KR20010112937A - 항균성 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

그람 음성 세균의 독성 유전자를 찾아냄으로써, 이들 독성 유전자 및 그 산물을 표적으로 하는 신규 항균제를 확인하고 백신으로 유용한 신규 그람 음성 세균 돌연변이체를 제공할 수 있다.

Description

항균성 백신 조성물{Anti-Bacterial Vaccine Compositions}

파스테우렐라(Pasteurella)과에는 광범위한 동물을 감염시키는 여러가지 중요한 병원균이 포함된다. 피. 멀토시다(P. multocida) 이외에, 이 과의 주요 구성원으로는 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus)가 포함된다. 피. 멀토시다(P. multocida)는 다수의 야생 동물 및 가축의 정상 플로라(flora)에서 발견되는 그람 음성의 부동성 코코바실러스(coccobacillus) 균으로서, 세계적으로 다수의 동물 종에서 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다[Biberstein, In M. Kilian, W. Frederickson, and E. L. Biberstein (ed.), Haemophilus, Pasteurella, and Actinobacillus. Academic Press, London, p. 61-73 (1981)]. 감염에 따른 질병 징후로는 패혈증, 기관지 폐렴, 비염 및 상처 감염이 포함된다(이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Shewen et al., In C. L. Gyles and C. O. Thoen (ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993)] 참조).

피. 멀토시다(P. multocida)에 의한 감염은 일반적으로 스트레스 기간의 침입으로부터 기인하지만, 연무질 또는 접촉 노출에 의해 전염되거나 벼룩 또는 진드기를 매개로 전염될 수도 있다. 가금(家禽)의 경우, 피. 멀토시다(P. multocida)의 감염은 급성 내지 과급성 패혈증을 유발하며, 특히 가축수 과잉, 알 낳기, 털갈이 또는 심한 기후 변화와 관련된 스트레스 조건하에서 가축용 칠면조 및 야생 물새에서 일반적으로 나타난다. 소의 경우, 감염에 의해 유사한 출혈성 패혈증이 유발되고, 고열 및 우울증을 비롯한 증상이 나타나며, 일반적으로 그 후에 급사하게 된다. 이는 연무질 접촉을 통해 가장 잘 전염되지만, 심한 기후 변화 기간 동안 감염될 수도 있다. 토끼의 경우, 감염되면 반복적 화농성 비염을 유발하게 되고, 일반적으로 그 후에 결막염, 중이염, 부비강염, 피하 농양 및 만성 기관지 폐렴을 수반한다. 심하게 감염되는 경우, 토끼는 급성 섬유성 기관지 폐렴, 패혈증 또는 내독소 혈증으로 인하여 죽게된다. 질병은 일반적으로 스트레스 기간에 발병한다. 돼지의 경우, 일반적인 피. 멀토시다(P. multocida) 관련 질병으로는 위축성 비염 및 세균성 폐렴이 포함된다. 또한, 유사한 폐렴 증상이 개, 고양이, 염소 및 양에서 발견된다. 피. 멀토시다(P. multocida)는 통상 많은 동물의 구강 플로라에서 발견되며, 따라서 물리거나 긁힌 상처에 통상적으로 오염되는 세균이다.

피. 멀토시다(P. multocida) 균주는 일반적으로 협막 혈청군 및 체세포 혈청형에 의해 명명한다. 특징적인 열-안정성 항원의 발현에 의해 5가지 협막 혈청군(A, B, D, E 및 F)과 16가지 체세포 혈청형으로 구별한다. 대부분의 균주는 숙주 특이적이고, 하나 또는 둘 이상의 동물이 감염되는 경우는 거의 없다. 전통적인 전세포 사균은 통상 특정 혈청형에 대해서만 특이적으로 보호할 수 있기 때문에, 상이한 혈청형들이 존재하는 경우 백신 접종에 문제점이 유발된다. 그러나, 한 가지 혈청형으로 자연 감염되면 여러가지 혈청형에 대해 면역학적으로 보호될 수 있고[Shewen et al., In C. L. Gyles and C. O. Thoen (Ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993)], 생체내에서 생장한 불활성화 세균을 이용하여 교차 보호(cross protection)가 촉진될 수 있음이 입증되었다[Rimler et al., Am J Vet Res. 42:2117-2121 (1981)]. 자발성 돌연변이 생균주인 피. 멀토시다(P. multocida) 균주 하나를 백신으로 사용했을 때 강력한 면역 반응이 나타났다[Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink et al., Avian Dis. 31(1):13-21 (1987)]. 그러나, 이 독성약화 균주는 백신 접종자가 스트레스를 받으면 독성 상태로 되돌아가거나 이 균주에 의해 사망을 초래할 수 있음이 밝혀졌다[Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink et al., Avian Dis. 31(1):13-21 (1987)].

파스테우렐라(Pasteurella)과의 다른 구성원인 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)는 돼지에 대한 엄격한 숙주 특이성을 나타내며, 고도의 전염성을 나타내는 돼지 흉막폐렴의 원인균이다. 감염은 일반적으로 집중적인 번식 조건에서 발생하며, 직접 전염 방식으로 발생한다고 믿어진다. 종종 이 질병은 치명적이며, 그 결과 양돈 산업에서 심각한 경제적 손실을 초래하게 된다. 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 감염은 만성 또는 급성일 수 있으며, 이 감염은 섬유성 흉막염을 수반하는 출혈성 괴사성 기관지 폐렴이 특징이다. 현재까지, 세균의 독성은 혈청형-특이적 협막 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드 및 표면 단백질을 비롯한 구조 단백질, 및 세포외 세포용해성 독소에서 기인하였다. 이러한 독성 인자들이 정제되고 일부 경우에는 클로닝되었음에도 불구하고, 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 감염에서 이러한 독성 인자들의 정확한 역할은 잘 모르는 실정이다.

협막 폴리사카라이드의 항원적 차이 및 세포외 독소의 생산에 기초하여, 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 12가지 혈청형이 확인되었다. 혈청형 1, 5 및 7은 미국에서 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 감염에 가장 연관성이 있으며, 유럽에서는 혈청형 1, 2, 5, 7 및 9가 우세하다. 혈액용해소(haemolysin) 족의 구성원이며 RTX 독소라 불리우는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 중요한 세포외 독소가 3가지 이상 존재한다. RTX 독소는 대장균(E. coli), 프로테우스 불가리사(Proteus vulgarisa) 및 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica)를 비롯한 다수의 그람 음성 세균에 의해 생산되며, 이들 단백질은 일반적으로 구조적 특성 및 기능적 특성을 공유한다. 그러나, 다양한 혈청형으로부터 생성된 독소는 숙주 특이성, 표적 세포 및 생물학적 활성이 다르다.

에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 주요 RTX 독소로는 ApxⅠ, ApxⅡ 및 ApxⅢ이 포함된다. ApxⅠ 및 ApxⅡ는 용혈 활성을 가지며, ApxⅠ의 활성이 더 강력하다. ApxⅢ은 용혈 활성을 갖지는 않지만, 폐포 대식세포 및 호중구에 대한 세포독성이 있다. 대부분의 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 혈청형은 상기 3가지 독소 중 2가지를 생산한다. 예를 들어, 혈청형 1, 5, 9 및 11은 ApxⅠ 및 ApxⅡ를 발현하고, 혈청형 2, 3, 4, 6 및 8은 ApxⅡ 및 ApxⅢ을 발현한다. 그러나, 혈청형 10은 단지 ApxⅠ만을 생산하고, 혈청형 7 및 12는 단지 ApxⅡ만을 발현한다. ApxⅠ과 ApxⅡ를 모두 생산하는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 혈청형이 이 세균 중 가장 독성이 강한 균주이다.

무작위적으로 돌연변이된 야생형 세균을 이용한 쥐과(murine) 모델 및 돼지 감염에서 Apx 독소가 독성 인자임이 입증되었다[Tascon et al., Mol. Microbiol. 14:207-216 (1994)]. 또한, AopA 외막 독성 단백질을 불활성화시키는 표적 돌연변이 유발로 다른 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체를 생성하였다[Mulks and Buysee, Gene 165:61-66 (1995)].

백신 조성물을 제조하려는 시도에서, 전통적인 전세포 사균은 특정 혈청형에만 특이적인 보호를 제공했지만[MacInnes 및 Smart의 상기 문헌], 독성이 높은 한 혈청형으로 자연 감염되면 여러가지 혈청형에 대해 강력한 보호적 면역성을 촉진할 수 있음이 입증되었다[Nielsen, Nord Vet Med. 31:407-13 (1979), Nielsen, Nord Vet Med. 36:221-234 (1984), Nielsen, Can J Vet Res. 29:580-582 (1988), Nielsen, ACTA Vet Scand. 15:80-89 (1994)]. ApxⅡ 독소의 불활성화 형태를 생산하는 특성화된 독성약화 생백신 균주가 돼지에서 교차 보호에 대한 장래성을 나타내는[Prideaux et al., Infection ＆ Immunity 67:1962-1966 (1999)] 한편, 다른 특성화되지 않은 독성약화 생돌연변이체들도 또한 교차 보호에 대한 장래성을 나타냈다[Inzana et al., Infect Immun. 61:1682-6, (1993), Paltineanu et al., In International Pig Veterinary Society, 1992, p. 214, Utrera et al., In International Pig Veterinary Society, 1992, p. 213].

특성화되지 않고 자발 돌연변이된 세균 균주를 포함하는 백신 조성물과 관련된 문제점 때문에, 당업계에는 상동성 및 이종성의 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 혈청형에 대한 보호적 면역성을 안전하게 자극할 수 있는 독성약화 생세균 균주의 합리적인 제작이 요구되고 있다. 또한, 독성약화 세균 균주 및 세균의 독성 유전자를 찾아내어 항균제를 확인하는 방법의 개발을 촉진해야 한다는 요구도 존재한다.

<발명의 개요>

일반적으로, 본 발명은 독성약화 그람 음성 세균을 포함하는 백신 조성물을 제조하고 이용하기 위한 재료 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 백신 조성물은 당업계에 공지되어 있으며 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌 [Dewhirst et al., J. Bacteriol. 174:2002-2013 (1992)]에 부분적으로 기재되어 있는 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae)과 세균 중에서 독성약화된 종을 포함한다. 상기 과의 종에는 에이. 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans), 에이. 캡슐라투스(A. capsulatus), 에이. 에쿨리(A.equuli), 에이. 리그니에레시이(A. lignieresii), 에이. 플레우로뉴모니아[A. pleuropneumoniae; 에이치. 플레우로뉴모니아(H. pleuropneumoniae)], 에이. 세미니스(A. seminis), 에이. 수이스[A. suis; 에이치. 수이스(H. suis)], 에이. 우레아[A. ureae; 피. 우레아(p. ureae), 에이. 캡슐라투스(A. capsulatus), 비스가르드 탁손(Bisgaard taxon) 11, 에이치. 애깁티우스(H. aegyptius), 에이치. 아프로필러스(H. aphrophilus), 에이치. 아프로필러스[H. aphrophilus; 에이치. 파라인플루엔자(H. parainfluenzae)], 에이치. 두크레이(H. ducreyi), 에이치. 헤모글로비노필러스(H. haemoglobinophilus), 에이치. 헤몰리티쿠스(H. haemolyticus), 에이치. 인플루엔자(H. influenzae), 에이치. 파라쿠니쿨러스(H. paracuniculus), 에이치. 파라갈리나룸(H. paragallinarum), 에이치. 파라헤몰리티쿠스(H. parahaemolyticus), 에이치. 파라인플루엔자[H. parainfluenzae; 에이치. 파라프로필러스(H. paraphrophilus)], 에이치. 파라프로헤몰리티쿠스(H. paraphrohaemolyticus), 에이치. 파라프로필러스(H. paraphrophilus), 에이치. 파라수이스(H. parasuis), 에이치. 파라수이스(H. parasuis) 5형, 에이치. 세그니스(H. segnis), 에이치. 솜너스(H. somnus), 헤모필러스(Haemophilus) 소그룹, 헤모필러스(Haemophilus) 탁손 C, 피. 에어로젠스(P. aerogenes), 피. 아나티스(P. anatis), 피. 아비움[P. avium; 에이치. 아비움(H. avium)], 피. 카니스(P. canis), 피. 다그마티스(P. dagmatis), 피. 갈리나룸(P. gallinarum), 피. 헤몰리티카(P. haemolytica), 피. 트레할로시[P. trehalosi; 피.헤몰리티카(P. haemolytica) 생체형 T], 피. 랑아(P. langaa), 피. 멀토시다(P. multocida), 피.뉴모트로피카(P. pneumotropica), 피. 스토마티스(P. stomatis), 피. 볼란티움[P. volantium; 에이치. 파라인플루엔자(H. panainfluenzae)], 피. 볼란티움(P. volantium), 파스테우렐라(Pasteurella) 종 A, 파스테우렐라(Pasteurella) 종 B 및 헤모필러스 파라프로헤몰리티쿠스(Haemophilus paraphrohaemolyticus)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 백신 조성물이 독성약화된 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus) 또는 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 세균을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 독성약화된 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. plueropneumoniae) 세균 균주를 포함한다.

본 발명의 한 측면은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나, 또는 그의 종 동족체로 표시되는 유전자 서열에 기능적 돌연변이를 함유하는 그람 음성 세균 생물체를 제공하며, 여기서 돌연변이는 코딩되는 유전자 산물(즉, 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드)의 발현 및(또는) 생물학적 활성을 억제 또는 제거하고, 상기 기능적 돌연변이는 세균 균주의 독성을 약화시킨다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 종 동족체에는 실질적인 폴리뉴클레오티드 서열 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 기능 및(또는) 특징을 갖는, 2종 이상의 상이한 종에서 발견되는 유전자가 포함된다. 바람직하게는, 종 동족체인 폴리뉴클레오티드 서열들이 실시예에 기재되는 중간 정도의 엄격 조건하에서 혼성화되고, 동일하거나 유사한 생물학적 활성 및(또는) 특징을 가질 것이다. 또다른 측면에서, 종 동족체인 폴리뉴클레오티드들은 약 60％가 넘는 서열 상동성, 약 70％가 넘는 서열 상동성, 약 80％가 넘는 서열 상동성, 약 90％가 넘는 서열 상동성 또는 약 95％가 넘는 서열 상동성을 공유할 것이다. 유전자 산물의 발현 및(또는) 생물학적 활성을 변화(즉, 증가 또는 감소)시키는 기능적 돌연변이로는 유전자 그 자체의 단백질 코딩 영역에서 삽입 또는 결실되는 것, 또는 유전자 발현의 조절을 담당하거나 이와 관련된 서열에서 삽입 또는 결실되는 것이 포함된다. 결실 돌연변이체에는 특정 유전자 서열의 전부 또는 일부가 결실된 것이 포함된다. 한 측면에서, 돌연변이의 결과 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실된다. 또다른 측면에서, 돌연변이의 결과 유전자에서 삽입이 발생하며, 여기서 삽입으로 인해 돌연변이 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이 유전자에 의해 코딩되는 불활성화 유전자 산물이 발현된다. 또한, 본 발명의 조성물, 바람직하게는 백신 조성물은 돌연변이화된 독성약화 그람 음성 세균 생물체를 포함하며, 임의로 적합한 면역보강제 및(또는) 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 변화된 균주가 백신 조성물에 효과적이도록 하기 위해서는, 병원체로부터의 심각한 임상적 증상의 발병을 예방하기에 충분하도록 독성약화 효과가 커야 하지만, 또한 숙주에서 세균의 복제 및 생장을 억제하기에 충분하도록 독성약화 효과가 작아야 한다.

또한, 본 발명은 그람 음성 세균의 독성에 필요한 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 상보성 DNA, 상보성 또는 안티센스 DNA를 비롯한 게놈 DNA, 및 전체적 또는 부분적으로 합성된 DNA와 같은 DNA; 센스 및 안티센스 가닥을 비롯한 RNA; 및 문헌 [Corey, TIBTECH 15:224-229 (1997)]에 기재된 바와 같은 펩티드 핵산이 포함된다. 본 발명의 독성 유전자 폴리뉴클레오티드에는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 서열, 또는 그의 종 동족체; 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 종 동족체에 의해 코딩되는 독성 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그의 종 동족체의 비코딩 가닥(또는 상보 가닥)에 중간 정도의 엄격 조건 내지 고도의 엄격 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae)로부터의 유전자 서열, 및 그의 자연 발생적(즉, 종 동족체) 변이체 및 인공적으로 유도된 변이체를 비롯한 다른 그람 음성 세균 생물체로부터의 관련 유전자 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나, 및 그의 종 동족체로부터 추정된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 지식을 습득하면, 상기 폴리뉴클레오티드의 모든 단편을 쉽게 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 작제물을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환, 형질감염 또는 전기천공된 숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현을 허용, 바람직하게는 촉진하는 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 그의 배지로부터 유전자 산물을 단리하는 단계를 포함하는, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 찾아내면 코딩되는 폴리펩티드를 이용할 수 있게 된다. 본 발명의 폴리펩티드에는 전장 및 단편 단백질, 또는 말단이 잘린 단백질; 그의 변이체; 융합 또는 키메라 단백질; 및 야생형 폴리펩티드에 보존적 아미노산 치환이 도입된 것을 비롯한 유사체가 포함된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체(모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 상보성 결정 영역(CDR)-이식 항체가 포함됨) 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 CDR 서열을 포함하는 화합물이 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체에 면역특이적인 항-유전자형 항체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 그람 음성 세균의 독성 유전자 또는 유전자 산물을 변화시키는 신규 항균제를 찾아내는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51,53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 서열, 또는 그의 종 동족체에 의해 코딩되는 독성 유전자 산물의 발현을 방해할 수 있는 잠재적 약제를 스크리닝하거나, 또는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 DNA 서열, 그의 종 동족체, 또는 그의 상보 가닥에 의해 전체적 또는 부분적으로 코딩되는 세균 유전자 산물의 생물학적 기능을 방해할 수 있는 잠재적 약제를 스크리닝한 후, 그러한 스크리닝 분석에서 양성 결과를 나타내는 약제를 확인하는 것을 포함한다. 특히, 독성 유전자 산물의 발현을 방해하는 약제로는 독성 유전자 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 리보자임(ribozyme)이 포함된다. 또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드에 의해 유도되는 삼중 나선 형성을 이용하여 본 발명의 유전자 산물의 전사를 변화시키는 방법을 포함한다.

독성 유전자 산물의 기능을 방해하는 약제로는 독성 유전자 산물의 변이체, 독성 유전자 산물의 결합 파트너 및 그러한 결합 파트너의 변이체, 및 효소 억제제(산물이 효소인 경우)가 포함된다.

본원에 기재된 방법에 의해 확인된 신규 항균제가 제공되며, 또한 그람 음성세균에 감염된 환자에게 세균의 존재를 감소시키기에 효과적인 양의 상기 신규 항균제를 투여하는 것을 포함하는 상기 환자의 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 무수한 부가적 측면 및 이점은, 현재 준비된 그의 실시양태를 설명하는 하기 발명의 상세한 설명을 고려하면 당업자에게 분명해질 것이다.

본 발명은 일반적으로 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 세균의 독성을 담당하는 유전자의 확인에 관한 것으로, 이를 통해 백신으로 유용한 신규 독성약화 돌연변이 균주를 제조하고 독성 유전자 및 그의 산물을 표적으로 하는 신규 항균제를 확인할 수 있다.

본원에 사용되는 "독성 유전자"는 그의 기능 또는 산물이 숙주 세포에서 세균의 성공적인 감염 및(또는) 유지에 필요한 유전자이다. 따라서, 독성 유전자 및(또는) 그에 의해 코딩되는 단백질은 숙주 생물체의 발병과 관련되어 있지만, 생장에 필수적인 것은 아니다.

본원에 사용되는 "시그너처 태그가 부착된 돌연변이 유발법(signature-tagged mutagenesis, STM)은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 국제 특허 공개 WO 96/17951호에 일반적으로 기재된 방법이며, 예를 들면 균혈증의 쥐과 모델에서 독성에 필요한 세균 유전자를 찾아내는 방법이 여기에 포함된다. 이 방법에서, 게놈에 무작위 돌연변이를 갖는 각 세균 균주는 트랜스포손(transposon) 통합을 이용하여 생성되고; 각각의 삽입 돌연변이는 돌연변이체가 서로 구별되게 하는 상이한 DNA 시그너처 태그를 지니고 있다. 이 태그는 중심 영역이 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 함께 증폭되게 하는 20 bp의 불변체 "암(arm)"에 인접한 40 bp의 가변성 중심 영역을 포함한다. 태그가 부착된 돌연변이 균주를 미세적정(microtiter) 접시에 모은 후, 혼합하여 감염 연구를 위한 "접종물 풀(inoculum pool)"을 생성한다. 접종 후 적합한 시간에, 세균을 동물로부터 단리한 후, 이를 모아서 "회수 풀(recovered pool)"을 생성한다. 회수 풀에서의 태그 및 접종물 풀에서의 태그를 별도로 증폭하고 표지한 후, 접종물에서 돌연변이를 나타내는 모든 상이한 태그로 배열된 필터를 조사하는데 사용하였다. 독성이 약화된 돌연변이 균주는 감염된 동물로부터 회수할 수 없는 균주, 즉 태그로 조사했을 때 접종물 풀로부터는 혼성화 신호를 나타내지만 태그로 조사했을 때 회수 풀로부터는 혼성화 신호를 나타내지 않는 태그를 갖는 균주이다. 이 방법에 대한 변형으로, 화학발광법과 같은 비-방사선 검출법이 이용될 수 있다.

시그너처 태그가 부착된 돌연변이 유발법을 통해 한 동물에서 독성의 손실에 대해 다수의 삽입 돌연변이 균주를 동시에 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 피. 멀토시다(P. multocida) 균주의 풀 19개를 스크리닝하여 독성이 감소된 60가지 이상의 균주를 찾아내었고, 이들 중 대부분은 이후에 개개 돌연변이체의 대략적인 LD₅₀을 측정함으로써 독성의 약화가 확인되었다. 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체의 스크리닝 결과, 35 종의 상이한 유전자에 돌연변이를 갖는 100가지 이상의 균주를 찾아내었다. 이들 중, 22 종의 유전자에 돌연변이가 유발된 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 상당한 독성약화 효과가 나타났다. 트랜스포손 삽입에 의해 붕괴된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 뉴클레오티드 서열은 양쪽 가닥 모두의 서열분석에 의해 결정하였고, 코딩된 아미노산 서열을 추정하였다. 폴리뉴클레오티드와 아미노산 서열의 신규성은 이 서열들을 DNA 및 단백질 데이타베이스 서열과 비교함으로써 결정하였다.

세균의 독성 유전자, 구체적으로는 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 독성 유전자는 독성이 감소된 생물체(즉, 독성약화 균주)를 제공하며, 이는 백신으로서 유용하다. 이러한 생물체에는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나로 표시되는 유전자를 불활성화시키는 1가지 이상의 기능적 돌연변이를 함유하는 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 돌연변이체가 포함된다. 당업자는 "기능적 돌연변이"가 본 발명 유전자의 단백질 코딩 영역에서 발생할 뿐만 아니라 독성 유전자 RNA의 전사를 변화시키는 조절 영역에서 발생할 수 있음을 알 것이다.

또한, 당업자는 본 발명의 독성약화 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 균주에 1가지 이상의 기능적 돌연변이를 가진 균주가 포함됨을 알 것이다. 1종 이상의 돌연변이는 상가적 또는 상승적 독성약화 효과를 초래할 수 있다. 다중 돌연변이는 디자인하여 만들어지거나, 또는 본래 단일 돌연변이를 도입하고자 의도된 돌연변이 유발시 결실 사건에 의해 우연히 발생할 수 있다. 다중 결실이 있는 독성약화 균주의 예에는cya및crp유전자가 기능적으로 결실된 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주가 있다. 이 돌연변이체 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 균주는 생백신으로서의 장래성을나타냈다.

피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 독성 유전자를 확인하면, 다른 병원성 종에서 유사한 유전자(즉, 종 동족체)에 관한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들면,aroA유전자의 확인 결과, 피. 헤몰리티카(P. haemolytica), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 두블린(Salmonella dublin), 살모넬라 갈라네룸(Salmonella gallanerum), 보르델라 페르투시스(Bordella pertussis), 예르시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae) 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)를 비롯한 다수의 병원체에서 보존적 유전자를 확인할 수 있었다. 이들 중 다수의 종에서,aroA유전자에 돌연변이를 포함하는 독성약화 세균 균주가 백신 제형에 효과적임이 증명되었다. 피. 멀토시다(P. multocida)에서 확인된 독성 유전자 서열을 이용하여, 유사하거나 상동성인 유전자가 다른 생물체, 구체적으로는 파스테우렐라(Pasteurella)과 뿐만 아니라 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 및 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus)에서 확인되었다. 이와 유사하게, 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 독성 유전자를 확인함으로써 다른 생물체에서 관련된 유전자를 확인할 수 있다. 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 유전자를 프로브로 사용하는 써던(Southern) 혼성화함으로써, 다른 생물체에서 유래한 염색체 라이브러리에서 관련 유전자들을 확인할 수 있다. 다른 방법으로, PCR도 동등하게 종의 경계를 벗어나 유전자의 확인시 효과적이다. 또다른 방법으로, 예를 들어 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체와 다른 종으로부터 유래한 염색체 라이브러리와의 상보성 실험을 동일하거나 관련된 독성을 갖는 유전자의 확인에 이용할 수 있다. 따라서, 관련 독성 유전자를 확인하면 또다른 백신 제형으로서 유용한 다른 생물체의 독성약화 균주를 제조할 수 있다. 다른 종[예를 들어, 피. 헤몰리티카(P. haemolytica), 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 및 에이치. 솜너스(H. somnus)]에 존재하는 것으로 입증된 피. 멀토시다(P. multocida) 유전자의 예로는exbB,atpG및pnp유전자가 포함된다.

STM을 이용하여 확인된 독성약화 피. 멀토시다(P. multocida) 균주는 오픈 리딩 프레임 또는 조절 DNA 서열에 트랜스포손 서열이 삽입되어 독성 유전자의 기능이 상실된 삽입 돌연변이체이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 독성약화 피. 멀토시다(P. multocida) 균주 및 기타 그람 음성 돌연변이체 세균 균주는 유전자에 삽입을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 삽입은 돌연변이 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현을 감소시키고(거나) 돌연변이 유전자에 의해 코딩되는 불활성화 유전자 산물을 발현시키게 된다. 이러한 삽입 돌연변이는 여전히 세균의 독성에 필요한 유전 정보를 모두 함유하고 있으며, 삽입된 트랜스포손의 결실에 의해 병원성 상태로 되돌아갈 수도 있다. 따라서, 백신 제형의 제조에 있어서, 독성약화 균주로부터 수집된 정보를 이용하여 독성 유전자 서열이 일부, 대부분 또는 모두 제거됨으로써 세균이 독성 상태로 되돌아갈 가능성이없는 결실 돌연변이체 균주를 생성하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 독성약화 피. 멀토시다(P. multocida) 균주 및 기타 그람 음성 돌연변이체 세균 균주에는 독성 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실된 돌연변이를 하나 이상 포함하는 균주들이 포함된다.

STM을 이용하여 확인된 독성약화 삽입 돌연변이체의 백신 특징은 동일한 유전자에 결실을 포함하는 세균의 특징과 동일하거나 유사할 것으로 기대된다. 그러나, 삽입 돌연변이가 인접하는 유전자 서열에 "극성" 효과를 발휘할 수 있으며, 그 결과 삽입 돌연변이체는 동일한 유전자 서열에 결실 돌연변이를 갖는 돌연변이체 균주와 구별되는 특징을 가질 수 있다. 결실 돌연변이체는 당업계에 잘 공지되고 통상적으로 수행되는 여러 기술을 이용하여 제작될 수 있다.

예를 들면, 많은 세균에서 유전자를 결실시키기 위해 통상적으로 사용되어 온, 부(副)선별가능한(counterselectable) 마커를 사용하는 전략이 이용될 수 있다. 예를 들어, 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Reyrat et al., Infection and Immunity 66:4011-4017 (1998)]을 참조할 수 있다. 이 기술에서는 원하는 결실 부위의 양쪽에서 유래한 DNA 서열이 인접하도록 선별가능한 마커와 부선별가능한 마커를 코딩하는 플라스미드가 제작되는, 이중 선별 전략이 종종 사용된다. 선별가능한 마커는 플라스미드가 게놈의 적합한 위치에 적합한 방식으로 통합되었는지 선별하기 위해 사용된다. 부선별가능한 마커는 통합된 플라스미드가자발적으로 제거된 매우 적은 비율의 세균을 선별하기 위해 사용된다. 따라서, 이들 세균의 분획은 다른 외래 DNA가 존재하지 않고 원하는 결실만을 함유하게 된다. 이 기술에서 중요한 점은 적합한 부선별가능 마커의 이용도이다.

또다른 기술에서,cre-lox시스템이 DNA의 부위 특이적 재조합을 위해 사용된다. 이 시스템은 세균의cre리컴비나제 유전자에 의해 인식되는 34 염기쌍의lox서열로 이루어져 있다.lox부위가 DNA에 적합한 방향으로 존재하면,lox부위에 인접한 DNA는cre리컴비나제에 의해 절단될 것이고, 그 결과 남아있는lox서열 1 복제본을 제외하고 모든 서열이 결실되게 된다. 표준 재조합 기술을 이용하여, 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 게놈에서 관심있는 표적 유전자를 결실시키고, 이를lox부위에 인접한 선별가능 마커(예를 들어, 카나마이신 내성을 코딩하는 유전자)로 대체할 수 있다.cre리컴비나제의 일시적 발현(피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 작동하는 프로모터의 조절하에 cre 유전자를 함유하는 자살 플라스미드의 전기천공에 의한 발현)에 의해lox에 인접한 마커가 효율적으로 제거되어야 한다. 이 과정은 원하는 결실 돌연변이 및 1 복제본의lox서열을 함유하는 돌연변이를 만들어낼 것이다.

또다른 접근법에서, 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 게놈에서 원하는 결실 서열을 녹색 형광 단백질(GFP), β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 마커 유전자로 직접 대체하는 것이 가능하다. 이 기술에서, 원하는 결실 부위에 인접한 DNA 단편은 PCR에 의해 제조하여피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에 적합한 자살(비복제) 벡터에 클로닝한다. 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 활성을 나타내는 프로모터와 적합한 마커 유전자를 함유하는 발현 카세트는 인접 서열들 사이에 클로닝한다. 이 플라스미드를 야생형 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에 도입한다. 마커 유전자를 혼입하여 발현하는 세균(빈도수가 매우 낮을 것임)을 단리하여 적합하게 재조합(즉, 야생형 유전자의 마커 유전자로의 대체)되었는지 여부를 조사한다.

이들 생물체의 감소된 독성 및 이들의 면역원성은 동물 환자에 투여함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 무독성 미생물을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 1종 이상의 그러한 돌연변이체 미생물을 적합한 면역보강제 및 제약상 허용되는 희석제나 담체를 함유하는 백신 조성물로 투여하는 것이 바람직하다. 상기 담체는 본 발명의 무독성 미생물과 상용할 수 있어야 하고 면역화될 환자에 유해해서는 안된다는 점에서 "허용되는" 것이어야 한다. 통상적으로, 담체는 멸균되고 발열원이 제거된 물 또는 식염수이다. 면역화될 환자는 피. 멀토시다(P. multocida), 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 또는 기타 병원성 미생물로부터의 독성에 의해 유발되는 질병으로부터 보호를 요하는 환자이다.

본 발명의 백신이 인간 의학 및 수의학 분야에 유용하리라는 것은 분명할 것이다. 따라서, 면역화될 환자는 인간 또는 다른 동물, 예를 들어 소, 양, 돼지, 말, 염소 및 가금(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 및 거위)을 비롯한 농장 동물; 개및 고양이와 같은 애완 동물; 외국산 동물 및(또는) 동물원 동물; 및 생쥐, 쥐, 토끼, 모르모트 및 햄스터를 비롯한 실험실 동물일 수 있다.

또한, 본 발명은 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 독성에 필요한 폴리펩티드 및 상응하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 자연 발생적 또는 인공 폴리뉴클레오티드 및 그의 폴리펩티드 산물을 포함한다. 자연 발생적 독성 산물로는 독특한 유전자 및 폴리펩티드 종 뿐만 아니라, 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 이외의 균주에서 발현되는 종 동족체가 포함된다. 인공 독성 산물로는, 유사체 및 공유결합 변형을 포함하는 독성 산물과 같은 자연 발생적 산물의 변이체가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 서열 및 그의 종 동족체를 포함하는 독성 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 세균의 독성 유전자 산물을 코딩하는, 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 정제 및 단리된 신규 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 센스 및 상보성 안티센스 가닥의 DNA 서열 및 RNA 전사물)를 제공한다. 본 발명의 DNA 서열에는 게놈 서열 및 cDNA 서열 뿐만아니라 전체적으로 또는 부분적으로 화학 합성된 DNA 서열이 포함된다. 본 발명의 게놈 DNA는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단백질 코딩 영역을 포함하며, 동일한 종의 다른 세균 균주에서 발견될 수 있는 변이체를 포함한다. 본원에 사용되고 당업계에서 이해되는 바와 같이, "합성된"이란 폴리뉴클레오티드를 제조는 방법에 있어서, 효소에 의한 방법에 상반되는 순전히 화학적인 방법을 의미한다. 따라서, "전체적으로" 합성된 DNA 서열은 전적으로 화학적 수단에 의해 생성되며, "부분적으로" 합성된 DNA는 생성된 DNA의 일부분만이 화학적 수단에 의해 생성된 것을 포함한다. 피. 멀토시다(P. multocida)의 독성 유전자 산물을 코딩하는 바람직한 DNA 서열은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 것, 및 그의 종 동족체이다. 독성 유전자 산물을 코딩하는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 바람직한 DNA 서열은 서열 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 것, 및 그의 종 동족체이다. 당업자라면 본 발명의 바람직한 DNA가, 예를 들어 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142,144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 서열, 및 그의 종 동족체를 갖는 분자가 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164의 서열로부터 추론가능한 서열을 갖는 상보성 분자("비코딩 가닥" 또는 "상보 가닥")와 함께 DNA의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 규칙에 따라 짝을 이루는 이중 가닥 분자를 포함한다는 것을 알 것이다. 또한, 바람직한 것은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나, 및 그의 종 동족체에 의해 코딩되는 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명은 피. 멀토시다(P. multocida) 또는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) DNA의 종 동족체, 바람직하게는 세균성 동족체를 추가로 포함한다.

본 발명에 의해 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열 정보를 이용하면, 써던 및(또는) 노던(Northern) 혼성화 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 비롯한 공지의 기술에 의해 관련 세균 독성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인 및 단리할 수 있다. 관련 폴리뉴클레오티드의 예로는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 어느 한 폴리뉴클레오티드, 및 그의 종 동족체에 의해 코딩되는 독성 유전자 산물에 상동성인 폴리펩티드, 및 본 발명의 독성 유전자 산물이 갖는 생물학적 및(또는) 물리적 특징을 하나 이상 공유하는 구조적으로 연관된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

또한, 본 발명은 중간 정도의 엄격 조건 내지 고도의 엄격 조건하에서 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 어느 한 폴리뉴클레오티드, 및 그의 종 동족체의 비코딩 가닥 또는 상보 가닥에 혼성화되는, 세균 유전자 산물을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)가 없다면 상기 서열에 혼성화할, 독성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열도 본 발명에 포함된다. 고도의 엄격 조건의 예로는 65℃ 내지 75℃에서 0.2X SSC/0.1％ SDS를 포함하는 완충액으로 최종 세척하는 것이 포함되며, 중간 정도의 엄격 조건의 예로는 35℃ 내지 45℃에서 2X SSC/0.1％ SDS를 포함하는 완충액으로 최종 세척하는 것이 포함된다. 당업자라면, 문헌 [Ausubel et al. (Eds.),Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 내지 6.4.10]에 기재된 바와 같이 온도와 완충액 또는 염 농도를 변화시킴으로써 동등한 엄격도가 성취될 수 있음을 이해할 것이다. 혼성화 조건의 변화는 경험적으로 결정하거나, 또는 프로브의 길이 및 구아노신/시토신(GC) 염기쌍 비율에 기초하여 정확하게 계산할 수 있다. 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 내지 9.51]에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.

또한, 독성 유전자 서열이 혼입된 플라스미드 및 바이러스 DNA 벡터와 같은 자가 복제성 재조합 발현 작제물이 본 발명에서 제공된다. 독성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 내생성 또는 외생성 발현 조절 DNA 서열 및 전사 종결자에 작동 가능하게 연결된 발현 작제물이 또한 제공된다. 독성 유전자는 피. 멀토시다(P. multocida)의 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR에 의해 클로닝할 수 있다. 상기 유전자를 발현 벡터에 용이하게 삽입하기 위해, PCR에 의해 증폭된 유전자가 개시 코돈인 ATG의 앞쪽 5'에 제한효소 부위를 갖고 정지 코돈인 TAG, TGA 또는 TAA의 뒤쪽 3'에 제한효소 부위를 갖도록 PCR 프라이머를 선택한다. 바람직한 경우에는 문헌 [Grosjean and Fiers, Gene, 18:199-209 (1982) 및 Konigsberg and Godson, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:687-691 (1983)]에 기재된 대장균(E. coli) 코돈 선호도에 따라 아미노산의 변화없이 유전자의 코돈을 변화시킨다. 코돈 이용도를 최적화하면 대장균(E. coli)에서의 생산시 유전자 산물의 발현량이 증가될 수 있다. 유전자 산물이 대장균(E. coli) 또는 다른 세균의 원형질 주변이나 세포 배양용 배지에서 세포외 생산되도록 하려면, 유전자를 개시 코돈없이 클로닝하여 벡터 중의 신호 서열 뒤쪽에 놓이게 한다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 본 발명의 독성 폴리펩티드가 발현되도록 하는 방식으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 안정하게 또는 일시적으로 형질전환, 형질감염 또는 전기천공시킨 원핵 및 진핵 세포를 비롯한 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 발현 시스템에는 세균 시스템, 효모 시스템, 진균 시스템, 바이러스 시스템, 무척추동물 시스템 및 포유동물 시스템이 포함된다. 본 발명의 숙주 세포는 독성 유전자 산물에 특이적인 면역활성을 나타내는 항체의 개발을 위한 가치있는 면역원의 공급원이다. 본 발명의 숙주 세포는 독성 폴리펩티드의 거대 규모 생산에 매우 유용하며, 여기서 상기 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양한 후, 면역친화성 정제 또는 당업계에 잘 공지되고 통상적으로 수행되는 여러가지 정제 기술에 의해 세포로부터 또는 세포를 배양한 배지로부터 원하는 폴리펩티드 산물을 단리한다. 대장균(E. coli), 기타 세균(피. 멀토시다(P. multocida), 바실러스(Bacillus) 및 에스. 아우레우스(S. aureus) 등), 효모(피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 등), 곤충 세포 또는 포유동물 세포(CHO 세포 등)와 같은 임의의 적합한 숙주 세포가 당업계에 공지된 적합한 벡터를 이용하는 유전자 산물의 발현에 사용될 수 있다. 단백질은 직접 생산되거나 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 상태로 생산될 수 있으며, 세포내에서 생산되거나 세균 세포의 원형질 주변 공간으로의분비 또는 세포 배양용 배지로의 분비에 의해 세포외에서 생산될 수 있다. 단백질의 분비는 신호 펩티드(또한 프리-서열로도 공지됨)를 필요로 하는데, 원핵생물 및 진핵생물로부터의 무수한 신호 서열이 재조합 단백질의 분비에 작용함이 알려져 있다. 단백질 분비 과정에서, 신호 펩티다제에 의해 신호 펩티드를 제거하여 성숙 단백질을 얻는다.

단백질 정제 과정을 간편하게 하기 위해, 유전자 코딩 서열의 5' 또는 3'에 정제 태그를 부착할 수 있다. 통상적으로 사용되는 정제 태그에는 히스티딘 잔기 6개의 스트레치(미국 특허 제5,284,933호 및 동 제5,310,663호), 문헌 [Schmidt and Skerra, Protein Engineering, 6:109-122 (1993)]에 기재된 스트렙타비딘 친화성 태그, FLAG 태그[Hopp et al., Biotechnology, 6:1205-1210 (1988)], 글루타티온 S-트랜스퍼라제[Smith and Johnson, Gene, 67:31-40 (1988)] 및 티오레독신[LaVallie et al., Bio/Technology, 11:187-193 (1993)]이 포함된다. 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 제거하기 위해, 단백질 분해성 절단 인식 부위를 융합 연결부에 삽입할 수 있다. 통상적으로 사용되는 프로테아제에는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제가 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 정제 및 단리된 독성 폴리펩티드를 제공한다. 현재 바람직한 폴리펩티드는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110,112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 어느 한 폴리뉴클레오티드, 및 그의 종 동족체에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 a) 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 DNA 서열, 및 그의 종 동족체, b) 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 의해 코딩되는 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 및 그의 종 동족체, 및 c) 중간 정도의 엄격 조건하에서 (a) 또는 (b)의 DNA에 혼성화되는, 독성 유전자 산물을 코딩하는 DNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA에 의해 코딩되는 독성 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바람직한 폴리펩티드에 약 99％ 이상, 약 95％ 이상, 약 90％ 이상, 약 85％ 이상, 약 80％ 이상, 약 75％ 이상, 약 70％ 이상, 약 65％ 이상, 약 60％ 이상, 약 55％ 이상 및 약 50％ 이상의 동일성 및(또는) 상동성을 갖는 폴리펩티드, 즉 종 동족체 및 오르토로그(ortholog)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 "동일성" 퍼센트는, 독성 유전자 산물의 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우에는 최대의 서열 동일성 퍼센트를 얻기 위해 갭을 도입한 후, 보존적 치환체는 동일한 서열의 일부로 고려하지 않은 상태에서, 독성 유전자 산물의 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 본 명세서에 정의된다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 "상동성" 퍼센트는, 독성 유전자 산물의 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우에는 최대의 서열 동일성 퍼센트를 얻기 위해 갭을 도입한 후, 어떤 보존적 치환체도 동일한 서열의 일부로 고려한 상태에서, 독성 유전자 산물의 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 본 명세서에 정의된다. 보존적 치환은 표 A 및 B에 기재된 바와 같이 정의할 수 있다.

보존적 치환 Ⅰ
측쇄 특성	아미노산
지방족	비극성	G A P
		I L V
	극성-무전하	C S T M
		N Q
	극성-전하	D E
		K R
방향족		H F W Y
기타		N Q D E

본 발명의 폴리펩티드는 천연 세균 세포 공급원으로부터 단리하거나 화학적으로 합성할 수 있지만, 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 재조합 절차에 의해 생산하는 것이 바람직하다. 본 발명의 독성 유전자는 전장 폴리펩티드, 생물학적 활성단편, 또는 특이적인 생물학적 또는 면역학적 활성을 보유하는 그의 변이체일 수 있다. 변이체는 독성 폴리펩티드 유사체를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 특이적(즉, 자연적으로 코딩됨) 아미노산이 결실 또는 대체되거나, 또는 하나 이상의 비특이적 아미노산이 (1) 독성 유전자 산물에 특이적인 1가지 이상의 생물학적 활성 또는 면역학적 특성의 손실없이, 또는 (2) 독성 유전자 산물의 특정 생물학적 활성을 특이적으로 무력화시키면서 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명의 결실 변이체에는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 폴리펩티드의 일부가 결손된 단편이 포함되며, 삽입 변이체에는 야생형 폴리펩티드나 그의 단편이 다른 폴리펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드가 포함된다.

독성 폴리펩티드의 변이체에는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변화에 의해 보존적 치환이 도입된 변이체들이 포함된다. 보존적 치환은 당업계에서 관련된 물리적 특징에 따라 아미노산을 분류하는 것으로 인식되며, 표 A에 기재된 바와 같이 정의될 수 있다(1997년 3월 13일에 공개된 WO 97/09433호의 10 페이지, 및 1996년 6월 9일 출원된 PCT/GB96/02197호 참조). 별법으로, 보존적 아미노산은 표 B에 기재된 바와 같이 문헌 [Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77]에 정의된 대로 분류할 수 있다.

보존적 치환 Ⅱ
측쇄 특성	아미노산
비극성 (소수성)A. 지방족B. 방향족C. 황-함유D. 양면성	A L I V PF WMG
무전하-극성A. 히드록실B. 아미드C. 설프히드릴D. 양면성	S T YN QCG
양전하성 (염기성)	K R H
음전하성 (산성)	D E

본 발명의 변이체 독성 산물은 성숙 독성 유전자 산물, 즉 리더 서열 또는 신호 서열이 제거된 것으로서 아미노 말단에 추가적인 잔기를 갖는 것을 포함한다. -1번 위치에 추가적인 메티오닌 잔기가 있는 독성 유전자 산물은 본 발명에 포함되며, -2번 및 -1번에 추가적인 메티오닌과 리신 잔기가 있는 독성 산물도 본 발명에 포함된다. 이러한 형태의 변이체들은 세균성 세포형 내에서의 재조합 단백질 생산에 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 변이체는 자연 발생적 단백질에서 발견되지 않는 아미노 말단 서열을 포함하는 변이체 뿐만 아니라 다른 단백질로부터 유래한 아미노 말단 서열이 도입된 유전자 산물을 포함한다.

또한, 본 발명은 특정 발현 시스템을 사용하여 추가적인 아미노산 잔기를 갖는 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 해당 폴리펩티드를 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로 발현시키는 시판되는 벡터를 사용하면, 해당 폴리펩티드로부터 GST 부분의 절단 이후에 -1번 위치에 추가적인 글리신 잔기가 있는 해당 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 다른 벡터 시스템을 사용하는 발현으로부터 생성된 변이체도 포함된다.

또한, 본 발명에는 항체(예를 들어, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화, 인간 및 CDR-이식 항체로서 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 CDR 서열을 비롯한 화합물을 포함) 및 독성 유전자 산물 또는 그 단편에 특이적인 기타 결합 단백질이 포함된다. "~에 특이적인"이라는 용어는 본 발명 항체의 가변 영역이 배타적으로 독성 폴리펩티드를 인식하고 결합하는 (즉, 폴리펩티드 군들 간의 서열 동일성, 상동성 또는 유사성에도 불구하고 하나의 독성 폴리펩티드를 관련 독성 폴리펩티드들로부터 구별할 수 있는) 것 뿐만 아니라, 항체의 가변 영역 바깥쪽의 서열, 특히 항체 분자의 불변 영역과의 상호작용을 통해 다른 단백질(예를 들어, ELISA 기술에서의 에스 아우레우스(S. aureus) 단백질 A 또는 다른 항체)과 상호작용할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 항체의 결합 특이성을 측정하기 위한 스크리닝 분석법은 널리 공지되어 있으며 당업계에서 통상적으로 수행되는 것이다. 그러한 분석법에 대해서는 문헌 [Harlow et al., (Eds.) Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6]을 참조한다. 또한, 상기 정의한 바와 같이, 단편이 유도된 본 발명의 독성 폴리펩티드에 가장 특이적인 항체라면, 상기 독성 폴리펩티드에서 유래된 단편을 인식하고 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명에서 제공되는 DNA 및 아미노산 서열 정보도 독성 유전자와 그 코딩된 유전자 산물의 구조 및 기능에 대한 체계적 분석을 가능하도록 한다. 또한, 본 발명의 독성 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 지식을 습득하면, 본 발명의 독성 폴리펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드를 인식하고 이에 혼성화되는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 전장 및 단편 안티센스 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 제공된다. 당업자는 본 발명의 단편 안티센스 분자가 (i) 특정 RNA(본 발명의 독성 유전자를 코딩하는 DNA와 기타 공지된 분자를 코딩하는 DNA를 서열 비교함으로써 결정됨)를 특이적으로 인식하고 이에 혼성화되는 분자, 및 (ii) 독성 단백질 족의 변이체를 코딩하는 RNA를 인식하고 이에 혼성화되는 분자를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 독성 단백질족의 다른 구성원을 코딩하는 RNA에 혼성화되는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 상기 독성 단백질족의 특징적 서열이나 시그너처 서열을 확인하는 서열 비교를 통하여 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 리보자임을 사용하여 유전자 발현을 조절하는 방법을 포함한다. 이는 문헌 [Gibson and Shillitoe, Mol. Biotech. 7:125-137 (1997)]을 참조한다. 리보자임 기술은 (i) 표적 mRNA에 상보 RNA를 혼성화시키고 (ii) 혼성화된 mRNA를 상보 사슬에 고유한 뉴클레아제 활성을 통해 절단하는 것에 의한 서열 특이적 방식으로 mRNA의 번역을 억제하는데 사용될 수 있다. 리보자임은 경험적인 방법으로 확인될 수 있지만, 표적 mRNA에서의 결합 부위를 기초로 하여 특이적으로 고안하는 것이 보다 바람직하다[Branlage et al., Trends in Biotech 16:434-438 (1998)]. 리보자임을 표적 세포로 전달하는 것은 당업계에서 널리 공지되고 통상적으로 수행되는 외생성 또는 내생성 전달 중 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 외생성 전달법은 표적 리포좀의 사용 또는 직접적인 국부 주입을 포함할 수 있다. 내생성 전달법은 바이러스 벡터 및 비-바이러스 플라스미드의 사용을 포함한다.

독성 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드의 독특한 영역에 대한 상보적이도록 고안할 경우, 리보자임은 독성 유전자의 발현을 특이적으로 조절할 수 있다. 따라서, "특이적으로 조절한다"는 것은 본 발명의 리보자임이 단지 하나의 폴리뉴클레오티드만을 인식한다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 리보자임이 단백질족의 전부 또는 일부의 발현을 조절하도록 고안할 수 있다. 이러한 형태의 리보자임은 상기 단백질족을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 보존된 폴리뉴클레오티드 서열을 인식하도록 고안한다.

또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드에 의해 유도되는 삼중 나선 형성을 이용하여 본 발명의 독성 유전자의 전사를 조절하는 방법을 포함한다. 이는 문헌 [Lavrovsky et al., Biochem.Mol.Med. 62:11-22 (1997)]을 참조한다. 삼중 나선 형성은 왓슨-크릭 모델에서 정의된 이중 나선 DNA의 주구(major groove)에 혼성화되는 서열 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수행한다. 서열 특이적 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키면 그 후에, 예를 들어 전사 인자 및 중합효소를 포함하는 DNA 결합 단백질의 활성을 조절할 수 있다. 혼성화에 바람직한 표적 서열은 독성 유전자 산물의 발현을 조절하는 전사 조절 영역을 포함한다. 또한, 삼중 나선 형성이 가능한 올리고뉴클레오티드는 표적 DNA 서열의 부위 특이적 공유 결합 변형에 유용하다. 공유 결합 변형에 유용한 올리고뉴클레오티드는 라브로브스키 (Lavrovsky) 등의 상기 문헌에 기재된 다양한 DNA 손상 인자와 커플링될 수 있다.

피. 멀토시다(P. multocida) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A.pleuropneumoniae)의 독성 유전자를 확인하면, 상기 유전자 및 유전자 산물을 항균제 확인 방법에 유용하게 사용할 수 있다. 그러한 방법은 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 및 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 DNA 서열, 및 그의 종 동족체(즉, 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 및 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164의 DNA 서열로 표시되는 유전자들이 독성 유전자 산물을 코딩하거나, 또는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 및 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164의 DNA 서열이 독성 유전자 산물을 코딩하는 유전자에 인접하거나, 독성 유전자 산물의 발현을 조절하는데 관여함)로 표시되는 독성 유전자 산물의 발현을 방해 수 있는 잠재적인 약제를 분석하는 것을 포함하거나, 또는 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100,102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 및 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 DNA 서열, 그의 종 동족체, 또는 그의 상보 가닥에 의해 전체적 또는 부분적으로 코딩되는 세균 유전자 산물의 기능을 방해할 수 있는 능력을 갖는 잠재적 약제를 분석한 후, 그러한 분석에서 양성 결과를 나타내는 약제를 확인하는 것을 포함한다. 이러한 분석에 유용한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에는 본 명세서에 개시된 유전자와 그 코딩된 폴리펩티드 뿐만 아니라 야생형 유전자 및 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성이 있는 그의 변이체가 포함된다.

상기 기재된 방법에 의해 생산된 독성 유전자 산물은 억제제를 스크리닝하기 위한 고처리 분석에 사용된다. 스크리닝될 잠재적 약제의 공급원으로는 화합물 라이브러리, 스트렙토마이세테스(Streptomycetes), 기타 세균 및 진균의 발효 배지, 및 식물과 기타 초목의 세포 추출물이 있다. 효소 활성이 알려져 있는 단백질에 대한 분석은 그 활성을 기초로 이루어지고, 다수의 잠재적 약제는 그 활성을 억제하는 능력에 대해 스크리닝한다. 다른 단백질이나 핵산에 결합하는 단백질에 있어서, 결합 분석은 그러한 결합 상호작용을 직접 측정하도록 이루어지고, 잠재적 약제는 그 결합 상호작용을 억제하는 능력에 대해 스크리닝한다.

당업계에 공지된 다양한 분석의 용도는 본 발명의 한 측면으로 포함된다. 공지된 유전자 산물과의 서열 유사성에 의해 독성 유전자 산물의 기능이 알려지거나 예상될 경우, 상기 유전자 산물의 기능 및(또는) 특징에 중점을 둔 효소적 또는기타 유형의 생물학적 및(또는) 생화학적 분석으로 잠재적 억제제를 스크리닝할 수 있다. 다른 단백질이나 핵산과 상호작용하는 것으로 알려진 공지 유전자 산물과의 서열 유사성에 의해 상기 독성 유전자 산물이 알려지거나 예상될 경우, 상호작용의 억제제는 결합 분석에서 직접 스크리닝할 수 있다. 본 발명은 상기 독성 유전자 산물의 결합 억제제에 대한 스크리닝 및 확인을 위한 다수의 분석법을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 독성 유전자 산물을 고정시키고, 추정 억제제 화합물의 존재 및 부재시 결합 파트너와의 상호작용을 평가한다. 다른 실시예에서, 상기 독성 유전자 산물과 그 결합 파트너 간의 상호작용은 추정 억제제 화합물의 존재 및 부재시의 용액 분석으로 평가한다. 이 두 분석에서, 상기 독성 유전자 산물과 그 결합 파트너 간의 결합을 감소시키는 화합물로서 억제제를 확인한다. 또한, 상기 유전자 산물의 결합 파트너가 단백질인 경우에 대한 다른 분석법도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 1995년 8월 3일 공개된 PCT 출원 WO 95/20652호에 기재된 바와 같이, 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포 내에서 양성 신호의 검출에 의해 단백질/단백질 상호작용의 억제제를 확인하는 디-하이브리드(di-hybrid) 분석법의 변형이 본 발명에 포함된다.

본 발명에 포함되는 후보 억제제에는 잠재적 억제제의 라이브러리로부터 선택된 화합물들이 포함된다. 소분자 조절인자를 확인하기 위한 다양한 라이브러리가 있으며, 여기에는 (1) 화합물 라이브러리, (2) 천연물 라이브러리, 및 (3) 무작위 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 유기 분자의 조합 라이브러리가 포함된다. 화합물 라이브러리는 공지된 화합물 또는 천연물 스크리닝을 통해 "적중물질(hit)"또는 "선도물질(lead)"로 확인된 화합물의 구조적 유사체로 이루어져 있다. 천연물 라이브러리는 (1) 토양, 식물 또는 해양 미생물로부터의 배양액 및 배양 추출물, 또는 (2) 식물 또는 해양 생물의 추출물로 스크리닝하기 위한 혼합물을 생성하는데 사용하는 미생물, 동물, 식물 또는 해양 생물의 수집물이다. 천연물 라이브러리는 폴리케티드, 비리보솜계 펩티드 및 그의 (인공) 변이체를 포함한다. 이는 문헌 [Science 282:63-68 (1998)]을 참조한다. 조합 라이브러리는 다수의 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 유기 화합물의 혼합물로서 이루어져 있다. 조합 라이브러리는 통상적인 자동화 합성법, PCR, 클로닝 또는 특허받은 합성법에 의해서 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 특히 관심있는 것은 펩티드와 올리고뉴클레오티드의 조합 라이브러리이다. 또한, 관심있는 다른 라이브러리에는 펩티드, 단백질, 펩티드 모방체, 다중평행(multiparallel) 합성 수집물, 재조합체 및 폴리펩티드 라이브러리가 포함된다. 조합 화학 및 그로부터 생성된 라이브러리에 대해서는 문헌 [Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707 (1997)]을 참조한다. 본 명세서에 기재된 수종의 라이브러리를 사용하여 조절제를 확인함으로써 후보 "적중물질" (또는 "선도물질")을 변형하여 활성을 조절하도록 상기 "적중물질"의 능력을 최적화할 수 있다.

본 발명에 포함되는 다른 후보 억제제를 고안할 수 있으며, 여기에는 결합 파트너의 가용성 형태 뿐만 아니라 키메라 또는 융합 단백질로서의 결합 파트너가 포함된다. 본원에 사용되는 결합 파트너는 항체, 항체 단편, 및 상기 확인된 독성 유전자의 발현 산물에 면역특이적인 항체 도메인을 포함하는 변형된 화합물을 광범위하게 포함한다.

독성 유전자 산물에 대한 결합 파트너(즉, 리간드)가 알려져 있지 않은 경우에는 다른 분석법을 사용할 수 있으며, 여기에는 표적 단백질에 대한 시험 결합 파트너의 직접적인 결합을 측정함으로써 표적 단백질의 결합 파트너를 확인하는 분석법, 및 이온 분무 질량분석계/HPLC 방법 또는 기타 물리적 및 분석적 방법으로 친화성 한외여과를 통해 표적 단백질의 결합 파트너를 확인하는 분석법이 포함된다. 별법으로, 문헌 [Fields and Song, Nature, 340:245-246 (1989)] 및 [Fields and Sternglanz, Trends in Genetics, 10:286-292 (1994)]에 기재된 효모 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 사용하여 간접적으로 그러한 결합 상호작용을 측정하며, 상기 두 문헌 모두 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다. 투-하이브리드 시스템은 두 단백질 또는 폴리펩티드 간의 상호작용을 검출하기 위한 유전적 분석법이다. 투-하이브리드 시스템은 해당 공지 단백질에 결합하는 단백질을 확인하거나 결합에 중요한 도메인 또는 잔기를 알아내기 위해 사용할 수 있다. 이 방법을 다양하게 변형하여 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 단백질에 결합하는 펩티드를 확인하며, 약물을 스크리닝하는 방법이 개발되었다. 투-하이브리드 시스템은 한 쌍의 결합 단백질이 전사 활성화 도메인을 리포터 유전자의 상류 활성화 서열(UAS)에 결합하는 DNA 결합 도메인 근처로 가져오도록 할 수 있으며, 일반적으로 효모에서 수행된다. 상기 분석법은 (1) 제1 단백질에 융합된 DNA 결합 도메인 및 (2) 제2 단백질에 융합된 활성화 도메인을 코딩하는 두개의 하이브리드 유전자 구조물을 필요로 한다. DNA 결합 도메인은 제1 하이브리드 단백질을 리포터 유전자의 UAS에 대한 표적이 되도록 하도록 하지만, 대부분의 단백질은 활성화 도메인이 결여되어 있기 때문에, 이 DNA 결합 하이브리드 단백질은 리포터 유전자의 전사를 활성화시키지 않는다. 활성화 도메인을 포함하는 제2 하이브리드 단백질은 UAS에 결합할 수 없기 때문에 그 자신만으로 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 없다. 그러나, 두 하이브리드 단백질이 존재하는 경우, 제1 단백질과 제2 단백질간의 비공유성 결합이 활성화 도메인을 UAS에 결합시켜 리포터 유전자의 전사를 활성화시킨다. 독성 유전자 산물(예를 들어, 제1 단백질)이 이미 다른 단백질 또는 핵산과 결합한다고 알려진 경우, 이 분석법은 결합을 방해하는 약제를 찾는데 사용할 수 있다. 리포터 유전자의 발현은 상기 시스템에 각기 다른 시험 물질을 첨가하여 모니터링하며, 억제제가 존재하면 리포터 신호가 결여되는 결과를 나타낸다.

독성 유전자 산물의 기능이 알려져 있지 않고 이에 결합하는 리간드도 알려져 있지 않은 경우, 효모 투-하이브리드 분석법은 상기 유전자 산물에 결합하는 단백질을 찾아내는데에도 사용될 수 있다. 제1 단백질(표적 단백질)에 결합하는 단백질을 찾아내는 분석에서, 서로 다른 제2 단백질을 코딩하는 다수의 하이브리드 유전자가 생성되어 상기 분석을 통해 스크리닝된다. 통상, 제2 단백질은 전체 cDNA 또는 게놈 DNA가 활성화 도메인에 연결된 플라스미드 집합체에 의해 코딩된다. 이 시스템은 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있으며, 제2 결합 단백질의 정체 및 기능을 알 필요는 없다. 이 시스템은 매우 감도가 좋아서 다른 방법에 의해 밝혀지지 않는 상호작용도 검출할 수 있으며, 심지어 일시적인 상호작용도 전사를 촉진함으로써 반복적으로 번역되어 리포터 단백질을 생성하는 안정한 mRNA를 생성할 수 있다.

표적 단백질에 결합하는 약제를 찾기 위해 다른 방법을 사용할 수도 있다. 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,585,277호에는 표적 단백질에 대한 시험 리간드의 직접 결합을 확인하는 그러한 스크리닝 방법 하나가 기재되어 있다. 이 방법은 일반적으로 단백질이 폴딩 상태와 비폴딩 상태의 혼합물이며 이 두 상태를 지속적으로 왕복한다는 원리에 근거한 것이다. 시험 리간드가 표적 단백질의 폴딩형에 결합한 경우(즉, 시험 리간드가 표적 단백질의 리간드인 경우), 리간드와 결합된 표적 단백질 분자는 폴딩 상태를 유지한다. 따라서, 표적 단백질에 결합하는 리간드의 존재시 리간드가 존재하지 않는 경우보다 폴딩 상태의 표적 단백질이 더 많이 존재하게 된다. 리간드와 표적 단백질의 결합 여부는 표적 단백질의 폴딩 상태와 비폴딩 상태를 구별하는 어떠한 방법에 의해서든 결정할 수 있다. 이 분석을 수행하기 위해 표적 단백질의 기능을 알 필요는 없다. 이 방법에 의해서 어떠한 약제라도 시험 리간드로서 평가할 수 있으며, 여기에는 금속, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 유기 소분자가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 문헌 [Wieboldt et al., Anal.Chem., 69:1683-1691 (1997)]에 표적 단백질에 대한 리간드를 확인하는 또다른 방법이 기재되어 있다. 이 기술을 이용하여, 약제 20 내지 30개의 조합 라이브러리의 표적 단백질에 대한 결합 여부를 용액 상태에서 한번에 스크리닝할 수 있다. 표적 단백질에 결합하는 약제는 원심분리성 한외여과에 의해서 다른 라이브러리 성분으로부터 분리한다. 필터 상에 잔존하는 특이적으로 선별된 분자는 이후에 표적 단백질로부터 유리되어 HPLC 및 공기식 전자분무(이온 분무) 이온화 질량 분석계로 분석된다. 이 방법으로 표적 단백질에 가장 높은 친화성을 갖는 라이브러리 성분을 선별할 수 있으며, 특히 소분자 라이브러리에 대해 유용하다.

피. 멀토시다(P. multocida) 감염의 생체내 생쥐 모델에서 최초 스크리닝에에 의해 확인된 억제제/결합제의 독성에 대한 효과를 평가할 수 있다. 균혈증, 심내막염, 패혈성 관절염, 연부조직 농양 또는 폐렴의 모델을 이용할 수도 있다. 또한, 다른 동물의 사용을 포함하는 모델도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 추정 억제제/결합제 화합물을 다양한 양으로 투여하기 전 또는 투여한 후, 토끼를 야생형 피. 멀토시다(P. multocida) 균주로 감염시킬 수 있다. 추정 억제제/결합제 화합물 대신 식염수만을 투여한 대조군 동물은 상기 시험 동물의 유해성을 측정할 수 있는 표준이 된다. 다른 동물 모델로는 문헌 [Animal and Plant Health Inspection Sevice, USDA, 1994년 1월 1일판 §§113.69-113.70], [Panciera and Corstvet, Am. J. Vet. Res. 45:2532-2537], [Ames et al., Can. J. Comp. Med. 49:395-400 (1984)] 및 [Mukkur, Infection and Immunity 18:583-585 (1977)]에 기재된 것들이 포함된다. 세균 독성을 방해하는 억제제/결합제는 감염을 예방하거나, 또는 일단 감염되면 그 결과를 역전시킬 수 있다.

당업계에 공지된 임의의 면역보강제를 백신 조성물에 사용할 수 있으며, 여기에는 프로인트(Freund)의 완전 면역보강제 및 프로인트의 불완전 면역보강제와같은 오일 기재의 면역보강제, 미콜레이트 기재의 면역보강제(예를 들어, 트레할로스 디미콜레이트), 세균성 리포폴리사카라이드(LPS), 펩티도글리칸류(예를 들어, 뮤레인, 뮤코펩티드 또는 N-오파카(N-Opaca), 뮤라밀 디펩티드[MDP] 또는 MDP 유사체 등의 당단백질), 프로테오글리칸류(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)의 추출물), 스트렙토코커스 조제(예를 들어, OK432), 바이오스팀(상표명, Biostim; 예를 들어, 01K2), EP 제109 942호, EP 제180 564호 및 EP 제231 039호의 "이스콤스(Iscoms)", 수산화알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 중성 오일(예를 들어, 미글리올), 식물성 오일(예를 들어, 아라키스 오일), 리포좀, 플루로닉(등록상표, Pluronic) 폴리올, 리비(Ribi) 면역보강제 시스템(예를 들어, GB-A-2 189 141호 참조), 또는 인터루킨, 특히 세포 매개성 면역 반응을 자극하는 것들이 포함된다. 미국 특허 제4,877,612호에는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales)목 내의 세균 속인 아미콜라타(Amicolata)의 추출물로 이루어진 다른 면역보강제가 기재되어 있다. 추가적으로, 특허받은 면역보강제 혼합물이 시판되고 있다. 사용되는 면역보강제는 부분적으로 수용 생물체에 따라 달라질 것이다. 투여하는 면역보강제의 양은 동물의 종류 및 크기에 따라 달라질 것이다. 최적 투여량은 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

임의로 백신 조성은 제약학적 비히클, 부형제 또는 매개체로서 작용하는, 백신 상용성이며 제약상 허용되는(즉, 살균 및 무독성) 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 어떠한 희석제라도 사용할 수 있다. 희석제의 예로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 스레아르산 마그네슘, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 알긴산염, 전분, 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 소르비톨, 만니톨, 아카시아 검, 인산 칼슘, 광유, 코코아 버터 및 테오브로마(theobroma) 오일이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

백신 조성물은 전달이 용이한 형태로 포장할 수 있다. 이 조성물은 캡슐, 캐플릿(caplet), 새셰이(sachet), 캐셰이(cachet), 젤라틴, 종이, 또는 기타 용기에 넣을 수 있다. 이들 전달 형태는 수용 생물체로의 면역원성 조성물의 유입과 상용성인 경우 및, 특히 상기 면역원성 조성물이 단위 투여 형태로 전달되는 경우에 바람직하다. 이 투여 단위는, 예를 들어 정제, 캡슐제, 좌약 또는 캐셰이로 포장될 수 있다.

백신 조성물은, 예를 들어 정맥내주사, 피부내주사, 근육내주사, 유방내주사, 복강내주사 또는 피하주사에 의해; 경구투여, 설하투여, 비강투여, 항문투여, 질투여를 비롯한 임의의 통상적인 방법에 의해 면역화될 환자에 도입시킬 수 있다. 치료는 단일 투여로 이루어지거나 일정 기간에 걸친 다수 투여로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 세균 감염 및(또는) 그 관련 증상을 예방하거나 경감시키는 백신 의약 제조에 있어서 본 발명의 독성약화 세균 균주의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 세균 감염 및(또는) 그 관련 증상을 예방하거나 경감시키는 의약 제조에 있어서 본 발명의 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 실시예 1은 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체의 제작에 대해 기술하고 있다. 실시예 2는 피.멀토시다(P. multocida) 돌연변이체의 스크리닝에 관한 것이다. 실시예 3은 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체의 독성을 측정하는 방법을 다루고 있다. 실시예 4는 피. 멀토시다(P. multocida) 독성 유전자의 클로닝에 대해 기술하고 있다. 실시예 5는 피. 멀토시다(P. multocida) 독성 유전자에 관련된 다른 종의 유전자들에 대한 확인을 다루고 있다. 실시예 6은 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체의 제작에 대해 기술하고 있다. 실시예 7은 독성약화 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체의 스크리닝을 다루고 있다. 실시예 8은 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 독성 유전자의 확인에 관한 것이다. 실시예 9는 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체 및 야생형 세균의 경쟁 감염을 기술하고 있다. 실시예 10은 확인된 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 유전자를 특성화하고 있다. 실시예 11은 야생형 세균 감염을 예방하기 위한 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 변종의 효능을 다루고 있다.

<실시예 1>: 태그-트랜스포손 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체 라이브러리의 제작

피. 멀토시다(P. multocida)에서 작용하며 랜덤한 것으로 이미 입증된[Lee et al., Vet Microbiol. 50:143-8 (1996)] 모 벡터 pLOF/Km [Herrero et al., J. Bacteriol. 172:6557-67 (1990)]에서 태그-트랜스포손 돌연변이체의 라이브러리를 제작하였다. 플라스미드 pLOF/Km은 자살 벡터인 pGP704를 변형하여 Tac 프로모터조절하의 트랜스포자제(transposase) 유전자 및 카나마이신 내성을 코딩하는 미니-Tn10 전위성 인자(transposable element)를 포함하도록 제작하였다. 하기와 같이 세미-랜덤 [NK]₃₅서열을 포함하는 서열 태그를 수용하도록 pLOK/Km을 변형하여 플라스미드 pTEF-1을 제작하였다.

먼저 플라스미드 pLOF/Km을 변형하여 다중 클로닝 영역내의 유일한KpnI 제한 부위를 제거한 다음, 미니-Tn10 영역내에 새로운KpnI 부위를 도입하였다. 플라스미드를KpnI로 절단하고, 생성된 돌출 말단을 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 클레나우(Klenow) 중합효소로 채워넣었다. 본원에 설명된 제한효소 절단 및 라이게이션은 제조자가 제안하는 프로토콜(Gibco BRL, Gaithersburg, MD 및 Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)에 따라 수행하였다. 평활 말단 생성물을 셀프-라이게이션하여 pLOF/Km-KpnI로 명명되는 플라스미드를 생성시키고, 증폭을 위해 대장균(E. coli) DH5α:λpir내에 형질전환시켰다. 대장균 DH5α:λpirΦ80dlacZㅿM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_k ^-, m_k, supE44, relA1, deoR, ㅿ(lacZYA-argF)U169를 37℃에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지에서 증식시켰다. 퀴아젠, 인크(QIAGEN, Inc, Santa Clarita, CA)사로부터 구입한 퀴아젠 스핀프렙(QIAGEN SpinPreps)을 사용하여 플라스미드를 제조하고, 미니-Tn10 전위성 인자내의 소정의 유니크 부위를 자르는 SfiI로 절단하였다. 올리고뉴클레오티드 TEF1(서열 86)과 TEF3(서열 87)을 어닐링하여SfiI-KpnI-SfiI 어댑터를 제조하고, 생성된 이중 가닥 어댑터를SfiI 부위에 라이게이션하여 플라스미드 pTEF-1을 생성시켰다. 올리고뉴클레오티드 TEF1 및 TEF3(및 본원에 기재된 모든 다른 올리고뉴클레오티드)은 제노시스 바이오테크놀러지(Genosys Biotechnologies, The Woodlands, TX)사에서 합성하였다.

TEF1 5'-AGGCCGGTACCGGCCGCCT (서열 86)

TEF3 5'-CGGCCGGTACCGGCCTAGG (서열 87)

pTEF-1의KpnI 부위내로의 삽입을 위한 유니크 서열 태그는 다음과 같이 제조하였다. 250 μM의 각 dNTP, 1.5 mM Mg(OAc)₂, 프라이머 TEF14(서열 88) 및 TEF15(서열 89) 각 100 pmol, 주형 DNA로서의 TEF26(서열 90) 1 ng, 및 재조합TthDNA 중합효소 XL 2.5 유닛을 포함하는 조건하에서, 진앰프(GeneAmp) XL PCR 키트(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 이중 가닥 DNA 태그를 생성시키도록 PCR을 수행하였다.

TEF14 5'-CATGGTACCCATTCTAAC (서열 88)

TEF15 5'-CTAGGTACCTACAACCTC (서열 89)

TEF26 5'-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT-[NK]₃₅-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG (서열 90)

반응 조건에는 95℃에서 1분 동안 최초 인큐베이션한 다음, 95℃에서 30초, 45℃에서 45초 및 72℃에서 15초의 사이클을 30회 반복한 후에, 72℃에서 2분 동안 최종 인큐베이션하는 것이 포함된다.KpnI을 사용하여 PCR 산물을 절단하고, 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 퀴아젠 뉴클레오티드 분리 키트(QIAGEN Nucleotide Removal Kit; QIAGEN, Inc., Chatsworth, GA)를 사용하여 정제하였다. 미리KpnI으로 절단하여 선형으로 만들어진 유니크 태그 서열을, 표준 방법을 이용하여 송아지 장의 알칼리 포스파타제(Boehringer-Mannheim)로 탈인산화시킨 후에 pTEF-1의 미니-Tn10 인자에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드 라이브러리를 대장균 DH5α:λpir내에 형질전환시켰다. 콜로니 블롯 분석은 DIG 사용자 지침서(DIG User's Guide, Boehringer-Mannheim)에 따라 하기와 같이 수행된 혼성화 및 검출과 함께 수행하였다.

혼성화는 본질적으로 제니어스 비-방사성 사용자 지침서(Genius Non-Radioactive User's Guide, Boehringer Mannheim Biochemicals), DIG-PCR 표지 키트의 제품 쉬이트(Boehringer Mannheim Biochemicals) 및 CSPD의 제품 쉬이트(Boehringer Mannheim Biochemicals)에 따라 수행하였다. 프로브의 제조를 위해, 앰플리택(Amplitaq) PCR 완충액(PE Applied Biosystems), 200 μM dNTP, 프라이머 TEF5(서열 91) 및 TEF6(서열 92) 각 140 pmol, 2 mM MgCl₂, 앰플리택(PE Applied Biosystems) 2.5 유닛 및 플라스미드 DNA 1 ng을 사용하여 100 ㎕의 1차 PCR 반응을 시작하였다.

TEF5 5'-TACCTACAACCTCAAGCT (서열 91)

TEF6 5'-TACCCATTCTAACCAAGC (서열 92)

사이클 조건은 95℃에서 2분 동안 최초 인큐베이션한 다음, 95℃에서 30초, 50℃에서 45초 및 72℃에서 15초의 사이클을 35회 반복한 후에, 72℃에서 3분 동안 최종 인큐베이션하는 것을 포함한다. 증폭된 생성물을 2％의 누시브(NuSieve) GTG(FMC BioProducts, Rockland, ME, USA):아가로스(3:1) 겔 상의 전기영동에 의해 분리하고, 109 bp 크기의 생성물을 절단하여 정제하였다. 겔 추출은 퀴아젠 겔 추출(QIAGEN Gel Extraction) 키트(QIAGEN)를 사용하여 수행하였다. DIG PCR Kit, 프라이머 TEF24 및 TEF25 각 50 pmol, 및 DIG 프로브 합성 혼합물(Probe Synthesis Mix)과 2 mM dNTP 원액의 1:1 혼합물을 사용하는 50 ㎕ PCR 반응에서 1차 생성물 약 15 ng을 표지하였다.

TEF24 5'-TACCTACAACCTCAAGCTT (서열 93)

TEF25 5'-TACCCATTCTAACCAAGCTT (서열 94)

PCR 조건은 95℃에서 4분 동안 최초 인큐베이션한 다음, 95℃에서 30초, 50℃에서 45초 및 72℃에서 15초의 사이클을 25회 반복한 후에, 72℃에서 3분 동안 최종 인큐베이션하는 것을 포함한다. 표지된 PCR 생성물을 총 반응 부피 90 ㎕ 중에서HindⅢ를 사용하여 절단하고, 이를 2％의 누시브 GTG(FMC BioProducts):아가로스(3:1) 겔을 사용하여 불변 프라이머 암(arm)으로부터 정제하였다. 표지된 가변 태그를 포함하는 영역을 절단하고, 전체 겔 슬라이스를 95℃에서 10분 동안 DIG 이지하이브(EasyHyb) 10 ml 중에 용해시켜 변성시켰다.

하이본드(등록상표, Hybond)-N⁺막(Amersham-Pharmacia Biotech)을 사용하여 도트 블롯을 제조하였다. PCR 생성물 약 30 ng을 사용하여 각각의 태그별로 표적 DNA를 96 웰 플레이트에서 제조하였다. 동 부피의 0.1 N NaOH를 가하여 샘플을 변성시키고, 각 샘플을 슐라이허 앤드 슈엘(Schleicher and Schuell)사(Keene, NH, USA)로부터 구입한 미니폴드 Ⅰ(상표명, Minifold Ⅰ) 도트-블롯 장치를 이용하여 최소 진공으로 막에 도포하였다. 중화 용액(Neutralization Solution)(0.5 M Tris / 3 M NaCl, pH 7.5) 150 ㎕ 및 2X SSC 150 ㎕으로 각 웰을 세척하였다. 스트라타링커(Stratalinker; Stratagene, La Jolla, CA, USA)에서 막을 UV에 의해 가교결합시키고, 42℃에서 DIG 이지하이브 완충액 20 ml 중에서 1시간 동안 예비혼성화시켰다. 변성된 프로브를 가하고, 42℃에서 밤새 혼성화를 수행하였다. 0.1％ SDS를 함유하는 2X SSC 중에서 막을 5분씩 2회 세척하였다. 표준 제니어스(Genius) 검출 프로토콜(Genius Manual)을 진행하기에 앞서, 68℃에서 15분 동안 0.1％ SDS를 함유하는 예비-가온된 0.1X SSC 완충액 50 ml 중에서 고 엄격 세척을 2회 수행하였다.

안전하고, 비용이 저렴하며, 사용하기 쉽고, 위험한 물질이 적은 비-방사성검출 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 기술한 것과 유사한 방법을 이용한 초기 실험[Mei et al., Mol Microbiol. 26:399-407 (1997)]에서는, 음성 대조군에서 허용되지 않는 수준의 배경값이 얻어졌다. 배경값을 줄이기 위해, 태그 길이를 30 bp 증가시켜 총 70 bp가 되게 하고, 가변성 영역의 인접한 모든 서열을 포함하도록 증폭 프라이머를 연장시키고, 더 낮은 농도의 dig-dUTP를 사용하였으며, 서열 태그 영역에 인접한 보존적 서열을 겔 여과에 의해 제거하였다. 가장 중요한 것으로, 트랜스포손 자체로부터 배경 혼성화를 검출한 후에, PCR을 이용하여 도트 블롯의 표적 DNA로서 태그 트랜스포손을 포함하는 전체 플라스미드가 아닌 [NK]₃₅서열 태그를 생성시켰다. 이러한 변형법을 이용하여 배경값을 제거함으로써, 화학발광성/비-방사성 스크리닝을 보다 효과적인 것으로 만들었다.

pTEF-1과 PCR에 의해 생성된 서열 태그의 라이게이션으로부터 생성된 약 400개의 다른 형질전환체를 콜로니 블롯에 의해 스크리닝하고, 추가로 사용하기 위해 혼성화도가 가장 큰 콜로니 96개를 미세적정 플레이트에 모았다. 태그가 복제될 가능성이 매우 적긴하지만, 마스터 태그 플레이트의 절반을 다른 것에 대해 조사한 결과, 어떠한 태그도 복제되지 않았음을 확인하였다. 이러한 태그를 포함하는 플라스미드를 정제하여, 대장균 S17-1:λpir(pir,recA,thi,pro,hsd, (r-m+), RP4-2, (Tc::Mu), (Km::Tn7), [TmpR], [SmR])내에 형질전환시키고, 형질전환된 세균을 37℃에서 루리아-베르타니(LB) 배지에서 증식시켰다. 태그 플라스미드 pTEF-1을 포함하는 96개의 대장균 S17-1:λpir 형질전환체 각각을 접합교배(conjugative mating)에서 사용하여 피. 멀토시다(P. multocida)의 트랜스포손 돌연변이체를 생성시켰다. 피. 멀토시다(P. multocida) 균주 TF5는 소의 임상 단리체인 UC6731로부터 유도되는 자발적 날리딕신산 내성 돌연변이체이다. 평판 배양하는 경우, 피. 멀토시다(P. multocida) 균주를 37℃, 5％ CO₂에서 뇌 심장 주입액 (BHI) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 배양시켰다. 대장균 S17-1:λpir/pTEF1:[NK]₃₅클론 및 TF5 균주 각각을 후기 로그기까지 배양하여 교배를 시작하였다. 각 태그-pTEF-1 클론의 배양물 50 ㎕를 TF5 배양물 200 ㎕와 혼합하고, 각각의 교배 혼합물 50 ㎕를 100 mM IPTG 및 10 mM MgSO₄를 함유하는 BHI 플레이트 상에 놓인 0.22 TM 필터에 스폿팅하였다. 37℃, 5％ CO₂에서 밤새 인큐베이션한 다음, 각 필터 상의 교배 혼합물을 PBS 3 ml로 세척해내어, 각 25 ㎕를 BHIN⁵⁰K⁵⁰플레이트 상에 플레이팅하였다. 선별을 위해 밤새 배양한 다음, 콜로니를 이쑤시개로 200 ㎕ BHIN⁵⁰K⁵⁰에 옮겨서 미세적정 플레이트에 모으고, 미세적정 플레이트내의 각 웰이 동일한 서열 태그를 갖는 트랜스포손 돌연변이체를 항상 포함하도록 하였다. 밤새 배양한 다음, 75％ 글리세롤 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 플레이트를 -80℃에서 동결보관하였다.

19개의 풀을 모아서 트랜스포손 돌연변이체를 미세적정 플레이트에 옮김으로써 각 웰이 각 웰마다 적합한 태그를 갖는 트랜스포손 돌연변이체를 포함하도록 하였다. 즉, 돌연변이체내의 트랜스포손의 위치가 다를지라도, 각 미세적정 플레이트내의 특정 웰은 동일한 서열 태그를 갖는 트랜스포손 돌연변이체를 항상 포함하였다.

<실시예 2>: 독성약화 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체에 대한 쥐과 스크리닝

패혈증 쥐과 모델을 사용하여 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 트랜스포손 돌연변이체로 구성되는 19개의 풀을 스크리닝하였다. 모아진 피. 멀토시다(P. multocida) 트랜스포손 돌연변이체의 동결된 플레이트를 -80℃의 보관소에서 꺼내어, 각 웰로부터 10 ㎕를 날리딕신산(Sigma) 50 ㎍/ml 및 카나마이신(Sigma) 50 ㎍/ml를 함유하는 뇌 심장 주입액(DIFCO, BHIN⁵⁰K⁵⁰) 200 ㎕가 들어있는 새로운 96 웰 둥근 바닥 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA, USA)에 옮겨서 2차배양하였다. 플레이트를 진탕하지 않으면서 37℃, 5％ CO₂에서 밤새 배양하였다. 각 웰로부터 10 ㎕를 웰 당 BHI 100 ㎕를 함유하는 새로운 평면 바닥 96-웰 플레이트(Corning Costar)에 옮기고, 대략 150 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 배양함으로써 밤새 배양한 플레이트를 2차배양하였다. 미세적정 플레이트 판독기를 사용하여 OD₅₄₀값을 모니터링하였다. 약 0.2 내지 0.25의 OD₅₄₀에서, 미세적정 플레이트의 웰로부터 각각 100 ㎕를 합하여 각 플레이트를 모음으로써 "유입 풀(input pool)"을 형성하였다. 배양물을 BHI 중에 약 10⁴, 10⁵, 10⁶CFU/ml의 투여량으로 대략적으로 희석시키고, 각 희석액 0.2 ml를 사용하여 복강내 투여에 의해 체중이 14 g 내지 16 g인 암컷 BALB/c 생쥐를 감염시켰다. 감염 후 2일째, 생존한 생쥐 1 마리 또는 2마리를 안락사시키고, 비장을 적출하였다. 비장 전체를 0.9％의 멸균된 식염수 1.0 ml 중에 균질화하였다. 10^-2내지 10^-5의 균질 희석액을 제조하여 BHIN⁵⁰K⁵⁰플레이트 상에 플레이팅하였다. 밤새 배양한 다음, 대략 20,000개의 콜로니를 BHI 브로쓰 10 ml 중에 모아서 "회수 풀"을 형성시키고, 회수 풀 0.5 ml을 3,500 X g에서 원심분리하여, 형성된 펠릿을 사용하여 선행 기술 문헌[Wilson, In F.M. Ausubel et al., (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, vol.1. John Wiley and Sons, New York, p. 2.4.1 - 2.4.5. (1997)]에 기재된 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 제조하였다.

독성 야생형 피. 멀토시다(P. multocida)를 사용한 초기의 실험 결과는 이 생물체를 비장, 폐, 신장, 및 간(패혈증 감염 모델을 실제적으로 나타냄)으로부터 회수할 수 있음을 암시한다. "유입" 및 "회수" 풀 둘 다에 대한 도트 블롯을 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하고, 시각적 검사와 반-정량적 분석에 의해 평가하였다. 유입 및 회수 풀로부터의 게놈 DNA 5 ㎍을 주형으로 사용한 점을 제외하고, 실시예 1에 설명된 바와 같이 혼성화를 수행하였다. 반-정량적 분석은 단일 클론이 상당히 감소되었는지 여부를 나타낸다. 돌연변이체가 숙주내에서 생존할 수 없다면, 회수 신호는 유입 신호에 비해 매우 낮아서, 유입/회수 비율은 높아지게 된다. 대부분의 돌연변이체는 시험관내에서 만큼 생체내에서도 잘 증식할 것이기 때문에, 이러한 신호들의 비율은 대략 1이 된다. 정량 분석에 의해 회수 풀에서 상당히 감소된 것으로 나타난 선별 클론을 후속 연구를 위해 선별하였다. 또한, 도트 블롯으로부터 얻은 필름을 시각적으로 평가한 다음, 의심되는 유입/회수 비를 갖는 다른 클론도 선별하였다.

<실시예 3>: 피. 멀토시다(P. multocida) 후보 돌연변이체에 대한 독성 측정

비장 조직으로부터 감소된 회수율을 나타내는 각각의 잠재적인 돌연변이체를 원래의 풀 플레이트로부터 단리하여, 트랜스포손 돌연변이에 의해 유발되는 독성약화를 조사하고 대략적으로 평가하기 위한 면역성 실험에 개별적으로 사용하였다. 생체내 스크리닝으로부터의 각 후보 돌연변이체를 37℃, 5％ CO₂에서 양 혈액 아가(Sheep Blood Agar) 플레이트 상에서 밤새 배양하였다. 각 돌연변이체로 구성되는 대략 6개의 콜로니를 BHI 배지에 접종하고, 6시간 동안 배양하였다. 희석액을 제조하고, 생쥐 5마리를 상기 설명한 바와 같이 10², 10³, 10⁴및 10⁵CFU로 각각 감염시켰다. 6일 후에, 사망률을 야생형의 것과 비교하여 독성약화를 측정하였다. 생존한 생쥐는 보호된 것으로 추정하였으며, 이어서 야생형 피. 멀토시다(P. multocida)를 야생형 균주에 대한 LD₅₀보다 대략 200배를 초과하는 농도의 투여량으로 시험하였다. 이이서, 시험된 각 생쥐 군에 대한 생존률을 측정하였다.

실험 결과, 잠재적인 트랜스포손 돌연변이체 120개 중 62개의 독성이 약화되었고, LD₅₀은 야생형 균주보다 대략 10배 이상 더 높은 것으로 나타났다. 클론 및이들의 대략적인 LD₅₀값은 하기 표 1에 기재되어 있다. 야생형 균주와의 대조 실험은 각 시험 세트와 동시에 수행하였고, 모든 경우에서 아생형-시험 군의 사망률은 100％이었다.

LD₅₀값 이외에도, 표 1은 면역화 및 면역성 실험으로부터의 테이타를 제공한다. 요컨대, 표 1에 나타낸 각각의 피. 멀토시다(P. multocida) 균주를 독성 야생형 균주의 LD₅₀보다 대략 200배를 초과하는 투여량으로 복강내 주입하여 일군의 생쥐(개체수는 5 내지 10마리임)를 면역화하였다.

<실시예 4>: 피. 멀토시다(P. multocida) 독성에 요구되는 유전자의 클로닝 및 확인

독성이 약화된 것으로 확인된 각 트랜스포손 돌연변이체를 추가로 분석하여 손상된 오픈 리딩 프레임의 동일성 여부를 결정하였다. 각 돌연변이체로부터의 DNA를 증폭 및 정제하고, 트랜스포손을 자르지는 않는 것으로 알려져 있으며 트랜스포손과 혼성화하는 4 내지 8 kb 크기의 단편을 일반적으로 생성하는 제한 효소로 절단하였다. 트랜스포손에 의해 코딩되는 카나마이신 내성에 대한 선별법을 이용하여, 각 트랜스포손 돌연변이체에 대해 하나 이상의 단편을 클로닝하였다.

pLOF/Km으로부터의 표지된 1.8 kb MluI 단편을 클로닝에 적합한 크기의 단편을 찾아내는 프로브로 사용하여, 독성이 약화된 각 돌연변이체에 대해 여러 제한 효소를 사용하는 써던 혼성화를 수행하였다. 각 돌연변이체로부터의 미니-Tn10 인자 및 인접 DNA를 pUC19에 클로닝하고, 내부 프라이머 TEF32 및 TEF40, 프라이머 워킹 및, 경우에 따라, 범용 pUC-19 프라이머를 사용하여 인접 서열을 결정하였다.

TEF-32 GGCAGAGCATTACGCTGAC (서열 95)

TEF-40 GTACCGGCCAGGCGGCCACGCGTATTC (서열 96)

PE 어플라이드 바이오시스템스(PE Applied Biosystems; Foster City, CA)사로부터 구입한 빅다이(상표명, BigDye) 다이 터미네이터 케미스트리(Dye Terminator Chemistry) 키트를 사용하여 ABI 프리즘(Prism) 377 DNA 서열분석기로 서열분석 반응을 수행하였다. 추정의 손상된 오픈 리딩 프레임에 대한 이중 가닥 서열을 각 클론에 대하여 수득하였다. 시퀀서(Sequencer) 3.0 소프트웨어 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI)를 사용하여 서열 데이타를 수집 및 분석하였다. GCG 프로그램[Devereux et al., 1997, Wisconsin Package Version 9.9, 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison]을 사용하여 현재 이용가능한 데이타베이스에서 상동성 서열을 검색하였다.

독성이 약화된 것으로 확인된 클론의 37％에서, 미니-Tn10 전위성 인자가 여러번 삽입되어 있었다. 그의 인접 서열과 함께 각 삽입체를 각각 pGP704에 클로닝하고, 야생형 균주와 교배하여 피. 멀토시다(P. multocida)의 신규 돌연변이체를 생성시켰으며, 이들은 각각 원래의 여러 삽입체 중 하나만을 보유하였다. 각 돌연변이체를 각각 재시험하여 독성약화 형질의 원인이 되는 삽입체를 결정하였다. 손상된 예상 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열은 양쪽 가닥을 서열분석하여 결정하였고, 예상 아미노산 서열을 사용하여 현재 이용가능한 데이타베이스에서 유사한 서열을 검색하였다. 이 서열은 공지 유전자, 비공지 유전자, 및 이미 서열이 분석된 이론상의 오픈 리딩 프레임과 매치되거나 기존에 확인된 어떠한 서열과도 매치되지 않았다. 기존에 확인된 서열과 상동성을 갖는 유전자의 경우, 잠재적 기능은 표 1에 기재되어 있는 바와 같이 지정하였다.

<실시예 5>: 다른 종에서 관련 유전자의 확인

별도의 실험에서, 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae(APP))를 사용하여 STM을 수행하였다. App 균주 중 하나가 서열분석된 유전자(서열 97)내에 삽입체를 포함하였으며, 이는 피. 멀토시다(P. multocida) aptG 유전자의 종 동족체인 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 또한 백신 조성물에 사용하기 위해 독성약화된 다른 세균 종의 균주를 생성하도록 돌연변이시킬 수도 있는, 종래에는 알려져 있지 않은 피. 멀토시다(P. multocida)에 대한 동족체가 다른 세균에 존재할 수 있음을 시사하였다. 다른 피. 멀토시다(P. multocida) 유전자의 동족체가 다른 세균 종내에 존재하는지를 결정하기 위해, 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) atpG 유전자를 프로브로 사용하여 다른 종으로부터의 게놈 DNA 상에서 써던 혼성화를 수행하였다.

CTAB 방법을 이용하여 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica(Ph)), 피. 멀토시다(P. multocida), 및 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus(Hs)) 게놈 DNA를 단리하고, 37℃에서 2시간 동안EcoRI 및HindⅢ로 절단하였다. 절단된 DNA는 TAE 완충액 중 0.7％ 아가로스 겔 상에서 40 V의 전압으로 밤새 분리하였다. 겔을 0.1 M HCl에서 30분 동안, 0.5 M NaOH/1.5 M NaCl에서 15분씩 2회, 2.5 M NaCl/1 M Tris(pH 7.5)에서 2회 순차적으로 액침시켰다. 20X SSC 완충액(3 M NaCl/0.3 M 시트르산나트륨)을 사용하여 DNA를 니트로셀룰로스 막(Amersham Hybond N⁺)에 밤새 전달하였다. UV 스트라타링커를 자동가교 세팅(20 밀리주울)으로 사용하여 DNA를 막에 가교결합시켰다. 막을 5X SSC/1％ 차폐 용액/0.1％ 나트륨 라우로일 사르코신/0.02％ SDS 중에서 50℃로 대략 7시간 동안 예비혼성화시키고, PCR에 의해 생성된 atgG 프로브를 포함하는 동일한 용액 중에서 50℃로 밤새 혼성화시켰다.

진앰프 PCR 시스템 2400의 진앰프 XL PCR 키트에서 프라이머 DEL-1389(서열 98) 및 TEF-46(서열 99)을 사용하여 프로브를 제조하였다. 주형은 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) DNA이었다.

DEL-1389 TCTCCATTCCCTTGCTGCGGCAGGG (서열 98)

TEF-46 GGAATTACAGCCGGATCCGGG (서열 99)

94℃에서 5분 동안의 최초 가열 단계 이후에, 94℃에서 30초 동안의 변성, 50℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 3분 동안 합성의 사이클을 30회 반복한 다음, 및 72℃에서 5분 동안의 최종 합성 단계로 PCR을 수행하였다. 증폭 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리하고, 퀴아퀵(QIAquick) 겔 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하고, DIG-하이 프라이머(DIG-High Primer) 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 표지하였다. 혼성화 용액에서 블롯을 꺼내어 2X SSC로 세정하고, 동일한 완충액 중에서 5분씩 2회 세척하였다. 이이서, 블롯을 0.5X SSC 중에서 60℃로 15분씩 2회 세척하였다. DIG 핵산 검출 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 상동성 밴드를 가시화하였다.

EcoRI에 의해 절단된 DNA를 사용하여 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica) 및 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus) 및 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 하나의 밴드를 검출하였다.EcoRI에 의해 절단된 DNA를 사용하여 파스테우렐라 멀토시다로부터 2개의 밴드를 검출하였다.

<실시예 6>: 태그-트랜스포손 피. 멀토시다(P. multocida) 돌연변이체의 라이브러리 제작

pLOF/Km을 사용한 트랜스포손 돌연변이 유발이 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)에서 작용성이며, 랜덤하다라는 사실은 이미 보고된 바 있다[Tascon et al., J. Bacteriol. 175:5717-22(1993)]. 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)의 태그 트랜스포손 돌연변이체를 제작하기 위해, 예비-선별된 태그 플라스미드(pTEF-1:[NK]₃₅)를 포함하는 96개의 대장균 S17-1:λpir 형질전환체 각각을 접합 교배에서 사용하여 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 균주 AP225의 트랜스포손 돌연변이체인, 생체내 계대배양된 ATCC 27088 균주로부터 유도된 혈청형 1의 자연발생 날리딕신산 내성 돌연변이체를 생성시켰다. 평판배양하는 경우, 에이. 플루로뉴모니아 균주를 37℃, 5％ CO₂에서 B-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(V¹⁰)(Sigma, St.Louis, Missouri) 10 ㎍/ml이 들어있는 뇌 심장 주입액(BHI)(Difco Laboratories, Detroit, MI) 배지에서 배양하였다. 대장균 S17-1:λpir(λpir,recA,thi,pro,hsdR(r_k-, m_k+), RP4-2, (Tc^R::Mu), (Km^R::Tn7), [Tmp^R], [Sm^R])를 37℃에서 루리아-베르타니(LB) 배지에서 증식시켰다. 필요하다면 암피실린(Sigma) 100 ㎍/ml, 날리딕신산(N⁵⁰)(Sigma) 50 ㎍/ml 및 카나마이신(Sigma) 50 (K⁵⁰) 또는 100 (K¹⁰⁰) ㎍/ml의 농도로 항생제를 사용하였다.

대장균 S17-1:λpir/pTEF1:[NK]₃₅클론 및 AP225 균주를 각각 후기 로그기까지 배양하여 교배를 시작하였다. 태그-pTEF1 클론 각각에 대해 배양물 분취액 50 ㎕를 APP225 배양액 150 ㎕와 혼합한 다음, 각 교배 혼합물 50 ㎕를, 100 μM IPTG 및 10 mM MgSO₄를 함유하는 BHIV¹⁰플레이트 상에 놓인 0.22 μM 필터에 스폿팅하였다. 37℃, 5％ CO₂에서 밤새 배양한 다음, 각 필터 상의 교배 혼합물을 PBS 2 ml로 세척해내고, 200 ㎕를 BHIV¹⁰N⁵⁰K¹⁰⁰플레이트 상에 플레이팅하였다. 선별을 위해 밤새 배양한 다음, 콜로니를 이쑤시개로 200 ㎕ BHIV¹⁰N⁵⁰K¹⁰⁰에 옮겨서 미세적정 플레이트에 모으고, 미세적정 플레이트내의 각 웰이 동일한 서열 태그를 갖는 트랜스포손 돌연변이체를 항상 포함하도록 하였다. 밤새 배양한 다음, 75％ 글리세롤 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 플레이트를 -80℃에서 동결보관하였다.

피. 멀토시다(P. multocida)와는 달리, APP는 미니-Tn10 인자의 다중 삽입체에 대해 많은 편향성을 갖지 않는 것으로 보인다. 돌연변이체의 대략 3％ 만이 다중 삽입체를 포함하고 있으며, 이는 기존에 보고된 4％와 일치하는 것이다[Tascon et al., J Bacteriol. 175:5717-22 (1993)]. APP에서의 문제는 23S RNA 영역내에 삽입체를 포함하는 많은 돌연변이체(13개의 유니크 부위내에 삽입체를 갖는 총 28개의 돌연변이체)를 확인하는 것이다. 이는, 23S RNA가 주된 삽입 부위를 포함하며, APP의 배양은 이러한 삽입체에 의한 영향으로 숙주내에서 차별적으로 생존할 수 있게 됨을 암시한다. APP 23S RNA 프로브를 사용한 서던 블롯 분석 결과는 APP가, 에이치. 인플루엔자(H. influenzae)에서 5개의 완전한 오페론[Fleischmann etal., Science 269:496-512 (1995)] 및 대장균에서 7개의 완전한 오페론[Blattner et al., Science 277:1453-1474 (1997)]에 비해 단지 3개의 리보좀계 오페론을 포함할 수 있음을 시사한다. 상당수의 클론이 이러한 rRNA내에 삽입체를 포함하고, 다른 유니크 독성약화 돌연변이를 얻기 위해 대용량 스크리닝이 필수적이기 때문에, 이 부위 선호도 및 성장률에 대한 그의 효과는 "포화 돌연변이유발"에 대한 상당한 장애가 될 수 있다.

<실시예 7>: 독성약화 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 돌연변이체에 대한 돼지 스크리닝

돼지 기관내 감염 모델을 이용하여, 대략 총 800개의 돌연변이체를 함유하는 에이. 플레우로뉴모니아의 풀 20개를 스크리닝하였다. 각 풀을 별개의 동물 2종에서 스크리닝하였다.

모은 악티노바실러스 플레우로뉴모니아 트랜스포손 돌연변이체의 동결된 플레이트를 -80℃ 저장기에서 꺼내고 20 ㎕를 각 웰로부터 BHIV¹⁰N⁵⁰K⁵⁰180 ㎕가 들어있는 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트 (Corning Costar, Cambridge, MA, USA)로 옮겨서 2차배양하였다. 플레이트를 진탕하지 않고 37℃, 5％ CO₂에서 밤새 배양하였다. 그 다음으로, 10 ㎕를 각 웰로부터 웰당 100 ㎕의 BHIV¹⁰이 함유된 새로운 평면 바닥 96웰 플레이트(Corning Costar)에 옮기고, 150 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 배양함으로써 밤새 배양한 플레이트를 2차배양하였다. 미세적정 플레이트 판독기를 이용하여 OD₅₆₂를 모니터링하였다. 약 0.2 내지 0.25의 OD₅₆₂에서 미세적정 플레이트의 웰 각각으로부터 100 ㎕를 합하여 각 플레이트를 모음으로써 "유입 풀"을 형성하였다. 배양물을 대략 2 X 10⁶CFU/ml까지 BHI에서 적절하게 희석하였다. 기관 튜브를 사용하는 기관내 투여에 의해 10-20 kg의 SPF 돼지(Whiteshire-Hamroc,Albion, IN)를 감염시키기 위해 희석된 각 풀을 4.0 ml씩 사용하였다. 감염 후 대략 20시간에 모든 생존 동물을 안락사시키고 폐를 적출하였다. 150 ml의 멸균 PBS를 폐에 관주한 후 마사지하여 PBS를 분산시킴으로써 세척을 수행하여 생존 세균을 회수하였다. 세척액을 회수하고, 이 과정을 한번 더 반복하였다. 세척액을 450 x g에서 10분 동안 원심분리하여 큰 찌꺼기(debris)를 분리하였다. 그 다음으로, 상청액을 2,800 x g에서 원심분리하여 세균 펠릿을 얻었다. 펠렛을 5 ml의 BHI에 재현탁하고 10^-2내지 10^-5로 희석하여 BHIV¹⁰N⁵⁰K⁵⁰플레이트 상에 플레이팅하였다. 밤새 배양한 후, 100,000개 이상의 콜로니를 10 ml의 BHI 배지에 모아 "회수 풀"을 형성하였다. 각 회수 풀에서 0.7 ml의 분취액을 사용하여 CTAB 방법 [Wilson, In Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley and Sons, New York, p. 2.4.1-2.4.5 (1997)]에 의해 게놈 DNA를 제조하였다.

동물로부터의 회수물은 통상 폐 세척액으로부터 10⁸CFU 범위내이었다.

도트 블롯을 수행하고, 상기와 같이 시각적 검사 및 반-정량적 분석에 의해평가하였다. 모든 혼성화 및 검출은 상기와 같이 수행하였다. 요컨대, 1차 PCR 증폭 후 원하는 생성물을 아가로스 겔 정제하고 dig-dUTP를 혼입하는 2차 PCR 증폭에 의해 프로브를 제조하였다. TEF5, TEF6, TEF24, TEF25, TEF48 및 TEF62를 비롯한 올리고뉴클레오티드를 제노시스 바이오테크놀로지(Genosys Biotechnoloy; The Woodlands, TX)에서 합성하였다. 또한, 프라이머 TEF69, TEF65 및 TEF66을 역 PCR 반응 및 서열분석에 사용하였다.

TEF69 GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTC (서열 166)

TEF65 GCCGGATCCGGGATCATATGACAAGA (서열 167)

TEF66 GACAAGATGTGTATCCACCTTAAC (서열 168)

그 다음으로, 표지된 PCR 산물을 HindⅢ로 절단하여 유니크 태그 영역으로부터 불변 프라이머 암(arm)을 분리하였다. 표지된 가변 태그를 포함하는 영역을 절단한 후 전체 겔 슬라이스를 DIG 이지하이브 중에 용해시켜 변성시켰다. 도트 블롯을 수행하고 표준 CSPD 검출 프로토콜을 이용하여 검출하였다. 시각 평가를 위해 필름을 노출시키고, 각 도트 블롯 샘플에 대해 초당 발광 계수 (LCPS)를 측정하였다. 각 돌연변이체에 대한 LCPS_유입/LCPS_회수비율을 이용하여 독성이 약화된 것일 수 있는 돌연변이체를 결정하였다.

유입 풀에는 존재하지만 회수 풀에서 매우 감소된 것으로 나타난 선별 클론을 후속 연구를 위해 선별하였다. 도트 블롯으로부터 얻은 필름을 시각적으로 평가한 후 의심스러운 유입/회수 비를 갖는 다른 클론도 선별하였다. 총 110개의 클론을 선별하였다.

<실시예 8>: 에이. 플레우로뉴모니아 독성 유전자의 확인

역 PCR 및 생성물의 직접 서열분석에 의해 110개의 돌연변이체 각각에 대해 일부 인접 서열을 결정하였다. 상기와 같이 직접 서열분석을 위한 인접 DNA 생성물을 얻기 위해 역 PCR을 이용하였다. 서열분석 반응은 PE 어플라이드 바이오시스템사 [PE Applied Biosystems (Foster City, CA)]의 빅다이 (BigDye; 상표명) 터미네이터 케미스트리 키트를 사용하여 ABI 프리즘 377 DNA 서열분석기로 수행하였다. 시퀀처(Sequencher) 3.0 소프트웨어 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI)를 이용하여 서열 데이타를 수집 및 분석하였다. GCG 프로그램 [Devereux and Haeberli, Wisconsin Package Version 9.0,9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison (1997)]을 사용하여 현재 이용가능한 데이타베이스에서 상동성 서열을 검색하였다.

표 2는 오픈 리딩 프레임을 결정할 수 있는 정도까지 확인된 에이. 플레우로뉴모니아 유전자를 나타낸다. 서열 번호는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 이 서열로부터 유추된 아미노산 서열에도 부여되어 있다.

에이. 플레우로뉴모니아 오픈 리딩 프레임
완전한 오픈 리딩 프레임	개시코돈 부재 - 정지코돈 존재
atpHaptGexbBOmpP5OmpP5-2tigfkpAhupArpmF	서열 134서열 132서열 140서열 152서열 150서열 160서열 142서열 146서열 158	dks AdnaKHI0379	서열 136서열 138서열 144
		개시코돈 부재 - 정지코돈 부재
개시코돈 존재 - 정지코돈 부재	pnpapvA-or 1apvA-or 2apvBapvD	서열 154서열 122서열 124서열 126서열 130
lpdApotDyaeEapvC	서열 148서열 156서열 164서열 128	RNA 또는 비코딩 서열
		tRNA-leutRNA-glu	서열 162서열 163

표 3 에 기재된 잠정적인 확인물 (하기 실시예 9)은 세균 데이타베이스와의 비교에 의해 선정하였다. 110개의 돌연변이체는 유니크 트랜스포손 삽입체 35개 군을 대표하였다. 유전자좌위 당 상이한 돌연변이의 수는 한 ORF내의 단일 부위에 있는 삽입체를 항상 함유하는 일부 클론부터 동일한 ORF의 다른 부위내에 있는 삽입체를 함유하는 클론까지 다양하였다. 다중 PCR 밴드의 생성 및 다중 서열 전기영동도의 발생에 의해 결정된 바, 3개의 다중 삽입체가 스크리닝된 110개의 돌연변이체에서 검출되었다.

<실시예 9>: 야생형 APP225와 에이. 플레우로뉴모니아 돌연변이체의 경쟁 감염(Competition Challenge)

회수된 집단에 부재하거나 매우 감소된 것으로 상기에서 확인된 유니크 독성약화 돌연변이체군 각각으로부터 대표적인 클론을 원래의 풀 플레이트로부터 단리하고 야생형 균주(AP225)와의 경쟁 감염 실험에 사용하여 트랜스포손 돌연변이에 의해 야기되는 상대적인 독성약화를 입증하였다. 돌연변이체 및 야생형 균주를 BHIV¹⁰에서 0.6-0.9의 OD₅₉₀까지 증식시켰다. 대략 5.0 x 10⁶CFU의 야생형 및 돌연변이 균주 각각을 4 ml의 BHI에 가하였다. 기관 튜브로의 기관내 투여에 의해 총 4 ml의 투여량으로 10-20 kg의 SPF 돼지를 감염시켰다. 감염 후 대략 20시간에 모든 생존 동물을 안락사시키고 폐를 적출하였다. 상기와 같이 폐 세척을 수행하였다. BHIV¹⁰N⁵⁰및 BHIV¹⁰N⁵⁰K¹⁰⁰상에서 플레이트를 계수하여 유입 배양물 및 폐 세척 샘플 둘다에서의 돌연변이체에 대한 야생형 균주의 상대적 수를 결정하였다. 경쟁 지수(CI)를 [돌연변이체 CFU /야생형 CFU]_유입/ [돌연변이체 CFU/야생형 CFU]_회수로서 계산하였다.

35개의 잠재적 트랜스포손 돌연변이체 중 경쟁 지수(CI)가 0.2 미만인 22개는 독성이 상당히 약화되어 있었다. STM 스크리닝 결과를 기준으로 할 때 독성이 약화된 것 같지 않은 트랜스포손 돌연변이체를 양성 대조군으로서 풀 중 하나로부터 선택하였다. 이 돌연변이체의 생체내 CI는 약 0.6이었다. CI가 0.8인 이 돌연변이체에 대해 시험관내 경쟁도 수행하였다. 그 후, 2개의 페닐알라닌 tRNA 사이의 삽입을 함유하는 돌연변이체를 확인하였다.

유니크 독성약화 단일-삽입 돌연변이체에 대한 경쟁 지수가 표 3에 기재되어 있다. atpG, pnp, exbB 및 App 돌연변이체에 대한 경쟁 지수는 이들 돌연변이체가 야생형 균주와 효과적으로 경쟁할 수 없으므로 독성이 약화되어 있음을 의미한다.

에이. 플레우로뉴모니아 돌연변이체의 독성 및 제안된 기능

돌연변이체	유사성	추정 기능 또는 공지된 기능	C.I.
AP20A6	atpH	ATP 합성효소	.009
AP7F10	atpG	ATP 합성효소	.013
AP17C6	IpdA	디히드로리포아미드 데히드로게나제	.039
AP11E7	exbB	철 화합물의 수송	.003, .003, .006
AP3H7	potD	스퍼미딘/퓨트레신 수송	.308
AP8H6	OmpP5	어드헤신/OmpA 동족체	.184
AP18H8	OmpP5-2	어드헤신/OmpA 동족체	.552
AP13E9	tig	펩티딜-프롤릴 이소머라제	.050
AP13C2	fkpA	펩티딜-프롤릴 이소머라제	<.001
AP15C11	pnp	폴리뉴클레오티드 포스포릴라제	.032
AP18F12	hupA	히스톤-유사 단백질	.001
AP20F8	dksA	dnaK 돌연변이의 투여량 의존성 억제제	.075
AP5G4	dnaK	열 충격 단백질-분자 샤페론 (chaperone)	.376
AP17C9	tRNA-leu	단백질 합성 (유전자 조절?)	.059
AP5D6	tRNA-glu	단백질 합성	.055
AP18B2	rpmF	단백질 합성	.112
AP10E7	yaeA	공지되어 있지 않음	.001
AP19A5	HI0379	공지되어 있지 않음	.061
AP10C10	apvA	공지되어 있지 않음	.157
AP18F5	apvB	공지되어 있지 않음	.103
AP2A6	apvC	공지되어 있지 않음	.091
AP2C11	apvD	공지되어 있지 않음	.014

exbB 돌연변이체가 3종의 다른 동물내에서 경쟁시킬 때 0.003, 0.003 및 0.006의 CI를 나타내는 것으로 보아 CI의 정확도는 매우 높았다. 큰 동물 연구에서 어떤 경쟁을 기초로 한 독성약화를 선정하는 경쟁 지수의 용도는, 하기 실시예11에 기재된 7종의 돌연변이체(n=8)로 돼지에서 실험한 예비 백신 접종의 결과를 기초로 더 확인하였다.

<실시예 10>: 에이. 플레우로뉴모니아 독성 유전자의 특성 규명

확인된 에이. 플레우로뉴모니아 유전자는 4가지의 광범위한 기능성 부류, 즉 생합성 효소, 세포성 수송 성분, 세포내 조절 성분 및 비공지된 것으로 분류할 수 있다.

F₀F₁H+-ATPase 복합체의 FI-γ서브유닛을 코딩하는 atpG 유전자는 ATP의 생산 또는 ATP의 가수분해에 의한 양성자 전달에 작용할 수 있다. 관련된 atpG 독성약화 돌연변이체도 피. 멀토시다(P. multocida)에서 확인하였다. F₁δ 서브유닛을 코딩하는 또다른 atp 유전자인 atpH도 확인하였다. atp 돌연변이체의 표현형으로는 비적응성 산-민감성 표현형 [Foster, J Bacteriol. 173: 6896-6902 (1991)], 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) [Garcia del Portillo et al., Infect Immun. 61: 4489-4492 (1993)] 및 피. 멀토시다(P. multocida)(상기)에서 독성이 상실되는 표현형, 및 헤모필러스 인플루엔자 Rd(Haemophilus influenzaeRd) [Gwinn et al., J Bacteriol. 179: 7315-20 (1997)]에서의 형질전환 빈도 및 수용능력 조절 유전자의 유도 둘다가 감소되는 표현형이 포함된다.

LpdA는 피루베이트 데히드로게나제 및 2-옥소글루타레이트 데히드로게나제로 이루어진 효소 복합체의 성분인 디히드로리포아미드 데히드로게나제이다. 독성과의 관련성은 비공지되어 있지만, LpdA의 생성은 인간으로부터의 살균 단백질에 노출될 때 살모넬라 티피무리움에서 유도되는데, 이는 이 유도가 외막을 복구하기 위한 시도와 관련될 수 있음을 암시한다 [Qi et al., Mol Microbiol. 17: 523-31 (1995)].

생장 및 생존에 필요한 희귀 화합물의 수송은 생체내에서 매우 중요하다. ExbB는 두 가지 이상의 다른 방법 [Karlsson et al., Mol Microbiol. 8: 389-96 (1993), Karlsson et al., Mol Microbiol. 8: 379-88 (1993)]으로 TonB와 상호작용하는, TonB 수송 복합체 [Hantke and Zimmerman, Microbiology Letters. 49: 31-35 (1981)]의 일부이다. 철 획득은 병원체에 필수적이다. 본 발명에서는 APP 및 피. 멀토시다(P. multocida) 둘다에서의 독성약화 exbB 돌연변이체를 확인하였다. 여러 가지 TonB-의존성 철 수용체가 다른 세균에서 확인된 바 있다 [Biswas et al., Mol. Microbiol. 24: 169-179 (1997), Braun, FEMS Microbiol Rev. 16: 295-307 (1995), Elkins et al., Infect Immun. 66: 151-160 (1998), Occhino et al., Mol Microbiol. 29: 1493-507 (1998), Stojiljkovic and Srinivasan, J Bacteriol. 179: 805-12 (1997)]. 에이. 플레우로뉴모니아는 철 획득을 위해 ExbB/ExbD/TonB 시스템에 의존할 가능성이 있는 2개의 트랜스페린-결합 단백질을 생산한다. PotD는 스퍼미딘(폴리아민)의 수송에 필요한 원형질막 주위공간의(periplasmic) 결합 단백질이다 [Kashiwagi et al., J Biol Chem. 268: 19358-63 (1993)]. 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae)과의 또다른 구성원인 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica)는 회복기 또는 외막 단백질 백신 접종된 소의 주요 면역원인 potD(Lpp38)의 동족체를 함유한다 [Pandher and Murphy, Vet Microbiol. 51: 331-41 (1996)]. 피. 헤몰리티카에서, PotD는 내막 및 외막 둘다와 결합하고 있는 듯하다. 선행 연구가 독성이 약화되어 있는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 potD 돌연변이체를 보였다고 하더라도 [Polissi et al., Infect. Immun. 66: 5620-9 (1998)], 독성 또는 보호 항체와의 관련성에 있어서 PotD의 역할은 공지되어 있지 않다.

헤모필러스 인플루엔자의 OMP P5와의 동족체를 제외하고 어드헤신 또는 독소와 같은 상대적으로 적은 "고전적 독성 인자"를 확인하였다. 에이치. 인플루엔자의 OMP P5는 OmpA 포린 단백질족과 관련된 주요 외막 단백질이다 [Munson et al., M Infect Immun. 61: 4017-20 (1993)]. 분류되지 않은 헤모필러스 인플루엔자의 OMP P5는 독성, 및 뮤신과 상피세포의 결합에 기여하는, 선상 구조로 발현되는 섬모 서브유닛 단백질 [Sirakova et al., Infect Immun. 62: 2002-20 (1994)]을 코딩하는 것으로 밝혀진 바 있다 [Miyamoto and Bakaletz, Microb Pathog. 21: 343-56 (1996), Reddy et al., Infect Immun. 64: 1477-9 (1996), Sirakova et al., Infect Immun. 62: 2002-20 (1994)]. OMP P5 동족체를 코딩하는 것으로 보이는 두 가지 다른 ORF를 확인한 것도 대단한 발견이었다. 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi)의 매우 유사한 두 단백질인 MOMP 및 OmpA2의 경우에도 두 가지 다른 ORF가 확인되었다. 두 ORF가 섬모의 생성에 기능적으로 관련되어 있는지, 그리고 두 ORF의 존재가 중복되거나 보충하는 기능을 나타내는 별개의 중복을 나타내는지를 밝히는 것이 남아 있다. 흥미롭게도, 두 OMP P5 돌연변이체는 다른CI값을 갖는 것으로 보이는데, 이는 단지 한 복제본에 대한 본성 및 기능성에서의 차이점을 암시한다. OMP P5는 만성 감염 동안 분자 변이를 받는 것으로 보이지만 [Duim et al., Infect Immun. 65: 1351-1356 (1997)], 이는 많은 유전자의 구별 발현으로 인한 "유형 변경(type switching)"이 아니라 아미노산 변화를 초래하는 점 돌연변이를 받는 한개의 유전자에 한정되는 것으로 보인다.

단백질 폴딩 효소는 원형질막 주위공간 및 세포외 단백질의 효율적인 폴딩에 중요한 보조물이고, 펩티딜-프롤릴 이소머라제 활성을 보이는 생성물을 발현하는 두 유전자, 즉 fkpA 및 tig(촉진 인자)를 확인하였다. FkpA는 FK506-결합 단백질족의 구성원인 원형질막 주위공간 단백질이다 [Horne and Young, Arch Microbiol. 163: 357-65 (1995); Missiakas et al., Mol Microbiol. 21: 871-84 (1996)]. FkpA는 살모넬라 티피무리움의 세포내 생존에 기여하는 것으로 밝혀진 바 있고 [Horne et al., Infect Immun. 65: 806-10 (1997)], 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 동족체인 mip [Engleberg et al., Infect Immun. 57: 1263-1270 (1989)]는 대식세포의 독성 및 감염의 원인이다 [Cianciotto et al., J. Infect. Dis. 162: 121-6 (1990); Cianciotto et al., Infect. Immun. 57 : 1255-1262 (1989)]. Tig, 즉 촉진 인자 [Crooke and Wickner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5216-20 (1987), Guthrie, and Wickner, J Bacteriol. 172: 5555-62 (1990), Hesterkamp, and Bukau., FEBS Lett. 389: 32-4 (1996)]는 전형적인 FKBP 영역 [Callebaut and Mornon, FEBSLett. 374:211-215 (1995)]을 포함하는 펩티딜 프롤릴 이소머라제이지만, FK506에 의해 영향받지 않는다 [Stoller et al.,EMBO J. 14:4939-48 (1995)]. Tig는 리보솜 및 발생초기의 폴리펩티드쇄와 관련되어 있는 것으로 밝혀진 바 있다 [Hesterkamp et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 4437-41 (1996), Stoller et al., EMBO J. 14: 4939-48 (1995)]. 가능한 역할로는 대장균에서의 세포 분열에 대한 비공지된 영향 [Guthrie, and Wickner, J Bacteriol. 172: 5555-62 (1990)], 스트렙토코커스 파이오젠스(Streptococcus pyogenes) 시스테인 프로테이나제의 분비 및 활성화에서의 역할 [Lyon et al., EMBO J. 17: 6263-75 (1998)], 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 기아 조건하의 생존 [Gothel et al., Biochemistry 37:13392-9 (1998)]이 있다.

세균성 병원체는 숙주내의 매우 다양한 환경 조건하에서 생존하기 위해 유전자 발현을 통합적으로 조절하는 많은 기작을 사용한다. mRNA 안정성에서의 차이는 원핵생물에서 유전자 발현을 조절할 수 있다 [Belasco and Higgins, Gene 72: 15-23 (1988)]. 예를 들어, rnr (vacB)는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)에서 플라스미드에 포함된 독성 유전자를 발현시키는데 필요하고 [Tobe et al., J Bacteriol. 174: 6359-67 (1992)], RnaseR 리보뉴클리아제를 코딩한다 [Cheng et al., J. Biol. Chem. 273: 14077-14080 (1998)]. PNP는 mRNA의 분해에 관여하는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제이다. 무효(null) pnp/rnr 돌연변이체는 치사성이므로 상기 pnp와 rnr 유전자의 기능이 중복되어 있을 가능성이 있음을 알 수 있다. 따라서, rnr 및 pnp 둘다 독성 유전자 발현의 조절에 관여할 가능성이 있다. 피. 멀토시다(P. multocida)의 pnp 돌연변이체는 패혈성 생쥐 모델 (실시예 2)에서 독성을 나타내지 않는다. 기타 pnp-관련 표현형으로는 바실러스 서브틸리스에서의수용능력 결핍(competence deficiency) 및 한랭 민감성이 있다 [Wang and Bechhofer, J Bacteriol. 178: 2375-82 (1996)].

HupA는 대장균에서 HupB와 결합하여 HU 단백질을 구성하는 세균 히스톤-유사 단백질이다. hupA 및 hupB 단독 돌연변이체는 어떠한 관찰 가능한 표현형도 나타내지 않는다는 보고가 있지만 [Huisman et al., J Bacteriol. 171: 3704-12 (1989), Wada et al., J Mol Biol. 204: 581-91 (1988)], hupA-hupB 이중 돌연변이체는 한랭 민감성을 보이고 열 충격에 민감하고 많은 형태의 부위-특이적 DNA 재조합에서 차단되는 것으로 밝혀진 바 있다 [Wada et al., J Mol Biol. 204: 581-91 (1988), Wada et al., Gene. 76: 345-52 (1989)]. hupA가 독성에 직접적으로 관여한다는 것을 보이는 제한된 데이타가 있다 [Turner et al., Infect Immun. 66: 2099-106 (1998)]. hupA 독성약화의 기작은 모르는 채로 남아있다.

DnaK는 다양한 스트레스성 환경 변화에 대한 조절 반응에 관여하는, 잘 공지되어 있고 매우 보존적인 열 충격 단백질이다 [Lindquist and Craig, Annu Rev Genet. 22: 631-77 (1988)]. DnaK는 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)에서 대식세포에 의한 대식작용 후에 가장 많이 유도되는 스트레스 단백질 중 하나이기도 하고 [Yamamoto et al.. Microbiol Immunol. 38: 295-300 (1994)], 브루셀라 수이스(Brucella suis) dnaK 돌연변이체는 인간 대식세포-유사 세포내에서 복제하지 못하였다 [Kohler et al., Mol Microbiol. 20: 701-12 (1996)]. 반대로, 또다른 세포내 병원체인 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)는 대식작용 후 dnaK의 유도를 보이지 않았다 [Hanawa et al.,Infect Immun. 63: 4595-9 (1995)]. 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)의 dnaK 돌연변이체는 ToxR의 생산 및 시험관내에서의 그의 조절된 독성 인자에 영향을 주지만, 생체내에서 생장된 세포로부터 유사한 결과가가 얻어지지는 않았다 [Chakrabarti et al., Infect Immun. 67: 1025-1033 (1999)]. 에이. 플레우로뉴모니아 dnaK 돌연변이체의 CI는 여전히 양성 대조군 균주의 대략 절반이지만 대다수의 독성약화 돌연변이체보다 더 높았다.

DksA는 대장균의 dnaK 돌연변이체에 있어서 필라멘트성 및 온도-민감성 생장의 투여량-의존성 억제제이다 [Kang and Craig, J Bacteriol. 172: 2055-64 (1990)]. DksA에 대해 정의된 분자 기능은 현재 없지만, 상기 DksA 유전자는 닭 및 새로 부화된 병아리에서 살모넬라 티피무리움의 독성에 매우 중요한 것으로서 밝혀진 바 있다 [Turner et al., Infect Immun. 66: 2099-106 (1998)]. DksA 돌연변이체는 글루코스 또는 히스티딘이 단독 탄소원인 경우 잘 생장하지 못하지만, 글루타민 또는 글루타메이트가 단독 탄소원인 경우 잘 생장한다는 것도 관찰되었다. 이 관찰은 dksA 돌연변이체가 글루타메이트의 생합성에 있어서 다소 손상되어 있음을 의미할 수 있다 [Turner et al., Infect Immun. 66: 2099-106 (1998)].

단백질 합성에 작용하는 tRNA-leu, tRNA-glu 및 rpmF 유전자를 확인하였다. 단백질 합성을 제외하고, tRNA는 펩티도글리칸 합성 [Stewart et al., Nature 230: 36-38 (1971)], 포르피린 고리(porphyrin ring) 합성 [Jahn et al., Trends Biochem Sci. 17: 215-8 (1992)], 분해를 위한 단백질 표적화 [Tobias et al., Science 254: 1374-7 (1991)], 번역후 (post-translation) 아미노산을 단백질에 부가하는 것 [Leibowitz and Soffer, B. B. R. C. 36: 47-53 (1969)], 및 세균-진핵생물 상호작용의 매개 [Gray et al., J Bacteriol. 174: 1086-98 (1992), Hromockyj et al., Mol Microbiol. 6: 2113-24 (1992)]에 있어서 매우 다양한 기능을 한다. 보다 구체적으로, tRNA-leu는 전사 약화 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8127-8131 (1986)], 슈도모나스 시린개 (Pseudomonas syringae)에 의한 병변 형성 [Rich and Willis, J Bacteriol. 179: 2247-58 (1997)], 및 병원성 대장균의 독성 [Dobrindt et al., FEMS Microbiol Lett. 162: 135-141 (1998), Ritter et al., Mol Microbiol. 17: 109-21 (1995)]과 관련되어 있다. 본 발명자들이 찾은 tRNA가 에이. 플레우로뉴모니아에 있는 tRNA-leu의 소수 종을 나타내는지는 공지되어 있지 않다. 이와 관계없이, tRNA-leu가 다양한 기능 중 임의의 한 기능을 가질 수 있을 가능성이 있다. RpmF는 대장균에서 지방산 생합성 효소를 함유하는 오페론의 일부이기도 한 유전자의 산물인 리보좀 단백질이다. fab 유전자 및 rpmF의 동일한 클러스터링(clustering)이 헤모필러스 인플루엔자에서 일어난다고 하더라도 악티노바실러스 플레우로뉴모니아에서도 이러한 균주군생성이 일어나는지를 밝히기 위한 추가 연구가 필요할 것이다 [Fleischmann et al., Science 269: 496-512 (1995)]. fab 유전자의 발현은 rpmF의 상류로부터 발생된 전사체에 반드시 의존하지는 않는데, 이는 rpmF내에서 확인된 2차 프로모터가 있기 때문이다 [Zhang and Cronan, Jr., J Bacteriol. 180: 3295-303 (1998)].

독성약화 돌연변이체의 최종 클래스로는 공지된 기능이 없는 유전자 또는 이전에 밝혀진 바 없는 유전자 내에서의 돌연변이가 있다. yaeA 및 HI0379의 동족체는 이미 대장균 [Blattner et al., Science 277: 1453-1474 (1997)] 및 헤모필러스 인플루엔자 [Fleischmann et al., Science 269: 496-512 (1995)] 각각에서 밝혀진 바 있다. 남아 있는 비공지된 유전자는 악티노바실러스 플레우로뉴모니아 독성 유전자(apv)로 지칭하였다. apvC 유전자는 HI0893과의 상당한 유사성을 보이지만, 지방산 반응 조절자 Bm3RI [Palmer, J Biol Chem. 273: 18109-16 (1998)]과 유사한 전사 억제제로서 제시된 HI0893의 유사성은 의심스럽다. apvD 유전자는 기능이 공지되어 있지 않은, 대장균의 막 단백질로 추정되는 단백질(b0878) [Blattner et al., Science 277: 1453-1474 (1997)]과도 매우 유사하다. 두 가지 다른 비공지된 유전자인 apvA 및 apvB는 공개 데이타베이스와 별로 일치되지 않았다.

<실시예 11>: 에이. 플레우로뉴모니아 돌연변이체의 안정성 및 효능

SPF 돼지 (4-5 주된 것, 3-10 kg)의 9 군 (n=8)을 사용하여 독성약화 생백신 균주로서 7종의 에이. 플레우로뉴모니아 돌연변이체의 안정성 및 효능을 측정하였다. 1일째, 7 군을 각 돌연변이체의 10¹⁰CFU로 비강내 감염시켰다. 1일 및 15일째, 시판되는 백신인 플레우로뮨(Pleuromune; Bayer)으로 1 군을 백신 접종하고, 또다른 1 군을 백신 접종하지 않았다. 29일째 날, 모든 군을 돼지 당 1-5 x 10⁵CFU의 야생형 APP225로 비강내 감염시켰다. 연구 42일째, 모든 생존 동물을 안락사시키고 부검하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

에이. 플레우로뉴모니아 돌연변이체의 효능

	비강내 감염 후 사망률％
백신	백신접종	감염
플레우로뮨	0	37.5
exbB	0	0
tig	12.5	0
fkpA	12.5	0
HI0385	50	0
pnp	0	0
yaeE	0	0
atpG	0	0
없음	N/A	50.0

exbB, atpG, pnp 및 yaeA 돌연변이체는 10¹⁰CFU의 투여량으로 비강내 투여할 때 전혀 사망을 초래하지 않았다. fkpA 및 tig 돌연변이체 군은 각각 1마리가 사망했고, HI0379 군 (실시예 9에 나타낸 바와 같이 시험된 7가지 돌연변이체의 CI는 2000년 4월 6일 가장 높았음)은 4마리가 사망했다. 이 모델을 사용한 야생형 LD₅₀은 대체적으로 1 X 10⁷CFU인데, 이는 이들 돌연변이체 각각이 100 배 이상 독성이 약화되어 있고 CI와 독성약화 사이에 합리적인 연관성이 있음을 의미한다.

상기 실시예에 기재된 바와 같은 본 발명에 있어서 수많은 개량 및 변형이 당업자에게 자명할 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항으로 한정된다.

Claims (51)

1. 서열 1, 3, 7, 9, 21, 25, 27, 29, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 104, 108, 112, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128 및 130 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 종 동족체로 표시되는 유전자에 그 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 활성이 감소되는 돌연변이를 포함하는 그람 음성 세균.
2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되는 것인 그람 음성 세균.
3. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 그람 음성 세균.
4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 전부 또는 일부가 결실되는 것인 그람 음성 세균.
5. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실되는 것인 그람 음성 세균.
6. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자에 삽입이 발생하며, 상기 삽입으로 인해 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 그람 음성 세균.
7. 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 종 동족체로 표시되는 유전자에 그 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 활성이 감소되는 돌연변이를 포함하는 독성약화 파스테우렐라세아 (Pasteurellaceae) 세균.
8. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
9. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
10. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 전부 또는 일부가 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
11. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
12. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자에 삽입이 발생하며, 상기 삽입으로 인해 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
13. 제7항에 있어서, 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 헤모필러스솜너스(Haemophilus somnus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
14. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
15. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
16. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 전부 또는 일부가 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
17. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
18. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자에 삽입이 발생하며, 상기 삽입으로 인해 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
19. 제13항에 있어서, 피. 멀토시다(P. multocida) 세균인 독성약화 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
20. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
21. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
22. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 전부 또는 일부가 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
23. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
24. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자에 삽입이 발생하며, 상기 삽입으로 인해 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
25. 제13항에 있어서, 에이. 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) 세균인 독성약화 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
26. 제25항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
27. 제25항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
28. 제25항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 전부 또는 일부가 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
29. 제25항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 99％ 이상이 결실되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
30. 제25항에 있어서, 상기 돌연변이의 결과로써 상기 유전자에 삽입이 발생하며, 상기 삽입으로 인해 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현이 감소되고(거나) 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 불활성 유전자 산물이 발현되는 것인 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 세균을 포함하는 면역원성 조성물.
32. 제31항의 면역원성 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물.
33. 제32항에 있어서, 면역보강제를 더 포함하는 백신 조성물.
34. 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39,41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 종 동족체로 표시되는 유전자에 그 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 활성이 감소되는 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는 그람 음성 세균의 제조 방법.
35. 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 종 동족체로 표시되는 유전자에 그 돌연변이의 결과로써 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물의 활성이 감소되는 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는 독성약화 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 세균의 제조 방법.
36. 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132,134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163 및 164에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 정제 및 단리된 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 폴리뉴클레오티드.
37. 서열 1, 3, 7, 9, 21, 25, 27, 29, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 104, 108, 112, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128 및 130에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 정제 및 단리된 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 폴리뉴클레오티드.
38. a) 제37항의 폴리뉴클레오티드,

    b) 폴리뉴클레오티드 (a)에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

    c) 중간 정도의 엄격 조건하에서 폴리뉴클레오티드 (a) 또는 (b)의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되며, 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae)의 독성 유전자 산물을 코딩하는, 정제 및 단리된 폴리뉴클레오티드.
39. 서열 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34, 38, 40,42, 52, 54, 56, 59, 61, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 및 165에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는, 정제 및 단리된 파스테우렐라세아(Pasteurellaceae) 폴리뉴클레오티드.
40. 제39항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
41. 제40항의 DNA를 포함하는 벡터.
42. 제41항에 있어서, DNA가 발현 조절 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터인 벡터.
43. 코딩 폴리펩티드가 발현되도록 하는 방식으로 제40항의 DNA가 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
44. 영양 배지에서 제43항의 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포 또는 상기 영양 배지로부터 코딩된 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법.
45. 제44항의 방법에 의해 생산되는 정제된 폴리펩티드.
46. 서열 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 52, 54, 56, 59, 61, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 및 165에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 정제된 폴리펩티드.
47. 제46항의 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체.
48. 제47항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
49. 세균 추출물을 상기 모노클로날 항체와 접촉시켜 상기 모노클로날 항체의 결합이 없음을 검출하는 단계를 포함하는, 제1항, 제7항, 제13항 또는 제19항의 세균을 확인하기 위해 제39항의 모노클로날 항체를 이용하는 방법.
50. 서열 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 52, 54, 56, 59, 61, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 101, 103, 105,107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 및 165 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 유전자 산물의 발현 또는 활성을 방해하는 능력에 대해 잠재적 약제를 분석하여, 상기 유전자 산물의 발현 또는 활성을 방해하는 약제를 찾아내는 단계를 포함하는 항균제의 확인 방법.
51. a) 서열 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 52, 54, 56, 59, 61, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 및 165에 기재된 유전자 산물의 발현 또는 활성을 측정하는 단계,

    b) (a)에서의 유전자 산물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계,

    c) 시험 화합물의 존재하에 유전자 산물의 발현 또는 활성을 측정하는 단계, 및

    d) 시험 화합물 부재시에 나타나는 발현 또는 활성에 비해 시험 화합물의 존재시에 나타나는 유전자 산물의 발현 또는 활성이 감소되는 경우에 시험 화합물이 항균제임을 확인하는 단계

    를 포함하는 항균제의 확인 방법.