Cloning, Volumes I and II(D.N.Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed. (1984)); Mullis et al. U.S.Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1984)); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London(1987)); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds. (1986)); and Miller, J.Experiments in Molecular Genetics(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1972))] 참조.

본원에 인용된 모든 참고문헌, 계류중인 특허출원 및 공개된 특허의 내용은 명시적으로 본원에 참고로 인용된다. 본원에 기재된 각각의 참고문헌은 완전하게 참고문헌으로 인용된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원이 완전하게 본원에 참고문헌으로 인용된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며 추가 한정으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1. 가용성 공동자극 분자의 CTL 반응의 증강

최적의 T 세포 활성은 T 세포 수용체를 통한 시그널링 및 공동자극을 요구한다. B7-1 및 B7-2는 APCs의 표면에서 유력한 두개의 보조 자극 분자이다. 생체내 T 세포 반응에 대한 B7-2의 가용성 형태의 효과를 조사했다. 가용성 분자는 마우스 IgG2a의 Fc 영역에 융합된 B7-2의 세포외 도메인을 함유하는 키메라 단백질이다. B7-2Ig 융합 단백질을 클래스 II 제한 펩티드 면역의 경우 투여하는 것은 항원-특정 T 세포 증식 및 사이토카인 반응을 상당히 증강시켰다. B7-2Ig 투여는 클래스 I-제한 펩티드로의 면역에 대해 CTL 반응을 증강시켰다. B7-2Ig에 의한 CTl 반응의 증강은 클래스 II-제한 펩티드에 대한 T 헬퍼 세포 반응의 존재하에 상당히 증가되었다. 이러한 발견은 다중 T 세포 면역반응 변수에 대한 공동자극 분자, 예컨대 B7-2의 가용성 단백질 형태의 면역 자극 활성을 설명하고, 이러한 분자가 감염성 질환 및 백신 적용에서 임상적인 유용성을 가짐을 입증했다.

실시예 1에서 사용된 물질 및 방법

마우스

7주 내지 10주령의 암컷 BALB/cJ 마우스 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME)를 연구에 사용하였다.

펩티드 면역원의 제조

사용된 모든 펩티드는 인플루엔자 바이러스 A/PR18/34의 핵산단백질(NP)로부터 H-2^d-제한된 면역지배적 에피토프였다. 클래스 I-제한 펩티드, 아미노산 147-155, TYQRTRALV, (참고문헌: Taylor, P.M., et al. 1987, Immunogenetics 26:267) 및 아미노산 206-229, FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK, (참고문헌: Brett, S.J. et al. 1991, Journal Immunology 147:1647)을 HOBT/DCC 아미노산 활성과 함께 표준 Fmoc/NMP 화학을 사용하여 PE 바이오시스템 430A 펩티드 합성기에서 합성하였다. 이들을 분석하고 베크만 HPLC 상에서 정제하고, 질량을 브루커 말디 (MALDI) 질량 스펙트로미터를 사용하여 확인하였다.

AIPR18/34 바이러스 스톡의 제조

AIPR/8/34 인플루엔자 스톡을 제조하고 104의 희석시 10일 부화된 달걀에 종자 바이러스를 주입시켜 적정하였다. 인큐베이션 42시간 후, 감염된 달걀의 요막 체액을 개별적으로 회수하고 혈액 아가 플레이트에서 무균성을 확인하였다. 무균 체액을 모아서, 부분표본을 제조하고, -70℃에서 저장하여 신속히 냉동시켰다. 플라크 적정 (문헌: Bucher, D.J.et al. 1991, J Clin Microbiol 29:2484)을 실행한후 신속히 해동시키고 바이러스 희석 (요막 체액에서)을 수행했다.

B7-2Ig 융합 단백질

B7-2Ig 융합 단백질을 발현시키고 이전에 개시된 바와 같이 정제시켰다 (문헌: Fields, P.E., et al. 1998. J Immunol 161:5268). 요약하면, 발현 플라스미드 pED를 시그널을 엔코딩하는 cDNA 및 힌지, 마우스 IgG2a의 CH2 및 CH3를 엔코딩하는 지놈 DNA와 결합된 쥐과동물 B7-2의 세포외 도메인으로 구성시켰다.

발현 벡터를 CHO 세포주내로 트랜스펙션시키고 앞서 설명된 기술 (참고문헌: Kaufman, R. J., et al. 1988.Journal of Biological Chemistry 263:6352)에 의해 증폭시켰다. 농축된 세포 배양 상층액을 rProtein A Sepharose Fast Flow 컬럼 (파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech))을 통해 통과시켰다. B7-2Ig를 20mM 시트레이트 pH 3.0을 사용하여 용리시키고, 1M 트리스 (Sigma) pH 8.0을 사용하여 중화시키고, 완충액 교환에 의해 PBS pH 7.2에서 제형화시켰다. 단백질 농도를 280nm에서의 흡광도를 사용하여 계산하였고 흡광 계수는 1.33 cm/mg/ml이었다. 내독소 수준은 젤 응고 검정 (케이프 코드 어소시에이츠(Cape Cod Associates))에 의해 결정된 바와 같이 0.25 EU/mg 미만이었다. 다량체로서 단백질의 백분율은 TSK 3000 SWXL 컬럼 (Toso Haas USA, Mongomeryville, PA)을 사용한 분석에 의해 결정된 바와 같이 1% 미만이었다. B7-2Ig의 시험관내 공동자극 활성이 증명되었다 (참고문헌: Fields, P.E., et al. 1998.J Immunol 161:5268). 본 실험을 3회 이상 수행하였으며 유사한 결과를 수득했다. 각각의 실험에 대해 1회 이상의 중복실험을, B7-2Ig 처리를 위한 대조로서 관련없는 사람 단백질 GDF-9 (GeneticsInstitute, Cambridge MA)에 대한 정제된 마우스 모노클로날 IgG2a를 사용하여 수행하였다.

펩티드 면역화

지시된 펩티드 또는 펩티드 혼합물 100 ㎍을 IFA (시그마)와 함께 부피비 1:1로 혼합시키고 에멀젼화시켰다. 마우스를 100 ㎕중의 항원/IFA 에멀젼을 사용하여 꼬리 시작부에 피하 면역화시켰다. 100 ㎕중의 B7-2Ig를 펩티드 면역화 부위에 대한 인접 부위에 피하 투여하였다. 림프절 세포를 채취하는 실험에서, 상기 기술한 바와 같이 꼬리의 시작부 및 목 뒤에 펩티드 및 B7-2Ig를 투여하였다. 치료 그룹을 각각 5마리의 마우스로 구성시켰다. B7-2Ig를 0.1% 수산화 알루미늄 (Rehydragel, Rehies, Dublin, Ireland)중에 투여하였다.

생바이러스 면역화 및 시험투여

메타판 (Mallinckrodt Veterinary, Mundelein, IL)을 마우스가 환류 반응을 상실할 때까지 노즈콘 (nose cone)으로 투여하였다. PBS중에 희석시킨 생바이러스를 40 ㎕의 최종 부피로 비내 투여하였다. 치사량의 바이러스 (4,000 PFU/마우스)는 면역화되지 않은 마우스에서 100% 사망율을 초래하였다. 40 PFU/마우스의 면역화 용량은 어떠한 이환율도 일으키지 않았고, 마우스를 치사적 시험투여로부터 완전히 보호하였다.

증식 검정

림프절 (장간막 림프절 배제) 및 비장을 지시된 날짜에 채취하고, 단일 세포현탁액을 제조하여 5 x 10^-5M 2ME, 2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(기브코/비알엘(Gibco/BRL)), 10% FCS를 포함하도록 보충한 RPMI 1640(기브코/비알엘)중의 200 ㎕중에, 4 x 10⁵세포/웰로 편평한 바닥 96 웰 플레이트에서 배양시켰다. 클래스 II-제한 펩티드를 배양의 시작시에 지시된 농도로 첨가하였다. 증식을, 3H 티미딘 혼입에 이어 1450 마이크로베타 플레이트 리더 (월락(Wallac))을 사용한 18시간 펄스(1μC/웰)에 의해 측정하였다. 일차 면역화시킨지 3, 5, 7 및 9일 후에 림프절 세포로부터의 증식 반응의 비교를 수행하였다. 이차 반응을 이차 면역화시킨지 3일 후에 수집한 비장으로부터 평가하였다.

사이토카인 검정

세포를, 증식 검정을 위해 상기에서 기술한 바와 같이 배양시켰다. 상층액을 제 3일째에 수집하고, IFN-γ, IL-5 및 IL-13의 수준을 시판용 키트 (Genzyme, Cambridge MA for IFN-γ, Endogen, Woburn MA for IL-5, and R&D Systems, Minneapolis, MN for IL-3)를 사용하는 ELISA로 결정하였다.

별도로 분획되지 않은 마우스 혈구 샘플에 대한 CTL 검정

일차 면역화시킨지 2 내지 3주 후에, 혈액 샘플 (각각 150 ㎕ 내지 200 ㎕)을 에어란 (Ohmeda Caribe, Inc, Guayama, PR)을 사용하여 마취시킨 마우스로부터 안와후방 채혈에 의해 수득하였다. 샘플을 50U 헤파린을 함유하는 100 ㎕ PBS를 사용하여 희석시켰다. 40 ㎕ 샘플을 백혈구 계수를 위해 제거하였다. 샘플상의 차별적인 계수는 통상 수행하지 않았다. 백혈구 분획중의 림프구의 백분율은 연구동안 다양한 시간에 취해진 100개의 샘플의 차별적인 계수에 의해 69%±8%였다. 세포를 세척하여 헤파린을 제거하였다. 8 x 10⁵WBC/마우스 전체를 증식 검정을 위해 상기에 기술한 바와 같이 보충되고, 추가로 일차적인 시험관내 CTL 반응의 생성을 위한 보충물 (4㎍/ml 항-CD28(PV1.17) 및 10 U/ml 재조합 뮤린 IL-12 (rmIL-12, Genetics Institute, Cambridge, MA), 10 U/ml IL-2 및 200 U/ml IL-6, (Genzyme, Cambridge, MA), 0.1pM 클래스 I-제한 펩티드 (TYQRTRALV, 아미노산 147-155), 및 1 x 10⁶/ml 조사된(2,000 rads) 동계의 비장세포 (Iyse RBC에 대해 0.017 M 트리스로 완충된 0.17 M NH4CL로 처리됨 (참조: Gajewski, T. F. 1996.J Immunol 156:465)))을 포함하는 RPMI 1640으로 구성된 배지 10 ml중에 재현탁시켰다.

세포를 웰당 8 x 10³백혈구 전체에 대해 100 ㎕ 부피로 96 웰 둥근 바닥 코스타 플레이트에 플레이팅하였다. 80개 웰 전부를 각각의 혈액 샘플을 위해 플레이팅하였다. 16개 웰은 각각의 플레이트상에 조사된 비장세포와 함께 배지만을 첨가하였다. 배양 7일 째에, 상층액을 플레이트를 뒤집어 제거하고 세포 펠렛을 플레이트 교반에 의해 현탁시켰다. 항원-양성(Ag-양성) 표적을 클래스 I-제한 펩티드 10 ug/ml과 함께 P815 세포의 하룻밤 펄스에 의해 제조하였다. 1 x 10³Ag-양성,⁵¹Cr 표지된, P815 표적을 50% 웰에 100 ㎕ 배양 배지중에 가하고, 1 x 10³Ag-음성,⁵¹Cr 표지된, 대조 P815 표적을 나머지 50%에 가하였다. 이펙터 세포를 포함하지 않는 플레이트당 16개 웰중에서, 8개를 자발적인 방출로 표시하고 8개 웰을 최대 방출 측정으로 표시하였다. 전체 방출을 10% 트리톤 X100 20 ㎕의 첨가에 의해 달성하였다. 4시간 배양시킨 후에, 50 ㎕ 상층액/웰을 월락 96 웰 플레이트 (1450-401)내로 수집하고, 125 ㎕ 섬광제 (OptiPhase SuperMix, Wallac, Turku, Finland)를 가하고, 플레이트를 월락 마이크로베타 1450으로 계수하였다.

평균 특정 용해의 계산

각각의 웰에 대한 용해 백분율을 표준식에 따라 계산하였다:

실험적 방출 - 배지 방출X 100

전체 방출 - 배지 방출

상기 식에서, 전체 방출은 표적 및 트리톤-X-100이 첨가된 모든 웰의 평균 cpm이고, 배지 방출은 평균 cpm + 표적 및 배지만이 첨가된 모든 웰의 SD였다. 웰당 평균 특정 용해 백분율을 하기식에 따라 계산하였다:

(Ag ⁺ 표적을 가진 40개 웰의 용해 ∑%)-(대조 표적을 가진 40개 웰의 용해 ∑%)

40

데이터를 그룹내에 5마리 마우스 각각으로부터 얻어진 웰당 평균 특정 용해값의 평균에 의해 계산된 평균 특정 용해±S.D로서 표현하였다. 통계적 유의성을 테일드 스튜던트 테스트 (two tailed Stuent's test)를 사용하여 결정하였다.

결과:

B7-2Ig는 클래스 II-제한 펩티드를 사용한 면역화에 대한 일차적인 CD4+ T 세포 증식 반응을 향상시킨다

B7-2Ig가 펩티드 면역화에 대한 일차적인 T 세포를 향상시키는지 억제시키는지 여부를 결정하기 위해, 마우스를 B7-2Ig 투여의 존재 또는 부재하에서 펩티드를 사용하여 면역화시켰다. A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스의 NP로부터의 클래스 II-제한 펩티드 아미노산 55-77 및 아미노산 206-229를 IFA중의 혼합물로서 피하 전달시켰다. 이들 펩티드는 면역지배적 CD4+ Th 세포 에피토프인 것으로 밝혀졌다 (참조: Brett, S. J., et al. 1991.Journal Immunology147:1647, Brett, S. J., and J. P. Tite. 1996). H-2-결합된 유전자 및 H-2-비결합된 유전자는 CD4+ T 세포에 의한 인플루엔자 핵단백질 에피토프 인식에 영향을 미친다 (참조:Immunology 87:42). B7-2Ig (0.1% 백반 중의)를 인접 부위에 투여하였다. 예비 연구에서, 펩티드-특이적 증식 반응을 면역화시킨지 3, 5, 7 및 9일 후에 림프절 세포로부터 측정하였다. 반응 역학은 B7-2Ig의 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 최적의 증식 반응은 면역화시킨지 7 및 9일 후에 B7-2Ig 및 대조 처리된 마우스 둘 모두에서 관찰되었다. 도 1에 도시한 바와 같이, 펩티드 면역화시에 B7-2Ig로 처리하는 것은 면역화시킨지 9일 후에 수집된 림프절 세포로부터 항원-특이적인 증식 반응을 현저하게 증가시켰다 (50㎍/ml 펩티드를 사용한 시험관내 재자극의 경우, p=0.014).

도 1에서, 그룹 당 5마리의 마우스를, 2개의 클래스 II 제한 펩티드 또는 PBS를 주입할 때 마다 100 ㎍을 함유하는 IFA 에멀션으로 2개의 피하 부위에서 면역화시켰다. 0.1% 백반중의 B7-2IgG2a 100 ㎍ 또는 0.1% 백반만을 면역처리 부위에 인접하는 부위에 투여하였다. 펩티드만으로 면역화시킨 마우스로부터의 림프절 세포 (-O-), B7-2Ig만으로 처리한 마우스로부터의 림프절 세포 (-△-), 또는 B7-2Ig로 처리한 마우스로부터의 림프절 세포 (-■-)를 면역처리 후 9일 째에 채취하고, 면역에 사용된 지시 농도의 2개의 펩티드로 시험관내에서 재자극시켰다. B7-2Ig를 주입하지 않은 펩티드 면역화시킨 마우스를 대조군으로서 백반을 수용케 하였다.³H-티미딘을 혼입시킴으로써 증식을 평가하였다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스의 평균 cpm/웰±SD로 표현하였다. 마우스 IgG2a mAb를 대조군으로 사용하였을 때에도 유사한 결과를 얻었다. 데이터는 3가지 대표적인 실험중의 하나의 실험으로부터의 데이터이다. 면역없이 수행된 B7-2Ig의 투여는 증식성 반응을 나타내지 않았는데, 이는 B7-2Ig의 항원 의존성이 일차 면역후에 발생함을 입증한다. 이들 결과는 B7-2Ig의 생체내 투여가 펩티드 면역에 대한 CD4⁺Th 세포 반응을 증대시킨다는 것을 입증한다.

B7-2Ig는 회상 반응을 증대시킨다

일차 항원 특이적 증식 반응의 B7-2Ig 의존성 증강이, 증강된 기억 반응을 유발시키는지를 시험하기 위해, 마우스를 B7-2Ig로 처리하거나 처리하지 않으면서 펩티드로 면역화시키고, 추가의 B7-2Ig를 투여하지 않고서 45일 후에 추가로 투여하였다. 이차 면역화시킨 3일 후에 비장세포를 취하고 펩티드 특이적 증식 반응을 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 일차 면역화시에 단일 B7-2Ig 처리를 수용한 마우스는 B7-2Ig를 전혀 수용하지 않은 마우스 (p=0.0006, 100 pg/ml 펩티드로시험관내 재자극) 보다 이차 면역화시킨 후에 보다 더 큰 증식성 반응을 나타내었다. 그룹 당 5마리의 마우스를 펩티드만으로 면역화시키고 (-O-) B7-2Ig만으로 처리하거나 (-△-), 펩티드로 면역화시키고 B7-2Ig로 처리하였다 (-■-). 일차 면역화시킨 후 46일 째에, 펩티드로 면역화시킨 마우스 그룹 둘 모두 B7-2Ig 동시투여 없이 펩티드로 재면역화시켰다. 비면역화시킨 마우스는 IFA 만을 투여했다. 재면역화시킨 후 3일 후에, 비장세포를 면역에 사용된 지시 농도의 2개 펩티드로 각각 시험관내에서 재자극시켰다.³H-티미딘을 혼입시켜 증식을 평가하였다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스의 평균 cpm/웰±SD로 표현하였다. 데이터는 2가지의 반복 실험중의 하나의 실험으로부터의 테이터이다. 이들 데이터는 B7-2Ig가, 일차 T 세포 반응에 대한 보조제로서 사용될 때, 회상 반응을 증대시킨다는 것을 나타낸다.

B7-2Ig는 Th1 및 Th2 의존성 일차 사이토카인 반응을 증대시킨다.

면역 보조제로서의 B7-2Ig가, Th1 또는 Th2 반응의 전개를 차별적으로 촉진시키는지를 결정하기 위해, 일차 면역화 후에 펩티드 특이적 사이토카인 반응을 면역후 3, 5, 7 및 9일 째에 면역화시킨 마우스의 림프절 세포로부터 분석하였다. 증식 반응의 경우와 마찬가지로, 최적의 사이토카인 반응을 9일 째에 관찰하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 펩티드에 의한 면역화의 경우 B7-2Ig의 투여는 Th1 결합된 사이토카인 IFN-γ(p=0.017) 및 Th2 결합된 사이토카인 IL-5(p=0.011), 및 IL-13(p=0.002)의 생성 수준을 상당히 증가시켰다. 항원 특이적 사이토카인 생성은 B7-2Ig으로 처리된 면역화된 마우스로부터의 배양물에서는 관찰되지 않았다. 이들결과는 B7-2Ig가 Th1 및 Th2 표현형 둘 모두의 일차적인 T 세포 반응을 증대시킨다는 것을 나타낸다.

B7-2Ig는 클래스 I 제한 펩티드에 대한 반응을 증강시킨다.

CD28과 막 결합된 B7의 상호작용은 CD4+ 세포의 부재하에 시험관내 CTL 반응이 유도되게 하는 것으로 입증되었다 (참고문헌: Harding, F.A. et al., 1993,J Exp Med 177:1791). 일차적인 CTL 반응에 대한 B7-2Ig의 효과를 시험하기 위해, 마우스를 동시적으로 B7-2Ig를 투여하거나 투여하지 않으면서 IFA의 면역지배적 클래스 I 제한 펩티드로 면역화시켰다. 펩티드 특이적 CTL 반응은 물질 및 방법에 기술된 바와 같은 CTL 검정과 같이, 작은 혈액 샘플을 사용하여 비분별된 말초 혈액 세포로부터 측정하였다. 이러한 검정은 단일 실험으로 다수의 마우스의 분석, 그룹들간의 차이의 통계적인 의미의 평가, 면역 반응의 과정 동안에 개개의 마우스로부터의 반복된 CTL 검정, 및 CTL 반응 및 생체내 결과간의 상관관계의 조사를 가능하게 하였다.

데이터는 마우스당 하나의 값 (평균적인 특이적 용해)으로 표현하였다 (도 3). 펩티드 (100 ㎍/마우스)는 IFA로 제공하였다. B7-2Ig (0.1% 백반중의 100 ㎍/마우스)을 피하 동시투여하였다. 면역 3주일 후에 수집된 비분별된 혈액으로부터 CTL을 측정하였다. 데이터는 평균적인 특이적 용해 ±SD로 표현하였다. 생바이러스 면역화시킨 그룹에 대한 값은 2마리 마우스의 단일 푸울로부터의 것이며, 9가지의 별도의 실험에서 시험된 18마리의 마우스로부터 얻은 이러한 그룹의 평균적인 특이적 용해는 52±12였다. 그 밖의 모든 그룹에는 그룹당 5마리의 마우스가존재했다. 제시된 데이터는 3회 반복 실험중의 하나의 실험이다. IFA에서 클래스 I 제한된 펩티드에 대한 반응은 기준 수준 이상으로 현저하지 않았다. 이러한 발견은 T 세포 헬프의 부재하에 IFA에서의 클래스 I 제한된 펩티드에 대한 CTL 반응이 기준 수준에 근접한 것을 보여준 문헌 (Fayolle et al. 1991Journal Immunology147:406)의 결과와 일치했다. B7-2Ig를 IFA의 클래스 I 제한 펩티드에 의한 면역화에 투여하였을 경우, 반응에서 작지만 통계학적 유의성(p=0.013)이 있는 증가가 관찰되었다 (도 3). 그러나, 펩티드로 면역화시키고 B7-2Ig를 동시쿠여한 마우스의 펩티드 특이적 CTL 반응의 크기는, 생바이러스로 면역화시킨 마우스의 펩티드 특이적 반응에 비하여 작았다. 따라서, 100㎍ 용량의 B7-2Ig의 동시투여는 클래스 I 제한 펩티드에 의한 면역에 대한 반응을 생바이러스 면역 방법으로 달성된 최대 수준으로 상승시키지 못했다.

CTL 반응에서의 최적 B7-2Ig 증대는 T 세포 헬프를 필요로 한다.

최적의 CTL 반응이 Th 세포에 의존하므로 (참고문헌: Fayolle, C. et al. 1991,Journal Immunology147:4069; Keene, J.A. et al. 1982,J Exp Med155:768; Von Herrath, M.G. et al. 1996J Virol70:1072 and Ossendorp, F. et al. 1998,Journal Experimental Medicine187:693), CTL 반응에 대한 B7-2Ig의 효과는 마우스가 Th 세포 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있는 펩티드에 의해 동시 면역화된 조건하에 시험하였다. 마우스를 클래스 I 제한 펩티드만을 함유하거나 도 1 및 2 및 상기 표 1에 제시된 2개의 클래스 II 제한 펩티드와 클래스 I 제한 펩티드의 혼합물을 함유하는 IFA 에멀션으로 면역화시켰다. CTL 반응은 비분획된말초 혈액 세포로부터 측정하였다 (도 4). 펩티드 면역은 IFA내의 단일 에멀션으로서 수행하였다. 마우스를 지시된 바와 같이 면역화시키고 시험하였다. 3주 후, CTL 반응을 말초 혈액으로부터 측정하였다. 데이터는 평균 특이적 용해 ±SD로서 표현하였다. 생바이러스 면역화시킨 그룹에 대한 값은, 2마리 마우스의 단일 푸울로부터의 것이며, 9가지의 별도의 실험에서 시험된 18마리의 마우스로부터 얻은 이러한 그룹의 평균적인 특이적 용해는 52 ±12였다. 그 밖의 모든 그룹에는 그룹당 5마리의 마우스가 존재했다. 백반중의 조절 Ig 및 IFA내의 클래스 II 제한 펩티드를 수용한 그룹의 평균 특이적 용해는, 조절 Ig를 수용한 마우스로부터 공제되었다. 백반중의 B7-2Ig 및 IFA내의 클래스 II 제한 펩티드를 수용한 그룹의 평균 특이적 용해는, B7-2Ig를 수용한 그룹으로 공제되었다. 제시된 데이터는 4회의 반복 실험중의 하나의 실험으로부터의 데이터이다.

클래스 I 및 클래스 II 제한 펩티드의 혼합물로 면역화시킨 마우스로부터의 세포의 평균 특이적 용해는, 클래스 I 제한 펩티드 단독으로 면역화시킨 마우스로부터의 세포의 용해 보다 현저하게 높았다 (제시된 실험에서 p=0.046 및 반복 실험에서 0.004). 클래스 I 제한 펩티드와 클래스 II 제한 펩티드의 혼합물에 의한 면역 및 100 ㎍의 B7-2Ig에 의한 처리는, B7-2Ig를 수용하지 않은 펩티드 면역화시킨 마우스로부터의 평균 특이적 용해 보다 현저하게 큰 평균 특이적 용해를 나타냈다 (4회의 반복 실험에서 p=0.003, p=0.0001, p=0.045 및 p=0.0012). 이러한 반응은, B7-2Ig의 용량이 200 ㎍/마우스로 2배 증가되었을 때는 증가되지 않았는데, 이는 100 ㎍ 용량이 최대 B7-2Ig 의존성 증대를 야기시킴을 나타냈다.

B7-2Ig 처리와 함께 상기 펩티드의 혼합물을 사용하는 면역화의 조합은, 생바이러스로의 면역화 후에 유도된 것과 유사한 정도로 펩티드-특이적 CTL 반응을 초래하였다. 평균 특이적 용해 값인 52±12는, 9개의 개별적인 실험에서 18마리의 생바이러스 면역화시킨 마우스로부터 얻은 값을 평균하여 수득한 것으로서, 이는 소량의 말초혈 샘플 CTL 검정의 재현성과, T 세포 헬프 (help) 및 B7-2Ig의 존재하에서의 펩티드 면역화가 효율적인 생바이러스 면역화법에 의해 유도된 것과 필적할만한 반응을 유도한다는 결론의 타당성을 입증한다. 말초혈 세포로부터 검출된 CTL 반응은 생바이러스로 면역화된 마우스 및 펩티드로 면역화되고 B7-2Ig로 처리된 마우스 모두에서 2 내지 3주에 최고였고, 5주 경과후 약해졌다. 이는 다시 한번 이들 반응의 유사성을 시사하는 것이다. 그러나, 하기에 논의되는 바와 같이, 펩티드 혼합물로 면역화되고 B7-2Ig로 처리된 마우스는 치명적인 바이러스 시험감염으로부터 보호받지 못하였다.

도 3 및 4의 데이타는, 그 자체로 임상적으로 인정된 면역 보조제 (참고문헌: Aprile, M.A. et al., 1966,Can J Public Health 57:343)인 0.1% 백반중에서 제형된 B7-2Ig을 사용하여 나타난 것이다. 백반 단독 또는 백반 중의 조절 Ig의 투여는 항 펩티드 반응에 영향을 미치지 않았으며, 백반 중의 제형은 B7-2Ig 의존성 면역 증강에 요구되지 않았다. 백반 중의 B7-2Ig의 효과를 PBS 중의 B7-2Ig의 효과와 직접 비교한 경우, CTL 반응의 큰 증강이, B7-2Ig이 백반 중에 투여되었을 때 관찰되었다 (38 ±12와 비교하여, 백반을 사용한 평균 특이적 용해 값은 72 ±13임, p=0.007).

최적 항원 특이적 활성화 및 T 세포 조절은 APC 표면 상의 B7 분자로부터 T 세포 표면 상의 CD28 및 CTLA-4로의 공동자극 신호의 전달을 필요로 한다 (참조: Boussiotis, V.A., et al., 1996,Immunol Rev 153:5; Lenschow, D.J. et al. 1996,Annual Review Immunology 14:233; Green, J. M. Et al. 1994.Immunity 1:501; Tivol, E.A. et al. 1995,Immunity3:541 and Waterhouse, P., 1995,Sceience270:985). 다수의 마우스 모델 시험으로, 면역 반응이 B7의 증가된 세포 표면 발현에 의해 증강될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 연구에서, B7 발현에서의 증가는 종양세포 형질도입 (참고문헌: Basker, S. et al. 1993;Proc Natl Acad Sci USA 90:5687; Cavallo, F. et al. 1995, EurJ Immunol 25:1154; Coughlin, C. M. et al. 1995,Cancer Research 55:4980; Chen, L., et al. 1992,Cell 71:1093;Chen, L. et al. 1994,Journal of Experimental Medicine 179:523; Gajewski, T.F. et al. 1996,J Immunol 8:2909; Yang, G. et al. 1995,Journal of Immunology 154:279and Dunussi-Joannopoulos K, et al. 1996,Blood 87:2938), cDNA 주입(Kim, J. J. et al. 1997,Nat Biotechnol 15: 641; Kim, J.J. et al. 1998,Vaccine Nov; 16:1828and Horspool, J.H. et al. 1998,J Immunol 160:2706), 또는 바이러스 벡터를 사용한 감염 (참고문헌: Chamberlain, R.S. et al. 1996,Cancer Res 56:2832; Emtage, P.C. et al. 1998,J Immunol 160:2531; Hodge, J.W. et al. 1994,Cancer Res 54:5552and Putzer, B. M. et al. 1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:10889)에 의해 유도되었다. 생체내 B7의 수준을 증가시키기 위한 또 다른 방법을 사용하는 것으로, 각각의 Ig 사슬에 결합된 B7-2의 세포외 부분과 융합된 마우스 IgG2a의 Fx로 이루어진, B7-2, B7-2Ig의 가용성 단백질 형태가 개발되었다. B8-2Ig의 생체내 투여는 항원 특이적 Th 세포 및 CTL 반응을 증강시킨다. 따라서, B7-2Ig의 생체내 투여는 종양세포의 생시험관내 B7 형질도입 또는 B7-2 매개된 공동자극을 최적화시키기 위한 바이러스 또는 DNA 벡터의 사용에 대한 간단한 대안을 제공한다.

감염 및 자가면역 질환의 발병은 Th 세포를 반응시키므로써 생성된 사이토카인의 패턴에 의해 크게 영향 받을 수 있기 때문에, B7 경로가 Th1 또는 Th2 타입 사이토카인 반응중 어느 하나쪽으로 스큐잉(skewing)하는데 사용될 수 있는 지를 결정하는데 가치가 있다 (참조: Kuchroo, V.K. et al. 1995,Cell 80:10; Lenschow, D.J. et al. 1995,J Exp Med 181:1145; Corry,, D.B. et al 1994,J Immunol 153:4142; Freeman, G.J. et al. 1995,Immunity 2:523; Schweitzer, A.N. et al. 1997,J Immunol 2 158:713; Rulifson, I.C. et al. 1997,J Immunol 158:658and McAdam, A. J. et al. 1998Immunol Rev 165:231). 많은 실험적 시스템은, Th2 분화가 Th1 분화보다 B7 공동자극에 보다 의존적임을 시사한다 (참조: Lenschow, D.J. et al. 1995,J Exp Med 181:1145; Corry, D.B. et al. 1994,J Immunol 153:4142; Freeman, G.J. et al. 1995,Immunity 2:523and Rulifson, I.C., A. et al. 1997,J Immunol 158:658). 항-B7 mAb은 생체내 T 세포 분화를 조작하는데 성공적으로 사용되어 왔다. B7-1의 mAb로의 차단은 Th2 분화를 유리하게 하는 반면, B7-2의 차단은 Th1분화를 유리하게 하는 것으로 보고되었다 (참조: Kuchroo, V.K. et al. 1995,Cell 80:Mar 10(5):; Lenschow, D.J. et al. 1995,JExp Med 181:1145; Corry, D.B. et al. 1994,J Immunol 152:4142; Freeman, G.J. et al. 1995,Immunity 2:523and Rulifson, I.c. et al. 1997,J Immunol 158:658). 대조적으로, B7 유전자파괴 마우스로부터 APC를 사용하여, 슈바이처 등은 B7-1과 B7-2 어느 것도 시험관내 Th1 또는 Th2 분화를 선택적으로 조절하지 않는 것으로 나타남을 발견하였다 (참조: Schweitzer, A. N. et al. 1997,J. Immunol 2 158:713). 이러한 실시예로부터의 데이타는 B7-2Ig의 시험관내 투여가 Th1 및 Th2 타입 모두의 항원 특이적 사이토카인 반응을 증강시킴을 보여주었다. 그러므로, 치료적 효능이 있는 B7-2Ig는 스큐잉이 아닌 반응의 상승이 목표인 상황에서 최대가 될 것이다.

CTL 반응에 대한 B7-2Ig의 효과를 시험하기 위해, 생바이러스로 면역화된 마우스로부터의 동일한 펩티드로 도출된 반응에 대해 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 NP로부터의 펩티드로 도출된 펩티드 특이적 CTL 반응을 비교하였다. B7 2Ig 처리는 IFA에서의 제 1류 제한된 펩티드에 대한 반응의 작으나 뚜렷한 증강을 유도하였다. 이러한 데이타는 외인성 헬프의 부재하에서, B7으로 트랜스펙션된 종양세포가 시험관내 CTL 반응의 생성에 충분함을 입증하는 데이터와 일치한다 (참조: Harding, F.A. et al. 1993,J Exp Med 177:1791).

그러나, B7-2Ig 증강된 반응은 생바이러스로 면역화된 마우스의 동일 펩티드에 대한 CTL 반응보다 현저히 낮았다. 이러한 데이타는 이들 마우스가 제 I류 제한된 펩티드 면역화 및 B7-2Ig동시 투여에 의해 유도된 반응보다 훨씬 더 큰 항 펩티드 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.

클래스 I 제한 펩티드에 대한 반응을 추가로 증강시키기 위한 시도에서, 클래스 I 제한 CTL 펩티드 항원을 함유하는 IFA 에멀션에 T 세포, 클래스 II 제한 펩티드 항원의 첨가 효과를 조사하였다. 최적 CTL 반응이 Th 세포에 의존하는 것은 이미 보고된 바 있다 (참조: Fayolle, c. et al. 1991,Journal Immunology 147:4069; Keene, J.A. et al. 1982,J Exp Med 155:768; von Herrath, M.G. 1996,J Virol 70:1072and Ossendorp, F. et al. 1998Journal Experimental Medicine 187:693). CTL 반응은 클래스 I 및 클래스 II 제한 펩티드 둘 모두로 면역화시킨 마우스에 현저히 상승하였다. 이들 데이터는 펩티드 항원에 대한 CTL 반응의 헬프가 Th 세포 항원으로의 동시 면역화에 의해 제공될 수 있음을 나타낸다. CTL과 Th 펩티드 에피토프 간의 공유 결합은 요구되지 않는데, 이는 어떠한 면역원성 단백질도 공동 면역원으로서 사용되어 CTL 반응을 위한 헬프를 제공할 수 있음을 시사한다. 이러한 결론은 추가로 제 I류 제한된 펩티드를 함유하는 IFA 에멀션으로의 KLH의 첨가가 펩티드 특이적 CTL 반응의 현저한 증강을 초래한다는 본 발명자들의 발견에 의해 지지된다.

증강되었음에도 불구하고, 클래스 I 및 클래스 Ⅱ 제한 펩티드로 면역화시킨 마우스의 펩티드 특이적 CTL 반응은, 생바이러스로 면역화시킨 마우스의 것보다 덜하다. 상기 프로토콜에 B7-2Ig의 첨가는, 펩티드의 혼합물로 면역화된 마우스의 CTL 반응을 생바이러스로 면역화된 마우스의 수준으로 증가시켰다. 이들 두 그룹의 반응은 필적할 만하나, 전자의 그룹은 바이러스 치명적인 바이러스 시험접종으로부터 보호받지 않았다. 이러한 결과는 로손 등의 결과와 일치하는데 (참조:Lawson, c.M. et al. 1994,Journal Virology 68:3505), 로손 등은 펩티드를 발현시키는 재조합 백시니아 바이러스를 투여함에 의해 본 연구에 사용된 동일 펩티드에 대해 왕성한 CTL 반응을 유도하였다. 현 시점에 따르면, 이러한 펩티드 단독에 대한 왕성한 CTL 반응은, BALB/c 마우스에 보호성 명역원성을 부여하는데 충분하지 않았다.

B7-2Ig의 면역 증강 효과에 요구되지 않지만, 백반 중의 제형은 PBS 중의 제형보다는 더 크게 증강시킨다. 백반 중의 대조군 Ig의 투여는 반응에 영향을 미치지 않는데, 이는 백반 단독으로는 반응을 증강시키지 않음을 시사한다.

생바이러스로의 감염은, 클래스 I 제한 반응의 활성화를 위한 자연적이고 효과적인 경로이다 (참조: Zinkernagel, R.M. et al. 1979,Adv Immunol 27:51). 그러므로, 필적할만한 항펩티드 반응이 생바이러스로 면역화시킨 마우스 및 클래스 I 및 클래스 II 제한 펩티드의 혼합된 에멀션으로 면역화시킨 B7-2Ig 처리 마우스로부터 수득할 수 있음을 보여주는 본원에 제시된 데이타는, 후자의 면역화 프로토콜의 효능을 확증시킨다. 최근에는, 클래스 I 제한 펩티드에 대한 CTL 반응의 유도가 많은 관심의 대상이 되고 있다.

사람 CTL이 마우스 CTL과 유사하게 클래스 I 제한 종양관련 펩티드를 인식한다는 최근의 증거들은, 이들 펩티드에 대한 CTL 반응이 사람의 종양에 대해 유효한 것으로 입증될 수 있음을 시사하였다 (참조: van der Bruggen, P. et al., 1991, Science 254: 1643; Wolfel, T. et al., 1993, Int. J Cancer 55: 237; Mauerer, M.. J. 1996, Melanoma Res 6: 11; Cormier, J. N. et al., 1997, Cancer J Sci Am3: 37; Apostolopoulos, V. et al., 1997, J. Immunology 159: 5211; Rosenberg, S. A. 1998, Nature Medicine 4: 321 및 Nestle, F. O. et al., 1998, Nature Medicine 4: 328). 이러한 가능성은 클래스 I 제한 펩티드 백신에 대한 반응을 최적화하는 면역접종 프로토콜을 고안하기 위한 강한 노력에 박차를 가하였다. 재조합 바이러스 및 세균에 미니유전자의 삽입, 펩티드 올리고머화, 지질 변형, cDNA 면역접종, 보조제로서 독소 및 사이토카인의 사용, 및 항원 펄스화된 수지상 세포를 포함하여 광범위한 다양한 방법에서 성공이 보고되었다 (참조: Allsopp, C. E. et al., 1996, European Journal of Immunology 26: 1951; Rotzschke, O et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 14642; Alving, C. A. et al., 1995, Immunological Reviews 145: 1; Ciernik, I. F. et al., 1996, J Immunol 156:2369; Porgador, A. et al., 1997, Journal of Immunology 158: 834; Noguchi Y. et al. 1995, Proceedings of the National Academy of Science; USA 92: 2219 및 Takahashi H. et al. 1992, International Immunology 5: 849). 본원에서 보고된 방법의 장점은, 추가 변형의 필요 없이 임의의 펩티드에 일률적으로 적용가능하고 클래스 I 및 클래스 I 제한 반응 모두에 유효하다는 것이다.

펩티드 면역화와 함께 B7-2Ig의 공동투여는 비교적 불량한 클래스 I 제한 펩티드 반응을, 생바이러스 면역접종으로부터 얻어진 반응과 대등한 수준으로 상승시켜 가용성 형태의 B7-2 단백질이 다른 불량한 면역원에 대한 반응을 증강시킬 수도 있음을 시사한다. 이러한 발견은 가용성 단백질 형태의 B7-2가, 면역계가 비효과적으로 반응하는 암 또는 염증성 질환 치료에서 항원 특이적 면역 반응을 증강시킬수 있다는 것을 나타낸다.

표 I. Th 사이토카인 반응의 B7-2Ig 의존적 증강^a

시험관내 재자극시 사이토카인의 발현

생체내 처리	IFNγ(pg/ml ±SD)	IL-5(pg/ml ±SD)	IL-13(pg/ml ±SD)
펩티드 면역화	b.db	54 ±44	136 ±125
펩티드 면역화+ B7-2Ig	1720 ±986	2479 ±1104	5365 ±1795
IFA + B7-2Ig	b.db	b.db	b.db

^a그룹 당 5마리 마우스를 클래스 II 제한 2개의 펩티드 각각을 주사액당 100 ㎍ 함유하거나 PBS를 함유하는 IFA 에멀션으로 2개 피하 부위에 면역화시켰다. 0.1% 백반중 B7-2IgG2a 100 ㎍ 또는 0.1% 백반 단독을 면역화 부위에 인접한 부위에 투여하였다. 9일 후에, 림프절 세포를 수집하여 각 펩티드 5 ㎍/ml로 3일간 배양시 재자극하였다. 각 마우스에 대한 값은 3배수의 웰로부터의 결과를 평균하여 수득했다. 데이터는 군±SD내의 마우스 사이토카인 평균 농도로 나타냈다. 결과는 대조 마우스 IgG2a mAb를 대조로서 사용한 경우에 얻어진 것과 유사했다. 제시된 데이터는 3회 반복 실험중 하나로부터 얻은 것이다.^b검정의 검출 한계 미만.

실시예 2. B7-IgG 융합 단백질은 항종양 면역 반응을 증강시키고 유발된 종양의 회복을 유도한다.

B7-1 또는 B7-2의 세포외 영역과 IgG.2a간의 융합 단백질을, 불량한 면역원성 흑색종 B16/F10을 포함하는 4개의 상이한 쥐과동물 종양 모델에서 항종양 반응을 증강시키는 능력에 대하여 평가하였다. B7-1 또는 B7-2-IgG와 혼합시 조사된종양세포를 사용한 단일 면역화는 활발한 종양 공격에 대해 마우스를 보호하였다. 보다 현저하게, 7일 유발된 종양은 B7-IgG와 혼합된 조사된 종양세포로 백신화 후에 회복되었다. 심지어 B7-IgG 단독의 치료적 투여가, 종양의 유사한 경감을 달성하였다. 확립된 종양을 거부한 동물들은, 재유발에 대해 내성이었으며, 이는 B7-IgG의 항종양 효과가 종양 특이적 면역 메카니즘에 의해 매개됨을 시사했다. 또한, B7-1 또는 B7-2-IgG와 혼합시킨 조사된 종양세포를 사용한 단일 백신화가, 종양 관련 항원에 대한 CD8 반응을 초래하였다. 따라서, B7-IgG는 외인성으로 전달된 항원 및 내인성 항원과 배합하여 강력한 보조제 활성을 나타냈다. 이러한 발견은 항종양 및 항바이러스 반응을 증강시키는 B7-IgG에 대한 임상적 가치를 제시한다.

실시예 2에 사용된 재료 및 방법

쥐과동물 B7-1-IgGIgG 및 B7-2-IgG2a 융합 단백질용 발현 플라스미드는, 시그널 및 쥐과동물 B7-1 또는 B7-2의 세포외 도메인을 엔코딩하는 DNA를, 쥐과 동물 IgG2a 항체로부터 유래하는 힌지-CH2-CH3 도메인을 엔코딩하는 DNA와 결합시킴으로써 제작하였다. 항체 힌지 영역내에 잔류하는 시스테인 잔기는 제조된 B7-1-IgGIgG2a 또는 mB7-2-IgG2a가 이량체이고 2가가 되도록 보존되었다. 고친화성 Fc 수용체에 의한 결합 및 보체 활성화를 방지하도록 IgG2a 영역이 돌연변이된 융합 단백질이 생성되었다(B7-IgG2mut로 지정). CH2 도메인의 하기 아미노산 잔기는 알라닌에 의해 치환되었다: #235 위치의 류신, #318 위치의 글루탐산, #320 위치의 리신, #322 위치의 리신. B7-IgG 단백질의 제조를 위해, 플라스미드를 CHO 세포주에서 발현시키고 단백질을 분리하였다.

P815는 DBA/2 마우스(잭슨 라보라토리스(Jackson Laboratories))에 5X10⁴개 세포를 피내(i.d.) 주사한 후 고형 종양으로 성장하는 비만세포종 유래의 종양세포주이다. 이 실험에 사용된 클론은 i.d. 주사후에 자연적으로 전이하여 25 내지 35일 후에 마우스의 사망을 초래한다. Balb/C 마우스의 육종에서 유래하는 종양세포주인 메트 A(Meth A)는 5X10⁵개 세포를 피내(i.d.) 주사한 후 고형 종양으로 성장한다(타코닉(Taconic)사의 Balb/C 마우스). C57BL/6 마우스(타코닉)의 흑색종에서 유래하는 비면역원성 종양주인 B16/F10은 5X10⁵개 세포를 피내(i.d.) 주사한 후 고형 종양으로 성장하고 25 내지 35일 후에 전이로 인해 사망을 초래한다. 방광 암종 MB49도 C57BL/6 마우스로부터 유래되며 5X10⁵개 세포를 피내 주사하여 5 내지 7일 후에 100%의 마우스에서 고형 종양을 유발시켰다.

시험관내 공동자극 검정

2X10⁵개의 비처리 (naive) 쥐과동물 비장세포를 저농도의 항-CD3 mAb (0 내지 500ng-ml의 -2C11, 파밍겐 (Pharmingen))이 코팅된 96-웰 플레이트에 3배수로 플레이팅하였다. 공동자극을 위해 필요한 시그널을 제공하기 위하여 플레이트를 양성 대조로서 항-CD28 mAb (0 내지 1㎍/ml)로 공동코팅하거나, B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG (0 내지 9㎍/ml)로 공동코팅하였다. 또한, B7-IgG는 가용성 형태로 첨가되거나 2차 항-마우스 IgG2a Ab에 의해 가교되었다. 비장세포를 72시간 동안 자극하였다. IFN-γ분석을 위해 분취량의 상층액을 제거하였고 세포를 H³-티미딘으로 8시간 동안 펄스화하였다. IFN-γ분석은 포획 Ab R46A4 및 비오틴화된 XGM1.2을 검출 Ab로서 사용하여 표준 ELISA로 수행하였다.

백신화 프로토콜:

예방적 종양 백신 모델에서, 마우스를 0일째에 백신화시켰고, 동시에 종양세포로 시험접종하였다. 마우스를, 75 내지 100 ㎍의 mB7-1-IgG, B7-2-IgG, 쥐과동물 IgG와 혼합되거나 아무것도 혼합되지 않은, PBS중의 조사된 종양세포 (1X10⁷세포)로 면역화시켰다. 양 뒷다리의 족저내 (i.fp.)에 주입하였다. B7-IgG의 주사는 3일 또는 5일째에 1회 반복하였다. 7일 째에, 동물들을 오른쪽 측복부에 규정된 용량의 생종양세포로 50 ㎕ 피내 주입하여 시험접종하였다. 1차 종양의 성장 및 동물의 생존을 40 내지 60일에 걸쳐 모니터링하였다.

치료적 종양 백신 모델에서, 규정된 수의 종양세포로 i.d. 접종하여 1차 종양을 유발시켰다. 5 내지 7일 째에 (종양이 명백히 촉진된 때), 마우스를 100 ㎍의 B7-1-IgG, B7-2-IgG와 혼합되거나 아무것도 혼합되지 않은 조사된 1X10⁷개의 종양세포로 족저내 백신화시켰다. 3일 후에 100 ㎍의 B7-IgG를 족저내로 재주입하였다. 이러한 백신화 투여법을 2 또는 3주 동안 반복하였다. 일차 종양의 성장 및 마우스의 생존을 7일부터 40 내지 70일까지 모니터링하였다.

치료 방법에서, 종양을 가진 마우스 B7-IgG는 융합 단백질로만 처리했다. 50-100㎍의 B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG만이 3주 동안 일주일에 2회씩 족저내 (i.fp.)주입하였다. 종양 성장 및 생존을 40일 동안 모니터링하였다.

PIA-특이적 CTL 반응의 측정:

B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 혼합되거나 혼합되지 않은 조사된 P815 세포로 단일 면역화시킨 후 10-14일에 DBA/2 마우스로부터 비장을 채취하였다. 적혈구 20×10⁶을 용해한 후, 비장세포(splenocyte)를 0.1 ng/ml의 P1A 펩티드 및 5 U/ml의 IL-2 (파민겐: pharmingen)를 가진 T25 플라스크 내에서 6일 동안 재자극시켰다. 다음, 표적으로서 P1A 펩티드로 펄스되거나 펩티드로 펄스되지 않은 A20 세포로 표준 5h Cr⁵¹-방출 검정을 수행하였다. P1A-펩티드 특이적 용해의 비율은, 펩티드 펄스된 표적의 용해율과 펄스되지 않은 표적의 용해율의 차이로서 표현했다.

결과:

고정화되거나 가교된 B7-IgG는 시험관 내에서 최적이하로 자극된 쥐과동물 비장세포에 대해 공동자극 신호를 제공한다.

FACS(등록상표) 또는 Biocore(등록상표) 분석은, B7-1-IgG 및 B7-2-IgG 융합 단백질이 쥐과동물의 CD28 및 CTLA-4에 결합한다는 것을 결정하였다. B7-IgG 융합 단백질이 T 세포의 활성을 증가 또는 억제하는지를 결정하기 위하여, 쥐의 비장세포가 플레이트 상에 고정화된 B7-IgG와 조합하여 플레이트에 결속된 항-CD3 mAb와 함께 시험관 내에서 배양되어 자극되었다. 양성 대조군 B7-1-IgG 및 B7-2-IgG로서 제공된 플레이트에 결속된 항-CD28 mAb에 의한 상호자극은, 증식 및 IFN-γ 분비 작용에서 투여량 의존적 증가를 유도하였다 (도 5). 2×10⁵의 비처리 비장세포를50 ng/ml의 항-CD3 모노클로날 항체 및 증가된 양의 고정된 항-CD28 항체, 또는 B7-1 또는 B7-2 IgG로 72시간 동안에 3회 자극하였다. 증식 반응을 3H-티미딘을 혼입하여 6h 펄스 후에 측정했다. 패널 B 및 C는 50 ng/ml의 항-CD3 항체 및 지시된 양의 고정화된 B7-2-IgG로 72시간 동안 자극한 후 방출된 IFN-γ또는 IL2의 각각의 양을 나타냈다. 표준 ELISA로 사이토카인을 측정하였다. 항-CD3 자극의 부재하에, B7-IgG는 증식을 유도하지 않았다. 가용성 B7-IgG 단백질이 증식 또는 IFN-γ생산을 강화하지 않으므로, 이차 항-쥐과동물 IgG mAb에 의한 B7-IgG 분자의 고정화 및 가교는 효율적 공동자극을 위하여 필수적이다. Fc 결합 영역에서 돌연변이된 B7-IgG 단백질 (B7-1-IgG 및 B7-2-IgGmut)은 플레이트에 고정되는 경우의 공동자극 비장세포내에서 효과적이다.

B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG는 조사된 종양세포 백신의 보호 효과를 강화한다.

B7-1-IgG 융합 단백질은 예방성 종양 백신 모델 내에서 보조제로 평가되었다. 5×10⁴의 생 P815 종양세포의 접종은, 100% 비처리 DBA/2 마우스 내에서 5-7일 후에 충실성 종양을 발생시켰다. 한 그룹 당 10 DBA/2 마우스를 한 번에 1×10⁷의 조사된 P815 종양세포로 복강내로 면역화시켰다. 세포 백신이 100㎍의 B7-1-IgG, B7-2-IgG, 또는 B7-1-IgG, B7-1-IgG 돌연변이 단백질과 혼합되거나 단독으로 주어졌다. 대조군의 경우, 100㎍의 B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG를 단독으로 제 0일 및 제 5일에 복강내로 투여하였다. 마우스에, 제 7일째에 5×10⁴의 생 P815 종양세포를 시험접종 하였다. 시험접종에 대한 보호는, 24일 후에 분명한 종양의 부재에 따라결정했다. 도 6은 5개 대표적 시험 중 하나로부터 획득된 결과를 나타낸다. 생 종양의 시험접종 전 일주일 동안, 조사된 P815 종양세포에 의한 마우스의 시험접종은 종양 성장에 대한 보호를 제공하지 못했다. 그러나, B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 혼합된 조사된 종양세포에 의한 단일 시험접종은, 60-70% 보호를 유도하였다 (도 6, 표 2). 대조적으로, B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG만에 의한 면역화는 보호를 전혀 제공하지 않았다 (도 6). 보호여부는, 14-24일 후 및/또는 60일 이상의 생존 후에 충실성 종양의 부재에 의해 결정했다. 후자는 전이성 질환의 부재를 나타내었다.

융합 단백질의 기능에 대한 IgG 도메인의 역할을 평가하기 위하여, Fc-수용체와 결합하지 않고 보체를 활성시키지 않는 돌연변이된 단백질, B7-1-IgGmut와 혼합된 조사된 P815 세포로 면역시켰다. 돌연변이된 분자는 B7-1-IgG 분자의 Fc 결합을 위한 역할을 제공하는 야생형보다 덜 효과적이다 (도 6, 표 2).

B7-1-IgG'와 혼합된 조사된 종양세포의 효과와 B7-1 또는 B7-2로 트랜스펙션시킨 종양세포의 효과를 비교하였다. B7-트랜스펙턴트에 의한 백신 처리는, 상당히 낮은 항-종양 면역을 유도하였고, 마우스의 30%만을 보호하였다. 이것은 B7-IgG와 혼합된 조사된 야생형 P815 세포에 의한 면역처리 후 60%인 것에 비교된다 (표 2). 이러한 발견은, B7-1-IgG'이 항-종양 보호를 발생시키기 위한 효과적인 보조제이고, B7-트랜스펙션된 종양세포보다 효과적임을 나타내었다.

B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 혼합된 조사된 P815 종양세포에 의한 백신화는 P815 종양이 확립된 마우스를 치료하였다.

치료적인 종양 백신 모델내의 B7-1-IgG의 보조제 활성을 시험하기 위하여,DBA/2 마우스에 P815 종양세포를 5-7일 후에 촉진성 충실성 종양을 발생시킬 투여량으로 피내 (i.d.) 주입하였다. 충실성 P815 종양은 제 0일 째에 5×10⁴의 P815 세포를 피내 주입하여 도입하였다. 촉지성 종양이 전개된 후 제 7일 째에 백신 처리를 하였다. 도 7은 족저내로 대조군 (A, E)으로서 PBS가 주입되거나, P815 종양세포가 단독으로(B) 또는 관련없는 마우스 IgG2a Ab와 혼합되어(F) 주사되거나, 조사된 P815 세포가 B7-1-IgG(C) 또는 B7-2-IgG(G)와 혼합되어 주사된 마우스의 결과를 나타낸다. 면역화는 제 7일, 제 14일, 제 21일에 반복하였다. PBS, 관련없는 Ab, 또는 B7-IgG는 각각 3일 후에 다시 투여하였다. 종양 성장을 40일 동안 모니터링하였다. 25-30일 후, 대조군 내의 동물들이 자발적 전이로 죽음을 직시하였다. 패널 D 및 H는 다른 처리 그룹의 생존 시간을 나타낸다. 데이터는 4개의 독립적 실험에 대한 대표값이다. 백신 처리 후 종양 성장 및 생존의 동역학은 도 7에 도시했으며, 4개의 독립적 실험의 대표값이다. 최초 면역화 후 약 일주일부터 시작하여, B7-IgG와 혼합된 종양세포로 면역화시킨 마우스 집단내에서 종양 퇴행으로 감소된 종양 성장이 관찰되었다. 종양 성장은 조사된 종양세포가 단독으로 또는 관련없는 마우스 B7-IgG2a Ab와 혼합 처리한 그룹에서는 감소하지 않았다. B7-IgG와 혼합된 조사된 P815 종양세포를 사용하여 면역화시킨 3회 주기 후에, 일차 종양이 60-80%의 마우스에서 사라졌다. 일차 종양의 퇴행은 마우스의 장기간 생존과 관련된다. B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 혼합된 조사된 P815 세포에 의한 면역화는 장기간 생존율을 약 80% 증가시켰다 (도 7, D, H). 처리되지 않거나 조사된 종양 백신 처리된 대조군내의 대수의 마우스는, 분명히 간, 비장 및 림프절내에서의 자발적 변형에 기인하여 25 내지 35일 사이에 사멸하였다.

다른 종양 모델내의 치료적 종양 백신 보조제로서의 B7-IgGs

B7-IgG의 결과가 P815 종양 또는 DBA/2 마우스계에 독특한 것인지를 결정하기 위하여, 2종의 상이한 마우스계내의 3종의 추가적인 종양 모델에 대해 보조제로서의 B7-IgG의 효과를 시험하였다. 유사한 긍정적 효과가 모든 모델에 대하여 수득되었다.

MethA 암종이 확입된 생후 7일 된 Balb/c 마우스를, PBS, 조사된 MethA 단독, 또는 B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 혼합된 조사된 MethA 세포로 면역화시켰다. 충실성 MethA 또는 B16/F10 종양이 Balb/c 또는 C57BL/6 마우스에 각각 확립되었다. 도 8은 그룹 당 10마리의 마우스가, 조사된 종양세포가 단독으로(B, E), 또는 25㎍(C, D) 또는 100㎍(F, G)의 B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG와 각각 혼합되어 족저내로 면역화됨을 도시한다. PBS, 또는 B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG 각각을 3-4일 후에 주입했다. 하나의 그룹은 PBS 단독으로 처리했다 (A, B16/F10에 대해 미도시). 종양 성장을 35일 동안 모니터링했다. 마우스는, MethA 종양이 일단 300mm²의 크기에 도달하면 안락사시켰다. B16/F10 종양을 가진 마우스는, 종양이 일단 400 mm²의 크기에 도달되면 안락사시키거나, 자발적 전이로 사멸하였다. 생존 동물의 백분율을 패널 H에 나타내었다. 실험을 3회 이상 반복하였다. B7-IgG와 혼합된 조사된 MethA 세포에 의한 2회의 면역화는, 100%의 마우스를 치료하였고, 이것은 대조군의자발적 치료율 10-15%와 비교된다 (도 8). 방광 암종 MB49를 가진 C57BL/6 마우스에서 유사한 결과가 관찰되었다. C57BL/6 마우스에서, 매우 전이성이 높고 면역원성이 부실한 흑색종 B16/F10의 반응이 연구되었다. B7-IgG 단백질 중 어느 하나와 혼합된 조사된 B16 종양세포에 의한 3회의 면역 처리는 대조군과 비교하여 종양 성장을 감소시키고 장기간 생존을 개선하였다 (도 8). 대조군내의 동물 모두는 35-40일 내에 사멸하였지만, B7-IgG 백신으로 처리된 마우스의 40-80% 이상이 60일 이상을 생존하였다 (도 8). 이러한 결과는 P815 종양 모델에서의 관찰을 지지하고, 치료적 종양 백신을 위한 보조제로서의 B7-IgG의 유효한 활성을 증명한다.

항-종양 반응을 유도시키는 B7-IgG 단독의 치료학적 투여:

상기한 바와 같이, 조사된 종양세포의 부재하에서 비처리 마우스를 B7-IgG로 예방 면역시키면, 종양 시험접종에 대해 마우스를 방어하지 못했다. 그러나, 모든 4가지 치료학적 종양 모델의 경우, B7-1-IgG 또는 B7-2-IgG 단독으로 종양 함유 마우스를 처리하면 종양 성장이 감소되었고, 생존율이 증가되었다 (도 9). 마우스를 0일째에 살아있는 P815 (A), MethA (B), MB49 (C) 또는 C57BL/6 (D)종양세포로 접종시켰다. 면역은 기술된 바와 같이 6 내지 8일째에 일어났다. 마우스를 PBS ( □), 조사된 종양세포 단독 (◇), B7-1-IgG와 혼합된 조사된 종양세포 (△), 또는 B7-2-IgG (Ｏ), 또는 B7-1-IgG (*) 또는 B7-2-IgG 단독 (+)으로 처리하였다. 7 내지 10마리의 마우스로 된 그룹에 대한 종양 크기의 평균값을 플로팅하였다. 마우스는 종양의 크기가 400㎟에 이르면 안락사시키거나 이들이 전이성 질병으로 치사하는 경우 이 값으로 할당되었다. 시험된 모든 모델의 경우, B7-IgG 단독으로 종양 함유 마우스를 치료학적으로 처리하면 종양 성장이 늦추어졌고, 종양 퇴행이 유도되었으며, 생존율이 증가하였다. 그러나, B16/F10 종양 모델로부터의 데이터는 조사된 종양세포 + B7-IgG로 백신접종시키는 것은 적어도 불량하게 면역원성인 종양에 대해서는 B7-IgG 단독에 의한 치료 보다 더욱 강력한 항-종양 치료법임을 암시한다.

가용성 B7-IgG와 관련된 이러한 결과는 세포의 표면에 제공되는 공동자극 분자 (고체상 공동자극)를 사용하여 수득한 결과로 볼때 의외이다. 이러한 모델 중 3가지 모두에서의 B7 트랜스펙션된 종양세포에 의한 치료학적 백신접종이 평가되었고, 종양 성장 및 생존율에 대해 적당한 효과를 나타내지 않았다. 약 10¹⁶B7 분자는 10⁷트랜스펙션된 종양세포의 표면상의 전체 약 10¹⁰내지 10¹¹B7 분자와 비교하여, B7-IgG 100㎍을 백신과 혼합함으로써 제공된다. 이러한 정량적 차이는 조사된 B7-트랜스펙턴트에 의한 백신접종이 생세포가 증식하여 이용가능한 B7 분자의 갯수를 증가시킬 수 있는 살아있는 B7-트랜스펙턴트에 의한 경우 보다 훨씬 덜 효율적인 이유를 설명해줄 수 있다. 그 밖의 설명은 조사된 종양세포의 표면상에서 발현되는 B7 분자와 비교하여 B7-IgG 분자의 확장된 존재를 포함할 수 있다. 또한, 가용성 분자는 체내에서 상이하게 분포할 수 있으며, 면역 자극의 더욱 적합한 부위에 도달할 수 있다.

CD8 T 세포 의존성이지만 IFN-γ비의존성인 B7-IgG 매개성 종양 치료법

B7-IgG 매개성 면역 자극에의 적응성 면역 반응의 관여를 추가로 특징화하기위해, 성숙한 T 및 B 세포가 결여된 SCID 마우스 중의 B7-IgG를 평가하였다. 고형 종양을 SCID 마우스에 확립시킨 후, 이러한 종양을 B7-IgG 단독 또는 조사된 세포 백신 + B7-IgG로 처리하였다. 둘 모두의 처리는 종양 성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 B7-IgG 매개성 종양 반응이 T 또는 B 세포에 의존성임을 입증해준다 (도 10). 종양 함유 마우스를 또한 CD8 또는 CD4 T 세포를 제거한 후에 처리하였다. 항체 주입에 의한 CD8 또는 CD4 T 세포의 제거는 B7-IgG 치료를 시작하기 하루 전에 개시하였다. 성공적인 제거는 28일째에 PBL의 FACS 분석에 의해 확인되었다. CD4 제거된 마우스의 경우, B7-IgG는 종양 퇴행을 유도시켰고 치료는 정상 마우스와 구별할 수 없었지만 (도 11), CD8 제거는 B7-IgG 매개성 항-종양 활성을 상실시켰다. 종양은 CD8 제거된 처리되지 않은 마우스의 경우 보다 느리게 성장하였지만, 종양 치료는 관찰되지 않았다 (도 11).

IFN-γ이 항-종양 면역 감시 및 항-종양 반응에서 중요한 역할을 한다는 사실에도 불구하고, B7-IgG가 IFN-γ와 무관하게 확립된 종양을 치료할 수 있는 것으로 결정되었다. 고형 종양을 IFN-γ 녹아웃 마우스에서 확립시켰고, B7-IgG 또는 B7-IgG와 혼합된 조사된 종양세포 백신으로 처리하였다. 둘 모두의 처리는 종양 퇴행을 유도시켰고 약 28일째의 치료는 야생형 마우스에 필적하였는데, 이는 B7-IgG 종양 치료의 IFN-γ비의존성을 입증해준다 (도 12). 또한, IFN-γ의 돌연변이로 인해 IFN-γ에 반응성이지 않은 종양은 B7-IgG로 처리하면 여전히 치료되었다.

항-종양 치료에서 또는 백신 애주번트로서의 B7-IgG는 CTLA4에 대한 블록킹 항체 보다 강력한 것으로 또한 결정되었다. 3가지 상이한 종양 모델의 경우, B7-IgG 치료는 항-CTLA4 항체가 CTLA4에 대한 이의 훨씬 큰 친화성 및 이의 블록킹 활성의 과거의 보고에도 불구하고 영향을 미치지 못하는 종양 시험감염에 대해 방어를 제공하거나 종양을 치료하였다. 이러한 데이터는 B7-IgG가 면역 반응을 증강시키는 메카니즘이 CTLA4에 의해 매개된 네거티브 신호의 블록킹에 의존성이지만 이것에만 제한되지 않음을 나타내준다.

표 2. 방어 면역을 제공하는 조사된 종양세포와 혼합된 B7-IgG2a

면역화	보호율 (평균 ±SD)	동물 마리수(보호된 마리수/시험접종된 동물 마리수)	실험 횟수
처리하지 않음	8% (11)	3/42	5
조사된 P815	2% (4)	1/43	5
조사된 P815-B7-1 트랜스펙턴트	23% (4)	3/13	2
조사된 P815 + B7-1 IgG	65% (18)	29/45	4
조사된 P815 + B7-2 IgG	60% (24)	23/37	4
조사된 P815 + B7-1 IgG (돌연변이됨)	28% (4)	5/18	2
조사된 P815 + B7-2 IgG (돌연변이됨)	20%	2/10	1
조사된 P815 + 항-CD28	0%	0/10	1
조사된 P815 + 항-CTLA-4	40%	4/10	1
조사된 L1210-P1A	0% (0)	0/19	2
조사된 L1210-P1A + B7-1-IgGIgG	10% (14)	2/20	2

등가물

당업자라면 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정한 구체예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

배경기술

외래 단백질에 대한 T 세포 반응을 위해서는, 두개의 시그널이 항원발현세포 (APCs)에 의해 T 림프구로 제공되어야 한다 (참고문헌: Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L., et al. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709). 제 1 시그널은 면역반응에 특이성을 부여하는 것으로서, 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 콘텍스트내에 발현되는 외래 항원성 펩티드의 인식에 후속하는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 유도된다. 제 2 시그널은 공동자극으로 명명되는 것으로서, T 세포가 증식되고 기능적이 되도록 유도하는 것이다 (참고문헌: Lenschow et al. 1996. Annu. Rev. Immunol. 14:233). 공동자극은 항원특이적이거나 MHC 제한적인 것은 아니며, APCs에 의해 발현되는 하나 이상의 독특한 세포 표면 단백질에 의해 제공되는 것으로 간주된다 (참고문헌: Jenkins, M.K., et al. 1988 J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; Young, J.W., et al. 1992 J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., et al. 1992 Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer, G.A., et al. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M., et al., 1991 J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I., et al., 1989 J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J. et al. 1992 Nature 357, 80-82; Liu, Y., et al. 1992 J. Exp. Med. 175, 437-445). 만약, T 세포가 추가의 공동자극 시그널 없이 T 세포 수용체를 통해서만 자극을 받는 경우, 이들은 비반응성, 무기력, 또는 사멸하여 면역반응을 하향 조절할 것이다.

APCs 상에 발현되는 CD80 (B7-1) 및 CD86 (B7-2) 단백질은 매우 중요한 공동자극 분자이다 (참고문헌: Freeman et al. 1991. J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. 1989 J. Immunol. 143:2714; Azuma et al, 1993 Nature 366: 76; Freeman et al. 1993. Science 262:909). B7-2는 일차 면역반응에서 지배적인 역할을 하는 반면에, 면역반응의 과정의 후기에 상향 조절되는 B7-1은 일차 T 세포 반응을 연장시키거나, 이차 T 세포 반응을 공동자극하는데 중요한 것으로 보인다 (참고문헌: Bluestone. 1995. Immunity. 2:555).

B7-1 및 B7-2에 결합하는 리간드인 CD28은 휴지중인 T 세포상에 구성적으로 발현되고 활성화 후에 발현이 증가한다. T 세포 수용체를 통한 시그널링 후, CD28의 결합 및 공동자극 시그널의 유또는, T 세포가 증식하고 IL-2를 분비하는 것을 유도한다 (참고문헌: Linsley, P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; June, C.H., et al. 1990 Immunol. Today. 11, 211-6; Harding, F.A., et al. 1992 Nature. 356, 607-609). CTLA4 (CD152)로 명명된 제 2 리간드는 CD28과 상동성이나 휴지 T 세포상에서는 발현되지 않고 T 세포 활성화에 후속하는 것으로 보인다 (참고문헌: Brunet, J.F., et al., 1987 Nature 328, 267-270). CD28과 대조적으로, CTLA4는 T 세포 반응의 음성 조절에 매우 중요한 것으로 보인다 (참고문헌: Waterhouse et al. 1995. Science 270:985). CTLA4의 봉쇄는 억제 시그널을 제거하는 것으로 발견된 반면에, CTLA4의 어셈블리는 T 세포 반응을 하향 조절하는 억제 시그널을 제공하는 것으로 발견되었다 (참고문헌: Allison and Krummel. 1995. Science 270:932).

면역반응을 강화시키는 방법의 개발에 대한 필요성이 장기간 존재하였다. 예를 들어, 현재까지 특정 바이러스 및 종양세포에 대한 면역반응을 종래 기술에 의한 방법을 사용하여 강화시키는 것은 곤란하였다. 일반적으로, 면역반응을 강화시키기 위한 방법, 및 특히 종양 항원 및 감염성 항원 (예를 들어, 바이러스성, 세균성, 및/또는 기생성 항원)에 대한 반응을 강화시키기 위한 방법은 매유 유용할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 공동자극 경로를 조작하여 면역반응을 강화시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 특히 종양 항원 및 감염성 제제로부터의 항원에 대한 반응을 증가시키는데 효과적이다. 본 발명은 공동자극 분자의 가용성 형태가 예방적 및 치료적으로 면역반응을 증강시킬 수 있다는 발견에 일부 이상 기초한다. 이러한 증강은, 본 발명의 가용성 공동자극 분자가 고체상에 투여되지 않으며 (예를 들어, 세포상에 투여되지 않으며), 가교제의 부재하에 투여된다는 사실에도 불구하고 관찰된다. 이러한 발견은, 특히 B7-1 및 B7-2 분자의 가용성 형태가 공동자극 반응을 일으키지 못한다는 교시 (참고문헌: Hayden et al. 1996. Tissue Antigens, 48:242; U.S. patent 5,580,756)의 관점에서 보면 매우 놀라운 것이다.

따라서, 일면에서, 본 발명은 공동자극 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 조성물을 투여함에 의해 항원에 대한 피험자의 면역반응을 예방적으로 증강시켜, 피험자의 항원에 대한 면역반응이 증강되도록 하는 방법을 제공한다.

다른 면에서, 본 발명은 공동자극 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 조성물을 투여함에 의해 항원에 대한 피험자에 의한 면역반응을 치료적으로 증강시켜, 피험자의 항원에 대한 면역반응이 증강되도록 하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 공동자극 분자는 B7-1 및 B7-2로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 면에서, 클래스 I 제한 항원 또는 이것의 단편 및 B7 분자의 세포외 도메인을 포함하는 제 1 제제를 투여함에 의해 피험자에서 클래스 I 제한 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증강시켜, 피험자에 투여시 클래스 I 제한 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응이 증강되도록 하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 피험자에 클래스 Ⅱ 제한 항원을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 피험자에 보조제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일 구체예에서, B7 분자는 B7-1 분자이다. 다른 구체예에서, B7 분자는 B7-2 분자이다.

일 구체예에서, 공동자극 분자는 단일특이성이다. 다른 구체예에서, 공동자극 분자는 이량체 및 이가이다. 일 구체예에서, 가용성 공동자극 분자는 단일특이성 및 이량체 및 이가이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, B7 분자의 세포외 부분이 면역글로불린 분자의 부분을 포함하는 제 2 단백질 또는 폴리펩티드와 융합된다. 일 구체예에서, 면역글로불린 분자의 부분은 시스테인 잔기를 포함한다. 일 구체예에서, 면역글로불린 분자의 부분은 사람 면역글로불린 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 분자의 부분은 사람 면역글로불린 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 면역글로불린 분자는 보체 (complement) 고정화 및/또는 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있도록 변형된다.

일 구체예에서, 항원은 종양세포 항원이다.

다른 구체예에서, 피험자는 결장암, 유방암, 전립선암, 신세포암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 비만세포종, 육종, 및 방광암종으로 구성된 군으로부터 선택된 유형의 암을 포함한다.

일 구체예에서, 면역반응은 세포성 면역반응이다. 다른 구체예에서, 면역반응은 체액성 면역반응이다.

Claims (21)

1. 공동자극 (costimulatory) 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 조성물을 투여하여 피험자의 항원에 대한 면역반응을 증강시키는 단계를 포함하는, 항원에 대한 피험자에 의한 면역반응을 예방적으로 증강시키는 방법.
2. 공동자극 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 조성물을 투여하여 피험자의 항원에 대한 면역반응을 증강시키는 단계를 포함하는, 항원에 대한 피험자에 의한 면역반응을 치료적으로 증강시키는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 공동자극 분자가 B7-1 및 B7-2로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
4. 클래스 I 제한 항원 또는 이것의 단편 및 B7 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 조성물을 포함하여 피험자에 투여시 클래스 I 제한 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증강시키는 단계를 포함하는, 피험자에서 클래스 I 제한 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증강시키는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 피험자에 클래스 Ⅱ 제한 항원을 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 피험자에 보조제를 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, B7 분자가 B7-1 분자임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, B7 분자가 B7-2 분자임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 공동자극 분자가 단일특이성임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 공동자극 분자가 이량체 및 2가 (bivalent)임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 가용성 공동자극 분자가 단일특이성, 이량체 및 2가임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, B7 분자의 세포외 부분이 제 2 단백질 또는 면역글로불린분자의 부분을 포함하는 폴리펩티드와 융합됨을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 면역글로불린 분자의 부분이 시스테인 잔기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 면역글로불린 분자의 부분이 사람 면역글로불린 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
15. 제 12항에 있어서, 면역글로불린 분자의 부분이 사람 면역글로불린 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
16. 제 12항에 있어서, 면역글로불린 분자가 보체 (complement) 고정화 및/또는 Fc 수용체 결합을 감소시키도록 변형됨을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 항원이 종양세포 항원임을 특징으로 하는 방법.
18. 제 2항에 있어서, 피험자가 결장암, 유방암, 전립선암, 신세포암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 비만세포종, 육종 및 방광암종으로 구성된 군으로부터 선택된 유형의 암을 가짐을 특징으로 하는 방법.
19. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 항원이 세균성 항원, 바이러스성 항원 및 기생성 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 항원임을 특징으로 하는 방법.
20. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 면역반응이 세포성 면역반응임을 특징으로 하는 방법.
21. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 면역반응이 체액성 면역반응임을 특징으로 하는 방법.