KR20010085753A - 신규한 수용체 단백질 및 그것을 이용한 염증성 질환의 검사 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 미성숙 나무상 세포에서 발견된 신규한 7회 막관통형 수용체 단백질 및 그것을 코드하는 DNA를 개시한다. 또한, 본 발명은 상기한 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA; 상기한 복제 가능한 재조합체 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포; 상기한 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 7회 막관통형 수용체 단백질; 상기한 7회 막관통형 수용체 단백질에 대한 리간드 또는 그 리간드와 7회 막관통형 수용체 단백질과의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법; 및 상기 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 항체를 개시한다. 또한, 본 발명은 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 류마티즘 등의 염증성 질환의 진단 방법을 개시하는 것이다.

Description

신규한 수용체 단백질 및 그것을 이용한 염증성 질환의 진단 방법 {Novel Receptor Protein and Method for Diagnosing Inflammatory Diseases by Using the Same}

본 발명은, 미성숙 나무상 세포에서 발견된 신규한 7회 막관통형 수용체 단백질 및 그것을 코드하는 DNA에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질 및 그것을 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 7회 막관통형 수용체 단백질 및 그것을 코드하는 DNA를 이용하면, 나무상 세포의 기능이 관여하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 물질의 스크리닝 또는 그와 같은 질환의 진단 방법이나 진단약을 작성할 수가 있다. 또, 본 발명은 상기한 DNA를 복제 가능한 발현 벡터로 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA; 상기한 복제 가능한 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포; 상기한 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 7회 막관통형 수용체 단백질; 상기한 7회 막관통형 수용체 단백질에 대한 리간드 또는 그 리간드와 7회 막관통형 수용체 단백질과의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법; 및 상기 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 염증성 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

<종래 기술>

생체내에서 감염이나 염증 등의 이상이 발생하면, 그 이상은 작용 부위의 세포로부터 방출되는 각종 단백질 인자에 의해 생체의 방어에 관계되는 세포로 전해진다. 감염에서는 백혈구, 특히 호중구로 대표되는 과립구 또는 마크로파아지 등의 작용이 생체 방어 반응의 계기로 되어 있다. 또한, 과립구와 마찬가지로 골수의 조혈간 세포에서 파생되어 있는 나무상 세포(임파절 또는 배태 중심에 나타나는 포체 돌기를 연장시킨 별 모양 세포)도 면역 및 염증과 관련되는 기능, 특히 항원 제시에 큰 역활을 하고 있다.

항원 제시 세포의 하나인 마크로파아지는 활성화된 T 세포 및 B 세포에 대하여 항원 제시를 하는데(Sornasse et al., J. Exp Med., 175, 15-21, 1992), 핼퍼 T 세포의 활성화는 나무상 세포에 의한 항원 제시에 의존한다. 나무상 세포는 말초혈 중의 항원을 포착하여 림프액으로 이동하고 최종적으로 임파절에서 성숙한다고 생각되고 있다. 마크로파아지와 나무상 세포는 함께 모든 성숙 단계에서, 이미 활성화되어 있는 T 세포에 항원을 제시할 수가 있지만, 성숙 나무상 세포만이 나이브 T 세포에 감작된다는 것이 보고되어 있다(Mehta-Damani et al., J. Immunology, 153, 996-1003, 1994). 나무상 세포는 조혈간 세포로부터 유도되는데, 나무상 세포의 전구체 및 미성숙의 나무상 세포는 혈액이나 림프액 중에 존재하고, 완전히 성숙한 나무상 세포는 비장 및 임파절에 존재한다. 일반적으로 미성숙 나무상 세포는 항원의 도입 능력이 높고, 성숙함에 따라 항원 제시 능력이 상승한다. 그리고, 항원 제시를 하고 있는 나무상 세포는 MHC(Major Histocompatibility Complex,주요 조직적합성 복합체) 클래스 I 단백질 및 클래스 Ⅱ 단백질을 다량으로 발현하고 있다.

상기한 바와 같이, 나무상 세포는 생체내의 면역 및 염증에 관련하고 있고, 유익한 면역 응답에 의해서 생체를 방어한다. 그러나, 자기 면역 등의 바람직하지 못한 면역 작용 및 염증 작용을 야기하는 수도 있다. 따라서, 나무상 세포의 기능을 제어하는 방법을 발견함으로써, 유익한 면역 응답에 의한 감염이나 종양의 치유, 또는 유해한 면역 응답의 감퇴에 의한 자기 면역성 질환 등의 치료가 가능해진다고 생각되고 있다.

나무상 세포의 기능, 즉, 그 증식, 분화, 활성화, 화학 유주 등은 나무상 세포에 발현되어 있는 여러가지 수용체 단백질에 의해서 제어되고 있다. 수용체란, 세포 표면에 존재하고, 다른 세포의 표면이나 체액 중에 존재하는 특정한 물질(시그널 분자)과 높은 친화성으로 결합하여 시그널 분자와의 결합이라는 세포 밖의 사건을 세포내 시그널로 변환하여 세포의 응답을 야기하는 단백질이다(Alberts, Bruce et al. eds., "Molecular Biology of the Cell", 2nd ed., Garland Publishing, Inc., pp. 681-726, 1989). 수용체와 결합하는 물질을 일반적으로 리간드라고 한다. 나무상 세포에서 발현되어 있는 수용체의 기능을 변화시키는 물질, 즉 수용체와 결합하여 세포를 자극하는 것 또는 수용체와 결합하여 다른 리간드에 의한 자극을 차단하는 것, 다른 리간드에 의한 자극이 세포내에 전달되는 것을 저해하는 물질을 얻을 수 있으면, 얻어진 물질은 나무상 세포의 기능을 플러스나 마이너스에 제어하여 나무상 세포의 기능의 부족 또는 과잉에 기인하는 질환의치료에 도움이 된다고 생각된다.

수용체로서는, 사이토카인 수용체군, EGF(Epidermal Growth Factor, 표피 성장 인자) 수용체군, 7회 막관통형 수용체군 등 여러가지 수용체 단백질이 알려져 있으며("The Leukocyte Antigen Facts Book", Academic Press Inc., 38-49, 1993), 그 기능은 다방면에 걸쳐 있다. 이러한 수용체군의 하나인 7회 막관통형 수용체 단백질군은, G 단백질 공액형 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR), 로돕신형 수용체 등이라고도 한다. 7회 막관통형 수용체 단백질의 연구는 비교적 최근 개시된 것으로, 아직 수 많은 미지의 7회 막관통형 수용체 단백질이 존재한다고 생각된다.

백혈구를 예로 들어 설명하면, 현재까지 백혈구에 존재하는 7회 막관통형 수용체로서 동정된 수용체에는, 아나필라톡신과 결합하는 수용체군, 케모카인과 결합하는 수용체군, PAF(혈소판 활성화 인자)와 결합하는 수용체 등을 들 수 있다. 아나필라톡신의 수용체는, 호중구 또는 마크로파아지의 기능, 예를 들면 활성 산소의 산생, 화학 유주, 세포 접착의 활성화에 관여하고 있다(Bouley, F. et al, Biochemistry, 30, 2993-2999, 1991). 또, 케모카인과 결합하는 수용체군의 하나인 IL-8(인터루킨 8)수용체의 상동성이 결손된 마우스에게 염증 유도 물질을 복강내 투여하면, 호중구 침윤의 감소, 호중구 증가증(호중구는 활성화되어 증식하지만 침윤되지 않는다), 골수 또는 임파절에서의 과립구나 형질 세포의 증가 등이 관찰된다(이이사자 히사시 및 마쯔시마 코우지 저, 임상 면역 28, 731 내지 737, 1996). 이러한 수용체에 작용하는 물질 중, 질환의 치료제로서의 가능성을 생각할수 있는 것 중에는, IL-8 또는 MCP-1(Monocyte Chemotactic Protein 1)과 같이 수용체와 결합하여 세포를 자극하는 것 또는 IL-8 변이체와 같이 수용체와 결합하여 리간드에 의한 자극을 차단하는 것이 있다(Howard, O.M.Z. et al. TIBTECH, 14, 46-51, 1996). 그러나, 대부분의 경우, 하나의 수용체가 복수의 시그널 분자와 결합하거나, 하나의 시그널 분자도 복수의 수용체와 결합한다. 따라서, 질환의 치료를 생각했을 경우에는, 시그널 분자를 아는 것 만으로는 불충분한다. 예를 들면 세로토닌의 경우에는, 세로토닌이라는 단일 시그널 분자에 대하여, 7회 막관통형 수용체 외에 이온 채널형 수용체라는 전혀 다른 시그널 전달 경로의 수용체를 포함하는 총 14종의 수용체와, 그리고, 이 14종류의 수용체에 특이적으로 결합하는 화합물이 알려져 있으며(1996 Receptor & Ion Channel Nomenclature, Supplement 1-81 Trends Pharmacol. Sci., 1996), 각 수용체의 다른 질환의 치료로의 응용도 생각되고 있다. 또, 케모카인군의 경우에는, 단일 시그널 분자(1종의 케모카인)가 다수의 수용체와 반응함과 동시에, 단일 수용체가 다수의 시그널 분자(다종의 케모카인)와 반응하는 예도 많이 알려져 있다(Power, C.A. et al., Trends Pharmacol. Sci., 17, 209-213, 1996).

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 만일 단일 시그널 분자가 질환의 원인이라 하더라도, 세포의 종류에 따라 다른 수용체가 복수 존재한다. 그리고 질환의 원인인 특정한 세포군의 기능을 특이적으로 제어하기 위해서는, 그 세포에 작용하는 시그널 분자의 특정보다도, 그 세포에 발현하고 있는 수용체를 특정하는 것이 중요해진다. 예를 들면 시그널 분자군의 하나인 케모카인군을 예로 들면 백혈구에 작용하는 시그널 분자 RANTES(Regulated on Activation, Normal T cell expressed and secreted, 활성화 제어, 발현 및 분비 정상 T 세포)에 반응하는 백혈구는 여러가지 존재하기 때문에, RANTES와의 반응성을 나타내는 백혈구를 특정할 수는 없다. 그러나, 백혈구의 일종인 호산구는 케모카인 수용체의 하나인 CCR3(C-C Chemokine Receptor 3, C-C 케모카인 수용체 3)를 특이적으로 발현하고 있으므로, 수용체 CCR3을 이용하면, 호산구를 특이적으로 제어하는 방법의 검색이 가능해진다(Howard, 0.M.Z. et al., TIBTECH, 14, 46-51, 1996).

또, 인간과 그 밖의 종류의 생물 수용체에서는, 동일한 화합물에 대한 반응이 다른 것도 알려져 있다(예를 들면 Marleau, S. et al., J. Immunol. 157, 4141-4146, 1996).

인간 수용체에 대하여 활성화의 작용을 나타내는 물질이, 다른 종류의 수용체에 대해서는 활성화를 저해하는 물질로서 기능하는 예도 알려져 있다. 또한, 수용체 중에는 바이러스 감염일 때의 수용체로서 기능하는 것도 알려져 있다(예를 들면 Choe, H. et al., Cell 85, 1135-1148, 1996), 이러한 수용체와 결합하는 분자가 바이러스의 감염을 방지하는 것도 알려져 있다(예를 들면 Bleul, C.C. et al., Nature, 382, 829-833, 1996). 이와 같은 경우에도 바이러스가 감염되는 세포에 발현하는 수용체를 아는 것이 중요해진다. 또한, 특정한 바이러스는 특정한 생물종(species)의 수용체와 결합함으로써 감염이 성립한다는 것도 알려져 있다.

시그널 분자 중에는(예를 들면 케모카인인 PF4 또는 HCC1 등), 그 수용체가 7회 막관통형 수용체라고 추정되고 있으나, 수용체 단백질은 동정되어 있지 않은것도 있다(Premack, B.A. et al., Nature Medicine, 2, 1174-1178, 1996; 및 Loetscher, M. et al., J. Exp Med., 84, 963-969, 1996). 특히 케모카인군에 대해서는 더욱 많은 미지의 케모카인이 존재한다고 추정되고 있고(Howard, O.M.Z. et al., TIBTECH, 14, 46-51, 1996), 미지의 케모카인에 대한 많은 수용체가 존재한다고 기대되고 있다.

상기한 백혈구의 경우와 마찬가지로, 나무상 세포에 작용하는 분자의 수용체는 모두 이해된 것은 아니며, 나무상 세포에도 많은 7회 막관통형 수용체가 존재한다고 생각되고 있다. 성숙한 나무상 세포에 존재하는 7회 막관통형 수용체로서는, ChemR23이 보고되어 있다(Samson, M. et al., Eur. J. Immunol., 28, 1689-100, 1998). 나무상 세포가 다른 분화 단계에서 발현하는 수용체를 취득하고, 다시 이러한 수용체의 작용을 변화시키는 물질을 얻을 수 있으면, 나무상 세포의 기능을 제어하고, 나아가 질환을 제어하는 방법의 확립이 기대된다.

7회 막관통형 수용체에 작용하는 내인성의 물질로서는, 여러가지 수용체에 대하여 여러가지 물질이 알려져 있다. 예를 들면, 생리 아민인 글루탐산 또는 도파민은 각각 글루탐산 수용체군, 도파민 수용체군과 결합한다. 또, 펩티드인 신경 펩티드 Y 또는 엔도셀린은 각각 신경 펩티드 Y 수용체군, 엔도셀린 수용체군과 결합한다(Watson, S. and Arkinstall, S., "The G-protein linked receptor Facts Book", Academic Press Inc., 1994). 이들 중에는, 케모카인군 또는 PAF와 같이 백혈구에 작용하는 것이 알려져 있는 물질과, 백혈구에는 작용하지 않는 물질이 포함되어 있다.

상기한 것 같은 7회 막관통형 수용체를 활성화하는 물질은, 천연·비천연을 불문하고, 그 물질, 7회 막관통형 수용체 그 자체, 및 수용체를 발현하고 있는 세포 3자 각각의 상태에 의존하여 여러가지 세포내 시그널의 변동을 야기한다. 그 시그널의 변동은, 예를 들면 세포내 cAMP 농도의 상승 또는 하강, 이노시톨 인산 농도의 상승, 세포내 칼슘 농도의 상승 등과 같은 반응이며(Watson, S. and Arkinstall, S., "The G-protein Linked receptor Facts Book", Academic Press Inc., 1994), 각각을 측정하는 방법도 개발되어 있다. 따라서, 상기한 바와 같은 반응을 측정함으로써, 특정한 물질이 특정한 7회 막관통형 수용체를 활성화하는지 여부, 또는 그 활성화를 방해하는지 여부를 판단할 수가 있다. 또한, 이러한 물질이 7회 막관통형 수용체와 결합하여 생기는 세포 증식, 유전자 발현의 변동 또는 화학 유주 등의 생리학적인 현상을 관찰하는 방법도 알려지고 있으며, 이러한 현상을 어떤 물질이 특정한 7회 막관통형 수용체를 활성화하는지 여부, 또는 그 활성화를 방해하는지 여부를 판단하기 위한 지표로서 이용할 수 있다. 이와 같이 7회 막관통형 수용체에 작용하는 물질의 동정 방법에는 여러가지 있지만, 이러한 방법을 이용하여 인간의 의약품으로서 유용한 물질을 얻기 위해서는, 처음에 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질을 취득하는 것이 중요하다.

마찬가지로 각종 7회 막관통형 수용체(예를 들면, 케모카인 수용체군)에 특이적으로 작용하는 물질이 얻어지면, 특정한 염증 반응 등을 선택적으로 억제하는 새로운 의약품의 개발로 연결될 가능성이 있다.

케모카인을 예로 들면 일군의 케모카인 및 케모카인 수용체는 각종 백혈구의유주를 제어하고 있다. 따라서, 특정한 백혈구에는 특이적인 케모카인 수용체의 발현이 있다고 생각된다. 실제로, CCR5는 Th1세포, CCR4는 Th2세포에 발현하고 있다는 보고가 있으며(Loetscher, P. et al., NATURE, 391, 344-345, 1998, 및 Bonecchi, R. et al., J.Exp. Med., 187, 129-134,1998), 항원 비특이적인 염증으로 이어지는 특이적인 세포성 면역 또는 액성 면역 반응의 선택에 케모카인 수용체의 관여가 시사되어 있다. 또한, CXC 및 CC 케모카인 등의 주로 호중구 또는 단구에 작용하는 케모카인은 급성 또는 만성의 염증 반응에서는 중요한 역할을 하므로, 염증성 케모카인라고 한다. 이러한 염증성 케모카인의 수용체에 대하여, 예를 들면 말초혈 중의 케모카인 수용체의 발현을 해석함으로써, 염증성 질환의 검출 또는 그 질환의 중증도, 치료 경과 등의 진단이 가능해진다.

상기한 것 같은 수용체의 해석에 의해, 아직 병의 원인의 해명되어 있지 않은 염증성 질환 등의 새로운 진단 방법 또는 치료 방법의 개발도 가능해진다고 생각된다. 예를 들면 류마티즘은 다발하는 미란성 관절염을 주요 특징으로 하고, 동시에 많은 장기를 상해하는 원인 불명의 전신성 염증 질환이다. 관해와 증악을 반복하면서 만성으로 진행하여 관절의 파괴와 변형을 초래하고, 종국적으로는 운동기의 기능 장해를 나타내게 된다. 현시점에서는, 할 수 있는 한 조기에 류마티즘을 진단하여 류마티즘 염증을 가급적 신속하며 최대한으로 억제하여 관절 파괴와 같은 원래로 회복하기가 불가능한 증상의 출현을 방지하는 것이 치료의 목표이다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 류마티즘의 치료는 조기에 개시하는 것이 매우 중요하다. 종래의 피라미드 방식(Smyth, C.J., Postgrad. Med., 51, No.6,31-39, 1972)의 만성 관절 류마티즘(RA)의 치료에서는, 비스테로이드성 항염증제(NSAID)만으로 3 내지 6 개월 간 치료를 하여 RA인 것을 확인한 후에 질환 수식성 항류마티즘제(DMARD)를 투여하였다. NSAID에 의한 치료가 한창일 때에 RA가 진행하여 이환 관절 수가 증가하여 버리면, DMARD의 효과는 현저히 감약되어 이미 골 파괴를 저지하기는 곤란해진다. 따라서, 골 파괴가 발생하기 전의 초기 단계부터 DMARD를 투여하기 위해서는 RA의 조기 진단이 필요하다. 현재 사용되고 있는 RA의 진단 기준(Arnett, F.C. et al., The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum, 31, 315-324, 1988)에 따르면, 조기의 RA 진단이 어려워, 진단까지 적어도 6주간이 필요하다. 또한, 임상 검사 소견서에서는, 적혈구의 침강 속도(적침, 조직의 파괴나 염증에 의해 항진되는 비특이적 반응) 또는 조직의 파괴나 염증시에 급속하게 증량되는 급성 반응 물질인 CRP(C-반응성 단백질)의 양은, 조기 RA 환자군에 유의에 인정되지만, 모두 RA 특이적이지 않기 때문에 RA와 다른 교원병 등으로의 감별에 이용할 수는 없다. 또한, 조기 RA의 적침이 정상이더라도, X선으로 보면 골 파괴의 진행이 인정되는 예가 있다. 또한 류마토이드 인자는, 발증 1 년 이내의 조기 RA에서는 71 %가 양성이지만, 발증 6 주 이내에서는 59 %로 양성율은 낮다. 백혈구 수, 적혈구 수, 혈색소에서는, 조기 RA(1년 이내)와 조기 비RA관절 질환군 사이에서 유의한 차이는 인정되지 않는다(야마마에 구니오미 저, 의학의 발자취, 182, No.9, 605-610, 1997).

따라서, 류마티즘의 치료에는 조기 진단이 필요함에도 불구하고, 류마티즘의진단에 유용한 진단 마커는 확립되어 있지 않아 조기 류마티즘의 진단은 곤란하다.

<발명의 개요>

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 미성숙 나무상 세포에 신규한 7회 막관통형 수용체가 존재한다고 생각하고, 이것이 나무상 세포의 기능을 제어하는 의약품의 탐색에 도움이 된다고 생각하였다. 처음에, 차이표시(Differential Display)법(예를 들면 Liang, P. et al., Curr. Biol., 7, 274-280, 1995), RDA법(Lisitsyn, N. et al., Science, 259, 946-951, 1993), 축중(Degenerative) PCR법(Innis, M.A. et al., PCR Protocols, 39-53, 1990) 등의 여러가지 방법을 사용하여 미성숙 나무상 세포에 발현되어 있는 신규한 7회 막관통형 수용체 단백질 cDNA의 취득을 시도하였다. 특히 축중 PCR법에 대해서는, 실시예 1에 나타내는 프라이머를 일례로 하는 20 종 이상의 프라이머를 시험하였다. 이렇게 예의 연구한 결과, 나무상 세포로부터 신규한 7회 막관통형 수용체의 cDNA 단편을 취득하고, 다시 얻어진 cDNA 단편의 전체 길이 코드 영역의 취득에 성공하였다. 본 발명자들은 이 신규한 7회 막관통형 수용체를 C5L2라 명명하였다. 또한, 이 신규한 DNA가 코드하는 수용체 단백질의 발현계를 작성하였다. 그리고, 인간 조직, 백혈구, 백혈병 세포주 등에서의 C5L2의 발현을 노던블로팅을 이용, 검토하여 백혈구, 특히 과립구에 C5L2의 강한 발현이 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 신규한 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질은 케모카인, FMLP, C5a 등의 주화성 인자에 대한 수용체와 동일한 구조를 가지므로, 각종 염증성 질환의 의약, 진단, 의료 분야에서의 이용이 생각되었다. 또한 본 발명자들은 본 발명의수용체가 염증성 질환의 진단에 도움이 된다고 생각하여, 류마티즘과 C5L2의 관련에 대하여 검토하였다. 그 결과, 염증성 질환의 진단에 7회 막관통형 수용체 C5L2가 유용하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 주된 하나의 목적은, 나무상 세포의 기능을 제어하는 의약품의 탐색에 유용한 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 7회 막관통형 수용체 단백질을 코드하는 DNA, 이 DNA를 발현 벡터에 조립한 재조합체 DNA, 및 이 재조합체 DNA로 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하는 방법, 및 7회 막관통형 수용체 단백질과 상기 단백질에 대한 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 염증성 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 여러가지 목적, 여러가지 특징 및 여러가지 이익은, 첨부한 도면 및 서열표를 참조하면서 기술하는 다음의 상세한 설명 및 청구의 범위의 기재로부터 명확해진다.

서열표의 프리 텍스트

서열 번호 5에서는, 18, 22와 24 잔기째의 n은 이노신/i를 나타낸다. 이 서열은 멜라노마의 증식에 관여하고 있다고 생각되는 공지된 7회 막관통형 수용체 단백질의 서열을 바탕으로 디자인한 축중 PCR법을 위한 프라이머이다.

서열 번호 6에서는, 22와 28 잔기째의 n은 이노신/i를 나타내고, 21 잔기째의 n은 a, g, c 또는 t를 나타낸다. 이 서열은 멜라노마의 증식에 관여하고 있다고 생각되는 공지된 7회 막관통형 수용체 단백질의 서열을 바탕으로 하여 디자인한 축중 PCR 법을 위한 프라이머이다.

서열 번호 7의 서열은, 서열 번호 1의 염기 서열 1 번째의 a에서 22 번째의 t에 상당하는 22 염기 서열의 5' 말단에 스페이서 서열 gggg 및 제한 효소 Hind III의 인식 서열 aagctt를 첨가한 서열이고, C5L2의 발현 벡터의 구축에 이용한 화학 합성 프라이머이다.

서열 번호 8의 서열은, 서열 번호 4의 염기 서열의 206번째의 c에서 225번째의 a에 상당하는 20 염기 서열의 5' 말단에 스페이서 서열 ggga와 제한 효소 SacII의 인식 서열 ccgcgg를 첨가한 서열이고, C5L2의 발현 벡터의 구축에 이용한 화학 합성 프라이머이다.

서열 번호 9의 서열은, C5L2의 RT-PCR에서 이용된 화학 합성 프라이머이다.

서열 번호 10의 서열은, C5L2의 RT-PCR에서 사용된 화학 합성 프라이머이다.

서열 번호 11의 서열은, G3PDH(글리셀알데히드3-인산 탈수소 효소)의 RT-PCR에서 이용된 화학 합성 프라이머이다.

서열 번호 12의 서열은, G3PDH의 RT-PCR에서 이용된 화학 합성 프라이머이다.

도면에 있어서,

도 1a 및 1b는 각각 플로우사이토미터를 이용하여 얻어진 미성숙 나무상 세포와 성숙 나무상 세포의 세포 표면의 C5L2의 발현을 나타내는 막대 그래프로서, 종축에는 세포의 양을 나타내고, 횡축에는 세포 표면에 존재하는 항원의 양을 항원에 결합하는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 표지 항체의 형광 강도로 나타낸다. 굵은 선은 비오틴화 표지한 항C5L2 항혈청을 일차 표지로서 이용한 결과이고, 가는 선은 비오틴화 표지한 토끼 IgG 항체를 일차 표지로서 이용한 네가티브 컨트롤의 결과이다.

도 2는 건강한 보통 사람의 민간 봉사자 말초혈로부터 조제한 과립구를 실온에서 보존했을 때의 C5L2 발현율의 경시 변화를 나타내는 그래프로서, 종축에는 C5L2 발현율을 나타내며, 횡축에는 채혈 후의 경과 시간을 나타낸다. 그래프 중, 흑점은 개개의 값을 나타내고, 직선은 그 평균값을 결합한 것이다.

도 3은 RA 환자의 신선혈로부터 조제한 과립구 중의 C5L2 발현율과 류마토이드 인자와의 상관을 나타내는 그래프(산포도)로서, 종축은 류마토이드 인자의 값을 나타내고, 횡축은 C5L2의 발현율을 나타낸다.

본 발명의 하나의 형태에 따르면, 서열 번호 2에 기재한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질이 제공된다.

이어서, 본 발명의 이해를 쉽게 하기 위하여 우선 본 발명의 기본적 특징 및 바람직한 형태를 열거한다.

1. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질.

2. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 연속된 5개 이상의 아미노산으로 이루어지는 부분 서열인 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 펩티드.

3. 전항 1에 기재된 7회 막관통형 수용체 단백질을 코드하는 단리된 DNA.

4. 서열 번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 전항 3에 기재된 단리된 DNA.

5. 서열 번호 3에 기재된 DNA 중의 연속된 12개 이상의 염기로 이루어지는 DNA 단편 또는 그 유도체.

6. 서열 번호 4에 기재된 DNA 중의 연속된 적어도 12개의 염기로 이루어지는 DNA 단편 또는 그 유도체.

7. 서열 번호 3에 기재된 DNA에 상보적인 RNA 중의 연속된 12개 이상의 염기로 이루어지는 RNA 단편 또는 그 유도체.

8. 전항 3 내지 6중 어느 하나에 기재된 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA.

9. 전항 8에 기재된 복제 가능한 재조합체 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포.

10. (a) 전항 3 또는 4에 기재된 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 결합하여, 상기 DNA와 복제 가능한 발현 벡터를 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA를 얻고,

(b) 상기 복제 가능한 재조합체 DNA에 의해 미생물 또는 배양 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성시키고,

(c) 상기 형질 전환체를 상기 미생물 또는 배양 세포의 모세포로부터 선별하고,

(d) 상기 형질 전환체를 배양하여 상기 형질 전환체에 상기 DNA를 발현시키는

것을 포함하는 방법에 의해 상기 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 7회 막관통형 수용체 단백질.

11. 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하는 방법으로서, 전항 1 또는 10에 기재된 단백질, 또는 전항 2에 기재된 펩티드를 샘플 재료와 접촉시키고, 상기 단백질 또는 상기 펩티드와 리간드의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로 하여 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 검출하는 것을 포함하는 방법.

12. 7회 막관통형 수용체 단백질과 상기 단백질에 대한 리간드와의 결합을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서,

전항 1 또는 10에 기재된 단백질, 또는 전항 2에 기재된 펩티드와 상기 리간드를 샘플 재료와 접촉시키고, 그리고 상기 단백질 또는 상기 펩티드와 상기 리간드와의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로서, 7회 막관통형 수용체 단백질과 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 물질을 검출하는 것을 포함하는 방법.

13. 전항 1에 기재된 7회 막관통형 수용체 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체.

14. 염증성 질환의 진단 방법으로서, 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 상기 7회 막관통형 수용체 단백질이 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 진단 방법.

15. 상기 염증성 질환이 만성 관절 류마티즘인 것을 특징으로 하는 전항 14에 기재된 방법.

16. 상기 인간 백혈구가 인간 과립구인 것을 특징으로 하는 전항 14 또는 15에 기재된 방법.

17. 상기 인간 과립구가 인간 조직으로부터 채취한 과립구인 것을 특징으로 하는 전항 16에 기재된 방법.

18. 상기 인간 과립구가 진단을 행하기 6 시간 이상 전에 채취한 과립구인 것을 특징으로 하는 전항 17에 기재된 방법.

19. 상기 발현량의 측정을, 상기 단백질을 코드하는 mRNA의 정량에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 전항 14에 기재된 방법.

20. 상기 mRNA의 정량을, RT-PCR 법으로 행하는 것을 특징으로 하는 전항 19에 기재된 방법.

21. 상기 발현량의 측정을, 상기 백혈구의 세포 표면에 존재하는 상기 단백질의 정량에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 전항 14에 기재된 방법.

22. 상기 단백질의 정량을, 상기 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 전항 21에 기재된 방법.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

서열표에 기재된 아미노산 서열의 좌단 및 우단은 아미노기 말단(이하, N 말단이라 함) 및 카르복실기 말단(이하, C 말단이라 함)이고, 또한 염기 서열의 좌단 및 우단은 각각 5' 말단 및 3' 말단이다.

또한, 본 발명에 있어서, DNA 염기 서열 중의 a는 아데닌, c는 시토신, g는 구아닌, t는 티민을 나타낸다.

또한, 본 발명에서는, 3문자 표시로, 아미노산 서열 중 Ala는 알라닌, Arg은 아르기닌, Asn은 아스파라긴, Asp는 아스파르트산, Cys는 시스테인, Gln은 글루타민, Glu는 글루탐산, Gly는 글리신, His는 히스티딘, Ile는 이소로이신, Leu는 로이신, Lys는 리진, Met는 메티오닌, Phe는 페닐알라닌, Pro는 프롤린, Ser는 세린, Thr는 트레오닌, Trp는 트립토판, Tyr는 티로신, Val은 발린이다.

본 발명에서 말하는 "나무상 세포"란, 임파절이나 배태 중심에 나타나는 포체 돌기를 연장시킨 별 모양 세포이고, 혈액 간세포 유래의 항원 제시 세포의 하나이다. 최근, 나무상 세포의 인 비트로에서의 대량 조제도 가능해졌다(Romani et al., J. Exp. Med., 180, 83-93, 1994). 골수 유래 또는 제대혈 유래의 미분화된CD34 양성 세포 또는 말초혈 단구로부터 분화 유도하는 것이 가능하며, 구체적으로는, GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor, 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자)와 IL-4(lnterleukin 4, 인터루킨 4)의 2종으로 자극하면 미성숙 나무상 세포를, IL-4, GM-CSF와 TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α, 종양 괴사 인자)의 3종으로 자극하면 성숙 나무상 세포를 유도할 수가 있다(Talmor M et al., Eur. J. Immunol., 28, 811-817, 1998, 및 Morse MA et al., Ann Surg., 226, 6-16, 1997).

본 발명에서 말하는 "백혈구"란, 단핵구(임파구·단구) 및 과립구(호중구·호산구·호염기구)의 총칭이다. 과립구는 백혈구 중에서도 핵이 막대 형상 또는 거기에 잘록함이 생겨 분엽된 세포이며, 상기한 바와 같이 호중구, 호산구, 호염기구로 구성된다.

본 발명에서 말하는 "인간 조직"에는, 혈액, 활액, 림프액 등의 체액, 및 임파절, 비장, 골수, 장관, 활막 등의 조직 또는 장기가 포함된다. 또한, "조직의 채취"란, 조직을 체외로 추출하는 것이며, 혈액이라면 채혈을 의미한다.

본 발명에서 말하는 "염증"이란, 비특이적 또는 특이적인 방어계의 반응을 포함하는 생체의 반응이다. 비특이적 방어계 반응이란, 일반적으로 면역학적 기억이 불가능이다고 생각되는 백혈구(마크로파아지, 호산구 및 호중구를 포함한다)에 의해 중개되는 염증 응답을 의미한다. 비특이적 반응의 예로서, 벌의 창상 직후의 종창, 박테리아의 감염 부위에서의 백혈구 덩어리(예를 들면 세균성 폐렴에서의 폐의 침윤 및 농양에서의 고름의 형성)등을 들 수 있다. 특이적 방어계 반응이란,항원에 대한 특이적 면역계의 반응을 의미한다. 특이적 방어계 반응의 예로서는, 항원(예를 들면 바이러스)에 대한 항체의 응답 또는 지연형 과민증 등을 들 수 있다. 본 발명에서 말하는 "염증성 질환"이란, 상기한 비특이적 방어계 기능 및 특이적 방어계 기능의 양쪽의 저하 또는 항진에 의해, 인체에 장해를 발생시키는 질환이다. 따라서, 염증성 질환에는 감염증 또는 자기 면역 질환이 포함된다. 본래, 감염증이란, 면역계(바이러스, 세균, 기생충, 곰팡이 등의 외부로부터의 감염에 대하여, 숙주인 자기를 방위하는 시스템)에 이상을 초래하여 배제하여야 할 외부로부터의 감염을 배제할 수 없어 야기되는 질환이며,

한편, 자기 면역 질환이란, 본래 배제해서는 안되는 자기를 배제하는 방향으로 면역계가 작용하는 질환이다. 자기 면역 질환에는, 장기 또는 기관에 특이적인 질환과, 비특이적인 전신성의 질환이 알려져 있다. 면역 조절 이상에는 전신성 홍반성 낭창, 만성 류마티즘양 관절염, I형 당뇨병, 염증성 장질환, 담즙성 간경변, 포도막염, 다발성 경화증 또는 크론병, 궤양성 대장염, 수포성 천포창, 사르코이도시스, 건선, 어린선 및 그레이브스 눈병 등의 질병도 포함되고 있으며, 그 범위는 광범위하다.

본 발명에서 말하는 "7회 막관통형 수용체 단백질"이란, 백혈구 수용체군의 하나이며, G 단백질 공액형 수용체(GPCR), 로돕신형 수용체 등이라고도 한다.

또한, 본 발명에서 기술되는 유전자 조작에 필요한 cDNA의 제작, 노던블로팅에 의한 발현의 검토, 하이브리다이제이션에 의한 스크리닝, 재조합 DNA의 제작, DNA 염기 서열의 결정, cDNA 라이브러리의 제작 등의 일련의 분자 생물학적인 수법은, 실험서에 기재되어 있는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 구체적으로는, 문헌 ["Molecular Cloning, A laboratory manual", Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 등을 참조할 수가 있다.

이어서, 본 발명의 기본적 특징을 더욱 밝히기 위하여, 본 발명의 완성에 이르는 경위를 추적하면서, 본 발명에 포함되는 기술적 특징에 대하여 설명한다.

하기에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 cDNA 단편은 미성숙 나무상 세포에서 발견된 것이며, 그 전체 길이 cDNA는 태반 유래의 cDNA 라이브러리에서 취득되었다. 또한, C5L2의 mRNA는 정상 말초혈 백혈구 중에도 검출되었다. 본 발명자들이 발견한 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질을 코드하는 전체 길이 cDNA를 본 명세서의 서열표의 서열 번호 1에 나타냈다. 서열 번호 1의 염기 서열에 대하여 공지된 유전자의 cDNA 서열과의 상동성을 비교하였다. 구체적으로는, GENETYX-Mac/DB Ver.39.1(Software Development Co., Ltd.)를 이용하여 데이타베이스 GenBank(릴리스 106.0, 1998년 4월)에서 서열 번호 1로 표시한 염기 서열과의 상동성을 검색하였다. 그 결과, 다음 상위 10종의 서열이 검출되었다(이하, 대괄호내는 엔트리명, 수치는 상동성):

C5a 수용체의 P.pygmaeus DNA [PPC5AR] 56.3.%;

C5a 수용체의 G. gorilla DNA [GGC5AR] 56.7 %;

C5 아나필라톡신 수용체의 H. sapiens C5aR rRNA [HSC5AR] 56.8 %;

인간 C5a 아나필라톡신 수용체 mRNA[HUMC5AAR] 56.8 %;

C5a 아나필라톡신의 H. sapiens RNA [HSC5ANAPL] 56.8 %;

C5a 수용체 단편의 M. mullata DNA [MMC5AR] 56.2 %;

C5a 수용체의 P. troglodytes DNA [PTC5AR] 56.6 %,

상보적 C5a 수용체의 C. familiaris mRNA [CFCOMC5AM] 59.1 %;

C5a 수용체의 Rattus norvegicus mRNA [ABO03042] 57.2 %; 및

R. norvegicus mRNA for C5a receptor[RNC5AREC] 57.2 %.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질을 코드하는 cDNA는 인간을 포함한 각종 생물의 아나필라톡신 수용체 C5a-R(Kroll, B. et al., FEBS Lett., 291, 208-210, 1991)의 상동성을 나타내면서도, 그 상동성은 불과 56 내지 59 % 정도였다.

또한, 본 발명자들은, 상기한 본 발명의 염기 서열로부터 얻어진 추정 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 2에 기재하였다. 이 아미노산 서열에 대하여 공지된 유전자가 코드하는 아미노산 서열과의 상동성을 비교하였다. 구체적으로는, GENETYX-Mac/DB Ver.39.1(Software Development Co., Ltd. 일본)을 이용하여 Swiss-Prot(릴리스 35.0, 1997년 11월)로 상동성을 검색하였다. 그 결과, 다음 상위 10종의 서열이 검출되었다(이하, 대괄호내는 엔트리명, 수치는 상동성).

C5A 아나필라톡신 주화성 수용체 (C5A-R)(CD88)[C5AR-HUMAN] 38.2 %;

C5A 아나필라톡신 주화성 수용체 (C5A-R)[C5AR-CANFA] 39.6 %;

C5A 아나필라톡신 주화성 수용체 (C5A-R)[C5AR-MOUSE] 38.1 %;

FMLP-관련 수용체 II(FMLP-R-II)(RFP)(HM63)[FML2-HUMAN] 29.9 %;

FMET-LEU-PHE 수용체 (FMLP 수용체)(N-포르밀 펩티드 수용체) [FMLR-HUMAN] 28.8 %;

가능한 G 단백질-공액 수용체 GPR1[GPR1-RAT] 28.1 %;

FMET-LEU-PHE 수용체 (FMLP 수용체)(N-포르밀 펩티드 수용체) [FMLR-RABIT] 29.8 %;

FMET-LEU-PHE 수용체 (FMLP 수용체)(N-포르밀 펩티드 수용체) [FMLR-MOUSE] 28.5 %;

가능한 G 단백질-공액 수용체 GPR1[GPR1-HUMAN] 28.1 %; 및

FMLP-관련 수용체 I(FMLP-R-I)[FML1-HUMAN] 26.3 %.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 아미노산 서열은, 공지된 인간 및 기타 포유류의 7회 막관통형 수용체 단백질과의 상동성을 나타내면서도, 그 상동성은 불과 30 내지 40 % 정도였다.

상기한 상동성 검색 결과로부터, 본 발명자들이 발견한 C5L2는, 공지된 인간 및 그 밖의 포유류의 7회 막관통형 수용체 단백질과 cDNA 서열에서 60 % 미만, 아미노산 서열에서 40 % 미만의 상동성밖에 나타내지 않은 신규한 서열이라는 것이 판명되었다.

또한 본 발명자들은, Kyte-Doolittle의 방법(J., Mol. Biol., 157, 105-132, 1982)에 따라 서열 번호 2의 아미노산 서열의 소수성 부분과 친수성 부분을 해석하였다. 그 결과로부터, C5L2는 세포막 통과 부분을 7개 갖는 세포막 단백질로서, 세포 표면에 발현되어 있다는 것이 시사되었다. 또한, 상기한 상동성 검색에 있어서, C5L2과의 상동성이 인정된 서열은 모두 7회 막관통형 수용체 단백질이므로, 본 발명의 단백질은 신규한 7회 막관통형 수용체 단백질이라고 결론지어졌다.

공지된 수용체 단백질에서는, 종간의 상동성이 매우 높다는 것이 알려져 있으며, 예를 들면 안지오텐신 수용체 Ia의 경우, 인간(Swiss-Prot Entry: AG2R-Human)과 쥐(Swiss-Prot Entry: AC22-Rat)와의 상동성은 90 %을 넘는다. 그러나, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2와 높은 상동성을 나타내는 서열은 데이타베이스상에 발견되지 않았다. 따라서, C5L2는 다른 생물종으로 알려져 있는 수용체의 인간에게 있어서의 대응물이 아니라 신규한 수용체라고 생각된다.

본 발명의 C5L2는 아나필라톡신 수용체 C5a-R와 근소하나마 상동성을 가지므로, 인간 아나필라톡신 수용체와 동일 서브 패밀리에 속한다고 생각된다. 최근의 보고에 의하면, 인간 아나필라톡신 수용체 C5a-R(Kroll, B. et al., FEBS Lett., 291,208-210, 1991), 인간 아나필라톡신 수용체 C3a-R(Crass, T. et al., Eur. J. Immunol., 26, 1944-1950, 1996), 균 유래 펩티드 FMLP 수용체(Boulay, F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 168, 1103-1109, 1990), ChemR23(Samson, M. et al., Eur. J. Immunol., 28, 1689-1700, 1998) 등은, 상동성으로 보아 GPCR 패밀리 중에서 서브 패밀리를 형성하고 있다(Samson, M et al., Eur. J. Immunol., 28, 1689-100, 1998). 이 서브 패밀리에 속하는 수용체는 모두 면역 조절에 깊이 관여하고 있다(예를 들면, 아나필라톡신 수용체 C3a-R 또는 C5a-R은 생체의 알레르기 또는 염증 작용, FMLP-R군은 감염 방어, ChemR23은 항원 제시 세포인 나무상 세포나 마크로파아지를 통한 면역 유도와 관련되어 있다)것이 알려져 있다. 이 서브 패밀리에 속하는 본 발명의 C5L2도 또한, 염증 또는 감염에 의한 면역 조절에 깊이 관여하고 있다고 생각하여, 본 발명자들은 C5L2와 염증성 질환과의 관계에 대하여 검토하였다. 그 결과, 말초혈 백혈구가 C5L2의 발현을 강하게 나타낸다는 것, 그 중에서도 과립구가 특히 강한 발현을 나타낸다는 것이 노던블로팅에 의해 판명되었다. 또한, 본 발명자들은, 채취한 체액 또는 조직 중에서, C5L2 발현량이 채취 후 변화하는 가능성에 주목하여 채혈 직후 및 일정 시간 경과 후의 말초혈에 포함되는 과립구를 분획하여, 경시적인 C5L2 발현량의 변화를 해석하였다. 그 결과, 건강한 보통 사람의 말초혈 유래의 과립구에서는, C5L2의 mRNA양은 채혈로부터 6 시간 동안에 급격히 감소하고, 그 후 24 시간 후까지 완만하게 감소되어 간다는 것이 발견되었다. 한편, RA 환자 말초혈을 동일하게 하여 해석했더니, RA 환자의 말초혈 유래 과립구 중 C5L2의 mRNA양은 채혈 후 24 시간 지나도 감소하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이 현상은 케모카인 수용체인 CCR4, CCR5에서는 나타나지 않아 C5L2에 특이적인 현상이라는 것이 본 발명자들에 의해서 발견되었다.

이상과 같은 예의 연구 결과, 본 발명자들은, 채혈 후의 C5L2 발현량의 변화가 염증성 질환의 마커로서 유용하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따르면, 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 전체 길이 단백질 및 그 부분 펩티드가 제공된다.

본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질은, 말초혈 백혈구, 특히 과립구에 강하게 발현하고 있는 7회 막관통형 수용체이고, 본 발명자들에 의해 처음으로 발견된 단백질이다.

본 발명의 단백질은, 수용체에 대해 특이적인 리간드와의 결합 활성, 및 시그널 전달 경로에 있어서 하류측에 존재하는 시그널 전달 활성을 갖는 단백질이다.

이러한 단백질의 하나가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질인데, 본 발명의 단백질은, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 한정되는 것은 아니다. 상기한 수용체로서의 특성을 갖는 폴리펩티드라면, 자연계에서 발생한다는 것이 알려져 있는 생물종내 변이, 알렐 변이 등의 돌연 변이에 의해서 발생하는 개변체(즉, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열)도 본 발명의 단백질에 포함된다. 아미노산의 개변, 치환에 대해서는 예를 들면 Bennett들의 특허 출원(국제 공개 공보 WO96/02645) 등에 상세히 기재되어 있어, 이것을 참고로 하여 제작할 수가 있다. 또한, 본 발명에는 상기한 것 같은 단백질의 염도 포함된다.

또한, 본 발명의 단백질은 번역 후 변성되어도 좋다. 서열 번호 2의 아미노산 서열에는, 당쇄가 부가될 수 있는 부분이 존재한다. 예를 들면 서열 번호 2의 3번째의 Asn은, N-글리코시드 결합의 공통 서열 Asn-X-Ser/Thr의 Asn이라고 생각되며, N-글리코시드로 변성될 가능성이 있다. 또한, N-아세틸-D-갈락토사민의 O-글리코시드 결합을 추정하는 부분으로서, 세린 또는 트레오닌 잔기가 빈출하는 부분을 생각할 수 있다. 이러한 당쇄가 부가된 단백질이 당쇄가 부가되어 있지 않은 단백질 그 자체보다도 일반적으로 생체내에서의 분해에 대하여 안정하고, 또한 강한 생리 활성을 가지고 있다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 단백질에는, 서열 번호 2의 아미노산 서열 중에 N-아세틸-D-글루코사민 또는 N-아세틸-D-갈락토사민 등의, N-글리코시드 또는 O-글리코시드 결합을 갖는 당쇄를 포함하는 단백질도 포함된다.

또한, 본 발명의 단백질은, 항원 에피토프 등의 공지된 태그 서열을 가지고 있어도 좋다. 예를 들면 FLAG(MDYKDDDDK), T7(MASMTGGQQMG), HSV(SQPELAPEDPED), S(KETAAAKFERQHMDS), Myc(EQKLISEEDL), His(HHHHHHHH), HA(YPYDVPDYA) 등의 태그 서열(괄호내의 서열은 전부 아미노산의 1문자 표기이다)이 있다. 태그 서열이 C5L2 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 존재함으로써 본 발명의 단백질을 플로우사이토메트리 또는 웨스턴 블로팅(이뮤노블로팅) 등의 수법을 이용하여 용이하게 검출할 수가 있다.

C5L2 단백질 및 그 단편은, 진단을 목적으로 한 항체의 작성 또는 치료를 목적으로 한 의약품의 검색에 유용하다. C5L2 단백질의 부분 서열로 이루어지는 펩티드는, 본 발명의 C5L2 전체 길이단백질의 연속된 적어도 5개의 아미노산으로 이루어지는 부분 서열이며, 이 부분 펩티드는, 전체 길이 단백질과 마찬가지로 항체의 제작, 리간드의 스크리닝, 및 C5L2와 결합하여 나무상 세포의 반응을 제어하거나 질환 치료를 행하는 물질을 검색하는 데에 있어서 유용하다. 항체의 작성, 즉, 항원으로서 이용하는 펩티드로서는, 예를 들면 세포밖 영역 또는 세포내 영역에 상당하는 부위의 5 내지 8 아미노산 잔기의 펩티드가 적당하다. 구체적으로는, 실시예 9에서 항체의 작성에 이용한 서열 번호 2의 아미노산 서열 중의 6 내지 32 번째 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드 또는 1 내지 23번째 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드를 항원으로서 이용할 수 있다. 리간드 등의 스크리닝에 이용하는 부분 펩티드로서는, 예를 들면 C5L2의 리간드 결합 부위라고 생각되는 N 말단 세포밖 영역(서열 번호 2의 1 내지 35번째의 아미노산 잔기) 또는 제1세포 밖 루프부(서열 번호 2의 96 내지 108번째의 아미노산 잔기), 제2 세포밖 루프부(서열 번호 2의 172 내지 198번째의 아미노산 잔기) 또는 제3세포밖 루프부(서열 번호 2의 681 내지 726번째의 아미노산 잔기)를 포함하는 펩티드를 이용할 수 있다.

본 발명의 단백질 및 그 부분 펩티드를 취득하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 아미노산 서열의 정보를 기초로 합성 펩티드를 조제하는 방법, 또는 펩티드를 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하여 펩티드를 합성하는 방법을 들 수 있다. 펩티드를 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하여 펩티드를 합성하는 방법으로서는, 문헌 [Kriegler, "Gene Transfer and Expression-A Laboratory Manual", Stockton Press, 1990, 및 Yokota et al., Bio-Manual Sries 4, "Methods for Gene Transfer and Expression, and Analysis Methods therefor", Yodosha Co., Ltd. 일본, 1994] 등에 기재되어 있는 다수의 방법을 참조할 수가 있다.

본 발명에 따르면, 상기한 7회 막관통형 수용체 단백질 C5L2를 코드하는 DNA가 제공된다.

7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질을 코드하는 DNA의 일례로서, 본 발명의 인간 유래의 cDNA 서열을 서열 번호 1에 아미노산 서열과 동시에 기재하였다. 그리고, C5L2의 mRNA의 서열로부터 얻어진 DNA의 서열을 서열 번호 3에, 서열 번호 3의 DNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 서열 번호 4에 기재하였다. 서열 번호 3의 서열은, 서열 번호 1의 DNA 서열과 그 5' 및 3' 말단에 존재하는 비번역 영역(1 내지71번째의 염기 서열 및 1086 내지 1287번째의 염기 서열)으로 이루어지는 염기 서열이다. 자연계에서 분리한 염색체 DNA 또는 cDNA에서, 유전 코드의 축중에 의해 그 DNA가 코드하는 아미노산 서열을 변이시키지 않고 DNA의 염기 서열이 변이된 예는 종종 발견된다. 이러한 변이 또는 유전 코드의 축중에 의해 얻어지는 염기 서열도 본 발명의 DNA에 포함된다. 또한, 5' 비번역 영역 및 3' 비번역 영역은 단백질의 아미노산 서열의 규정에는 관여하지 않기 때문에 비번역 영역의 염기 서열은 변이되기 쉽다. 이러한 변이 또는 유전 코드의 축중에 의해서 얻어지는 염기 서열도 본 발명의 DNA에 포함된다.

본 발명자들이 취득한 C5L2의 전체 길이 염기 서열을 서열 번호 1에 나타냈는데, 이 서열과는 다른 서열을 갖는 클론도 확인되었다. 서열 번호 1의 DNA 서열의 724번 내지 729번에는 티민(t)이 6개 연속하여 배열되어 있는데, 다시 t가 1개 부가되어 7개 연속하고 있는 클론도 검출되었다. 본 발명의 C5L2의 이 부위를 포함하는 핵산 프로브, 핵산 프라이머를 이용함으로써, t가 6개 연속되어 있는 서열과 t가 7개 연속되어 있는 서열을 구별하여 검출할 수가 있다.

본 발명의 C5L2를 코드하는 DNA를 취득하기 위해서는, 본 명세서의 서열 번호 1, 3 및 4에 기재한 염기 서열을 기초로 합성하면 좋다. 천연 DNA가 필요한 경우에는, 미성숙 나무상 세포나 정상 말초혈 유래 백혈구 등의 C5L2의 발현이 확인되어 있는 조직으로부터 추출하거나, 본 명세서의 실시예 2에서 행한 바와 같이 태반 유래 cDNA 라이브러리로부터 취득할 수도 있다. 또한, 서열 번호 1에 기재한 C5L2를 코드하는 DNA를 취득하기 위해서는, C5L2의 전체 아미노산 서열을 코드하는cDNA를 포함하는 재조합체 DNA를 도입한 형질 전환체(구체적으로는, 본 발명자들이 기탁한E. coli: DH5-pcDNAC5L2 등)로부터 단리할 수도 있다.

또한, 본 발명은, 서열 번호 3 또는 4에 기재된 DNA 중의 연속된 적어도 12개의 염기로 이루어지는 DNA 단편 및 그 유도체, 및 서열 번호 3에 기재된 DNA에 상보적인 RNA 중의 연속된 적어도 12개의 염기로 이루어지는 RNA 단편 및 그 유도체를 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 유전자는 다른 공지된 유전자와의 상동성이 낮기 때문에(60 % 미만), 다른 유전자를 프로브로서 이용한 크로스-하이브리다이제이션법 등으로 클로닝하기는 곤란하다. 크로스-하이브리다이제이션을 이용한 클로닝의 예는 다수 존재하지만(예를 들면, Murphy, P.M. et al., Science, 253, 1280-1283, 1991; Combadiere, C. et al., J. Biol. Chem., 270, 16491-16494, 1995), 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2의 클로닝은 이루어져 있지 않다. 또한, 본 명세서의 실시예에 나타내는 바와 같이, C5L2의 cDNA 서열의 일부를 이용한 cDNA 라이브러리의 스크리닝에서는 공지된 수용체 유전자라고 생각되는 클론은 검출되지 않으며(실시예 2 참조), C5L2의 cDNA 서열의 일부를 이용한 노던 블로팅에 의한 해석에서는 공지된 수용체 유전자라고 생각되는 전사 산물은 검출되지 않았다(실시예 3 참조). 따라서, 공지된 유전자를 이용한 크로스 하이브리다이제이션으로 본 발명의 유전자를 클로닝하기가 곤란하고, 본 발명의 DNA 단편 또는 RNA 단편은, C5L2의 cDNA 또는 그 단편, 게놈 DNA나 그 단편을 다른 DNA 중으로부터 검출할 때에 매우 유용하다.

cDNA 또는 게놈 DNA의 검출에 유용한 핵산 단편으로서는, 서열 번호 2 또는 3의 염기 서열, 또는 그의 염기 서열에 상보적인 DNA나 RNA 중의 연속된 적어도 12 개, 바람직하게는 16 개 이상, 더욱 바람직하게는 20 개 이상의 염기로 이루어지는 DNA 단편 또는 RNA 단편, 또는 이들 핵산 단편의 유도체를 들 수 있다. 핵산 단편의 길이는, 그 단편의 특이성, 검출하고자 하는 핵산과의 결합 안정성 등에 따라 다르다. DNA 단편을 프라이머로 하여 PCR(Polymerase Chain Reaction, 폴리머라제 쇄 반응)법을 행하는 경우에는, T_m(2개쇄 해리 온도)가 45 ℃ 이상이 되는 DNA 단편을 이용하는 것이 바람직하다. PCR과 같이 DNA 끼리 결합하는 경우에는, 하나의 GC 결합을 4 ℃로 하고, 하나의 AT 결합을 2 ℃로 하여 합산하여 T_m을 추정할 수가 있다. 따라서, 검출하고자 하는 서열의 GC 컨텐트가 높은(90 % 이상인) 경우에는 연속된 적어도 12개의 염기로 이루어지는 핵산 단편을 이용하고, 보다 일반적인 GC 컨텐트가 약 50 %인 서열을 검출하는 경우에는, 연속된 적어도 16개의 염기로 이루어지는 핵산 단편이 필요하다. DNA와의 결합이 보다 안정한 핵산 유도체를 프라이머로서 이용하는 경우에는, 다시 짧은 핵산을 이용하여 목적으로 하는 DNA를 검출하는 것이 가능하다.

진단 목적으로 본 발명의 유전자의 발현을 조사하기 위해서는, 서열 번호 4의 DNA(서열 번호 3의 DNA의 상보쇄) 또는 서열 번호 3의 DNA에 상보할 수 있는 RNA, 또는 그 속의 연속된 적어도 12 개, 바람직하게는 16 개 이상, 더욱 바람직하게는 20 개 이상의 염기로 이루어지는 핵산 단편, 즉 안티센스 DNA 또는 RNA, 또는안티센스 핵산이 메틸화, 메틸포스페이트화, 탈아미노화, 또는 티오포스페이트화된 유도체를 이용한 하이브리다이제이션, 프라이머 익스텐션, 누크레아제·프로텍션·정량, 역전사 유전자 증폭(RT-PCR)법 등을 채용할 수가 있다. 구체적으로는, 실시예 4에 나타내는 바와 같이 서열 번호 4의 염기 서열(서열 번호 3의 DNA에 상보적인 DNA)의 단편을 이용한 C5L2의 mRNA의 검출이 가능하다.

또한, 본 발명의 염기 서열을 이용하여 쥐 등의 다른 생물이 갖는 본 발명의 유전자의 상동물의 검출 또는 그와 같은 유전자의 클로닝이 가능하다. 또한, 본 발명의 DNA나 RNA, 및 그 단편을 이용하면 인간, 마우스를 포함한 게놈상의 유전자 클로닝도 마찬가지로 가능하다. 구체적으로는 트랜스제닉 마우스, 진 타게팅 마우스 또는 본 발명의 유전자와 관련되는 유전자를 함께 불활성화한 더블 넉아웃 마우스 등의 최근 개발된 유전자 조작 기술을 이용한 연구도 가능하다. 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 게놈에 이상이 있으면, 유전자 진단이나 유전자 치료로의 응용도 가능하다.

본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 더욱 상세한 기능을 밝히는 것을 목적으로 하며, 세포 또는 생체로의 안티센스 핵산의 투여도 생각할 수 있다. 예를 들면 C5L2가 과잉의 반응이 병태로 되어 있는 질환에 대해서는, 안티센스 핵산을 이용하여 유전자의 발현을 억제함으로써 치료를 행할 수가 있다. 또한, 안티센스 핵산을 적당한 벡터에 조립하여 얻어지는 재조합체 핵산을 이용할 수도 있다. 이러한 안티센스 핵산의 작성예·사용예에 대해서는 문헌 [Murray, J. A. H. ed., ANTISENSE RNA AND DNA, Wiley-Liss, Inc., 1992]를 참조할 수가 있다.

또한 본 발명에 따르면, 상기한 본 발명 중 어느 하나의 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합체 DNA가 제공된다.

본 발명의 재조합체 DNA를 조제하기 위하여 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않지만, 통상 이용되는 벡터를 이용할 수가 있다. 구체적으로는, 대장균(E. coli) 유래의 pBR322, pUC8, pUC18, pUC19, pUC119(모두 일본국, 다까라주조사 제품); 고초균(Bacillus subtilis) 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 등의 플라스미드 벡터; λgt10, λgt11(모두 미국, Stratagene사 제품)등의 박테리오파지 벡터; 레트로바이러스 또는 왁시니아 바이러스 등의 동물 바이러스 등을 들 수 있는데, 그 밖의 것이더라도 숙주내에서 증식할 수 있는 것이면 된다. 본 발명의 재조합체 DNA의 구체적인 예로서는, 벡터로서 pcDNA3.1/Myc-His(+) B를 이용한 재조합체 DNA(실시예 4 참조)를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 전체 아미노산 서열을 코드하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pcDNAC5L2를 대장균 DH5에 유전자 도입한 형질 전환 세포 E. coli: DH5-pcDNAC5L2를 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(일본국 305-0046 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 1998년 9월 1일에 기탁하였다(기탁 번호: FERM BP-6833).

또한, 본 발명의 재조합체 DNA는 공지된 숙주에게 도입하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 재조합체 DNA로 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포도 제공한다.

본 발명의 재조합체 DNA를 도입하는 숙주는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 재조합체 DNA를 발현 가능한 미생물 또는 배양 세포이면 좋다. 구체적으로는, 에스케리키아(Escherichia) 속균(대장균), 바실루스(Bacillus)속균(고초균) 등의 원핵 세포에, 칼슘 클로라이드법 등을 이용하여 재조합체 DNA를 도입할 수가 있다. 상기 에스케리키아속균의 예로서는,Escherichia coliK12, HB101, MC1061, LE392, JM109, INVαF'를 들 수 있다. 바실루스 속균의 예로서는Bacillus subtilisM1114를 들 수 있다. 또, 파지 벡터는, 예를 들면 증식시킨 대장균에 시험관 내 패키징법(Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 4242-4246, 1978)를 이용하여 도입할 수가 있다. 또한, 동물 세포, 곤충 세포 등의 진핵세포도 숙주로서 이용할 수 있다.

또한 본 발명은, 형질 전환체에 의해 그 세포 표면에 제조된 7회 막관통형 수용체 단백질을 제공한다. 구체적으로는,

(a) C5L2를 코드하는 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 결합하여 상기 DNA와 상기 복제 가능한 발현 벡터를 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA를 얻고,

(b) 상기 복제 가능한 재조합체 DNA로 미생물 또는 배양 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성시키고,

(c) 상기 형질 전환체를 상기 미생물 또는 배양 세포의 모세포로부터 선별하고,

(d) 상기 형질 전환체를 배양하여 상기 형질 전환체에 상기 핵산을 발현시키는

것을 포함하는 방법에 의해서 상기 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 C5L2를 제공한다.

형질 전환체의 세포 표면에 C5L2를 제조할 때에 사용하는 재조합 벡터는, 벡터에 삽입된 C5L2를 코드하는 DNA의 5' 말단에 번역 개시 코돈, 그 3' 말단에 번역 중지 코돈을 가지고 있어도 좋다. 번역 개시 코돈 또는 번역 중지 코돈은 적당한 합성 핵산 어댑터를 이용하여 부가할 수도 있다. 또한, 목적으로 하는 DNA를 발현시키기 위해서는, DNA의 상류에 프로모터를 접속하는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용되는 프로모터는, 유전자 발현에 이용하는 숙주에게 대응한 프로모터이면 특별히 한정되지 않는다. 숙주가 에스케리키아 속균인 경우는, tac 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 등이 바람직하고, 숙주가 바실루스 속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 원핵 세포인 경우에는, 도입하는 재조합체 DNA는 프로모터와 함께 리보좀 결합 부위를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 숙주가 효모인 경우에는 PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하고, 숙주가 동물 세포인 경우에는, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈티오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 C5L2를 제조할 때에 이용하는 DNA로서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 C5L2를 코드하는 DNA이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 서열 번호 1의 염기 서열을 이용할 수 있다. 또한, 특정한 기능을 부가한 C5L2를 생산하기 위하여 C5L2를 코드하는 DNA에 공지된 염기 서열을 결합할 수도 있다. 예를 들면 세포 표면으로의 발현을 보장하기 위해서 시그널 펩티드를 코드하는 DNA를 5' 말단(펩티드의 N 말단)에 부가하거나, 생산된 단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여 항원 에피토프를 코드하는 DNA 등을 부가할 수가 있다. 이러한 기술의 일례에 대해서는, 문헌 [Choe, H. et al., Cell, 85, 1135-1148, 1996] 등을 참조할 수가 있다.

C5L2를 제조하기 위한 형질 전환체는, 상기한 바와 같이 하여 구축된 재조합체 DNA를, 벡터를 발현 가능한 숙주 세포에 도입하여 얻어진다. 숙주으로서 이용되는 세포로서는, 상기한 에스케리키아속균, 바실루스 속균, 효모, 동물 세포 등을 들 수 있다. 바람직한 숙주는 동물 세포이며, 원숭이 세포인 COS-7, Vero 세포, 차이니스 햄스터 세포인 CHO, 누에 세포인 SF9 등을 들 수 있다. 본 명세서의 실시예 5 및 7에서 행한 바와 같이 상기한 재조합체 DNA를 293 세포 또는 CHO 세포에 유전자 도입하여 형질 전환체를 제조하는 것은 용이하며, 형질 전환체를 배양함으로써, C5L2를 형질 전환체의 세포 표면에 제조할 수가 있다. 배양한 형질 전환체에 의한 C5L2의 제조는, 실시예 5에서 이용한 웨스턴 블로팅법 또는 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)에 의해 확인할 수가 있다.

본 발명의 7회 막관통형 수용체 단백질을 이용하여, 7회 막관통형 수용체 단백질에 대한 리간드의 스크리닝을 행할 수 있다. 본 발명은, 실질적으로 순수한 C5L2 단백질, 그 부분 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 C5L2를 샘플 재료와 접촉시키고 C5L2 또는 그 펩티드와 리간드와의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로 하여 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 이용되는 C5L2는, 정제한 단백질이든 미정제의단백질이든 상관없지만, 생체 내와 동일한 리간드 결합 활성을 가질 필요가 있다. 미정제 C5L2에는, 세포막 획분 또는 본 발명의 단백질을 세포막에 발현하고 있는 천연의 세포나 형질 전환체가 포함된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 이용되는 리간드를 포함한다고 생각되는 샘플 재료는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 생리적인 리간드가 포함된다고 생각되는 생체 유래의 조직 또는 세포의 추출액 또는 배양 상청, 합성 화합물 또는 미생물의 배양 상청을 이용할 수 있다. 본 발명의 수용체가 공지된 인간의 아나필라톡신 수용체와의 상동성을 갖는 것과 연관하여 생각하면, C5L2의 리간드는 케모카인군에 속하는 물질로 한정되지 않고, 소마토스타틴, 안지오텐신, 브라디키닌 등의 펩티드 호르몬, 또는 보체 또는 균체 성분 등일 가능성도 생각된다.

C5L2에 대한 리간드를 검출하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 C5L2와 샘플 재료를 접촉시키고, 그 결과로서 발생한 C5L2와 리간드 복합체의 양 및(또는) 미결합 샘플 재료의 양을 측정하는 방법 또는 샘플 재료와 C5L2의 결합에 의해 야기되는 반응을 측정하는 방법을 들 수 있다. 복합체의 양 및(또는) 미결합 샘플 재료의 양을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 방사성 화합물이나 색소 등을 이용하여 샘플 재료를 표식하고 나서 C5L2와 접촉시키고, 그 후, C5L2-리간드 복합체와 미결합 샘플 재료를 분리하고, 표지를 이용하여 복합체의 양 및(또는) 미결합 샘플 재료의 양을 측정할 수가 있다. 일례로서, 본 명세서의 실시예 6에서는, 방사 표지된 미결합된 리간드 후보 화합물의 양을 측정하였다. 또한, 수용체와 결합하는 물질이 특정되어 있는 경우에는, 그 물질을 표지하여, 샘플 재료가 표지 물질과 경합되는지 여부로써, 샘플 재료의 결합을 측정할 수가 있다. 이러한 방법의 구체예는, [아사누마 마사또들, 실험 의학 11, 22 내지 29, 1993년] 등에 기재되어 있다. 그 밖에도, SPA(Scintillation Proximity Assay, 신틸레이션 근접 정량)과 같이, C5L2-리간드 복합체와 미결합 샘플 재료를 분리하지 않고 리간드의 결합량을 측정하는 방법도 있다.

샘플 재료와 C5L2의 결합에 의해서 야기되는 반응을 측정하는 방법으로서는, C5L2가 공액되어 있는 시그널 전달계를 이용한 여러가지 방법을 생각할 수 있다. 이러한 방법으로서, 예를 들면 [가라끼 히데아끼들 편, 실험 의학 7, 26 내지 109, 1989년]의 기재와 같이, 세포내 칼슘 농도를 측정하는 방법, [Samson, M. et al., Biochem. 35, PP 3362-3367, 1996]과 같이 마이크로 피지오미터를 이용하는 방법, 세포내 cAMP의 양을 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 일례로서, 본 명세서의 실시예 7에서는, LPS를 투여한 쥐 혈청을 이용한 C5L2 형질 전환 세포의 화학 유주를 관찰하였다.

또한, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 단백질의 부분 서열로 이루어지는 단편 펩티드를 이용하여 리간드를 결정하는 수법으로서는, BIACORE(등록상표명)을 이용한 방법, 수지 칼럼을 이용한 정제에 의한 방법 등을 들 수 있다. BIACORE(등록상표명)은 2개의 단백질의 회합을 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 검출하는 장치이다(단백질 핵산 효소 37, 2977 내지 2984, 1992). 이 경우, 정제한 본 발명의 펩티드, 바람직하게는 N 말단 세포외 영역 부분을 BIACORE(등록상표명)의 센서 칩상에 고정하고, 리간드 후보인 샘플 재료를 그 위에 첨가하여 부분 펩티드와 샘플 재료의 결합(즉, 샘플 재료가 본 발명의 7회 막관통형 수용체 단백질의 리간드인지 여부)을 검토한다. 또한, 본 발명의 부분 펩티드를 칼럼 크로마토그래피용 수지에 고정한 친화성 칼럼을 제작함으로써, 예를 들면 세포 배양 상청 중 등에 존재하는 인간형 C5L2의 리간드를 친화 정제할 수가 있다. 이와 같이 하여 정제한 리간드의 단리 및 동정이 가능하다.

상기한 본 발명의 전체 길이 단백질 및 그 부분 펩티드를 이용한 스크리닝 방법에 의해서 얻어지는 리간드는 7회 막관통형 수용체 C5L2에 작용하고 나무상 세포의 기능을 제어하여 질환의 치료를 행하는 물질을 검색하는 데에 있어서 유용하다.

또한, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질에 작용하는 물질, 즉, 본 발명의 단백질에 대한 리간드를 발견했을 경우에는, C5L2와 리간드와의 작용을 변화시키는 물질, 즉, 결합에 의해서 발생하는 반응을 활성화하거나, 반대로 활성화를 저해하는 물질을 검색하는 것도 가능하다. 구체적으로는, 실질적으로 순수한 수용체 C5L2 단백질, 그 부분 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 C5L2와, 그 단백질 또는 펩티드에 대한 리간드를 샘플 재료와 접촉시키고, 그리고 단백질 또는 펩티드와, 리간드와의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로 하여 C5L2와 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 물질을 검출하는 것을 포함하는 방법이다.

구체적인 스크리닝 방법으로서는, 예를 들면 본 명세서의 실시예 8에서 행한 형질 전환체의 화학 유주 시험을 채용할 수가 있다. 또한, C5L2에 대한 리간드를결정하는 방법과 같이, 리간드와 본 발명의 단백질 또는 펩티드와의 결합을 저해하는 물질은, 7회 막관통형 수용체 단백질에 작용하여 나무상 세포의 반응을 제어하고 질환의 치료를 행하는 물질로서 유용하다.

또한, 본 발명의 7회 막관통형 수용체 단백질의 부분 서열로 이루어지는 펩티드를 이용하여, 펩티드와 리간드와의 결합을 저해하는 물질 등을 스크리닝하는 수법으로서는, 리간드를 결정하는 방법과 마찬가지로 BIACORE(등록상표명)을 이용한 방법 등을 채용할 수가 있다.

또한 본 발명은 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.

본 발명의 항체의 작성에 이용되는 항원은 특별히 한정되지 않지만, C5L2 단백질을 특징화하는 길이가 있으면 좋고, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중의 연속된 적어도 5개의 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드를 이용하는 것이 바람직하며, 연속된 적어도 8개의 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드가보다 바람직하다. 이 펩티드를 그대로, 또는 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin, 키홀 림펫 헤모시아닌) 또는 BSA(Bovine Serum Albumin, 소 혈청 알부민)라는 캐리어 단백질과 가교한 후에 필요에 따라 어쥬번트와 함께 동물에게 접종시키고, 그 혈청을 회수함으로써 C5L2 단백질을 인식하는 항체(폴리클로날 항체)를 포함하는 항혈청을 얻을 수 있다. 또한, 항혈청으로부터 항체를 정제하여 사용하는 것도 가능하다. 항원을 접종하는 동물로서는 양, 소, 염소, 토끼, 마우스, 쥐 등이 사용되는데, 폴리클로날 항체 제작에는 양 또는 토끼가 바람직하다. 구체적으로는, 실시예 9에서 행한바와 같이 항인간 C5L2 단백질 토끼 폴리클로날 항체 또는 항인간 C5L2 단백질의 이뮤노글로블린 용액을 작성할 수가 있다.

또한, 하이브리도마 세포를 제작하는 공지된 방법에 따라 모노클로날 항체를 얻는 것도 가능하지만, 이 경우에는 마우스를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이 또는 그 중의 5잔기 이상, 바람직하게는 8잔기 이상의 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드를 GST(글루타치온 S-트랜스퍼라아제) 등과 융합시킨 것을 정제하거나, 미정제인 채 항원으로서 이용할 수도 있다. 문헌 ["Antibodies a laboratory manual", E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory]에 나타낸 각종 방법 및 유전자 클로닝법 등에 의해 분리된 이뮤노글로블린 유전자를 이용하여 세포에 발현시킨 유전자 재조합체 항체를 이용하여도 모노클로날 항체를 제작할 수가 있다.

본 발명의 항체는 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 정제에 이용할 수도 있다. 또한, 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하면, C5L2의 검출이나 정량이 가능하고, 세포의 분화 이상을 수반하는 질환 또는 자기 면역 질환, 예를 들면 악성 종양, 바이러스 감염, 류마티즘 등 질환의 진단약으로서 사용할 수가 있다. 또한, 본 명세서의 실시예 5에 나타내는 바와 같이, 이 검출이나 정량에는 웨스턴 블로팅, FACS 등의 방법을 이용하면 좋다. 웨스턴 블로팅에 관해서는 ["Antibodies a laboratory manual"(E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory)의 pp. 471-510]에 그 방법의 상세한 설명이, 그리고, 면역 침강, 면역 측정 등에 관해서는, 동 문헌 pp. 421-470, pp. 553-612에 각각상세한 설명이 기록되어 있다. FACS를 이용한 임상 진단의 예는, 예를 들면 [텐진 요시오들 편 "플로우 사이토메트리 핸드북"(사이언스포럼사, 1984년)의 제4부 "플로우 사이토메트리의 임상 의학으로의 응용"]에 개시되고 있고, FACS시의 세포의 염색에 대해서는 [다까쯔 기요시, 다끼 신스께 저 "면역 연구의 기초 기술"(양토사, 1995) pp. 16 내지 61]에, 조작 방법에 대해서는 [텐진 요시오들 편 "플로우 사이토메트리 핸드북"(사이언스포럼사, 1984)]에 상세한 설명이 개시되어 있다.

또한 본 발명은, 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 발현량의 측정을 포함하는 염증성 질환의 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 7회 막관통형 수용체 C5L2는, 상동성 검색의 결과 등으로부터도 염증, 감염에 의한 면역 조절에 깊이 관여하고 있는 것이 시사되어 있으며, 말초혈 백혈구에서의 발현이 높다는 이유에서 염증을 수반하는 질환의 진단으로의 응용이 생각되었다. 처음에, 백혈구를 임파구(T 세포, B 세포, 단구)와 과립구(호중구, 호산구, 호염기구)로 분획하여, C5L2의 발현량을 RT-PCR로 해석한 결과, 서열 번호 2의 아미노산 서열은 과립구에 강하게 발현하고 있는 것이 판명되었다. 이어서, 염증성 질환의 하나로서 만성 관절 류마티즘(RA)에 주목하여, RA 환자와 건강한 보통 사람의, 총 30증례 이상의 말초혈로부터 과립구를 조제하여 RT-PCR로 해석하였다. 또한, RA 환자의 활액, 활액로부터 분획한 세포, 활막 조직편, 활막 조직편을 콜라게나아제 처리하여 얻어진 세포, 및 이 활막 조직편로부터 얻어진 세포로부터 분획한 백혈구에 대하여 RT-PCR에 의한 해석을 행하였다. 그 결과, C5L2이 활액에서도 과립구에 강하게 발현하고 있다는 것, 과립구를 거의 포함하지 않은 활막 조직에서는 거의 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다.

또한, 본 발명자들은, 인간으로부터 분리 채취한 체액 또는 조직에 있어서, C5L2 발현량이 분리 채취 후 변화할 가능성에 주목하여, 채혈 직후 및 일정 시간 경과 후의 말초혈에 포함되는 과립구를 분획하여, 경시적인 C5L2 발현량의 변화를 해석하였다. 구체적으로는, 건강한 보통 사람으로부터 혈액을 채취하고, 그 일부에서 비중 원심법에 의해 과립구 획분을 얻었다. 나머지 혈액은 실온에서 정치하고, 일정 시간 경과 후에 신선혈과 함께 비중 원심법에 의해 과립구 획분을 얻었다. 각 과립구 획분에 대하여 서열 번호 9와 10의 화학 합성 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해서 세포중의 mRNA량을 측정하였다. 그 결과, 건강한 보통 사람의 말초혈 유래의 과립구에서는, C5L2의 mRNA량은 채혈로부터 6 시간만에 급격히 감소하고, 그 후 24 시간 후까지 완만하게 감소한다는 것이 판명되었다(도 2 참조).

또한, RA 환자의 말초혈을 상기와 동일하게 하여 해석했더니, RA 환자의 말초혈 유래 과립구 중의 C5L2의 mRNA량은 채혈 후 24 시간이 경과하여도 감소되지 않는다는 것이 밝혀졌다.

과립구 획분에서의 C5L2의 발현은, 채혈 직후의 신선혈에서는 매우 높음에도 불구하고, 채혈 후 보존하고 있는 동안에 발현량이 크게 감소한다. 이러한 현상은 케모카인 수용체인 CCR4나 CCR5에서는 나타나지 않고, 본 발명의 수용체인 C5L2에 특유한 현상이라는 것이 본 발명자들에 의해서 처음으로 발견되었다.

과립구 획분에 나타나는 C5L2의 발현의 제어에 대해서는, 이하와 같이 생각된다. 인간 말초혈의 백혈구에서의 각 혈구의 비율은, 임파구가 25 내지 33 %, 단구가 3 내지 7 %, 호중구가 55 내지 60 %, 호산구가 1 내지 3 %, 호염기구가 0 내지 0.7 %(생화학사전 동경 화학동인 참조)이고, 환산하면 과립구 획분(호중구, 호산구 및 호염기구)의 9할 이상은 호중구이다. 호중구는 비특이적 면역 기구의 일원이고, 접착, 주화, 탐식, 살균 등의 일련의 메카니즘에 의해, 병원체(주로 세균)을 생체로부터 배제하는 백혈구이다. 말초혈에서의 성숙 호중구의 혈중 체류 시간은 10 내지 16 시간, 수명은 2 내지 3일이고, 성숙 호중구 중에는 혈중을 순환하고 있는 것과 혈관 내피 세포벽에 부착되어 있는 것이 있다. 그 수는 정상시에는 거의 동수이고, 성숙 호중구는 혈관 내피 세포벽에 부착 후 조직에 유출된다. 조직에 유출된 성숙 호중구는 구강, 소화관, 폐포 등으로 손실되거나, 간장, 비장, 피하 등의 조직으로 아포트시스를 일으켜 마크로파아지에 탐식되므로, 조직내출의 평균 수명은 1 내지 4일 정도라고 생각되고 있다. 일단 조직으로 유출된 성숙 호중구는 혈중에는 되돌아가지 않고, 염증 부위로 향한 것은 아포토시스가 제어되어 수명이 길어진다. 한편, 세균을 탐식한 호중구의 수명은 단축된다. 아포토시스에 빠진 호중구는 주화 성능, 식 작용, 형태 변화, 부착 능력, 탈과립, 활성화 산소의 산생 등의 기능이 전부 저하되어 있다[Haslett, C. et al., Chest, 99(Suppl. 3): 6S, 1991; 및 Whyte, M. K. et al., J. Immunol., 150, 5124-5134, 1993]. 호중구가 아포토시스에 빠지는 것은, 호중구의 활성화가 지속되면 생체에 유해하기 때문에, 이러한 문제를 방어하기 위한 메카니즘이라고 생각되고 있다.

본 발명의 C5L2는 평소부터 세포에 발현되어 있어, 감염 또는 염증 등의 어떠한 이상이 체내에 발생한 경우에는, C5L2를 발현하고 있는 세포가 이상이 있는부위에 유출되어 작용한다고 생각된다. 즉, 염증 부위에서 충분히 기능할 수 있는 세포에 C5L2는 발현하고 있고, 세포가 염증 부위에 유출되어 살균 작용을 개시하면, C5L2는 그 역할을 마쳐 발현이 저하된다. 또한, C5L2를 발현하는 세포가 염증에 관계없이 조직으로 유출되어 아포토시스에 빠진 경우에도, C5L2는 세포로부터 소실된다고 생각된다. 따라서, 혈관내에 존재하는 정상적인 상태와는 많은 점에서 다른 채혈 후의 혈액에서는, 채혈 후의 보존에 의해 세포 활성의 저하 또는 아포토시스의 유도가 발생하여 C5L2 발현량이 저하되는 것이다.

한편, 염증 부위로 향했던 호중구는 아포토시스가 제어되어 수명이 길어진다는 보고[Watson, R. W. et al., J. Immunol., 158, 945-953, 1997] 또는 비활동기의 베체트병 환자의 말초혈 중의 호중구의 아포토시스가 억제되어 있기 때문에[사까네 쯔요시와 다께노 미쯔히로 저, "호중구 기능 저하와 기능 항진", 의약 저어널사, 1998] 염증성 질환을 앓는 사람의 말초혈 중의 호중구도 마찬가지로 아포토시스의 억제를 받고 있다고 생각된다. 따라서, 세포 활성의 저하 또는 아포토시스의 유도가 발생하는 채혈 후의 혈액에서도, 염증성 질환 환자로부터 얻어진 호중구는 그 활성을 유지하고 있기 때문에 C5L2의 발현량이 건강한 보통 사람과 같이 감소되지 않고 계속되는 것이라고 생각된다.

또한, 호중구의 활성 그 자체가 저하되지 않고 계속 유지되는 것이, 염증 만성화의 원인이라고도 생각된다.

이상과 같은 예의 연구 결과, 본 발명자들은, 채혈 후의 C5L2 발현량의 변화, 또는 채혈로부터 일정 시간 경과 후의 C5L2 발현량을 측정하는 것이, 염증성질환의 마커로서 유용하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 진단 방법은, 호중구의 기능 저하 또는 항진이 하나의 요인인 염증성 질환, 예를 들면 만성 관절 류마티즘, 베체트병, 스위트 증후군 또는 괴저성 농피증 등의 호중구성 피부증, 성인 호흡 궁박 증후군(adult respiratory distress syndrome, ARDS), 허혈 재관류 장해, 패혈증성 쇼크 증후군, 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 췌장염 등의 진단에 유용한데, 바람직하게는 류마티즘, 특히 바람직하게는 만성 관절 류마티즘의 진단에 이용할 수 있다. 현재 이용되고 있는 류마티즘의 마커는 6주간의 장기간에 걸치는 관찰이 필요하였으나, C5L2의 발현량을 마커로서 이용하는 본 발명의 진단 방법을 이용하면, 진단 결과가 수일만에 얻어지기 때문에 조기 진단이 가능하다.

또한, 본 발명의 진단 방법은 만성 염증성 질환의 검출에도 유용하다. 호중구의 아포토시스 및 그것에 계속되는 마크로파아지에 의한 탐식은 정상적인 면역 반응에 불가결한 것이며, 호중구가 활성을 계속 유지하는 것은 염증의 만성화를 나타내는 지표가 된다. 따라서, C5L2의 발현은 만성 염증성 질환의 마커가 된다. 또한, 궤양성 대장염 또는 클론병과 같이 증악 관해를 반복하는 염증성 질환에 있어서는, C5L2의 발현량으로부터 질환이 활동기인지 여부를 판단할 수도 있다.

본 발명의 진단 방법에 이용하는 세포로서는 백혈구가 바람직하고, 특히 과립구가 바람직하다. 염증 부위에서 충분히 기능할 수 있는 세포인 과립구는 C5L2를 항상 발현하고 있어 세포의 활성이 저하하면 C5L2의 발현도 소실된다고 생각된다. 따라서, 상기한 바와 같이, 건강한 보통 사람의 과립구는 채혈 후에는 경시적으로 C5L2의 발현량이 저하된다. 특히 염증성 질환의 이환 환자와 건강인의 차이를 명확히 검출하기 위해서는, 진단에 이용하는 과립구는, 적어도 6 시간 전에 채취한 과립구인 것이 바람직하다.

C5L2의 발현량을 정량하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 백혈구 중에 존재하는 C5L2의 mRNA를 정량하는 방법 또는 세포 표면에 존재하는 단백질을 정량하는 방법을 들 수 있다. 유전자로부터 전사된 mRNA는, 세포내의 메카니즘에 의해서 단백질로 번역되기 때문에 mRNA량으로부터 단백질량을 추정할 수가 있다. C5L2를 코드하는 mRNA의 정량에 이용하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, RT-PCR(역전사 PCR)법을 이용하는 것이 바람직하다. RT-PCR법이란, 역전사 효소를 이용하여 mRNA에서 cDNA를 합성한 후, 내열성 DNA 폴리머라아제와 C5L2에 특이적인 2종류의 프라이머를 이용하여 mRNA에서 합성한 cDNA를 증폭하는 방법이다. 증폭된 핵산량으로부터 세포 중에 포함되어 있는 mRNA량을 상대적으로 구할 수 있다.

RT-PCR에 이용하는 프라이머로서는, 본 발명의 DNA단편, 즉, 서열 번호 3 또는 4의 DNA 중의 연속된 적어도 12개, 바람직하게는 16개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 염기로 이루어지는 DNA 단편, 또는 그 유도체를 들 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 9 및 10에 기재된 프라이머를 이용할 수 있다. C5L2의 mRNA를 정량하는 방법으로서는, 본 명세서의 실시예 11에서 행한 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 9 및 10의 프라이머를 이용하여 C5L2의 mRNA를 검출하고, 다시 서열 번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 동일 샘플 중의 G3PDH를 검출한다. C5L2를 코드하는 mRNA의 양은, G3PDH의 PCR 산물량을 100 %로 한 상대값(발현율)으로 구할 수 있다.

세포 표면에 존재하는 단백질을 정량하는 방법으로서는, C5L2를 특이적으로 정량할 수가 있는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 C5L2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 명세서의 실시예 9에서 작성한 바와 같은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중의 연속된 적어도 5개 이상의 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드를 항원으로서 이용하여 얻어진 항체를 이용할 수 있다. 항체를 이용한 C5L2 단백질의 발현량의 정량 방법으로서는, 실시예 11에 나타내는 FACS 또는 면역 침강 등의 방법을 이용할 수 있다. FACS를 이용한 임상 진단의 예는, 예를 들면 [텐진 요시오들 편 "플로우 사이토메트리핸드북"(사이언스포럼사, 1984)의 제4부, 플로우 사이토메트리의 임상 의학에의 응용]을 참조할 수가 있다. 또한, 면역 침강, 면역 측정 등에 관해서는 ["Antibodles a laboratory manual"(E. Harlow et al,, Cold Spring Harbor Laboratory)의 pp. 421-470와 pp 553-612]에 각각 상세한 설명이 기록되어 있다.

또한, 염증을 일으키고 있는 관절의 활액 등의 염증 부위를 둘러싸는 체액 중에는, 7회 막관통형 수용체 단백질(예를 들면 CD97)의 세포밖 도메인이 가용화되어 안정된 형태로 유리되어 있는 예가 보고되어 있다(James X. Gray et al., J. Immunol., 157, 5438-5447, 1996). 혈액 또는 활액 중에 유리되어 있는 C5L2 단백질 또는 그 부분 펩티드를 정량하는 것도 염증성 질환의 진단에는 유효한 수단이 된다. 이 경우도, 상기한 바와 같이 본 발명의 C5L2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하는 것이 바람직하고, C5L2 단백질의 정량법으로서는, 웨스턴 블로팅또는 FACS 등을 채용할 수가 있다.

이어서, 본 발명의 실시 형태를 상세히 설명하는데, 본 발명은 이러한 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

신규한 7회 막관통형 수용체 유전자 단편의 취득

1 리터의 건강한 보통 사람의 말초혈로부터 백혈구연층을 회수하여 얻은 유핵 세포를 37 ℃, 5 % 탄산 가스 분위기하에서 14 일 간 배양하여 미성숙 나무상 세포에 분화시켰다. 배지는, 10 % 소태아 혈청(FBS)(미국, Intergen사 제품), 100 ng/㎖ 인간 GM-CSF, 50 ng/㎖ 인간 IL-4 및 1×항생 물질-항진균제(100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/㎖ 안포테리신 B)(미국, GIBC0 BRL(등록상표명))을 포함하는 RPMI1640 배지를 사용하였다. 이에 따라, 말초혈 백혈구로부터 1×10⁷개의 미성숙 나무상 세포를 얻었다.

얻어진 미성숙 나무상 세포를 회수하여 PBS(Phosphate Buffered Saline, 포스페이트 완충 식염수) 30 ㎖에 현탁한 후, Quick Prep mRNA 정제 키트(스웨덴, Pharmacia Biotech사 제품)를 이용하고, 제2 칼럼 정제를 행하지 않은 것 이외에는 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하였다. 이어서, 추출한 mRNA 1 ㎍을 이용하여 SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(미국, Life Technologies사 제품) 및 그 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하고, 다시, 올리고(dT) 프라이머를 이용하여cDNA를 2개쇄(dsDNA)로 하였다. 페놀/클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행한 후, dsDNA를 40 ㎕의 멸균수에 용해하여 cDNA 샘플로 하였다.

cDNA 샘플을 PCR에 걸어 증폭하였다. 구체적으로는, cDNA 샘플 2 ㎕에, DNA 폴리머라아제로서 5 U/㎕ TaKaRa Taq(코드 ROO1A)(일본국, 다까라주조사 제품)를 0.5 ㎕, 폴리머라아제에 첨부된 10×PCR 버퍼와 dNTP 혼합물(각 뉴클레오티드의 농도: 2.5 mM)를 각각 5 ㎕과 4 ㎕, 및 프라이머로서 서열 번호 5와 6에 나타낸 합성 올리고뉴클레오티드를 각각 200 pmol 첨가하여 최종 용량을 50 ㎕로 하였다. PCR는, TaKaRa PCR Thermal Cycler 480(일본국, 다까라주조사 제품)를 이용하여, 95 ℃ 1분, 40 ℃ 2 분, 72 ℃ 3 분의 사이클을 5 사이클 행한 후, 95 ℃ 1분, 50 ℃ 2분, 72 ℃ 3분의 사이클을 25 사이클 행하였다. 얻어진 PCR 산물의 일부를 1.5 % 아가로스·겔에 의한 전기 영동에 걸어, 약 700 bp의 cDNA가 증폭되어 있다는 것을 확인하였다. 이 밴드를 겔로부터 추출하여 GENECLEAN II 키트(미국, BIO101사 제품)를 사용하여 정제하고, 얻어진 cDNA 단편을 TA 클로닝 키트(미국, Invitrogen사 제품)를 이용하여 pCR2.1 벡터(미국, Invitrogen사 제품)에 조립하였다. cDNA를 조립한 pCR 2.1 벡터로 대장균 0ne Shot Competent Cells(미국, Invitrogen사 제품)를 형질 전환하고, 암피실린 내성을 지표로 하여 형질 전환체(즉, 클론)을 회수하고, Wizard(등록상표명) Minipreps(미국, Promega사 제품)의 프로토콜에 따라 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드를 제한 효소 FcoRI로 소화하여, 약 700 bp의 DNA가 추출됨으로써 상기한 PCR 산물이 벡터에 삽입되어 있다는 것을 확인하였다.

정제한 플라스미드에 대하여, 조립한 cDNA 단편의 염기 서열을 형광 시퀀서(미국, Applied Biosystems사 제품)를 이용하여 결정하였다. 시퀀스 샘플의 조제에는 PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(미국, Applied Biosystems사 제품)를 이용하였다. 구체적으로는, 0.5 ㎖ 용량의 마이크로 튜브에 반응 스톡액을 9.5 ㎕, 0.8 pmol/㎕의 T7 프로모터프라이머(미국, GIBCO BRL(등록상표명))를 4.0 ㎕, 및 0.16 ㎍/㎕ 시퀀스용 주형 DNA를 6.5 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 100 ㎕의 미네럴 오일을 중층후, TaKaRa PCR Thermal Cycler 480을 이용하여 PCR를 행하였다. 반응 조건은, 96 ℃ 30 초, 55 ℃ 15 초 및 60 ℃ 4 분을 1 사이클로 하는 반응을 25 사이클 행한 후, 4 ℃에서 5 분 간 보온하였다. 반응 후의 혼합 용액에, 80 ㎕의 멸균 정제수를 첨가하여 교반하고, 수성상을 원심 분리한 후, 그 수층에 대하여 페놀/클로로포름 추출을 3회 행하였다. 다시, 실온에서 에탄올 침전을 행한 후, 침전된 DNA를 건조시켰다. 10 mM EDTA를 포함하는 포름아미드 4 ㎕에 DNA를 용해하고 90 ℃에서 2 분 간 변성후, 얼음 속에서 냉각하여 시퀀스용 샘플로 하였다.

약 250의 클론에 관해서 DNA의 염기 서열을 결정했더니, 그 중 1개의 클론이 서열 번호 1의 235 내지 852번째에 대응하는 염기 서열을 가지고 있었다. GenBank(릴리스 106.0, 1998년 4월)를 이용하여 상동성 검색을 행한 결과, 이 서열은 7회 막관통형 수용체군과 유사하다는 것이 판명되었다.

<실시예 2>

신규한 7회 막관통형 수용체 전체 길이 유전자의 취득

인간 태반 조직 유래의 cDNA 라이브러리(미국, CLONTECH사 제품)로부터 플라그 하이브리다이제이션으로 본 발명의 7회 막관통형 수용체의 전체 길이 cDNA를 갖는 클론을 단리하였다. 구체적으로는, 10⁶개의 파아지를 통상법에 따라 플레이트에 뿌리고, 출현된 플라그를 나일론 필터 Hybond N+(영국, Amersham사 제품)에 전사하였다. 전사된 나일론 필터를, 알칼리 버퍼(1.5 M NaCl/0.5 M NaOH)을 스며들게 한 여과지상에 5 분 간 방치하고 알칼리 처리를 행하고, 중화 버퍼(1.5 M NaCl/0.5 M Tris-HCl, pH 7.5)을 스며들게 한 여과지상에 알칼리 처리를 행한 나일론 필터를 5 분 간 방치하여 중화 처리를 행하였다. 또, 중화 처리는 2회 반복하였다. 중화 처리 후의 필터에 대하여 2×SSC 용액(1×SSC 용액은, 0.15 M NaCl/15 mM 시트르산, pH 7.0) 속에서 5 분 간의 진탕 세정을 2번 행한 후, 통풍건조하였다. 그 후, UV 크로스 링커 CL-1000형(일본국, 후나고시사 제품)를 이용하고, 이 필터에 자외선을 1,200×160μJ/㎠로 조사하여 DNA를 고정하였다.

이어서, 실시예 1에서 얻어진 수용체 유전자 단편을 방사성 동위 원소³²P로 표지한 프로브를 제작하였다. 수용체 유전자 단편이 삽입된 pCR 2.1 벡터를 EcoRI로 소화하고, 얻어진 EcoRI 단편(약 700 bp)을 0.8 % 아가로스·겔로 전기 영동하여 분리한 후, 겔로부터 추출하여 GENECLEAN II 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 EcoRI 단편을, 메가프라임 DNA 표지 장치(Megaprime DNA labeling System)(코드 RPN1607)(영국, Amersham사 제품)를 이용하고, 그 프로토콜에 따라 α-³²P-dCTP(코드 AA O005)(영국, Amersham사 제품)로 표지하였다. 이어서 Quick Spin(등록상표명) Column Sephadex(등록상표명) G-50(독일국, 베링거 맨하임사 제품)로 표지한 DNA를 정제하여, 5 분 간의 비등 수용 후, 2 분 간 빙냉하여 프로브로 하였다.

DNA를 고정한 필터에 대하여³²P로 표지한 수용체 유전자 단편 프로브에 의한 하이브리다이제이션을 행하였다. 상기한 DNA 고정필터를, 6×SSC 용액, 5×덴할트액, 0.5 % SDS(소듐 도데실 술페이트) 및 100 ㎍/㎖ 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션액 중에 침지하고, 65 ℃에서 2 시간 진탕한 후, 상기한³²P 표지된 프로브를 하이브리다이제이션액에 첨가하고 65 ℃에서 16 시간 진탕하여 하이브리다이제이션을 행하였다.

이어서, 필터를 0.1 % SDS를 포함하는 2×SSC 용액에 침지하여 실온에서 3회 세정하고, 다시 동일 용액을 이용하여 실온에서 15 분 간 세정 후, -85 ℃에서 오토라디오그래피를 행하였다. 오토라디오그래피에 있어서, 강하게 노광된 부분에 대응하는 파아지클론을 선택하였다. 이 파아지를 다시 뿌리고, 상기와 동일한 방법으로 스크리닝을 행하여, 완전히 단일한 클론을 분리하였다.

단리된 파아지클론 중 2 클론을 이용하여 신규한 7회 막관통형 수용체의 전체 길이 유전자의 염기 서열을 결정하였다. 통상법에 따라, 이들 2 클론의 파아지를 각각 약 10⁹pfu(plque forming unit, 플라그 형성 단위)로 조제하고, Wizard(등록상표명) Lambda Preps(미국, Promega사 제품)를 이용하여 파아지 DNA를 정제 후, EcoRI로 소화하여 DNA 단편을 얻었다. 마찬가지로 EcoRI로 소화한 플라스미드 pBluescript II KS(+)(미국, Stratagene사 제품)를 조제하고, 파아지 DNA의 EcoRI단편을 거기에 조립하였다. DNA를 조립한 클론의 염기 서열을 형광 시퀀스에 의해 해석하여, 신규한 7회 막관통형 수용체의 전체 길이 유전자, 즉, 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열을 결정하였다. 이 신규한 7회 막관통형 수용체를 본 발명자들은 C5L2라 명명하였다. 서열 번호 3 중에서 C5L2 단백질을 코드하고 있는 부분의 염기 서열만을 서열 번호 1에 기재하였다. 또한, 이 C5L2 단백질을 코드하고 있는 DNA를 포함하는 플라스미드를 pBSC5L2라 명명하였다.

<실시예 3>

노던 블로팅에 의한 해석

실시예 2에서 유전자의 전체 길이 염기 서열이 얻어진 인간 7회 막관통형 수용체 C5L2의 각 장기에서의 mRNA의 발현을 노던 블로팅으로 해석하였다. 각 장기의 RNA를 고정한 필터로서, 다조직 노던 블롯 (Multiple Tissue Northern (MTN) Blots) 필터(Cat. #7757-1, #7759-1, #7760-1및 # 7767-1)(미국, CLONTECH사 제품)를 이용하였다. 프로브로서는, C5L2 유전자의 3' 말단측의 NaeI-EcoRI 단편을 실시예 2와 같은 방법으로³²P 표지한 것을 이용하였다. 상기한 필터를 5×SSPE 용액(1×SSPE 용액은, 0.15 M NaCl/10 mM NaH₂PO₄/1 mM EDTA, pH 7.4), 10×덴할트액, 2 % SDS, 50 % 포름아미드, 및 100 ㎍/㎖ 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션액 중에 침지하고, 50 ℃에서 2 시간 진탕하였다. 이어서 프로브를 하이브리다이제이션액에 첨가하고, 50 ℃에서 16 시간 진탕하여 하이브리다이제이션을 행하였다.

필터의 세정은, 0.1 % SDS를 포함하는 0.1×SSC 용액 중에서, 50 ℃, 20분간을 2회, 60 ℃, 20 분 간을 1회 행하였다. 세정 후의 필터에 대하여 -85 ℃에서 오토라디오그래피를 행하였다. 그 결과, 말초혈 백혈구 및 비장에 있어서, C5L2에 상당하는 약 2.4 kb의 매우 강한 밴드가 검출되었다. 또 골수, 임파절, 척수, 신장, 간장, 폐, 태반 및 심장에서도 약한 밴드가 확인되었다. 약간 사이즈가 큰 밴드가 말초혈 백혈구, 비장 및 정소에서 확인되었다. 뇌, 골격근, 췌장, 흉선, 전립선, 위, 갑상선, 기관, 부신, 태아뇌, 태아폐, 태아간 및 태아 신장에서는 어떤 밴드도 검출되지 않았다.

미성숙 나무상 세포에서도 약 2.4 kb의 밴드가 검출되었지만, 성숙한 나무상 세포에서는 이 밴드는 검출되지 않았다. 이것으로부터, C5L2의 발현은 나무상 세포의 성숙에 따라 소실된다는 것이 나타났다.

<실시예 4>

7회 막관통형 수용체 C5L2 발현 벡터의 제작

실시예 2에서 단리한 C5L2 전체 길이 유전자를 포함하는 플라스미드클론(pBSC5L2)을 주형으로 하여 C5L2 유전자의 PCR를 행하였다. PCR에는 고성능 Taq 폴리머라아제(독일, 베링거 맨하임사 제품)를 이용하였다. 5 ng/㎕의 pBSC5L2 용액 1 ㎕에 Taq 폴리머라아제 0.5 ㎕, 폴리머라아제에 첨부된 10×버퍼 5 ㎕ 및 2.5 mM dNTP 혼합물(일본국, 다까라주조사 제품) 4 ㎕을 첨가하고, 다시 프라이머로서 서열 번호 7에 나타낸 올리고뉴클레오티드(서열 번호 1의 1 내지 22 번째의 염기 서열의 5'말단에 스페이서 서열 GGGG와 제한 효소 Hind III의 인식서열 AAGCTT를 첨가한 것)과 서열 번호 8에 나타낸 올리고뉴클레오티드(서열 번호 4의 206 내지 225번째의 염기 서열의 5' 말단에 스페이서 서열 GGGA와 제한 효소 Sac II의 인식 서열 CCGCGG를 첨가한 것)을 20 pmol첨가하고, 멸균수를 첨가하여 최종 용량을 50 ㎕로 하였다.

이 혼합물을, TaKaRa PCR Thermal Cycler 480을 이용하여, 96 ℃ 1 분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 2분의 사이클을 20 사이클 행한 후, 72 ℃ 7분의 반응을 행하였다. 얻어진 PCR 산물의 일부를 0.8 % 아가로스·겔을 이용한 전기 영동에 걸어 약 1,150 bp의 cDNA가 증폭되어 있다는 것을 확인하였다. 통상법에 따라, PCR 산물을 페놀/클로로포름 추출하고, 다시 에탄올 침전시켜, 침전물인 DNA를 회수하였다. 회수한 DNA를 멸균수에 용해하여 DNA 용액을 얻었다. 이어서, 얻어진 DNA 용액을 Hind Ⅲ, Sac Ⅱ로 순차 처리하여, 0.8 % 아가로스 겔상으로 분리 후, Hind Ⅲ-Sac Ⅱ 단편을 겔로부터 추출하여 GENECLEAN Ⅱ 키트를 이용하여 정제하였다. pcDNA 3.1/Myc-His(+)B도 상기와 마찬가지로 같이 Hind Ⅲ, Sac Ⅱ로 소화후 정제하였다. C5L2의 Hind Ⅲ-Sac Ⅱ 단편을 pcDNA 3.1/Myc-His(+) B의 Hind Ⅲ-Sac Ⅱ 단편 추출하여 부위에 삽입하고, DNA 라이게이션 키트 Ver.2(일본국, 다까라주조사 제품)를 이용, 연결하여 C5L2 재조합 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플러스미드로 대장균 DH5 컨피텐트 셀(일본국, 다까라주조사 제품)을 형질 전환하였다. 암피실린 내성을 지표로 하여 형질 전환체(즉, 클론)을 회수하고, Wizard(등록상표명) Minipreps(미국, Promega사 제품)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ과 Sac Ⅱ로 소화하여 약1,150 bp의 DNA가 추출됨으로써, C5L2 유전자가 벡터에 삽입되어 있다는 것을 확인하였다. C5L2 유전자를 조립한 재조합체 DNA를 pcDNA C5L2라 명명하였다.

또, pcDNA C5L2를 대장균 DH5에 도입한 균주E. coliDH5-pcDNA C5L2는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소에 1998년 9월 1일에 기탁하였다(기탁번호: FERM BP-6833).

<실시예 5>

발현 벡터에 의한 세포의 형질 전환과 그 발현

실시예 4에서 제작한 pcDNA C5L2로 293세포(다이닛본 세이야꾸사로부터 입수 가능, ATCC 번호 CRL-1573)를 형질 전환(트랜스팩트)하였다. 293세포의 배양에는, 1.0 %, 말 혈청(Cat.No.2921149)(미국, ICN Biomedicals사 제품)와 1 용량%의 페니실린-스트렙토마이신 용액(Cat. No. 16-70D-49DN)(일본국, 다이닛뽄 세이야꾸사 제품)를 포함하는 MEM 아아르 액체 배지(MEM with Earles Salts; Cat. No. 12-102-54CN)(일본국, 다이닛뽄 세이야꾸사 제품)를 이용하여 37 ℃, 5 % 이산화 탄소, 습도 100 % 환경하에서 배양하였다.

형질 전환에는, 인산 칼슘 트랜스팩션 키트(Cat. No. IV2780-1)(미국, Invitrogen사)를 이용하고, 프로토콜에 따라 인산 칼슘 공침법에 의해 행하였다. 또한, 컨트롤로서 pcDNA 3.1/Myc-His(+)B 벡터에서도 형질 전환을 행하였다. 재조합체 DNA(또는 벡터만)은, 35 mm 플레이트당 5 ㎍을 사용하였다.

상기한 형질 전환체의 막 획분을 이하와 같이 조제하였다. 형질 전환체(pcDNA C5L2형질 전환체와 컨트롤)을 48 내지 72 시간 배양하고, PBS로 세포를 세정한 후, 1 ㎖/플레이트의 EDTA(최종 농도 0.01 %)를 포함하는 PBS를 배양 세포에 첨가하였다. Cell Scraper-L(Cat. No. MS-93300)(일본국, 스미토모 베이크라이트사 제품)를 이용하여 세포를 플레이트로부터 박리하였다. 플레이트로부터 박리한 세포를 PBS로 2 회 세정 후, 컴플리트(등록상표명)(프로테아제 인히비터 칵테르정)(독일, 베링거 맨하임사 제품)의 25 mM HEPES(pH 7.4) 용액 0.5 ㎖로 현탁하여 마이크로 튜브에 옮겼다. 26 G 주사 바늘을 부착한 실린지로 세포 현탁액을 균질화시킨 후, 마이크로 튜브용 원심기(MRX-150형)(일본국, 도미 세이꼬사 제품)로 4 ℃, 3,000 rpm에서 5분간 원심하였다. 원심 분리에 의해서 얻어진 상청을 회수하고, 회수한 상청을 다시 15,000 rpm에서 15 분 간 원심하여 침전물을 회수하였다. 이 침전물을, HMS 액(50 mM HEPES, pH 7.4/5 mM MgCl₂/150 mM NaCl)으로 2회 세정 후, 100 ㎕의 HMS 액에 현탁하였다. 이 현탁액을 막 획분 조제액으로 하였다.

이어서, 얻어진 막 획분 조제액을 이용하고, 웨스턴 블로팅법으로 7회 막관통형 수용체 C5L2 단백질의 발현을 확인하였다. 구체적으로는, 막 획분에 2-머캅토에탄올을 첨가하고, 5분간의 비등 수욕 가열에 의한 환원 처리를 행한 후, 5 내지 15 %의 글라디엔트 겔을 이용하여 SDS-PAGE(SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)을 행하였다. 분자량 마커는, 무지개 마커(고분자 레인지)(영국, Amersham사 제품)를 이용하였다. SDS-PAGE 종료후, 아크릴아미드 겔 중의 단백질을 이뮨-블로트 PVDF 멤브레인(이뮤노블로트용)(미국, Bio-Rad Laboratories사 제품)에 미니 트랜스 블로트셀(미국, Bio-Rad Laboratories사 제품)를 이용하여 전사하였다. 단백질을 전사한 필터를 블럭에이스(일본국, 다이닛뽄 세이야꾸사 제품)액에 침지하고, 4 ℃에서 하룻밤 진탕하여 블로킹하였다. TBS-T(20 mM Tris-HCl, pH 7.6/137 mM NaCl/0.1 % Tween 20)으로 필터를 세정 후, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템(영국, Amersham사 제품)를 이용하여, 프로토콜에 따라 웨스턴 블로팅을 행하였다. 일차 항체로서는 실시예 9에서 작성한 항 C5L2 항혈청을 이용하고, 이차항체로서는 퍼옥시다아제 표지 항토끼 I g 로바 항체(영국, Amersham사 제품)를 이용하여 각각 실온에서 한시간 반응시켰다. 각 항체와의 반응 후의 필터에 대하여 TBS-T를 이용하여 실온에서 10 분 간의 진탕 세정을 3회 행하였다. 세정 후의 필터를 ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템의 반응액에 5 분 간 침지하고, 그 후 X선 필름에 감광시켰다. 그 결과, pcDNA C5L2를 도입한 세포의 막 획분에서는, 약 38 내지 42 kD의 밴드가 검출되었지만, pcDNA 3.1/MyC-His(+)B 벡터만을 도입한 세포의 막 획분에서는 밴드가 검출되지 않았다.

<실시예 6>

리간드의 스크리닝

pcDNA C5L2을 도입한 293 세포와 컨트롤로서 pcDNA 3.1/Myc-His(+)B 벡터를 유전자 도입한 293세포로부터, 실시예 5와 같은 방법으로 각각의 막 획분을 조제하였다. 리간드 후보 화합물로서는, GPCR의 하나인 A_2A수용체의 특이적 아고니스트로서 알려져 있는 CGS21680을 이용하였다. 막 획분 조제액 50 ㎕에, 방사성 표지된CGS21680(카탈로그 번호 NET-1021)(미국, DuPont NEN사 제품)를 50 ㎕(최종 농도 100 nM)과, PBS 50 ㎕를 첨가하여 전량을 150 ㎕로 하여 혼합함으로써 후보 화합물을 C5L2 단백질과 접촉시켜 37 ℃에서 30 분 간 보온하였다. 보온 후의 혼합액을 마이크로 튜브용 원심기로 실온, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리함으로써, C5L2 단백질과 결합하지 않은 후보 화합물을 분리하였다. 미결합된 후보 화합물을 포함하는 상청을 1 ㎕ 덜어, 10 ㎖의 액체 신틸레이터용 칵테일 ECONOFLUOR-2(미국, DuPont NEN사 제품)에 첨가하여 혼합한 후, Beckman LS600OLL형 신틸레이션 카운터(미국, Beckman사 제품)를 이용하고 방사 활성을 카운트하여 미결합된 후보 화합물량을 측정하였다.

그 결과, C5L2 형질 전환 세포와 컨트롤로서 이용한 세포와의 사이에서 방사활성에 차이는 나타나지 않았다.

<실시예 7>

리간드의 스크리닝

실시예 4에서 제작한 pcDNA C5L2를 CHO 세포(다이닛뽄 세이야꾸사에서 입수가능, ATCC 번호 CCL-61)에 유전자 도입하였다. CHO 세포의 배양은 10 %의 FBS(Cat. No. 10099-141)(미국, GIBCO BRL(등록상표명)), 1 용량%의 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 F-12 영양소 혼합물(Ham's F-12)(Cat. No. 11765-047)(미국, GIBCO BRL(등록상표명))을 이용하여 37 ℃, 5 % 이산화 탄소 환경하에서 행하였다. 유전자 도입은, 인산 칼슘 트랜스팩션 키트를 이용한 첨부된 프로토콜에 따라 인산 칼슘 공침법으로 행하였다. DNA는 35 mm 플레이트당 5 ㎍ 사용하였다.

유전자 도입 후의 세포는, 400 ㎍/㎖ 제네티신(Cat. No. 11811-023)(미국, GIBCO BRL(등록상표명))를 포함하는 배지에 여러가지의 세포 농도로 바꾸어 심었다. 2주간정도 배양하여 증식된 세포를 C5L2 발현 세포로 하였다.

상기한 C5L2 발현 CHO 세포를 이용하여, 화학 유주의 측정을 행하였다. 리간드 후보 물질을 포함하는 샘플 재료로서는, 이하와 같이 조제한 LPS(리포폴리사카라이드) 투여 쥐혈청을 이용하였다. 살모넬라 미네소타 Re595 유래 LPS(미국, SIGMA(등록상표명))을 최종 농도 1 mg/㎖가 되도록 생리 식염수에 현탁하여, 소니케이터(일본국, Branson사 제품)로 소니케이터하여 투명한 액으로 하였다. 이것을 생리 식염수로 10 배로 희석하고, 400 ㎕를 7 주령의 Wistar 쥐 ((주)닛뽄 세이부쯔 자이료로부터 구입)의 꼬리 정맥부터 투여하였다. 투여 후 약 22 시간 후의 쥐를 에테르 마취하여 개복하고, 심장에서 채혈하였다. 얻어진 혈액을 마이크로 튜브용 원심기로 4 ℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심하고, 그 상청을 리간드 후보 물질을 포함하는 샘플 재료로 하였다.

96혈 마이크로플레이트 챔버(카타로그 번호 FE-2292-96)(일본국, 후나고시사 제품)에 96혈 마이크로플레이트(카타로그 번호 FE-2300-02)(일본국, 후나고시사 제품) 및 15 ㎍/㎖ 피브로넥틴(미국, SIGMA(등록상표명))을 포함하는 PBS로 처리한 프레임 필터(포어사이즈: 8 ㎛)(카타로그 번호 FE-2340-08)(일본국, 후나고시사 제품)를 설치하였다. 하실에는, 샘플 재료를 0.15 % BSA(소 혈청 알부민)을 포함하는 RPMI1640 배지(Cat. No. 22400-071)(미국, GIBCO BRL(등록상표명))에 10 배로 희석하여 첨가하였다. 상실에는, 0.15 % BSA를 포함하는 RPMI1640배지에 현탁한C5L2 단백질 발현 CHO 세포를 첨가하고, 5 % 이산화 탄소, 37 ℃에서 5 시간 보온하여 샘플 재료를 C5L2 단백질에 접촉시켰다. 그 후, 필터를 고정 및 염색하여 현미경하에 관찰하였다. 그 결과, 화학 유주하고 있는 세포가 관찰되어 LPS 투여 쥐혈청에는 리간드 후보 화합물이 포함된다는 것이 밝혀졌다.

<실시예 8>

리간드와 길항하는 물질의 스크리닝

C5L2 유전자로 형질 전환한 CHO 세포를 이용하여 세포 증식 시험을 행하였다. 처음에, 실시예 7과 마찬가지로(즉, 실시예 7에서 제작한 C5L2 단백질을 발현하는 형질 전환 CHO 세포에 LPS 투여 쥐혈청을 첨가하여) 화학 유주하고 있는 세포를 관찰하였다. 이어서, 상실 및 하실의 배지에, 리간드와 길항하는 물질의 후보로서, GPCR의 안티아고니스트의 하나인 NECA[5'-(N-에틸카르복시아미드)아데노신](미국, SlGMA(등록상표명)을 최종 농도 100 μM이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 화학 유주하고 있는 세포를 관찰하였다. 리간드와 길항하는 물질의 후보의 비존재하에서의 화학 유주와, 리간드와 길항하는 물질의 후보 존재하에서의 화학 유주를 비교했더니, 양자의 차이는 발견할 수 없었다.

<실시예 9>

C5L2 단백질을 인식하는 항체의 작성

서열 번호 2의 아미노산 서열 중의 6 내지 32번째의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 합성하였다. 그 때, 캐리어 단백질과의 결합 반응을 높이기 위하여 N 말단에 시스테인 잔기를 도입하였다. 이어서, KLH 및 OVA를 이용한 임젝트 활성화면역원 콘쥬게이션 키트(Cat. No. 77108)(미국, PIERCE사 제품)를 이용하여 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌)과 OVA(오발부민)와 합성 펩티드를 콘쥬게이트하여 면역원으로 하였다. 얻어진 면역원을 토끼에게 면역하고, 항체가의 측정 후에 전체혈을 채혈하고 혈청을 채취하였다. 채취한 혈청으로부터, 애코노팩 혈청 IgG 정제 키트(미국, Bio-Rad Laboratories사 제품)를 이용하고, 첨부된 취급 설명서에 따라 항인간 C5L2 단백질 토끼 폴리클로날 항체를 정제하였다.

또한, 서열 번호 2의 아미노산 서열 중의 1 내지 23번째의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 합성하고, 상기와 같이 하여 토끼를 면역하고, 그 혈청을 채취하였다. 혈청으로부터 항체 단백질을 황산 암모늄 침전에 의해 조정제하고, 투석에 의해 PBS로 버퍼 교환하였다. 항원 펩티드를 첨부된 메뉴얼에 따라 고정한 AF-트레실 TOYOPEARL 겔(일본국, 도소 가부시끼가이샤 제품) 칼럼에, 정제 항혈청의 일부를 통해서 항원 펩티드에 항체 단백질을 결합시키고, 1.0 M 글리신 염산 버퍼(pH 2.5)로 칼럼으로부터 이뮤노글로블린을 용출하였다. 이뮤노글로블린 용액을 투석에 의해 PBS로 버퍼 교환하였다. 이 용액에는 결합성이 높은 항C5L2 이뮤노글로블린이 포함되고 있고, 이것을 친화성 정제 항C5L2 항 혈청 용액으로 하였다. 이 친화성 정제 항C5L2 항 혈청 용액 중의 단백질 0.3 mg에 대하여, EZ-Link(cat. No. 21338)(미국, PIERCE사 제품)를 첨부된 메뉴얼에 따라 반응시켜 이뮤노글로블린의 비오틴화를 행하였다.

<실시예 10>

나무상 세포에 의한 C5L2 단백질 발현된 플로우 사이토미터에 의한 검출

건강한 보통 사람으로부터 말초혈을 채취하고, 피콜로 단핵 세포층을 회수하였다. 얻어진 단핵 세포를 다시 배양 샬레(FALCON(등록상표명)) 속에서 배양하고, 그 후 부착 세포를 회수하였다. 이 부착 단핵 세포를 37 ℃, 5 % 탄산 가스 분위기하에 배양하였다. 다시, 미성숙 나무상 세포를 얻는 경우는 7 일 간, 성숙 나무상 세포를 얻는 경우는 11 일 간 배양하여 단핵 세포를 분화시켰다. 배지에는, 10 % FBS(미국, Intergen사 제품)와 1×항생 물질-항진균제를 포함하는 RPMI 1640배지를 이용하고, 배양 개시 후 7 일 간은 다시 자극 인자로서 인간 GM-CSF(최종농도 100 ng/㎖)과 인간 IL-4(최종 농도 50 ng/㎖)을 첨가한 배지를 사용하고, 7 일째 이후의 배양에는 다시 인간 TNF-α(최종 농도 10 ng/㎖)을 첨가한 배지를 사용하여 건강한 보통 사람의 말초혈로부터 나무상 세포를 조제하였다.

상기한 배양 방법에 의해서 얻어진 나무상 세포에 대하여 세포 표면에 발현된 C5L2 단백질을 플로우사이토미터를 이용하여 검출하였다. 나무상 세포의 표지는 이하와 같이 행하였다. 세포를 마우스 정상 혈청(덴마크, DAKO사 제품)를 포함하는 PBS에 현탁하고, 일차 표지로서 비오틴화 표지한 항C5L2항 혈청을 첨가하고 4 ℃에서 30 분 간 반응시켰다. 네가티브 컨트롤에는, 일차 표지로서 비오틴화 표지한 토끼 IgG 항체를 이용하였다. 일차 표지한 세포를 PBS로 2 회 세정하였다. 이어서, 이차 표지로서 FITC 표지 아비딘(미국, Beckton-Dickinson사 제품)를 세정 후의 세포에 첨가하여 4 ℃에서 30 분 간 반응시켰다. 그 후, 세포를 세정하여 표지 세포를 얻고, FACS 칼리버(미국, Beckton Dickinson사 제품)으로 형광 강도를 측정하였다.

도 1에, 나무상 세포의 세포 표면에 발현하고 있는 C5L2를 FACS에서 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과, C5L2는 미성숙 나무상 세포에서 발현이 높고, 성숙 나무상 세포에서는 그것에 비교하여 발현이 낮았다. 이것으로부터, 본 발명의 신규한 7회 막관통형 수용체 C5L2는, 미성숙 나무상 세포에는 발현되어 있지만, 성숙 나무상 세포에서는 발현이 감소한다는 것이 나타났다.

<실시예 11>

만성 관절 류마티즘(RA) 환자의 말초혈에서의 C5L2 유전자의 발현

(1) 말초혈 단핵구 및 과립구의 조제

말초혈 혈액 세포의 분화는 다음과 같이 행하였다. 최종 농도 20 U/㎖이 되도록 헤파린을 첨가한 인간 말초혈 10 ㎖을, RPMI 1640의 무혈청 배지(이하, 단순히 "RPMI-0"이라 칭한다)에 3배로 희석하였다. 미리 피콜-플라그(Ficoll-Paque)(스웨덴, Pharmacia Biotech사 제품)를 10 ㎖ 넣어 둔 50 ㎖ 용량의 원심관에 희석한 말초혈을 중층하고, 원심기의 브레이크를 해제한 형태에서, 20 ℃, 400×g에서 40 분 간 원심하였다. 말초혈 단핵구(PBMC)는 상층과 피콜층의 경계선에 밴드를 형성하고, 과립구는 적혈구와 함께 원심관의 바닥에 침전하였다. PBMC 층을 파스퇴르 피펫으로 회수한 후, 상층과 피콜층을 흡인 제거하여 침전된 적혈구와 과립구를 얻었다. 회수한 PBMC 층을 RPMI-0으로 2배 이상으로 희석하고, 4 ℃, 250×g에서 5분간 원심하여 세포를 모아 이것을 PBMC 획분으로 하였다. 적혈구와 과립구를 포함하는 획분에 대해서는, RPMI-0을 첨가하여 전체 내용량을 10 ㎖으로 하였다. 여기에 0.9 % NaCl로 조제한 3 %의 덱스트란 T-500 용액 10 ㎖(실온)을 첨가하여잘 혼화하고, 실온에서 30 분 정도 정치하여 적혈구를 침전시켰다. 과립구를 포함하는 상층을 회수하고 4 ℃, 250×g에서 8분간 원심한 후 상청을 버렸다. 잔류하는 용액으로 세포 펠렛을 잘 푼 후, 냉각된 0.2 % NaCl 용액을 7 ㎖ 첨가하고 잘 혼화하여 용혈시켰다. 30 초 후, 냉각된 1.6 % NaCl 용액을 7 ㎖ 첨가하여 혼화하고 등장으로 복귀한 후, 4 ℃, 250×g에서 8분간 원심하여 세포를 모았다. 얻어진 세포를 과립구 획분으로 하였다.

PBMC와 과립구의 순도는, 각각 플로우사이토미터로 검정하였다. 세포 염색은, 우선 5 내지 10×10⁴개의 세포를 1.5 ㎖ 용량의 튜브에 덜고, 1 % BSA/PBS에 현탁하여 원심하였다. 침전된 세포 획분에, 1 % BSA/PBS에서 20 배로 희석한 형광표지 항체를 첨가하고, 4 ℃에서 30 분 간 반응시켰다. 형광 표지 항체에는, T 세포 검출용으로 FITC 표지 항인간 CD3 항체(클론: HIT3a; Cat. No. 30114X)(Pharmingen사 제품), B 세포 검출용으로 PE(파이코에리트린) 표지 항인간 CD19 항체(클론: HIB19, Cat. No. 30655X)(Pharmingen사 제품), PBMC 검출용으로 FITC 표지 항인간 CD14 항체(클론: M5E2, Cat. No. 30544X)(Pharmingen사 제품), 과립구 검출용으로 FITC 표지 항CD66b 항체(클론: G10F5; Cat. No. 33734X)(Pharmingen사 제품)를 각각 반응시켜 세포를 표지하였다. 반응 후, 세포를 1 % BSA/PBS로 세정하여, 30 ㎛의 나일론 메쉬에 통과시켜 FACS 칼리버로 형광 강도를 측정함으로써 순도를 검정하였다.

(2) RNA의 조제

상기한 바와 같이 하여 조제한 PBMC와 과립구로부터, 다음과 같은 방법으로 RNA를 추출하였다. 5 내지 10×10⁶개의 세포를 1.5 ㎖ 용량의 튜브에 덜고, PBS(-) 0.5 ㎖로 2회 세정하였다. 세정 후는 가능한 한 PBS(-)를 제거하고, 4M GITC 용액(4M 구아니딘 이소티오시아네이트/25 mM 소듐 시트레이트, pH7/0.5 % 소듐 N-라우로일사르코시네이트) 400 ㎕와 2-머캅토에탄올 2 ㎕을 첨가하여 실온에서 10 분 간 교반하였다. 20 G의 주사 바늘을 부착한 1 ㎖의 실린지를 이용하여 세포가 용해된 GITC 용액 중의 게놈 DNA를 전단하였다. 이어서, 40 ㎕의 2 M 아세트산나트륨(pH 4.2), 440 ㎕의 수포화 페놀, 120 ㎕의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 순차 첨가하여, 각 시약 첨가 후에 잘 혼화하고, 얼음 속에 5 분 간 방치하였다. 마이크로 튜브용 원심기로 혼합물을 4 ℃, 14,000 rpm에서 20 분 간 원심한 후, 상층을 300 ㎕정도 덜어 새로운 튜브에 옮겼다. 새로운 튜브에 동 용량의 2-프로판올을 첨가하여 상층액과 혼화한 후, -80 ℃에 30 내지 60 분 간 방치하였다. 튜브를 추출하여 얼음 중에서 샘플을 녹인 후, 마이크로 튜브용 원심기로 4 ℃, 14,000 rpm에서 30 분 간 원심하였다. 상청을 버리고, 70 % 에탄올로 침전물을 3회 세정한 후, 침전물로서 얻어진 RNA의 펠렛을 통풍건조하였다. 10 내지 20 ㎕의 멸균수를 RNA의 펠렛에 첨가하고, 65 ℃의 온욕조에서 1 내지 2 분 간 가온하여 RNA를 용해하였다. 얻어진 RNA 용액을 DNase 1(증폭 등급)(Cat. No. 18068-015)(미국, GIBC0 BRL(등록상표명))으로 처리하여 게놈 DNA를 분해하였다. 다시, 페놀/클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하여 RNA를 정제하고, 얻어진 RNA의 침전물을 멸균수에 용해하여 RNA로 하였다.

(3) RT-PCR 법

상기한 바와 같이 하여 조제한 RNA 1 내지 5 ㎍를, SUPERSCRIPT(등록상표명) Ⅱ RNase H-Reverse Transcriptase(Cat. No. 18064-014)(미국, GIBCO BRL(등록상표명))의 프로토콜에 따라 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성하였다. mRNA의 발현량은 컨트롤인 G3PDH 유전자의 발현량에 대한 발현율로서 구하였기 때문에, C5L2 유전자와 G3PDH 유전자를 PCR로 증폭하였다.

PCR은 GeneAmp(등록상표명) PCR 코어 시약(미국, PERKINELMER사 제품)를 이용하고 첨부된 프로토콜에 따라 행하였다. RNA 15 ng 분에 상당하는 cDNA 용액 21.3 ㎕에 1O×PCR 버퍼를 3 ㎕, 25 mM MgCl₂를 2.4 ㎕, 10 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 0.6 ㎕씩, 20μM의 5'프라이머와 3'프라이머를 0.3 ㎕씩 첨가하고, 다시 TaqStart(등록상표명) 항체(미국, CLONTECH사 제품)를 0.15 ㎕, AmpliTaq(등록상표명) DNA 폴리머라제를 0.15 ㎕ 첨가하여 혼합하였다. C5L2 유전자의 증폭에는 서열 번호 9와 10에 기재된 프라이머를, G3PDH 유전자의 증폭에는 서열 번호 11과 12의 프라이머를 각각 사용하였다. TaKaRa PCR Thermal Cycler 480을 사용하여, 94 ℃, 2 분의 변성 스텝 후, 94 ℃, 45 초, 60 ℃, 45초, 72 ℃, 2 분을 1 사이클로 하여 30 사이클의 증폭 반응을 행하였다. 최종 사이클 후에 72 ℃, 7 분의 신장 반응을 행하고, 그 후 4 ℃까지 냉각하여 반응을 종료시켰다. 반응액 10 ㎕를, 2 % 아가로스겔을 이용하여 전기 영동한 후, 겔 프린트 2000i/VGA(미국, Bio Image사 제품)를 이용하여 전기 영동 화상을 컴퓨터에 입력하였다. 화상 해석 소프트 Basic Quantifier(일본국, 일본 바이오이미지 리미티드사)로 각 유전자의 PCR 산물량을 수치화하여 동일 샘플 중의 G3PDH 유전자의 PCR 산물량을 100 %로 한 상대값으로 C5L2 유전자의 PCR 산물량을 나타냈다. PCR는 2회 행하고, 그 평균값을 해석에 이용하였다.

(4) 건강한 보통 사람의 해석

상기한 (1) 내지 (3)의 방법을 이용하여 건강한 보통 사람의 민간 지원자 8예로부터 조제한 PBMC 및 과립구에서의 C5L2 유전자의 발현율을 조사하였다. 플로우 사이토미터에 의한 세포 순도 검정에서는, 과립구 획분의 CD66b 양성 세포의 비율은, 세포 획분 중의 전체 세포수에 대하여 90.5±3.2 %(평균±S.E.)이고, PBMC 획분에서의 CD66b 양성 세포의 비율은 4.1±0.9 %였다. 과립구에서의 C5L2 유전자의 발현율은 73.4±17.8 %, PBMC에서의 C5L2 유전자의 발현율은 0.5±0.5 %였다. 이 결과로부터, C5L2 유전자가 주로 과립구로 발현되어 있다는 것이 판명되었다(p≤O.01). 결과를 표 1에 나타냈다.

건강한 보통 사람의 말초혈 유래 단핵구(PBMC) 획분 및 과립구 획분에 있어서의 C5L2 유전자의 발현율

	PBMC 획분	과립구 획분
C5L2 유전자 발현률a)	0.5±0.5	73.4±17.8
CD66b 양성률b)	4.1±0.9	90.5±3.2

평균값±S.E.^a)% G3PDH^b)FACS 해석(%)

(5) 채혈 후의 C5L2 유전자 발현율의 경시 변화

이어서, 채혈 후의 C5L2 유전자 발현율의 경시 변화를 조사하였다. 건강한 보통 사람의 민간 지원자 8 예에서, 채혈 직후의 혈액(이하, 단순히 "신선혈"이라 한다)으로 조제한 과립구와, 채혈 후 하룻밤 방치한 혈액(이하, 단순히 "보존혈"이라 한다)으로 조제한 과립구로의, C5L2 유전자의 발현율을 비교하였다. 신선혈로 조제한 과립구의 C5L2 유전자의 발현율은, G3PDH 유전자의 발현율을 100 %로 한 상대값으로 나타내어 73.4±17.8 %, 보존혈로 조제한 과립구에서의 C5L2 유전자의 발현율은 10.8±3.1 %이고, C5L2 유전자의 발현율은 경시적으로 감소한다는 것이 밝혀졌다(p≤0.01). 결과를 표 3에 나타냈다.

또한, 건강한 보통 사람의 민간 지원자 3 예에 대하여 채혈 직후, 6 시간 후 및 24 시간 후에 말초혈로 조제한 과립구에 대하여 마찬가지로 C5L2 유전자의 발현율을 측정하였다. 그 결과, C5L2 유전자의 발현율의 평균값은, 채혈 직후에 71.7 %, 6 시간 후 31.1 %, 24 시간 후 10.6 %였다. 이것으로부터 채혈 후 6시간 동안에 C5L2 유전자의 발현율은 급격히 감소하는 것, 그 후 24 시간 후까지 감소를 계속하지만 그 변화는 처음의 6 시간과 비교하면 완만하다는 것을 알수 있었다. 결과를 도 2에 나타냈다.

(6) RA 환자의 해석

이어서, RA 환자 8예의 신선혈로부터 PBMC 획분 및 과립구 획분을 조제하여 C5L2 유전자의 발현율을 비교하였다. 그 결과, PBMC 획분에서는 거의 발현되지 않았고(O.O±0.0 %), 과립구 획분에서만 발현(44.7±4.7 %)이 인정되었다. RA 환자에 있어서도, 건강한 보통 사람과 마찬가지로 C5L2 유전자가 과립구 획분에서 많이 발현되어 있다는 것이 밝혀졌다(p≤0.01). 이 때의 CD66b 양성 세포의 비율은 PBMC 획분에서는 3.3±2.2 %, 과립구 획분에서는 80.9±5.8 %였다. 결과를 표 2에 나타냈다.

이어서, RA 환자 8예의 신선혈 및 12 예의 보존혈로 각각 조제한 과립구 획분에서의 C5L2 유전자의 발현을 해석하고, 건강한 보통 사람의 민간 지원자 8 예의 신선혈 및 보존혈에서의 해석 결과와 비교하였다. 그 결과, RA 환자의 신선혈로 조제한 과립구 획분에서의 C5L2 유전자 발현율은, G3PDH 유전자의 발현율을 100 %로 한 상대값으로 나타내어 44.7±4.7 %, RA 환자 보존혈로 조제한 과립구 획분에서의 C5L2 유전자 발현율은 42.8±6.9 % 이었다. RA 환자 유래의 과립구 획분에서의 C5L2 유전자의 발현율은, 건강한 보통 사람과는 달리 경시적으로는 감소하지 않아 발현율이 유지된다는 것이 밝혀졌다. 보존혈로 조제한 과립구 획분에서의 C5L2 유전자의 발현율은 건강한 보통 사람에서 10.8±3.1 %인데 반하여, RA 환자에서는 42.8±6.9 %이고, RA 환자 유래의 보존혈에서의 C5L2 유전자의 발현율은 건강한 보통 사람보다도 유의하게 높다는 것이 인정되었다(p≤O.001). 결과를 표 3에 나타냈다.

RA 환자 말초혈 유래 단핵구(PBMC)획분 및 과립구 획분에서의 C5L2 유전자의 발현율

	PBMC 획분	과립구 획분
C5L2 유전자 발현률a)	0.0±0.0	44.7±4.7
CD66b 양성률b)	3.3±2.2	80.9±5.8

평균값±S.E.^a)% G3PDH^b)FACS 해석(%)

건강한 보통 사람 및 RA 환자에 있어서의 말초혈 유래 과립구 획분 중에서의 C5L2 유전자 발현율의 보존에 의한 변화

	신선혈	보존혈
건강한 보통 사람 과립구 획분	73.4±17.8	10.8±3.1
RA 환자 과립구 획분	44.7±4.7	42.8±6.9

% G3PDH 평균값±S.E.

또한, RA 환자의 신선혈에서의 C5L2 유전자의 발현율과 류마토이드 인자의 발현율 사이에는, 유의한 플러스의 상관 관계가 인정되고(상관 계수 R=0.846, p≤0.01), C5L2 유전자의 발현율이 류마티즘의 진단에 유용하다는 것이 나타났다. 결과를 도 3에 나타냈다.

본 발명 인간 유래의 신규한 7회 막관통형 수용체 단백질 및 그것을 코드하는 DNA를 이용하면, 나무상 세포의 기능이 관여하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 물질의 스크리닝 또는 그와 같은 질환의 진단 방법 또는 진단약을 작성할 수가 있다. 또한, 본 발명의 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 염증성 질환의 진단 방법을 이용하면 빠르게 염증성 질환을 진단할 수가 있어 종래, 질환의 초기 단계에서의 진단이 곤란하던류마티즘 등의 조기 진단이 가능해진다.

Claims (22)

1. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 인간 유래의 7회 막관통형 수용체 단백질.
2. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 연속된 5개 이상의 아미노산으로 이루어지는 부분 서열인 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 펩티드.
3. 제1항에 기재된 7회 막관통형 수용체 단백질을 코드하는 단리된 DNA.
4. 제3항에 있어서, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 DNA.
5. 서열 번호 3에 기재된 DNA 중의 연속된 12개 이상의 염기로 이루어지는 DNA 단편 또는 그 유도체.
6. 서열 번호 4에 기재된 DNA 중의 연속된 12개 이상의 염기로 이루어지는 DNA 단편 또는 그 유도체.
7. 서열 번호 3에 기재된 DNA에 상보적인 RNA 중의 연속된 12개 이상의 염기로이루어지는 RNA 단편 또는 그 유도체.
8. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA.
9. 제8항에 기재된 복제 가능한 재조합체 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 배양 세포.
10. (a) 제3항 또는 제4항에 기재된 DNA를 복제 가능한 발현 벡터에 결합하여, 상기 DNA와 복제 가능한 발현 벡터를 조립한 복제 가능한 재조합체 DNA를 얻고,

    (b) 상기 복제 가능한 재조합체 DNA에 의해 미생물 또는 배양 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성시키고,

    (c) 상기 형질 전환체를 상기 미생물 또는 배양 세포의 모세포로부터 선별하고,

    (d) 상기 형질 전환체를 배양하여 상기 형질 전환체에 상기 DNA를 발현시키는 것을 포함하는 방법에 의해 상기 형질 전환체의 세포 표면에 제조된 7회 막관통형 수용체 단백질.
11. 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 스크리닝하는 방법 으로서, 제1항 또는 제10항에 기재된 단백질, 또는 제2항에 기재된 펩티드를 샘플재료와 접촉시키고, 상기 단백질 또는 상기 펩티드와 리간드의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로 하여, 7회 막관통형 수용체 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 검출하는 것을 포함하는 방법.
12. 7회 막관통형 수용체 단백질과 상기 단백질에 대한 리간드와의 결합을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서,

    제1항 또는 제10항에 기재된 단백질, 또는 제2항에 기재된 펩티드와 상기 리간드를 샘플 재료와 접촉시키고, 그리고 상기 단백질 또는 상기 펩티드와 상기 리간드와의 결합에 대응하여 일어나는 변화를 지표로 하여, 7회 막관통형 수용체 단백질과 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 물질을 검출하는 것을 포함하는 방법.
13. 제1항에 기재된 7회 막관통형 수용체 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
14. 염증성 질환의 진단 방법으로서, 인간 백혈구에 발현되어 있는 7회 막관통형 수용체 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하고, 상기 7회 막관통형 수용체 단백질이 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 진단 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 염증성 질환이 만성 관절 류마티즘인 것을 특징으로하는 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 인간 백혈구가 인간 과립구인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 인간 과립구가 인간 조직으로부터 채취한 과립구인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 인간 과립구가 진단을 행하기 6 시간 이상 전에 채취한 과립구인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제14항에 있어서, 상기 발현량의 측정을, 상기 단백질을 코드하는 mRNA의 정량에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 mRNA의 정량을, RT-PCR 법으로 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제14항에 있어서, 상기 발현량의 측정을, 상기 백혈구의 세포 표면에 존재하는 상기 단백질의 정량에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 단백질의 정량을, 상기 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.