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KR20010103596A - 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서 - Google Patents

섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서 Download PDF

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KR20010103596A
KR20010103596A KR1020017004377A KR20017004377A KR20010103596A KR 20010103596 A KR20010103596 A KR 20010103596A KR 1020017004377 A KR1020017004377 A KR 1020017004377A KR 20017004377 A KR20017004377 A KR 20017004377A KR 20010103596 A KR20010103596 A KR 20010103596A
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Abstract

이종의 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하고 분비하기 위한 섬유상의 진균성 숙주의 분야에서의 신규한 형질전환 시스템을 개시한다. 또한 본 발명은 경제적인 방법으로 다량의 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 공정을 포함한다. 본 시스템은크리소스포륨속, 보다 바람직하게는크리소스포륨 루크노웬스및 그들의 유도 돌연변이체의 형질전환되고 트랜스펙션된 진균성 균주를 포함한다. 또한크리소스포륨코딩 서열 뿐 아니라크리소스포륨유전자의 발현-조절 서열을 포함하는 형질전환체를 포함한다.

Description

섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템: 크리소스포륨속에서 {TRANSFORMATION SYSTEM IN THE FIELD OF FILAMENTOUS FUNGAL HOSTS: IN CHRYSOSPORIUM}
유전자 발현 및 형질전환 방법에 사용되는 다수의 숙주가 종래의 발명에 개시되어 있다. 박테리아, 예컨대에쉐리히아 콜라이. 이. 콜라이가 자주 언급되지만 다수의 단백질 또는 폴리펩티드의 분비가 불가능한 미생물이고 따라서 공업적 규모로 단백질 또는 폴리펩티드의 생산에 사용하기 위한 숙주 세포로서는 바람직하지 않다. 이.콜라이의 추가적인 단점으로서, 이것은 일반적으로 박테리아에 대해 유효한 것인데, 원핵생물은 수많은 진핵생물의 단백질 또는 폴리펩티드를 활성형으로 생산하는데 필요한 추가적인 개질을 제공할 수 없다는 것이다. 단백질 또는 단백질의 적합한 접힘의 글리코실레이숀은 활성 단백질 또는 폴리펩티드가 생산되는 것을 확인하기 위해 필요한 공정의 예이다. 상기 공정을 확인하기 위하여 때로는 포유류의 세포를 이용할 수 있다. 그러나 그러한 세포의 단점은 종종 그들이 유지되는 것이 어렵고 고가의 배지를 필요로 한다는 점이다. 따라서 상기 형질전환 시스템은 공업적 수준으로 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 데에 실질적이지 않다. 그들은 상대적으로 소량을 필요로하는 상당히 고가의 약학적 화합물에 유효한 가격일 수 있으나, 공업적 효소에는 유효한 가격이 아닌것은 확실하다.
다수의 진균성 발현 시스템은 예컨대아스페르길러스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길러스 니둘란스 (Aspergillus nidulance), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)를 발달시켰다. 기타의 것이 다수 제안되었으나, 다양한 이유들로 광범위하게 허용되거나 이용되지는 않았다. 일반적으로 이상적인 숙주는 다수의 기준을 만족시켜야 한다.
-이상적인 숙주는 저가의 배지를 이용하여 용이하게 발효되어야 한다.
-이상적인 숙주는 배지를 효율적으로 이용하여야 한다.
-이상적인 숙주는 고수율로 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하여야 한다. 즉, 생물체량 비에 비해 고단백질을 나타내야만 한다.
-이상적인 숙주는 단백질 또는 폴리펩티드를 효율적으로 분비할 수 있어야 된다.
-이상적인 숙주는 소정의 단백질 또는 폴리펩티드의 분리 및 정제를 용이하게 하여야 한다.
-이상적인 숙주는 소정의 단백질 또는 폴리펩티드를 가공하여 추가적인 활성 또는 개질 단계를 필요로 하지 않는 활성형으로 생산할 수 있어야 한다.
-이상적인 숙주는 용이하게 형질전환되어야 한다.
-이상적인 숙주는 광범위한 발현 조절 원소가 사용되어 용이하게 적용하고 다능할 수 있도록 하여야 한다.
-이상적인 숙주는 사용하기에 저가인 용이하게 선택할 수 있는 마아커들을 사용할 수 있어야 한다.
-이상적인 숙주는 안정한 형질전환체를 생산하여야 한다.
-이상적인 숙주는 발현된 단백질 또는 폴리펩티드에 해롭지 않은 조건, 예컨대 저점성도, 저전단 하에서 배양가능하여야 한다.
광범위하게 사용되는 것으로 아직 밝혀지지 않은 진균성 시스템은 예컨대,아스페르길러스(Aspergillus) 및 트리코데르마(Trichoderma)와 함께뉴로스포라 (Neurospora), 포도스포라(Podospora), 엔도티아(Endothia), 무코르(Mucor), 코코이볼루스(Cochoibolus) 및 피리쿨라리아(Pyricularia)를 제안하고 있는 Berka 등에 의한 미국 특허 5,578,463호에 개시되어 있다. 그러나아스페르길러스및트리코데르마에 대한 형질전환 및 발현의 설명만이 제공되어 있을 뿐, 다른 제안된 숙주 중 어느것에 관해서도 상세하게 설명되어져 있지 않다.
노보 노르디스크의 WO 96/02563호 및 미국 특허 제5,602,004호, 제5,604,129호 및 제5,695,985호는아스페리길러스및트리코데르마시스템의 단점을 개시하면서 기타의 진균류의 배양 조건이 대규모 단백질 생산에 보다 적합할 것이라고 제안 하고 있다. 임의의 형질전환된 배양물에 제공된 유일한 실시예는마이셀리오프토라 테르모필라, 아크레모늄 망아바멘스, 티엘라비아 테레스트리스및스포로트리컴 셀룰로필럼균주에 대한 실시예이다.스포로트리컴균주는 다른 균주에서 상기 결과를 유발하지 않는 발효 조건하에서 녹색 색소를 분해시키고 생산하는 것으로 기록되어 있다.티엘라비아 테레스트리스의 비-포자형성 돌연변이체는 그의 형태에 의하여 선택된 생물로서 기재되어 있다. 그러나티엘라비아및아크레모늄의 프로토플라스팅(protoplasting) 효율(이로서 사용되는아크레모늄균주는 사용되는티엘라비아균주의 불완전한 상태이다)은 저조하고 하이그로마이신은 선택 마아커로서 유용하지 않다는 것을 언급하고 있다. 기타로서 다수가 그들의 형태에 의해 잠재적으로 유용한 것으로 제시되고 있으나 그들의 형질전환은 기재되어 있지 않다.
제안된 균주로는코리나스쿠스(Corynascus), 테르모아스쿠스(Thermoascus), 케토늄(Chaetinium), 크테노마이시스(Ctenomyces), 스키탈리듐(Scytalidium) 및 탈라로마이시스(Talaromyces)가 있다. 형질전환된 숙주들은 소량의 도입된휴미콜라크실라나제만이티엘라비아가 소량 생산되면서 생산되는 것으로 언급되나, 그러한 정보는 모호하며,티엘라비아가 최선의 태양이라고 실제적으로 추론할 수 있을 것이다. 본 참고문헌의 명명법은 1994년의 공업적 진균 ATCC 명칭에 근거하고 있다. 따라서 고도의 이종 발현이 달성되지 않았으며, 요구되는 형태와 발현도 사이의 긍정적인 상관성이 실제로 유래될 수 없다는 것은 명백하다. 어떤 상관성이 있다면,부정적일 가능성이 있다. 1996 ATCC 진균성 분류에 따르면,스포로트리큠 테르모필룸ATCC 20493은마이셀리프토라 테르모필라균주이다. 현재 상기 균주는마이셀리오프토라 테르모필라로서 동정되었다. 상기 분야의 예측불가능성은 이러한 최근의 발견으로부터 명백하다.
또한 알리슨 등 (Curr.Genetics21:225-229,1992)은휴미콜라 그리세아 바.트레모이디아의 형질전환을 초산리튬법 및휴미콜라효소-암호화 서열을 이용하여 개시하고 있으나, 그러한 균주의 이종의 단백질 발현에 관해서는 보고되지 않았다.
1997년에 Hawaii Biotechnology Group이 키모신과 같은 포유류 펩티드의 발현에 관한 형질전환된뉴로스포라에 대하여 특허를 등록하였다. 영양요구뉴로스포라 크라사의 형질전환이 스페로플라스트에서 일어났다. 내인성 전사 조절 영역이 도입되고 대비형질전환이 실시되었다. 기타의 숙주들 및 기타의 형질전환 프로토콜에 관해서는 아무런 언급도 없었다. 개시로부터 발현정도에 관하여 나타내지 않았다. 면역기술(소량의 단백질을 검출하는데 유용함)이 단백질의 존재를 나타내는 데 사용되는 유일한 기술이라고 할 때, 발현의 정도가 고도한 지 여부는 의심스럽다. 단백질의 실질적인 분리는 개시되어 있지 않다.
노보 노르디스크의 WO 97/26330호는 이종의 폴리펩티드를 생산하기 위한 개선된 특성을 가지는 섬유상의 진균성 모세포의 돌연변이체를 얻는 방법을 제시하고 있다. 상기 방법은 우선 특정의 변경된 형태를 밝힌 후에 형질전환체가 부모에 비해 보다 많은 이종의 폴리펩티드를 생산하는 지를 분석하는 단계를 포함한다. 상기 방법은푸사륨A3/5 및아스페르길러스 오리자의 균주에 대해서만 설명된다. 상기방법은아스페르길러스, 트리코데르마, 티엘라비아, 푸사륨, 뉴로스포라, 아크레모늄, 톨리플로카듐, 휴미콜라, 스키탈리듐, 아미셀리오프토라또는무코르에 대해 적용가능하도록 제안되어 있다. 전술한 바와 같이, 본 분야의 예측불가능성 및 인용된 적용예에 대한 본 방법의 예측불가능성은 성공에 대한 합리적인 기대를 가진 일반적으로 적용가능한 교시를 제공하지 못한다.
본 발명은 이종의 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키고 분비하기 위한 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 신규한 형질전환 시스템에 관한 것이다. 또한 본 발명은 경제적인 방식으로 다량의 폴리펩티드를 생산하는 공정에 관한 것이다. 상기 시스템은크리소스포륨속(Chrysosporium), 보다 자세히는크리소스포륨 루크노웬스 (Chrysosporium lucknowense)의 형질전환된 또는 트랜스펙션된 진균성 균주 및 그들의 돌연변이체 또는 유도체를 포함한다. 또한크리소스포륨속을 코딩하는 서열을 함유하는 형질전환체를 포함한다. 신규한 돌연변이체크리소스포륨균주가 그들로부터 유도된 신규한 효소와 함께 개시되어 있다.
도1은 실시예에 기재된 바와 같은 Western 블롯이다.
도2는 pUT720 맵이다.
도3은 pUT970G 맵이다.
도4는 pUT1064 맵이다.
도5는 pUT1065 맵이다.
도6은 pF6g 맵이다.
도7은 pUT1150 맵이다.
도8은 pUT1152 맵이다.
도9는 pUT1155 맵이다.
도10은 pUT1160 맵이다.
도11은 pUT1162 맵이다.
도12: F-60-31 CF 샘플의 DEAE-Toyoperal 이후, NB-분절의 Macro Prep Q 상의 이온 교환 크로마토그래피.
도13: Cl 단백질에 대한 30kD(pl 8.9) 및 90 kD (pl 4.2) 프로테아제 활성의 pH 코스 (50℃, 30 분. 항온배양).
도14: 50°에서 F 60-31 CF의 NBNB-분절 (Macro Prep Q) 의 크실라나제 활성에 대한 "알칼리성" 프로테아제 30 kD (pI 8.9) 의 효과.
도15: 50℃에서 60-8 UV-conc 샘플의 결합된 분절 #44-45 (DEAE-Toyopearl)에서의 단백질의 CMCase 활성에 대한 "중성" 프로테아제 90 kD (pI 4.2)의 효과.
도16: 폴리갈라투로나제 (pI 4.4) 65 kD 에 의한 폴리갈라투론산의 완벽한 가수분해: 50℃, pH 4.5; 농도 pfPGA=5 g/l, 단백질 농도 = 0.1 g/l.
도17: F-60-43 UF-conc의 폴리갈락투로나제 활성의 pH- 및 온도 의존성
도18: 55 kD CBH (pI 4.4)용 셀로비오스에 의한 MUF-셀로비오시드에 대한 활성 억제: pH 4.5, 40℃.
도19: 아비셀 (40℃, pH 5, 25 min)에 대한 25 kD 엔도 (pI 4.1) 및 55 kD CBH (pI 4.4) 사이이 상승 효과.
도20: F-60-8 UF-conc. 샘플 (50℃, pH 5)의 결합된 분절로부터 분리된 효소에 의한 CMC (a) 및 avicel (b)의 완벽한 가수분해: CMC 및 아비셀의 농도- 5 g/l, 25kD 엔도의 농도 = 0.01 g/l, 43 kD 엔도의 농도 = 0.02 g/l; 1-25 kD 엔도 (pI 4.1), 2-43 kD 엔도 (pI 4.2).
도21: 55 kD CBH (pI 4.4)에 의한 CMC (1) 및 아비셀 (2) 의 완벽한 가수분해, 글루코노-δ-락톤 (50℃, pH 4.5) 부재하에서 (a) 글루코노-δ-락톤 (50℃, pH 4.5) 존재하에서 (b): CMC 및 아비셀의 농도 = 5 g/l, 단백질의 농도 = 0.1 g/l,글루코노-δ-락톤의 농도 = 5 g/l.
도22: F-60-8 UF-conc. 샘플에서 분리된 효소의 CMCase 및 RBB-CMCase 활성의 pH-의존성.
도23: 55 kD CBH (pI 4.4)의 CMCase and RBB-CMCase 활성의 pH-의존성.
도24: F-60-8 UF-conc. 샘플의 결합된 분절로부터 분리된 효소의 CMCase 활성 (pH 4.5)의 온도 의존성.
도25: F-60-8 UF-conc. 샘플의 결합된 분절로부터 분리된 효소의 pH-안정성(50℃): 1-55 kD CBH (pI 4.4), 2-25 kD 엔도 (pI 4.1), 3-43 kD 엔도 (pI 4.2).
도26: F-60-8 Uf-conc. 샘플의 결합된 분절로부터 분리된 효소의 흡수.
본 출원인은 전술한 필요조건을 만족시키는아스페르길리및트리코데르마의 이용을 단순하게 하는 대안적인 진균성 발현 시스템을 개시하고 있다. 이 신규한 시스템은 종래 기술에서 교시되거나 제안된 바 없다. 본 발명에 따른 이 신규 시스템은 형질 전환 속도가 자주 사용되는트리코데르마 리세이시스템에 대한 것 보다도 높다는 추가적인 장점을 제공한다. 또한 배양 조건은 발현된 폴리펩티드에 대한 장점이 되는 추가적인 보너스를 제공한다. 본 명세서 및 첨부한 청구범위에서 본 발명의 발현 시스템의 생성물로서 "폴리펩티드" 또는 "특정 폴리펩티드"는 참고문헌에 인용되고, 또한 이러한 용어는 예컨대 특정 기능 및/또는 제2 및/또는 제3의 구조를 가진 폴리펩티드와 같은 단백질을 포함한다.
배양 배지의 pH는 중성이나 알칼리성일 수 있으며 따라서 공격적이며 잠재적인 불활성화 산성 pH에 생성된 단백질 또는 폴리펩티드를 가하도록 하지 않는다. 또한 단백질 또는 폴리펩티드가 산성화된 조건에 대해서 보다 적합한 경우에는 pH 4와 같은 산성 pH에서 배양시키는 것도 가능하다. 적절하게는 배양은 pH 가 4.0-10.0 의 범위에서 일어날 수 있다. 그러나 숙주 균주가 예컨대 pH 6 내지 9 사이에서 보다 나은 성장을 나타내므로 중성에서 알칼리성 pH로 하는 것이 바람직하다. pH 8 이상으로까지, 심지어는 10까지 알칼리성 온도를 상승시키는 것은 일부 경우에는 좋은 대안이다. 또한 상기 숙주 균주의 배양 온도가 임의의 형태의 생성된 폴리펩티드의 안정성에 유익하다. 배양 온도는 25 ∼ 43 ℃가 적합한다. 40 ℃ 에서 23 ℃ 및 30 ℃까지 범위의 온도 또한 적용하기 유리하다. 명백하게 상기 조건은 포유류의 폴리펩티드 생성을 위해 특별한 관심 대상이다. 선택된 온도는 배양의 가격 효율성 및 폴리펩티드 또는 배양 균주의 민감성에 의존할 것이다. 상기 조건은 당업계에서 통상적으로 이루어 지는 바와 같이, 개개의 경우마다 부당한 부담 없이 당업자에 의해 판단될 수 있다.
점성도와 생물체량의 상관성 및 생성된 단백질 양이 본 발명에 따른 숙주에 아주 유리하다는 것이 확인되었다.트리코데르마 롱기브라키아툼(이전에트리코데르마 리세이로 공지됨) 및아스페르길러스 니거와 비교하였다. 각각의 최적화된 조건하에서트리코데르마 롱기브라키아눔은 2.5 ∼ 5 g/l 생물체량을 산출하였고,아스페르길러스 니거는 5 ∼ 10 g/l의 생물체량을 산출하였으며, 본 발명에 따른 숙주는 0.5 ∼ 1 g/l의 생물체량을 산출하였다. 따라서 시판되는 균주에 비해서 5 내지 10 배의 개선이 있었다. 이러한 시판되는 균주는 스스로 당엄계에서 단백질의 우수한 생산자로 여겨지고 있으며 공업적으로 단백질 생산을 위하여 사용되고 있다. 이들은 대규모의 공업적 발효기에서 생육가능하게 발달되고 성장된 최적의 조건하에서 배양되어 왔다. 동일한 균주가 본 발명의 숙주 배양물에 대한 점성도값에서의 커다란 개선을 설명하기 위하여 사용되었다. 발효 공정의 마지막 단계에서,트리코데르마 롱기브로키아툼은 200 ∼ 600 cP(센티포와즈)의 값을 산출하였고,아스페르길러스 니거는 1500 ∼ 2000 cP의 값을 산출하였으며, 본 발명에 따르는 숙주는 10 cP의 값을 산출하였다. 따라서 시판되는 균주들의 점성도값에 비하여 최소한 20 내지 200 배 이상의 개선을 나타냈다. 진정 놀라운 측면은 본 발명에 따른 숙주 세포에 대한 단백질 농도가 전술한 바와 같이 놀라울 정도로 낮은 생물체량 및 점성도를 가짐에도 불구하고, 시판되고 있는아스페르길리및트리코데르마 리세이균주보다 높다는 것이다. 요약해서 말하자면, 다용도의 개선된 형질전환 시스템 및 개선된 배양 조건을 가지고 있는 발현 시스템의 이용 용이성이 여기에 소개되고 있다. 본 발명에 따른 균주는 놀랍게도 이들 개선된 조건하에서 놀라운 정도의 고 단백질을 생산하고 추가적으로 그들은 보다 짧은 발효 시간에 상기 단백질을 생산한다.
본 발명은 이종의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 돌연변이의크리소스포륨균주에 관한 것이며, 상기 핵산 서열은 발현 조절 영역 및 선택적으로 분비 신호 암호화 서열 및/또는 캐리어 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 균주는 관심있는 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 이는 관심있는 폴리펩티드를 분리하기 위하여 세포를 붕괴시켜야 되는 필요성을 회피할 수 있으며, 또한 숙주 세포의 다른 성분에 의하여 발현된 생성물의 분해의 위험을 최소화 할 수 있다.
크리소스포륨은 Barnett 및 Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungy, 3판, Burgess Publishing Company에 개시되어 있는 것과 일치하는 형태로서정의될 수 있다.크리소스포륨속의 진균 분류와 관련된 세부 사항을 제공하는 다른 것으로는 예컨대 Sutton Classfication(Van Oorschot, C.A.N.(1980) "A revision of Chrysosporium and allied genera" in Studies in Mycology No. 20 of the CBS in Baarn the Netheralnds pl-36)이 알려져 있다. CBS는 부다페스트 조약의 기탁 기관 중 하나이다. 이들 교시에 따르면크리소스포륨속은 총생균목에 속하는 담색선균과에 속하는 것이다. 사용할 수 있는 기준은 다음과 같다.
1. 총생균목의 표시
분생자는 균사체, 분리된 유표자 세포 또는 독특한 분생자병에서 직접 생산된다.
2. 담색선균과의 표시
분생자 및 분생자병(존재한다면) 모두 유리모양이거나 밝게 착색되어 있고; 분생자병은 단일하거나 헐거운 클러스터로 존재한다.
3. 크리소스포륨 코르다 1833 속의 표시
콜로니는 통상 퍼뜨려져 있으며, 백색, 때로는 크림색, 담갈색 또는 황색이며, 펠트 및/또는 파우더이다. 균사는 대부분 유리모양이고 평활한 벽으로 둘러싸여 있으며 불규칙적으로 얼마간의 동소이식으로 분지된다. 풍성한 균사는 차이점이 거의 없거나 전혀 없다. 분생자는 말단, 측면, 엽상체형, 모든 균사를 거쳐 운반되고, 무경 또는 짧은 돌출 또는 측면 브랜치, 부유리모양 또는 엷은 황색, 얇거나 두꺼운 벽으로 둘러싸인, 서브글로보스(subglobos), 추자상, 서양배 모양, 구형공극, 1-세포, 이따금 2-세포, 절단형이다. 중간의 분생자가 때때로 존재하고, 단독의 이따금 연결형, 부유리형 또는 엷은 황색, 지지 균사보다 넓고, 일반적으로 양 말단에서 1-세포, 절단형이다. 후막포자가 이따금 존재한다.
진균 명명법에 관한 정보를 제공하는 다른 것은 ATCC(US)이다. 그 웹사이트는 http://www.atcc.org. 이다. CBS도 유사한 정보를 제공하는 웹사이트(http://www,cbs.knaw.nl)가 있다. 모스코바의 VKM도 상기 정보의 신뢰할 만한 공급원이다; VKM의 이메일 주소는 http:/www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/ general이다. 다른 공급원은 http://NT.ars-grin.gov/-fungaldatabases이다. 이러한 모든 기관들은크리소스포륨의 특이한 특성들에 관한 교시를 제공할 수 있다.
마이셀리오프토라 테르모필라로 정의된 균주는 본 발명의 정의에 따르면크리로르포륨균주로 정의되지 않는다. 과거에는 일부마이셀리오프토라균주의 명명에 관하여 상당한 혼란이 있어왔다. 본 발명에 따르면크리소스포륨은 상기와 같이 명백하게 구별할 수 있는 것이며,마이셀리오프토라, 스포로트리큠또는파네로케트 크리소스포륨과 혼동될 수 없다.
다음의 균주가크리소스포륨으로 정의되는 것이나 이들 균주로 한정되지 않는다:C. 보트리오이데스(C. botryoides), C. 카르미카엘리(C. carmichaelii), C. 크라스투니카툼(C. crassitunicatum), C. 유로파(C. europae), C. 에볼세아누이(C. evolceannui), C. 파리니콜라(C.farinicola), C. 파스듐(C. fastidium), C. 필리포르메(C. filiforme), C. 조르지아(C. georgiae), C. 글로비페룸(C. globiferum), C. 글로비페룸 바. 아르티쿨라툼(C. globiferum var.areiculatum), C.글로비페룸 바. 니베움(C.globiferum var.niveum), C. 히룬도(C.hirundo), C. 히스파니쿰(C.hispanicum), C. 홀미(C.holmii) , C. 인디쿰(C. indicum), C.이노프스(C. inops), C.케라티노필룸(C. keratinophilum), C. 크레이셀리(C. kreiselii), C. 쿠주로비아눔(C. kuzurovianum), C. 리그노룸(C. lignorum), C. 로바툼(C.lobatum), C. 루크노웬스(C. luknowense), C.루크노웬스 가르그 27K(C. luknowense Garg 27K), C. 메디움(C.medium), C. 메디움 바. 스피세신스(C. medium var. spossescens), C. 메피티쿰(C. mephiticum), C. 메르다룸(C. merdarium), C. 메르다룸 바. 로세움(C. merdarium var. roseum), C. 미노르(C. minor), C. 파니콜라(C. pannicola), C. 파르붐(C. parvum), C. 파르붐 바. 크레센스(C. parvum var. spissescens), C. 필로숨(C. pilosum), C. 수도메르다륨(C. pseudomerdarium), C. 피리포르미스(C. pyriformis), C. 퀸스란디쿰(C. queenslandicum), C. 시글레리(C. sigleri), C. 설푸레움(C.sulfureum), C. 신크로눔(C.synchronum), C. 트로피쿰(C. tropicum), C. 운두라툼(C.undulatum), C. 발레나렌스(C.vallenarense), C. 베스페르틸륨(C.vespertilium), C. 조나툼 (C.zonatum).
C. 루크노웬스는 천연의 셀룰라제 단백질의 높은 생산자를 제공하면서 특정 관심 관심있는크리소스포륨의 종들중 하나를 형성한다(WO 98/15633 및 이와 관련된 미국 특허 제5,811,381호). 이러한크리소스포륨 루크노웬스의 특성은 다음과 같다:
콜로니는 14일간 사부로포도당한천배지에서 55 mm의 직경이 되고, 크림색이며, 펠트같고 폭신폭신하며; 밀집되어 있고 3∼5 mm 높이이고; 가장자리는 한정되고 통상적이며 사상돌기가 있으며; 반대편은 엷은 황색에서 크림색에 가깝다. 균사는 유리형이고, 평활하며, 얇은 벽으로 둘러싸여 있고 약간 분지가 있다. 기중 균사는 거의 풍성하고 격벽을 가지고 있으며 폭이 약 1∼3.5 mm이다. 잠입 균사는 풍성하지 않으며 폭이 약 1∼4.5 mm이고, 종종 뒤틀린 얇은 균사를 가지고 있다. 분생자는 말단, 측면이고, 거의 무경이거나 짧고, 자주 원뿔형의 돌출부 또는 짧은 측면 분지이다. 분생자는 고립성이나 서로 가까이 있으며, 1∼4개의 분생자는 하나의 균사 세포상에서 발달되며, 부유리형, 상당히 얇고 평활한 벽으로 둘러싸인, 거의 서브글로보스이고, 또한 추자상의 구형공극이며, 1-세포, 2.5x11x1.5∼6 mm이고, 넓은 기저의 자국(1∼2 mm)을 가지고 있다. 중간의 분생자는 없다. 후막포자가 없다. ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 및 CBS 272.77은크리소스포륨 루크노웬스균주의 예이고 다른 예는 WO 98/15633 및 미국 특허 제5,811,381호에 개시되어 있다.
추가적인 균주를 셀룰라아제에 대해 보다 높은 생산성을 갖는 이들 종으로부터 분리한다. 이들 균주를 C1으로 내부 표지법으로 부르고, 부다페스트 조약에 따른 기탁으로서 1997년 8월 29일에 러시아 113184, 모스코바, 마크루시나 스트리트 8에 소재하는 Russian Academy of Science의 International Depository of the All Russian Collection of micro-organism에 기탁하였으며, 수탁 번호는 VKM F-3500D를 받았다. 이것은크리소스포륨 루크노웬스가르그 27K라고 일컫는다. C1의 특징은 다음과 같다.
콜로니는 7 일간 감자-포도당한천배지에서 55∼66 mm의 직경으로 성장하고;백색 크림색이며 펠트같고, 중간부는 높이가 2∼3 mm 이고; 가장자리는 한정되고 통상적이며 사상돌기가 있으며; 반대편은 엷은 크림색에 가깝다. 균사는 유리형이고, 평활하며, 얇은 벽으로 둘러싸여 있고 약간 분지가 있다. 기중 균사는 풍성하고 격벽을 가지고 있으며 폭이 약 2∼3 mm이다. 잠입 균사는 풍성하지 않다. 분생자는 말단, 측면이고; 무경이거나 짧고; 부재하고; 고립성이나 서로 가까이 있으며, 유리형, 상당히 얇고 평활한 벽으로 둘러싸인, 서브글로보스이고, 또한 추자상의 구형 공극이며, 1-세포, 4∼10 mm이고, 후막포자가 없다. 중간의 분생자는 없다.
C1 균주의 분리 방법은 WO 98/15633 및 미국 특허 제5,811,381호에 개시되어 있다. 상기 형태를 나타내는 균주는 본 발명에 따른크리소스포륨의 정의내에 포함된다. 천연적으로 또는 유도되는 돌연변이 유발법에 의하여 어느정도 돌연변이된 것들을 비롯한크리소스포륨선조로부터 유래된 균주 또한크리소스포륨의 정의내에 포함된다. 특히 본 발명은 유도되는 돌연변이 유발법, 특히 방사선 및 화학적 돌연변이 유발의 결합에 의하여 유발됨으로써 얻어지는크리소스포륨의 돌연변이체를 포함한다.
예를 들어 C1 균주는 이것을 UV 13-6 균주를 생성하기 위하여 자외선을 가함으로써 돌연변이시킨다. 이어서 이 균주를 N-메틸-N'-니트로소구아니딘으로 추가적으로 돌연변이를 유발하여 NG7C-19를 생성한다. 후자의 균주는 계속해서 자외선에 의하여 돌연변이시켜 UV 18-25 의 균주를 얻는다. 이러한 돌연변이 공정 중에 형태적 특성들이 어느정도 배양액에서 액체상태 또는 플레이트상에서 그리고 현미경하에서 변화한다. 콜로니가 평평하고 매트한 외관을 나타낼 때까지 각각의 연속적인 돌연변이 유발로서 배양물은 솜털이 많고 펠트같은 외관을 플레이트 상에서 나타내는데, 이것은크리소스포륨의 특성으로 묘사된 것이다. 임의의 배지에서 야생형의 균주로 관찰된 갈색 색소는 돌연변이 균주에서 우세하지는 않다. 액체 배양물에서 돌연변이체 UV 18-25는 야생형 균주 C1 및 돌연변이체 UV 13-6 및 NG7C-19 보다 현저하게 덜 점성을 띈다. 모든 균주가크리소스포륨의 총 현미경적 특성을 유지하는 반면에, 균사체는 각각의 연속적인 돌연변이 유발 및 수득가능한 UV 18-25의 균사체의 독특한 분절에서 점점 더 좁아졌다. 균주들의 홀씨 형성 능력은 각각의 돌연변이 유발 단계에서 감소하였다. 이것은 균주가크리소스포륨속에 속한다는 것에 대해 상기 형태적 정의로부터의 임의의 편향이 있다는 것을 설명한다. 각각의 돌연변이 유발 과정에서 셀룰라제의 생산 및 세포외 단백질은 추가적으로 증가하였고, 반면에 수개의 돌연변이체는 프로테아제 발현를 감소하는 결과가 되었다. 진균성 분류법 결정 기준을 CBS,VKMF 및 ATCC로부터 예컨대 구득할 수 있다.
특히,크리소스포륨의 아나모프는 본 발명의 생산 응용에 적합하다는 것이 밝혀졌다. 아나모프의 대사는 고도의 발현에 극히 적합하다. 또한 적합하게는 테레오모프는 아나모프의 유전자 구조로서 존재해야 하고 테레오모프는 동일하다. 아나모프와 테레오모프의 차이는 하나가 무성 상태이고 다른 것은 유성상태인 것이다. 상기 2 상태는 특정 조건하에서 상이한 형태를 나타낸다.
대규모 생산시 환경에 대한 위험을 감소시키고 이에 수반하여 가격면에서의 감소로 생산 공정을 단순화시킬 수 있으므로 당업계에 공지된 다수의 무 독성의크리소스포륨균주를 사용하는 것이 바람직하다.
발현 조절 영역은 숙주 발현를 위해크리소스포륨균주에 의해 인지된 DNA 서열이다. 이것은 발현되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있는 프로모터 서열을 포함한다. 상기 프로모터는 연결되어 발현되는 서열의 개시 코돈과 마주보는 위치에서 발현하도록 한다. 프로모터 서열은 본질적이거나 유도가능하다.크리소스포륨균주로부터 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 발현 조절 서열이나 그들의 조합체를 고찰한다. 발현 조절 서열은 예컨대 자낭균류 조절 영역과 같은 진균의 발현 조절 영역이 적합하다. 적합하게는 진균 발현 조절 영역은 다음의 진균속 중 임의의 것의 조절 영역이다:아스페리길러스, 트리코데르마, 크리소스포륨, 한세눌라, 무코르, 피치아, 뉴로스포라, 톨리포클라둠, 리조무코르, 푸사룸, 페니실룸, 사카로마이시스, 탈라로마이시스또는 이들의 대안적인 양성형(에메르셀라, 하이포크레아)으로서, 예컨대트리코데르마로부터 유래한 셀로비오히드롤라제 프로모터,아스페르길러스에서 유래한 글로코아밀라제,아스페르길러스에서 유래한 글리세르알데히드 포스페이트 데하이드로제나제 프로모터,아스페르길러스에서 유래한 알콜 데하이드로제나제 A 및 알콜 데하이드로제나제 R 프로모터,아스페르길러스에서 유래한 TAKA 아밀라제 프로모터,뉴로스포라에서 유래한 포스포글리세레이트 및 교차 콘트롤 프로모터,리조무코르 미에세이에서 유래한 아스파르트 프로테이나제 프로모터,리조무코르 미에세이에서 유래한 리파제 프로모터 및페니실룸 카네신스에서 유래한 베타-갈라토시다제 프로모터가 있다. 숙주 균주로서 상기와 동일한 속으로부터 유래한 발현 조절 서열이 아주 적합하고, 특정숙주에 특이적으로 적용하기가 아주 용이하다. 따라서 발현 조절 서열은크리소스포륨균주로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 출원인은크리소스포륨균주가 매우 거대한 양으로 단백질을 발현한다는 점 및 이들 균주로부터 유래한 발현 조절 서열이 특히 흥미롭다는 점을 밝혔다. 이들 균주는 내부적으로크리소스포륨균주 C1, 균주 UV 13-6, 균주 NG7D-19 및 균주 UV 18-25로서 나타낸다. 이들은 모스코바에 소재하고 있는 Russian Collection (VKM) depository institute에 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 야생형 C1 균주는 VKM F-3500 D의 수탁번호로 1996년 8월 29일 부다페스트 조약에 따라 기탁되었고, C1 UV 13-6 돌연변이체는 VKM F-3500 D의 수탁번호로 1996년 8월 29일, C1 NG7c-19 돌연변이체는 VKM F-3633 D의 수탁번호로 1998년 9월 2일, C1 UV 18-25 돌연변이체는 VKM F-3631 D의 수탁번호로 1998년 9월 2일에 기탁되었다,
선택된 숙주에서 고도의 발현을 가능하게 하는 발현 조절 영역이 적용되는 것이 바람직하다. 이것은 또한 이종의 숙주로부터 유래한 고도의 발현 조절 영역일 수 있으며, 이것은 당업계에 공지되어 있다. 다량으로 발현되고 본 발명을 위해 적합한 발현 조절 서열을 제공하는 것으로 공지된 단백질의 특정 실시예가 하이드로포빈, 프로테아제, 아밀라제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테라제, 베타 갈락토시다제, 셀룰라제(예컨대 엔도-글로카나제, 셀로비오하이드롤라제) 및 폴리갈라투로나제가 있으나 이것으로 한정되지는 않는다. 고도의 생산은 고체 상태 및 물속의 발효 조건 모두에서 확인되었다. 상기 단백질의 존재 또는 생산을 분석하기 위한 분석법이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 시그마 및 메가짐의 카탈로그는 수많은 예들을 제시한다. 메가짐은 Irelana, County Wicklow, Bray, Bray Business Park에 소재하고 있다. Sigma Aldrich 는 다수의 지부를 전세계적으로 가지고 있는데, 예컨대 USA St. Louis Missouri 14508. P.O.Box 14508를 들 수 있다. 셀룰라제에 대하여 본 출원인은 CMCase 분석, 엔도비스코메트리 분석, 아비셀라제 분석, 베타-글루카나제 분석, RBBCMCase 분석, 셀라자임 C 분석과 같은 시판되는 분석물을 예시한다. 또 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 주제에 관한 일반적인 문헌에서 발견할 수 있을 것이고 이러한 정보는 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 예를 들기 위하여 본 출원인은 "Method in Enzymology Volume 1, 1995 에서 1998년의 volume 297∼299"를 예시한다.크리소스포륨프로모터 서열은 숙주에 의한 그들의 양호한 인지를 확인하기 위하여 적용되는 것이 적합하다.
본 출원인은 이종의 발현-조절 서열이 천연의크리소스포륨서열만큼크리소스포륨내에서 효율적으로 작용한다는 것을 밝혔다. 이것은 구조체 및 벡터가크리소스포륨의 형질전환에 사용되게 할 뿐 아니라 수많은 다른 신규의 발현 및 분비 숙주에서 발현의 속도를 양호하게 하는 벡터를 구조화하는 가능성을 제공한다. 예컨대 표준의아스페르길러스형질전환 기술은 Christiansen 등, Bio/Technol. 6:1419-1422(1988)에서 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.아스페르길러스형질전환 벡터들의 상세 설명을 제공하는 다른 문헌, 예컨대 미국 특허 4,816,405호, 제5,198,345호, 제5,503,991호, 제5,364,770호 및 제5,578,463호, EP-B-215994호(또한트리코데르마에 대한 것임) 및 그들의 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 셀룰라아제에 대한 고도의 발현속도가크리소스포륨균주에서 확인되었으며,상기 단백질의 발현 조절 영역은 특히 바람직하다. 본 출원인은 전술한 기탁된크리소스포륨균주에 대한 특정 실시예를 예시한다.
크리소스포륨, 바람직하게는크리소스포륨 루크노웬스또는 그들의 유도체의 핵산 발현 조절 영역을 포함하는 핵산 구조는 본 발명의 별개의 태양을 구성하고, 발현되는 폴리펩티드와 작동적으로 연결되는 것을 포함하는 돌연변이체크리소스포륨균주도 마찬가지이다. 상기 핵산 구조는 셀룰라제 또는 크실라나제 발현과 연관된크리소스포륨의 발현 조절 영역인 것이 적합할 수 있으며, 셀로비오하이드롤라제 발현이 바람직하고, 55 kDa 셀로비오하이드롤라제의 보다 특정적인 발현이 바람직하다. 25kDa(C1-EG5)의 엔도뉴클라제 및 43kDa(C1-EG6)의 엔도뉴클라제의 상기크리소스포륨프로모터 서열[이때 분자량은 SDS PAGE(21.9 kDa 및 30.5 kDa인 아미노산 서열 데이터에 따른 분자량을 가짐) 에 따라 결정됨]은 실시예의 방법으로서 제공된다. 따라서 하이드로포빈, 프로테아제, 아밀라제, 크실라나제, 에스테라제, 펙티나제, 베타-갈락토시다제, 셀룰라제(예컨대 엔도글루카나제, 셀로비오하이드롤라제) 및 폴리갈라투로나제의크리소스포륨프로모터 서열 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 여겨진다. 표1 또는 2에 개시된 효소 발현의 임의의 프로모터 또는 조절 영역이 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산 서열은 본 발명에 따른크리소스포륨균주로부터 수득하는 것이 적합할 수 있으며, 이러한 균주는 명세서의 다른 부분에서도 정의되어 있다. 프로모터 서열이 결정되는 방식은 다양하며 당업계에 공지되어 있다. 관련된 유전자의 개시에서 ATG 코돈의 상부 영역 뉴클레아제 결실 실험들은 상기 서열을 제공할 것이다. 또한 예를 들어 공통 서열의분석은 관심 있는 유전자를 밝힐 수 있게 한다. 잡종 및 확대 기술을 사용하여 당업자는 용이하게 상응하는 프로모터 서열에 도달할 수 있다.
C1 엔도뉴클라제의 프로모터 서열을, 상응하는 유전자를 클로닝함으로서 이러한 방식으로 동정하고, 서열번호 2(EG5) 및 1(EG6) 로 각각 표기한다. 효소가 그들의 프로모터로서 높은 수준으로 발현되는 것 처럼, 본 발명에 따른 다른 바람직한 프로모터는 55 kDa 셀로비오하이드롤라제(CBH1) 프로모터 및 39 kDa 크실라나제(XylF) 프로모터이다. 상응하는 프로모터 서열은 엔도글로카나제 프로모터에 대하여 후술하는 바와 같이 클로닝에 의한 직접적인 방식으로 동정할 수 있고, 서열번호 4(CBH1) 및 서열번호 5(XylF)로 각각부여된 부분적인 서열 정보를 이용한다.크리소스포륨의 탄수화물-분해 효소, 특히 C1 효소는 숙주 생물, 특히 진균성 또는 다른 미생물 숙주에서 소정의 폴리펩티드를 발현하는데 사용되는 것이 유리하다. 서열번호 1 및 2로 부여된 서열, 또는 기타의크리소스포륨유전자에 대해 발견된 서열과 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 가장 바람직하게는 80 % 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 것은 본 발명의 일부이다.
또한 본 발명에 따른 재조합 균주 및 핵산 서열의 특정 태양에 관하여 본 출원인은 실시예에서 예시하고 있다. 또한 진균성 예컨대아스페르길러스및트리코데르마에 대해 개시된 바와 같이 고 발현을 제공하는 특정의 균주에서의 고 발현 프로모터 서열을 기재하고 있는 종래 기술에 대해 재조합 균주를 예시한다. 종래 기술은아스페르길러스에 사용되기 위한 다수의 발현 조절 영역을 제공한다(예컨대 노보의 미국 특허 제5,252,726호 및 유니레버의 미국 특허 제5,705,358호). 종래기술의 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.
하이드로포빈 유전자는 고 발현 진균성 유전자이다. 따라서 하이드로포빈 유전자의 프로모터 서열(바람직하게는크리소스포륨에서 유래) 은 본 발명의 적절한 태양에서 발현 조절 서열로 적절하게 적용될 수 있다는 것이 제안된다. 하이드로포빈 용의트리코데르마 리세이및트리코데르마 하르지아눔유전자 서열은 예컨대 종래 기술에 개시되었을 뿐 아니라아스페르길러스 푸미가투스및아스페르길러스 니둘란스의 유전자 서열 및 관련된 서열 정보를 본원에서 참고문헌으로 인용하고 있다(Munoz 등, Curr. Genet, 1997, 32(3):225-230; Nakari-Setala T. 등, Eur.J.Biochem. 1996 15:235(1-2):248-255, M. Parta 등. Infect. Immune. 1994 62(10):4389-4395 및 Stringer M.A. 등 Mol. Microbiol. 1995 16(1):33-44). 이러한 서열 정보를 이용하여 당업자는 이미 전술한 바와 같이 표준에 따르는 부적합한 실험 기술 없이도크리소스포륨하이드로포빈 유전자의 발현 조절 서열을 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 재조합크리소스포륨균주는 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된 하이드로포빈-조절 영역을 포함할 수 있다.
또한 발현 조절 서열은 증폭자(enhancer) 또는 침묵자(silencer)를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 또한 종래 기술에서 공지된 것이고 일반적으로 프로모터로부터 어느정도 떨어진 곳에 위치한다. 상기 발현 조절 서열은 또한 활성화 인자 결합 부위 및 억제자 결합 부위를 구비한 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에는 상기 부위들이 이러한 형태의 조절을 제거하기 위하여 개질될 수 있다. 섬유상의 진균성 프로모터(여기에 creA 부위가 존재)가 개시되었다. 상기 creA 부위가 돌연변이되어 비-돌연변이되는 부위의 존재에 의해 통상 생기는 글루코스 억제가 제거되는 것을 확인할 수 있다. Gist-Brocades의 WO 94/13820호는 이러한 원리을 나타낸다. 상기 프로모터를 사용하면 글루코스 존재하에서 프로모터에 의하여 조절되는 핵산 서열에 의하여 암호화된 폴리펩티드의 생성을 가능하게 한다. 상기와 동일한 원리가 WO 97/09438호에도 나타나 있다. 이들 프로모터는 그들의 creA 부위가 존재하거나 부재할 때 모두 사용될 수 있다. creA 부위가 돌연변이된 돌연변이체가 본 발명에 따른 재조합 균주에서의 발현 조절 서열로서 사용될 수 있으며, 따라서 이것이 조절하는 핵산 서열은 글로코스의 존재하에서 발현될 수 있다. 상기크리소스포륨프로모터는 WO 97/09438호에서 설명한 바와 유사한 방식으로 유전자를 활성화시킨다. creA 부위와의 동일성이 종래 기술로부터 공지되어 있다. 또 다른 방법으로 프로모터를 억제 시스템의 다른 곳, 예컨대 creA 자체에서 돌연변이되고 숙주 균주에서 돌연변이되지 않은 CreA 결합 부위에 적용하는 것이 가능하므로 균주는 creA 결합 부위의 존재에도 불구하고 글루코스의 존재하에서 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
터미네이터 서열이 또한 발현 조절 서열이며, 이들은 발현되는 서열의 3' 말단에 작동적으로 연결된다. 임의의 진균성 터미네이터는 본 발명에 따라 숙주크리소스포륨균주에서 기능적이 되는 것 같다. 실시예는A. 니둘란스trpC 터미네이터 (1),A. 니거알파-글루코시다제 터미네이터(2),A. 니거글루코아밀라제 터미네이터(3),무코르 미헤이카르복실 프로테아제 터미네이터(미국 특허 제5578463호) 및트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 터미네이터가 있다. 자연히크리소스포륨터미네이터 서열은크리소스포륨에서 작용하며 예컨대 EG6 터미네이터에 적합하다.
본 발명에 따른 적합한 재조합크리소스포륨균주는 발현되는 핵산 서열을 가지는데 이는 시그널 서열로서 정의된 아미노산 서열을 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된다. 시그널 서열은 아미노산 서열로서 발현되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 작동적으로 연결되는 경우 숙주 진균류로부터 그들의 분비를 가능하게 한다. 상기 시그널 서열은 이종의 폴리펩티드와 통상 관련된 것이거나 숙주 천연의 것이다. 또한 이것은 숙주 및 폴리펩티드 모두에게 외부 물질일 수 있다. 시그널 서열을 암호화하는 핵산 서열은 시그널 서열 및 이종의 폴리펩티드의 전사를 가능하게 하는 프레임에 위치하여야 한다.크리소스포륨균주로부터 폴리펩티드의 분비를 허용할 수 있는 임의의 시그널 서열을 고찰한다. 상기 시그널 서열은 진균성 시그널 서열이 적합하며, 자낭균류 시그널 서열이 바람직하다.
시그널 서열의 적합한 실시예는 통상 효모 또는 임의의 다음의 진균류의 특정 속으로부터 유래될 수 있다:아스페르길러스, 트리코데르마, 크리소스포륨, 피치아, 뉴로스포라, 리조무코르, 한세눌라, 후미콜라, 무코르, 톨리포클라듐, 푸사륨, 페니실룸, 사카로마이시스, 탈라로마이시스또는 그들의 대안적인 양성형(에메리셀라, 하이포크레아). 특히 유용한 시그널 서열은 다음의 단백질과 자주 천연적으로 관련되고, 셀레비오하이드롤라제, 엔도글루카나제, 베타-갈락토시다제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테라제, 하이드로포빈, 프로테아제 또는 아밀라아제가 있다. 실시예는아스페르길러스또는휴미콜라(4)의 아밀라제 또는 글루코아밀라제,아스페르길러스 오리자의 TAKA 아밀라제,아스페르길러스 니거의 알파-아밀라제,무코르의 카르복실 펩티다제(미국 특허 제5,578,463호),리조무코르 미헤이의 리파제 또는 프로네이나제,트리코데르마(5)의 셀로비오하이드롤라제,페니실룸 카네센스의 베타-갈락토시다제 및사카로마이시스의 알파 메이팅 인자가 있다.
또 다른 방법으로 시그널 서열은 아밀라제로부터 또는바실러스균주의 섭틸리신 유전자로부터 유래될 수 있다. 숙주 균주로서 상기 유전자로부터 유래한 시그널 서열은 이것이 특정 숙주에 특이적으로 적응하기가 가장 용이하므로 매우 적합하고, 따라서 시그널 서열은크리소스포륨의 시그널 서열인 것이 바람직하다. 본 출원인은 방대한 양으로 단백질을 분비하기 위한크리소스포륨의 특정 균주 및 천연적으로 이들 균주로부터 유래한 시그널 서열이 특히 흥미롭다는 것을 밝혔다. 이들 균주는 내부적으로크리소스포륨균주 C1, 균주 UV 13-6, 균주 NG7D-19 및 균주 UV 18-25로 표시한다. 이들은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 부다페스트 조약에 따라 기탁되어 있다. 섬유상의 진균류, 효모 및 박테리아로부터 유래한 시그널 서열이 유용하다. 비-진균성 기원의 시그널 서열 또한 유용한 것으로 간주되고 특히 박테리아, 식물 및 포유류가 그러하다.
본 발명의 임의의 태양에 따른 재조합크리소스포륨균주는 선택 마아커를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 선택 마아커는 형질전환된 또는 트랜스펙션된 세포를 용이하게 선택하게 할 것이다. 선택 마아커는 종종 비-형질전환된 균주에 대해 외부물질 내성의 특이적 형태를 제공하는 유전자 생성물을 암호화한다. 이것은 통상 중금속, 항생제 및 생물치사제에 대해 내성이 있을 수 있다. 원영양체 또한비-항생 변종의 유용한 선택 마아커이다. 비-항생 선택 마아커는 괌심있는 단백질 또는 폴리펩티드가 식품 또는 약품에 사용되는 경우에 촉진제 또는 상기 생성물의 덜 복잡한 조절 허용 면에서 바람직할 수 있다. GRAS 지표가 상기 마아커용으로 사용되는 경우가 매우 흔하다. 다수의 상기 마아커가 당업자에게 알려져 있다. 예컨대 FDA가 상기 물질의 목록을 제공한다. 가장 흔하게 사용되는 것은 약에 대한 내성 또는 영양 부족을 완화하는 것에 부여하는, 예컨대 amdS(아세트아미다제), hph(하이그로마이신포스포트란스퍼라제), pyrG(오로티딘-5'-포르페이트 디카르복실라제), trpC(안트라닐레이트 신타제), argB(오르니틴 카르바모일트란스퍼라제), sC(설페이트 아데닐트란스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제), 글루포시네이트 내성, niaD(니트레이트 리덕타제), 블레오마이신 내성 유전자, 보다 특이적으로는 Sh ble, 술포닐우레아 내성, 예컨대 아세토락테이트 신타제 돌연변이 ilvl을 포함하는 군로부터 선택된 선택 마아커이다. 공형질전환(cotransformation)에 의하여 선택이 이루어지는데, 이때 선택 마아커는 별개의 벡터상에 있거나, 관심있는 폴리펩티드를 위한 폴리펩티드-암호화 서열로서 동일한 핵산 분절상에 있다.
본원에서 이종의 폴리펩티드는 본 발명에 따른 발현에 사용되는크리소스포륨숙주 균주에 의하여 통상 발현, 분비되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 식물 또는 동물(척추 동물 또는 무척추동물) 기원이고 예컨대, 포유류, 어류, 곤충, 또는 미생물 기원일 수 있으나, 다만 이것은 숙주 균주에서 발생하지 않는다. 포유류는 인간을 포함할 수 있다. 미생물은 바이러스, 세균, 고세균 및 진균을 포함하고, 즉 섬유상의 진균 및 효모를 포함한다. Bergy's Manual for Bacterial Determinology는 세균 및 고세균의 적절한 목록을 제공한다. 약학적 목적 면에서 인간 단백질에 대한 선호성이 꽤 자주 존재할 것이며, 따라서 바람직한 태양을 형성하는 본 발명에 따른 재조합 숙주는 폴리펩티드가 인간을 기원으로하는숙주가 될 것이다. 식품과 같은 것을 목적으로 하면, 이종의 폴리펩티드가 동물, 식물 또는 해조류를 기원으로 하는 것이 적합하다. 따라서 상기 구체예는 본 발명의 적합한 실시예로 간주된다. 유용한 대안적인 태양은 또한 임의의 세균, 효모, 바이러스, 고세균 및 진균을 기원으로하는 이종의 폴리펩티드를 포함한다. 진균을 기원으로 하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 적합한 태양은 적응된 코돈 용도를 갖는 이종의 핵산 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 숙주의 천연의 아미노산 서열을 암호화하는데, 이것은 숙주로부터 유래되지만 상이한 핵산 서열을 갖는다. 즉, 특정 코돈에서의 핵산 서열은 동일한 핵산을 암호화하는 기타의 코돈에 의해 대체되었지만 발현을 위하여 사용되는 숙주 균주에 의하여 보다 용이하게 사용된다. 이것은 이종의 핵산 서열을 보다 양호하게 발현시킨다. 이것은 당업자가 통상적으로 실행하는 것이다. 이러한 적응된 코돈 처리는 진균에 대응하는 비-진균성 코돈 처리의 공지된 것을 기준으로 하여 실시될 수 있다. 또한크리소스포륨자체의 코돈 용도에 보다 특이적으로 적응될 수도 있다. 유사하게는트리코데르마, 휴미콜라및아스페르길러스에서 관찰되는 바와 같은 코돈의 용도가 코돈 적응 없이 상기 생물의 서열을 교환시킬 수 있을 것이다. 상세 설명은 이들 진균의 코돈 용도와 관련해서 당업자에게 알려져 있으며 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.
본 발명은 전술한 재조합크리소스포륨균주에 한정되지 않으며,크리소스포륨균주에 대한 동종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합크리소스포륨균주도 포함하며, 상기 핵산 서열은 작동적으로 발현 조절 영역에 연결되어 있고 상기 재조합 균주는 동일한 조건하에서 대응하는 비-재조합 균주 보다 상기 단백질을 더 발현시킨다. 관심있는 동종의 폴리펩티드의 경우에는, 이미 설명한 바와 같이 히드롤라제, 프로테아제 또는 탄수화물 분해 효소와 같은 중성 또는 알칼리성의 효소가 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 또한 산성일 수 있다. 재조합 균주는 비-재조합 균주보다 많은 양으로 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 대응되는 이종의 폴리펩티드레 관해 설명한 모든 사항들은 동종의 폴리펩티드 셀룰라제에 대해 또한 유효하다(필요한 변경을 가하여).
따라서 본 발명은 또한 유전적으로 설계된크리소스포륨균주를 포함하는데, 여기서 소개된 서열은크리소스포륨을 기원으로 한다. 그러나 상기 균주는 예컨대 이종의 서열이크리소스포륨을 형질전환하거나 트랜스펙션하는 데 사용되는 핵산에 존재함으로써, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 다중 복사(copy)가 존재한다는 사실로 인하여 또는 이들이 동일한 조건하에서 비-설계된 균주의 발현양을 초과하는 양으로 발현된다는 사실로 인하여 또는 발현이 통상의 비-발현 조건하에서 발생한다는 사실로 인하여 천연적으로 발생하는 균주와는 구별된다. 유도가능한 프로모터가 비-재조합 상황과 상반되게 관심있는 서열을 조절한다면, 또는 기타의 요소가 비-설계된 균주의 경우보다 발현을 유도한다면 후자의 경우가 될 것이다.상기 태양들에서 정의된 바와 같이 본 발명은 천연적으로 발생하는크리소스포륨균주를 포함하고자 하는 것이 아니다. 본 발명은 통상의 유전자 기술 또는 유전 공학 방법론을 이용하여 공학을 통하여 유도시킨 균주에 관한 것이다.
본 발명의 모든 재조합 균주는 탄수화물-분해 효소(셀룰라제, 크실라나제, 만나나제, 만노시다제, 펙티나제, 아밀라제 예컨대 α-아밀라제, α- 및 β-갈락토시다제, α- 및 β-글루코시다제, β-글루카나제, 키티나제, 키타나제), 프로테아제(엔도프로테아제, 아미노-프로테아제, 아미노- 및 카르복시-펩티다제), 기타의 하이드롤라제(리파제, 에스테라제, 피타제), 옥시도리덕타제(카탈라제, 글루코-옥시다제) 및 트린스퍼라제(트란스글리코실라제, 트란스글루타미나제, 이소머라제 및 인베르타제)로부터 선택된 이종의 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
효소가 활성 및/또는 안정성을 보유하는 pH 범위
샘플 > 50% 효소적 활성을 유지하는 pH 범위 > 70% 효소적 활성을 보유하는 pH 범위 최대값에서 안정성 %(20시간,50℃)
CMCase RBB-CMCase 기타의 기질 CMC-ase RBB-CMDase 기타의 기질 pH 7.5/8
30 Kd 프로테아제(알칼리성) 30 kD - - 12.5 - - 12.0 -
Xyl (알칼리성) - - 10.0 - - 8.5 80
51 kD Xyl - - 8.0 - - 7.5 -
60 kD Xyl - - 9.5 - - 9.0 58
45 kD Xyl 7.0 8.0 - 6.5 7.0 - 75
55 kD 엔도 8.0 8.0 - 7.0 7.0 - 55
25 kD(21.8 kD*)엔도 7,5 10.0 - 6.5 9.0 - 80
43 kD(39.6 kD*)엔도 8.0 8.0 - 7.2 7.2 - -
45 kD α,β-Gal/β-Gluc - - 6.8 - - 5.7 -
β-Glue 흔적이 있는 48 kD CBH 5.2 7.5 8.0 5.0 6.8 - -
55 kD CBH 8.0 9.0 - 7.4 8.5 - 70
65 kD PGU - - 8.0 - - 7.3 -
90 kD 프로테아제 - - 9.0 - - 9.0 -
100 kD 에스테라제 - - 9.0 - - 9.0 -
*분자량 (MALDI에 의함)
노트:
* 모든 기타 분자량은 SDS PAGE에 의함.
* 효소는 동일한 단백질 함량으로 취함.
* xyl = 크실라나제
* 엔도 = 엔도글루카나제
* gal = 갈락토시다제
* gluc = 글루코시다제
* CBN = 셀비오하이드롤라제
* PGU = 폴리갈락투로나제
본 발명에 따라 생산되는 가장 흥미있는 생성물은 셀룰라제, 크실라나제, 펙티나제, 리파제 및 프로테아제이고, 여기서 셀룰라제 및 크실라제는 베타-1,4-결합을 자르며 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로비오하이드롤라제 및 베타-글루코시다제를 포함한다. 이들 단백질은 당업계에 공지된 다양한 공업적 공정에 매우 유용하다. 특히 셀룰라제에 대해서 예컨대 WO 98/15633호를 셀로비오하이드롤라제 및 엔도글루카나제를 이용하는 것으로 언급한다. 상기 명세서의 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 본 출원인은 또한 표1 및 표2를 관심있는크리소스포륨단백질의 보다 상세한 설명을 제공하는 것으로 언급한다.
본 발명에 따라,크리소스포륨돌연변이체는 프로테아제의 발현을 감소시키는 것으로 제조되고, 따라서 특히 단백성 산물이 프로테아제 활성에 민감하다면 단백성 산물을 생성하는 데 보다 적합하게 한다. 따라서 본 발명은 또한 비-돌연변이크리소스포륨균주, 예컨대C. 루크노웬스균주 C1(VKM F-3500 D)에 비하여 프로테아제를 조금 생성시키는 돌연변이크리소스포륨균주에 관한 것이다. 특이하게는 상기 균주의 프로테아제 활성은 C1 균주에 의하여 생산되는 양의 절반도 안되고, 보다 특이하게는 30 % 이하이다. 감소된 프로테아제 활성은 공지의 방법, 할로 형태의 op 스킴 밀크 플레이트 또는 BSA 분해에 의하여 측정할 수 있다.
특히 흥미로운 본 발명의 태양은 본 발명에 따른 재조합크리소스포륨으로서, 여기에서 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열이 산성 pH, 즉 6 미만, 심지어는 pH 5.5 미만, 보다 적합하게는 pH 5 미만, pH 4이거나 그보다 작은 값에서 불활성이거나 불안정한 폴리펩티드를 암호화한다. 이것은 매우 흥미로운 태양인데, 통상적으로 개시된 진균성 발현 시스템은 중성 내지 알칼리성 조건하에서 배양되지 않고 산성 pH 에서 배양되기 때문이다. 따라서 본 발명에 따른 시스템은 산성 pH 에서 불화성되거나 불안정한 것에 영향받기 쉬운 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 안정한 진균성 발현 시스템을 제공한다.
매우 특이하게는 본 발명에 따르는 임의의 태양으로서 정의되는 재조합 균주, 이때 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 pH 5 이상, 바람직하게는 중성 또는 알칼리성 pH(즉, 7 이상) 및/또는 pH 6 이상에서 최적의 활성 및/또는 안정도를 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 균주가 바람직한 태양으로 간주된다. 상기 pH 값에서 50 % 이상, 70 % 이상, 심지어는 90 % 이상의 최적 활성값을 나타내는 것이 특히 유용한 태양이 될 것으로 예상된다. 상기 배양 조건하에서 발현되는 폴리펩티드는 배양 조건에서 반드시 활성일 필요는 없고, 사실상 활성형이 숙주에게 해로울 수 있기 때문에 불활성인 조건하에서 배양되는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예컨대 프로테아제에 대한 경우이다. 그러나 필요한 것은 단백질 또는 폴리펩티드가 배양 조건하에서 안정한 것이다. 이러한 안정성은 열안정성일 수 있다. 이것은 또한 특정 조성물 또는 화학물질에 대한 안정성일 수 있으며, 예컨대 관심있는 폴리펩티드 또는 단백질의 적용 또는 생산 공정 또는 조성물에 존재하는 것이다. 셀룰라제 또는 리파제 등을 포함하는 세제 조성물의 LAS는 단백질에 유해한 화학물질의 예이다. 적용예에서 사용되는 노출 시간은 짧을 수도 길 수도 있는데, 이것은 안정성 시간이 변화하는 적용예에 따라 변하기 때문이다. 당업자는 각각의 경우마다 수정된 조건을 알 수 있을 것이다. 다양한 효소 산물의 최적 활성을 측정하기 위한 시판하고 있는 다수의 분석물을 사용할 수 있다. 예컨대 Sigma 및 Megazyme의 카탈로그가 상기의 것을 개시한다. 특정 시험예가 본 명세서에 언급되어 있다. 제작자는 상기 명세서의 지침을 제공한다.
본 출원인은 놀랍게도 발현되는 대상 서열로서 형질전환 또는 트랜스펙션하는 데 적절하게 사용될 수 있는크리소스포륨균주가 비교적 낮은 생물체량을 나타내는 균주임을 밝혀냈다.크리소스포륨균주가 발효의 마지막 단계에서 200∼600 cP의 점성도로 배양되는 경우에트리코데르마 리세이보다 2 내지 5 배 낮은 생물체량을 가지며, 이에 상응하는 조건하에서 1500∼2000 cP의 점성도로 배양하는 경우에아스페르길러스 니거보다 10 내지 20 배 낮은 생물체량을 갖는다는 것, 즉 그들 각각의 최적 배양 조건은 높은 수준의 발현을 제공할 수 있다는 것을 밝혔다. 이 발현의 정도는 보다 낮은 생물체량 및 보다 보다 낮은 점성도에서 2 개의 공업적 참조 균주를 능가한다. 이것은 상기크리소스포륨균주의 발현 수율이아스페르길러스 니거및트리코데르마 리세이로부터의 수율을 현저히 상회할 것이라는 것을 의미한다. 상기 형질전환되었거나 트랜스펙션된크리소스포륨균주는 본 발명의 적합한 태양을 형성한다.
전술한 조건하에서아스페르길러스 니거5∼10 g/l 및트리코데르마 리세이2.5∼5.0 g/l 에 반하여크리소스포륨균주 C1(18-25)의 생물체량은 0.5∼1.0 g/l 이다. 실시예에서 본 출원인은 본 공정의 상세한 설명을 제공한다.
적합한 태양에서 본 발명에 따른 재조합크리소스포륨균주는 균주 UV 13-6 또는 C-19에 의한 셀룰라제(ℓ당 mol 수) 생산에 상응하는 양 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하고, 가장 바람직하게는 상응하는 또는 동일한 조건, 즉 그들각각의 최적 배양 조건하에서 균주 UV 18-25 에 의한 양 이상인 것이다.
뜻밖에도 균주 UV 18-25의 균사체 구조, 즉 섬유성의 짧은 균사체를 나타내는크리소스포륨균주를 이용하는 경우에 발현율 및 분비율은 매우 높다는 것을 밝혔다. 따라서 본 발명에 따르는 재조합 균주는 상기 구조를 나타내는 것이 바람직하다. 그러나 본 발명은 비-재조합 균주 또는 이러한 신규의 발명적인 특성들을 나타내는 달리 설계된크리소스포륨균주를 포함한다. 또한 본 발명에 따라 개시된 임의의 태양에서의 재조합크리소스포륨균주는 추가적으로 C1 과 비교하였을 때 감소된 홀씨 형성을 나타내고, 동등한 발효기 조건하에서 UV 13-6 의 것 이하인 것이 바람직하고, NG7C-19 의 것 이하인 것이 바람직하며, UV 18-25 의 것 이하인 것이 바람직하며, 이러한 것이 본 발명에 또한 포함된다. 또한 본 발명에 따라 개시된 임의의 태양에서의 재조합크리소스포륨균주는 C1 과 비교하였을 때 그 생물체량에 대한 단백질 생산율 이상의 생산량을 추가적으로 나타내고, 동등한 발효기 조건하에서 UV 13-6, NG7C-19 및 UV 18-25 에 비해서 바람직하며, 이러한 것이 본 발명에 또한 포함된다. 그러나 본 발명은 또한 상기 또는 임의의 기타 태양과의 조합으로 이러한 신규의 발명적인 특성들을 나타내는크리소스포륨균주의 달리 설계된 균주 또는 비-재조합 균주를 포함한다.
본 발명의 다른 양호한 태양은 또한 상응하는 또는 동등한 발효기 조건하에서 NG7C-19 균주, 바람직하게는 UV 18-25 균주 보다 낮은 점성도를 나타내는 재조합크리소스포륨균주를 포함한다. 그러나 본 발명은 또한 상기 또는 임의의 기타의 태양과의 조합으로 이러한 신규의 발명적인 특성들을 나타태는크리소스포륨균주의 달리 설계된 균주 또는 비-재조합 균주를 포함한다. 본 출원인은 각각 그들의 최적의 배양 조건하에서 발효의 마지막 단계의 점성도가트리코데르마 리세이가 200∼600 cP,아스페르길러스 니거가 1500∼2000 cP 임에 반하여, UV 18-25의 배양물의 점성도가 10 cP 라는 것을 측정하였다. 상기 측정에 사용되는 공정은 실시예에 제공되어 있다.
점성도는 많은 경우에 시각적인 관찰에 의하여 분석이 가능하다. 물질의 유동은 고형, 소스(sauce) 유사형, 또는 거의 액상인 정도로 광범위하게 변할 수 있다. 점성도는 Brookfield 회전 점성도분석법, 동적 점성도 튜브, 볼 낙하 점성도계 또는 컵형태 점도계에 의하여 용이하게 확인될 수 있다. 상기 낮은 점성도 배양물로부터의 수율은 시간당 그리고 셀당 상업적으고 공지된 높은 점성도 배양물에 비하여 높다.
본 발명에 따라 상기 낮은 점성도 배양물의 공정은 특히 배양물의 스케일이 커지면 더욱 유리하다. 저 점성도의크리소스포륨균주는 배양물이 150,000 ℓ정도로 큰 배양물에서 매우 잘 배양된다. 상기 150,000 ℓ정도의 배양물 크기는 본 발명의 유용한 태양을 제공한다. 임의의 다른 통상적인 발효의 크기는 본 발명에 따라 상기 균주로 잘 실행될 것이다. 그 이유는 균사체를 갖는 응집물 형성으로 대규모 생산은 너무 밀집된다거나 및/또는 불균질하게 분산되는 문제가 발생하기 때문이다. 결론적으로 배지는 배양 중에 효과적으로 이용될 수 없으며 따라서 대규모 발효, 즉 150,000 ℓ이상의 경우 특히 비효율적인 생산 공정이 되고 만다. 탄산가스 포화 또는 혼합은 산소 및 영양소 부족의 문제를 야기하고 따라서 생상적인 생물체량의 농도를 감소시키며 배양 동안 폴리펩티드의 수율을 감소시키고 및/또는 발효 시간을 연장할 수도 있다. 또한 고점성도 및 고전단은 공업적인 발효 공정에서 바람직하지 않으며 현재의 공업적 공정에서 생산 제한 요소들이다. 이러한 모든 부정적인 측면은 본 발명에 따르는크리소스포륨숙주에 의하여 극복될 수 있고, 이것은 이러한 견지에서 공업적으로 사용되는트리코데르마 리세이, 아스페르길러스 니거및아스페르길러스 오리자보다도 나은 특성을 보이며, 이것은 보다 나은 단백질 생산 수준 및 점성도 특성 및 생물체량 수치를 나타낸다.
C1, UV 13-6, NG7C-19 및 UV 18-25 로부터 선택된크리소스포륨균주는 본 발명의 다양한 측면들을 매우 우수하게 설명한다. 그러나 본 발명은 상기한 또는 조합체로서 임의의 신규하고 발명적인 특성들을 나타내는 4개의 기탁된 균주로부터 유래한크리소스포륨의 달리 설계된 균주 또는 재조합 균주를 또한 포함한다. 이들 균주들에 대한 기탁 데이터는 본 명세서에 기재되어 있다. 또한 본 발명은 상기한 또는 조합체로서 임의의 신규한 및 발명적인 특성들을 나타내는 4개의 기탁된 균주로부터 유래한크리소스포륨의 달리 설계된 균주 또는 재조합 균주를 또한 포함한다. 본 발명에 따르는크리소스포륨균주는 또한 상응하는 배양 조건하에서트리코데르마 리세이보다 2배 이상 낮은 생물체량을 나타내는, 보다 적합하게는트리코데르마 리세이보다 5 배 낮은 생물체량을 나타내는 균주를 포함하며,트리코데르마 리세이는 실시예의 조건하에서 개시한 바와 같이 200∼600 cP의 점성도를 나타낸다. 본 발명에 따른크리소스포륨균주는 또한 상응하는 또는 동등한 조건하에서 적어도 C1, UV 13-6, NG7C-19 또는 UV 18-25 균주에 의한 셀룰라아제 (ℓ당 몰) 량이상의 폴리펩티드를 생산하는 균주를 포함한다.
본 발명에 따른크리소스포륨균주는 그들이 중성 내지 알칼리성의 pH 에서, 및 25∼43℃의 온도에서 최적의 성장 조건을 나타낸다면 또한 바람직하다. 바람직한 것은 중성 및 심지어는 알칼리성 pH 이다. 상기 생산 조건은 다수의 폴리펩티드 및 단백질, 특히 산성의 pH 에 의한 공격에 취약한 것 또는 저온에서 불활성이거나 불안정한 경우에 유리하다. 그러나 본 발명의 태양은 이것이 특정 단백질 및 폴리펩티드에 유용할 수 있는 것처럼 산성의 pH에서 배양될 수 있는크리소스포륨균주를 포함한다. 적절한 산성 pH 는 7.0 이다. 6.5 보다 낮은 산성 pH는 본 발명의 양호한 태양을 제공하는 것으로 생각된다. 약 5.0∼7.0 의 pH 또한 적절한 태양이다.중성의 pH 는 7.0 또는 약 7 즉, 6.5∼7.5 일 수 있다. 다른 부분에서도 설명한 바와 같이, 최적의 대상 pH 는 당업자에게 명백한 다수의 요인들에 좌우된다. 7.5 보다 높은 pH는 알칼리성이고, 적절하게는 7.5∼9.0이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 균주의 데이터를 다른 최적의 조건을 가지는 어떤 다른 균주(예컨대아스페르길러스및트리코데르마)와 점성도 측정면에서 비교하는 경우, 관련 균주에 대한 관련 최적 조건을 이용해서 생물체량 특정 또는 단백질 생산 비교가 이루어진다. 이것은 당업자에게 명백한 것이다.
본 발명의 임의의 전술한 태양에 따른크리소스포륨균주는 (상기 균주는 탄수화물-분해 효소, 프로테아제, 기타의 하이드롤라제, 옥시도리덕타제 및 전술한 트란스퍼라제로부터 선택된 1 이상의 진균성 효소의 생산을 나타냄) 본 발명의 특히 유용한 태양으로 생각된다. 가장 흥미로운 생성물은 특히 셀룰라제, 크실라나제, 펙티나제, 리파제 및 프로테아제이다. 그러나 또한 본 발명의 태양으로서 유용한 것은 중성 또는 알칼리성의 최적 안정성 및/또는 활성을 나타내는, 바람직하게는 알칼리성 최적 안정성 및/또는 활성을 나타내는 1 이상의 진균성 효소의 생산을 나타내는크리소스포륨균주이며, 상기 효소는 탄수화물-분해 효소, 하이드롤라제 및 프로테아제에서 선택되고 바람직하게는 탄수화물-분해 효소, 하이드롤라제에서 선택된다. 비-재조합크리소스포륨의 경우에 있어서, 상기 효소가 WO 98/15633호에 개시된 셀룰라제에 비해 적합하다. 특히 흥미로운 효소는 크실라나제, 프로테아제, 에스테라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루카나제 및 펙티나제가 있다. 상기 효소는 전술한 것에 한정되지 않는다. 본 명세서의 다른 부분에서 이에 대응하는 안정도 및 활성에 대한 언급은 여기서도 유효하다.
또한 본 발명은 관심있는 폴리펩티드 제조 방법을 포함하는데, 상기 방법은 폴리펩티드를 발현하고 바람직하게는 분비하게한 후 이어서 관심있는 생산된 폴리펩티드를 회수하는 조건하에서 본 발명에 따른 임의 태양의크리소스포륨균주를 배양하는 것을 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드를 언급하는 경우에, 변종 및 돌연변이, 예컨대 자연적으로 일어나는 단백질의 치환, 삽입 또는 결실 돌연변이는 비-돌연변이의 활성을 나타내는 것에 포함하고자 한다. 동일한 것은 상응하는 핵산 서열과 대응하여 유효하다. 유전자 샤플링(shuffling), 단백질 설계 및 지시된 진화 부위 지시 돌연변이 및 무작위적 돌연변이와 같은 공정을 통하여 상기 폴리펩티드, 변종 또는 돌연변이체가 얻어진다. 미국 특허 제5,223,409호, 미국 특허 5,780,279호, 및 미국 특허제5,770,356호는 정해진 진화를 교시하고 있다. 이러한 공정들을 이용하여 예컨대 에러 프론 PCR을 통하여 유전자 샤플링에 의해 생성된 무작위적 돌연변이 유전자 서열의 라이브러리가 임의의 셀형에서 발생한다. 각각의 유전자는 분비 영역 및 이에 부착된 고정화 영역을 가지고 있어서 생성된 단백질은 분비되고 숙주 표면에 고정된다. 이어서 특정 폴리펩티드의 생물학적 활성을 필요로 하는 조건을 만든다. 이것은 소정의 특성을 가지는 최종적인 유전자로 궁극적으로 이끌어가는 수 많은 사이클에 대해 발생한다. 다시 말해서 가속화된 정해진 진화 공정이다. 또한 미국 특허 제5,763,192호는 확률적으로 제조된 서열의 합성 폴리뉴클레오티드 커플링, 그들을 숙주로 도입시키고 상응하는 예정된 특성을 구비한 숙주 셀을 선택함으로써 DNA, RNA, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 얻는 방법을 개시하고 있다.
표준의 클로닝 및 단백질 또는 폴리펩티드 분리 기술이 필요한 서열 정보에 도달하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 공지 서열은 기타 속 및 균주에서 기타 동종을 분리하기 위한 탐침으로 사용될 수 있다. 특정 효소의 활성을 암호화하는 핵산 서열이 예컨대크리소스포륨라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 어떠한 잡종 조건이 적합한 지 알 수 있을 것이다. 라이브러리의 핵산 잡종 구조에 대한 통상의 방법 및 클로닝 기술은 샘브룩 등(Eeds)(1989)"Molecular Clining. A Labratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, 및 Ausubel 등(Eds) "Current Protocols in Molecular Biology"(1987) John Wiley and Sons, New York. 에 기재되어 있다. 또한 관련된 정보는 최근의 핸드북 및 특허 뿐 아니라 본 분야에서의 시판되는 키트로부터 유도할 수 있을 것이다.
대안적인 태양에서, 상기 방법은 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그들의 전구체를 발현시키고 바람직하게는 분비시키는 조건하에서 본 발명에 따른 균주를 배양하고, 이어서 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계 및 선택적으로 상기 전구체를 추가적인 분리 및 정제 단계를 실시하여 관심있는 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 적절하게는 전구체를 폴리펩티드 또는 관심있는 전구체로 절단하는 단계를 포함할 수 있다. 프로테아제 절단부위가 잘 분비된 단백질 담체 및 관심있는 폴리펩티드와 결합되는 경우에, 절단 단계는 Kex-2 유사 프로테아제, 임의의 염기성 아미노산과 짝을 이룬 프로테아제 또는 예컨대 Kex-2의 절단일 수 있다. 당업자는 Kex-2-유사-프로테아제 서열을 공통서열 상세사항으로서 용이하게 발견할 수 있으며, 이는 상기의 것이 구득가능한 다수의 대안(예컨대 furin)들이 이미 개시되어 있기 때문이다.
적절하게는 본 발명의 임의의 태양에 따른 폴리펩티드의 생산을 위한 방법에 있어서, pH가 5 이상, 바람직하게는 5∼10, 보다 바람직하게는 6∼9 에서 배양한다. 적절하게는 상기 방법에 있어서 온도가 25∼43℃, 바람직하게는 30∼40℃ 사이에서 배양한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는크리소스포륨균주는 임의의 개시된 태양에 따른 재조합크리소스포륨균주인 것이 매우 적절하다. 상기 경우에 있어서 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 재조합크리소스포륨균주의 제조에 선행한다. 적절한 조건의 선택은 발현되는 폴리펩티드의 특성에 좌우되며 그러한 선택은 당업자의 통상적인 활동 영역내에 있다.
본 발명에 따른 재조합크리소스포륨균주의 제조 방법 또한 본 발명의 일부이다. 본 방법은 이종의 또는 동종의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을크리소스포륨균주에 안정적으로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 서열은 작동적으로 발현 조절 영역에 연결되어 있고 상기 도입은 섬유상 진균을 형질전환 하기 위한 그 자체의 공지된 방식으로 실시한다. 전술한 바와 같이 상기에 대한 다수의 참고문헌은 구득가능하고 일부 선택하여 본원에 인용하였다. 제공된 정보는 당업자가 부적절한 부담없이 본 방법을 실시하도록 하는 데 충분하다. 본 방법은 본 방법에 따른 재조합크리소스포륨의 다양한 태양에 개시되어 있는 임의의 핵산 원소를 그 자체로 또는 조합체로서 포함하는 핵산 서열 도입을 포함한다.
실시예를 통하여 상기 도입은 원형질체 형질전환 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 상기 방법은 실시예에 기재되어 있다. 대안적인 원형질체 또는 스페로플라스트 형질전환 방법은 다른 섬유상의 진균에 대해 종래 기술에 개시되어 있는 바와 같이 공지되어 있고 사용될 수 있다. 상기 방법의 상세 설명은 다수의 인용된 참고문헌에서 밝히고 있으며 따라서 참고문헌에 인용되어 있다. 본 발명의 방법은 적합하게는 본 발명에 따른 비-재조합크리소스포륨균주를, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 소정의 서열을 도입하기 위한 출발 물질로서 이용하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은크리소스포륨효소를 생산하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 전술한 바와 같은 본 발명의 임의의 태양에 따라 또는 pH 가 5 이상인, 바람직하게는 5∼10인, 보다 바람직하게는 6∼9, 적절하게는 6∼7.5, 중성 및 알칼리성 pH 범위로서 7.5∼9의 배양 배지상에서크리소스포륨균주를 배양하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 25∼43℃, 바람직하게는 30∼40℃ 사이의 온도에서 배양 배지를 이용하는 그러한 방법을 포함한다. 바람직한 pH 및 온도의 조합이 본 발명에 따른크리소스포륨효소를 생산하는 방법의 특히 바람직한 태양이다.
통상 본 발명은 중성 또는 알칼리성의 최적 활성 및/또는 안정성, 바람직하게는 알칼리성의 최적 활성 및/또는 안정성을 나타내는 효소를 생산하는 방법을 포함한다. 대응하는 pH 및 최적 활성의 바람직한 범위 뿐 아니라 이것을 측정하는 분석물을 본 명세서의 다른 부분에 제공하고 있다. 효소는 탄수화물-분해 효소, 프로테아제, 기타의 하이드롤라제, 옥시도리덕타제 및 트란스퍼라제로부터 선택되어야 하며, 전술한 바와 같이 상기 방법은 상응하는 효소-암호화 핵산 서열로 형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 셀을 배양하는 단계를 포함한다. 적절하게는 상기 효소는크리소스포륨효소일 것이다. 상기의 적합한 방법은 셀룰라제, 크실라나제, 펙티나제, 리파제 및 프로테아제의 특이적 생산을 포함하는데, 이때 셀룰라제 및 크실라제는 β-1,4-결합을 절단하며 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로비오하이들로제 및 β-글루코시다제를 포함한다. 상기 발명에 따른 방법은 전술한 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따르는 임의의크리소스포륨숙주를 배양하는 단계를 포함한다. 적절하게는 본 발명에 따르는 비-재조합크리소스포륨숙주 생산은 탄수화물 분해 효소, 하이드롤라제 및 프로테아제의 생산에 대한 것이다. 상기 방법에 있어서 효소는 셀룰라제 이외의 것이 적합하다. 생산되는 생성물의 적합한 실시예는 표1 및 표2에 기재되어 있다. 분리 방법은 WO 98/15633호에 개시되어 있는 것과 유사하며 참고문헌에 인용되어 있다.
본 발명에 따르는크리소스포륨균주에 의해 생산되는 효소가 또한 본 발명에 포함된다.크리소스포륨기원의 효소는 본 발명에 따르는 비-재조합크리소스포륨균주로부터 분리될 수 있는 바와 같이 본 발명에 포함한다. 그들은 전술한 안정성, 활성 특성들을 나타낸다. 적합하게는 그들은 LAS 존재하에서 안정하다. 특히 pI 4∼9.5의 프로테아제, 25∼95 kD MW의 프로테아제, 4.0 및 9.5 사이의 pI의 크실라나제, 25∼ 65 kD MW의 크실라나제, 3.5∼6.5 사이의 pI의 엔도글루카나제, 25∼55 kDa MW의 엔도글루카나제, 4∼4.5 사이의 pI의 β-글루코시다제, α,β-갈락토시다제, 45∼50 kDa MW의 β-글루코시다제, α,β-갈락토시다제, 4∼5 pI의 셀로비오하이드롤라제, 45∼60 kDa MW의 셀로비오하이드롤라제, 예컨대 45∼50 MW 및 pI 4.4, 폴리갈락투로나제, 60∼70 kDa 4.0-5.0 폴리갈락투로나제, 예컨대 65 kDa, pI 4∼5의 에스테라제, 및 MW 95∼105 kDa 의 에스테라제가 전술한 안정성, 활성특성을 구비할 것이 요구된다. 분자량(MW)은 SDS-PAGE에 의하여 측정된다. 비-재조합, 즉천연적으로 생기는 효소는 WO 98/15633에서 개시한 바와 같은 셀룰라제이외의 것이다. WO 98/15633에서 개시된 효소는 제외된다. 본 발명에 따른 효소는 표2의 효소로 나타낸다. 전술한 pI 값 및 분자량의 조합을 구비한 효소가 또한 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이(재조합)에 의한 비-단백질 생성물의 (과)생산에 관한 것이다. 그러한 비-단백질 생성물은 유기산, 아미노산과 같은 1차 대사산물 및 항생제와 같은 제2차 대사산물, 예컨대 페니실린 및 세팔로스포린을 포함한다. 이들 생성물은 생화학적 경로의 조합 결과이고, 관심있는 수개의 진균성유전자를 포함한다. 진균성 제1차 및 제2차 대사 산물 및 진균성 생물체의 이들 대사 산물 생산 공정은 당업계에 공지되어 있다. 제1차 대사 산물의 생산 실시예는 Matty M., The Production of Organic Acids, Current Reviews in Biotechnology, 12,87-132(1992) 에 개시되어 있다. 제2차 대사 산물의 생산 실시예는 Penalva 등. The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi, Trends in Biotechnology 16, 483-489(1998).
후술하는 작동 파라미터 데이터 범위는 3개의 상이한 진균 생물체를 이용하여 진균성 발효에 대해 측정한 것이었다. 비교되는 3개의 진균 생물체는 다음과 같다:트리코데르마 롱기브라키아툼(이전에T. 리세이),아스페르길러스 니거및크리소스포륨 루크노웬스(UV 18-25).
점성도
점성도는 작은 샘플 어댑터 및 스핀들 31번을 이용하여 Brookfield LVF 점성도계로 측정한다.
물 재킷을 평형화하기 위하여 점도계를 사용하기 전에 회전 펌프를 5분으로 맞춰놓는다. 수욕 온도는 30 ℃이어야 한다.
발효 브로스의 새로운 샘플을 수득하고 작은 샘플 스핀들에 브로스 10 ㎖를 넣는다. 10-80의 범위에서 판독하기 위한 스핀들 속도를 선택한다. 4 분간 방치한 후에 점도계 눈금을 읽는다. 센티포와즈(cP)로 점성도를 얻기 위하여 하기에 주어진 율로서 판독을 증대시킨다.
스핀들 속도 증대율
6 50
12 25
30 10
60 5
다음의 점성도 범위는 전술한 방법을 이용하여 특정의 진균 생물로 발효에 대해 측정하였다.
점성도 (cP)
T. 롱기브라키아툼200∼600
A. 니거1,500∼2,000
C. 루크노웬스(UV 18-25) LT 10
생물체량
생물체량은 다음의 공정들에 의하여 측정한다.
5.5 cm 여과지(Whatman 54)를 알루미늄 칭량 접시에서 사전 칭량한다.
5.0 ㎖ 전체 브로스를 흡인 여과기상에서 5.5 cm 여과지를 통과시켜 여과하고 여과고형분를 10 ㎖ 탈이온수로 세정한 후에, 세정된 고형분을 놓고 칭량팬에서칭량한 후 밤새 60 ℃에서 건조시킨다. 100 ℃에서 1 시간 동안 건조를 완료하고 건조기에 방치하여 냉각시킨다.
건조물의 중량을 측정한다. 총 생물체량(g/l)은 200 배한 최초중량과 최종중량이 차이와 동일하다.
다음의 생물체량 범위는 전술한 공정을 이용하여 특정 진균 생물로 발효에 대해 측정하였다.
생물체량 (g/l)
T. 롱기브라키아툼2.5-5
A. 니거5-10
C. 루크노웬스(UV 18-25) 0.5-1
단백질
단백질 양은 Sigma Company의 BioRad Assay Procedure를 이용하여 측정하였다. 단백질 양은크리소스포륨에서 제일 높았다.
전술한 데이터는 발효 공정 마지막까지 48 시간동안 발효 공정에서 측정한 값을 나타내고;아스페르길러스및트리코데르마의 모든 값은 유사한 공업적인 진균 생물에 대한 것이고, 실제 공업 데이터를 반영한다.
C. 루크노웬스(UV 18-25)의 진균 균주는 발효시 저점성도가 낮은 전력 공급 및/또는 전단을 이용하게 하여 생성물에 대한 전단 강도가 생성물 분자의 물리적인 손상에 기인하여 생산성에 해가되는 그러한 경우 산소 요구량에 부합시키는 장점이 있다. 고 단백질 생성시 저 생물체량을 생성하는 생물은 발효 배지에서 생성물로의전환면에서 보다 효율적인 생물을 나타낸다. 따라서크리소스포륨은 향상된 생물체량 및 점성도를 제공할 뿐 아니라 상응하는 양 이상의 단백질을 배출하고, 사실 4개의 일반적인 공공 콜렉션에 기탁된 통상의아스페르길러스또는트리코데르마 리세이균주보다 우수한 것이 명백한 공업적으로 사용되는 2개의 시스템보다 매우 많은 단백질을 배출한다.
C. 루크노웬스에 의하여 생산되는 저생물체량 농도로 고 단백질을 생성하는 것은, 증가된 생물체량이 증가된 생산성의 결과가 된다면, 한계 발효 조건에 도달하기 전에 소정의 생성물에 대하여 생물체량 면에서 고배율로 발효 조건을 개선시키는 것을 가능하게 하는 것이다.T. 롱기브라키아툼및A. 니거생물체에 의해 생산된 현재의 고 생물체량 수준 및 점성도의 수준은 생물체량의 증가를 억제하며, 이것은 현재의 생물체량 수준 및 점성도 수준이 실질적인 한계 발효 조건에 가까이 있다는 것과 같다.
크리소스포륨, 트리코데르마 및 톨리폴클라둠 게오데스의 실시예
2개의 형질전환되지 않은크리소스포륨C1 균주 및 1개의트리코데르마 리세이비교 균주를 2개의 배지에서 시험 하였다(Gs pH 6,8 및 Pridham agar, PA, pH 6,8). 항생제 내성 수준을 시험하기 위하여 포자를 7 일간 방치한 PDA 플레이트로부터 회수하였다. 선택 플레이트를 32 ℃ 에서 항온 배양하고 2일, 4일 및 5일 후에 기록하였다. 상기 결과는 C1 균주 NG7C-19 및 UV 18-25는 명백하게 플레오마이신 및 하이그로마이신 모두에 대해 낮은 기본적 내성을 가졌다. 이 수준은 실험실 균주로서 통상 사용되는 비교T. 리세이에 대한 값에 상당하는 것이다. 따라서 이들 2개의 표준 진균 선택 마아커는크리소스포륨균주에 사용될 수 있다는 것을 명백하게 나타낸다. 다른 표준 진균 선택 마아커가 가진 문제가 있어서는 안된다.
Sh-ble(플레오마이신-내성) 형질전환된크리소스포륨균주의 선택이 50 ㎍/㎖에서 성공적으로 실시되었다. 이것은T. 리세이에 대해 사용하는 선택 수준이고 따라서 상이한 선택이크리소스포륨에서 용이하게 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기와 동일한 설명이 150 ㎍/㎖의 수준에서 하이그로마이신 내성을 가진 형질전환된 균주에 대하여도 유효하다.
Gs (pH 6.8) Pridham Agar (PA, pH 6.8)
NG7C-19 UV 18-25 T. r. 11D5 NG7C-19 UV 18-25 T. r. 11D5
플레오마이신 7.5 ㎍/ml 10 ㎍/ml 5-7.5 ㎍/ml 2.5 ㎍/ml 10 ㎍/ml 2.5 ㎍/ml
하이그로마이신 7.5-10 ㎍/ml 10 ㎍/ml 10 ㎍/ml 15 ㎍/ml 25㎍/ml 15 ㎍/ml
원형질체 형질전환 기술은 매우 통상적으로 적용되는 진균성 형질전환 기술을 기초로 하여크리소스포륨에 사용되었다. 1개의 90 mm PDA 플레이트로부터의 모든 포자를 8 ㎖ ICI에서 회수하고 35℃ 및 200 rpm에서 15시간 동안 항온 배양의 50 ㎖ ICI 배지의 진동 플라스크내로 이동시켰다. 이후 배양물을 원심분리하고 펠렛을 MnP로 세척한다음, 10 ㎖ MnP 및 10 ㎎/㎖ 카일라제 C3이 있는 용액에 돌려놓고 35 ℃에서 30분간 교반하면서(150 rpm) 항온배양하였다.
용액을 여과하고 여과물을 3500 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 펠렛을 10 ㎖ MnPCa2+로 세정하였다. 이것을 25 ℃에서 10분간 원심분리하였다. 이후 차가운 MPC 50 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 30 분간 얼음상에 방치한 후 그 위에 2.5 ㎖PMC 를 첨가하였다. 15분 후에 실온에서 처리된 원형질체 500 ㎕를 MnR Soft 3㎖에 혼합하고 선택제로서 플레오마이신 또는 하이그로마이신을 함유하는 MnR 플레이트상에 평평하게 하였다. 5일간 30 ℃에서 항온 배양 한 후에 형질전환체를 분석하였다(클론은 48시간 후에 볼 수 있다). 형질전환 효율은 비교 플라스미드 pAN8-11910㎍을 이용하여 측정하였다. 결과는 다음 표4에서 개시하고 있다.
형질전환 효율(비교 플라스미드 pAN8-1, 10 ㎍ 사용)
T. 리세이 NG7C-19 UV18-25
유효성 106/200 ㎕ 5 106/200 ㎕ 5 106/200 ㎕
200㎕ 당 형질전환체 2500 104 104
106의 생육가능한 셀 당 형질전환체 2500 2000 2000
결과는크리소스포륨형질전환체 가시성이트리코데르마형질전환체 가시성보다 우수하다는 것을 나타낸다. 균주의 형질전환성은 상당하고 따라서 1번의 실험에서 수득되는 형질전환체의 숫자는크리소스포륨의 경우T. 리세이에 비하여 4배나 높다. 따라서크리소스포륨형질전환체 시스템은 통상 사용되는T. 리세이시스템과 동등할 뿐 아니라 그것을 능가한다. 이러한 진보는 pAN8-1보다 형질전환에 있어서 덜 효율적인 벡터에 대하여 충분히 유용하다는 것을 증명할 수 있다. 이러한 덜 효율적인 형질전환 벡터의 예로는 통상 10배 정도 적은 형질전환체를 통상 수득하기 위한 비-진균성 단백질 생산용 단백질 담체 벡터를 들 수 있다.
다수의 기타 형질전환 및 발현 벡터를 동종의크리소스포륨단백질 암호화 서열 및크리소스포륨을 이용하여 형질전환 실험에 사용하기 위한 이종의 단백질암호화 서열로서 구성였다. 상기 벡터 맵은 도6-11에 제공된다.
발현될 동종의 단백질을크리소스포륨에 의하여 생산된 셀룰라제 군으로부터 선택할 수 있으며 6군(MW 43 kDa)에 속하는 엔도글루카나제 6으로 구성되어 있으며 이종의 단백질은 페니실린의 12군(MW 25 kDa)에 속하는 엔도글루카나제 3으로 구성되어 있다.
pF6g는 엔도- 글루카나제 6 시그널 서열에 결합된크리소스포륨엔도글루카나제 6 프로모터 분절을 포함하며, 프레임상에 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임 뒤에 엔도글루카나제 6 터미네이터 서열이 뒤따른다. 형질전환 선택은 선택가능한 벡터를 구비한 형질전환법을 이용하여 실시한다.
pUT1150은 엔도- 글루카나제 6 시그널 서열에 결합된트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 프로모터 분절을 포함하며, 프레임상에 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임 뒤에T. 리세이셀로비오하이드롤라제 터미네이터 서열이 뒤따른다. 또한 벡터는 선택 마아커를 구비한, 즉 플레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자) 를 구비한 제2 발현 카셋트를 보유한다.
pUT1152는 엔도- 글루카나제 6 시그널 서열에 결합된아스페르길러스 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 A 프로모터 분절을 포함하며, 프레임상에 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임 뒤에,A. 니둘란스안트라닐레이트 신타제(trpC) 터미네이터 서열이 뒤따른다. 또한 이 벡터는 선택 마아커를 구비한, 즉 플레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자) 를 구비한 제2 발현 카셋트를 보유한다.
pUT1155는트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 시그널 서열에 연결된A. 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 A 프로모터를 포함하며, 프레임상에 담체 단백질 Sh-ble 가 있고 이것은 연속하여 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임과 연결되어 있으며,A. 니둘란스trpC 터미네이터 서열이 뒤따른다. 이 벡터는 관심있는 단백질에 융합되는 담체 단백질 기술을 이용하고 있으며 이것은 관심있는 단백질의 분비를 매우 증진시키는 것으로 공지되어 있다.
pUT1160은트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 시그널 서열에 결합된아스페르길러스 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 A 프로모터를 포함하며, 프레임상에 담체 단백질 Sh-ble 가 있고 연속하여 페니실럼의 엔도글루카나제 3 오픈 리딩 프레임과 연결되어 있으며, A. 니둘란스 trpC 터미네이터 서열이 뒤따른다.
pUT1162는T. 리세이셀로비오하이드롤라제 터미네이터 서열이 뒤따르는페니실럼의 엔도글루카나제 3 오픈 리딩 프레임을 구비한 프레임상에서, 엔도 글루카나제 3 시그널 서열과 연결된아스페르길러스 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 A 프로모터 분절을 포함한다. 또한 이 벡터는 선택 마아커를 구비한, 즉 플레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자) 를 구비한 제2 발현 카셋트를 보유한다.
비교 형질전환
벡터 균주 형질전환 형질전환이 없음. 배양액에서 시험
PUT1150 UV 18-24 플레오마이신 선택 285 5
T.geodes 플레오마이신 선택 144 5
PUT1152 UV 18-24 형질전환 pAN8.1 398 5
T.geodes 형질전환 pAN8.1 45 4
PF6g UV 18-24 형질전환 pAN8.1 252 6
T.geodes 형질전환 pAN8.1 127 5
PUT1162 UV 18-24 플레오마이신 선택 >400
T.geodes 아직 미실시
표5는크리소스포륨UV 18-25 및톨리포클라둠 게오데스모두의 형질전환 결과를 나타낸다. 사용된 형질전환 프로토콜은 이종의 형질전환에 대한 섹션에 기재되어 있다.
크리소스포륨 형질전환체의 이종 및 동종 발현의 예
C1 균주(NG7C-19 및/또는 UV 18-25)를 그들의 다양한 이종의 단백질을 분비하는 능력면에서 시험하였다: 박테리아 단백질[스트렙토알로테이커스 힌두스타누스플레오마이신-내성 단백질(Streptoalloteichus hindustanusphleomcin-resistance protein), Sh-ble], 진균 단백질[트리코데르마 리세이크실라나제 II(Trichoderma reesaixylanase II), XYN2] 및 인간 단백질(인간 리소짐, HLZ).
상기 공정의 상세한 설명은 다음과 같다.
[1] 스트렙토알로테이커스 힌두스타누스 플레오마이신-내성 단백질 (Streptoalloteichus hindustanus phleomycin-resistance protein) (Sh ble)의 C1 분비
C1 균주 NG7C-19 및 UV 18-25는 플라스미드 pUT7201에 의하여 형질전환되었다. 이 벡터는 다음의 진균성 발현 카셋트를 나타낸다.
-아스페르길러스 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 (gpdA) 프로모터2
-합성적트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 (cbh1) 시그널 서열1,3
-스트렙토알로테이커스 힌두스타누스플레오마이신-내성 단백질 Sh ble4
-아스페르길러스 니둘란스 트립토판-신타제(trpC) 터미네이터5
또한 상기 벡터는 베타-락타마제 유전자(bla) 및 pUC186로부터 유래된이.콜라이복제 기원을 보유한다. 상세한 플라스미드 맵은 도2에 제공되어 있다.
C1 원형질체를 C1(배지 및 용액 조성물은 본 명세서의 다른 부분에 명시)에 적응한 Durand 등7에 따라 형질전환시켰다: 형질전환된 C1 균주의 1개 90 mm PDA 플레이트의 모든 포자를 8 ㎖ ICI 에서 회수하고 35℃ 및 150 rpm에서 15시간 항온 배양의 50 ㎖ ICI 배지의 진동 플라스크내로 이동시켰다. 그 결과 배양물을 회전시키고, 펠렛을 MnP로 세척한다음, 10 ㎖ MnP + 10 ㎎/㎖ 카일라제 C3에서 용해시키고 35 ℃에서 30분간 교반하면서(150 rpm) 항온배양하였다. 용액을 여과하고 여과물을 3500 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 펠렛을 10 ㎖ MnPCa2+로 세정하였다.이것을 3500 rpm에서 10분간 회전시키고 펠렛을 1 ㎖ MnPCa2+로 세정하였다. pUT720 DNA 10 ㎍을 원형질 용액 200 ㎕에 첨가하고 실온에서(20 ℃)에서 10분간 항온배양하였다. 이후 차가운 MPC 50 ㎕ 를 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분간 얼음위에 방치시키고 2.5 ㎖, PMC를 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 처리된 원형질체 500 ㎕를 MnR Soft 3㎖에 혼합시키고 즉시 선택제로서 플레오마이신(pH 6.5에서 50 ㎍/㎖) 을 함유하는 MnR 플레이트상에서 평평하게 하였다. 5일간 30 ℃에서 항온 배양 한 후에 형질전환체를 분석하였다(클론은 48시간 후에 보이기 시작한다).
C1 형질전환체의 Sh ble 생산(플레오마이신-내성 클론)을 다음과 같이 분석하였다: 제1 형질전환체를 GS+플레오마이신(5㎕/㎖) 플레이트로 집어내고 5시간동안 32 ℃에서 내성 입증을 위하여 생장시켰다. 각각이 유효한 내성 클론을 GS 플레이트상으로 서브클로닝되었다. 형질전환체 당 2개의 서브클론이 PDA를 접종하는 데 사용되어 액체 배양 개시를 위한 포자를 수득하였다. ICI 에서의 액체 배양물은 5일간 27 ℃(200 rpm에서 진동)에서 생장하였다. 이후 상기 배양물을 원심분리하였고(5000 g, 10분), 상청액 500 ㎕를 회수하였다. 이들 샘플로부터 상기 단백질을 TCA를 이용하여 침전시키고 Western Sample Buffer에서 재현탁하여 4 ㎎/㎖ 의 총 단백질(Lowry Method8)을 얻었다. 10 ㎕(총 단백질 약 40㎍)을 12 % 아크릴아미드/ SDS 겔상에서 부하시키고 전개시켰다(BioRad Mini Trans-Blot sysems). 웨스턴 블로팅을 BioRad 의 지시(Schleicher & Schull 0.2 ㎛ 막)에 따라 토끼 항혈청(Cayla Cat.Ref.#ANTI-0010)을 제1 항체로 이용하여 실시하였다.
결과는 도1 및 표6에 나타나 있다:
Cl에서 추정된 Sh ble 생산량
Western 블롯에서 추정된Sh ble 량 생산 배지내에서 추정된 Sh ble 농도
미형질전환된 NG7C-19 검출 불가
Ng7C-19::720 클론 4-1 25 ng 0.25 mg/l
Ng7C-19::720 클론 5-1 25 ng 0.25 mg/l
Ng7C-19::720 클론 2-2 250 ng 2.5 mg/l
미형질전환된 NG7C-19 검출 불가
UV18-25::720 클론 1-2 500 ng 5 mg/l
UV18-25::720 클론 3-1 250 ng 2.5 mg/l
이들 데이터는 다음을 설명한다:
1) pUT720의 이종 전사/번역 시그널이크리소스포륨에서 기능적이다.
2) pUT720의 이종 시그널 서열이크리소스포륨에서 기능적이다.
3)크리소스포륨은 이종 박테리아 단백질의 분비를 위한 숙주로 사용될 수 있다.
[2] 인간 리소짐(HLZ)의 C1 분비
C1 균주 NG7C-19 및 UV 18-25는 플라스미드 pUT7201에 의하여 형질전환되었다. 이 벡터는 다음의 진균성 발현 카셋트를 나타낸다.
-아스페르길러스 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제 (gpdA) 프로모터2
-합성트리코데르마 리세이셀로비오하이드롤라제 (cbh1) 시그널 서열1,3
-담체 단백질로 사용되는스트렙토알로테이커스 힌두스타누스플레오마이신-내성 유전자Sh ble 4
-pAN56-211,12에서 복제된아스페르길러스 니거플루코아밀라제(glaA2) 힌지 도메인
-KEX2-유사 단백질 절단부1를 특징으로 하는 링커 펩티드
-합성 인간 리소짐 유전자(hlz)10
-아스페르길러스 니둘란스트립토판-신타제(trpC) 터미네이터5
또한 상기 벡터는 베타-락타마제 유전자(bla) 및 pUC186로부터 유래된이.콜라이복제 기원을 보유한다. 상세한 플라스미드 맵은 도3에 제공되어 있다.
C1 원형질체를 이미 실시예 1에 기재한 것과 동일한 공정에 따라 플라스미드 pUT970G를 이용하여 형질전환하였다. 융합 단백질은(Sh ble:GAM 힌지::HLZ) 은 C1 형질전환체를 선택하기 용이한 플레오마이신-내성면에서 기능적이다. 더욱이 플레오마이신 내성 수준은 hlz 발현 수준과 대략적으로 관련되어 있다.
C1 형질전환체(플레오마이신-내성 클론)의 HLZ 생성은 다음과 같은 리소짐-활성에 의하여 분석한다: 제1 형질전환체를 GS+플레오마이신(5㎕/㎖) 플레이트로 (내성 검증), LYSO 플레이트상에(영역 가시화를 명백하게 함으로써 HLZ 활성 검출1,10) 집어냈다. 플레이트를 5시간동안 32 ℃에서 생장시켰다. 각각 유효한 내성 클론을 LYSO 플레이트상으로 서브클로닝시켰다. 형질전환체 당 2개의 서브클론이PDA를 주입하는 데 사용되어 액체 배양 개시를 위한 포자를 수득하였다. ICI 에서의 액체 배양물은 5일간 27 ℃(180 rpm에서 진동)에서 생장하였다. 이후 상기 배양물을 원심분리하였다(5000 g, 10분). 이들 샘플로부터 리소짐 활성을 Morsky 등13에 따라 측정하였다.
C1에서의 활성 HLZ 생산량
배양배지에서 활성 HLZ 농도
미형질전환된 NG7C-19 0 mg/l
Ng7C-19::970G 클론 4 4 mg/l
Ng7C-19::970G 클론 5 11 mg/l
미형질전환된 UV 18-25 0 mg/l
UV18-25::970 클론 1 8 mg/l
UV18-25::970 클론 2 4 mg/l
UV18-25::970 클론 3 2 mg/l
UV18-25::970 클론 2 2.5 mg/l
이들 데이터는 다음을 나타낸다:
1) 실시예 1의 1 및 2 점이 확인된다.
2) Sh ble 은 내성 마아커로서크리소스포륨에서 기능적이다.
3) Sh ble 은 담체-단백질로서크리소스포륨에서 기능적이다.
4) KEX2-유사 프로테아제 절단부는크리소스포륨에서 기능적이다(그렇지 않으면 HLZ 가 활성일 수 없다).
5)크리소스포륨은 이종의 포유류 단백질의 분비를 위한 숙주로서 사용될 수 있다.
[3] 트리코데르마 리세이 크실라나제 II(XYN2)의 C1 분비.
C1 균주 UV 18-25는 플라스미드 pUT1064 및 pUT1065에 의하여 형질전환되었다. pUT1064는 다음의 2개의 진균성 발현 카셋트를 나타낸다.
제1 카셋트는 플레오마이신-내성 형질전환체를 선택하게 한다.
-뉴로스포라 크라사교차 조절 유전자 1(cpc-1) 프로모터14
-스트렙토알로테이커스 힌두스타누스플레오마이신-내성 유전자 Sh ble4
-아스페르길러스 니둘란스트립토판-신타제(trpC) 터미네이터5
제2 카셋트는 크실라나제 생성 카셋트이다:
-T. 리세이균주 TR2 cbh1 프로모터15
-T. 리세이균주 TR2 xyn2 유전자(시그널 서열을 포함)16
-T. 리세이균주 TR2 cbh1 터미네이터15
또한 상기 벡터는 플라스미드 pUC196로부터 유래된이.콜라이복제 기원을 보유한다. 상세한 플라스미드 맵은 도4에 제공되어 있다.
pUT1065 는 다음의 진균성 발현 카셋트를 나타낸다.
-A. 니둘란스글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로제나제(gpdA) 프로모터2
-합성T. 리세이셀로비오하이드롤라제 (cbh1) 시그널 서열1,3
-담체 단백질로 사용되는 S. 힌두스타누스 플레오마이신-내성 유전자 Shble4
-KEX2-유사 단백질 절단부1를 특징으로 하는 링커 펩티드(SGERK)
-T. 리세이균주 TR2xyn2 유전자(시그널 서열 없음)16
-A. 니둘란스트립토판-신타제(trpC) 터미네이터5
또한 상기 벡터는 베타-락타마제 유전자(bla) 및 pUC186로부터 유래된이.콜라이복제 기원을 보유한다. 상세한 플라스미드 맵은 도5에 제공되어 있다.
C1 원형질체를 이미 실시예 1에 기재한 공정과 동일한 공정에 따라 플라스미드 pUT1064 및 pUT1065를 이용하여 형질전환하였다. 플라스미드 pUT1065 의 융합 단백질은(Sh ble:XYN2) 은 C1 형질전환체를 선택하기 용이하게 하는 플레오마이신-내성면에서 기능적이다. 더욱이 플레오마이신 내성 수준은xyn2발현 수준과 대략적으로 관련되어 있다. pUT1064에 있어서,xyn2는 그 자신의 시그널 서열로 클로닝되었다.
C1 형질전환체(플레오마이신-내성 클론)의 크실라나제 생성은 크실라나제-활성에 의하여 다음과 같이 분석하였다: 제1 형질전환체를 GS+플레오마이신(5㎕/㎖) 플레이트로 (내성 검증), XYLAN 플레이트상에(영역 가시화를 명확히 함으로써 크실라나제 활성 검출17) 집어냈다. 플레이트는 5시간동안 32 ℃에서 생장시켰다. 각각 유효한 내성 클론을 XYLAN 플레이트상으로 서브클로닝하였다. 형질전환체 당 2개의서브클론을 PDA를 주입하는 데 사용하여 액체 배양 개시를 위한 포자를 수득하였다. ICI+5g/l KPhtalate 에서의 액체 배양물은 5일간 27 ℃(180 rpm에서 진동)에서 생장시켰다. 이후 상기 배양물을 원심분리하였다(5000 g, 10분). 이들 샘플로부터 크실라나제 활성을 Miller 등18에 따른 DNS 기술에 따라 측정하였다.
C1 에서의 활성 XYN2 생산량 (최상의 생산자)
배양배지에서 활성 크실라나제 II 배양배지에서 크실라나제 II특정 활성
미형질전환된 UV 18-25 3.9 U./ml 3.8 U./mg 총 단백질
UV18-25::1064 클론 7-1 4.7 U./ml 4.7 U./mg 총 단백질
UV18-25::1064 크론 7-2 4.4 U./ml 4.3 U./mg 총 단백질
UV18-25::1065 클론 1-1 29.7 U./ml 25.6 U./mg 총 단백질
UV18-25::1065 클론 1-2 30.8 U./ml 39.4 U./mg 총 단백질
이들 데이터는 다음을 설명한다:
1) 실시예 2의 1 내지 4 점이 확인된다.
2) C1 은 이종 진균성 단백질의 분비를 위한 숙주로서 사용될 수 있다.
[4] 본 출원인은 형질전환된 UV 18-25의 발현의 데이터를 설명하고자 하며, 여기에서 표1은 어떠한 형질전환이 실시될 것인지에 대한 결과를 나타낸다. 상기 표는 이종의 발현 조절 서열 및 시그널 서열을 이용하지만 또한 동종의 발현 조절 서열 및 시그널 서열을 이용하여서도 양호한 엔도글루카나제 및 셀로비오하이드롤라제의 발현 수준을 나타낸다. 다양한 플라스미드의 상세한 설명은 본 명세서의 다른 부분에서 및 도면으로부터 유도할 수 있다. 알칼리성 pH 에서 35 ℃의 온도에서 생산이 일어난다.
형질전환된 UV 18-25 균주의 실험 데이터
배양물 총 단백질 CMCase β-글루카나제 pH 값
mg/ml u/ml u/mg u/ml u/mg
*UV 18-25 100% 100% 100% 100% 100% 7.90
1150-23 94% 105% 111% 140% 149% 7.90
-30 96% 105% 110% 145% 151% 8.10
1152-3 94% 112% 120% 147% 156% 7.85
-4 100% 105% 105% 132% 132% 7.90
1160-2 69% 81% 118% 90% 131% 7.90
-4 73% 72% 98% 83% 114% 8.35
-1 92% 95% 103% 120% 130% 8.45
1162-1 102% 105% 103% 145% 142% 8.20
-11 112% 109% 98% 115% 103% 8.20
F6g-20 104% 102% 98% 130% 125% 7.90
-25 - - - - - -
배양 조건 (진동 플라스크): 88 시간 35℃, 230 rpm
*모든 상기 도면은 UV 18-25 모균주에 대한 상대적인 %이다.
실시예에 첨부:배지
형질전환 배지:
만델 염기(Mandels Base): Mnp 배지:
KH2PO42.0 g/l 만델 염기와 함께
(NH4)2SO41.4 g/l 펩톤 1 g/l
MgSO4.7H2O 0.3 g/l MES 2 g/1
CaCl20.3 g/l 수크로스 100 g/l
올리고엘레먼트 1.0 ml/l pH 를 5로 조절
MnR MnP CA 2+ :
Mnp+수크로스 130 g/l MnP 배지 +
효모 추출물 2.5 g/l CaCl22H2O 50 mM
글루코스 2.5 g/l pH 를 6.5 로 조절
한천 15 g/l
MnR Soft:단지 7.5 g/l 의 한천만 있는 MnR
MPC:
CaCl250 mM pH 5.8
MOPS 10 mM
PEG 40%
선택 및 배양을 위하여
GS:
글루코스 10 g/l
바이오소야스 5 g/l [Merieux]
한천 15 g/l pH 는 6.8 이어야 함
PDA:
감자 당 한천 39 g/l [디프코]
pH 는 5.5 이어야 함.
MPG:
만델 염기와
K.프탈레이트 5 g/l
글루코스 30 g/l
효모 추출물 5 g/1
50 ㎍/㎖ 플레오마이신 또는 100-150 ㎍/㎖ 하이그로마이신을 구비한 보충된 재생 배지(MnR)가 형질전환체를 선택하는 데 사용된다. 5 ㎍/㎖ 플레오마이신으로 보충된 GS 배지는 항생 내성을 확인하기 위하여 사용된다.
PDA 는 빠른 성장 및 양호한 홀씨 형성을 위한 완벽한 배지이다. 액체 배지는 포자현탁액 1/20th로 주입시키고(5㎖ 0.1 % Tween 내의 1개 90 mm PDA 플레이트로부터의 모든 포자). 상기 배양물은 진동 플라스크(200 rpm)에서 27℃로 생장시킨다.
C1 단백질의 분리 및 특성화
다양한 단백질을 수득하는 공정이 다수의 단백질 특성들 만큼 기재되어 있다. 표1, 2 및 10은 상세한 정제도 및 활성을 제공한다. 분리는 DEAE-Toyopearl 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 본원발명에 참고문헌으로 인용되어 있는 WO 98/15633에서 기재된 방법에 유사하게크리소스포륨배양 여과물로부터 실시한다. 이러한 크로마토그래피로부터 수득된 비결합 분절(F 60-31CF)은 pH 7,6으로 평형을 이룬 후 Macro Prep Q 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제한다. 비-결합 분절(NBNB)을 풀(pool)로 만들고 결합 단백질을 0.1 M- NaCl로 기울기로 서서히 용출하였다. NBNB 분절은 19, 30, 35 및 46 kD의 주요 단백질 밴드 및 51 kD에서 작은밴드를 제공하였다. 0.1M NaCl 경사에서 단백질 피크는 다양한 분절로부터 용출되었다. 39-41은 28, 36 및 60 kD 단백질을 포함하고, 44-48은 33, 36, 55, 60 및 67 kD 단백질을 구비한 주요 단백질로서 28,45 및 66 kD을 포함하였으며, 49-51 분절은 30, 36, 56 및 68 kD 단백질을 부여하고, 52-59 분절은 주요한 33 및 55 kD 단백질을 주요하지 않은 28 및 36 kD 단백질을 포함하였다. 풀을 이룬 NBNB 분절을 추가적으로 소수성 크로마토그래피로서 페닐 수퍼로스 상에서 정제하였다. NBNB 분절을 1.2 M(NH4)2SO4를 함유하는 0.03 M Na-포스페이트 완충용액 pH 7.0 으로 평형화하였고, 컬럼에 가하였다. 흡수된 단백질은 1.2∼0.6 M(NH4)2SO4기울기로 용출시켰다. 따라서 각각 수득된 MW 30 및 51 kD 이고 pI 9.1 및 8.7인 동종 크실라나제는 pI 8.9인 30 kD 프로테아제였다.
크실라나제는 MUF 셀로비오스 활성을 가지고 있지 않고, 따라서 진정한 크실라나제이다. 알칼리성 30 kD 크실라나제(pI 9.1)는 pH 9∼10 에서 최대 활성의 65 % 를 유지하는 5-8의 매우 넓은 pH 내에서 고 활성을 가지고 있다; 이것은 크실라나제 F 군의 일원이다; 이것의 일부 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있다. 일부 기재된 아미노산 서열은 성숙 단백질의 N 말단로부터 약 50-170 의 아미노산에 상응한다. 본 발명에 따른 크실라나제는 아미노산 서열, 서열번호 5번의 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 가장 바람직하게는 80 % 이상의 서열 동일성을 가진다. 상응하는 크실라나제 프로모터는 본 발명의 바람직한 태양인데, 이것은 서열번호 5번의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 이용하여 동정될 수있다. 51 kD 크실라나제(pI 8.7)는 pH 6에서 최대 활성을 가지고, pH 7.5에서 그 활성의 70 % 이상을 보유하고, pH 8.0에서 그 활성의 50 % 이상을 보유하였다. 단지 pH 5.5 에서 15 %의 활성, pH 7.5 에서 4 %의 활성으로는 매우 안정하지는 않다. 자작나무 크실란에 대한 Michaelis 상수는 30 kD 크실라나제에 대해 4.2 g/l이고, 51 kD 크실라나제에 대해 3.4 g/l 이었다. 최적 온도는 둘 모두의 크실라나제에 대해 70 ℃ 이상이었다.
NBNB 분절의 단백질에 대해 측정된 30 kD 프로테아제 활성은 50 ℃, pH 7, 90 kD에서 0.4 x 10-3단위/ml인 것으로 나타났다. 상기 분절은 착색 카세인에 대한 활성, 약 0.4 unit/mg (pH7)을 나타냈다. 카오트로픽제(chaotropic agent)로 요소를 추가하면 프로테아제 활성이 2-3배 증가되었다. 크실라나제 활성에 대한 프로테아제의 효과는 현저하였다. 단지 30 % 크실라나제 활성만이 30분간의 항온배양 후에 pH 10.3, 50 ℃에서 여전히 유지되었다. pH 8 에서 크실라나제 활성의 95 %가 유지되었다. LAS 추가는 pH 8 및 10.3 에서 크실라나제 활성의 현저한 감소를 나타냈으며, 프로테아제 억제제 PMSF 존재 또는 부재하에서 10분간의 항온 배양 후에, 크실라나제 활성의 50 % 만을 나타냈다. 30 kD 프로테아제는 pH 10-11에서 pH를 최적화하여 알칼리성으로 하였다. 상기 활성은 페닐메틸술포닐 플로라이드(PMSF)에 의하여 억제되고 요오드아세트산, 펩스테틴 A 및 EDTA에 의하여 억제되지 않으며, 이것은 세린형 프로테아제로 특징짓는다. 프로테아제는 카오트로픽제 부재, 중성 pH 및 50 ℃에서 C1 단백질에 대해 활성이 아니다. pH 의 상승 및 LAS, SDS와 같은 카오트로픽제 및 요소를 추가하면 단백질 분해를 현저하게 증가시킨다.
39-41 분절을 페놀 수퍼로스로 소수성 크로마토그래피로서 정제하였다. 분절은 1.5 M (NH4)2SO4를 함유하는 0.03 M Na 포스페이트 완충용액 pH 7.2 로 평형시키고 컬럼에 가하였다. 흡수된 단백질은 1.5-0 M (NH4)2SO4에서 용출시켰다. 따라서 MW 60 kD 및 pI4.7의 동종 크실라나제를 수득하였다. 이러한 크실라나제는 크실란, MUF-셀로비오시드, MUF-크실로시드 및 MUF-락토시드에 대해 활성을 가졌다. 상기 크실라나제는 거의 10 군(F 군)에 속한다. 이러한 크실라나제는 24 시간 동안 5 내지 8의 pH에서 안정하며, 50 ℃에서 80 % 이상의 활성을 보유하였다. 60 ℃, 5∼7의 pH에서 70 % 의 활성을 보유하였다. 50 ℃, pH 9 에서 5 시간동안 80 %의 활성을, 24시간 동안 35 % 의 활성을 유지하였다. pH 10에서, 60 % 의 활성이 50 ℃, 0.5 시간의 항온 배양시 유지되었다. pH 8에서, 60 ℃의 5시간의 항온 배양 후에 24시간이 지나면 0으로 감소하는 것으로 밝혀졌다. pH 6∼7 범위에서 최적의 pH를 가졌으며 그 활성을 pH 9에서 70 %, pH 9.5에서 50 %로 유지하였다. 자작나무 크실란에 대한 Michaelis 상수는 0.5 g/l이었다. 최적 온도는 80 ℃ 이상이었다.
이후 분절 44-48 을 단백질 용출에 사용되는 7.63∼5.96의 pH 기울기로 Mono P.A로 크로마토포커싱(chromatofocusing)에 의하여 정제하였다. 결론적으로 45 kD의 엔도글루카나제가 pI 6으로 분리되었다. 45 kD 엔도는 pH 5에서 CMC 에 대해 최대의 활성을 갖고, RBB-CMC에 대해 pH 5∼7에서 최대 활성을 갖는다. 45 kD 엔도는 pH 6.5에서 CMC 에 대해 최대의 활성의 70 %를 유지하고, RBB-CMC에 대해서 70 %의 최대 활성은 pH 7.0에서 유지시켰다; CMC에 대한 최대 활성의 50 % 는 pH 7에서 유지되고, RBB-CMC에 대해서 최대 활성의 50 %는 pH 8.0에서 유지시켰다. CMC 에 대한 Michaelis 상수는 4.8 g/l이었다. 최적 온도는 80 ℃ 이상이었다. 기타의 단백질 28, 33, 36, 55, 60 및 66 kD은 함께 혼합되어 용출되었다.
분절 52-58 을 7.6∼4.5의 pH 기울기로 Mono P too 로 크로마토포커싱 (chromatofocusing)에 의하여 정제하였다. pI 4.9의 각각의 55 kD 엔도글루카나제가 수득되었다. 55 kD 엔도는 중성이었다. pH 4.5-6의 넓은 최적 pH를 CMC 및 RBB-CMC에 대해 가지며, 50 % 의 활성을 pH 8에서 CMC 및 RBB-CMC에 대해 유지시켰다. CMC 에 대한 Michaelis 상수는 1 g/l이었다. 최적 온도는 80 ℃ 이상이었다. 다수의 분절 또한 MW 28, 33 및 36 kD의 단백질을 가졌다.
45, 48 및 100 kD 단백질을 Macro Prep Q 크로마토그래피를 이용하여 50-53 분절로부터 크리소스포륨 배양물의 F 60-8 UF conc. 의 결합된 DEAE Toyopearl 분절로부터 분리하였다.
분절 50-53 을 0.03 M 이미다졸 HCl 완충용액, pH 5.75로 평형화시키고, 컬럼에 적용시킨 후 흡수된 단백질을 0.1-0.25 M NaCl 경사에서 4 시간 동안 용출시켰다. 결론적으로 45 kD(pI 4.2), 48 kD(pI 4.4) 및 100 kD(pI 4.5) 단백질을 동종 상태로 분리하였다.
45 kD 는 p-니트로페닐 알파-갈락토시다제 및 p-니트로페닐 베타-갈락토시다제에 대한 그 활성으로 인하여 알파 베타-갈락토시아제일 것이다. 최적 pH 는 4.5이고 70 % 활성은 pH 5.7에서 유지되며, 활성의 50 % 는 pH 6.8 에서 유지되었다. 최적 온도는 60 ℃였다.
48 kD 단백질은 p-니트로페닐 베타-글루코시다제에 대한 고활성 및 MUF 셀로비오시드, MUF 락토시드 및 p-니트로페닐 부티레이트에 대해 활성을 갖는 셀로비오하이드롤라제였다.
pI 4.5 인 100 kD 단백질은 p-니트로페닐 부티레이트에 대해서만 활성을 가졌다. 이것은 에스테라제일 것이나 페룰산의 메틸 에스테르에 대항하는 활성이 없으므로 페룰로일 에스테라제는 아니다. 중성/알칼리성 최적 pH (pH 8-9)을 가지고 최적 온도는 55-60 ℃이었다.
pI 4.2 인 90 kD 단백질은 결합된 분절로부터 분리되었고 NBNB 분절의 단백질에 대하여 측정된 활성은 50 ℃, pH 7에서, 90 kD에서 12 x 10-3단위/ml와 같았다. 상기 분절은 착색 카세인 0.01 임의의 단위/mg(pH 7)에 대하여 활성을 나타냈다. 카오트로픽제로서 요소의 추가는 프로테아제 활성의 2-3배 증가를 가져오고, pH 7 및 9(50 ℃) 모두에서 LAS의 추가도 마찬가지이다. 90 kD 프로테아제는 중성이고 pH 8에서 최적이었다. 활성은 페닐케닐술포닐 플로라이드(PMSF) 에 의하여 억제되고 요오드아세트산, 펩스타틴 A 및 EDTA에 의하여 억제되지 않으며, 이것은 세린형 프로테아제로 특징짓는다.
pI 4.2 인 43 kD 엔도글로카나제(분절 33-37) 및 pI 4.1 인 25 kD 엔도글루카나제(분절 39-43), pI 4.9 인 55 kD 셀로비오하이드롤라제(분절 39-43) 및 pI 4.4 인 65 kD 폴리갈라투로나제(분절 39-43) 또한 결합된 분절로부터 분리되었다. 엔도글루카나제는 아비셀 또는 MUF 셀로비오시드에 대하여 활성을 가지고 있지 않으며 MC, RBB-CMC, CMC41, 베타-글루칸 및 엔도글루카나제에 대하여 고활성을 가졌다. 25 kD 엔도는 CMC로부터 글루코스를 생산하지 않았고 43 kD 엔도는 생산하였다. 글루코스는 아비셀로부터 형성되지 않았다. 43 kD 단백질에 대한 최적의 pH는 4.5이고 70 % 의 최대 활성은 pH 7.2에서 유지되었으며, 50 % 의 최대 활성은 pH 8에서 유지되었다. 43 kD 엔도는 pH 5 및 6에서 25시간의 항온배양 동안 70 % 의 활성을 유지하였다. 이것은 상기 항온 배양 기간동아 pH 7에서 10 % 만을 유지하였다. 25 kD 엔도는 pH 5 에서 CMC에 대하여 활성의 최적 pH를 가지고, RBB-CMC 에 대하여 넓은 최적의 pH, pH 9 에서 최대 활성의 70 %를, pH 10 에서 최대 활성의 50 %를 가졌다. pH 5 및 6에서 100 % 의 활성을 가지고 pH 7, 8, 8.6 및 9.6에서 120 시간의 항온 배양 동안 80 % 의 활성을 유지하였다. 25 kD 엔도는 70 ℃에서 최적의 활성 온도를 가졌다. 43 kD 엔도는 60 ℃에서 최적의 온도를 가졌다. PGA 에 대한 Michaelis 상수는 3.8 g/l이었다. PGU 활성의 최적 pH는 pH 5-7 범위내이고 최적의 온도는 50-65 ℃ 범위내이다.
유전자 암호화C. 루크노웬스단백질을 PCR을 이용하여 수득하였고 서열 분석에 의하여 묘사하였다. 대응하는 전체 유전자를 분리된 PCR 분절을 이용하여 스크리닝(부분) 유전자 라이브러리에 의하여 수득하였다. C1 균주의 43 kD 엔도글루카나제 총 유전자(EG 6, 6군)는 클로닝되었고, 서열화되었으며 분석되었다(2.5 kb 프로모터 영역 및 0.5 kb의 터미네이터 영역을 포함). 그것의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 번호 1번에 기재되어 있다. 예시된 성숙 단백질의 분자량은 39,427 Da이고 예시된 pI는 4.53 이며, 이 값은 측정된 값에 잘 대응한다. 6.2 군의 기타 글리코실 하이드롤라제로 단백질 정열 분석은, C1-EG6 이 SwissProt SAMBA소프트웨어(Smith & Waterman algorithm, Gap penalty 12/2, alignment 10, Blosum62 matrix)를 이용하여 셀룰로스-결합 도메인(CBD) 상동 분석을 포함하지 않으며, C1-EG6 은푸사룸 옥시스포룸EG-B와 51.6 % 의 동일성(375 아미노산 이상)을 나타내고,트리코데르마 리세이CBH2와 50.7 %의 동일성(376 아미노산 이상)을 갖는다는 것을 보여준다. 추정되는 시그널 서열은 Met 1 에서 Arg 28에 걸쳐있다. 프로모터는 수개의 잠재적인 CreA 결합 부위를 함유하고, 따라서 이 프로모터는 CreA 조절을 작용시키면서 진균 균주에서 글루코스를 억제시키는 것 같다.
유사하게는 C1 균주의 25 kD 엔도글루카나제(EG5, 45 군) 전체 유전자는 클로닝되고 서열화되고 분석된다(3.3 kb 프로모터 영역 및 0.7 kb의 터미네이터 영역을 포함). 그것의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 번호 2번에 기재되어 있다. 예시된 성숙 단백질의 분자량은 21,858 Da이고 예시된 pI는 4.66 이며, 이 값은 측정된 값에 잘 대응한다. 이것은 최소의 진균 엔도글루카나제로 알려진 데이터이다. 45 군의 기타 글리코실 하이드롤라제의 단백질 정열 분석은 C1-EG5가 셀룰로스 바인딩 도메인(CBD)를 함유하지 않으며, 코헤젼/도커린 도메인도 함유하지 않는다는 것을 나타낸다. NCBI-BLASTP2 소프트웨어(Gap penalty 11/1, alignment 10, Blosum62 matrix)를 이용한 상동 분석은 C1-EG5에 가장 가까운 동종 단백질인푸사룸 옥시스포룸EG-K와 63 % 의 동일성을 나타낸다. 추정되는 시그널 서열은 Met 1 에서 Arg 18에 걸쳐있다. 프로모터는 수개의 잠재적인 CreA 결합 부위를 함유하고, 따라서 이 프로모터는 CreA 조절을 작동시키면서 진균 균주에서 글루코스 억제시키는 것 같다.
더우기, 추가적인 엔도글루카나제는 12 군 셀룰라제 동종 분석에 기초하여 PCR에 의하여 밝혀졌다. 이 추가적인 엔도글루카나제의 부분적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은(EG3, 12 군) 서열 번호 3번에 기재되어 있다.
55 kD 단백질은 MUF-셀로비오시드, MUF 락토시드, FP 및 아비셀에 대항하는 활성을 가지는 또한 p-니트로페닐 β-글루코시드, 셀로비오스 및 p-니트로페닐 락토시드에 대항하는 활성을 가지는 셀로비오하이드롤라제(본원에서 DBH1)였다. MUF- 셀로비오시드에 대한 활성은 셀로비오스에 의하여 억제된다. 억제 상수 0.4 mM가 측정되었다. MUF 셀로미오시드에 대한 Michaelis 상수는 0.14 mM이었고, MUF 락토시드에 대한 상수는 4 mM이었으며 CMC 에 대한 상수는 3.6g/l이었다. 최적 pH는 4.5 내지 7로 좀 넓은 편이고 CMC 에 대한 최대 활성의 50 % 및 RBB-CMC 에 대한 활성 80 %는 pH 8에서 유지되었다. pH 5-8 범위내에서 70-80 %의 활성이 25 시간의 항온 배양 동안 유지되었다. 최적 온도는 60-70 ℃이다. CBH1 은 아마도 셀로비오하이드롤라제 7군의 일원일 것이다; 그것의 부분적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 서열 번호 4번에서 기재하고 있다. 부분적인 아미노산 서열은 성숙 단백질의 N 말단으로부터 약 300- 450 아미노산에 상응하도록 묘사되었있다. 본 발명에 따른 셀로비오하이드롤라제는 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 가장 바람직하게는 80 % 이상 서열 번호 4번의 부분적인 아미노산 서열과 동일성을 가진다. 상응하는 CBH 프로모터는 본 발명의 바람직한 태양인데. 부분적인 뉴클레오티드 서열의 서열 번호 4번을 이용하여 동정할 수 있다. 합성 효과는 아비셀 가수분해 동안 25 kD 엔도 및 55 kD CBH 사이에서 관찰되었다. 상승작용 계수는 25 kD 대 55 kDCBH 의 비를 80:20 으로 하였을 때 가장 크다. Ksyn는 이 최대값에서 1.3 이었다.
5개의 주요한크리소스포륨유전자의 발현 정도는 Northern 분석에서 연구되었다. 다양한C. 루크노웬스균주를 셀룰로스 및 락토스를 함유한 파메디아 (pharmedia)를 함유하는 영양이 풍부한 배지(배지 1)에서, 또는 파메디아 및 글루코스를 함유하는 영양이 풍부한 배지(배지 2)에서 33℃로 생장시켰다. 48 시간후에, 균사체를 배양하고 RNA 를 분리하였다. RNA 를 5개의 상이한 프로브로 잡종화하였다: EG5, EG6, EG3, XyIF 및 CBH. 노출시킨 후에, 블롯상의 mRNA의 양을 조절하기 위하여 Northern 블롯을 벗겨내고 다시 리보솜 L3레 대한 프로브로 다시 잡종화하였다. 대부분의 균주는 CBH에 대하여 고 반응성을 나타냈으며 배지 1에서 VyIF 에 대해 고 반응성; 배지 2에서 균주의 절반이 모든 유전자에 대하여 고 반응성을 나타냈고 나머지 반은 낮은 반응성을 나타냈다. 발현 강도는 이들 데이터로부터 CBH> XyIF>EG%> EG3> Eg6으로서 추론되었다.
표 1, 2 및 10은 상기 설명한 부분을 나타낸다.
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Claims (29)

  1. 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 돌연변이체크리소스포륨균주로서, 상기 핵산 서열은 작동적으로 발현-조절 영역에 연결되어 있고 선택적으로 분비 시그널 서열에 연결되어 있으며, 동일한 조건에서 상기 돌연변이체 균주가 상기 균주에 상응하는 비-돌연변이체 균주보다도 고농도로 상기 폴리펩티드를 발현시키는 돌연변이체크리소스포륨균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체가 이종 폴리펩티드-암호화 핵산 서열에서 선택된 1 이상의 이종 핵산 서열의 안정한 도입을 포함하는 재조합 방법에 의하여 수득되는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 식물, 동물(인간 포함), 조류(藻類), 세균, 고세균 또는 진균 기원의 이종 폴리펩티드인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 동종의 폴리펩티드로서, 동일한 조건하에서 상응하는 비-돌연변이 균주에서 보다 고농도로 발현되는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 탄수화물-분해 효소, 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 기타의 하이드롤라제, 옥시도리덕타제 및 트랜스퍼라제로부터 선택되는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 유기산을 비롯한 제1 대사 산물과 항생제를 비롯한 제2 대사산물을 (과) 생산하게 하는 진균성 효소로부터 선택되는 돌연변이체크리소스포륨균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 5 이하의 pH, 특히 6 이하의 pH에서 불활성화 되는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 6 이상의 pH에서 최적의 활성 및/또는 안정성을 나타내거나, 및/또는 6 이상의 pH에서 활성 및/또는 안정성의 70 % 이상을 나타내는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체크리소스포륨균주가 이종의 시그널 서열, 바람직하게는 진균성, 예컨대 자낭균의 시그널 서열을 포함하는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  10. 제9항에 있어서, 진균성 시그널 서열이 셀룰라제, β-갈락토시다제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테라제, 프로테아제, 아밀라제, 폴리갈락투로나제 또는 하이드로포빈의 시그널 서열인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 크리소스포륨 균주가 추가적으로 선택 마아커, 예컨대 약에 대해 내성을 공여하거나 영양 부족을 경감시키는 마아커를 포함하는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체크리소스포륨균주가 이종의 발현-조절 영역, 바람직하게는 진균성 발현-조절 서열을 포함하는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  13. 제12항에 있어서, 상기 발현-조절 영역이 유도 프로모터를 포함하는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 발현-조절 영역이 고 발현 프로모터를 포함하는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  15. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체가 자외선 조사 및 화학적 돌연변이 유발 중 1 이상, 바람직하게는 제1차 자외선 조사 단계, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 처리 단계 및 제2차 자외선 조사 단계를 포함하는 돌연변이 유발 단계에 의하여 수득되는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체가크리소스포륨 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 특히C. 루크노웬스균주 C1(VKM F-3500 D)로부터 유래되는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  17. 제16항에 있어서, 상기 돌연변이체가크리소스포륨 루크노웬스돌연변이체 균주 UV13-6(NKM F-3532 D), NG7C-19(VKM F-3633 D) 및 UV18-25(VKM F-3631 D) 중 하나에 상응하거나 이로부터 유래되는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주가트리코데르마 리세이(Trichoderma reesai)생물체량(biomass)의 절반 이하의 생물체량을 나타내며, 배양물 내의 상기트리코데르마는 같은 최적 조건에서 배양되면 200 ∼ 600 cP의 점성도를 나타내는 것인, 돌연변이체크리소스포륨균주.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주가크리소스포륨 루크노웬스돌연변이체 균주 C1, (VKM F-3500 D), UV13-6(NKM F-3532 D), NG7C-19(VKM F-3633 D) 및 UV18-25(VKM F-3631 D) 중 임의의 것에 의하여 생산된 셀룰라제 양(몰/리터) 이상을 생산하는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주가크리소스포륨 루크노웬스균주 C1 (VKM F-3500 D)에 의하여 생산된 프로테아제 보다 적은 양을 생산하는 것인, 바람직하게는 상기 C1 균주에 의하여 생산된 양의 반 이하를 생산하는 것인 돌연변이체크리소스포륨균주.
  21. 크리소스포륨, 바람직하게는크리소스포륨 루크노웬스, 보다 바람직하게는C. 루크노웬스C1 (VKM F-3500 D) 또는 UV18-25(VKM F-3631 D)로부터 유래한 핵산 발현-조절 영역을 포함하며, 이러한 영역이 작동적으로 폴리펩티드-암호화 핵산 서열에 연결되어 있는 핵산 구조체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 발현-조절 영역이 셀룰라제 발현 또는 크실라나제 발현과 관련된 프로모터 서열, 바람직하게는 셀로비오하이드롤라제(CBH1) 프로모터 서열을 포함하는 것인 핵산 구조체.
  23. 제21항 또는 제22항에 따른 핵산 구조체를 함유하며, 코딩 핵산 서열에 의하여 암호화되는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 미생물 균주, 바람직하게는 진균성 균주,
  24. 제1항 내지 20항 및 23 내지 24항 중 어느 한 항에 따른 균주를 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하게 하고 바람직하게는 분비하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드 생산 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법이 상기 폴리펩티드의 전구체의 절단, 바람직하게는 Kex-2 유사 프로테아제로 절단, 임의의 염기성 아미노산 짝을 이룬 프로테아제 또는 Kex-2로의 절단 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, pH 6∼9, 및/또는 25 ℃ 내지 43 ℃ 사이의 온도에서 배양시키는 방법.
  27. 이종 또는 동종의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을크리소스포륨균주에 안정적으로 도입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체크리소스포륨균주를 생산하는 방법으로서, 상기 핵산 서열은 발현 조절 영역에 작동적으로 연결되고, 상기 도입은 섬유상의 진균을 형질전환시키기 위해 그 자체가 공지된 방식으로 실시되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 형질전환 방법이 원형질체(protoplast) 형질전환 방법인 방법.
  29. SDS PAGE 에 의하여 약 30 kD의 분자량, pI 9.1을 가지며, 서열 번호 5번에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 일련의 120 개의 아미노산과 아미노산 동일성이 75 % 인 크실라나제 F 군의크리소스포륨크실라나제.
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