KR20010080384A - 암 관련 항원 및 이의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 단리된 종양 관련 항원 및 생물학적 샘플 중에서 이러한 항원을 동정하는 방법 및 생물학적 표본 중에서 이러한 항원의 존재를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 동정된 종양 항원은 종양 관련 항원을 발현시키지만 증식능력이 없는 종양 세포와 시토카인을 포함하는 백신으로 처리된 피검자로부터의 혈청과 반응한다. 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다.

Description

암 관련 항원 및 이의 동정 방법 {CANCER-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS OF THEIR IDENTIFICATION}

면역계는 신생물의 병인론에서 중요한 역할을 한다. 이러한 질환에서의 면역계의 단점은 넓게는 유해한 표적에 대해 현저하게 강력한 반응을 발생시키지 못하는 것으로서 간주될 수 있다. 화학요법, 수술 및 방사선 요법을 포함하는 암에 대한 통상적인 의학적 치료법은 효율과 독성 둘 모두와 관련하여 명백한 한계를 지닌다. 원발성 및/또는 전이성암을 예방하는 것이 이상적이지만, 이러한 방법은 대체로 거의 성공을 거두고 있지 못하다. 따라서, 면역계를 자극하여 신생물 세포에 대한 성공적인 공격을 개시시키는 신규한 방법이 절실히 필요하다.

신생물의 존재는 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다.예를 들어, 흑색종 및 신장암 환자로부터의 혈액 및 종양 침윤물은 자가 흑색종(참조: Darrow et al. (1989)J. Immunol. 142:3329-35; Crowley et al. (1991)J. Immunol. 146:1692-9; Crowley et al. (1992)Cancer Res. 52:394) 및 신장 암종(참조: Belldegrun et al. (1988)Cancer Res. 42:206-214; Radrizzani et al. (1989)Cancer Immunol. Immunother. 28:671; Belldegrun et al. (1990)Cancer Immunol. Immunother. 31:1; Ikemoto et al. (1992)Cancer Immunol. Immunother. 34:289; Koo et al. (1991)J. Immunol. Ther. 10:347; Alexander et al. (1990)J. Cancer. 45:119)에 대해 특정한 반응성을 지니는 순환성 세포독성 전구체 세포를 함유한다. 이러한 세포성 반응은 종양 세포의 표면에 있는 종양 거부 항원의 존재에 기인할 수 있다 (참조: U.S. Patent No. 5,763,155). 그러나, 종양에 대한 혈청학적 반응은 입증에 어려움이 있어왔다.

이러한 무능력에 대해 수 가지 가설이 존재하는데, 예를 들어 종양 세포가 불량한 항원 제공 세포이고, 세포 표면상에서 MHC 분자가 적게 발현되거나 없으며, 서프레서 인자를 분비시킨다는 가설 또는 보조자극성 신호없이 종양 항원에 의해 T 세포 수용체(TCR)가 결합되면 아네르기를 유도시킨다는 가설이 있다. 면역계가 항체 반응을 유도시킬 수 없는 것은 또한 부분적으로 공통적인 표면 항원의 점유로 인해 면역계가 신생물 세포와 암세포가 아닌 정상 세포를 구별할 수 없는 것에 기인한다.

암에 대한 면역요법은 면역계가 종양을 인식하고 박멸시키도록 활성화되거나 조작될 수 있다는 전제를 기초로 한다. 종양 세포에 대한 전신성 면역 반응은 암에 걸린 동물 모델 및 몇몇 환자에서 종양 거부를 매개할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Joannides, et al. (1993)Immunol. 37:413-442; Urban et al. (1993)Ann. Rev. Immunol. 10:617-644; Van der Bruggen, et al. (1991)Science 254:1643-1647; Porgador, et al. (1994)Nat. Immunol. 13:113-130; and Pardoll (1993)Curr. Op. Immunol. 5:719-725).

면역계를 활성화시키는 방법은 백신을 사용하는 것을 포함해 왔다. 백신은 면역계가 항원을 외래로서 인식하여 이러한 항원을 함유하는 임의의 세포를 거부하거나 파괴시키도록 면역계에 항원을 전달하는 하나의 수단이다. 증식능력이 없는 동종이형 또는 자가 종양 세포가 백신으로서 사용되어 왔다. 예를 들어, 다가의 동종이형 흑색종 백신은 전이성 흑색종에 걸린 환자의 생존율을 개선시키는 것으로 보고되어 왔다 (참조: Sanda et al. (1994)J. Urol. 151:622-628). 또한, 동종이형 흑색종 종양 세포주로부터 유도된 백신은 단독으로 투여되는 경우 임상적으로 현저한 독성과 관련이 없었다 (참조: Dranoff et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)90:35-39). 그러나, 이러한 면역은 일시적이었다.

자가 암세포는 또한 항종양 면역을 증강시키기 위해 백신으로서 사용되어 왔다 (Oettgen et al. inBiologic Therapy of Cancer(1991), Devita et al., eds., 5 Lippincott Co., pp. 87-119). 이러한 백신은 이론적으로는 매우 강력해야 하는데, 이는 이들이 백신이 제조된 종양에 대해 고도로 특이적이기 때문이다. 그러나, 암세포의 면역원성은 일반적으로 너무 약해서 질병을 극복하기에 충분할 정도로 두드러진 면역 반응을 일으킬 수 없는데, 아마도 이는 상기 설명된 이론때문일것이다. 이러한 "미가공(raw)" 백신에 대한 환자 반응은 일반적으로 부분적일 뿐이고, 비교적 일시적이었다. 따라서, 신생물 세포의 면역계 인식 및 이에 대한 반응을 증가시키는 방법이 절실히 필요하다.

이러한 백신접종의 효능을 개선시키는 한 가지 방법은 BCG 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 비특이적 보조제 또는 면역자극제를 사용하는 것을 포함하였다. 그러나, 이는 거의 개선을 가져오지 않았다.

또 다른 방법은 주입시키려는 세포를 다양한 방식으로 처리하여 이들의 표면 항원의 노출을 향상시킴으로써 종양 세포의 면역원성을 증가시키고자 하였다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,931,275호에는 백신으로서 압력 또는 콜레스테릴 헤미숙시네이트로 처리된 세포를 사용하거나, 백신으로서 이들 세포로부터의 혈장막 또는 막 단백질을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

또 다른 방법은 시토카인과 면역계의 상호작용에 촛점을 맞추었다. 시토카인과 시토카인의 조합물은 면역계의 자극에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,098,702호에는 TNF, IL-2 및 IFN-β의 조합물을 상승적 유효량으로 사용하여 존재하는 종양을 제거하는 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제 5,078,996호에는 재조합 GM-CSF를 주입시켜서 대식세포 특이적이지 않은 살종양 활성을 활성화시킴으로써 종양에 걸린 환자를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 종양 발생을 일으키는 데에 필요한 시토카인의 용량이 종종 전신적으로 독성이므로, 환자를 직접 치료하는 것은 자주 불가능하다 (참조: Asher et al., (1991)J. Immun. 146:3227-3234 and Havell et al., (1988)J. Exp. Med. 167:1067-1085).

이러한 독성을 피하기 위해, 시토카인을 발현시키도록 유전적으로 변형된 비-신생물 세포가 백신으로서 투여되었다. 예를 들어, IL-2를 분비시키도록 유전적으로 변형된 자가 섬유아세포가 활성 종양 부위 이외의 부위에 종양 항원과 함께 투여되었다. 한 가지 관련된 방법에 있어서, 섬유아세포는 시토카인과 종양 항원 둘 모두를 발현시키도록 유전적으로 변형되었다 (참조: U.S. Patent No. 5,674,486 Sobel, et al.).

한 가지 대안적인 방법에 있어서, 종양 세포 그 자체가 시토카인을 발현시키도록 유전적으로 변형되었다. 이들 백신은 피검자의 T 세포에 대한 종양 관련 항원 제공을 강화시키기 위해 사용되었다. 예를 들어, 실험 결과, 시토카인 유전자를 쥐과동물 종양 세포내로 도입시키면 증가된 면역원성과 감소된 종양발생을 유도시키는 것으로 밝혀졌다 (참조: Gansbacher et al., (1990)Cancer Res. 50: 7820-7825; Fearon et al., (1990)Cell. 60:397-403; Ley et al., (1981)Eur. J. Immunol. 21:851-854; Watanabe et al., (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:9456; Gansbacher et al., (1990)J. Exp. Med. 172:1217-1224; Gansbacher et al., (1992)Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 33:351; Tepper et al., (1989)Cell 57:503-512; Hock et al., (1991)J. Exp. Med. 174:1291-1298; and Porgador et al., (1992)Cancer Res. 52:3679). 또한, 유전적으로 변형된 세포에 의해 전달된 특정한 시토카인의 국부화된 고농도는 동물과 인간에게서 종양 퇴행(참조: Gansbacher et al., (1990)Cancer Res., 50:7820-7825; Fornis et al., (1988)Cancer Met. Rev., 7:289-309; Fearon et al., (1990)Cell 60:397-403; and published GVAXvaccine patent applications and patents)을 일으켰고, 몇몇 경우, 종양 면역(Fearon et al., (1990)Cell 60:397-403)을 일으켰다. 따라서, 종양에 대해 반응하도록 면역계를 활성화시키는 것은 조사(irradiation) 및 화학요법에 대한 실행가능한 대안적 치료법이다. 따라서, 특정한 암에 대해 특이적인 개선된 더욱 효능있는 활성화 방법이 절실히 필요하다.

면역계를 활성화시키는 한 가지 방법은 종양 거부 항원과 같은 신규한 종양 관련 항원을 동정하는 것이다. 미국 특허 제 5,763,155호에는 흑색종 관련된 종양 거부 항원의 MACE 종양태아성 패밀리(family)를 동정하는 방법이 기재되어 있다. 이들 항원은 숙주 인간 T 세포에 의해 인식되지만, 항체 반응을 일으키지 않을 수 있다. 불운하게도, 대부분의 그 밖의 타입의 암 치료용의 면역 요법을 위한 임상적으로 관련된 종양 거부 항원은 아직까지 동정되지 않았다.

따라서, 임상적으로 관련된 종양 관련 항원을 동정하는 것이 종양 세포가 효과적인 세포성 및 혈청성 또는 체액성 반응을 일으키게 되도록 면역계를 자극하여 정상적으로 표적화되지 않은 종양 세포를 인식하게 하는 개선된 방법을 제공하기 위해 필요하다. 또한, 이러한 항원을 스크리닝하는 방법이 필요하다.

본 발명은 일반적으로 암 진단 및 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 암에 걸린 환자의 면역계에 의해 사전 인식되지 않은 신규한 단리된 종양 관련 항원, 이러한 항원을 동정하는 방법 및 이러한 항원을 이용하여 원발성 및 전이성 신생물(neoplasm)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 종양 관련 항원의 발현을 특징으로 하는 상태를 지니는 것으로 진단된 환자를 확인하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

도 1a는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 시토카인 코드화 서열을 함유하는 MFG 벡터의 개략도이다.

도 1b는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 pLJ 벡터의 개략도로서, 여기에서 "∇"는 시토카인을 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 나타낸다.

도 1c는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 pEm 벡터의 개략도로서, 여기에서 "∇"는 시토카인을 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 나타낸다.

도 1d는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 α-SGC 벡터의 개략도로서, 여기에서 "∇"는 시토카인을 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 나타낸다.

도 1e는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 재조합 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 플라스미드(SSV9/MD2-hGM)의 개략도이다.

도 1f는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 재조합 아데노 관련바이러스(AAV) 벡터 플라스미드(SSV9/MD2-hGM)의 개략도이다.

도 1g는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 HIV LTRs가 측면에 접한 GM-CSF 발현 카세트를 함유하는 재조합 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.

도 1h는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한, ICP22 HSV 유전자를 대체하는 GM-CSF 발현 카세트를 함유하는 HSV-1 기초 벡터의 개략도이다.

도 1i는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한, GM-CSF 발현 카세트를 포함하는 SV-40 기초 플라스미드(pSV HD GM-CSFII), SV-40 복제 기원, 및 바이러스 후기 유전자의 개략도이다.

도 1j는 본 발명의 방법 및 백신에 유용한 백시니아 바이러스 프로모터 및 종결 서열을 포함하는 백시니아 바이러스 발현 카세트의 개략도이다.

도 2는 LNCaP 세포상의 3개의 항원(150쪽, 31쪽, 및 26쪽)이 자가 전립선 GVAX백신으로 처리되지 않은(A, 백신투여 전) 및 처리된(B, 백신투여 후) 8명의 환자의 혈청들로 동정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다.

도 3은 항원(150쪽)이 자가 GVAX백신으로 처리된 환자의 전처리 및 후처리 혈청을 하기 세포주로부터의 단백질 배열에 적용함으로써 동정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다: (1) LNCaP(전립선 암종), (2) PC-3(전립선 암종), (3) A549(폐 암종), (4) LS-174T(결장 암종), (5) DU-145(전립선 암종), (6) KLEB(난소 암), (7) Jurkat(백혈병), 및 (8) MDA-MB-435s(유방 암종).

도 4는 항원(150쪽)의 발현이 전처리 및 후처리 혈청을 하기 세포에 적용함으로써 동정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다: (1) LNCaP 전립선 암 세포주, (2) 정상전립선 간질 세포, (3) 정상 전립선 상피 세포, (4) 정상 전립선 평활근 세포, (5) 정상 폐 섬유아세포, 및 (6) 정상 주위 혈액 세포.

도 5는 PC-3/GM 전립선 암세포 상에서 3개의 항원(250쪽, 160쪽, 및 14쪽)이 동종이형 전립선 GVAX백신으로 처리되지 않은(A, 전 백신투여) 및 처리된(B, 후 백신투여) 환자들(301, 305, 314, 307 및 312)의 혈청들로 동정되는 웨스턴 블롯을 나타낸다.

도 6은 항원(250쪽, 160쪽, 및 14쪽)이 하기 세포주 내에서 동종이형 전립선 GVAX백신으로 처리된 환자의 혈청과 접촉하여 측정된 웨스턴 블롯을 나타낸다: (1) LNCaP(전립선 암종), (2) PC-3(전립선 암종), (3) A549(폐 암종), (4)LS-174T(결장 암종), (5) MCF7 유방 암종, (6) DU-145(전립선 암종), (7) KLEB(난소 암), (8) Jurkat(백혈병), 및 (9) MDA-435S(유방 암종).

도 7은 항원(250쪽, 160쪽 및 14쪽)의 발현이 하기 세포 상에서 동종이형 전립선 GVAX백신으로 처리된 환자의 혈청을 사용하여 관찰된 웨스턴 블롯을 나타낸다: (1) LNCaP 전립선 암 세포주, (2) PC-3 전립선 암종, (3) 정상 전립선 간질 세포, (4) 정상 전립선 상피 세포, (5) 정상 전립선 평활근 세포.

도 8a는 GM-CSF 및 본 발명의 하나 이상의 종양 관련 항원을 코드화하는 레트로바이러스 벡터의 개략도이다.

도 8b는 GM-CSF 및 본 발명의 하나 이상의 종양 관련 항원을 코드화하는 아데노바이러스 벡터의 개략도이다.

발명의 상세한 설명

본원에서 참조된 특허 및 기술 문헌은 당업자에게 자명한 지식을 설정한다. 반포된 미국 특허, 출원, 공개된 외국 출원, 및 참고 문헌은 본원에 참고로서 통합된다.

본 발명은 환자의 혈청을 GVAX백신으로 처리함에 의한 항원-항체 결합 검정에 의해 동정할 수 있는, 임상적으로 적절한, 신규의 단리된 종양 관련 항원을 기술한다. 이들 종양 관련 항원은 제 1 종양 세포 또는 전이성 종양 세포, 및/또는 과발현되거나 시기 부적절하게 발현된 어떤 비종양세포에 의해 발현될 수 있다. GVAX백신 처리에 앞서, 이들 항원은 이들이 종양성 (neoplastic) 세포상에서 과발현될 수 있다는 사실에도 불구하고, 면역원성이 아니거나 약한 면역원성일 수 있다. GVAX백신 처리는 환자의 면역계가 항원을 인식하게 하고, 그에 따라 백신 처리 이전에 존재하였던 항원에 대한 면역 내성을 극복하게 한다. 항원에 의해 유도된 면역 반응은 종양의 성장을 억제하거나, 종양의 제거를 유도할 수 있으며, 및/또는 질환의 진단에 유용한 마커일 수 있다.

따라서, 본 발명은 종양 관련 항원을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 단백질 어레이(array)가 생물 샘플로부터 제조된다. 제 1 혈청 샘플 및 제 2 혈청 샘플 각각은, 피험자를 상기한 GVAX백신으로 처리하기 이전 및 이후에 피험자로부터 수득된다. 단백질 어레이의 제 1 샘플은 제 1 혈청 샘플과 접촉되고, 단백질 어레이의 제 2 샘플은 제 2 혈청 샘플과 접촉된다. 제 2 혈청 샘플과 반응하나 제 1 혈청 샘플과는 반응하지 않는 어레이 중의 단백질이 동정되고, 이는 GVAX백신으로 환자를 처리한 후 환자에 의한 면역 반응을 유도한 종양 관련 항원인 반응성 단백질이다.

상기한 바와 같이, GVAX백신 처리가 신규한 종양 관련 항원의 동정을 가능하게 한다. 이러한 처리에서, 종양을 지닌 환자는 면역계가 종양에 의해 발현된 항원에 대해 활성화되도록 종양 세포 기초 백신으로 면역화된다. 이들 항원은 정상 조직 세포, 신규의 돌연변이된 종양 특이적 항원, 또는 종양 태아성 항원을 포함한다. 종양에 의해 발현된 정상 자가 항원의 지배가 잘 기록되었다. 환자의 면역계는 이미 정상의 "자가" 항원에 대해 내성이다. GVAX백신 처리에 의해, 면역화는 자가 항원에 대한 내성을 극복한다.

GVAX백신 처리는, 증식무능력이 부여되고, 시토카인, GM-CSF를 발현하도록 유전자 조작된 암세포를 사용한 환자의 면역화로부터 출발한다. 다른 시토카인 및 다른 면역계 강화제 및/또는 인핸서가 GM-CSF를 대신하여 또는 이것에 부가하여 백신에 유용하다. 종양세포는 공지의 임의의 유전자 전달 방법에 의해 시토카인을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 방법의 한 예는, 시토카인을 코드화하는 벡터 예컨대, 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 세포를 감염시킬 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 이러한 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노계 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 신드비스 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, SV-40 벡터, 및 수두 바이러스 벡터 예컨대, 백시니아(미국 특허출원 제 90/324,707호 참조)가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 다양한 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. MFG, α-SGC,pLJ, 및 pEm, 및 이들의 유도체(도 1a 내지 1d)가 본원에 참고로서 통합된 1991년 10월 31자 미국특허출원 제 07/786,015호(1991년 10월 31자 출원된 PCT/US91/ 08121)에 보다 더 상세히 개시되어 있다. GVAX백신의 한 형태는, 동일하거나 다른 유형의 하나 이상의 시토카인을 코드화하는 레트로바이러스 벡터에 의한 종양 세포의 단일 감염을 이용한다. 대안적인 형태의 GVAX백신에서, 다른 시토카인을 코드화하는 다수의 레트로바이러스 벡터에 의한 다중 감염이 이용된다.

다른 바이러스 벡터가 GVAX백신의 종양세포를 형질도입시키기위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특히 유용한 바이러스 벡터는 복제중이 아니거나 휴지기의 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 것이며, 이것은 세포 배양의 필요 없이 세포의 효과적인 형질도입을 가능하게 한다. 하나의 이러한 바이러스 벡터가 아데노바이러스로부터 구성되며, 이것의 대표적인 예가 도 1e에 도시된다. 본 발명의 GVAX백신 방법에 유용한 다른 바이러스 벡터는, 아데노계 바이러스 벡터 (AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 신드비스바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, SV-40 바이러스 벡터, 및 수두 바이러스 벡터 예컨대, 비제한적인 예로서 백시니아 바이러스 벡터(대표적인 예로서 도 1f-1j 참조)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. GVAX백신은 하나 이상의 시토카인을 코드화하는 하나 이상의 이들 벡터에 의한 종양 세포의 단일 감염을 이용하거나, 다른 시토카인을 코드화하는 벡터에 의한 다중 감염을 이용할 수 있다.

당업자라면, 상기 벡터가 작동 특성 즉, 형질도입 효능이 실질적으로 유지되면서 다소간 변형될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이와 같이, 본 발명은 또한 면역 조절성 항원을 코드화하는 유전자를 세포에 전달하기 위해, 상기 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노계 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 신드비스 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, SV-40 벡터 및 천연두 바이러스 구성체의 작동성(형질도입 능력이 있는) 유도체를 하나 이상 사용하는 것을 제시한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 MFG-S는 MFG 벡터중에 3개의 점 돌연변이를 포함하며, 이는 벡터의 안전성을 이론적으로 개선하는 반면 (비록 MFG가 불안정하다는 어떠한 증거도 없으나), 실질적으로 동일한 트랜스펙션 효과를 유지한다. 구체적으로, MFG-S는 1256째 누클레오티드에서 A가 T로, 1478째 누클레오티드에서 C가 T로, 및 1273째 누클레오티드에서 T가 A로 변이됨을 갖는다. 유사하게, 아데노바이러스 벡터 AV-GM-CSF는 바이러스 지놈의 E1 및 E3 영역내에 결실(deletion)을 가질 수 있다. 물론, 적절한 트랜스펙션 효율을 유지하면서 바이러스의 동일하거나 다른 영역내에서의 다른 또는 추가의 결실이 가능하다.

다양한 항원 및 시토카인이 GVAX백신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간의 시토카인 또는 항원과 실질적으로 상동인 다른 포유동물의 시토카인 및 항원이, 면역계에 유사한 활성을 보이는 것으로 입증된 경우에, GVAX백신 처리에 유용하다. 이와 같이, GVAX백신 방법은 항원 및 시토카인 또는 이들의 결합을 사용한 처리를, 다른 전신성 치료 예컨대, 화학치료, 방사선치료 및 다른 생물학적 반응조절제와 결합하여 수행하는 것을 포함할 수 있다.

시토카인을 코드화하는 GVAX백신의 벡터는, GVAX백신으로 처리되어질 환자에 보유된 유형의 종양세포를 형질도입하는데 사용된다. 종양세포는 자가유래즉, 환자 또는 그의 직계 후손으로부터 직접 수득되거나, 동종이형 즉, 환자에 존재하는 종양과 동일한 유형의 세포주로부터의 것일 수 있다.

각각의 환자에 대한 자가 백신 세포를 생산하기 위해, 종양세포는 무균 조건에서 조심스럽게 배양되어야 하며, 효소적으로 분해되어야 하고(종양이 고형인 경우 필요한 것으로서), 생체외에서 일시적으로 증식해야 하며(세포가 레트로바이러스로 형질도입된 경우), 높은 수준의 측분비 GM-CSF 분비를 허용하도록 시토카인 코드화 벡터와 함께 형질도입되어야 한다(Wallack 등 (1995) Cancer 75:34-42). 종양이 고형인 경우, 일반적으로 외과 수술로 2g 이상의 종양세포가 채취 수집된다. 이와 같이, 다양한 암에 대한 자가 GVAX백신 처리는 백신을 제조하는 제 1 종양 조직의 이용가능성에 의존한다.

불운하게도, 많은 수의 진행성 전립선 암 환자에 있어서, 자가 종양 백신 방법은 기술적으로 이용하기 어렵다. 이들 환자 및 다른 암에 걸린 다른 환자에 있어서, 동종이형의 GVAX백신 경로가 보다 더 유용한데 이는 암세포주가 제한 없이 공급될 수 있기 때문이다. 동종이형 암세포 백신은 선택적인 암세포 파괴를 허용하기 위해 면역계에 의해 표적화 될 수 있는 실질적인 분획을 함유한다. 결과적으로, 이러한 백신의 제조는 현재 개발중인 비특이적 항원 백신(예를 들어, PSA- 또는 PSMA-기초 백신) 보다 더 우수할 수 있으며, 이는 치료적 면역 반응을 이끌어내기 위해 표적화하기 위한 이상적인 종양 관련 항원이 아직 알려지지 않았기 때문이다. 또한, 항종양 효능에 대한 높은 가능성을 제공하기 위해, 궁극적인 암 면역치료법 처리 기술은, 인간의 거의 모든 진행성 전립선암에서 나타나는 유전자 발현에서의 현저한 이질성을 극복하기 위해, 수개의 다른 세포 성분을 표적화하는 화학치료와 결합한 것으로서, 수개의 다른 항원을 표적화하는 것이 필요할 수 있다(Nelson 등 (1996) Urol. Clin. N. America 23:685-696).

전립선 암의 동종이형 치료를 위해, 용이하게 증식할 수 있는 인간 전립선암 세포주 예컨대, 제한적이지 않는 예로서, LNCaP(Peehl in Atlas of Human Tumor Cell Lines, pp. 387-407. Acad. Press, Inc., 1994) 또는 PC(Amico 등 (1991) Clin. Nucl. Med. 16:643-648; Gerber 등 (1991) Urol. 37:418-422)가 동종이형 전립선 암 백신 구성을 위한 유용한 전립선 암 항원 공급원으로서 기여한다. 이들 전립선 암 세포주는 GM-CSF 유전자 형질도입을 위해 선택되었고, 이들 사이에서, 이들은 인간의 전이성 전립선 암세포에 의해 발현된 많은 수의 공지된 종양 항원을 환자에서 발현한다. 이와 같이, 이들 2개의 세포주가 동종이형 전립선 GVAX백신의 한 구체예로서 혼합된다.

다른 GVAX백신 유형 방법에서, 면역계 강화제 및/또는 인핸서 예컨대, 시토카인을 발현하는 비암종 세포가 증식능력이 없는 종양 세포와 함께 백신으로서 투여된다. 이러한 "바이스탠더(bystander) 방법"에서, 비암종 세포는 종양 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 상기 방법중 임의의 하나를 사용하여 예를 들어, 유전자 조작에 의해 변형될 수 있다(Borello 등 (1999년 8월 10일) Hum. Gene Ther. 10:1983-1991).

환자가 GVAX백신 처리된 후, 혈청이 채취되고, 처리 이전에 인식할 수 없었던 암관련 항원 또는 종양 관련 항원을 인식하는 이들의 능력을 스크리닝하였다.스크리닝은 항체 및 환자의 혈청의 다른 분리 성분을 사용하는 임의의 공지된 면역학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양 관련 항원은 웨스턴 블롯 분석, ELISA, 방사면역검정, 또는 수회의 T세포 검정에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 생물 샘플로부터의 단백질 어레이가 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통해 분리되는 경우, 특정 종양 관련 항원이 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 및 잘라낸 겔 슬라이스에 의해 겔 속에 위치할 수 있다. 다양한 다른 공지의 동정 방법 예를 들어, 쿠마시(Coomasie) 블루, 아세트산 나트륨, 또는 염화구리와 함께 예를 들어, 겔의 단부로부터의 측면 스트라이프 염색 또는 겔의 광 염색, 및 예를 들어¹²⁵I,³⁵S,³²P를 사용한 방사활성 표지화에 의한 밴드의 위치 추적, 및 이에 후속하여 목적하는 밴드를 잘라내기 위한 주형으로서 오토래디오그램의 사용 있다(예를 들어, Harlaow and Lane (eds.) Antibiotics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1988, pp. 61-67).

한 연구에서, 암종관련 항원이 다음과 같이 동정되었다. 자가 전립선 GVAX백신을 제조하기 위해, 전립선 종양을 8명의 환자로부터 제거하여 제 1 전립선 암 세포주를 생성시켰다. 인간 GM-CSF-함유 레트로바이러스 벡터를 이들 제 1 세포주에 형질도입하여 GM-CSF를 분비하는 세포를 생성시켰다. 환자에게 자가 제 1 전립선 암 세포를 발현하는 이들 GM-CSF를 2주마다 피하 주입했다. 환자 1, 2 및 3에 1×10⁷세포를 6회 투여하고; 환자 4에 1×10⁷세포를 5회 투여했으며; 환자5 및 6에 5×10⁷세포를 6회 투여했으며; 환자 7에 1×10⁷세포를 3회 투여하고; 환자 8에 5×10⁷세포를 3회 투여했다. 하기 연구에 사용한 혈청은 예비 백신화인 경우에 백신화의 2시간 전에 채혈한 혈액으로부터 제조했으며, 추가 백신화의 경우에 최종 백신화 후 2주 후에 채혈한 혈액으로부터 제조했다.

최종 백신화 후, 자가 전립선 GVAX백신 시험중 환자의 혈청내의 항체에 의해 인식되는 특이적 항원의 동정은, LNCaP 전립선 암 세포주의 웨스턴 블롯 분석에 의해 수행했다. LNCaP 용해질 25㎍을 4-20% 농도구배 SDS 폴리아클릴아미드 겔상에 전개시키고, 후속하여 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS내에 1:1000 내지 1:3000 범위의 환자 혈청의 희석액을 제 1 항체에 대한 웨스턴 블롯 분석에 사용했다. 퍼옥시다제-축합-폴리클로날 염소 항-인간 IgG+M+A의 1:3000 희석액을 제 2 항체에 대해 사용했다. 결과를 화학형광성 ECL 키트로 나타냈다.

LNCaP 세포로부터 세개의 특이적 항원을 백신처리 전 및 후로부터 유도된 혈청을 비교하므로써 새롭게 확인하였다. 환자 1 및 6으로부터 유도된 혈청은 항원의 겉보기 분자량이 약 26kD 및 31kD(각각, p26 및 p31)인 것을 인식하였고, 환자 7로부터 유도된 혈청은 150kD 단백질(p150) 및 26kD 단백질(p26)을 인식하였다(도 2). 두개의 다른 전립선암 세포주(PC-3 및 DU-145)로부터 유도된 용해물이 웨스턴 블롯 분석에 사용된 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다.

p31 및 p26 항원의 분자량은 PSA의 32kD 분자량에 매우 근접한다. PSA는 전립선 종양 성장의 발병 및 진행에 대한 대리 마아커로서 사용된다. p26 및 p31 항원이 PSA와 관련되어 있는 지와 PSA가 발현되고 있는 지를 측정하기 위해 자가 GVAX백신 처리된 환자로부터의 혈청을 조사하였다. 3㎍의 정제된 PSA를 4-20% 구배의 SDS-폴리아클리아미드 겔로 분석한 후, 웨스턴 블로팅 분석하였다. 백신처리 전 및 후의 혈청을 비교하였을 때, 자가 GVAX백신 시험한 8명의 환자로부터 특이적 항체 반응은 검출되지 않았다. 이 결과는 p26 및 p31이 PSA와 관련없음을 시사한다.

p150 항원의 조직/세포 특이적 발현은 다음의 상이한 유형의 암 세포에서의 발현을 조사하므로써 특징된다: LNCaP(전립선 암종); PC-3(전립선 암종); A549(폐암종); LS-1747(결장 암종); DU-145(전립선 암종); KLEB(난소 암종); 쥬르케이트(Jurkat)(백혈병); 및 MDA-MB-345S(유방 암종). 환자 7로부터 백신 처리 전 및 후의 혈청이 사용된 경우, 웨스턴 블롯 분석에 의해 얻어진 결과를 비교한 결과, p150이 모든 시험된 암종 세포주 상에 발현되는 것으로 측정되었다. 이는, 신규 항원, p150은 전립선 종양 특이적 항원이 아니라 "pan" 종양 관련 항원임을 시사한다.

p150 항원이 종양 특이적 항원인 지를 측정하기 위해, 정상 1차 세포주에서의 발현을 조사하였다. 네가지 정상 1차 세포주, 즉, 전립선 간질 세포; 전립선 내피 세포; 전립선 평활근 세포 및 폐 섬유아 세포를 시험하였다. 새로 단리된 말초혈 세포 또한 시험하였다. 웨스턴 블롯 분석과 환자 7로부터 유도된 백신처리 전 및 후의 혈청을 비교하므로써, p150이 전립선 간질 세포, 폐섬유아세포 및 말초혈 세포가 아닌 전립선 상피 세포 및 평활근 세포 상에서 발현되는 것으로 측정되었다(도 4). p150이 정상 전립선 조직 상에서 발현되기 때문에, 종양에서 과발현되는 종양 관련 항원일 수 있다. 이러한 발견은 또한, GVAX백신이 자가 내성을 파괴할 수 있고, 면역 시스템이 양성과 악성 세포 간에 공유된 항원을 인식할 수 있게 함을 시사한다.

신규 항원은 또한 동종이형 GVAX백신으로 처리된 환자의 혈청에 의해 동정되었다. 동종이형 전립선 GVAX백신 시험에서, 21명의 환자를 1.2 x 10⁷GM-CSF-발현 LNCaP(LNCaP/GM) 세포 및 GM-CSF 발현 (PC-3/GM) 세포로 8주 동안 백신처리하였다. GVAX백신 투여하기 2시간 전("백신처리 전"이라함)에 채혈된 혈액과 마지막 GVAX백신 투여 2주 후("백신처리 후"라 함)로부터 혈청을 준비하였다.

수개의 동종이형 GVAX백신 처리된 환자로부터 유도된 혈청을 후속 연구를 위해 선정하였다. 이러한 데이타의 일부가 도 5에 도시되며, 하기 표 I에 요약된다.

표 I

LNCAP 및 PC3 세포에 대한 체액 면역 반응이 동종이형 GVAX백신 처리된 전립선 암 환자의 대부분에서 관찰되었다. 이러한 항-PC3 및 항-LNCaP 항체 반응의 유도 및 21명 중 15명의 동종이형 GVAX백신처리된 전립선 암 환자에서의 PSA 속도 감소의 관찰은 이러한 체액 면역 반응이 동종이형 GVAX백신 처리된 환자에서 전립선 종양 성장을 근절시키기 위한 면역 반응의 개시에 관련될 수 있음을 시사한다.

이후, GVAX후-백신처리된 환자의 혈청이 PSA를 인식하는 지를 측정하였다. 3㎍의 PSA를, 환자 301, 305, 314, 307 및 312를 이용하여 4-20% 구배의 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, 웨스턴 분석을 수행하였다. 이 결과, PSA는 이러한 혈청을 인식하지 않음을 나타냈으며, 이는 PSA가 종양 성장을 근절시키기 위한 상응하는 면역 반응을 유도하는 원인이 될 수 없음을 시사한다.

이러한 신규 항원을 더욱 특징화하기 위해, 환자 305로부터 유도된 백신처리 전 및 후의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 조직/세포 특이적 발현을 조사하였다. 암종 세포주의 패널로서, LNCaP(전립선); PC-3(전립선); A549(폐); LS-174T(결장); MCF7(유방); DU-145(전립선); KLEB(난소); 쥬르케이트(백혈병) 및 MDA-MB-435S(유방)을 조사하였다. 도 6에 도시된 이것의 결과는 p14가 PC-3 전립선 암 세포에 의해 발현됨을 입증하고 있다. p14의 발현을 정상 1차 세포주, 즉, 전립선 간질 세포; 전립선 내피 세포 및 전립선 평활근 세포에서 조사하였다. 도 7은 p14가 PC-3에서는 발현되지만, 시험된 정상 1차 전립선 세포주에서 발현되지 않음을 보여준다. 종합해 보면, 이러한 결과는 p14가 전립선 종양 특이적 항원임을 강력하게 시사한다.

p250 및 p160 항원의 조직/세포 특이적 발현은 또한 p14에서 사용된 바와 같은 암종 세포주와 정상 1차 전립선 세포주의 동일한 패널로 특징화하였다. p160은 PC-3 암 및 정상 전립선 내피 세포에서, 매주 A549(폐 암종) 및 MCF7(유방 암종)에서 발현되나, 다른 유형의 시험된 암종 뿐만 아니라, 전립선 간질 세포 또는 평활근 세포에서는 발현되지 않는다(도 6 및 7). 이러한 결과, p160이 종양 특이적이지 않더라도, 전립선 특이적 항원임을 시사한다.

동일 실험으로부터 p250은 전립선 암 세포주, PC-3 및 DU-145, 및 A549 폐암종에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 6). P250은 정상 전립선 내피 세포에서 발현되나, 간질 세포 또는 평활근 세포에서 발현되지 않는다(도 7). 이러한 결과는 p250이 p160과 유사하게 전립선 특이적 항원임을 강력하게 시사한다. p250 및 p160과 같은 정상 전립선 특이적 항원에 대한 항체 반응이 있다는 사실은 동종이형 GVAX백신이 내성을 파괴하고, 면역 시스템이 전립선 특이적 항원을 인식하므로써 이러한 종양에 대해 반응을 확립하게 할 수 있음을 시사한다.

GVAX백신 처리 후 이러한 종양 관련 항원의 동정은 종양에서의 면역학적으로 관련된 유전자의 신속한 평가를 가능하게 한다. 이러한 유전자에 의해 코드화된 종양 관련 항원의 동정은 외래 또는 그 자체로서 면역 시스템에 의해 인식된 단백질 서열의 컨스티투언시(constituency)를 측정하는데 유용하다. 이러한 서열의 인식은 새로운 진단 및 치료 방법을 제공할 수 있다.

면역학적으로 관련된 항원의 종래 평가에서는 항-종양 반응을 유도하기 위한 방법으로서 종양 면역반응을 사용하지 않았다. 또한, GVAX백신의 애쥬번트 효과는, 자가 또는 동종이형 종양을 이용한 종래 인간의 치료가 유사한 결과를 낼 수 없었던 이유를 설명하는, 종양 면역원성에 대한 상당한 개선을 제공할 수 있다.

상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 동정된 종양 관련 항원은 단리될 수 있으며, 추가로 특징될 수 있고, 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에의해 동정된 항원은 상응하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 배치되고, 추출되어, 이들의 아미노산 서열이 당해 널리 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 서열로부터, 여러가지 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 상응하는 올리고누클레오티드가 유도될 수 있고, 이후에 이들 항원의 cDNA를 클로닝할 수 있다.

본 발명에 따른 종양 관련된 항원을 코드화하는 cDNA는 당해 공지된 어떠한 수단에 의해서도 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 항원 cDNA의 클로닝은 (1) 이들 항원에 대한 mRNA에 상보적인 올리고누클레오티드를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하므로써; (2) 동정된 항원의 올리고누클레오티드를 사용하여 EST-태깅된(tagged) 게놈 라이브러리를 함유하는 칩을 스크리닝하므로써; 및/또는 (3) GVAX백신 처리된 환자로부터의 혈청을 사용하여 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하므로써 달성될 수 있다. cDNA 라이브러리는 파아지, 플라스미드 또는 코스미드(cosmid)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 공지된 벡터 시스템에서, 특정 항원을 코드화하는 cDNA의 크기에 의존하여 생성된다. cDNA 라이브러리를 구성하기 위해, cDNA는 특정 신규 종양을 발현시키는 암 세포주로부터 단리된 mRNA로부터 생성된다. 항원에 특이적인 올리고누클레오티드는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용되어 하이브리디제이션(hybridization)의 상이한 엄중도에 의해 항원 특이적 cDNA를 단리시킨다. 항원을 코드화하는 cDNA는 이후 이 단백질을 정상적으로 발현시키지 않는 세포주에서 발현된다. GVAX백신 처리된 환자의 혈청을 사용하여 트랜스펙션된 세포주의 웨스턴 블롯 분석이 단리된 cDNA에 의해 코드화된 단백질이 혈청에 의해 동정된 항원인 지를 확인하기 위해 수행된다.

본 발명의 종양 관련 항원에 대한 올리고누클레오티드 프로브는, 또한 오픈-리딩 단편이 EST 태그와 같은 공지된 올리고누클레오티드 서열에 의해 태깅된 게놈 라이브러리를 함유하는 칩을 스크리닝하는데 사용된다. 항원 특이적 cDNA의 서열은 항원의 올리고누클레오티드를 이용하여 높은 엄중도로 하이브리디제이션된 칩의 웰로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방법으로부터 얻어진 결과는 cDNA 또는 게놈 데이타베이스의 서치(예를 들어, Genbank 또는 NIH에서)에 의해 관련된 클로닝된 단백질을 동정할 수 있게 한다.

신규 종양 관련 항원을 코드화하는 cDNA는 또한 GVAX백신 혈청을 사용하여 발현 라이브러리로부터 클로닝될 수 있다. cDNA는 관심이 되는 신규 종양 항원을 발현시키는 세포주의 mRNA로부터 생성된 후, 발현 벡터를 구성하는데 사용된다. 이러한 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 시스템중 어느 하나에서 항원을 코드화하는 cDNA를 발현시키기 위한 프로모우터를 함유한다. 이후, 발현 라이브러리가 파아지를 사용하여 숙주, 예를 들어 박테리아 숙주 세포에 형질 도입되거나 트랜스펙션된다. 이와 같이 형성된 콜로니는 용해되고, 이후 웨스턴 블롯팅 분석되어 양성 클론이 GVAX백신 처리된 환자로부터의 혈청에 의해 동정된다. 양성 박테리아/파아지 클론의 cDNA는 이후 단리되고 시퀀싱된다. 이러한 cDNA는 이후 세포주에서 발현되어, 이의 발현은, 단리된 cDAN에 의해 코드화된 단백질이 이미 동정된 종양 항원에 상응하는 지를 확인하게 위해 동일한 환자의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 조사된다.

클로닝된 cDNA 또는 종양 관련된 항원, 이들 자체는 본 발명의 종양 관련 항원, 핵산-, 단백질-, 또는 세포 기초 종양 관련 백신을 인식하고, 이와 반응성을 갖는 항체의 제조, 여러 가지 암의 치료 및/또는 예방, 동종이형 GVAX백신에 사용하기 위한 암 세포주의 선택, GVAX백신 치료를 위한 환자의 선정 및 백신 치료의 개발을 최적화하고 안내하기 위한 면역 반응 시험의 개발을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 많은 치료 및 진단 응용에 유용하다.

생물학적 표본에서 종양 관련 항원의 존재 여부를 스크리닝하는 방법에 있어서, 본 발명의 동정 방법에 따라 동정된 항원에 대한 항체를 제조한 후, 분리한다. 생물학적 표본이 항체와 접촉하여, 종양 관련 항원이 생물학적 표본에 존재하는 경우 항원-항체 반응이 검출된다. 물론, 표준물에 대해서도 항체를 가지고 분석하여, 비특이적 백그라운드 결합을 측정하고, 당해 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 표본중의 종양 관련 항원을 정량화한다.

본 발명의 하나 이상의 분리된 종양 관련 항원, 또는 그의 면역원성 단편 또는 유도체는 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 단백질을 기초로 한 백신의 성분이기도 하다. 종양 관련 항원의 면역원성 단편은, 예를 들어 어느 부분의 단백질이 전체 항원을 최초로 인식한 GVAX백신 치료 환자의 혈청에 의해 여전히 인식되는지를 결정함으로써 동정될 수 있다. 항원 또는 그의 부분은 전형적인 단백질 백신을 제조하기 위하여 생리적으로 허용되는 담체 및 애쥬번트로 제형화될 수 있다. 한 유용한 담체는 생리 식염수이다. 유용한 애쥬번트의 비한정적인 예로서 수중유의 마이코박테리움, 및 세균성 애쥬번트가 포함된다. 백신은 면역계 강화제 및/또는 인핸서를 비독성 농도로 추가로 함유할 수 있거나, 대안적으로 이러한 강화제및/또는 인핸서를 발현하는 세포를 추가로 함유할 수 있다. 다양한 면역계 강화제 및/또는 인핸서가 본 발명에 사용될 것이다. 이러한 강화제 및/또는 인핸서의 비한정적인 예로서 GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, CD2, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, B7, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, M-CSF, G-CSF 및/또는 ICAM이 포함된다. 또한, 동일물의 인간 형태와 상당한 상동성을 가지는 기타 포유동물의 강화제 및/또는 인핸서가 면역계에 대해 유사한 활성을 나타내는 것으로 입증된 경우 본 발명에 유용하다. 또한, 본 발명의 백신은 화학요법, 방사선 치료, 및 기타 생물학적 반응 조절제와 같이 기타의 전신 요법과 결합될 수 있다.

기타의 백신은 하나 이상의 새로운 종양 관련 항원을 코드화하는 핵산, 또는 그의 항원성 단편, 및 GM-CSF와 같이, 하나 이상의 단백질을 기초로 하는 강화제 및/또는 인핸서를 코드화하는 핵산을 포함하는 핵산을 기초로 하는 백신들이다. 종양 관련 항원은 종양형성성은 아니지만, 마커 단백질일 수 있다. 종양형성성 단백질은 세포를 암종화시키는데, 제어불가능한 증식 능력을 그의 한 특징으로 한다. 종양 관련 항원의 종양형성성을 검사하는 대표적인, 비한정적 방법은 하기와 같다. 표적 비종양 세포를 약 50,000 내지 10,000세포/웰의 밀도로 멀티웰 플레이트에 플레이팅한다. 종양 관련 항원 또는 종양 관련 항원을 코드화하는 백터를 세포에 첨가한다. 세포를 7일간 매일 유사하게 처리한다. 그 후, 세포를 수집하여 약 2,000 내지 5,000개 세포를 연질 한천에, 예를 들어 문헌[Freedman and Shin, Cell 3:355-359 (1974)]에 기재된 바에 따라 플레이팅한다. 플레이팅 2주 후에, 연질 한천에 형성된 콜로니의 수를 광학 검사에 의해 계수한다. 종양 관련 항원이 종양형성성인 경우, 미처리된 세포에 의해 형성된 콜로니와 비교하여 콜로니 수의 용량의존적인 증가가 관찰된다.

대안적으로, BALB/c 누드 마우스(Talconic Labs, Great Barrington, NY)의 측복부 부분에 종양 관련 항원 또는 동일물을 코드화하는 핵산 또는 백신으로 처리된 약 2x10⁶개의 비종양 세포를 피하 주사할 수 있다. 종양의 형성은 종양 관련 항원의 종양형성성을 시사한다.

바람직하게는, 백신중의 핵산은 RNA 또는 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있는 DNA이다. 종양 관련 항원 및 강화제 및/또는 인핸서를 코드화하는 핵산은 바이러스 벡터와 같은 하나 이상의 벡터상에서 함께 또는 별개로 운반될 수 있다. 유용한 바이러스 벡터는 GVAX백신 방법에 사용되는 상기 기재한 것들이다. 2개의 대표적인 바이러스 벡터가 도 8a 및 8b에 개략적으로 도시된다. 대안적으로, 플라스미드 DNA를 포함하는 비바이러스 벡터는 단독으로 또는 예컨대 리포좀 및 단백질 콘덴서(예를 들어, 폴리-리신 화합물)로 제형화되어 사용될 수도 있다. 그 후, DNA 또는 벡터는 공지된 유전자 치료법을 사용하여 투여될 수 있다.

새로운 종양 항원 또는 그의 단편을 코드화하는 DNA 또는 벡터는 세포를 유전자 조작하여 종양 항원을 생산 및 발현하는데 사용될 수도 있다. 이러한 세포는 본 발명의 세포를 기초로 하는 백신에 사용된다. 상기 기재한 GVAX백신에서와 같이, 유전자 조작하려는 세포는 동종이형(allogeneic) 또는 자가조직(autologous) 세포일 수 있다. 이러한 GVAX형 백신은 정의된 새로운 암종 항원을 사용하여최적화될 수 있다. 최적화는 종양 관련 항원을 사용하여 높은 발현 수준 및 넓은 암종 항원 레퍼터리를 가진 종양 세포주를 선택함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포주의 조합이 최적의 암종 항원 조성과 함께 선택될 수 있다. 하나 이상의 암종 항원이 종양중의 암종 유전자 발현을 변이시켰을 가능성이 있는 모든 환자에 적용되도록 사용될 수 있고, 단일 항원에 대한 생체내 종양 돌연변이에 의해 면역학적 도피(immunological escape)를 방지될 수 있기 때문에, 다수개의 암종 항원이 동정되어 왔고 현재 동정중에 있다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본 발명의 암 백신은 다수개의 항원을 함유 또는 코드화한다.

또한, 본 발명은 초기 및/또는 전이성 종양의 치료를 포함하여, 본 발명의 항원 및 백신을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 따라 동정된 새로운 종양 관련 항원은 생체외에서 환자의 종양 특이적 T 세포를 자극 및 확장시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 활성화된 T 세포는 환자에게 되돌려 보내져 항-종양 반응을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명은 예방 목적에 유용한, 예를 들면 한 개체를 종양의 발병 또는 진행에 대해 방어시키기 위한 백신을 포함한다. 치료 목적으로, 백신은 치료학적 유효량 및 치료학적으로 유효한 방법으로 투여된다.

본원에서 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 의미있는 피검자 또는 환자의 이익, 즉 종양 증식 감소 또는 암종을 유발 또는 특성화하는 단백질의 발현의 감소를 나타내기에 충분한 백신 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 단독으로 투여되는 개별적인 활성 성분에 대해 적용되는 경우, 상기 용어는 그 성분 단독에관해 언급한다. 조합물에 적용되는 경우, 상기 용어는 병용하여 연속으로 또는 동시에 투여되든 아니든, 치료 효과를 가져오는 활성 성분들을 합한 양을 언급한다.

"치료학적으로 유효한 방법"이라 함은 궁극적으로 상기 기재한 바와 같은 의미있는 환자의 이익을 가져오는 약학 조성물의 투여 경로, 투여 기간, 및 투여 횟수를 언급한다. 예를 들면, 본 발명의 백신은 피내, 근육내, 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 단백질을 기초로 하는 백신을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는 본 발명의 백신은 설하, 직장, 경구, 또는 장으로, 대용량(bolus)으로 연속적으로, 단속적으로, 또는 연속적 투여후 단속적 투여방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신의 치료학적 유효량은 치료되는 질환의 특성 및 중증도에 좌우되며, 환자가 받은 이전의 치료의 특성에 좌우된다. 궁극적으로, 주치의가 각각의 개별적인 환자를 치료하기 위한 백신의 양 및 타입을 결정할 것이다. 초기에, 주치의는 보다 저용량의 백신을 투여하고 환자의 반응성을 관찰할 수 있다. 환자에 대해 최적의 치료 효과가 달성될 때까지 보다 대용량의 백신을 투여할 수 있으며, 치료 효과가 달성되었을 때 투여량을 더이상 증가시키지 않는다.

GVAX백신으로 면역화된 환자의 체액성 반응에 의해 동정되는 항원의 동정은 면역우성 종양 거부 항원의 선택에서 중요한 단계이다. 암종에서 면역요법적 치료에 있어서 임상적으로 중요한 항원의 확인(vaildation)은 종양 관련의, 항원 특이적 면역 반응과 임상적 항-종양 반응을 상호관련화한 후, 이러한 항원에 대한 면역 반응과 관련있는 통계적으로 유의한 임상 효과를 나타내는 종양 관련 항원을포함하는 백신의 최적화된 투약 계획을 사용한 임상 시험을 필요로 한다.

항원 면역 반응의 상호관련화는 임상적 종말점을 암 특이적 면역 반응의 정성 및 정량적 평가와 비교함으로써 수행된다. 이러한 상호관련화는 통계학적 관점에서 볼 때, 비례적 또는 연속적(중단되지 않은) 관련성에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 한 환자에서 최초 백신접종 3개월 후 기준치로부터 50%의 PSA 감소의 임상적 종말점은 소정의 양성 임상 결과로 간주된다. 이러한 종말점에 대한 기준을 충족하고 웨스턴 블롯상에서 항원에 대한 면역 반응도 가진 환자의 비율을, 이러한 기준을 충족하지 못하고 웨스턴 블롯상에서 항원에 대해 동일한 면역 반응을 발현하는 환자와 비교한다. 음성 임상 반응 및 항체를 갖지 않은 환자와 비교하여 양성 임상적 기준을 충족하고 항원에 대한 항체를 가진 환자가 현저히 증가한 경우, 상관성이 시사된다.

PSA 속도의 기울기는 정량적 연속 변수의 한 예이다. 이러한 평가에 있어서는, 치료 전에 소정의 시간간격에서 PSA 속도의 기울기를 치료후의 소정의 시간간격에서 PSA 속도의 기울기와 비교한다. 치료전 및 치료후 기간에 대하여 2주 마다 얻은 PSA 값은 본 계산에 대한 생데이터를 제공한다. 본 분석에 대하여, 기울기의 백분율 변화를 계산할 수 있다. 진행성 전립선 암은 기울기의 플러스 백분율 변화로서 정의된다. 양성 치료 결과는 기울기의 마이너스 백분율 변화로서 정의된다. 특이적 암종 항원에 대해 면역 반응을 가진 환자에서 기울기의 평균 또는 중간값의 백분율 변화를 분석하여 유의성을 평가할 수 있다. 이 분석은 모든 임상 데이터를 통합하며 정량적 분석이라는 것이 장점이다.

이러한 유형의 분석은 PSA, PSA 속도, 생존, 질병 없이 생존, 진행성 질환에 이르는 시간, 대체 요법의 개시까지의 시간, 삶의 질, 뼈의 통증 등을 포함한 모든 관련된 임상적 종말점에 대하여, 항원에 대한 면역 반응의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 상호관련화될 수 있는 항원에 대한 면역 반응의 유형은 항원의 존재에 한정되지 않으나, ELISA 또는 RIA와 같은 정량적 항원-특이적 항체 분석 및 CD4 증식 분석 또는 CD8 용해 분석과 같은 항원 특이적 세포 분석을 포함한다.

본 발명의 새로운 종양 관련 항원의 기타 용도는 피검자로부터 채취한 생물학적 샘플에서 종양 관련 항원을 검출하는 진단 방법을 포함한다. 이러한 검출 방법은 환자의 백신 요법에 대한 선택 및 최적의 요법을 가이딩(guiding)하는데 유용하다. 항체에 기초한 분석, 중합효소 연쇄 반응, 및 종양 관련 항원에 특이적인 핵산 하이브리드화 분석은 유용한 검출 방법의 비한정적인 예이다. 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 종양 관련 항원의 존재에 대해 분석한 다음, 본 발명의 적당한 종양 관련 항원 백신을 투여한다. 백신의 효능을 평가하고 돌연변이가 환자에서 암종 항원의 어레이를 변화시켰는지 여부를 평가하기 위하여 환자의 종양에 대한 반복 분석을 실시할 수 있다. 이러한 방법은 종양 특이적인 암종 항원에서 진단 및 치료 효능 검정으로서 효과가 있다.

환자의 면역계가 종양 관련 항원에 대해 면역 반응을 일으켰는지 여부를 검출하는 방법은 치료법을 관리하는데 유용하다. 이러한 방법은 재조합 종양 관련 항원 또는 상기 항원 유래의 면역원성 단편 또는 펩티드를 사용하는, 항체를 기초로 하는 분석(ELISA, RIA, 웨스턴 블롯), 항원 특이적 세포 분석법, 증식 분석, 세포 용해성 세포 분석, 생체내 지연형 과민증 시험을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석은 제 2상 용량 최적화 시험에서 면역계의 항체 또는 세포성 아암(arm)이 암종 항원 특이적 반응을 일으켰는지 여부를 결정하는데 유용하다. 이러한 분석 및 시험으로부터 얻은 정보는 암종 항원 백신의 용량 또는 투약계획을 변경시키는데 유용하고, 백신을 함유한 치료제를 의약품 허가에 대해 최적화하는데 유용하며, 개개 환자의 치료법에 유용하다.

대부분의 유용한 항체는 본 발명의 종양 관련 항원에 의해 생성된 것들이다. 그러나, 일부 경우에는, 본 발명의 종양 관련 항원에 의한 것이라기 보다는 밀접하게 관련있는 항원에 의해 유도된 교차 반응 항체가 존재할 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 새로운 종양 관련 항원, 세포, 및 종양 관련 항원 발현 및 종양 관련 항원 및 사이토카인 발현 자가조직 및 동종이형 종양 및 정상 세포를 포함하는 본 발명의 세포주에 관한 폴리클로날 및 모노클로날 인간, 키메라, 및 인간화된 항체의 제조를 포함한다. 이러한 항체는 본 발명의 진단 및 치료 방법에 사용되는 항체 함유 조성물 제조하는데 사용될 수 있다.

항체는 당업자에게 잘 알려진 기법에 의해 제조된다[참조: Harlow and Lane (eds.) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1988]. 특히, 본 발명에 따른 영속하는 종양 세포주에 대해 생성된 모노클로날 항체는 전립선 암과 같이 다양한 암의 검출 및 치료법에 유용하다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 악성 세포와 결합한다. 따라서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하나 이상의 종양 거부 항원 또는 하나 이상의 종양 관련 항원 및 그의 에피토프와 면역반응성을 나타낸다.

항체 분자의 예로서, 완전한 면역글로불린 분자, 실질적으로 완전한 면역글로불린 분자 또는 Fab, F(ab)², 및 F(v)를 포함하는, 항원 결합 부위를 함유한 면역글로불린 분자의 부분이 있다. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497; and Caㅡpbell, in Burdon et al., (eds.) (1985), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam]. 항체 또는 그의 부분은 키메라 항체, 단일 사슬 항체[참조: Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655-3659; and Milenic et al. (1991) Cancer Res. (1991) 51: 6363-6371], 및 인간화된 항체[참조: U.S. Patent No. 5,530,101]를 포함하여, 유전자 조작에 의해 생산될 수도 있다.

항체 또는 그의 부분은 면역요법제로서 사용될 수 있다. 항체 또는 그의 부분은 단독으로, 또는 당해 분야에서 공지된 화학요법제 또는 면역억제제와 병용하여 투여될 수 있다.

항체 또는 그의 부분은 악성의 초기 및 전이성 세포를 특이적으로 표적화하여 살해하는 면역독소로서 사용될 수도 있다. 면역독소는 2개 성분을 특징으로 하며, 특히 시험관내 또는 생체내에서 선택된 세포를 살해하는데 유용하다. 한 성분은 부착 또는 흡수될 경우 세포에 대개 치명적인 세포독성제이다. 투여 비히클로 알려진 제 2 성분은 독성 약제를 특정한 세포 유형, 예를 들어 악성 전립선 세포로송달하는 수단을 제공한다. 2개 성분은 통상적으로 잘 알려진 다양한 화학적 방법에 의해 서로 결합되어 있다. 예를 들면, 세포독성제가 단백질인 경우, 항체와의 연결은 이종이작용성 가교제, 예를 들어 SPDP, 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등에 의할 수 있다. 다양한 면역독소의 생산은 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982)]. 성분들은 쇼더리 등의 문헌[Chaudhary et al. Nature (1989) 339:394]에 기재된 바와 같이 유전자적으로 연결될 수도 있다.

다양한 세포독성제가 면역독소에 사용하기에 적합하다. 세포독성제는 방사성핵종, 예를 들어 요오드¹³¹, 또는 요오드의 다른 동위원소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이트륨⁹⁰, 테늄(Thenium)¹⁸⁸, 및 비스무트²¹²또는 기타 알파 방사체; 빈데신, 메토트렉세이트, 안드리아마이신, 탁솔, 및 시플라티넘(ciplatinum)과 같은 많은 화학요법제; 및 리보좀 억제 단백질형 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A), 리신(ricin), 디프테리아 톡신, 리신 A 사슬 등과 같은 세포독성 단백질[참조: Olsnes et al. (1982) Pharmacol. Ther. 25: 355-381; and "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin and Byers pp. 159-179, and 224-266, Academic Press, 1985].

진단 목적으로, 항체는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 다른 표지된 항체와 함께 사용될 수 있다. 다양한 표지, 예를 들어 방사성핵종, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드 등이 사용될수 있다. 다양한 유형의 면역분석법이 사용가능하며 당업자에게 잘 공지되어 있다.

또한 본 발명의 항체는 생물학적 샘플에서 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하기 위한 키트의 성분일 수 있다. 본 발명의 키트는 종양 관련 항원에 대한 표지되지 않은 제 1 항체를 포함하고 종양 관련 항원은 GVAX유형의 백신으로 처리된 개체의 혈청과 반응하지만, 백신으로 처리하기 전에는 개체의 혈청과 반응하지 않는다. 또한, 키트는 제 1 항체를 부착시키는 고형 지지체를 포함한다. 이 지지체는 플라스틱일 수 있다. 바람직하게, 이 고형 지지체는 접시, 슬라이드, 비드 또는 항체의 접착에 유용한 다른 구조체이다. 또한, 키트는 표지된 제 2 항체를 포함한다. 제 2 항체는 제 1 항체에 따라 지시될 수 있다. 예를들면, 제 1 항체가 인간, 인간화되거나, 인간 항체의 일부를 함유하는 키메라 항체인 경우, 제 2 항체는 항인간 항체일 수 있다. 또한, 제 1 항체가 비인간 포유동물에서 나온 경우에는, 제 2 항체는 이러한 비인간, 포유동물 항체에 따라 구체적으로 지시된다. 제 2 항체는 제 1 항체가 모노클로날 항체인 종양 관련 항원에 대해 상이한 에피토프에 따라 지시된 모노클로날 항체일 수 있다.

생물학적 지지체에 접착된 제 1 항체는 암에 대해 스크리닝되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 이러한 샘플은 내부에서 단백질 항원이 지지체 위의 항체를 인식하고 항체와 반응할 수 있는 형태로 개체 또는 세포주로부터 취해진 어떠한 샘플을 포함한다. 유용한 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 조직 생검재료, 척수액, 타액, 눈 분비물, 정액, 질 분비물, 분변, 소변, 복수액 또는 종양 세포주를 포함하나 이에한정되지는 않는다. 생물학적 샘플은 단백질 항원을 내부에 결합하기 위해 사용되도록 처리될 수 있다. 예를들면, 조직 또는 세포 샘플은 균질화에 의해 처리될 수 있다. 생물학적 샘플이 종양 관련 항원 또는 종양 관련 항원에 따라 지시된 제 1 항원과 교차 반응하는 항원을 함유하는 경우, 이 항원은 지지체 상에서 항체와 반응할 것이다. 제 1 항원 또는 종양 관련 항원의 다른 에피토프에 따라 지시된 제 2 표지된 항체를 첨가하는 것은 생물학적 샘플에서 종양 관련 항원의 동정을 가능하게 한다.

하기 실시예는 본 발명의 다양한 양상을 수행하도록 고려된 최상의 모드를 개시하는 것과 함께 앞서 설명한 발명을 사용하는 방식을 보다 완전히 설명하는 역할을 한다. 이러한 실시예는 본 발명의 실제 범위를 한정하는 어떠한 역할을 하지 않고 오히려 예시적인 목적으로 존재한다는 것이 이해될 것이다.

발명의 요약

신생물 세포 및 몇몇 정상 세포에 의해 발현된 특정한 종양 관련 항원은 특정한 시토카인을 발현시키는 종양 세포로 처리된 후 인간 암 환자의 면역계에 의해인식되는 것으로 발견되었다. 이러한 발견은 신규한 단리된 종양 관련 항원 및 이들의 동정 방법과 용도를 포함하는 본 발명을 개발하는 데에 이용되었다.

더욱 상세하게는, 첫 번째 일면에 있어서, 본 발명은 종양 관련 항원을 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 종양 관련 항원은 암 관련되어 있고, 또한 조직 특이적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "종양 관련"은 종양 세포상에서 발견되거나 이 세포에 의해 발현되지만, 과발현된 수준 또는 발생적으로 시기에 맞지 않는 수준으로 그 밖의 암세포 이외의 세포상에서 발견되거나 이들 세포에 의해 발현될 수 있는 항원을 의미한다. "종양 관련 항원"은 난소암에 의해 생성된 복수액, 폐암종에 의해 생성된 흉막 유출물 및 비고형 혈액 종양과 같은 고체상 종양과 액상 종양을 포함한다. "조직 특이적"이란 용어는 특정 조직 타입에서 주로 발견되는 항원을 의미한다.

본 발명의 동정 방법에 있어서, 단백질의 어레이는 생물학적 샘플로부터 제조된다. 몇몇 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 조직 생검재료, 척수액, 타액, 눈(lacrimal) 분비물, 정액, 질 분비물, 분변, 소변, 복수액 또는 종양 세포주이다. 바람직한 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈액이다. 그 밖의 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 종양 세포주이다. 특정한 양태에 있어서, 어레이는 단백질을 분자량에 따라 분리시킴으로써 제조된다. 몇몇 양태에 있어서, 단백질은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리된다.

제 1 혈청 샘플과 제 2 혈청 샘플은 면역계 강화제 및/또는 인핸서 및 종양관련 항원을 발현시키지만 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 피검자를 처리하기 전 및 후에 피검자로부터 각각 수득된다. 단백질의 어레이의 제 1 샘플은 제 1 혈청 샘플과 접촉하고, 단백질의 어레이의 제 2 샘플은 제 1 혈청 샘플과 접촉한다. 그 후, 단백질은 제 2 혈청 샘플과 반응하지만 제 1 혈청 샘플과는 반응하지 않는 어레이에서 동정되며, 반응성 단백질은 피검자를 백신으로 처리한 후 피검자에게서 면역 반응을 일으켰던 종양 관련 항원이다.

본원에서 사용된 용어 "증식능력이 없는"은 분열할 수 없지만, 종양 관련 단백질을 코드화하는 유전자를 발현시키는 세포를 의미한다. 한 가지 특정한 양태에 있어서, 단백질 어레이와 접촉하는 데에 사용되기 전에, 항체가 아닌 성분이 분리되도록 혈청 샘플이 정제된다.

본원에 사용된 용어 "면역계 강화제 및/또는 인핸서"는 면역 반응을 개시시키고, 향상시키고, 증강시키고, 높이고/거나 연장시키는 것과 관련있는 임의의 단백질 기초 분자를 포함한다. 몇몇 양태에 있어서, 강화제 및/또는 인핸서는 GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, CD2, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, B7, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, M-CSF, G-CSF 및/또는 ICAM 이다. 면역계 강화제 및/또는 인핸서는 몇몇 양태에서는 시토카인이고, 한 가지 바람직한 양태에서, 시토카인은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)이다. 다른 양태에 있어서, 백신은 두 개 이상의 면역계 강화제 및/또는 인핸서를 추가로 포함한다. 한 가지 특정한 양태에 있어서, 증식능력이 없는 종양 세포는 면역계 강화제 및/또는 인핸서를 발현시키도록 유전 공학처리되었다. 한 가지 특정한 양태에 있어서, 종양 세포는 GM-CSF를 발현시키도록 유전 공학처리되었다. 다른 양태에 있어서, 면역계 강화제 및/또는 인핸서는 종양세포 이외의 세포에 의해 발현된다. 한 가지 양태에 있어서, 종양세포 이외의 세포가 면역계 강화제/인핸서를 발현시키도록 유전 공학처리되었다.

몇몇 양태에 있어서, 종양 세포는 자가 종양 세포이다. "자가 종양 세포"는 환자에게서 발견되는 종양으로부터 수득된 세포이거나, 이러한 세포의 제 1 후손(descendent)이다. 다른 양태에 있어서, 종양 세포는 동종이형이다. "동종이형 종양 세포"는 피검자가 보유하고 있는 종양 세포와 동일한 타입의 종양 세포이지만, 관련없는 피검자로부터 유도된 확립 종양 세포주로부터 유도되거나, 관련없는 종양 타입으로부터 유래되지만 공통적인 종양 관련 항원을 공유하는 종양 유도된 세포이다.

한 가지 양태에 있어서, 피검자는 포유동물이다. 바람직한 양태에 있어서, 피검자는 신생물을 보유하는 인간이다. 본 발명의 특정한 양태에 있어서, 피검자는 인간 피검자이고, 생물학적 샘플과 종양 세포는 인간 기원을 지닌다. 한 가지 양태에 있어서, 인간 피검자는 전립선암에 걸려있고, 종양 세포는 하나 이상의 전립선 종양 세포주로부터 유래된다. 또 다른 양태에서, 환자는 결장 암을 갖고, 종양 세포는 하나 이상의 결장 암 종양 세포주로부터 유래한다. 또한, 다른 양태에서, 환자는 유방암을 갖고, 종양 세포는 하나 이상의 유방암 세포주로부터 유래한다. 또 다른 양태에서, 환자는 난소 암을 갖고, 종양 세포는 하나 이상의 난소 암 세포주로부터 유래한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 표본 내에서 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 상기와 같이 동정된 종양 관련 항원이 분리된다. 종양 관련 항원에 대해 유도된 항체가 제조되고, 종양 관련 항원이 면역 시스템 강화제 및/또는 인핸서를 포함하는 백신 및 종양 관련 항원을 나타내는 증식능력이 없는 종양 세포로 처리된 환자의 혈청과 반응하지만, 처리되지 않은 환자의 혈청과는 반응하지 않는다. 그 다음, 생물학적 표본은 항체에 접촉된다. 항원-항체 반응이 있는지 검출되고, 그러한 반응의 존재는 표본 조직내의 종양 관련 항원의 존재를 의미하며, 그러한 반응의 부재는 종양 관련 항원의 부재를 의미한다. 몇몇 양태에서, 생물학적 표본내의 종양 관련 항원은 종양 세포 상에 있다. 한 가지 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 또 다른 양태에서, 항체는 폴리클로날 항체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 생물학적 표본은 혈액, 혈청, 조직 생검재료, 척수액, 타액, 눈 분비물, 정액, 질 분비물, 분변, 소변, 복수액, 또는 종양 세포주이다.

한 가지 양태에서, 표본은 암종을 가진 환자로부터 취해지고, 항체는 SDS-PAGE에 의해 결정된 약 150 kD의 분자량을 갖는 종양 관련 항원에 대해 유도된다. 몇몇 양태에서, 표본은 전립선 암종, 유방 암종, 폐 암종, 결장 암종, 난소 암종, 또는 백혈병을 가진 환자로부터 취해진다.

또한, 본 발명은 분리된 종양 관련 항원을 제공한다. 몇몇 양태에서, 신규하고 분리된 종양 관련 항원은 SDS-PAGE에 의해 측정되는 경우 분자량이 약 250kD, 160kD, 150kD,130kD, 105kD, 60kD, 32kD, 31kD, 27kD, 26kD, 14kD 및 12kD이고, 전립선 특이 항원(PSA)과 면역학적으로 교차반응 하지 않는다. PSA를 나타내는 전립선암 환자로부터 혈청이 취해지는 경우 종양 관련 항원이 PSA와 교차반응 하지 않는다는 사실이 중요하다는 것을 이해할 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 항원은 암종 관련성이고, SDS-PAGE에 의해 측정될 때 약 150kD의 분자량을 갖는다.

본 발명의 다른 측면은 암을 치료하기 위한 개선된 백신 및 방법을 포함한다. 한 가지 양태에서, 백신은 종양 형성성이 아닌 본 발명의 하나 이상의 종양 관련 항원을 코드화하는 노출된 핵산을 포함한다. 몇몇 양태에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이고, 이들은 유전자 DNA 또는 cDNA이다. 한 가지 양태에서, 백신은 지질에 결합되거나 리포좀에 내포된 종양 항원을 코드화하는 DNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, 백신은 하나 이상의 면역 시스템 강화제 및/또는 인핸서를 코드화하는 핵산을 추가로 포함한다. 한 가지 양태에서, 강화제 및/또는 인핸서는 시토카인이다. 바람직한 양태에서, 시토카인은 GM-CSF이다. 몇몇 양태에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이고, 이들은 유전자 DNA 또는 cDNA이다.

다른 양태에서, 백신은 시토카인 및 본 발명의 신규한 종양 관련 항원 모두를 코드화하는 벡터를 포함하는 데, 항원은 자체로 종양 형성성이 아니다. 몇몇 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 신드비즈 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, SV-40 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터와 같은 폭스 바이러스 벡터이다. 바람직한 양태에서, 시토카인은 GM-CSF이다. 몇몇 양태에서, 벡터는 하나 이상의 시토카인 및/또는 종양 항원을코드화하고, 및/또는 동일한 시토카인 유전자 또는 종양 관련 항원 유전자의 하나 이상의 사본을 포함한다. 벡터는 본 발명의 몇몇 양태에서 적어도 종양 관련 항원의 면역성 부위 또는 항원 부위를 교대로 코드화한다.

다른 측면에서, 본 발명의 종양 관련 항원을 포함하는 백신이 제공된다. 몇몇 양태에서, 백신은 면역 시스템 강화제 및/또는 인핸서를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 이것은 시토카인일 수 있다. 특정 양태에서, 백신은 GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, B7, MIP-1α, MIP-2, M-CSF, G-CSF, 및/또는 ICAM을 포함한다. 바람직한 양태에서, 시토카인은 GM-CSF이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 종양 관련 항원을 나타내는 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 세포 기초 백신을 제공한다. 백신은 면역 시스템 강화제 및/또는 인핸서를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 백신은 GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, CD2, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, B7, MIP-1β, MIP-2, M-CSF, G-CSF, 및/또는 ICAM을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 백신은 시토카인을 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서, 시토카인은 GM-CSF이다. 몇몇 양태에서, 종양 세포는 강화제 및/또는 인핸서를 나타낸다. 다른 양태에서, 정상 세포는 강화제 및/또는 인핸서를 나타낸다.

특정 양태에서, 본 발명의 핵산-, 벡터-, 단백질-, 및 세포-기초 백신은 면역 형성 반응을 증강 또는 유력하게 하는 비변형, 증식능력이 없는 종양 세포 또는 비종양성 세포와 같은 보조 및/또는 조력(helper) 세포를 추가로 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에게 본 발명의 백신을 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 백신의 "치료학적 유효량"은 환자의 종양 세포에 대한 면역 반응을 끌어내어 환자내의 종양 또는 종양성 병소의 크기를 감소시켜 환자가 회복되고, 및/또는 전이성 세포가 파괴되는 양이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 시토카인 및 종양 관련 항원 또는 그것의 면역 형성 부위를 코드화하는 RNA, DNA, 유전자 또는 cDNA를 함유하는 벡터를 제공한다. 몇몇 양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, SV-40 벡터, 렌티바이러스 벡터, 신드비즈 바이러스 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터와 같은 폭스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 바람직한 양태에서, 코드화된 시토카인은 GM-CSF이다.

또한, 본 발명은 시토카인 뿐만 아니라 신규한 종양 관련 항원 또는 다수의 종양 관련 항원을 코드화하는 핵산이 형질 도입된 세포를 제공한다. 몇몇 양태에서, 코드화된 시토카인은 GM-CSF이고, 몇몇 양태에서, 신규한 종양 관련 항원은 암종 관련성이며 150kD의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 신규하고 분리된 종양 관련 항원은 약 250kD, 160kD, 130kD, 105kD, 60kD, 32kD, 31kD, 27kD, 26kD, 14kD, 또는 12kD의 분자량을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상에게 하나 이상의 본 발명의 백신을 투여함으로써 암을 방지하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 백신은 대상에게 근육 내로, 피부 내로, 또는 피하로 주사된다.

다른 측면에서, 본 발명은 시토카인을 코드화하고 종양 관련 항원의 적어도면역 형성 부위를 발현하는 DNA로 형질 도입된 신규한 종양 관련 항원 또는 세포와 반응성인 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플내의 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 종양 관련 항원에 대해 유도된 비표지 제 1 항체를 포함하고, 종양 관련 항원은 종양 관련 항원 및 GM-CSF를 나타내는 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 처리된 대상으로부터 수득된 혈청에 반응성이지만, 백신으로 처리되기 전의 대상으로부터 수득된 혈청에는 비반응성이다. 또한, 키트는 종양 관련 항원에 대해 유도된 제 1 항체를 부착하는 고형 지지체를 포함한다. 한 가지 양태에서, 고형 지지체는 플라스틱이다. 또한, 키트는 표지된 제 2 항체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 제 1 및 제 2 항체는 모노클로날 항체이다. 어떤 양태에서, 비표지 제 1 항체는 종양 관련 항원의 제 1 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체이고, 표지된 제 2 항체는 종양 관련 항원의 다른 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체이다. 특정 양태에서, 제 1 및 제 2 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태에서, 제 2 항체는 방사성 화합물, 효소, 또는 염료로 표지된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플내의 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 종양 관련 항원에 대해 유도된 비표지 제 1 항체를 포함하고, 종양 관련 항원은 종양 관련 항원 및 GM-CSF를 나타내는 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 처리된 대상으로부터 수득된 혈청에는 반응성이지만, 백신으로 처리되기 전에 대상으로부터 수득된 혈청에는 비반응성이다. 또한, 키트는 생물학적 샘플을 부착하는 고형 지지체를 포함하고, 샘플은 종양 관련 항원을 함유할 수 있다. 한 가지 양태에서, 고형 지지체는 플라스틱이다. 또한, 키트는 제 1 항체에 대해 유도된 표지된 제 2 항체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 제 1 및 제 2 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 양태에서, 제 1 및 제 2 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태에서, 제 2 항체는 방사성 화합물, 효소 또는 염료로 표지된다.

본 발명 자체뿐만 아니라 본 발명의 상기 및 기타 목적, 다양한 특징은 다음의 도면을 참조함으로써 하기로부터 더욱 상세하게 이해될 수 있다.

1. GVAX 백신을 사용하는 임상 실험

A. GVAX백신을 제조하기 위한 시토카인을 코드화하는 재조합 바이러스 벡터의 생성

하기 시토카인을 코드화하는 바이러스 벡터는 종양 세포주 또는 인간 종양으로부터 수득된 주요 종양 세포에 도입하기 위하여 제조되었다.

(1) 레트로바이러스 벡터

레트로바이러스 벡터는 당업계에 널리 이해된 표준 결찰 및 제한 기술을 사용하여 제작되었다. 중요한 시토카인을 코드화하는 유전자 또는 유전자들을 함유하는 다양한 레트로바이러스 벡터를 사용하였다. MGF 벡터는 1990년 10월 31일에 출원된 "내피 세포의 유전자 변형"이라는 제목의 U.S.S.N. 07/607,252호; 1991년 10월 31일에 출원된 "유전자 치료법에 유용한 레트로바이러스 벡터"; 및 1991년 10월에 출원된 PCT/US91/08121에 설명되어 있으며, 이들의 교시는 참고로 본원에 수록하였다. 또한 이들은 특히 시토카인을 코드화하는 유전자의 도입과 발현에 대한 참고로 하기에 설명된다. 또한, 여러가지의 MFG 벡터가 ATCC에 기탁되었다: 변형되지 않은 MFG 벡터는 ATCC 기탁 번호 제 68754호로서 기탁되었고; 인자 VIII 삽입물을 갖는 MFG 벡터는 기탁 번호 제 68726호로서 기탁되었고; tPA 삽입물을 갖는 MFG 벡터는 ATCC 기탁 번호 제 68727호로서 기탁되었다. 이러한 기탁은 특허 절차 및 특허 법령의 목적을 위해 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약의 규정 하에 이루어졌다.

MFG 벡터는 도 1c에 도시되어 있고 pEm 벡터와 유사하지만, 패키징 세포주에서 재조합 게놈의 캡시드화를 증가시키는, MoMuLV에 대한 gag 서열의 1038 염기쌍, 및 스플라이스(splice) 수용체 서열을 함유하는 MOV-9에서 유도된 350 염기쌍을 함유한다. Nco I 및 BamHI 부위를 함유하는 18 염기쌍 올리고누클레오티드가 MOV-9 서열 뒤에 오며, 적합한 부위에 유전자의 편리한 삽입을 가능하게 한다. 유전자의 코딩 영역은 Nco I 부위 및 BamHI 부위에서 MFG 벡터의 골격으로 도입되었다. ATG 개시제 메티오닌 코돈은 Nco I 부위로 프레임에서 서브클로닝되며, 존재한다면 정지 코돈 위에 서열이 거의 없어, 생성물이 불안정해지는 것을 피하고 암호 부위를 도입하는 것을 피한다. 결과적으로, 삽입물의 ATG는 야생형 바이러스ATG가 발생하는 부위에서 벡터에 존재했다. 따라서, 이 스플라이스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스에서 발생하는 것과 본질적으로 동일하며, 바이러스가 매우 잘 작용했다. MoMuLV LTR은 전사를 조절하고, 생성된 mRNA는 삽입된 유전자의 오픈 리딩 프레임이 직접 뒤따르는 음성 gag 전사체의 진정한 5' 비번역된 영역을 함유한다. 이러한 벡터에서, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 말단의 긴 반복 서열을 사용하여, 완전한 길이의 바이러스 RNA(바이러스 입자로 엔켑시데이션하기 위하여) 및 삽입된 서열의 발현을 담당하는 서브게놈 mRNA(Mo-MuLV env mRNA의 유사체) 양쪽 모두를 발생시켰다. 벡터는 env mRNA의 발생에 필수인 정상 5' 및 3' 스플라이스 부위와 바이러스 RNA의 엔캡시데이션을 향상시키는 것으로 보여지는 바이러스 gag 영역에서의 양쪽 서열을 보유하였다. 모든 올리고누클레오티드 접합은 디데옥시 종결 방법 및 T7 DNA 중합효소(시쿼나제(sequenase) 2)를 사용하여 서열화되었다. MFG의 구조는 도 1a에 나타나있다. 보여진 바와 같이, 바이러스는 이것이 지배적인 선택가능한 마커(하나가 임의로 삽입됨에도 불구하고)를 포함하지 않는다는 점에서 마커가 없으며, 높은 수준의 형질도입 효능과 벡터 구조내에서 고유의 발현이 주어진다면, MGF 유도체를 이용한 형질도입은 일반적으로 매우 긴 단계와 연관이 없거나 매우 긴 단계를 필요로 하지 않는다.

하기 단백질에 대한 유전자를 함유하는 MFG 벡터를 제조하였다: 뮤린 IL-2, GM-CSF, IL-4, IL-5, γ-IFN, IL-6, ICAM, CD2, TNF-α 및 IL-1-RA(인터류킨-1-수용체 길항제). 또한, TNF-α, GM-CSF 및 IL-2를 코드화하는 인간 서열을 제작하였다. 하기 하나 이상을 코드화하는 유전자를 함유하는 MFG 벡터를 제작할 수 있다:VCAM, ELAM, 마크로파지 염증 단백질, 열충격 단백질(예컨대 hsp60), M-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-β, B7, MIP-2, MIP-1 α 및 MIP-1 β.

MGF로 서브클로닝된 정확한 cDNA 서열은 다음과 같다: 뮤린 IL-2 염기쌍 49-564; 뮤린 IL-4 염기쌍 56-479; 뮤린 IL-5 염기쌍 44-462; 뮤린 GM-CSF (29) 염기쌍 70-561; 뮤린 ICAM-1 염기쌍 30-1657; 뮤린 CD2 염기쌍 48-1079; 뮤린 IL-1 수용체 길항제 염기쌍 16-563; 인간 TNF-α 염기쌍 86-788.

(2) 아데노바이러스 벡터

인간 GM-CSF(AVGM-CSF)를 형질도입한 아데노바이러스는 E3 영역에서 바이러스 게놈을 추가 결실시키면서 아데노바이러스 유형 5의 E1 유전자로 치환된 CM-CSF 발현 카세트를 함유한다. Ad5(기탁번호 제 M73260)에 대한 완전한 GenBank 서열에 따라, E1 영역에서 455 내지 3327을 결실시켰다. 번호매김은 말단의 전환된 반복서열의 제 1 염기에서 시작한다.

아데노바이러스 벡터는 당업계에 널리 이해된 표준 결찰 및 제한 기술을 사용하여 제작되었다. E3 결실은 야생형 300(H. Ginsberg 유래)(0 내지 27330) 및 dl324(Thimmappaya et al. (1982) Cell 31:543-551)(왼쪽 단부부터 21561) 사이의 재조합을 중첩시켜 도입되었다. GM-CSF 발현 카세트를 cre/lox 중개된 재조합에 의해 CRE8 세포에서 pAdlox MC hGM 및 E3 결실된 아데노바이러스 사이에 첨가하였다(Hardy et al. (1997) J. Virol. 71:1842-1949). pAdlox MD hGM은 pAdlox로부터 유도되며(Hardy et al.(1997) 및 pMD. G(Naldini et al, (1996) Science 272:263-267) 하기 서열을 함유한다: Ad5로부터의 0 내지 455, pBC12/CMV/IL-2(Cullen (1986) Cell 46:973-982)로부터 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 발현 유전자 프로모터/활성제(누클레오티드 위치 -670 내지 +72, GenBank 기탁번호 제 X03922), 인간 β-글로블린 엑손 2의 작은 영역 및 단축된 제 2 전구유전자 허서열(IVS2)(누클레오티드 위치 62613 내지 62720 추가 63088 내지 63532, GenBank 기탁번호 제 J00179), 엑손 3 및 인간 β-글로빈으로부터의 폴리아데닐화 신호(누클레오티드 위치 63532 내지 64297), 엑손 3에 삽입된 GM-CSF cDNA, SV-40으로부터의 제 2 폴리아데닐화 부위(위치 2681 내지 2534), (GenBank 기탁번호 제 J02400), 및 박테리아 서열 앞의 loxP 부위. GM-CSF cDNA는 플라스미드로부터 얻어졌다(분자 및 세포 생물학의 DNAX 연구소(Palo Alto, CA)). DNA 서열을 콘카나발린(Concanavalin) A-활성화 인간 T-세포 클론으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 포유 동물 세포에서의 기능 발현에 의해 분리되었다. 유전자의 완전한 서열을 포함하는, cDAN의 분리 및 특징은 과학 문헌에 기록되어 있다(Lee et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:4360-4364). 클론의 동정은 즉시 제한 엔도누클레아제 소화에 의해 입증되었다. MD 발현 카세트는 PCR에 의해 변형되어 IVS2의 다운스트림에 트랜스유전자를 삽입시키기 위해 Pm1I, EcoRI 및 BglII에 대한 제한 부위를 포함한다. GM-CSF cDNA를 Pm1I 및 pMFG-S hGM으로부터 BamHI를 사용하여 제거하고(Dranoff et al. (1997) Human Gene Ther. 7:111-123) MD 카세트의 PmlI 및 Bgl II 부위에 삽입하였다. 아데노바이러스(Ad GM 바이러스)에 혼입된 pAdlox MD hGM 플라스미드의 영역을 양쪽 가닥에서 서열화시켰다. 초기 바이러스 제작의 올바른 구조는 감염된HeLa 세포로부터 GM-CSF 제조를 위해 제한 분석과 ELISA 시험에 의해 확인되었다. 재조합 바이러스에 이후 2회의 플라크 정제를 행하였다. 플라크로부터의 재조합 바이러스는 제한 맵핑되었고 293 세포(미생물 기탁기관으로부터 인증된 세포)에서 성장시켜 두가지의 패시지를 확장시켜 연구용 바이러스 원액을 생성시켰다. 바이러스에서 GM-CSF 유전자의 서열은 연구용 바이러스 원액으로부터 제조된 바이러스 DNA의 직접적인 서열화에 의해 결정되었다. 최종적으로, 연구용 바이러스 원액으로부터의 재조합 바이러스를 미코플라즈마 및 불임증에 대해 시험하고, 양성임이 발견되었을때 마스터 바이러스 원액에 대해 세포를 감염시키기 위해 사용하였다.

B. GVAX백신 처리

(1) 자가이식 전립선 GVAX백신 시행

등록한 9명의 환자들은 18세 보다 연령이 많으며, 측정가능한 전이성 질환의 증거가 없이 또는 호르몬 치료 이전에, 수술 후 PSA 수준에서 두가지의 연속적 비정상적인 상승에 의해 규정되는 진행성 미세 전이성 전립선 암을 갖고, 1.0ng/㎖ 초과의 최소 PSA로 치료를 시작하였다. 병리학적 진단과 질환의 단계결정은 수술하는 동안 이루어졌다.

절제된 일부 종양을 일차 배양물에서 퍼지게 하고, GM-CSF 유전자를 갖는 MFG 바이러스 벡터로 형질도입시키고, 세포 증식을 못하게 하도록 방사선 치료를 하고, 자가 GVAX백신을 제조하기 위해 사용될 때까지 액체 질소에서 저장시켰다. 수술후 약 60일 후에, 백신은 임상 부위에 사용하기에 유용했다. 각각의 백신접종을 위해, GVAX백신을 제조하고 세포를 해동하고, 세척하고, 0.9% 염화 나트륨 용액 또는 2.5% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.9% 염화 나트륨 용액중에서 재현탁시켜 주입할 수 있도록 제제화시켰다.

수술후 약 60일 후에, 기준선 값을 얻고, 자가, 비형질도입된 세포에서의 제 1 DTH의 측정을 개시하도록 사전 백신접종이 계획되었다. 혈청을 취하고, PSA 수준을 RT-PCR로 측정하였다. 사전 백신접종 이틀 후에, 각 환자는 14일 마다 세번의 백신접종 주기를 통과하도록 계획되었다. 세번의 백신접종 후, 누적 독성의 증거가 없고 충분한 백신 세포가 남아 있다면, 환자는 6번의 백신접종을 위한, 세번 이하의 추가 백신접종을 수용하기에 적합했다.

백신접종 부위의 공간과 위치는 하기 표 2에 제시되었다. 각각의 투여량이 외래환자 기준으로 환자에게 투여되었고, 외래환자의 일부에서 방출전에 임상 관찰되었다.

표 II : 백신접종 기법

용량 레벨	주입된 용량	세포/ml	주입 부피	주입 회수
1	1 x 107	1 x 107	0.5 cc	2
2	5 x 107	2.5 x 107	0.5 cc	5

그리드 패턴(grid pattern)에 이어서 환자의 사지에 피내적으로 주입하였다. 각 주입은 가장 인접한 주입으로부터 니들 진입부에서 5 cm 이상 이격되도록 하였다. 용량 레벨 1에 있어서, 3명의 환자에게 각각 연속적인 사이클로 서로 다른 사지를 사용하여 하나의 사지에 주입하였다. 용량 레벨 2에 있어서, 6명 환자에서의 주입을 각각 연속적인 사이클로 두 개의 서로 다른 사지를 사용하여, 소정의 사이클로 두개의 사지 사이에 동일하게 나누었다. 제 0일에 제 1 백신접종을 하였고이후 제 14일, 제 28일, 제 42일, 제 56일 및 제 70일에 백신접종을 하였다. 이어서 국부적 및 전신적 독성 및 항종양 면역 반응의 유도에 대해 평가하였다. 또한 자가면역에 대한 증거를 평가하였다.

41회 완전 평가가능한 백신접종 전체를 수용한 8명의 백신접종된 환자사이에서 독성을 제한하는 어떠한 NCI CTC 용량도 관찰되지 않았다. 피내적 부위의 생체검사는 분명한 염증성 침입을 보여주었고, 효과적인 예비임상 모델에서 관찰된 것과 유사한 대식세포, 수상돌기 세포, 호산구 및 T-세포로 구성되어 있었다. 환자 중 100%는 형질도입되지 않은 자기유래 PCA 표적 세포에 대한 DTH 반응성을 나타내었다. 수술전의 정중 혈청 PSA는 28.85였고(6.7-7.5의 범위를 가진) 제 1 백신접종에서 정중 PSA 레벨은 0.65였다(0.1-30.4의 범위를 가진). 고감도 혈청 PSA에 의해, 6/8 환자를 수술후에 진행시키고 백신접종하였다: 평균 F/U 24 개월. 상기 연구는 효능을 추정하기 위해 보강된 단계 II 실험을 위한 생체내 GM-CSF 유전자-형질도입된 PCA 백신의 실현가능성, 외래환자 안정성 및 생활성을 입증하였다.

(2) 동종이형의 전립선 GVAX백신 실험

30명의 등록 환자들은 PSA 레벨의 2회 연속적인 비정상적 상승에 의해 정의되는 바와 같이 수술후에 진행성 미세전이성 전립선암을 앓고 있지만, 측정가능한 전이성 질환 또는 선행 호르몬 치료의 증거가 없고, 적어도 치료 시작시에 1.0 ng/ml을 넘는 기선 PSA를 가진 18세 이상이었다.

동종이형의 전립선암 세포주 백신을 GM-CSF/10⁶세포/24 시간 148 - 639 ng을 분비하도록 유전학적으로 변형시킨 동종이형 전립선암 세포주(LNCap 1740 및 PC-3)의 2개의 동일 세포 용량으로 구성하였다. 또한, 상기 백신을 GM-CSF/10⁶200 - 300 ng을 분비하도록 유전학적으로 변형시킨 3가지 상이한 조사된 자기유래 전립선암 세포주(LNCap, PC-3 및 DU 145)의 혼합물로 구성하였다. 백신의 각 바이알을 직접 주입할 수 있는 것으로서 글리세롤 및 인간 혈청 알부민중에 제조하였다. 세포주 백신접종의 용량을 하기 표 III에 제공하였다.

표 III : 백신접종 기법

세포주	주입된 용량	세포/ml	주입 부피	주입 회수
LNCap - 1740	6 x 107	3 x 107	2 x 1.0 cc	3 x 107세포로 2회
PC - 3	6 x 107	3 x 107	2 x 1.0 cc	3 x 107세포로 2회

소정의 백신접종 날짜에, 1.2 x 10⁸전체 세포(세포주 당 6 x 10⁷세포) 전체를 소정의 각각 1.0 cc씩 4회 내피 주입(세포주당 2회 주입)으로 주입하였다. 각 주입을 내피적 공간에 의해 피하적으로 완료하였다. 제 0일에 후속하는 백신접종 날짜에, 주입 부위를 순환시켰다. 1.2 x 10⁸세포의 전체 용량을 4회 주입으로 나누어서, 8주 동안 매주 1회 수행하였다.

치료 사이클 동안, 백신접종에 대한 국부적 전신 반응에 대한 평가를 백신접종한 당일에 수행하였다(1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 및 8주). 제 1 백신접종으로부터 출발시에, PSA 측정을 4개월 동안 매달 결정한 다음, 연구의 파트 2에서 2년 동안 4개월마다 결정하였다. PSA 레벨은 임상적으로 표시하는 경우 매 4개월 보다 더 자주 작성하였다. PCR 시험을 위한 혈액 샘플을 제 1 백신접종 이전에 뽑았다. 파트 1을 위한 최종 임검을 마지막 백신접종(8주)의 투여후에 2주 수행하였다.

1회 이상 백신접종을 수용한 등록 환자들은 이들의 PSA 검사와 함께 장기간 후속 평가에 참여하였다. 이들은 환자가 축거나 동종이형 전립선암 세포주 백신이 FDA에 의해 승인될 때까지 임상적으로 지시된 바와 같이 그후 물리적 검사 및 임상적 평가를 매년 또는 좀더 자주 가지게 될 것이다.

2.신규한 종양-관련 항원의 동정

A. 혈청의 제조

본 연구를 위해 사용된 혈청을 자기유래 또는 동종이형 전립선 GVAX백신 실험에서 백신접종 2시간 전과 최종 백신접종 2주 후에 환자로부터 뽑은 혈액으로부터 제조하였다.

B. 세포 용해질의 제조

전립선 간질세포, 전립선 상피세포, 전립선 평활근 및 폐 섬유아세포로부터 유도된 1차 세포주를 클론테닉스(Clontenics, San Diego, CA)로부터 구입하여 SCGM, PrEGM, SmGM 및 FGM-2 배지(Clontenics, San Diego, CA)중에서 성장시켰다. 세포들을 10% 우태아 혈청, 페닐실린/스트레파비딘 및 글루타민을 함유하고 있는 DMEM + F12 배지(JHR bioscience, Lenexa, KS)중에서 성장시켰다. 세포 밀도가 T-175 플라스크(Becton, Dickinson & Company, Franklin Lakes, NJ)중에서 80% 컨플루언스에 도달하는 경우, 세포를 PBS를 사용하여 2회 세척하고 나서베르센(Versene, Gibco BRL, Grand Island, NY)중에 10-30분 동안 인큐베이션시킴으로써 플라스크로부터 세포를 분리시켰다. 그런 다음 세포를 수확하고 탁상 원심분리기(CS-6R, Beckman, Palo Alto, CA)로 10분 동안 1,000 rpm으로 스핀 다운(spin down)시켰다. 세포를 PBS를 사용하여 3회 세척하였다. 비부착성 세포(주루카트(Jurkat) 및 말초 혈액 세포)에 있어서, 세포를 수확하고, 스핀 다운시키고, PBS를 사용하여 3회 세척하였다. 세척한 후에, 2 x 10⁷세포를 용해 완충액(10 mM 트리스 pH 7.4, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% NP40, 1 mM PMSF 및 1% 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(Cat. 539134, Calbiochem, San Diego, CA)) 1 ml을 사용하여 용해시킨 다음 얼음 위헤서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 불용성 세포 찌꺼기를 탁상 에펜도르프 원심분리기를 사용하여 4℃에서 30분 동안 원심분리시킴으로써 제거하였다. 상층액을 제거하고 BCA(Pierce, Rockford, IL)에 의해 단백질 농도를 측정하였다.

C. 웨스턴 블롯 분석:

세포 용해질 또는 정제된 PSA(Calibiochem, San Diego, CA)중의 지시돈 양의 단백질(25 - 35 ㎍/레인) 또는 다른 암-관련 마커들을 4-20% 농도구배 SDS-PAGE(Norvex, San Diego, CA)상에서 분리시킨 다음, 2-3시간 동안 25 mV 일정한 전압에서 트랜스블롯 장치(Xcell II, Blot Module, Norvex, San Diego, CA)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 전기-이동시켰다. 이동시킨 후에, 니트로셀룰로오스 막을 블로킹 용액(PBS중의 0.05% 트윈 20중의 10% 탈지유)을 사용하여 4℃에서 밤새 블로팅하였다. 밤새 블로팅시킨 후에, 막을 실온에서 2시간 동안 환자의 혈청(PBS + 0.05% 트윈 20중의 1:1000 희석액)과 함께 인큐베이션시킨 다음 PBS + 0.1% 트윈 20을 사용하여 5회 세척하였다. HPRT-컨쥬케이션된 염소 항-인간 IgM+G+A(Zymed, South San Francisco, CA, PBS + 0.05% 트윈 20중의 1:3000 희석액)를 1시간 동안 막과 인큐베이션시킨 다음 PBS + 0.1% 트윈 20을 사용하여 6회 세척하였다. 결과를 화학형광성에 의해 현상시켰다(예컨대, ECL 웨스턴 블로팅 시스템(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)을 사용하여).

등가물

당업자들은 일상적인 실험만을 사용함으로써 본 명세서에 특이적으로 기술되어 있는 본 발명의 특정 양태에 대한 많은 등가물들을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물들을 다음의 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims (22)

1. (a) 생물학적 샘플로부터 단백질의 어레이를 제조하는 단계;

   (b) GM-CSF와 종양 관련 항원을 발현시키지만 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 피검자를 처리하기 전 및 후에 피검자로부터 제 1 혈청 샘플 및 제 2 혈청 샘플을 각각 수득하는 단계;

   (c) 단백질의 어레이의 제 1 샘플을 제 1 혈청 샘플과 접촉시키는 단계;

   (d) 단백질의 어레이의 제 2 샘플을 제 2 혈청 샘플과 접촉시키는 단계;

   (e) 어레이에서 제 2 혈청 샘플과 반응하지만 제 1 혈청 샘플과는 반응하지 않는 단백질을 동정하는 단계를 포함하여 종양 관련 항원을 동정하는 방법으로서, 반응성 단백질이 피검자를 백신으로 처리한 후 피검자에게서 면역 반응을 유도시켰던 종양 관련 항원인 방법.
2. 제 1항에 있어서, 피검자가 인간 피검자이고, 생물학적 샘플과 종양 세포가 인간 기원을 지님을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 어레이가 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 단백질을 분자량에 따라 분리시킴으로써 제조됨을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 조직 생검재료, 척수액, 타액, 눈 분비물, 정액, 질 분비물, 분변, 소변, 복수액 및 종양 세포주로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 생물학적 샘플이 종양 세포주임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 증식능력이 없는 종양 세포가 자가세포임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 증식능력이 없는 종양 세포가 동종이형세포임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 증식능력이 없는 세포가 종양 세포주로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제 2항에 있어서, 피검자가 전립선암이 걸려있고, 종양 세포가 하나 이상의 전립선 종양 세포주로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 단백질 어레이에 접촉시키기 전에, 항체가 아닌 성분이 분리되도록 제 1 혈청 샘플과 제 2 혈청 샘플이 정제됨을 특징으로 하는 방법.
11. (a) 제 1항의 방법에 따라 동정된 종양 관련 항원을 단리시키는 단계;

    (b) 단리된 종양 관련 항원에 대해 유도되는 항체를 제조하는 단계;

    (c) 생물학적 표본을 항체와 접촉시키는 단계; 및

    (d) 항원-항체 반응이 일어나는 지를 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 표본 중에서 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하는 방법으로서, 항원-항체 반응의 존재가 생물학적 표본 중에 종양 관련 항원이 존재함을 나타내는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 생물학적 표본 중의 종양 관련 항원이 종양 세포상에 있음을 특징으로 하는 방법.
13. 제 11항에 있어서, 단계(a)의 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 단계(a)의 항체가 폴리클로날 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
15. 제 11항에 있어서, 생물학적 표본이 혈액, 혈청, 조직 생검재료, 척수액, 타액, 눈 분비물, 정액, 질 분비물, 분변, 소변, 복수액 및 종양 세포주로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
16. (a) 종양 관련 항원에 대해 유도된 표지되지 않은 제 1 항체 (여기서, 종양 관련 항원은 종양 관련 항원과 GM-CSF를 발현시키지만 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 처리된 피검자로부터의 혈청과 반응성이지만 상기 백신으로 처리하기 전의 피검자로부터의 혈청과는 반응성이 아님);

    (b) 제 1 항체를 부착시키기 위한 고형 지지체; 및

    (c) 표지된 제 2 항체를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하기 위한 키트.
17. 제 16항에 있어서, 고형 지지체가 플라스틱 지지체임을 특징으로 하는 키트.
18. 제 16항에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 키트.
19. 제 16항에 있어서, 표지되지 않은 제 1 항체가 종양 관련 항원의 제 1 에피토프에 대해 유도되고, 표지된 제 2 항체가 종양 관련 항원의 또 다른 에피토프에 대해 유도됨을 특징으로 하는 키트.
20. (a) 종양 관련 항원에 대해 유도된 표지되지 않은 제 1 항체 (여기서, 종양 관련 항원은 종양 관련 항원과 GM-CSF를 발현시키지만 증식능력이 없는 종양 세포를 포함하는 백신으로 처리된 피검자로부터의 혈청과 반응성이지만 상기 백신으로 처리하기 전의 피검자로부터의 혈청과는 반응성이 아님);

    (b) 생물학적 샘플을 부착시키기 위한 고형 지지체; 및

    (c) 제 1 항체에 대해 유도된 표지된 제 2 항체를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 종양 관련 항원의 존재를 스크리닝하기 위한 키트.
21. 제 20항에 있어서, 고형 지지체가 플라스틱 지지체임을 특징으로 하는 키트.
22. 제 20항에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 키트.