KR20010052377A - 치료용 물질을 압력 조절에 의해 선택적으로 전달시키는방법 및 캐뉼라 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장기의 조직적 또는 해부학적 특정 부위에 치료제를 선택적으로 전달하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 미리 정해놓은 세포 층(상피 또는 상피 하 공간)까지 물질이 도달하도록 제어된 압력, 부피 또는 유속으로 속이 빈 장기(간담도관 또는 담낭의 관강)안으로 치료제를 주입한다. 관강 안의 압력이 물질의 곧 이은 상피하 공간으로의 전달이 일어나는 미리 정해놓은 한계 압력 보다 높아지도록 물질의 부피 또는 유속을 조절할 수 있다. 그렇지 않으면, 한계 압력을 넘지 않는 낮은 압력을 선택하여 상피 층으로만 전달이 일어나도록 만들 수도 있다. 이렇게 부위에 특이적으로 전달을 하게되면 (예컨대, 장기의 중간에 들어있는 조직까지) 그렇지 않으면 몸 전체에 독성을 만드는 농도인 물질을 어떤 위치로 전달할 수 있게 만든다. 장기에서 나오는 정맥 또는 림프액 배액로를 폐색시키면 치료제가 몸 전체로 퍼지는 것을 막을 수 있고, 얕은 상피 층으로 의 선택적 전달성을 향상시킨다. 유전자 표현이 필요한 경우에는 유전자 벡터를 세포로 훨씬 좋게 전달시킨다. 이 접근 장치는 관강의 벽을 뚫고 들어가는 투관침을 가지고있는 캐뉼라로 구성된다. 하나의 축으로 늘어선 두 개의 팽창 가능한 벌룬이 벽면에 접촉되어 캐뉼라를 지지하고 뚫린 부위를 밀봉한다. 폐색용 벌룬이 장치된 카테터는 케뉼라를 통해 치료제를 전달하려고 하는 부위까지 뻗어간다.

Description

치료용 물질을 압력 조절에 의해 선택적으로 전달시키는 방법 및 캐뉼라{METHOD FOR PRESSURE MEDIATED SELECTIVE DELIVERY OF THERAPEUTIC SUBSTANCES AND CANNULA}

치료용 제제들을 목적하는 장기 또는 조직에 국소적으로 전달하는 방법은 부작용을 최소화하면서 약물을 전달하기 위한 매우 바람직한 기술이다. 미국 특허 제 5,087,244호에는 이러한 목적한 약물 전달법의 한 예로 여기서의 맥관 내(endovascular) 카테터는 혈관의 내벽과 접촉되도록 부풀려지는(팽창되는) 벌룬(ballon)을 가진다. 이 약물은 벌룬 안에 있는 미소한 구멍을 통해 전달되는데. 이 벌룬은 혈관 벽면과 가깝게 접촉되고 있다. 미국 특허 제 5,282,785호에는 또 다른 맥관 내 약물 전달 카테터가 기재되어있는데 접촉되어있는 카테터와 관벽(lumen wall)을 관통하여 약물을 전달시키기 위해, 팽창 가능한 벌룬이 카테터의 구멍 뚫린 약물 전달 부분을 맥관 벽면의 방사형 부분과 잘 접촉되도록 만든다. 혈관 주입을 통해 치료를 하기 위해서, 벌룬들 사이에 혈관의 일 부분을 고립시키기 위해 한 쌍의 팽창 가능한 벌룬들을 가지는 카테터에 관한 미국 특허 제 5,662,609호 및 치료하기 위해 맥관 벽의 일부와 접촉시키기 위해 하나의 팽창 가능한 벌룬을 사용하는 미국 특허 제 5,674,192호를 참조하기 바란다.

미국 특허 제 4,781,677호와 5,514,088호에는 담낭 안에 위치한 카테터를 통해 용매(메틸 3차 부틸 에테르)를 담낭으로 직접 주입하므로써 담석을 치료하는 방법이 기재되어있다.

미국 특허 제 5,720,720호에는 뇌의 연조직 안으로 약물(화학 요법제 같은)을 고속(high flow) 미세 주입하는 방법이 기재되어있다. 이러한 방법을 이용하여, 카테터를 뇌의 종양에 삽입하고 비교적 균질하고 다공성인 뇌 매질을 통해 물질을 빠르게 확산시키기에 충분한 유속으로 카테터를 통해 화학 치료제가 주입된다.

그러나, 이들 중 어떠한 방법 또는 장치도 장기 내에 있는 해부학적으로 미세한 특정 영역 또는 쎌 타입에 치료용 물질(약물 및 DNA벡터 같은)을 선택적으로 전달하는 것에 관해서는 언급하지 않았다. 이것은 많은 질병들이 해부학적으로 미소한 특정 영역 또는 세포 영역에 국한되는 비정상성을 갖기 때문에 중대한 결점이 된다. 치료용 물질을 충분한 농도로 국한된 영역에 닿게 하기 위한 일반적인 몸 전체에 퍼지게 하는(systemic) 전달 방식은 독성을 퍼지게 하는 원인이 될 수 있다. 약물 및 유전자 치료 벡터를 몸 전체에 퍼지게 하는 전달 방식은 부위에 직접 전달하는 방식 보다 훨씬 효과가 덜한데 이는 선택적 전달 방식은 약물 또는 벡터를 이것이 작용하려는 조직에 직접 주입시키기 때문이다. 부위에 특이적인 전달 방식은 조직에 특이적인 리간드를 이용하므로서 어느 정도까지 성취할 수 있으나 확인된 리간드의 이용 가능성 및 알려진 리간드의 특이성의 정도는 몸 전체에 퍼지게 하는 전달 방식의 부정적 효과를 막기에는 불충분하다. 이러한 리간드를 발견하고 디자인하는 것은 복잡하고 시간 소모가 크며 비용이 비싼 과정이다.

그러므로, 본 발명의 목적은 치료(진단 포함)제를 국부적이고 조직- 또는 세포에 특이적으로 전달하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

압력을 조절하면서 치료제를 몸의 관강(lumen)(담낭, 간담도관, 위장관, 요생식로, 호흡관, 동맥, 정맥 또는 기타 관상형 부위 같은)으로 주입시키므로서 치료제를 향상되게 부위-, 장기-, 조직- 및 세포-에 특이적으로 전달될 수 있다. 특히, 약물이 관 안으로 전달되는 조건들(압력/유속/부피)을 조절하므로서 액상 제제를 관강 벽면의 특정 깊이의 조직까지 전달할 수 있다는 것을 발견하였다. 비교적 낮은 압력으로 가압시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 비교적 낮은 압력으로 가압시킬 수 있는 속이 빈 장기의 폐쇄된 영역 안으로 제제를 투여하면 상피 세포의 정단(epical)표면 같은, 장기의 얕은 층에 약물을 특이적으로 전달 할 수 있게 만든다. 처음부터 최소한 역치점 위의 높은 압력/유속/부피에서 약물을 주입하면 해부학적으로 미세한 막을 부술 수 있고 더 깊은 층, 상피하 공간까지 약물을 선택적으로 전달 할 수 있다. 상피하 공간으로 전달을 하면 약물을 세포 및 기타 해부학적 구조물(간 안에 있는 동양 혈관(sinusoids) 같은)의 기본 표면에 접근되도록 만든다. 따라서, 본 발명에 따라 약물을 국소 투여하면 부위(및 쎌 타입에도)에 특이적으로 약물을 전달시킬 수 있다.

본 발명의 일면은 얕은 상피 세포의 정단 표면 또는 상피하 공간 같은 특이적인 쎌 타입 또는 깊이까지 약물 전달을 유도하는 조건들(압력 및 유속 같은)을 결정하는 방법이다. 맥관 부위의 경우, 내피 세포의 정단 표면까지 전달되며 또는 맥관 내막 또는 중막(media) 같은 특이적 조직 소실까지 전달된다. 어떤 구체 예로, 이 방법에는 폐쇄된 장기 공간(담낭의 관강, 간담도계, 또는 귀밑샘 또는 췌장관 같은)을 고립시키므로서 폐쇄된 압력 시스템을 형성하는 것이 포함된다. 폐쇄 시스템 안에 있는 해부학적으로 미소한 소실(세포들 사이에 있는 폐쇄막)이 파괴되는 한계 압력을 결정하기 위해 점도가 미리 정해진(염류액 같은) 테스트 유체를 미리 정해놓은 유속(또는 부피)으로 폐쇄 시스템 안에 주입한다. 그런 다음 약물을 상피 하로 또는 전신에 영향을 주도록 투여하는 것을 피하기 위해 치료용 물질을 피크 압력을 초과하지 않는 유체의 일부분으로서 투여한다. 그렇지 않으면, 물질을 상피하 공간(전신에 영향을 주는 것을 포함하여)까지 투여하려면 고의로 피크 압력을 초과하게 만들 수 도 있다.

또 다른 구체 예로, 두 번째 피크 압력(첫 번째 피크 압력보다는 낮은)을 알아내기 위해 테스트 유체를 첫 번째 투여하고 난 뒤 두 번째 테스트 유체를 투여한다. 그런 다음 두 번째 피크 압력을 초과하지 않으면서 유동하는 유체의 일 부분으로서 치료 물질을 장기 안으로 투여하면 최적의 상태로 약물을 몸 전체로 퍼지지 않게 만들 수 있다. 다른 한편으로, 선택적으로 전신에 투여하기 위해서는 치료용 물질을 두 번째 피크 압력과 같거나 또는 이를 초과하여 흐르는 유체의 일 부분으로서 장기의 공간 안으로 투여한다. 속이 빈 장기가 간담도 관(hepatobiliary tract)인 특별한 예에서는, 흐르는 동안 피크 압력을 초과하지 않게 선택적으로 투약하면 물질을 담관 세포(관 안을 싸고 있는 상피세포)까지 전하는 반면, 피크 압력과 같거나 이를 초과하게되면 물질을 간세포 및 간 안에 있는 동양 혈관(sinusoides)까지 전달하게 된다(상피하 공간에서부터 관의 관강을 분리하는 폐쇄막같은 해부학적으로 미세한 파괴된 구조물을 통해 물질을 이동시키므로서).

본 발명의 또 다른 일면은 세포를 손상시키거나 또는 제제가 몸 전체에 퍼지지 않도록 하면서 속이 비어있는 내장의 내부 또는 관강 같은 속이 빈 가압 가능한 장기의 공간 안으로 압력을 조절- 또는 미리 정해 놓은 상태에서 제제를 전달하는 방법인데, 타겟은 내부 세포의 얕은 층(양면을 갖는 상피세포의 정단 표면 같은)이거나 또는 더 깊은 조직 부위(상피 하 공간 같은)이다. 특별한 예로, 미리 정해놓은 압력이란 정상적이고 생리적인 관의 내부 압력 보다 약간만 높으며, 첫 번째 한계 피크 압력보다는 낮다(또는 보다 특수한 경우에는 두 번째 한계 피크 압력보다 낮다). 이 전달 압력은 예컨대 상피에 특이적이게 전달하기 위해서는 정상적인 생리학적 관의 내부 압력보다 약 2 - 5mmHg 이상 높지 않다. 맥관이 아닌(non-vascular)전달 시스템의 경우에는, 일정한 압력(항압, constant pressure)은 5 - 100mmHg(예컨대, 25 - 75, 또는 약 50 mmHg, 또는 최소한 5, 25, 50 또는 100 mmHg), 이며 맥관 전달인 경우에는 항압은 5 - 400mmHg(예컨대, 5 -200mmHg, 5 - 100mmHg, 또는 최소한 5, 25, 50 또는 100 mmHg)이다. 특수한 예로, 전달 압력은 정상적인 생리적 조건하에서 약물이 상피하 공간까지 접근되는 것을 억제하는 상피세포들 사이의 폐쇄막 같은 해부학적으로 미세한 구조물들을 파괴시키기 위한 한계 압력보다 낮다.

또 다른 구체 예로, 주입물이 관의 내부 공간 안에 들어가 있게 만들도록 정해진 일정한 주입 압력으로 유체를 투여한다. 그렇지 않으면, 폐쇄막이 파괴되어 관 내부의 상피 하 또는 관 내부의 내피 하 압력 구배(pressure gradient)에 따라 상피 하 또는 내피 하 조직 소실들에까지 운반되도록 일정한 주입 압력을 선택할 수 있다. 치료용 제제를 전달하기 위해 압력 구배를 이용하는 것이 특히 바람직한데 이는 확산에 의해 대량의 거대 분자들을 분포시키는 것은 한계가 있고 그러므로서 약물 및 기타 잠재성 치료제들을 타겟 부위에 효과적으로 전달할 수 없게 만들기 때문이다. 다른 한편으로, 조절이 안된 매우 높은 압력을 이용하면 약물 또는 입자들을 거의 충격적으로 전달하게 되며 이렇게 되면 치료하려고 하는 조직에 외상을 입히게 될 수 도 있다. 본 발명의 특별한 구체예는 미립자가 아닌 분자(직경이 500nm 까지인)를 상피 하 또는 내피 하 조직 소실에 선택적으로 전달하기 위해 조절된 압력 구배를 이용하는 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이 열린 폐쇄막에 일정한 속도 또는 일정한 압력으로 투여하는 방법을 이용하므로서 분자들이 이동하는 경로가 만들어진다. 다른 한편으로, 이 경로는 약물에 의한 또는 전기적으로 파괴시키는 것 같은 공지된 방법에 의해 만들어지거나 촉진되며, 치료용 제제를 보다 효과적으로 상피 하 또는 내피 하 소실에 전달시킬 수 있도록 하기 위해 본 발명에 활용된다. 이것을 통해 압력 구배에 따라 분자들이 이동하는 통로를 약물을 이용해 만들어내는 한 예는 Zona Occludens Toxin(Zona Occludens Toxin에 관한 정보, 미국 특허 제 5,864,014, 4,827,534, 5,664,389호 참조)을 이용하는 것이다.

주는 맥관 과 받는 맥관의 직경이 같지 않기 때문에 두 맥관 사이를 접합시키기 위한 외과적 맥관 수술을 때때로 까다롭게 만들기도 한다. 이와 유사하게 정관 절제 또는 난관 결찰을 복원하기 위한 외과 수술에서 정관 또는 난관에서 효과적으로 재접합시키기에 충분히 넓은 부분들을 찾아내야 하는 것 때문에 까다롭다. 따라서 관형 구조물을 팽창시킬 수 있는 방법이 의학적으로도 유용하며 도움을 받을 수 있다. 본 발명의 장치는 관형 구조물(혈관 또는 도관) 또는 내장을 그 직경이 미리 정해놓은 단면적을 갖도록 하는 정도까지 확장시키는데 사용할 수 있다. 이러한 팽창은 생체 내 또는 생체 외에서 실행될 수 있으며 곧이어 주고받는 구조물사이를 문합시킨다(anastomosis). 본 발명의 또 다른 구체예에서, 이렇게 팽창시키는 것과 함께 약물, 유전자 벡터 또는 기타 치료용 제제들을 연속하여 관강 안으로 주입시켜주는 및/또는 받는 구조물까지 주입한다.

압력 구배를 만들어내므로서, 특히 분자들을 장기 내에 있는 미리 선택해 놓은 부위(특정한 조직 층)까지 직접 전달하도록 선택된, 조절된 압력 구배를 만들어내므로서 분자들을 다른 조직 소실까지 전달하는데 압력을 이용할 수 있다. 이 구배는 구조물의 두 소실 사이의 압력 차를 조절하는 것이 포함된다. 따라서, 관상 또는 관형 구조물의 경우, 튜브의 관강과 더 깊은 구조물 사이에서 압력 구배가 생길 수 있다. 상피 장기 또는 관의 경우에, 이 압력 구배는 상피세포의 최외막 표면과 고유층(laminar propria) 또는 장막 사이에서 만들어질 수 있다. 맥관 구조물인 경우에는, 이 압력 구배는 상피세포의 최외막 표면과 민무늬 근육층 또는 외막 사이에서 만들어질 수 있다. 이 압력 구배는 더 깊은 구조물에서 보다 관강 안에서의 압력을 높게 거는 것으로 이루어지거나, 그렇지 않으면 구조물의 안쪽에서 보다 바깥면 쪽의 압력을 더 높게 걸므로서 이루어 질 수 있다. 본 발명은 두 형태의 압력 구배 발생을 모두 포함 하므로서 주입을 구조물의 안쪽에서부터 바깥쪽으로 또는 바깥쪽에서부터 안쪽으로 유도할 수 있게 만든다. 두 번째의 경우는 별개의 관강을 갖는 구조물(혈관, 호흡관, 위장관, 방광 등)뿐 아니라 그렇지 않은 것(예컨대 신경) 구조물이 특이 이용된다. 구조물의 외부 표면(완전한 외곽 부위 같은)을 분리하고 가압하기 위해 해부학적 구조물 주위를 둘러싼 외부 커프에 의해 압력이 가해 질 수 있다

관강 내의 압력을 조금만 올려도 상피세포 또는 내피세포에 의한 흡수 및 이동을 증대시킬 수 있고, 역시 외부 압력을 증가시키면 예컨대 외막, 장막, 신경 외막 등과 같은 외부 표면 세포에 의한 흡수 및 이동을 증가시킬 수 있다. 두 종류의 압력 구배를 이룰 수 있게 하는 특별한 장치가 본 발명에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 일면은 기본적인(생리적으로) 관내 부피/압력(예컨대 씨스틱 덕트가 폐색된 담낭의 생리적 압력)보다 실제로 낮은 부피/압력으로 약물을 투여하면 매우 소량만이(또는 전혀) 상피세포로 전달 될 것이다. 장기 안으로 카테터를 주입하고 그곳에서부터 분비액(담즙 같은)을 흡입해 내므로서 관 내 압력을 생리적 수준 이하로 낮출 수 있다. 압력/부피가 기본적인 관 내 부피/압력(예컨대, 장기를 막고 담낭 안에 있는 담즙과 같이 장기 안에 있는 액체 성분들을 흡입해 낸 직후의 압력) 쪽으로 증가하게 되면 상피 세포 쪽으로의 전달도 증가하게 될 것이다. 압력/부피가 기본 압력/부피 보다 훨씬 높을 때는 상피 하 전달이 일어날 것이다.

본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 결과적으로 치료물질을 외피 세포로 또는 상피 하 공간 및 세포로 선택적으로 전달시키도록 주입 파라메타들(유속, 압력 및 부피 같은)을 조절하면서 치료용 물질(미립자 형태가 아닌 유기 화합물 같은)을 몸 안의 상피세포로 안이 대어진 관강 내로 주입하여 전달시킨다. 여러 가지 방법으로 주입을 적당히 조절할 수 있다. 예를 들면 이렇게 주입하는 것은 특정 압력(예컨대 기본 압력에 대해 증가된 압력)에서만, 또는 일정 범위내의 압력에서만 실행될 수 있는데, 이 특정 압력이란 상피 하 공간으로의 전달을 최대화시키기 위한 것이거나 또는 피하기 위한 것이다. 이와 유사하게, 특정한 한계(최고치)압력에 도달할 때까지 필요한 기간동안 유지되는 주어진 유속으로 주입하게된다. 일단 피크 압력에 도달하게 되면 동일한 유속으로 계속 주입이 되더라도 압력은 감소한 상태에서 계속 유지된다. 얕은 세포까지만 전달하기에 충분한 정도로 관을 채우거나 또는 더 깊은 공간 및 세포까지 전달하기에 충분하게 과하게 채우도록 특정 부피를 특정 속도로 주입하므로서 주입량을 조절할 수 있다.

고압식 주입법을 통해 약물을 몸 전체로 전달하는 것이 바람직한 경우도 있다. 본 발명의 방법은 화학 치료용 물질을 직접 동맥 안으로 전달하는 것과 같은 공격적인 맥관 방법 대신 사용될 수 도 있다. 맥관 내 전달 방식( 및 혈전증에 수반되는 문제점) 대신에 상피 하에 전달되도록 의도된 압력에서 속이 빈 가압된 내장 또는 도관(간담도계 또는 귀밑샘관 같은) 안으로 약물을 주입하므로서 장기에 직접 전달할 수 있다. 타겟에 전달하기 위해 맥관 내(간 동맥 주입에서와 같이)로 투여하는 방법을 피하면 내피의 손상 문제 및 이에 수반하는 병적인 문제들을 제거할 수 있으며 어떤 약제를 심장 혈관 시스템에 직접적으로 전달할 때 고질적으로 생기는 온 몸에 널리 퍼지게 전달되는 것을 피할 수 있게된다. 약물을 상피 하로 전달시키기에 충분한 압력에서 주입할 때에도 장기를 더 고립시키고 약물이 몸 전체로 넓게 퍼지는 것을 막기 위해서 담낭 내로 전달하는 것을 정맥을 일시적으로 폐쇄하거나 또는 림프액을 빼내는 것과 함께 할 수도 있다.

다양한 방법으로 특정한 제어 파라메타들을 결정할 수 있다. 예컨대 몸의 관내의 기본 부피 또는 한계 압력은 미리 결정해 놓은 주입 속도에서 샘플 집단에서 측정하므로서 결정된다. 측정 당시의 기본 수치는 키 및 몸무게 같은 인구 통계 데이터로 다시 보정될 수 있다. 이런 다음 예를 들어 해부학적으로 미세한 파괴가 일어나는 한계 압력을 초과하도록(또는 초과하지 않도록) 예견된 선택된 유속에서 특정한 부피를 주입시키므로서, 미리 정해진 변수들에 따라 주입을 조절하게 된다.

또 다른 구체예에서, 표면 세포에서 깊이 들어간 공간으로 전달이 시작되는 임계 압력을 결정하기 위해 먼저 불활성인 주입물을 사용할 수 있다. 이러한 예에서 불활성 주입물을 주어진 속도로 몸 안의 주어진 관강 안으로 주입하고 주입이 멈추는 시간에 압력의 최고치에 달하고 이를 통과할 때까지 관내 압력을 추적한다. 불활성 주입물을 최소한 다시 한번 다시 주입하고 최고 압력을 다시 측정한다. 이렇게 마지막으로 측정된 최고 압력을 주입물이 표면 세포에서부터 안으로 들어가지 시작하는 압력 수준으로서 취하게 된다. 만일 표면 세포까지만 전달되는 것이 필요하다면 그 동안 마지막으로 측정된 피크 압력을 초과하지 않는 주입법을 통해 치료제를 계속 주입한다. 만일 표면 세포에서 깊이 들어간 공간 및 세포에까지 전달 할 필요가 있다면 최소한 주입 초기에 그 동안의 주입 압력 이 최종적으로 측정된 최고 압력에 부합되거나 또는 초과하는 주입법으로 치료용 제제를 계속 주입한다.

본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 전달되는 치료용 물질은 약물일 수 있다. 확실한 예에는 화학 요법제, 항-염증성 약물, 및 바람직하지 못하게 몸 전체로 퍼지는 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 갖는 모든 약물(cytoxan 같은 암 치료용 화학 요법제 및 코르티코스테로이드를 투여해야하는 담즙성 간경변 치료를 포함하는)이 포함된다. 다른 한편으로, 치료용 제제는 낭성 섬유증 같은 유전적 장애를 교정하기 위한 유전자를 포함하고있는 아데노 비루스 벡터 같은, 유전자 치료법에 이용하기 위한 DNA 벡터일 수 있다. 이 벡터 또한 (a) 상피 세포 또는 상피 하 세포까지(또는 모두); (b)내피 세포, 죽상판의 포말 세포, 및/또는 민무늬 근육 세포; (c) 구조물의 최외각 표면층의 세포 및/또는 그 밑에 있는 세포(또는 모두); (d) 신경 세포 또는 아교 세포; 또는 구조물 내에 있는 기타 쎌 타입을 포함하는 특정 세포를 특이적으로 타겟으로 삼을 수 있으며 따라서 또 다른 특이성을 제공하게 된다. 이 벡터는 어떤 극성 세포의 특정 표면(극성 상피 세포의 바닥(basal) 표면과 정단 표면 같은)에서만 발견되는 수용체에 특이적으로 타겟되므로서 특정 표면에 인접한 공간으로 전달이 이루어지는 경우에만 이 벡터가 특정 극성 세포에 의해 흡수된다.

본 발명의 한 가지 유용한 구체예는 비교적 낮은, 피크 압력보다 낮은 전달 압력으로 간담도계 내에서 유전 물질을 정단 상피세포 또는 담관 세포에 특이적으로 전달하기 위한 것이다. 치료 물질의 이러한 표면적인 전달법은 특히 원발성 담즙성 간경변증, 경화성 담도염 및 MAI,크립토스포리움 감염같은 AIDS와 연관된 담관 질환 등과 같은 질병에 특히 바람직하다. 다른 한편으로, 한계 압력보다 훨씬 높은 압력으로 간세포와 담관 세포를 합쳐 전달하거나 또는 상피 하까지 전달할 수 도 있다(크기가 큰 간 담도의 내부 또는 외부의 경우에는 고유층 같은 Ito, Stellate, Kuppfer 세포까지 또는 간에서의 기타 상피 하 세포까지). 예컨대 간 세포성 암 및 간 섬유증 같이 치료용 약물이 간세포를 타겟으로 하는 경우인 질병에서는 더 깊이 침투하는 것이 필요하다. 담관암인 경우에는, 담관 세포 뿐 아니라 더 깊은 상피 하 쎌 타입 모두를 타겟으로 하는 효과가 있다. 담도계 바깥에서는 항-염증약을 고유층 까지 전달하는 것이 필요한 크론병 같은 질병을 치료하기 위해 직접 상피 하로 전달하는 방법이 이용된다. 이와 유사하게, 인터루킨-8(IL-8)같은 프로-염증약 또는 시톡산(cytoxan)같은 화학 요법제를 직접적으로 상피 하로 전달하는 것이 방광암을 치료하는데 사용될 수 있다.

특정한 내부 층 또는 외부 층에 한정하여 전달하는 방법이 어떤 환경에서는 유용할 수 도 있다. 예컨대, 내장, 기타 관형 구조물(상피 세포) 또는 맥관 구조물(내피 세포)의 빈 공간의 안쪽 면을 덮고있는 세포들에 국한하여 관내로 전달하는 방법이 유용할 수 있다. 상피 세포로만 전달하는 예로는 어떤 악성인 상태를 치료하는 상피세포만을 타겟으로 하는 인터루킨- 8 같은 프로-염증제를 투여하는 것이 있을 수 있다. 유사하게 어떤 맥관 질환을 치료하는데 내피 세포에만 국한하여 전달하는 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일면에는 치료용 제제를 타겟 까지 전달하기 위한 접근식(access) 케뉼라 및 카테터 또는 접근식 포트(port)가 포함된다. 이 케뉼라는 멀리 있는 말단부와 인접해 있는 말단부를 가지고 있으며 몸 안의 원하는 관강의 벽, 예컨대 방광 또는 창자 같은 속이 비어있는 장기 의 벽면을 뚫고 들어가는 끝이 뾰족한 투관침을 가지도록 형성된 관강을 포함한다. 이 케뉼라는 이것의 축을 따라 배치된 한 쌍의 벌룬을 더 포함하는데 그러므로서 이들을 팽창시키면 장기의 안쪽과 바깥쪽에서 서로 마주보며 위치하게 된다. 안쪽 벌룬이 팽창되고 나면 첫 번째 벌룬이 몸 안의 관강 내벽에 대해 꼭 맞아질 때까지 카테터를 약간씩 빼낸다. 그런 뒤 두 번째 벌룬을 팽창시키는데 그 동안 몸의 관강의 내벽에 대해 첫 번째 벌룬이 꼭 맞게 유지되도록 충분한 텐션을 유지시킨다. 이렇게 하므로서 두 개의 팽창된 벌룬들이 몸의 관강의 안쪽과 바깥쪽 벽면을 압박하게 되어 카테터를 그 위치로 고정시키고 분비액이 누출되는 것을 막아주게 된다.

본 발명의 방법에는 목표로 하는 몸의 관광을 밀봉하고, 배출하고 헹구고, 이어서 상기한 바와 같이 조절된 조건하에서 치료용 물질을 주입시키는 것이 포함된다. 주입을 하고 난 후에 남아있던 나머지 주입물들을 흡출해 내므로서 몸 전체로 퍼질 가능성을 더 줄인다.

입력은 그 자체가 세포의 이동 과정을 촉진시킬 수 있으며 이는 전달력을 향상시키는데 이용된다. 예컨대, 상피세포 및/또는 내피세포의 최외막 표면을 통한 흡수를 증대시키기 위해 일정한 속도와 압력으로 관강 내 주입을 실행한다. 이와는 달리, 분자들을 세포 융해를 통해 정단(Epial)표면에서부터 바닥세포 또는 기저측(Basolateral)세포 표면으로전달하는 것을 증대시키는데 일정 속도와 일정 압력으로 관내로 주입시키는 방법을 사용 할 수 도 있다.

본 발명의 특별한 예는 내장, 도관 또는 혈관의 팽창을 측정하는 방법을 함께 이용하는 것이다. 이러한 방법에는 조직 소실의 직경을 측정하는 것에 관해 기술된 관광 내 초음파를 이용하는 것이 포함된다. 관광내 초음파 또는 치료용 약물의 전달 깊이를 측정할 수 있게 하는, 압력을 조절하는(Pressure Mediated) 전달방법과 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 , 일정 압력으로 투여하는 것은 혈관 내에 있는 죽상판 같은 내강 구조물의 내표면층을 압박하는데 이용된다. 상피 또는 내피를 벗기기 위해서 관강 내 압력을 매우 높게 이용할 수 도 있다.

본 발명은 약물 또는 유전 벡터 같은 치료용 제제(therapeutic agent)를 특정 장기, 조직 소실(tissue compartment) 또는 쎌 타입(cell type)에 선택적으로 전달시키는 방법에 관한 것이다.

제 1도는 담낭(A), 작은 담관(bile duct)(B), 및 간(C)의 내부를 덮고 있는 상피세포의 도식화된 단면이다.

제 2A 및 2C는 비교적 낮은 담도 압력에서 담낭 안에 있는 상피세포의 정단 표면까지 특이적으로 전달하는 부위를 도식화한 것이며; 제 2B 및 2D도는 담도의 압력이 높을 때 상피하 공간까지 특이적으로 전달하는 부위를 나타낸다.

제 3A도는 비교적 낮은, 최고치 보다 낮은 간담도 압력에서 간 안에 있는 간세포의 정단 표면까지 특이적으로 전달하는 부위를 도식화 한 것인 반면 제 3B도는 일단 최고 압력을 넘어선 상피하층 까지 전달하는 것을 도식화한 것이다.

제 4도는 약물 및 기타 제제들을 특정부위에 전달하기 위해, 압력하에서 액체를 간담도계(hepatobiliary tree)의 폐쇄된 관형 시스템 안으로 주입하기 위한 시스템을 도식화한 것이다.

제 5도는 동물 하나(5A도) 및 동물들의 집단(5B도)에서 온쓸개관(Common bile duct)을 폐쇄시킨 후에 담관 내(intrabiliary) 압력을 측정한 그래프이다.

제 6도는 주입속도를 240㎕/2min. 으로 하였을 때 시간의 함수로서 압력의 변화를 나타내는, 온쓸개관을 폐쇄시킨 후 주입하는 동안 측정된 담관 내의 압력을 나타내는 그래프이다.

제 7도는 제 6도와 유사하나 0.9% NaCl의 주입속도를 0.06, 0.66, 2.00, 8.00 및 16.00㎕/sec 하였을 때 주입된 부피의 함수로서 담도 내 평균 압력을 나타내는 그래프이다.

제 8A도는 온쓸개관이 폐쇄된 동물에서의, 역행식 담도 주입(Retrograde biliary infusion)을 하는 동안 담도 내의 최고 압력 및 주입이 완료된 때의 압력을 나타내는 히스토그램이다. 제 8B도는 여러 가지 주입속도에 대해서, 시간에 대한 담도 내의 압력의 변화를 나타낸 그래프로서, 주입이 완료되고 나면 담도 내 압력은 주입 이전의 압력으로 빠르게 감소되는 것을 나타내는 것으로, 주입속도가 빠르고 부피가 클수록 회복압력이 낮아지는 것을 보여준다.

제 9A도는 2분 동안 80㎕씩 3회 연속 주입했을 때의 시간에 대한 담도 내 압력의 그래프로, 반복하여 주입시키면 초기주입보다 낮은 압력에서 최고 한계 압력에 도달하게 됨을 나타낸다. 제 9B도는 두 번째 주입이후에 반복 주입하여도 두 번째 주입의 최고 압력과 크게 차이가 없음을 나타내는 히스토그램이다.

제 10A도는 점도가 다른(21.90 및 1.05 센티포아즈 ) 주입물에 관한 시간에 따른 압력변화 그래프이며 ; 제 10B도는 부피와 주입속도가 다를 때 점도가 담도 내 최고압력에 미치는 효과를 나타내는 히스토그램이다.

제 10C도는 두 가지 주입온도에 점도와 담도 내 최고 압력사이의 관계를 선형 회귀 분석한 그래프이다.

제 11도는 하위 대정맥을 클립하기 전과 후 모두, 간세포보다는 담관세포에 β-gal 아데노 비루스를 우세하게 전달하는 것을 보여주는 히스토그램이다.

제 12도는 0.06㎕/sec 와 0.66㎕/sec으로 80㎕의 주입물을 주입하는 동안 시간에 따른 담도 내 압력 변화를 나타내는 그래프이다.

제 13도는 주입속도를 0.06㎕/sec, 0.66㎕/sec으로 하여 정맥내(Ⅳ)투여와 담도 내 주입을 비교한, 유전자 전달에 양성인 담관세포 및 간세포 핵의 퍼센트를 나타내는 히스토그램으로 유속이 낮을수록 담관세포로의 전달이 우세함을 나타낸다.

제 14도는 고압으로 역행식 담도 주입하여 얻은 가능한 조직학적 경로의 일부를 나타내는 도식화된 다이어그램이다.

제 15도는 치료제를 담낭 안으로 특정부위에 전달하는데 사용될 수 있는 담도계(biliary tree) 접근식 캐뉼라(빼낸 투관침과 함께)의 어느정도 도식화한 투시도이다.

제 16도는 제15도의 캐뉼라를 조립하여 담낭의 벽을 통해 삽입한 것을 나타낸 그림으로, 담낭의 내벽에 대해 벌룬이 부풀려져있다.

제 17A도는 제16도와 유사하나, 투관침이 없고 캐뉼라가 담낭 벽에 대해 올라가 있는 그림이다. 제 17B도는 투관침이 뚫고 들어간 구멍을 밀봉하는 것을 돕기 위해 외부 벌룬이 팽창된 것을 보여준다. 제17도C는 구멍을 더 밀봉하기 위해 두 벌룬 사이에 있는 투관침 둘레에 실리콘 또아리를 만들어서 담도 시스템을 폐쇄된 압력 시스템으로 유지시키는 또 다른 구체예이다.

제 18도는 17B도와 유사하나 캐뉼라를 선택적으로 잠그기 위한 뚜껑을 보여주는 도면이다.

제 19도는 제18도와 유사하나 담낭의 압력을 고립시키기 위하여 시스틱 덕트(cystic duct)내에 폐쇄용 벌룬을 위치시키기 위한 투관침을 통해 삽입된 카테터의 멀리 있는 팁(Tip)을 보여준다.

제 20A도는 제 19도와 유사하나 압력을 조절하여 담낭을 여러번 헹구고 이를 배출해 내기 위해 담낭 안에 삽입된 구멍이 많은 카테터를 보여준다.

제 20B도는 카테터의 여러 개의 통로를 보여주며 이들의 유체와 카테터의 바깥쪽과의 연결을 보여주는 20A도의 카테터의 단면이다.

제 21도는 카테터를 통하는 여러 개로 된 동심(同心) 전달 통로가 있는 카테터의 또 다른 예의 팁의 도면이다.

제 22도는 카테터 상에 있는 일련의 밴드들이 그것을 통해 담낭 안으로 물질들을 가지는 또 다른 카테터의 예를 보여준다.

제 23도는 작은 잎 모양의 관을 폐쇄시키기 위해( 및 간엽의 관형 시스템을 효과적으로 밀봉하기 위해) 구멍이 많은 원거리 팁을 담관(biliary duct)안으로 집어넣는, 카테터의 또 다른 예이다.

제 24도는 제 23도의 카테터의 팁을 확대한 그림으로, 압력매질을 주입하고 벡터를 전달하고, 카테터의 팁에서 압력을 감지하는 것과 같은 여러 가지의 작업을 실행하기 위한 여러 개의 관강을 보여준다.

제 25도는 주입물의 유속을 10㎕/30sec.(실선), 20㎕/30sec.(점선)으로 하였을 때 담낭 안에서의 시간에 대한 압력 그래프이다.

제 26도는 담낭의 고유층으로 아데노비루스를 전달하는 것을 나타내는 사진이다.

제 27도는 간 전체에서부터 담즙이 분비되는 주된(Common) 간장관(Hepatic duct)(실선)으로 주입물을 전달하는 것과 간의 ⅓만 분비하는 더 작은관(점선)으로 주입하여 전달할 때의 시간에 대한 압력 그래프이다.

제 28A-D, 29A-E 및 30A-C도는 본 발명의 방법에 의해 폐쇄막을 파괴시킨 것을 보여주는 전자 현미경 사진이다.

제 31A도는 만성적으로 담즙 분비를 중단시킨(chronically cholestatic) 동물들에게 역행식 담도 주입을 한 후에 관찰된 압력 변화의 패턴을 나타내는 그래프이다. 제 31B도는 역행식 담도 주입을 반복하였을 때 정상상태(normostatic) 및 만성적으로 담즙 분비를 중단시킨 동물의 관내 압력에 미치는 영향을 비교한 히스토그램이다.

제 32도는 정상상태와 담즙분비를 중단시킨 상태의 두 경우에 역행식 담도 주입한 후의 미량 분자의 플라즈마 함량을 나타내는 히스토그램이다.

제 33A-D도는 방광을 채웠을 때의 반응을 보여주는 방광의 단면도이다.

제 34도는 본문에 기술된 바와 같은 연구를 하기 위해 만든 방광의 부분 단면도로서 본 발명의 방법에 따른 Foley 카테터는 이를 이용한 것이다.

제 35도는 항압식 주입하는 장치예의 다이어그램이다.

제 36도는 제 35도의 주입장치로 방광 주입을 실시할 때 관찰되는 기포의 경로를 나타내는 그래프이다.

제 37도는 항압식 방광 주입에서의 시간에 대한 유속의 그래프이다.

제 38도는 시간에 대한 압력(가해진 압력 대 방광 내부의 압력)의 차이 및 시간에 따른 유속의 그래프이다.

제 39도는 여러 개의 다른 방광들에 대한 시간에 따른 유속의 그래프이다.

제 40도는 제 39도의 방광들에 대한 시간에 대한 방광의 부피 분의 유속을 나타내는 그래프이다.

제 41도는 정상상태 및 만성적으로 담즙 분비를 중지시킨 동물들에게 가해지는 압력의 함수로서 쥐과 동물의 담도 주입 유속을 나타낸 그래프이다.

제 42도는 쥐과 동물들의 담도 주입의 일정 압력(항압)을 여러 가지로 달리 하였을 때의 저항(가해진 압력/유속)그래프이다.

제 43도는 항압식 방광 주입하는데 시간의 함수로서 유속 및 플라즈마내의 수크로즈 트레이서의 수를 플로팅 한 것이다.

제 44도는 20, 30 및 40㎜Hg의 항압으로 주입할 때 시간에 따른 유속의 그래프이다.

제 45도는 20, 30 및 40㎜Hg의 항압으로 주입할 때 시간에 따른 근접 세포(paracellular) 누출의 그래프이다.

제 46A도는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 몸의 관강 안에 집어넣을 카테터의 도식화된 단면도이다. 제 46B도는 제 46A도의 카테터와 몸 안의 관강의 종단면도이다.

제 47도는 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 여러 개의 관강 카테터 예의 단면도이다.

본 발명은 가압된 몸의 빈 공간, 속이 빈 내장(예컨대, 담낭, 소장) 또는 관(예컨대, 침관, 귀밑샘관 또는 간쓸개 시스템의 관)을 포함하는, 장기의 관강 안으로 약물(치료약 또는 진단약을 특이적으로 전달하는 방법이다. 인체의 빈 공간을 해부학적으로 압력계로 고립시킨다(예컨대, 위장관과 통해있는 장기로부터 나온 하나 이상의 관들을 폐쇄시키므로). 그런 다음 상피를 관통하여 약물전달이 일어나는 한계치 보다 높거나 낮은 압력/유속/부피로 고립된 몸 안의 공간 안으로 약물을 주입시켜 전달되도록 만든다. 따라서 한계점 보다 낮게 약물을 전달하면 상피세포의 표면을 덮고 있는 세포까지만 약물이 전달되고 반면 한계점보다 높게 하면 상피하 공간(예컨대 관의 주변 또는 간의 동양 혈관을 통한 몸 전체로 퍼지는 맥관투여를 포함할 수 있는) 까지 약물을 전달하게 된다.

몸 안에 있는 빈 공간을 가지는 여러 가지 장기(방광, 간 담즙관, 귀밑샘관 및 위장 같은) 들은 극성을 갖는(polarized) 상피세포에 의해 안이 둘러싸여 있는 상피세포를 갖는다. 이들 세포는 이들이 관강에 면하는 정단 표면(apical surface)와 상피 세포들 사이에 있는 폐쇄막에 의해 관강 에서부터 고립된 바닥 표면을 갖는 다는 점에서 "극성을 갖는다". 이 극성 세포들의 표면들은 때때로 관강 내로 전달시키기 위해 세포를 통해 생물학적 물질들을 한 방향으로 통과시키도록 특수화시킨다.

제 1도는 여러 가지 다른 부류의 조직을 조직학적으로 구성한 도식화된 단면도이다. 제 1 도에서는 극성을 갖고 있는 상피세포(30)들이 바닥세포 표면(36) 및 세포(30)의 정단 표면(34)을 고유층을 가지고 있는 상피하 공간(38)에서부터 분리해 내는 폐쇄막(32)에 의해 서로 연결된 담낭, 큰 바일 덕트(large bile duct) 및 창자에서 공통적인 구조를 볼 수 있다. 제 1B도의 작은 바일 덕트의 구조는 모세관망(Capillary Plexus)으로 점유된, 그러나 고유층을 가지고 있지 않은 상피세포(이 바일 덕트에서는 담관세포 라고 불리는)를 나타낸다. 제 1C 도는 간 안에 있는, 박리공간(Space of Disse)과 간의 동양 혈관에 의해 점유되며 고유층은 없는 상피하 공간(30)을 보여준다.

상피하의 구조와는 상관없이, 상피세포들 사이의 폐쇄막들은 관강 과 상피하 공간 사이의 물리적이고 기능적인 벽을 형성한다. 따라서 이러한 모든 구조의 경우 약물을 전달하기 위한 타겟이 될 수 있는 최소한 두 개의 부위가 있는데; 이들은 관강 내 공간의 안을 둘러싼 상피세포들 및상피세포 깊숙이 위치한 공간들 ( 및 이들의 세포질 및 기타 구조물)이다.

본 발명에 따라 약물을 압력으로 유도하여 전달시키는데 구체적으로 언급하지 않았던 이외의 내피세포로 덧대어진 몸 안의 빈 공간 및 관들을 타겟으로 삼을 수 있다. 그러나 예시용으로 간담도계를 예를 들어 압력으로 유도된 전달을 해 보이겠다.

제 2A 도는 클립(44)로 폐쇄된 시스틱 덕트(42)를 갖고 있는 담낭(40)을 도식화 한 것이다. 담낭(40)의 벽을 통해 카테터(46)을 삽입하여 카테터(46)의 멀리 있는 팁(48)을 관강(49)에 놓이도록 만든다. 카테터(46)을 둘러싼 위치 고정/밀봉 장치(50)은 카테터의 위치를 유지하도록 도우며 카테터(46)이 삽입된 구멍을 밀봉시키는 것을 보조한다. 화살표(52)는 비교적 낮은 압력 조건하에서 액체(약물 같은)를 전달하는 것을 보여주는데 이 경우 폐쇄막은 파괴되지 않았으며(제 2C도) 상피세포의 정단 표면까지 거의 완벽하게 전달된다. 이와 반대로 제2B도 에서는 폐쇄막(32)(제2D도)을 파괴하고 액체 매질이 상피하 공간까지 접근할 수 있도록 하는 비교적 높은 압력 조건하에서 액체 매질을 담낭(40)으로 전달하는 것을 보여준다.

제 3A도는 압력이 낮은 전달조건하에서 간 안에 있는 상피세포의 정단 표면까지 약품을 전달하는 것을 예시하는 반면 제 3B도는 비교적 압력이 높은 전달 조건하에서 간 안에 있는 박리공간(Space of Disse)과 동양 혈관까지 전달되도록 만드는, 폐쇄막같은 해부학적으로 미세한 구조물이 파괴되는 것을 예시한다.

ⅰ) 담도 압력을 동시에 측정하기 위한 신규 시스템;

ⅱ) 방사선 불 투과성 염료의 분포를 디지털 형광투시법으로 평가하는 방법;

ⅲ) 아데노비루성 및 리포소옴성 벡터에 필적하는 크기의 형광성 라텍스 미소 알갱이(microspheres)의 분포를 조직학적으로 평가하는 방법 ; 및

iv) 재조합 아데노비무스성 벡터를 투여하고 난 후에 얻어진 유전자 전달 패턴을 조직학적으로 평가하는 방법; 을

이용하여 쥐에서의 역행성 담도 주입법의 압력 및 조직학적 중요성을 전체적으로 평가하였다.

본 발명의 여러 가지 다른 구체예를 보여주는 이러한 평가방법들을 다음의 실시예에서 기술하겠다.

실시 예 1

전달 장치 및 주입 데이타

제 4도는 역행식 담도 주입법이 담도 내 압력에 미치는 영향 및 약물을 부위에 특이적으로 세포로 전달하는데 미치는 영향을 예시하기 위해 사용된 기구를 보여준다. 실험용으로 20-40g의 마취시킨 CD-1 수컷 쥐(Charles River)를 이용하였다. 중앙선을 개복한 후에 시스틱 덕트(42)를 통해 담낭(40)을 손으로 꺼냈다. 담낭 절개용 카테터(60)(실라스틱 튜빙, 0.012인치 ID/0.025 인치 OD)를 담낭(40) 벽을 통해 삽입시키고 담낭 안에 있도록 고정시키고 카테터 팁(48)이 뻗어나가 시스틱 덕트(42)와 바로 인접하도록 만든다. 흡수제 셀룰로우즈(XO-Med, Jacksonvile, ㎕) 팩킹(62)을 이용하여 담즙이 복막 내로 누출되지 않도록 카테터의 입구 주위를 패킹한다.

게이지가 23인 바늘(63)을 사용하므로서 십이지장(64)안에 구멍을 만들고 오디(Oddi) 괄약근(66)(담즙이 소장으로 들어가는 것을 조절할 수 있게 도와주는)을 절개한다. 담도 내 압력을 기록하기 위해 폴리에틸렌 튜빙 카테터(68)(ID 0.011", OD 0.024")를 십이지장 구멍을 통해 삽입하고 오디 괄약근(66)을 거쳐 온쓸개관(70)(Common Bile Duct)까지 뻗쳤다. 이 카테터(68)을 진행시켜 이것의 팁이 위 쪽 췌장관과의 접합부 바로 입구에 오게 만든다. 미리 배치해놓은 6-0 실크타이를 이용하여 카테터의 위치를 고정시킨다. 담도계(biliary system)는 닫힌 관형 시스템이기 때문에 온쓸개관 안에서 기록된 압력(압력 변환장치 69에 의한)을 간담도 시스템(hepatobiliary system) 전체(담즙이 흐르는 관들 및 소관 들)를 통한 압력을 정확히 반영한 것이다. 저압식 변환장치(Digimed, Indianapolice) 와 PC를 이용하여 매 0.15-2.0초마다 연속적으로 담도 내 압력을 기록하였다. 담낭 절개용 카테터(60)과 미소주입 펌프(72)(Harvard)를 이용하여 역행식 담도 주입을 하였다. 압력 카테터(68)의 팁이 닿을 때까지 주입물은 순행식 (Normograde) 방향(74)을 따라 계속적으로 시스틱 덕트(42)와 온쓸개관(70)으로 내려갔다. 압력 카테터가 더 이상 순행식으로 흐르지 못하게 막게되면 주입은 역방향으로 흘러 윗쪽 간장관(hepatic duct)으로 이동하여 간까지 가게된다. 따라서, 카테터(60)을 통해 담낭(40)으로 주입하면 간의 관 및 소관들을 포함하여 간담도 시스템 전체로 주입물을 전달할 수 있게 만든다. 역행식 담도 주입법을 사용하지 않고 온쓸개관을 폐쇄시키는 동안 담도 내 압력의 기본치수를 25분 동안 계속 기록하였다. 담즙이 여전히 만들어지기 때문에 담도 내 압력은 기본선 0.8 ±0.2 ㎜Hg(n=5)에서 점점 올라가 10분 정도 면 10.0 ±1.4 ㎜Hg 에 도달한다(제 5도). 이 압력은 최소한 25분 동안 거의 일정하게 유지되었으며 이때 기록을 멈추었다.

주입속도를 여러 가지로 일정하게 하여 역행성 담도 주입을 하면 결과적으로 제 6도에 예시된 특정한 패턴의 압력변화가 일어난다. 관강내 압력이 최고압력 Q에 다다를 때까지 P 에서 급속히 상승되고 이후에는 압력이 약간씩 감소되고 주입이 완료 될 때까지 평평한 압력 R이 거의 유지된다. 일단 S 에서 주입이 중단되면 압력은 급속히 T까지 떨어져 주입전의 수치로 돌아가게 된다. 따라서, 압력이 Q에서 한계치에 도달하면 거기서 해부학적 미소 막 구조물들이 생리적으로 파괴되고 그러므로서 편평한 R보다 낮은 동안 주입물이 담낭에서부터 보다 쉽게 빠져 나오게된다.

제 7도는 주입속도를 달리하였을 때 부피에 관한 함수로서 담도 내 압력변화를 나타내는 것으로, 압력변화( 및 최고압력)는 주입속도와 부피에 따라서 달라진다. 주입속도를 빨리 할수록 최고압력도 더 커졌다.

주입속도를 크게 하면 시간에 따라 압력도 더욱 빠르게 증가하고 주입물을 채우고 있는 동안 압력-부피 커브의 초기 기울기는 주입속도에 따라 달라지며 이것은 주입속도가 빠를수록 작아진다. 최고압력(특정 타입의 한계 사건의 예인) 또한 주입속도가 클수록 컸다.

제 8도는 주입 부피와 속도를 달리하였을 때의 피크압력과 주입의 마지막 압력을 나타내는 히스토그램이다. 피크(한계)압력은 주입하지 않은 그룹(n=0)과 0.66㎕/sec(n=4), 2.66㎕/sec(n=6), 5.33㎕/sec(n=5)로 80㎕를 주입한 동물들 사이에 큰 차이가 났다. 2㎕/sec(n=4), 8㎕/sec(n=5) 및 16㎕/sec(n=4)로 240㎕를 주입하였어도 피크압력이 비교대조용(P〈0.05)과 크게 차이가 났다. 80㎕를 0.066㎕/sec로 주입(n=5)하였더니 담도 내 최고 압력이 14.5±0.9㎜Hg가 되었으며 이는 주입하지 않은 그룹(11.5±1.5㎜Hg)과는 큰 차이가 나지 않지만 다른 80㎕를 주입한 그룹과는 큰 차이가 났다(P〈0.05). 피크압력은 속도에 따라 달라지며; 주어진 주입부피에서 평가된 각각의 주입속도는 다른 주입속도를 이용하여 얻은 것과 현격히 다른 (P〈0.05) 최고압력을 나타내었다. 측정된 최고 피크압력은 43.6 ±0.6㎜Hg (16㎕/sec로 주입된 240㎕)였다. 주입 마지막의 압력 또한 주입속도와 부피모두에 달려있다. 0.66㎕/sec로 주입하면 피크압력이 크게 올라가지만 주입 마지막에서 압력은 온쓸개관만을 폐쇄시켜 얻은 피크와 비교했을 때 더 이상 크게 높지 않았다. 결과적으로 피크압력이 크게 올라가는 기타 모든 주입속도의 경우 주입 마지막 압력은 비교용 압력에 비해 현격히 높아진 상태로 남게된다. 주입 후 압력은 부피가 클수록, 주입속도가 빠를수록 더 낮아지는 경향이 있다(제 8B도).

몇몇 연구에서 한 동물에 대해 동일한 주입속도와 부피로 4회까지 연속적으로 반복하여 주입 실험하였다. 계속하여 압력을 모니터하고 약 3분씩 간격을 두어 각각 주입하였다. 제 9A도는 3회 주입하였을 때의 시간경과를 나타낸다. 제 9B도는 특정 속도와 부피에 대해 초기 주입하여 얻은 것보다 반복하여 주입하면 압력이 확실하게 약간만 상승하였음을 보여준다. 이 결과는 최고 많은 량을 최고 빠른 속도로 실험하였을 때(16㎕/sec 속도로 240㎕/sec 주입)만을 제외하고는 통계적으로 확실하였다. 두 번째 주입한 결과 압력변화가 첫 번째 주입하였을 때의 압력변화 보다 훨씬 작았지만 주입부피와 속도가 어떻든 간에 2, 3 및 4회 주입하여 얻은 압력변화는 서로 크게 다르지 않았다.

주입물의 점도 및 온도가 관강 내 압력에 미치는 영향을 측정하기 위해 주입물의 속도와 부피를 달리하여, 일정 범위내의 점도를 갖는 유체를 동물에게 역행성 담도 주입하였다. 0.9% NaCl로 방사성 불투과성 컨트라스트 염료를 희석시켜 점도가 다른 용액들을 만드는데, 염료 대 염류액의 비율을 : 9:1, 3:1, 1:1, 1:3 으로 하고 또 희석하지 않은 염료 및 염료가 없는 염류액을 만들었다. 이 담도 주입물 시스템을 약 37℃에서 주입하도록 조절하였다. 39℃ 물이 계속해서 관류하는 길이가 3/8" 실리콘 튜빙을 통해 주입 카테터를 넣었다. 용액들은 39℃까지 예열해 놓고 사용하기 바로 전에 빼냈다. 카테터를 담낭의 관강 내로 고정시키는데 시간이 소모되었기 때문에 카테터 팁에서 측정하였을 때의 온도는 약 2℃ 내려가 있었다. 22℃와 37℃에서 Ostwald Capillary 점도계를 이용하여 유체의 점도를 측정하였다.

주입물의 점도가 올라 갈수록 담도 내 압력도 유사하게 올라갔다. 제 10A도에 나타난 그래프는 주입물의 점도가 다를 때 담도 내 압력 변화의 일시적 패턴을 나타낸다. 점도가 담도 내 압력에 미치는 영향은 주입의 후반부에서 더욱 명확해진다. 담도 내 주입(20㎕; 16㎕/sec)을 한지 11.5초가 지난 후에 담도 내 압력은 주입물 점도가 높을수록 훨씬 커졌다(주입물 점도 0.0070g/㎝·sec에서 27.1±2.7㎜Hg vs 주입물 점도 0.0642g/㎝·sec에서 56.8±8.8㎜Hg ; P〈0.05). 유체의 점도와 담도의 관강 내 압력 사이의 관계는 일정한 주입 속도와 부피 범위에서는 유지되지만 부피가 더 크고 주입 속도가 더 빠르면 크게 증가되었다(제 10B도). 제 10C도는 두 가지의 다른 주입 온도에서 주입물 점도의 함수로서 담도 내 피크 압력을 선형 회귀식 분석한 것이다. 담도 내 압력은 22℃와 37℃모두에서 주입 점도에 따라서 달라졌다(상관계수; 22℃, γ=0.74). 비록 점도를 높게 하여 주입을 하면 22℃에서 보다는 37℃에서 압력이 더 크게 증가하지만 제 10C도에 나타난 선형 회귀선은 크게 다르지 않았다. 점도가 다른 용액들을 반복 주입하면(데이타는 없는) 염류액을 주입했을 때 보여진 것과 동일한 패턴을 따르는데 이는 즉 주입을 반복하면 처음 주입하여 만들어진 것과 피크압력 변화가 확실히 낮아지게 된다.

실시 예 2

방사성 불 투과성 트레이서에 관한 연구

Silastic 카테터를 상기한 바와 같이 담낭 안에 삽입한다. 직선형(1㎜×3㎜) 또는 곡선형(1㎜×5㎜) Kleinert-kutz 미세혈관 클립(MVC; Pilling-Week, Research Triangle, North Carolina)을 윗쪽 췌장관과 온쓸개관이 접합되는 입구에 장치하여 간담도계가 닫힌 압력 시스템이 되도록 만든다. 실시 예 1에서와 같이 주입물을 투여하고 미소맥관(microvascular) 클립으로 폐쇄시키므로서 주입물이 역행하여 간장관으로 이동한 뒤 간장의 소관과 미세관(Ductules)으로 들어간다. 투여기간의 마지막에 (주입+체류시간)클립을 제거하고 담낭 절개용 카테터를 빼냈다.

역행성 담도 주입을 한 후에 간 정맥 배출이 방사성 불투과성 염료와 아데노비루스의 분포에 미치는 영향을 측정하기 위해 간에 대해서는 머리 쪽이고 횡경막의 대정맥 뒤 구멍에 대해서는 꼬리 쪽인 지점에 곡선형 미소맥관 클립을 하여 5-10분 동안 일시적으로 간상부 하위 대정맥을 폐쇄시켰다. 레노그라핀 및 OEC 시리즈 9400 X-Ray 화상시스템 (OEC Diasonics, Salt Lake City)으로 디지털 형광경 시험을 하였다.

어떤 동물에서는 레노그라핀을 역행식으로 빠르게 주입하고 시스템적 순환계(systemic circulation)에 들어갔는지, 또 언제 들어갔는지를 알아내기 위해 디지털 형광경 시험을 이용하였다. 1초당 30프레임을 포착한 디지털 이미지는 시스템적 순환계 안에 염료가 빠르게 니타난것을 나타낸다. 염료는 심장에서 보여지기 전에 간상부 하위 대정맥(superhepatic inferior vena cava)까지 올라가는 것으로 나타났다. 간상부 하위 대정맥을 일시적으로 차단하면 고압으로 역행식 담도 주입하는 동안, 또 그 후에 전체로 퍼지는 것을 막게된다. 따라서, 어느 정도 림프액을 분비시킬 수 있는 반면, 방사성 불투과성 염료를 고압적으로 역행식 담도 주입을 하게되면 먼저 주입물을 간정맥 분비를 통해 시스템으로 전달하게된다.

역행식 담도 주입을 디지털 형광경 시험으로 기록하는 동안 동시에 담도 내 압력을 측정하면 담도 내 압력이 빠르게 올라갈 때 방사성 불투과성 염료가 시스템 순환계 안에 나타나는 것으로 나타났다. 주입속도 8㎕/sec에서 2초 후에 16㎕ 염료를 주입하고 난 후에 압력이 증가하기 시작하였다. 3초 후에 또는 24㎕가 다 주입되고 난 후에 염료가 폐 안에서 발견되었다. 따라서 트레이서가 이렇게 처음 나타난다는 것은 이 주입속도에서 2초 후에 도달된 압력이 염료의 상피하 전달이 발생하는 압력이며 상피로만 투여하기를 원하는 경우에는 이 보다 낮은 압력으로 (이 유속에서) 주입물을 투여해야만 한다는 것을 나타낸다.

간 안에서의 염료의 강도는 몸 전체로 분포된 것이 먼저 검출된 후에도 계속 증가하였다. 5초(40㎕) 후에, 염료는 하위 대정맥 안에서 더욱 뚜렷해졌다. 6초(48㎕)가 되니 피크 압력에 도달하고 염료는 간, 위 대정맥과 폐 모두에 더욱 더 확실해졌다. 따라서, 이 피크 압력은 상피하 전달이 우세하게 일어나는 또 다른 한계점 즉, 오로지 상피하 전달만이 필요한 상황에 이용될 수 있는 압력을 나타내게된다. 동일한 동물에 주입을 반복하는 염료의 간 분포를 비교하기 위해 디지탈 서브트랙션 형광경 시험을 이용하였다. 각각의 새로운 주입물로 처음에 낮은 압력에서(보이지 않는 데이터) 이상 발달 조직(Parenchyma)을 채웠다. 따라서 처음 주입한 후에 상피하 전달이 우세하게 증대될 수 있었다.

몸 전체의(systemic) 맥관 순환계에 실제 염료가 보이는 것은 간담도계 안의 압력이 주로 또는 거의 완전하게 정단 상피세포로의 전달이 일어나는 수준을 초과했다는 것을 나타내는 것이다. 따라서 일단 몸 전체의 맥관 시스템에 트레이서가 나타나면 간 안에서 트레이서의 상피하 전달이 일어나는 것이다. 이 테스트는 (국소 투여 대신)몸 전체로의 투여가 일어나는 피크 압력 하에서의 주입물의 압력 및 부피를 예견하는데 이용될 수 있다.

실시 예 3

벡터를 전달하기 위한 모델로서의 라텍스 미소 알갱이

주입물 분포를 디지털 형광경 시험연구 및 조직학 적으로 평가한 것을 모두 확인하기 위해 직경이 100㎚, 200㎚인 형광성 라텍스 미소알갱이를 역행성 담도 주입법으로 투여하였다. 알갱이의 직경은 아데노비루성(80㎚) 및 리포좀성(200-500㎚)벡터의 직경과 유사하도록 결정한 것이다. 황록색의(490㎚ 피크 여기 파장) 카복실 레이트-조절된 형광성 라텍스 미소알갱이(Molecular Probes, Eugene, Oregon)를 1×PBS안에 희석시키고 사용하기 전에 완전하게 초음파처리 하였다. 알갱이의 농도를 동물 당 1×10¹¹의 알갱이로 일정하게 유지시키는 반면 주입 부피와 속도는 동물에 따라 달리하였다. 주입을 완료하고 난 후에 갓 냉동시킨 부분들을 간과 폐에서부터 준비해 놓고 형광 현미경으로 평가하였다. 조직을 보다 자세히 보기 위해서 580㎚ 여기 파장에서 빨간색을 나타내는 Evans Blue(0.05%, 20초 동안)로 슬라이드들을 염색시켰다. (a)폐쇄막을 둘러싼 막이 물리적으로 파괴되거나 또는 (b) 간세포 및/또는 담도 상피세포를 통한 세포 융해(Trancytosis)가 일어나지 않는 한 이 라텍스 알갱이는 담도계의 바깥쪽으로 통과할 수 없다.

낮은 주입속도로 10㎚ 알갱이들을 역행성 담도 주입시켰을 때(주입물의 부피 80㎕에 알갱이 1×10¹¹개, 0.66㎕/sec의 속도로 주입) 알갱이들은 Acinar 구역1 - 3 전체에서 발견되었다. 알갱이들은 중앙 정맥에 인접한 간의 동양 혈관 및 소관에서 뿐 아니라 문맥 주변의 바일 덕트 및 소관에 위치해 있었다. 이러한 발견은 이렇게 낮은 주입속도와 낮은 압력에서, 실질적인 몸 전체에 투여를 하지 않고도 상피 및 관 주변에 전달시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

주입 부피를 달리하여(주입부피: 20, 80, 240㎕; 주입시간 각 경우 30초) 역행식 담도 주입한 뒤 검출된 분포를 비교하였다. 부피를 최대로 하였을 때 간 에서는 매우 적은 량의 알갱이가 발견되었으며 이렇게 검출된 것들은 중앙 소정맥 내에 및 주변에서 발견되었다. 고압으로 역행성 담도 주입한 후 폐(Pulmonary)의 이상 발달 조직(parenchyma)에서 100㎚와 200㎚ 알갱이가 모두 발견되었다. 이 결과는 디지털 형광경 시험과 일치하는 것이며 이는 이렇게 고압으로 역행성 담도 주입을 하면 직경이 100 - 200㎚인 라텍스 알갱이를 간의 동양 혈관에 분포시키고 연이어 전체로 퍼지게 만든다는 것을 가르키는 것이다.

그러므로, 미소 알갱이 분포법은 선택된 주입 속도 및 점도에서 특별한 종(Species), 장기 또는 단일체(individual)에 처음으로 상피 또는 상피 하 전달이 일어날, 압력 또는 부피를 선택하는데 이용될 수 있는 또다른 시험이다. 이러한 테스트 결과(또는 컴퓨터 또는 기타 모델링)를 다음 단계의 주입 파라메타를 선택하는데 사용할 수 있다.

실시 예 4

아데노 비루성 벡터의 제조 및 전사 평가

Av1LacZ4는 Rous Sarcoma Virus(RSV) 프로모터의 조절 하에서 재조합 핵 타겟된 E.Coli-갈락토시다아제 유전자를 나타내는 복제가 불완전하고 Ela가 삭제된 재조합 아데노비루스(사람, 타입5)이다. 비루스를 제조하고 본문의 참고문헌으로 포함된 Miltereder et al., J. Virol 70; 7498-7509, 1996에 기재된 방법에 따라 갓 제거해 낸 조직들을 10% 자연 완충된 포르말린에 최소한 6시간동안 넣어둔 뒤 파라핀 안에 끼워두고 Milterreder et al.에 기술된 바와 같이 적정(Titered)하였다. 변형된 아비딘-비오틴 콤플렉스 기법을 이용하여 β-갈락토시디아제 단백질을 면역 조직 화학적으로 검출하였다. 1차(primary) 항체는 토끼의 IgG 안티-β- 갈락토시디아제 항체 또는 네가티브 컨트롤 토끼의 IgG 항체(Cortex Biochem)이었다. 2차 항체는 염소의 IgG 안티- 토끼 IgG 항체였다. 아비딘-비오틴 콤플렉스와 DAB 크로마젠으로 검출하였다. 헤마톡실린(Biomeda)으로 슬라이드들을 역(counter) 염색하였다. 여섯 개의 랜덤 200×필드에서 보았듯이 면역세포 화학적으로 양성인 간세포와 담도세포 핵의 퍼센트를 결정 하므로서 정맥 내 주입 및 역행성 담도 주입을 한지 일주일 후에 유전자의 전사 수준을 측정하였다. 정맥 내 주입 및 역행성 담도 주입을 한지 3일 후의 유전자 전사수준은 4개의 랜덤 400×필드에서 관측된 바와 같이 면역 조직 화학적으로 양성인 핵의 퍼센트를 계산하므로서 측정된다. 고압식 역행성 담도 주입을 한 뒤 15분 후에 심장을 찔러 얻어진 혈청을 가지고 트랜스미션 전자 현미경으로 관찰하였다. 직경이 8㎚인 미립자와 형태적 특성을 갖는 아데노 비루스가 매우 낮은 농도로 존재하였다.

간정맥 배출을 일시적으로 막으면 고압으로 역행식 주입하여 전달된 방사성 불투과성 염료가 간 안에 머무르게된다. 이와 유사하게 간 정맥의 방해로 인해 늘어난 유전자 전사도 되돌린다. 간정맥을 5분 또는 10분간 일시적으로 막거나 또는 그렇게 하지 않으면서 매우 높은 압력으로 역행성 담도 주입(240㎕, 2㎕/sec)법으로 동물에게 β-gal 아데노비루스의 생물적 플래크-형성 단위 6×10⁸을 정맥 내로 투여하였다. 벡터를 투여한지 일주일 후에 간을 떼어내고 유전자가 전사되었는지를 면역조직 화학적으로 평가하였다. 정맥 내 투여한지 일주일이 지난 후에 간 안에서는 유전자가 전혀 검출되지 않았다. 이것은 아데노 비루스의 사용량을 적게하고 유전자가 전사되었는지를 평가하는 시점이 늦었을 때와 결과가 같았다. 그러나, 동일한 양의 아데노 비루스를 고압으로 역행성 담도 주입한 뒤 일주일 후에 양성 간세포와 담도 세포가 검출되었는데 이는 몸전체로 퍼지는 투여방법과 비교해볼 때 국소적으로 투여하는 방식이 비교적 효과적임을 보이는 것이다.

양성 핵들을 가지고있는 간세포와 담도 세포의 퍼센트는 간 상부 하위 대정맥을 일시적으로 폐색시키면 증가되었다(제 11도). 따라서 유전자 전사가 장기에 특이적으로 전달되는 것을 향상시키기 위해 간에서부터 나오는 정맥을 일시적으로 폐색시키는 방법을 이용할 수 있다. (예컨대, 제 11도에 보여지는 바와 같이 간세포와 비교했을 때 담도 세포 쪽으로 최소한 2배 또는 3배 우세하게 전달된다.) 간에서부터 되돌아오는 정맥을 일시적으로 폐색시키는 기간을 늘이면 선택적으로 담도 세포 쪽으로의 전달을 증대시킬 수 있다. Portal Triads 근처의 담도 상피세포에서 유전자 전사가 최고로 증가된다. 역행성 담도 주입을 병행하여 하위 대정맥을 폐색시킨 후 일차적으로 문맥 주위의 분??(primarily periportal distribution)에서 양성 간세포를 발견하였다. 어떤 동물에서는 β-gal 아데노비루스를 고압으로 역행성 주입한 뒤 일주일 후에 간 상부 하위 대정맥을 제거하고 면역조직 화학적으로 평가하였다. 간 상부 하위 대정맥을 폐색시키는 것과 병행하여 고압으로 역행성주입을 한 동물에서부터 제거한 간 상부 대동맥에서부터의 상피 세포 안에서 유전자 전사가 검출되었다. 이것은 고압으로 역행성 주입을 하면 대정맥 안으로 아데노 비루스가 순환됨을 가르키는 것이다.

전달 압력을 낮게 하였을 때 유전자 전사가 일어나는지 여부를 알아보기 위하여, 두 개의 다른 주입 파라메타(80㎕ ; 0.66㎕/sec(n=4) 대 0.066㎕/sec(n=5))를 이용하여 역행식 담도 주입하여 β-gal 아데노비루스를 동물에 투여하였다. 제 8B도에 보여진 바와 같이 동일한 조건하에서 0.9% NaCl을 주입하였더니 담도 내 압력 대 피크압력을 현격하게 다르게 만들어냈다. 0.66㎕/sec로 주입하였더니 담도 내의 압력이 현격히 상승한 반면(P〈0.05), 0.06㎕/sec로 주입하면 압력에 별 변화가 생기지 않았다. 제 12도는 0.066㎕/sec와 0.66㎕/sec로 80㎕를 주입했을 부피의 함수로서의 압력 변화를 보다 자세하게 나타낸다. 압력-부피 곡선은 초기에는 차이가 났으며 주입량이 많아지면 그 상태로 유지된다.

역행식 주입법으로 β-gal 아데노비루스를 받은 동물의 경우, 온 쓸개관을 폐색시키는데 드는 총시간은 담도 세포와의 접촉시간이 25분으로 일정하도록 유지시켰다. 비교하기 위하여, 정맥 내로 β-gal 아데노비루스를 받은 또다른 조직을 떼어내어 β-갈락토시디아제 면역조직 화학적으로 유전자가 전사되었는지를 평가하였다. 세 개의 실험 그룹들은 유전자 전사의 조직적 패턴이 현격히 달랐다. 제 13도는 β-gal 아데노비루스를 3×10⁹bpfu 투여한지 3일 후에 β-갈락토시디아제 면역조직 화학법으로 관찰한 유전자 전사 패턴을 요약한 히스토그램이다.

정맥 내로 투여하면(n=4) 양성인 담도 세포는 없는 반면 동양 혈관 패턴의 유전자 전사는 완벽하였는데 ; 28.2±5.0 % 간세포는 유전자 전사에 관해 양성이었다. 이 수준의 유전자 전사는 매체(Vehicle) 주입법(n=6)과 비교하였을 때 확실한 것이었다.(P〈0.05) 압력을 높인 역행식 담도 주입 그룹(80㎕ ; 0.66㎕/sec, n=3)은 담도 세포(32.2±7.3% 양성, P 〈 0.05)가 합쳐진 혼합된 패턴을 갖는다. 주입 압력이 최저인 그룹(80㎕ ; 0.66㎕/sec, n=4)은 유전자 전사에 관해 매우 낮은 미미한 정도의 1.9 ±1.0% 양성, P 〈 0.05) 간세포가 양성으로 나타나고 거의 전적으로(53.4 ±4.5% 양성, P 〈 0.05)에 유전자 전사가 일어났다. 이 결과는 담관 내 압력을 줄이면 담관 세포에 선택적인 유전자 전사가 일어나므로 역행식 담도 투여를 하는 동안 주입물이 누출되는 것을 감소시킨다는 것을 보여준다. 누출이 감소되면 비루스가 이 쎌 타입과 접촉되는 시간의 양이 길어지므로서 담도 세포 유전자 전사가 또한 증가될 것이다.

이러한 발견은 임계 충진 부피/ 압력을 넘어서 역행식 담도 주입을 하면 간의 동양 혈관을 통한 주입물의 재 분포가 일어나 연이어 간정맥 배출이 일어나고 주입물이 혈관 전체에 분포되게 된다. 주입속도( 및 압력)가 매우 낮으면 보다 효과적으로 유전자들을 상피세포로 전달하게 되며 상피 하로는 거의 전달되지 못한다. 제 13도에 보여주는 바와 같이 높은 속도/압력(0.66㎕/sec)으로 전달되지만 담관 세포 대 간세포의 비는 약 2:1 정도이다. 그러나, 전달 속도/압력(0.06㎕/sec)을 낮게 하면 담관 세포 대 간세포의 비율을 약 10:1 이상 되게, 담관 세포에 우세하게 전달된다.

담관 내 압력변화는 주입 부피, 속도 및 점도에 따라서 달라지며 본 명세서의 실시 예에 따라 모든 물질에 대한 압력곡선을 만들 수 있다. 디지털 형광경 시험 측정법은 시스템이 누출되는 점까지 담도계를 채우는 압력에 관련 자세한 정보를 제공한다. 결과적으로 비교적 낮은 담도 내 압력을 만드는 조건하에서 주입물을 전달하게되면 100 및 200㎚ 라테스알갱이 또는 아데노비루스성 벡터와 같은 제제들이 주로 관 주변 및 소관에 분포되게 된다. 이와는 대조적으로, 담도 내 압력을 현격히 증가시키는 조건하에서 역행식 담도 주입을 하면 주입된 미소 알갱이들이 동양 혈관에 분포되게 되며 담도 세포와 간세포 모두에 유전자가 전달된다.

주입 부피와 속도를 달리할 때 관찰되는 미소 알갱이의 분포와 유전자 전사의 조직학적 패턴은 관강 내 부피/압력을 초과한 초과분을 정확하게 방출하는 것에 관련한 폐쇄막들이 작은 바일 덕트들 차원에서 일정한 담도 세포들 사이에 위치하거나 또는 간세포들 사이에 위치한다는 것을 가리키는 것이다. 제 14도는 고압 역행식 담도 주입법으로 얻을 수 있는 가능성 있는 경로를 도식화한 것이다. 고유층이 부족한(즉, 소관들) 바일 덕트 차원에서 폐쇄막이 파괴되면 역행식 담도 주입물이 상피하 공간으로 누출되는데 이것이 정맥 모세관에 의해 배출될 경우 결과적으로 주입물이 동양 혈관으로 재 분포되게 된다. 담도 소관 차원의 폐쇄막이 파괴되면 박리 공간(Space of Disse) 안으로 누출되게 된다. 그런 뒤 주입물은 이 공간에 인접한, 그러나 제한판(Limiting)위에 위치한 림프액 모세관 안으로 배출되거나 또는 창(Fenestrae)을 지나쳐 혈관(동양 혈관)의 공간 안으로 들어간다. 직경이 100㎚이상인 분자들이 동양 혈관 공간으로 들어가려면 창이 파괴되어야 한다. 200㎚ 미소 알갱이는 100㎚ 미소 알갱이로 얻은 것과 같은 역행식 담도 주입을 하면 동일한 패턴의 동양 혈관 분포를 갖는다. 따라서, 고압으로 역행식 담도 주입을 하면 다음으로 고압으로 혈관 내 관류를 일으키게 하기 위해 앞서 보여줬던 것과 동일한 방식으로 창을 파괴시킬 수 있다.

담도 내 부피/압력의 용량(부피 변화를 수반하는 압력변화)을 측정 하므로써 또 폐쇄막을 파괴시키기 위한 부피/압력 한계점을 결정하므로서 국소 전달을 최대화시키는 담도 내 투여 파라메타를 이용할 수 있게 만들고 결과적으로 주입물이 몸 전체로 퍼지는 것을 최소화(또는 전혀 없게) 시킨다(예컨대 국소 대 전체 전달 비율은 최소한 2:1, 3:1, 10:1 또는 그 이상이다.). 이 특이적 전달법을 다양한 방법들을 이용하여 이룰 수 있다. 주입을 반복하면 초기 주입과 동일한 피크 압력을 얻을 수 없기 때문에 폐쇄막을 파괴하기 위한 압력 한계점을 측정하도록 특별히 고안된 초기 주입에 이어 파괴된 폐쇄막을 통해 주입물이 누출되는 압력/부피를 측정하기 위해 사용되는 두 번째 주입을 한다(상술한 바와 같이 방사선 사진 트레이서 연구 및 조직의 조직학적 시험을 이용하여). 그런 다음 누출 한계점 아래의 부피/온도를 이용하여 치료제를 전달시킨다. 각각의 주입물은 동일한 유체점도를 가져야 하며 치료용 분자는 이상적으로 열려진 폐쇄막을 통해 최소량만 확산될 것이다. 다른 한편으로, 용량 및 파괴/누출 한계점을 결정하고 일단 폐쇄막이 수복되면 (예컨대 몇 시간이 지나고 나면 폐쇄막이 다시 만들어진다.) 파괴가 일어나는 압력보다 낮은 압력으로 치료용 제제를 투여한다.

카테터 또는 기타 장치들은 타겟된 세포와 일정 기간 동안 접촉하고 난, 흡수되지 않고 잔류하는 주입물을 제거할 수도 있다. 낮은 압력으로 국소 전달하면서 이와 병행하여 흡수되지 못한 물질을 제거하면, 이들주입물을 제거 하므로서 몸에 독으로 퍼질 가능성을 최소화시키기 때문에 그렇지않으면 독성을 가지는 물질을 복용물로서 보다 유용하게 사용할 수 있게 만든다. 내시경 법 및 복강경 법으로 반복적으로 투여 할 수 있으며 이와는 다르게 계획적인 관리하에서( 및 외래 환자일 수도 있는) 일시적으로 역행식 담도 주입을 할 수 있는 새로운 이식 가능한 장치를 이용하여 투여할 수 있다.

폐쇄막을 파괴하기 위한 임계 압력과 담도 내 용량을 미리 알아놓으면 실험용 제제 및 치료제를 간의 동양 혈관까지 선택적으로 전달할 수 있다. 담도 소관 및/또는 소관의 폐쇄막을 파괴하여 누출을 일으키도록 특별히 고안된 제어된 압력으로 역행식 담도 주입할 수 있다. 동양 혈관으로 관류시키는 이 방법은 문(Portal)정맥 및 간 동맥 카테터 사용방법의 대안적 방법일 수가 있다. 약물을 전달하는 대류식(즉, 압력구배)방법은 직접 주입한 후에 비교적 확산되지 않은 제제를 뇌의 이상발달 조직으로 효과적으로 전달하는 것을 증대시키기 위해 보고되었었다. 이와 유사하게 혈관을 통하지 않고(예컨대 역행식 담도 주입법) 간의 이상 발달 조직에 대류식 전달하는 방법은 간의 이상발달 조직 안에 있는 병든 조직의 왕성하지 못한 부위로의 전달을 최대화시키는 방법을 제공한다.

폐쇄막에 의해 분리된 극성화된 상피세포는 많은 장기들 안에 있는 관형 구조물의 내부를 감싸는 것으로 밝혀졌다. 이들 세포가 병드는 것은 사람이 병들고 사망하는 원인이 되기 때문에 매우 중요하다. 따라서, 압력이 조절된 관강내 전달법을 이용하여 관형 구조물을 통해 치료제들을 투여하는 방법은 간담도 조직 및 이외의 조직 타겟 및 질병에 적당하다. 치료제를 관으로 투여하여 치료할 수 있는 질병의 예로는 담도 상피세포의 질병(낭성 섬유증, 자가 면역성 담관 질환 및 AIDS와 관련된 기회 간염성 질환); 간 섬유증과 연관된 경변증 같은 질환; 타액선 또는 이하선 질환; 및 여러 가지 악성종양, 예컨대 혈관 신생이 잘 안되고 전형적인 치료방법에는 잘 반응하지 못하는 췌장 선암등이 포함된다. 본 발명의 방법은 장 질환이 있는 (코르티코스테이로이드 또는 기타 항 염증약을 국소적으로 투여할 필요가 있는 크론병 같은) 장벽에 항 염증약을 선택적으로 전달하는 것과 같은, 기타 속이 빈 장기로 약물을 전달하는데 적합하다. 속이 빈 장기의 단편을 고립시켜(예컨대, 첫 번째와 두 번째의 팽창 가능한 벌룬 사이에 있도록) 속이 빈 장기의 이 부분을 선택된 압력/부피/유속으로 주입물을 주입할 수 있는 가압될 수 있는 단편으로 변환시키므로서 선택적으로 장 안(또는 기타 속이 빈 장기)으로 주입시킬 수 있게 된다.

실시 예 5

전달 장치

본 발명은 또한 세포 및 해부학적 부위에 특이적으로 전달할 수 있도록 하는 세심하게 제어되는 압력 조건하에서 물질을 투여하기 위한 다양한 전달장치를 포함한다. 이러한 장치의 한 예를 제 15도에 나타냈는데 담도계 접근식 캐뉼라(80)에는 중심 관(84)를 규정하는 늘어나는 관형 몸체(82)가 포함된다. 팽창 가능한 첫 번째와 두 번째 벌룬(86), (88)은 몸체(82)를 에워싸고 이 들은 이 들이 팽창되었을 때 담낭 안의 안쪽과 바깥쪽 벽면에서 마주보고 위치하도록 충분한 거리를 두고 떨어져있다. 벌룬(86), (88)이 팽창되면 이들이 카테터의 외표면과 밀착되게 되며 뚫어진 구멍을 통하여 카테터가 주입되는 것을 방해하지 않는다.

작은 오리피스 (90), (92), (94), (96)들이 캐뉼라(80)의 멀리 있는 평평한 원주면 위에 만들어지며 각각의 오리피스들은 캐뉼라(80)의 벽안에 있는 각각의 통로와 통하여 캐뉼라(80)의 더 가까운 부분에 있는 배출라인(98)과 통하도록 되어있다. 캐뉼라의 가까운 쪽에 팽창용 포트(100)과 (102)가 장치되어 있고 이들은 벌룬(86), (88)을 팽창 및 수축시키는 통로이다. 뾰쪽하게 잘려진 팁(106)을 갖고있는 딱딱한 투관침(104)와 뭉뚝한 핸드 말단부(18)은 캐뉼라(80)의 관내(84)로 밀려들어가기에 충분한 크기를 갖는다.

전달장치를 사용하기 위하여, 제 16도에 나타난 바와 같이 투관침(104)를 캐뉼라(80)의 관 내(84)로 주입한다. 외과 수술로 복강까지 도달한 후에(예컨대 복강경 또는 중앙선 절개를 통해) 투관침(104)의 뾰족한 팁(106)을 이용하여 담낭(40)의 벽면을 통하여 캐뉼라(80)을 삽입한다. 침투시킨 후에 첫 번째 벌룬(86)(수축된 상태)이 담낭(40)의 내부로 들어 갈 때까지 밀어 넣는데 두 번째 벌룬(88)(수축된 상태)이 담낭 안으로 들어가기 전에 멈추어야 한다. 포트(100)을 통해 가압된 유체(공기같은)를 주입하여 첫 번째 벌룬(86)을 팽창시키므로서 이것이 부풀어올라 담낭의 내부 표면과 딱 맞게되고 캐뉼라가 원하는 위치에 안정하게 고정되도록 만든다. 캐뉼라(80)의 먼쪽 면위에 뚫려있는 오리피스(90~96)을 통해 담낭에서부터 담즙을 빼낸다.

그런 다음 캐뉼라(80)에서부터 투관침(104)를 빼내고 (제17A도) 담낭(40)의 바깥쪽 표면 위에 두 번째 벌룬(88)을 부풀려 두 벌룬(86), (88)이 캐뉼라가 원하는 위치에 고정되도록(제 17도에 나타난) 만든다. 다른 한편으로, 제 17C도에 나타난바와 같이 캐뉼라(80)의 가까운 말단부 위에 실리콘 워셔(110)을 주입하여 담낭에 있는 캐뉼라가 관통하는 구멍의 바깥쪽표면 주위를 둘러싸므로 비교적 충격 없이 압력을 밀봉시킨다. 캐뉼라(80)을 고정시키고 벌룬 들을 부풀리고 난 뒤, 안에 들어있는 캐뉼라에 선택적으로 접근할 수 있도록 하기 위해 케뉼라의 가까운 말단부 위에 킵을 씌울 수 있다. 예시된 캡(112)는 스크류 캡으로 캐뉼라의 가까운 관 안에 있는 내부 나삿니(보이지 않음)와 맞는 나선형 나삿니(114)를 가지고 있다. 캡(112)는 선택적으로 제거할 수 있으며(예컨대 나사를 풀어서) 또는 이를 투과시킬 수 있다(예컨대 나사를 이용하여).

담낭에 접근시킬 필요가 있을 때 캡(12)를 빼내고 연장시킬 수 있으면서 유연한 관이 여러 개가 있는 카테터(120)을 캐뉼라(80)을 통해 삽입한다. 카테터 (120)은 멀리 있는 팁(124)에 인접해 있는 팽창 가능한 벌룬(122)(제 19도)을 가지고 있으며 제 19도에 나타난 바와 같이 담낭 안에 완전히 밀봉된 챔버를 만들기 위해 팽창 가능한 벌룬이 시스틱 덕트(42)를 폐색시킬 수 있는 위치에 올 때까지 캐뉼라(8)을 통해 카테터를 진전시킨다.

카테터(120)의 한 구체 예를 제 20A도의 확대된 모습으로 나타내었는데 이 카테터는 중앙에 있는 4분된 4개의 관강(126), (127), (128), (129)과 중심이 같은 바깥쪽에 있는 두 개의 관강을 포함한다. 최외각에 있는 관강(136)은 구멍을 통해 카테터(120)의 바깥쪽 면과 통하게 되어있다. 카테터(120)의 바깥쪽 관은 구멍(131)-(135)를 거쳐 카테터의 바깥쪽과 통하게 되어있다.

여러 가지 관강을 다른 목적으로 사용할 수 있다. 하나 또는 두 개의 관강은 담낭 안 및/또는 담도계 안의 압력을 감지하는데 이용할 수 있으며 다른 관강은 치료용 주입물을 주입시키는데, 다른 관강은 치료용 주입물을 빼내는데 이용한다. 하나는 헹굼용 유체를 주입하는데, 다른 하나는 빼내는데 이용할 수 있다.

또 다른 디자인의 카테터로서, 여러 개의 관강들은 구심점이 하나인 형태일 수 있다(제 21도). 구멍의 배열이 다른 예로서 제 22도에 나타난 제 20B도 또는 21도의 팁을 가지고 있는 것과 같은 카테터에 환형 밴드 형태로 구멍들이 배열된 여러 개의 구멍 밴드가 뚫어져있다. 첫 번째 밴드(140)은 헹굼용 유체를 카테터를 통해 담낭 안으로 주입하는데 이용되는 첫 번째 중앙 관강과 통해있다. 두 번째 밴드(144)는 카테터를 통해 헹굼용 유체를 빼내는데 사용할 수 있는 첫 번째와 원 중심이 같은 제 2 관강과 통해 있다. 세 번째 밴드(148)은 세 번째 관강과 통해 있으며 미리 선택한 유속/압력에서 카테터 안으로 약물/벡터를 주입하는데 사용되며, 네 번째 밴드는 벡터를 미리 정해진 압력에서 원하는 기간동안 적당한 세포와 접촉된 상태로 있게 한 후에 벡터를 담낭에서부터 빼내기 위해 네 번째 관강과 통해있다.

본 발명에 사용하기 위한 카테터에서, 접근하려는 공간의 위치에 따라서 관강들과 벌룬 (122)의 가깝거나 또는 먼 카테터 외부와 통하게 된다. 이중 및 여러 가지 기능을 제공하는데 단일-관강 카테터를 사용할 수 있지만 팁에 또는 팁 근처에 맞추어놓은(built - in) 변환장치를 가지는 카테터, 또는 최소한 두 개의 관강을 갖는 카테터가 일반적으로 바람직하며 그러므로 압력을 모니터링하고 주입을 쉽게 동시에 실행 할 수 있다. 그러나 만일 주입회로 안에 민감한 압력 변환장치가 포함된다면, 또 주입물 회로의 유체 흐름특성이 주입물을 공급할 때의 압력이 담낭 또는 기타 속이 빈 장기 내부의 압력을 정확하게 반영하게 하는 경우라면 맞추어놓은 변환장치가 없는 단일-관강 카테터를 사용할 수도 있다.

물론 예로 들지 않은 기타 일반적인 다른 디자인의 카테터가 업계의 숙련자들에게 알려져 있으며 본 발명의 상황에 유용하게 응용될 수 있다. 따라서 상기한 관강 구조물들은 본 발명의 상황에 유용하게 응용될 수 있다. 따라서 상기한 관강 구조물들은 본 발명을 예시하기 위한 것 일뿐 이 것으로만 국한되지는 않는다.

제 23도는 전달장치의 변형된 형태로, 이는 주입물을 담낭 내로 관강 내 전달하는 것뿐만 아니라 유사한 기타 장기 안에 사용할 수도 있다. 잘 알려진 바와 같이 폐엽(폐엽(160), (162) 및 (164) 같은)에서 나온 담즙은 순행식 방향(167)으로 담도관(biliary duct)(168), (170) 및 (172)를 통해 간에서부터 온쓸개관으로 이동한다. 제 23도는 간의 개별적인 로브(lobe)에서(로브(160)같은)부터 담즙을 배출하는 담도관 안에 팁이 자리잡을 때까지 카테터(120)을 시스틱 덕트(42)를 통해 역행식으로 간 덕트까지 뻗칠 수 있다. 팁이 이 위치에 있을 때 첫 번째 벌룬은 폐엽 (160)을 효과적으로 고립시키고 이어서 속이 빈 장기의 공간을 가압하기 위해 팽창 될 수 있는 위치에 있게된다. 카테터 상의 두 번째 벌룬(170)은 시스틱 덕트 안에 놓이는데 여기서 이것이 담즙이 담낭으로 이동하는 것을 막을 수 있다.

일단 카테터가 제 23도에 나타난 바와 같이 자리를 잡으면 압력 하에서 주입물을 카테터를 통해 간엽(160)의 담도관 시스템 안으로 주입시킬 수 있다. 제어기(보이지 않음)를 이용하여 주입물을 원하는 부위(정단 상피세포/ 관 주변 조직 또는 상피 하/ 동양 혈관 내 같은)까지 부위에 특이적으로 전달하는 것으로 알아낸 미리 선택된 압력(또는 부피)까지 제어 할 수 있다. 상피세포까지 특이적으로 전달하는 것이 필요한 경우, 카테터(120)의 멀리 있는 팁 안에 있는 압력 변환기는 연속적으로 또는 주기적으로 압력 측정값을 압력제어기로 보내어 관형 시스템 내에서의 압력이 부위에 특이적으로 전달이 일어날 수 있도록 하는 미리 선택된 수준 또는 그 부근으로 유지시킨다. 다른 한편으로, 카테터 관강들 중 하나를 통해 전달 부위와 유체가 통하는 외부 변환기를 통해 압력을 측정할 수 있다. 간 안으로 전달시키는 경우, 카테터 관강의 전부가 아니라면 최소한 하나라도 벌룬(122)에서부터 멀리 있는 위치에서 카테터의 외표면과 통해야만 한다 (제 24도).

실시 예 6

담낭 고유층으로의 벡터의 전사(Transfer)

20gm 쥐의 담낭 안에 관강이 두 개인 카테터를 외과적으로 심고 그 동안 클립으로 시스틱 덕트를 폐색시켰다. 마이크로인퓨전 펌프를 이용하여 관강중 하나를 통해 주입물을 투여했는데 그 동안 담낭 내 압력 변화는 다른 관강을 통해 압력 변환기로 측정하였다. 이 시스템은 주입 부피 또는 속도 변화에 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. 예컨대 30초에 걸쳐 0.9% NaCl 10㎕를 주입하면 압력 3㎜Hg 상승하고 30초에 걸쳐 20㎕ 주입하면 압력이 45㎜Hg 상승하였다. 조직 전자현미경(TEM)을 이용하여 주입압력을 달리하였을 때의 초미세 구조적 효과를 측정하였다. 낮은 압력에서는(3㎜Hg 상승하는 것 같은 ) 상피 폐쇄막은 파괴되지 않는 반면 주입 압력이 높으면( 압력을 45㎜Hg 상승시키면) 인접한 세포 폐쇄막이 파괴되었다(즉, 이들이 정상보다 물리적으로 넓어진 것으로 나타난다). 따라서, 폐쇄막의 광현미경 시험은 부위에 특이적인 전달을 하기 위하여 압력/유속/부피 수준을 선택하는 또 다른 접근방법이다.

아데노비루스(AV)와 아데노-관련비루스(AAV)를 낮거나(80㎕/20분) 또는 높은(80㎕/2분) 속도/압력으로 주입하고 담낭을 곧바로 제거하고 TEM을 이용 시험하였다. 주입 압력이 낮을 때, 바이러스성 입자들을 융모에 결합되는 과정에서 볼 수 있었으며 상피세포의 세포질 내 소포 안으로 내화된다. 주입압력이 높았을 때 바이러스성 입자들은(제 26도의 광 현미경 사진에 예시된 바와 같이) 고유층 안에서도 볼 수 있게된다.

유전자 전사의 선택성이 이 담낭 주입 파라메타에 의해 영향을 받는지의 여부를 결정하기 위해, 핵에 위치하는 LacZ유전자를 표현하는 재조합 아데노비루스의 상응하는 절대 바이러스 복용량을 낮고 높은 주입압력에서 전달하였다. 주입한지 3일 후에 조직을 제거하고 재 조합 β-gal 단백질에 대한 면역조직 화학법을 이용하여 측정하였다. β-갈락토시다아제 아데노비루스의 6×10⁸플래크 -형성단위 전달에 대한 결과도 다음과 같았다: 낮은 주입압력에서 유전자 전사는 상피세포들(7.2% 양성)에만 국한되었으며 높은 압력에서 주입하였을 때는 고유층 안의 상피 세포와 민무늬 근세포 모두에서(각각 7.2%, 8.3% 양성) 유전자 전사가 검출되었다. 이러한 결과는 관강 내 알력을 낮게 하여 담낭 상피세포로 전달 및 유전자 전사시키면 Zona Occluden의 파괴를 선택적으로 방지하며 높은 압력에서 주입하면 폐쇄막을 물리적으로 파괴시키므로 물질을 담낭 고유층으로 전달될 수 있게 만든다.

실시 예 7

간엽에 특이적인 전달 방법

본 실시 예는 제 23도에 나타난 바와 같은 카테터를 이용하여 쥐 안에 벡터를 간엽에 특이적으로 전달하는 것을 예시한다. 제 27도는 카테터를 주입하고 액체를 이들 간엽에 의해 특이적으로 전달하는 것을 예시한다. 제 27도는 카테터를 주입하고 액체를 이들 간엽에 의해 제공받는 바일 덕트(Bile Duct)로 전달하는 방법에 의해 240㎕의 0.9% NaCl을 30초에 걸쳐 간 전체로 역행식 담도 주입하면 240㎕의 0.9% NaCl을 30초 안에 간의 1/3로(오른 쪽 중앙 로브, 오른 쪽 측면 로브, 꼬리 로브) 주입하였을 때 보다 압력이 크게 감소함을 보여준다. 일단 간의 영역에서의 한계 압력이 결정되고 나면 폐쇄막이 확실히 파괴되는 피크압력을 이루기에 충분한 부피로 담체 안에 있는 아데노비루스를 주입시키므로 β-gal 아데노비루스 유전자 전사벡터를 간의 1/3까지 전달시켰다. 비록 초기압력 피크 이후에(동일한 부피흐름에서) 간의 관내 압력이 감소되었어도 타겟된 로브 안에서 간세포로의 상피하 유전자 전사가 관찰되었다. 타겟된 로브 이외에서는 유전자 전사가 발견되지 않았다.

실시 예 8

저압에서의 역행식 아데노비루스 담도 주입 이후의 DNA분포

쥐의 담낭에서부터 저압으로 역행식 담도 주입(부피 80㎕; 주입속도 0.066㎕/sec)시켜 Lac Z 아데노비루스를 전달시켰다. 이 쥐에서 떼어낸 간 조직을 DNA 분포 패턴에 관해 자체 DNA 잡종화시켜 평가하였으며 여기서 Lac Z DNA가 기본적으로 바일 덕트 내에 위치하였다. 바로 인접한 관 주변의 간세포에서도 약간의 DNA가 검출되었다. 이러한 분포는 유전자 발현 분석법으로 얻은 분포에 상응하였다. 바일 덕트 및 간의(Hepatic) Acina Zone 1 안에 있는 인접한 관 주변 조직으로 국소적으로 전달하는 것이 중요한데 그 이유는 이 부위를 포함하는, 간 섬유증을 포함한 여러 가지 중요한 병들이 있기 때문이다.

Lac Z 아데노-연관 비루스(AAV)를 이용하여 유사한 분포 패턴을 얻었다. 저압으로 역행식 담도 주입한지(부피 80㎕; 주입속도 0.066㎕/sec) 2일 후에 바일 덕트와 관 주변 간세포 안에서 Lac Z DNA가 발견되었다. 투여된 바이러스 복용량은 3×10¹⁰Dnase-Resistance Particles(DRP)/㎖ 였다. 저압식 주입을 한지 2일 후에 자체로 잡종화시켜 조직을 분석하였다. 조직을 면역조직 화학법으로 분석하여 AAV 1×10¹⁰DRD를 저압으로 주입한지 28일째 바일 덕트, 담관 세포 및 인접한 관 주변의 간세포 안에서 Lac Z DNA 발현을 발견하였다.

실시 예 9

토끼에 대한 압력에 관한 연구

팁 안에 압력센서가 달려있는 관강이 여러 개인 카테터를 가지고 주입에 관한 연구를 실행하였다. 카테터의 다른 관강들은 따로 된 포트를 통해 여러 가지 액체들은 주입, 배출시키도록 되어있다. 토끼의 담낭(시스틱 덕트가 폐색된) 안으로 0.9% NaCl을 주입한 결과는 쥐의 담낭에 주입하였을 때와 쥐의 역행식 담도 주입했을 때의 경우와 매우 유사한 특이한 압력변화를 일으켰는데 즉, 압력이 증가하여 피크압력이 된 뒤 일정치 않게 감소되고 거의 일정한 주입속도로 계속 주입하는 동안에는 평평하게 유지된다. 일단 주입이 끊기면 비록 시스틱 덕트가 폐색된 채로 유지된다 하더라도 압력은 즉시 급히 감소되어 주입 전 기본상태로 떨어진다. 그러므로, 해부학적으로 미소한 파괴를 시키기 위한 한계압력 위로 담도 내 압력을 높히므로써 만들어지는 장기 내에서의 해부학적으로 미소한 파괴를 통해 액체가 계속적으로 빠져 나오게된다.

쥐로 연구를 할 때, 반복하여 주입하면 초기 주입으로 얻어진 것보다 낮은 피크압력을 만들어낸다. 점도가 높은 물질(Hypague)을 주입하면 동일한 주입 조건 하(즉, 동일한 부피 및 주입속도)에서 점도가 낮은 물질을 주입했을 때 보다 담낭 내 압력이 더 크게 증가하였다. 담낭의 부피, 주입물의 부피와 속도 및 주입된 물질의 점도에 의해 압력을 결정하였다. 주입물의 부피를 작게 하고 곧이어 빼내는 방법을 사용하여 관강내 압력을 크게 올리지 않고 담낭을 세척할 수 있었다. 세척물의 부피/압력을 낮게 하면 상피 또는 상피 하로 투여되지 않고 세척용 유체가 관강 내에 머무르게된다.

각 토끼의 담낭 안으로 카테터를 삽입시키고, 시스틱 덕트를 폐색 시키고난 뒤 매우 적은 부피의 세척액으로 담낭의 매우 적은 부피를 세척하면(예컨대 부피가 1.5㎖인 담낭의 경우 세척액 0.5㎖ ) 장기의 관강 내 압력은 크게 증가되지 않았다. 그런 뒤 담체, DNA 또는 상응하는 량의 DNA를 향유하고 있는 리포좀으로 주입물을 만들었다. 주입물이 상피 또는 상피하로 투여되지 않도록 하면서 관강 내에서 유지되도록 매우 낮은 주입 부피/압력을 (담낭 1.5~2.0㎖에 주입물 부피 1㎖) 이용하였다. 매우 낮은 압력조건(예컨대 초기 압력보다 1~2㎜Hg 높은) 하에서 담체, DNA 또는 리포좀으로 유전자 전사가 전혀 관찰되지 않았다. 높은 압력조건(해부학적으로 미소한 파괴가 일어나는 것을 넘어 한계 피크에 도달하기에 충분한 부피를 담낭 안으로 주입하는) 하에서, 담낭 고유층 안의 담낭 상피 및 민무늬 근육에 리포좀 전달로 유전자 전사가 검출되었다. 중간정도의 부피/압력 범위(즉, 매우 높고 낮은 압력조건 사이)에서는 상피에만 국한되어 전달이 일어났다.

실시 예 10

배출의 최소화 방법

상피하 공간으로의 모든 누출 가능성을 더 줄이기 위해서 저압식 관강내 전달법을 림프 또는 정맥배출을 일시적으로 감소시키는 방법과 병행하였다. 한편, 상피하 공간에서부터 몸 전체로 배출되는 것을 지연시키므로서 감소시키기 위해 고압식 관강내 전달법을 림프 및 정맥배출을 일시적으로 감소시키는 방법과 병행하였다. 림프관 또는 정맥혈관을 외과적으로 또는 복강경을 이용해 폐색시키는 것과 같은 직접적인 방법을 이용하거나 그렇지 않으면(간에서와 같이) 폐색용 벌룬 카테터를 간정맥의 한쪽 또는 양쪽에 배치시키므로 림프 또는 정맥 배출을 일시적으로 감소시킬 수 있다.

조직을 관류시키기 위한 비-맥관식 방법을 이루기 위해 고압의 관강 내 전달법을 사용할 수도 있다. 고압식 조직 관류법(최소한 초기에는 한계 압력보다 높은)을 상세한 림프 또는 정맥 배출을 감소시키는 방법과 병행하므로서 다음의 사이 주입에서 몸으로 퍼지기전에 주입된 제재가 타겟 세포에 의해 흡수되기에 충분한 시간을 준다. 특별한 구체 예로, 고압식 역행식 담도 주입법을 간정맥 혈액이 몸 전체 순환계로 들어가는 것을 막기 위한 장치를 수반하지만 혈액의 정상적인 흐름이 간의 이상 발달조직을 지나가는 것을 막지는 못한다. 예컨대 관강이 여러 개인 벌룬 카테털를 간정맥에 삽입하여 팽창된 벌룬 이 카테터와 간정맥 벽면사이의 공간을 밀폐시켰을 때 간정맥 혈액은 몸의 순환계로 들어가지 않으면서 계속적으로 카테터 관강 안으로 흘러 들어오고 통과해 갈 수 있다. 제거된 혈액은 혈액이 환자에게로 되돌아가기 전에 투여된 약제를 제거하는 처리를 할 수 있다. 이러한 방식으로 고압식 관강내 전달법을 이용하면 치료제가 몸의 순환계로 곧이어 들어가지 않으면서 극히 많은 량의 치료제를 간의 이상발달 조직에 직접 투여할 수 있게 만든다. 이것은 특히 간동맥 또는 문정맥을 관류시킬 때 부딪치게 되는 맥관에 합병증이 생길 위험을 피하면서, 몸 전체에는 독성을 가질 수 있는 제재를 국소적으로 최적의 치료농도를 이룰 수 있게 하는 특별한 이점이다.

실시 예 11

간세포 내 폐쇄막을 정확히 파괴하는 고압의 역행식 담도 주입법

역행식 담도 주입 후에 관찰된 압력 변화의 패턴은 반복적인 주입을 하면 담도 내 피크압력을 현격히 낮추게 된다는 것을 발견한 것과 함께 역행식 담도 주입을 하여 담도관 및/또는 소관을 채우면 이어서 한계 압력에서 누출된다는 것을 보여준다. 물리적으로 열려진 폐쇄막을 직접적으로 통과하거나, 그렇지 않으면 상피를 통한 세포융해(Transcytosis) 속도를 조정하므로 관강 내 공간에서부터 유체의 이동이 일어날 것이다. 그러나 관찰된 압력 변화의 빠르기는 폐쇄막이 파괴되는 것이 보다 적당함을 보여준다. 구조적으로 변화되지 않은 폐쇄막에 대해 보통 일시적인 중금속인 란타늄쿨로라이드의 간 안에서의 분포를 정성적으로 초미세 구조적으로 평가하므로서 역행식 담도 주입이 폐쇄막을 파괴하는 능력을 평가하였다.

5 mM 란타늄클로라이드(sigma) 또는 0.09% NaCl 담체를 동물에게 역행식으로 주입하였다. 동물 하나 당 2 또는 8㎕/sec의 속도로 240㎕를 3회 주입하였는데 각 회당 10초씩 쉬었다. 조직을 갓 떼어내어 0.2M 코코디레이트 버퍼 내의 2% 글루타르알데히드 안에 넣어 밤새 고정시켰다. 표준 처리하고 사이에 끼워 놓아둔 뒤(embedding) 두께가 0.5㎛인 조각을 우라닐 아세테이트와 레드(lead) 시트레이트로 염색시켰다. Philips 201 전자 현미경으로 이 조각을 시험하였다.

제 28A-D 도의 전자 현미경사진에 보여지지는 바와 같이 5mM Lacl 720㎕를 2㎕/sec 또는 8㎕/sec의 속도로 투여하는 역행식 담도 주입한 후에 란타늄클로라이드의 존재와 일치하는 전자가 밀접한 침전물을 바일 덕트 안에서만 발견하였으며 바일 덕트에 일접한 상피 하 조직 소실에서는 발견할 수 없었다. 제 28A-D 도에서, 전자가 밀집된 침적물 영역은 순환되는 란타늄클로라이드의 존재와 일치한다.

그러나 제 29B-E 도의 전자 현미경사진에서 보여지는 바와 같이 담즙소관, 간세포 사이의 세포공간 및 동양 혈관 주변의 박리 공간(Space of Disse) 안에서 전자가 밀집한 침전물을 발견하였다. 제 29A도는 비교용 담체를 주입한 조직의 현미경사진이고 제 29B-E 도는 실험조직의 현미경 사진이다.

제 30A-C 도의 전자 현미경사진은 고압에서의 역행식 담도 주입물에 의해 흡수된, 화살표로 표시된 가능한 전체 경로를 보여주는데: 담즙소관에서부터 이들에 인접한 상피 하 소실까지 즉, 소관의 관강에서 부터 파괴된 소관의 폐쇄막을 통과하여 측면의 세포간 공간으로 , 이어서 동양 혈관 주변의 박리 공간까지의 경로를 보여준다.

고압으로 역행식 담도 주입한 직후에 LaCl이 간세포 사이의 세포공간과 동양 혈관 주변의 박리 공간 안에 존재하는 것은 폐쇄막의 투과성이 변하는 것과 정확하게 일치한다. 강하게 운반(세포 융해를 통한)시키면 관강내 공간에서부터 측면의 세포 사이의 공간 및 박리 공간까지 란타늄클로라이드가 이동하는 결과를 (그러나 실험 시간 안 에서는 가망이 없는) 얻을 수도 있다. 시간이 짧은 것 이외에도, 간세포 또는 담도 세포 안에서 란타늄클로라이드 입자들을 발견하지 못했다는 점이 세포 융해를 통해서 보다는 폐쇄막의 투과성이 조정되었기 때문임을 증명한다.

실시 예 12

역행식 담도 주입에 감응하는 담도 내 피크압력을 줄이는 만성 담즙 울체

간 내 및 간 외 담즙 울체(담즙 분비 중지)는 압력을 조정하는 전달법을 일정 질병에 응용할 수 있는지를 평가하기에 유용한 테스트 시스템을 제공하는 일반적인 만성적 상황이다. 만성적인 담즙 울체는 역행식 담도 주입에 대한 담즙 시스템의 역동적인 반응에 미치는 영향을 측정하기 위해 한 그룹의 동물들을 4일동안 간 외 담도 폐색시켰다. 마취시킨 뒤 중앙을 개복하여 온쓸개관을 보도록 하였다. 6-0 실크 타이를 사용하여 이자관과 연결되는 온슬개관 입구를 폐색시킨다. 6-0 실트를 사용해 복부 절개한 것을 두 겹으로 꿰매었다. 4일 후에 동물들을 마취시키고 다시 개복하였다. 온쓸개관을 폐색시킨 것보다 위쪽에 미소 혈관 클립을 해 놓고 카테터를 온쓸개관에 심었다. 그런 뒤 미소혈관 클립을 빼고 담도 내 기본압력을 측정하였다. 그런 다음 담낭 카테터를 심고 상술한 바와 같이 역행식 담도 주입을 실시하였다.

일정 범위의 역행식 담도 주입부피와 주입속도를 이용하여 담도의 입력을 잰 결과는 제 31도에 나타난 바와 같다. 4일 동안 담즙분비를 중지시킨 후의 담도 내 압력을 앞서 보여준 수치와 비교하였다(시간=0분; 폐쇄없음; t=10분; 10분간 온쓸개관 폐색). 간 외 담도 폐색을 시킨 지 4일 후에, 담도 내 기본압력(주입전)은 크게 상승되었다(정상 상태의 기본 값(normostasis baseline), 0.8 ±0.2㎜Hg(n=5) vs 4일간 담즙분비 중지, 8.2±1.0㎜Hg(n=10); P 〈 0.05). 담즙분비 중지 4일 후에 주입전 담도내 압력은 담도계를 10분만 폐색시켰을 때의 압력수준과 크게 다르지 않았다(10분간만 담즙 분비중지, 10.0 ±1.4㎜Hg(n=5) vs 96 시간 담즙분비중지, 8.2±1.0㎜Hg(n=10); P 〈 0.05).

제31A도는 담즙분비를 중단시킨 동물들은 순행식 동물에서 본 것과 거의 유사한 패턴의 압력 변화 즉, 피크압력에 도달할 대까지는 관강 내 입력이 급격히 상승하고 그 후로는 약간씩 감소한 뒤 주입이 완료될 때까지 그 수준을 유지하는 패턴을 갖는 것을 보여준다. 일단 주입이 중단되면 압력은 주입 이전으로 급격히 감소되게 된다. 정상 상태인 동물에서와 같이, 담즙분비를 중지시킨 동물에서의 압력변화 또한 주입 속도와 부피에 따라 달라진다. 주입속도를 빠르게 할수록 피크압력이 커지며 주입속도를 크게 한 시점에서 압력이 보다 빠르게 상승한다. 유사하게 피크 압력은 주입속도에 의존하며; 주어진 주입 부피에서 주입속도를 증가시키면 제 31B도에 보여지는 바와 같이 주입속도를 느리게 하여 얻어진 것보다 현격히 다른 피크압력을(P 〈 0.05) 얻게된다. 주입 마지막에서의 압력 또한 주입 속도와 부피 모두에 따라서 달라진다. 정상 상태인 동물과는 달리, 주입 전 압력도 부피를 더 크게 하고 속도를 더 빠르게 하여 주입한 후에 더 낮아지지는 않았다.

제 31C도에 나타난 바와 같이 정상 상태와 담즙분비를 중단시킨 동물 모두에서 역행식 담도 주입을 반복하면 담도 내 피크 압력이 초기 주입 때보다 낮아지는 결과를 나타냈다. 그러나 이러한 정상 상태인 동물들이 주어진 주입속도와 부피에서 초기 주입한 후의 담도 내 압력의 최대 변화가 담즙분비를 중지시킨 동물에서 보다 확실히 커지는 경향을 갖는다는 것이 보다 뚜렷해졌다. 부피를 크게 하고 주입속도를 더 빠르게 하면 정상 상태인 동물과 담즙분비를 중단시킨 동물 사이의 차이가 줄어든다는 것이 확실하다.

실시 예 13

정상 상태인 동물과 담즙분비를 중지시킨 동물 모두에서 폐쇄막을 파괴시키는 역행식 담도 주입법

정상 상태 및 담즙분비를 중단시킨 조건하에서 역행식 담도 주입이 폐쇄막의 투과도에 미치는 영향을 측정하기 위해, 실험하지 않은 새 쥐에 일정 범위의 주입속도와 부피를 이용하여 [14C]-수크로즈를 역행식 주입하고 이어서 4일 동안 만성 간 외 바일 덕트(Bile duct)를 폐색시켰다. 중앙선을 개복하고 양쪽 뇨관을 확인하고 미소혈관 클립으로 폐색시켰다. 카테터를 담낭 관강 안에 삽입시키고 위쪽 쓸개관을 폐색시켰다. 0.9% NaCl 또는 0.9% NaCl에 희석시킨 [14C]-스크로즈 2μCi(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)역행식 담도 주입물(22℃)을 일정범위의 주입부피와 속도로 투입하였다. 주입을 완료한지 5분 후에 흉골 중앙을 빠르게 절개하고 게이지 27 니들 및 시린지를 이용하여 심장 안에서부터 혈액을 빼냈다. 이혈액을 10단위의 소듐헤파린(Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ)이 들어 있는 1,5㎖ 미소 원리분리용 튜브에 즉시 넣고 5분간 4,000 RPM으로 원심분리 시켰다. 200㎕의 플라즈마를 빼내 15㎖ 신틸레이션 용액(National Diagnostics, Atlanta, GA)이 들어있는 유리 바리알에 넣었다. 신틸레이션 카운터(Beckman)로 방사성 카운트(cpm)를 하였다. 물리적으로 접촉되어있는 폐쇄막은 수크로즈를 투과시키지 못하기 때문에 이 실험 조건하에서 [14C]-스쿠로즈가 몸 전체 순환계에 나타났다는 것은 폐쇄막의 분리가 일어났다는 것을 뜻하는 것이다.

제 32도는 이 실험의 결과를 나타낸다. 정상 상태인 동물에서, 주입한 지 5분 후에 [14C]-스쿠로즈가 일정범위의 주입속도와 부피에 대략 상응하는 수준으로 몸 전체로 누출된 것이 검충되었다. 담즙 분비를 중단시킨 동물의 경우, 누출된 양은 같은 경우의 정상 상태인 동물에서 보다 적어졌다. 담즙분비를 중단시킨 동물에서 주입부피 또는 주입시간을 증가시키면 부근 세포(paracellular)로의 누출량이 더 커지게 된다.

담즙분비를 중단시킨 동물에서, 역행식 담도 주입을 하면 첫 번째 주입하는 도안의 담도 내 피크압력이 정상 상태인 동물에서 첫 번째 주입 조건하에서 관찰된 것보다 현격히 낮아지는 결과를 가져온다. 이것은 상습적으로 간 외 바일 덕트(Bile Duct)를 폐색시키면 역행식 담도 주입에 의해 유도된 것과 상관없이 어느 정도 폐쇄막이 파괴된다는 것을 보여준다. 그러나, 담즙분비를 중단시킨 동물들은 역행식 담도 주입을 하고난 5분후에 혈류 내에서의 [14C]-스쿠로즈의 양이 정상 상태인 동물에서보다 더 작아지는 경향이 있었다. 이렇게 확실하게 대조적인 발견에 대한 한가지 설명은 담도 내 피크압력은 열려진 폐쇄막의 직경에 및/또는 부근세포로 이동하는 추진력에 영향을 미치므로 특정 직경을 갖는 분자들의 부근 세포로의 누출량을 결정하게된다. 따라서, 본 실험에서 담즙분비 중지에 의한 것이라고 알려진 폐쇄막의 붕괴는 역행식 담도 주입을 하는 동안 수크로즈보다 더 작은 분자(예컨대, 물)가 어느 정도 누출되기에 충분한 것이었다. 이러한 유체의 누출은 역행식 담도 주입을 하는 동안 이루어지는 담도 내 피크압력의 상승정도를 최소화한다. 이렇게 담도 내 피크압력을 작게 하면 직경이 수크로즈 정도인 분자들이 겨우 빠져나가는 정도까지 넓혀져 있는 폐쇄막의 수를 줄일 수 있거나, 그렇지 않으면 수크로즈가 파괴된 폐쇄막을 통해 부근 세포로 이동하도록 유도하는 추진력(압력 구배)을 감소시킬 수 있다. 본 실시 예는 담도 내 압력의 절대적 수준, 폐쇄막의 파괴된 정도, 및 부근 세포로의 누출량 사이의 상관관계를 보다 정확하게 결정하는데 필요한 주입압력 및 직경이 다른 분자들의 범위를 알아낼 수 있다는 것을 예시한다.

실시 예 14

토끼의 방광으로의 관강 내 전달

요 생식로 시스템은 압력-조절된 전달을 할 수 있는 또 다른 관강 구조물의 예이다. 제 33A-D도는 방광을 채웠을 때 방광 내 조직학적 소실들에 미치는 효과를 예시하는 방광의 도식화된 단면도이다. 제 33A도는 비교적 비어있는 상태인 방광의 단면도이다(여기서,(200)은 변하는 상피세포, (202)는 고유층, 층(204), (206)은 근육, (208)은 외막이다). 제 33B도는 제 33A도의 색칠된, 압축되지 않은 벽면 부위를 확대한 그림이다. 제 33C도는 비교적 채워진 상태인 방광의 횡단면도이며, 제 33D도는 33C도의 색칠된, 압축된 벽면 부위를 확대한 그림이다. 화살표는 방광의 내용물에 의해 가해지는 압력의 방향이다.

요 저장고에서부터 느리거나 빠르게 채우거나, 정확한 부피로 강하게 채우거나, 또는 압력을 조절하여 팽창시키므로 방광의 막을 제 33A-D도와 같이 압축시킨다. 요도 역행식 카테터화는 방광으로 전달하기 위한 이미 알려져있는 방법이다. 그러나, 방광 압력이 분자전달에 미치는 영향은 이전에는 알려진 것이 없었다. 특히, 약물을 표면상피세포에 또는 고유층 및 근육층을 포함하는 더 깊은 조직학적으로 아래 있는 소실까지 선택적으로 전달하는 것을 강화시키기 위해 방광압력을 이용하는 방법은 이전에는 특성화되지 않았다.

요도 역행식 주입법을 모방하는 실험적 모델로서 네덜란드 줄무늬 토끼 수컷들(1-2㎏ BW)을 각각의 요도의 관강 안에 PE-50 튜브를 꽂고 밀어 넣어 팁이 방과의 관강 내로 들어가도록 만들었다. 요도 카테터 하나를 압력 변환기와 연결하여 관강 내 압력을 기록하는데 사용하였다. 다른 요도 카테터는 미소주입 펌프에 연결시켰다. 역행식으로 환류되는 것을 방지하기 위해 요관 위에 미소혈관 클립을 하였다. 혈관 루프를 이용하여 요도를 폐색시켰다. 5mM 란타늄클로라이드를 주입하여 관강 내 압력이 20㎜Hg 또는 50㎜Hg이 되었다.

10분 후에 조직을 떼어내 전자 현미경 관찰을 하였다. 25㎜Hg에서, 상피세포들 사이에 있는 세포공간에서 전자가 밀집된 점들이 검출되었다. 50㎜Hg에서, 상피가 누덕누덕하게 침식된 것이 보였다. 50㎜-100㎜ 관강 내 압력에서 20㎚ 형광성 미소 알갱이를 이용하여 갓-냉동된 부분을 평가하니 첫 번째 근육층에 바로 인접한 고유층 안에서 미소 알갱이가 발견되었다. 이 결과는 관강 내 압력을 증가시키면 방광 주입물을 상피세포 폐쇄막을 거쳐 전달할 수 있다는 것을 가리킨다.

어떤 상황에서 이것은 관강 내 부위로 전달해야하는 주입물의 전체부피를 줄이는데 사용할 수 있다. 주입물이 매우 비싸거나 또는 구하기 힘든 경우에는 특히 이로운 방법이다. 따라서, 압력이 조절된 관강 내 전달법의 이점은 취하면서 전달해야하는 주입물의 부피를 줄이기 위해서 관강 내 벌룬을 압력 조절된 전달법과 병행하여 사용할 수 있다. 전달해야하는 주입물의 부피를 줄이기 위해 주입물을 투여하기 전에 벌룬(들)을 팽창시킨다. 앞서 만들었던 이 기술을 응용하는 작업이 제34도에 나타났는데, 여기서 관강 내 벌룬(212)가 방광(214) 안에 보이고 카테터의 팁(216)은 이것을 통해 주입물이 전달되는 오리피스(216)을 가지고 있다. 방광의 관강 안으로 3,5 French Foley 카테터를 삽입하고 팽창 시켰다. 이렇게 하면 관강 안의 부피/압력을 여전히 높게 유지시키는 상태에서 주입물의 부피를 줄여 방광에 전달할 수 있게 만든다.

실시 예 15

항압식 전달 장치

앞서 나타낸 결과는 상피세포 또는 내피세포로 안이 씌어진 구조물까지 주입물을 관강 내 전달하는 것은 적당한 전달 파라메타들을 선택하므로서 관강 내 표면까지, 또는 더 깊은 상피하 또는 내피하 소실까지 선택적으로 타겟할 수 있다는 것을 가르킨다. 조직에 주입물에 반응하는 것과는 상관없이 전달압력이 일정하게 유지되는 안정 상태(steady state) 하에서 약제를 투여하는 것이 특히 유용하다. 예컨대 비-안정 상태인 전달 조건하에서 폐쇄막이 열린다거나 또는 구조물의 크기가 팽창하게 되면 관강 내 압력에 영향을 미치게 될 것이다. 이러한 면에서 안정 상태로 전달하는 측관을 이용하면 일정한, 미리 정해놓은 압력으로 주입할 수 있게 만든다.

제 35도는 일정 압력으로 관강 내 전달을 하기 위한 시스템의 작업예의 다이어그램이다. 유체 주입용기(222) 안에 있는 압력으로 조절되는 질소가스/유체의 경계면(220)이 항압으로 투여할 수 있게 만든다. Cole-Palmer 압력 조정기를 연결하여 실용 모형을 조절하였다. 저장용기에서 나온 유체는 모세 유리관(224)안에 있는 기포(228)를 추적하여 유속을 알아낸다.

주입라인(226) 가까운 곳에서 압력쎈서(230)가 주입유체의 압력을 알아낸다. 시스템을 만들기 위해 , 유체를 저장기에 넣고 이 유체로 시스템을 헹구고 채운다. 외과 수술을 하여 주입라인(226)을 동물의 장기에 꽂는다. 시스템이 작동되기 시작할 때 뉴마틱 써보- 압력조절기(보이지 않음)가 저장기(222)안의 경계면(220)에서 액체 레벨의 상부에 일정한 공기압을 제공한다. 조절기 세팅을 조정하여 동물에서와 동일한 높이(Z=0)를 유지시키는, 압력쎈서에서 원하는 압력을 얻게된다. 압력쎈서에서 읽은 값은 가한 압력(펌프압력)과 압력헤드(저장기 안에서의 액체 레벨의 상부와 주입라인의 높이사이의 높이의 변화로 인한 압력 증가)를 합한 것과 같다. 주입라인의 높이는 압력쎈서 및 수술대 위의 동물의 높이와 동일하게 하였다. 물론 저장기의 상부가 아니라 압력 쎈서에서의 압력이 일정하게 유지되는 또 다른 시스템을 이용할 수 있다. 이것은 부피가 큰 유체를 주입할 때 가장 중요하다. 구체적으로 저장기 상부에서의 압력이 조절된다면 그리고 많은 량의 유체가 주입된다면 압력은 압력헤드가 줄어든 만큼 서서히 증가된다.

시스템이 개시되면 일정한 압력으로 주입물을 동물에 전달시킨다. 시간이 지남에 따라 주입압력 및 내부 장기의 압력을 기록한다. 이것은 예컨대, 압력 변환기에 연결된 두 번째 카테터를 토끼의 방광 안에 넣으므로서 토끼의 방광시험을 하기 위해 했던 것과 같다 . 본 발명의 또 다른 형태로서, 전달 카테터의 팁을 통해 관강 내 압력을 측정하며 이 압력은 질소-가스/주입물-유체 경계면 에서와 같은 주입 유체의 압력을 제어하는데 이용할 수 있다.

주입물의 유속을 다음과 같은 방식에 따라 실험적으로 기록하였다. : 길이를 측정한 기포튜브 안으로 부피를 알고 있는 물을 (시린지(232)에서부터)주입시키므로 기포 튜브의 단면적을 알아내었다. 단면적은 0.233㎠(15㎝안에 0.35㏄)였다. 흐름이 시작되면 공기 기포가 주입 유체 흐름 안으로 서서히 주입된다. 기포는 기포튜브를 따라 이동한다. 기포는 튜브 끝에서 기포트랩(234) 안으로 올라가고 동일한 부피의 액체를 배출시킨다. 각 기포에 대해 자(229)의 1㎝ 간격 당 25개의 시점에서 기록되었다. 기포가 진행된 시간 대 거리를 플롯하여 만들어진 라인의 기울기가 기포의 속도가 된다. 이 기울기를 기포 튜브의 단면적과 곱하면 주입 유체의 평균 유속이 나온다. 이러한 유속 측정방법은 예를 들기 위한 실용모형 및 실험 모델이다. 실제로는 초음파나 기타 업계에 공지된 방법으로 유속을 결정할 수도 있다.

실시 예 16

토끼의 방광으로의 항압식 전달법

실용 모형으로서, 실시예 14에 기재된 전달장치를 사용하는데 요관 카테터를 항압식 투여장치와 연결하는 것으로 변형시켜 사용하였다. 카테터 하나는 주입유체를 전달하고; 다른 하나는 방광 내 압력을 측정한다( 이것 또한 시간에 따라 기록하였다). 주입용 카테터를 통해 방광을 비우고 염류액으로 2회 헹구고 난 뒤 주입용 유체로 다시 한번 헹군다. 방광을 바람직한 안정상태 압력 즉, 실험에 항압 시스템을 적용하기 위해 책정한 것과 같은 압력에 이를 때까지 처리하였다.

스탑코크(234)(제 35도)를 통해 시린지로 방광을 헹구고 초기 주입하였다. 일단 방광 내부 압력이 원하는 실험압력에 도달하면 항압 시스템에서부터 주입라인으로 흐르도록 스탑코크(234)를 돌렸다. 그런 뒤 60 - 90분 동안 5 - 50㎜Hg의 항압을 유지하면서 0.9% NaCl을 주입하였다. 항압 시스템이 켜지면(작동되면) 방광 내 압력이 처음 떨어지게 된다. 이것은 아마도 시린지로부터 가해진 압력과 시스템에서부터 가해진 압력 사이의 차이 때문일 것이다. 방광 내부압을 원하는 압력까지 상승시키기 위해 시린지로 가해주는 압력은 항압 시스템이 가해주는 압력(원하는 압력과 동일한)보다 10이상 크다.

유속은 주입압력과 직접적인 연관이 있다. 전체 주입 시간에 대한 유속은 일정하지 않았다. 그러나 짧은 간격에 걸쳐 기포가 기포 튜브를 통해 이동하는 시간, 유속은 비교적 일정하였다. 제36도는 토끼의 방광에 일정한 압력으로 관강 내 투여하는데 있어 선택된 버블에 대해 대표적인 시간 대 기포의 거리 플롯을 나타낸다. 기포 플롯의 기울기는 시간에 따라 감소된다. 각각의 계산된 유속을 시간에 대해 플롯하였다(d=1㎝와 d=25㎝의 시간평균). 토끼의 방광으로 주입하는 경우 유속은 대수적으로 감소하였다. 제 37도는 토끼의 방광주입에 관한 시간 대 유속의 그래프이다.

실험을 하는 동안, 근육이 이완됨에 따라 방광이 서서히 팽창되는 것을 보였다. 원하는 압력이 낮을 때(예컨대, 25㎜Hg), 내부 압력은 45-70분 이내에 원하는 압력에 도달하였다. 일단 방광의 내부압력이 원하는 압력 또는 주입압력에 도달하면 방광으로의 흐름이 멈추게 된다. 원하는 압력이 높다면(예컨대, 50㎜Hg), 내부압력은 항상 체류시간 90분 안에 원하는 압력에 이르지 못했다.

주입압력과 방광 내부 압력 사이의 차이는 방광 내로의 유속에 비례한다. 압력의 차이를(가해진 압력 대 방광 내부의 압력) 시간과 유속(두 번째 y축 상에)에 대해 플롯하면 두 플롯은 유사한 형태를 나타낸다. 이것은 모든 토끼의 방광 주입하는 경우에 그러하다. 제 38도는 대표적인 그래프이다.

토끼의 방광주입에 관한 유속 대 시간의 플롯은 주입압력과 유속이 달라도 동일한 모양을 갖는다. 초기 방광부피는 유속 대 시간을 관련시키기 위한 유용한 표준인자로 변한다(제 39도). 토끼들의 초기 방광 사이즈는 최소한 인자 10정도 차이가 난다. 만일 준비해 놓은 방광의 사이즈(5.578㏄)로 유속(㎤/min)을 나누면 방광이 원하는 유체의 양, 그리고 시간 대 (유속)/(준비된 방광의 사이즈) 커브를 하나의 챠트로 그래프할 때 하나로 모았다. 이것은 제 39 및 40도에서 볼 수 있다.

항압식 주입을 하는 동안 외부에 고정된 초음파 크리스탈(Sonometrics, Toronto)을 이용하여 세로, 중간, 배(ventral)-등(dorsal)의 직경을 계속적으로 측정하므로 방광의 부피를 알아낼 수 있다. 방광의 모양은 타원체라고 가정하였다. 일정한 주입압력을 유지하는 범위 내에서 안정 상태 주입을 하면 전달 압력에 의존했던 속도로 방광 안으로 흐르게 된다. 일정한 주입압력이 높으면 유속 또한 따라서 증가하였다. 25㎜Hg의 안정 상태 압력에서 토기의 방광 안으로 120분 동안 항압 주입하면, 시간에 따라서 유속이 감소하였다. 주입된 물질의 부피는 방광의 전체 부피(방광의 관강 내 용량 + 방광 벽면의 두께) 변화로 완벽하게 알아낸다. 이것은 방광을 강하게 늘이면 일정한 주입압력 22㎜Hg에서 시간에 다라 유속이 급속하게 감소되는 결과를 가져온다. 이와는 반대로 50㎜Hg 안정 상태 압력에서 120분간 일정 압력으로 주입시키면 시간에 다라 감소되지 않는 지속적인 유속을 가지게된다. 방광의 부피는 전달하는 과정동안 크게 증가하지 않았는데, 이는 50㎜Hg의 일정한 주입압력으로 유속이 유지되기 때문에 유체가 방광의 상피세포를 통해 이동한다는 것을 가리키는 것이다.

방광에서, 어떤 크기를 갖는 치료제들을 상피하 소실까지 전달하는 속도는 초기에 노출된 일정압력의 수준에 의해 영향을 받을 뿐 아니라 일단 상피 폐쇄막이 파괴되고 난 뒤 유지되는 압력의 수준에 의해서도 영향을 받는다. [14C]-스쿠로즈(3.8μCi/㎖)를 120분 동안 25, 37.5, 50㎜Hg의 일정한 주입 압력으로 투여하였다. 헤파린으로 응혈을 방지하게 만든 경정맥(Heparinized Jugular Venous) 카테터를 사용하여 t=-5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 60, 90 및 120분에서 플라즈마 샘플을 얻었다. 400㎕의 플라즈마에서 14C 함량(cpm)을 측정하였다. 상술한 시험의 결과로 25 - 50㎜Hg에서 폐쇄막이 파괴되고 고유층 안에 200㎚ 라텍스 미소 알갱이들이 침척된 TEM 증거를 얻었기 때문에 수크로즈도 고유층안에 들어갈 수 있고 정맥 및/또는 림프액 배수로를 통해서 몸 전체 순환계로 들어갔을 거란 추측을 할 수 있다. 그러나 몸 전체에 [14C]-스쿠로즈가 누출된 증거는 없었다. 대신 방사성 측정하니 방광의 외표면 위에 놓인 거즈에서 [14C]-스쿠로즈가 검출되었다.

이것은 방광내 압력을 높게 유지하면 미세한 탈루가 일어나 방광을 통해 빠르게 이동되는 경로를 제공하게 된다. 처음에는 폐쇄막을 파괴한 뒤 5 - 10㎜Hg의 일정하게 낮은 압력으로 유지시키는 방법 같은 적당한 주입조건을 선택하면 크기가 작은 분자들을 상피하 공간으로 느리게 관류시킬 수 있다.

실시 예 17

쥐에서의 항압 역행식 담도 주입법

앞서 설명한 바와 같은 역행식 담도 주입장치를 이용하여 쥐에서의 항압 주입법을 평가하였다. 미소주입 펌프 대신 항압장치로 대체하였다. 정상 상태인 쥐 및 만성적으로 담즙분비가 중지된 쥐(4~21일 동안 계속적으로 간 외 바일 덕트가 폐색된)들에게 모두 [14C]-스쿠로즈 (분자량 342; 3.8μCi/㎖)를 투여하였다. 상기한 기포 튜브 방법을 이용하여 주입 유속을 기록하였다. 혈액 샘플을 얻어 상기한 바와 같이 평가하였다.

쥐의 담도 주입 유속은 전체 체류시간동안 일정하였는데, 이는 시간에 따라 감소하는 토끼의 방광의 유속과는 다른 것이다. 토끼의 방광 실험에서와 같이 항압으로 역행식 담도 주입을 한 결과 유속은 투여 압력과 직접적인 관계가 있다는 것을 알았다.

제 41도는 정상 상태인 쥐 및 만성적으로 담즙분비가 중지된 쥐들에서, 가해진 압력의 함수로서의 주입물 유속의 그래프이다. 제 42도는 일정 압력이 다를 때의 저항(가한 압력/유속)의 그래프이다.

흐름에 대한 저항은 주입압력이 최저일 때 최고가 되고 주입압력이 상승할수록 감소한다. 만성적으로 간외 바일 덕트를 폐색시키면 간 내 폐쇄막을 파괴시키는 것으로 알려져 있는데, 이는 이들 동물에서의 흐름에 대한 저항이 감소됨을 반영하는 것이다.

압력이 일정한 조건하에서, 본래의 폐쇄막에 의해 보통 차단되는 용질들은 전체 혈류 안에서 검출되었다. 측정된 용질로는 수크로스(분자량 370), 이눌린(분자량 5200), 덱스트란(분자량 7000)이 포함된다. 주입압력이 낮으면 분자량이 큰 용질은 흐르는데 더 큰 저항을 받고(제 43도 참조. 이눌린 4일 vs 수크로즈 4일) 유속도 느려진다(표 1참조). 다른 주입압력에서의 [14C]-스쿠로즈와 [14] 이눌린에 대한 유속을 비교하는 표1은 유속, 저항 및 근접세포 누출 수준(평균수치)을 수록하였다.

실시 예 18

토끼의 담낭으로의 항압 주입법

토끼의 담낭을 비우고 담낭의 관강 내로 실리콘 카테터(030" ID/ 065" OD)를 심고 밀봉하여 담낭으로 일정압력으로 주입하였다. 담동맥 또는 정맥을 폐색시키지 않도록 조심하면서 미소혈관 클립을 사용하여 시스틱 덕트를 폐색시켰다. 담낭 카테터와 상술한 바와 같은 항압장치를 이용하여 20분 동안 40㎜Hg의 일정한 압력으로 [14C]-수크로즈 (3.8μCi/㎖)를 주입하였다. 플라즈마 샘플을 얻기 위해 헤파린으로 응혈을 방지하게 만든 경정맥 카테터를 사용하였다. 시점을 달리하여 플라즈마 샘플들을 얻고 신틸레이션 카운터(Beckman)로 측정하였다.

제 43도는 실험이 진행되는 동안 유속과 근접세포로의 누출([14C]-스쿠로즈의 플라즈마 함량) 모두를 플롯하였다. 유속은 처음에는 높았지만 빠르게 감소되어 대략 안정된 수준으로 되었다. 유속이 빠르게 감소되는 것은 주입물로 담낭을 채우는 기간 때문이었다. 흐름이 거의 일정한 기간(4~20분)은 주입물을 수용하기 위해 담낭이 늘어났거나 또는 담낭 관강에서 부터 주입물이 누출되었다는 것을 가리킨다.

주입과정 동안 플라즈마[14C]가 계속 상승한 것은 일정한 주입 속도에 관해 설명한 바와 같이 담낭이 늘어나기보다는 근접세포로 누출된 것과 일치한다. 주입이 계속되지 않아도 근접세포로의 누출이 계속되는 것은 아마도 수크로즈가 고유층 안에 있는 정맥 및/또는 림프액 모세관 안으로 흡수되는데 필요한 시간과 관강 내 상피하의 압력 구배의 조합에 의한 것으로 짐작된다.

실시 예 19

토끼에서의 항압 역행식 담도 주입법

시알스틱 카테터(030" ID/ 065" OD)를 역행식 주입하게 연결되는 구멍을 가진 온쓸개관의 관강내로 삽입하고 고정시켰다. 상기한 바와 같은 압력장치와 온쓸개관 카테터를 이용하여 20분 동안 20, 30, 또는 40㎜Hg의 항압에서 [14C]-수크로즈 (3.8μCi/㎖)를 투여하였다. 헤파린으로 응혈을 방지하게 만든 속목 (Internal Jugular) 카테터를 사용하여 플라즈마 샘플들을 신틸레이션 카운터(Beckman)로 측정하였다. 제 44도는 일정한 주입압력을 20, 30, 40㎜Hg로 하였을 때 시간에 대한 유속의 그래프이다. 제 45도는 20, 30, 40㎜Hg에서 시간에 대한 근접 세포로의 누출량의 그래프이다. 유속은 주입압력에 비례하였으며 일단 안정 상태 수위까지 오르면 거의 일정하게 유지된다. 근접 세포로의 누출 또한 주입압력에 비례하였다.

실시 예 20

일정한 압력으로 관강 내 주입을 하면, 한정된 압력을 혈관의 내표면에 집중적으로 작용하게 만든다. 제 46A도는 체내 민무늬 근세포(318)에 둘러싸인 관강(302) 안에 카테터(300)이 자리 잡은 도식화된 단면도이다. 카테터(300)은 화살표가 가리키는 방향으로 압력을 조절하여 가하게 된다. 관강(316)을 포함하는 카테터는 혈액이 혈관을 통해 흐르고 한정된 맥관 단편이 카테터 원주 상의 벌룬들에 의해 고립되고 일정한 압력으로 주입되는 동안 회로를 통해 계속 흐를 수 있게 만든다. 제 46B도는 몸 안의 관강(302)내에 있는, 팽창된 벌룬(304)를 갖고있는 카테터(300)의 부분적 수직 단면도이다. 혈액은 카테터(300)의 관강을 통해 화살표 방향으로 흐른다.

카테터(300)로 주입을 하여 죽상경화성 플라크를 압축시키거나, 또는 표면 상피세포들 사이의 폐쇄막을 파괴시키므로 주입물이 압력 구배를 따라 맥관성 민무늬 근세포 같은 조직학적으로 더 깊은 세포에까지 이동할 수 있게 만든다. 그렇지 않으면 표면의 투과성을 증대시키기 위해 약제 또는 기타 제재를 정단 표면에 가할 수 있다. 조직학적으로 더 깊은 소실들까지 분자들을 전달하기 위해 압력 구배를 이용할 수 있다.

카테터는 제 47도의 횡단면에서와 같이 여러 개의 관강을 가지는 것이 바람직하다. 최고로 큰 관강(306)은 혈액 흐름의 경우에 바람직하게 사용되는 반면, 작은 관강 (308), (310), (312) 및 (314)는 ; (1) 벌룬을 팽창 및 수축시키는데, (2) 벌룬들에 의해 고립된 공간으로 치료용 물질(들)을 전달하는, (3) 벌룬들에 의해 고립된 공간 안에서의 압력을 측정하는데, (4) 벌룬들에 의해 고립된 공간의 부피를 측정하기 위해 초음파 또는 기타 수단들을 이용하는; 것과 같은 목적으로 사용될 수 있다.

실시 예 20

약리학적 및/또는 물리적 조정법과 압력 구배를 병행하는 방법

본 발명의 방법에 따라 만들어지고 이용되는 압력 구배를 이용하는 방법을 폐쇄막의 파괴를 증가(또는 감소)시키는 약물 또는 동일한 효과를 갖는 물리적인 처리법과 병행하여 이용하면 치료용 제제를 조직에 또는 세포에 특이적으로 전달하는 효과를 증진시킬 수 있다. 예컨대, 폐쇄막의 약리학적 파괴와 마찬가지로 전기적으로 또는 음파를 이용하여 파괴하면 치료용 제제를 상피하 또는 내피하 조직 소실들까지 보다 효과적으로 전달할 수 있게 만든다. 분자들이 압력 구배를 따라 이동하는 경로를 약리학적으로 만드는 한 예는 미국특허 제 5,864,014, 제 4,827,534 호 및 5,664,389호에 기제된 Zona Occludens Toxin을 이용하는 것이다.

실시 예 21

용량 측정 방법

조직 소실의 유효부피를 계산하기 위해 내장, 도관 또는 혈관의 팽창을 측정하는 방법을 상술한 바와 같은 항압식 관강 내 전달법과 병행할 수 있다. 이러한 방법에는 조직 소실의 직경을 측정하기 위해 기술된 관강 내 초음파를 사용하는 방법이 포함된다. 이 방법은 용량, 즉 소실 안의 압력의 함수로서의 소실의 부피를 직접 측정할 수 있게 만든다. 치료제를 주입하기 전에 용량을 알아내면 개별적인 생리적 기능에 미치는 변화를 줄이는, 특정 조직으로의 전달의 선택성을 더 좋게 만든다. 관강내 초음파법 또는 기타 조직의 소실을 측정하는 다른 방법들을 압력-조절된 전달법과 병행하면 치료용 제제의 전달 깊이를 알아낼 수 있다.

본 발명의 방법 및 장치를 적당히 변형하여 제제들을 귀밑샘 또는 침샘 같은 상피 장기의 관 안으로 전달시킬 수 있다. 모든 해부학적 부위에서, 치료용 물질에는 유전자 치료 벡터, 예컨대, 아데노 비루스, 아데노-관련 비루스, 레트로비루스, 헤르페스 심플렉스 비루스, 렌티비루스, 하이브리드 비루스, DNA 플라스미드, 분자 컨주게이트 및 리포소옴 등이 포함될 수 있다. 이러한 방법들을 이용하여 유전자 치료법으로 치료할 수 있는 질병에는 대사성 질환(콜레스테롤 대사 이상 포함), 간 섬유증(항-염증성 유전자 IL-10을 표시하는 유전자로), 간세포의, 췌장의, 담낭 콜론, 방광, 자궁, 난소의, 경부의, 요관의, 신장의, 침샘 또는 귀밑샘의 암종(프로-염증 유전자, 아데노 비루스성 Ela-유전자 같은 기타 항-종양 유전자를 표시하는 유전자로), 경화성 담도염 또는 원발성 담즙성 간경변증(IL-10 같은 항-염증약의 표현을 이용하여), 낭성 섬유증(간담도계, 췌장 및 장의 상피 세포에 유세하게 전달되는 CFTR 유전자를 표시하므로서) 및 면역억제(예컨대, 간담도 상피 세포에 우세하게 전달된 진균성(fungal)유전자의 표현에 의해)를 보인 타입의 간담도 감염 등이 포함된다.

본 발명의 방법 및 장치를 적당히 변형시켜 제제를 동맥 또는 정맥 같은 맥관 구조물의 관강 안으로 전달시키는데 이용할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법 및 장치를 적당히 변형시켜 제제를 가슴 림프관, 샘(gland) 같은 림프관으로 전달하는데 이용할 수 있다. 모든 해부학적 부위에서, 치료용 물질에는 유전자 치료용 벡터, 예컨대, 아데노 비루스, 아데노-관련 비루스, 레트로비루스, 헤르페스 심플렉스 비루스, 렌티비루스, 하이브리드 비루스, DNA 플라스미드, 분자 컨주게이트 및 리포소옴 등이 포함될 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 유전자 치료를 할 수 있는 질병에는 맥관 이식 후, 또는 혈관 성형 수술 후에 이들 맥관이 재 협착되는 것을 막는 경우가 포함된다(항-염증성 유전자 IL-10 또는 기타 신생 내막이 두꺼워지는 것을 방지하는 유전자들을 표시하는 유전자를 이용한).

어떤 구체 예에서는 ,이 방법 및 장치로 치료용 제제를 전달하기 위한 목적의 압력 구배, 예컨대 구조물의 내부에서의 압력이 구조물의 조직적으로 더 깊은 성분들 보다 크므로 해서 안쪽에서부터 바깥쪽으로 흐르게 만드는 경우인 압력 구배를 만들어 낸다. 상피 장기 또는 도관의 경우, 이러한 압력 구배가 생겨 관강 내 압력이 고유층 안의 압력 보다 크고, 고유층에서의 압력은 근육층에서 보다 크고, 근육층 에서의 압력은 장막에서의 압력보다 커지게 만든다. 맥관 구조물의 경우, 압력 구배는 관강 내의 압력이 중막 또는 외막에서의 압력 보다 커지도록 만들 수 있다. 압력구배를 만드는 것은 상피세포, 내피세포 또는 죽상판을 제거하고 난 뒤 내부 또는 외부에서 압력 구배를 가하는 것과 같은 보다, 안쪽 층으로 접근하는 방법과 병행할 수 있다. 그렇지 않으면, 압력 구배를 형성하므로서 구조물의 더 바깥쪽 성분들에서의 압력이 안쪽에서의 압력보다 커서 흐름이 바깥쪽에서부터 안쪽을 향하여 흐르도록 만들 수 있다. 상피 장기 또는 도관의 경우, 장막 내에서의 압력이 근육층, 고유층 또는 관강 내에서의 압력보다 커지도록(또는 압력 구배가 그 방향으로 형성되도록) 압력 구배를 만들 것이다. 맥관 구조물의 경우, 외막에서의 압력이 보다 안쪽인 구조물 내에서의 압력보다 커지도록 압력 구배를 만들 것이다. 신경의 경우, 신경 외막 또는 기타 구조물에 압력 구배가 적용되고 신경 섬유의 안쪽 부분까지 전달된다. 압력 구배를 만드는 작업은 외막, 신경 외막 또는 장막을 벗겨내고 이어 안쪽, 바깥쪽 압력 구배를 적용하는 것과 같은, 보다 안쪽에 있는 층으로 접근하기 위한 기법과 병행할 수 도 있다.

본 문에서 사용된 "치료제"라는 용어에는 의학적인 진단을 하는데 사용되는 진단제가 포함된다. "미리 정해진" 압력, 유속 및 부피는 특정 환자에서 측정한 것이거나 또는 이미 존재하는 데이터에서부터 얻어진 값이다. "비-맥관성" 이란 용어는 "혈관이 아닌" 이란 뜻이다. 그러나, "맥관" 이란 용어에는 림프관과 혈관이 모두 포함된다. "외과적" 이란 용어에는 몸의 내부 또는 몸의 장기로 접근하기 위한 모든 기법이 포함되며, 여기에는 통상적인 외과적 수술 뿐 아니라 내시경법 또는 복강경법이 포함된다. "관강"이란 속이 빈 또는 튜브형 장기(담낭 또는 도관 같은) 안에 있는 공간 또는 통로이다. "hepatic"은 간을, "biliary"란 담낭 또는 바일 덕트를, "hepatobiliary"란 담낭, 간 및 바일 덕트(소관 포함)-담즙을 모으고 두 장기 사이를 통하게 하는)-를 가리키는 말이다. 장기 안에 있는 "고립된" 또는 "가압된" 챔버는 유체를 완전히 밀봉할 필요는 없지만 장기의 챔버 안에 적당한 압력을 이루기에 충분한 정도로 장기의 챔버로 부터 유체 흐름을 줄일 뿐이다.

"한계 압력" 이란 상피 전달이 시작, 상피 하 전달이 시작, 몸 전체로의 전달이 시작, 또는 기타 다른 타입의 전달(상술한 타입의 전달이 바람직하게 혼합된 것 같은)이 시작되는 압력이다. 한계치의 특별한 예는 폐쇄된 장기의 공간 안에 진입되는 피크 압력이며 실제적인 상피 하 전달을 일으키는 해부학적으로 미소한 파괴가 일어났음을 나타낸다.

다음의 청구 범위에 사용된 바와 같이 단수에는 복수도 포함된다. 따라서, "a"는 하나 이상을 포함한다는 의미이다.

본 발명의 기본 원리를 여러 가지 구체 예를 들어 보였으나, 업계의 숙련자들은 발명의 기본 원리에서 벗어나지 않게 하면서 이러한 구체 예들의 배치 및 세부 사항을 변형시킬 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (78)

1. 장기의 안에 있는 또는 이와 인접한 챔버를 완전히 밀폐시키고 치료제 또는 진단제로 구성된 유체를 미리 정해 놓은 압력, 유속 또는 부피로 투여하여 이를 미리 선택해놓은 구역으로 전달하는 것으로 구성된; 치료제 또는 진단제를 전달하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 미리 선택해 놓은 구역이 장기의 조직적 층인 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 조직적 층이 (a) 상피 또는 상피 하 층; (b) 내피 또는 내피 하 층; (c) 장막 또는 장막 아래 층; 및 (d) 외막 또는 외막 아래 층 ;으로 구성된 그룹에서부터 선택된 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 장기가 혈관 또는 속이 비어있는 내장으로 구성되고, 미리 정해놓은 압력, 유속 또는 부피로 투여하는 것을 제어하기 위해 이 혈관 또는 내장의 내부를 고립시키는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 미리 정해놓은 압력, 유속 또는 부피로 투여하는 것을 제어하기 위해 장기의 바깥 영역을 고립시키는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   장기의 속이 빈 공간 안에 폐색된 챔버를 형성하거나, 또는 장기 또는 장기의 일 부분의 주변에 폐색된 챔버를 형성하고;

   장기의 속이 빈 공간 안으로 또는 장기 주변의 챔버 안으로 유체를 투여하고;

   폐색된 챔버 안으로 투여하는 유체의 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하므로서 약물을 얕은 층보다 더 깊은 구역으로, 또는 실제적으로 장기의 공간을 둘러싼 얕은 층으로 만 선택적으로 전달시키거나, 또는 장기의 외부 표면으로, 또는 실제적으로 장기 외부 표면 깊숙한 층으로만 전달시키는 ; 것으로 더 구성되는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 치료제(agent)가 상피 하로 전달되는 것을 막는 해부학적으로 미소한 막을 파괴하는 한계 압력을 측정하고; (a) 얕은 층 까지만 전달 할 필요가 있을 때는 한계 압력 보다 낮은 압력으로 유체를 투여하고, 또는 (b) 얕은 층 보다 깊은 구역까지 전달할 필요가 있을 때는 한계 압력 또는 이 보다 높은 압력으로 유체를 투여하는 것으로 구성된; 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것이 액체의 압력을 제어하는 것으로 이루어지는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 액체의 압력을 제어하는 것이 장기의 내부의 압력 구배, 또는 장기를 가로지르는 압력 구배를 제어하는 것으로 이루어지는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 액체의 압력을 제어하는 것이 액체를 일정 압력으로 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 속이 빈 장기의 관강 안으로 접근하고, 관강의 유출구를 완전히 폐색시켜 폐색된 챔버를 만들고 그 곳에서부터 치료제 또는 진단제의 작용을 방해하는 체액을 제거하기 위해 이들을 흡출해 내는 것으로 구성된; 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 장기의 내부를 비운 후에 치료제 또는 진단제의 작용을 방해하는, 장기 안에 남아있는 미량의 체액을 제거하기 위해 헹구는 것으로 더 구성되는 방법.
13. 제 6 항에 있어서, 치료제 또는 진단제로 이루어진 유체를 투여한 후에 이들을 제거하기 위해 장기의 내부를 비우는 것으로 더 구성되는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 치료제 또는 진단제를 제거하기 위해 장기의 내부를 비운 후에 이들의 잔류물을 제거하기 위해 장기의 내부 공간을 헹구는 것으로 더 구성되는 방법.
15. 제 6 항에 있어서, 얕은 층은 속이 빈 장기의 공간을 둘러싸는 상피 세포로 구성되고, 얕은 층보다 더 깊은 구역은 상기 상피 세포 속 깊은 구역으로 구성되는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것이 속이 빈 장기의 공간을 나오는 유출구를 실질적으로 폐색시킨 뒤 유속 또는 부피를 변화시켜 원하는 압력을 얻는 것으로 구성되는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것이 특정 부피를 닫혀있는 챔버 안에 투여하는 것으로 구성되는 방법.
18. 제 1 항에 있어서, 선택해놓은 해부학적 부위 또는 해부학적으로 미소한 부위로 전달하기 위해 한계 압력, 유속 또는 부피를 미리 결정하고, 치료제를 선택된 부위로 직접 전달하기 위해 압력, 유속 또는 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것으로 더 구성되는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 한계치를 미리 정하는 것이 시험 유체를 주어진 유속으로 폐색된 챔버 안에 투여하고 얕은 층 보다 더 깊은 구역으로 전달이 개시되는 피크 압력을 측정하는 것으로 더 구성되고, 여기서 압력, 유속 또는 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것은 (1) 유체를 얕은 층으로만 선택적으로 전달할 필요가 있을 때는 피크 압력을 초과하지 않는 동안 유체를 유체의 흐름의 일부로서 폐색된 챔버 안으로 투여하고, 또는 (2) 얕은 층보다 더 깊은 구역으로 선택적으로 전달 할 필요가 있을 때는 피크 압력과 같거나 이를 초과하는 동안 폐색된 챔버 안으로 투여하는 방법.
20. 제 1 항에 있어서, 테스트 유체를 여러 회 주어진 유속으로 속이 빈 장기의 관강 안으로 투여하고, 각각의 경우 얕은 층 보다 깊은 곳으로의 전달이 개시되는 피크 압력을 측정하는 것으로 구성되며; 여기서 압력, 유속 또는 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것은 진단제 또는 치료제로 구성된 유체를 (1) 얕은 층으로만 선택적으로 전달할 필요가 있을 때는 마지막으로 측정된 피크 압력을 초과하지 않는 동안 유체의 흐름의 일부로서 투여하고, 또는 (2) 얕은 층보다 더 깊은 구역으로 선택적으로 전달 할 필요가 있을 때는 마지막으로 측정된 피크 압력과 같거나 이를 초과하는 동안 투여하는 방법.
21. 제 1 항에 있어서, 폐색된 챔버가 속이 빈 장기 안의 공간으로 구성되고, 압력, 유속 또는 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것은 진단제 또는 치료제로 구성된 유체를 속이 빈 장기의 정상적인 생리적 관강 내 압력 보다 약간 높은 압력, 실제적으로 얕은 층으로만 전달이 되기에 충분한 압력으로 투여하는 것으로 구성된 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 장기의 정상적인 생리적 관강 내 압력 보다 약간 높은 압력으로 투여되는 유체는 , 속이 빈 장기의 정상적인 생리적 관강 내 압력 보다 2 - 5mmHg를 초과하지 않는 압력으로 투여하는 방법.
23. 제 6 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간이 속이 빈 내장의 비-맥관식 내부로 구성되는 방법.
24. 제 6 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간이 도관의 관강으로 구성되는 방법.
25. 제 1 항에 있어서, 폐색된 챔버가 속이 빈 장기의 공간으로 구성되고, 체내의 속이 빈 장기의 공간의 일 부분을 고립시켜 실제적으로 폐색된 챔버를 만드는 것으로 더 구성되는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간의 일 부분을 고립시키는 것이 장기에서 나온 도관을 폐색시키는 것으로 구성되는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간의 고립된 부분이 간담도관(hepatobiliary tract)으로 구성되는 방법.
28. 제 25 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간의 고립된 부분이 담낭 및/또는 간담도관의 도관으로 구성되는 방법.
29. 제 25 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간의 고립된 부분이 간의 바일 덕트 또는 장의 일 부분으로 구성되는 방법.
30. 제 7 항에 있어서, 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 것이 한계 압력 이상의 유체를 얕은 층 보다 깊은 구역으로 투여하는 것으로 구성되는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 장기의 이상 발달 조직으로유도 되기에 충분하게 한계 압력보다 높은 압력으로 투여하는 방법.
32. 제 25 항에 있어서, 상기 압력이 치료제 또는 진단제를 간의 이상 발달 조직으로 유도하는 방법.
33. 제 1 항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 최소한 하나의 화학 치료제, 프로-염증약, 항-염증약 및 유전성 벡터로 구성되는 방법.
34. 제 6 항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 유전성 벡터로 구성되며, 이 유전성 벡터를 속이 빈 장기에 인접된 얕은 세포에만 선택적으로 전달되도록 유체를 투여하는 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 방법.
35. 제 6 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간이 간담도관의 최소한 일 부분으로 구성되고, 치료제 또는 진단제가 유전성 벡터로 구성되며, 속이 빈 장기에 인접된 간세포에만 선택적으로 전달되도록 유체를 투여하는 압력, 유속 및 부피 중 최소한 하나를 제어하는 방법.
36. 제 6 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간이 종양을 포함하고 있는 장기 안에 있고, 약물(치료제 및 진단제)이 항-종양제 또는 프로-염증성 시토킨으로 구성되는 방법.
37. 제 6 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간이 :

    (a) 간 섬유증, 원발성 담즙성 간경변증 또는 경화성 담도염에 관련된 또는 인접한 간담도계의 일 부분, 및 항-염증약으로 구성된 치료제 또는 진단제; 또는

    (b) 크론병에 걸린 장의 일 부분, 및 치료제 또는 진단제를 장 벽의 상피 하 고유층까지 전달하기에 충분한 압력으로 전달하기 위한 항-염증약으로 구성된 치료제 또는 진단제; 또는

    (c) 간담즙관의 일 부분, 간담즙관의 안을 싸고있는 상피 세포로 구성된 얕은 층, 및 담낭의 민무늬 근세포, 고유층, 박리 공간, 간의 장막 중 최소한 하나로 구성된 얕은 층 깊은 구역; 또는

    (d) 췌장 선암종에 걸린 췌장의 일 부분, 항-종양제 또는 프로-염증약 으로 구성된 치료제, 또는 혈관의 형성을 촉진하는 제제 ; 및 이 제제는 상피세포 또는 상피하 세포 또는 이 둘 모두로 전달되며; 또는

    (e) 식도암에 걸린 식도의 일 부분, 항-종양제 또는 프로-염증약으로 구성된 치료제; 또는

    (f) 전립선암에 걸린 전립선의 일 부분, 항-종양제 또는 프로-염증약으로 구성된 치료제; 또는

    (g)암에 걸린 방광의 일 부분, 얕은 상피 세포, 고유층, 돌림근육층 및 세로 근육층의 전부 또는 일부, 및/또는 장막에 전달되는 항-종양제 또는 프로-염증약 으로 구성된 치료제;로

    구성되는 방법.
38. 제 1 항에 있어서, 제제는 직경이 약 500nm 이하인 구형 알갱이로 구성되는 방법.
39. 제 1 항에 있어서, 제제는 미립자가 아닌 방법.
40. 제 1 항에 있어서, 유체를 0.066 - 960㎕/sec 미만의 유속으로 투여하는 방법.
41. 제 1 항에 있어서, 유체를 1000㎕/sec 미만의 유속으로 투여하는 방법.
42. 제 41항에 있어서, 유체를 약 500mmHg 미만의 압력으로 투여하는 방법.
43. 제 42항에 있어서, 유체를 거의 일정한 압력으로 투여하는 방법.
44. 제 43 항에 있어서, 장기는 비-맥관성이고, 유체는 약 5 - 100 mmHg의 거의 일정한 압력에서 투여되는 방법.
45. 제 43 항에 있어서, 장기는 맥관이고, 유체는 약 5 - 400 mmHg의 거의 일정한 압력에서 투여되는 방법.
46. 제 1 항에 있어서, 압력이 제어되고, 유체를 투여하는 동안의 압력을 거의 일정하게 모니터링 하는 것으로 더 구성되는 방법.
47. 제 1 항에 있어서, 폐쇄막을 여는 것을 증대시키는 약리학적 물질을 투여하는 것으로 더 구성되는 방법.
48. 제 1 항에 있어서, 장기는 속이 빈 내장이고, 유체를 투여하기 전에 속이 빈 내장의 공간을 팽창 가능한 폐색 장치로 부분적으로 채우는 것으로 더 구성되는 방법.
49. 제 1 항에 있어서, 제제를 미리 정해놓은 구역으로 전달하도록 미리 정해놓은 압력 구배가 장기의 고형(solid)부위에 만들어지도록 압력을 제어하는 방법.
50. 제 49 항에 있어서, 압력 구배가 장기의 내부에서 최고가 되는 방법.
51. 제 49 항에 있어서, 압력 구배가 장기의 외부에서 최고가 되는 방법.
52. 속이 빈 장기의 공간을 고립시키고;

    미리 정해놓은 유속으로 테스트 유체를 속이 빈 장기의 공간 안으로 1회 이상 주입하고;

    상피 또는 상피 하 폐쇄막을 통한 누출이 발생하는 압력을 측정하기 위해 테스트 용액을 1 회 이상 투여하고;

    치료용 또는 진단용 물질을 포함하고 있는 액체를 고립된 공간 안으로 투여하는데, 투여하는 동안의 압력은 장기의 상피 층으로만 물질이 우세하게 전달되기를 원할 때는 피크 압력을 넘지 못하게 하고, 상피 하 층에 우세하게 전달되기를 원할 때는 피크 압력을 초과하는 압력을 유지시키는 ; 것으로 구성된, 치료용 물질 또는 진단용 물질을 선택적으로 투여하기 위한 한계 압력을 결정하는 방법.
53. 제 52 항에 있어서, 물질을 상피 하 또는 내피 하 층으로 우세하게 전달하기 위해 액체를 최소한 일시적으로 피크 압력을 넘는 압력에서 투여하는 것으로 구성된 방법.
54. 속이 빈 장기의 공간을 고립시키고;

    미리 정해놓은 거의 일정한 압력으로 테스트 유체를 속이 빈 장기의 공간 안으로 1회 이상 주입하고;

    테스트 유체가 주입될 때의 주입된 유체의 주입 속도를 1 회 이상 측정하고;

    테스트 용액을 포함하고있는 유체를 속이 빈 장기의 공간 안으로 주입하고, 내피 또는 상피 폐쇄막을 통한 근접 세포로의 누출이 발생하는 때의 유속을 측정하는; 것으로 구성된,

    치료용 물질 또는 진단용 물질을 선택적으로 투여하기 위한 전달 압력을 결정하는 방법.
55. 제 52 항에 있어서, 테스트 유체의 점도가 치료용 물질 또는 진단용 물질을 함유하는 액체의 점도와 거의 비슷한 방법.
56. 제 52 항에 있어서, 속이 빈 장기의 공간 안으로 카테터를 삽입시키고 이 공간에서 나오는 하나 이상의 유출구를 밀봉시키므로서 속이 빈 장기의 공간을 고립시키는 방법.
57. 극성의 상피 세포로 안이 씌어진 장기의 관강 내로 유연한 카테터를 삽입하고;

    치료용 물질 또는 진단용 물질이 오로지 상피 세포의 정단 표면에만 전달되고 상피 하 구역으로는 전혀 전달되지 않도록 하는 미리 정해진 제어되는 압력 조건하에서 카테터를 통해 장기의 관강 안으로 치료용 물질 또는 진단용 물질을 주입하는 것; 으로 구성된,

    치료용 물질 또는 진단용 물질을 전달하는 방법.
58. 제 57 항에 있어서, 장기의 관강이 간의 도관 또는 담도이고, 치료용 물질 또는 진단용 물질은 거의 간의 도관 또는 담도의 내부를 씌우고있는 담도 세포에만 전달하기에 충분한 압력에서 주입되는 방법.
59. 제 57 항에 있어서, 치료용 물질 또는 진단용 물질이 상피 세포의 정단 표면뿐 아니라 상피세포의 바닥세포를 포함하는 상피 하 구역까지 전달되는, 미리 선택된 제어된 압력 조건하에서 치료용 물질 또는 진단용 물질을 장기의 관강 안으로 주입하는 것으로 더 구성되는 방법.
60. 제 59 항에 있어서, 몸의 관강이 간의 도관 또는 담도이고, 치료용 물질 또는 진단용 물질은 담도세포, 간세포 또는 이 둘 모두에게 전달하기에 충분한 압력에서 주입되는 방법.
61. 벽; 멀고 가까운 말단부; 및 원하는 속이 빈 장기의 벽을 침투하기 위한 끝이 뾰족한 투관침을 포함하도록 하는 구조를 갖는 관강;을 갖는 신장 가능한 캐뉼라, 및

    캐뉼라가 원하는 체내 장기의 벽을 뚫고 들어가고 벌룬들이 팽창되었을 때, 첫 번째 벌룬을 장기의 안쪽 표면, 두 번째 벌룬을 장기의 외표면에 접하게되고, 위치를 잡은 캐뉼라의 먼쪽 말단부를 장기의 내부 공간 안에 유지시키고 거의 누출이 되지 않도록 밀봉시키는 것으로 구성된;

    치료제 또는 진단제를 원하는 곳으로 전달시키기 위한 접근 장치.
62. 제 61 항에 있어서, 배액로 가 첫 번째와 두 번째 벌룬 에서부터 멀리 떨어진 배액 유입구와 통해있는 것으로 더 구성된 접근 장치.
63. 제 61 항에 있어서, 첫 번째와 두 번째 벌룬을 팽창시키기 위해 캐뉼라의 가까운 말단부에, 또는 그 근처에 위치한 팽창용 포트로 더 구성된 접근 장치.
64. 제 61 항에 있어서, 캐뉼라를 선택적으로 폐색시키는 선택적으로 제거 가능한 폐색 장치로 더 구성된 접근 장치.
65. 제 64 항에 있어서, 폐색 장치가 캐뉼라 캡으로 구성되는 접근 장치.]
66. 제 61 항에 있어서, 캐뉼라가 생물과 호환 가능한(bio-compatible) 물질고 구성되는 접근 장치.
67. 제 61 항에 있어서, 캐뉼라를 통해 삽입될 수 있으며 바깥쪽 멀리있는 팁을 가지고있고 이 팁 근처에 팽창 가능한 벌룬을 가지고있어서 캐뉼라가 삽입된 원하는 장기와 통하는 도관을 폐색시킬 수 있게 만드는 유연한 카테터로 더 구성되는 접근 장치.
68. 제 67 항에 있어서, 카테터가 여러 개의 관강들로 구성되며, 이들 중 하나가 팽창 가능한 벌룬들 가까이에서 카테터의 외부와 통하게 되어있는, 접근 장치.
69. 제 67 항에 있어서, 여러 개의 관강들 중 최소한 하나가 팽창 가능한 벌룬 멀리에서 카테터의 외부와 통하게 되어있는, 접근 장치.
70. 둘레에 팽창 가능한 첫 번째와 두 번째 커프(cuff)를 가지고있는 캐뉼라 안으로 투관침을 삽입하고;

    담낭의 삽입 부위의 벽을 통해 캐뉼라와 함께 투관침을 삽입하고, 팽창 가능한 첫 번째 커프는 담낭 안으로 들어가지만 두 번째 커프는 담낭 안으로 들어가지 못하도록 캐뉼라를 담낭으로 밀어 넣고;

    첫 번째 커프가 담낭의 삽입 부위 주위의 안쪽 벽면과 접촉되도록 팽창시키고;

    두 번째 커프가 담낭의 삽입 부위 주위의 바깥쪽 벽면과 접촉되도록 팽창시키는; 것으로 구성된, 담낭의 내부로 접근시키는 방법.
71. 간의 선택된 부분을 배액하는 간내의 도관 안으로 카테터를 삽입하고;

    카테터의 멀리있는 팁으로부터 순방향의 도관을 폐색시키고;

    약물이 도관에서 나와 도관 주변의 조직으로 이동되도록 하는 미리 선택된 주입 압력으로, 간의 선택된 부분의 최소한 일 부분으로 카테터를 통해 치료제 또는 진단제를 주입하는 것으로 ; 구성된,

    치료제 또는 진단제를 간의 미리 선택된 부분으로 전달하는 방법.
72. 제 71 항에 있어서, 속이 빈 위장이 간담도관이고, 관 주변 조직은 간 조직인 방법.
73. 제 71 항에 있어서, 내장이 거기서부터 흘러 나오는 맥관을 가지고 있고, 내장 안에서의 약물의 흡수를 증대시키도록 내장에서 나온 맥관 흐름을 최소한 부분적으로 폐색시키는 것으로 더 구성되는 방법.
74. 제 73 항에 있어서, 맥관 흐름이 림프액 흐름인 방법.
75. 제 71 항에 있어서, 내장이 환자의 담낭, 췌장, 간, 담관(bile duct), 장, 위, 식도, 호흡관, 기관지, 나팔관, 자궁, 자궁 경부, 질, 귀밑샘관, 침샘관, 전립선, 요관, 방광, 신장 중 최소한 하나의 최소한 일부분인 방법.
76. 제 71 항에 있어서, 상피 세포들 사이의 폐쇄막을 여는 경향을 갖는 약리적 물질을 내장 안으로 주입하는 것으로 더 구성되는 방법.
77. 약물을 액체 안에 넣어 이를 일정한 압력으로 생물학적 구조물에 주입하는 것으로 구성된, 체내의 생물학적 구조물 내로 치료제 또는 진단제를 주입하는 방법.
78. 체내의 도관 또는 내장 안에 고립된 챔버를 만들고, 이들의 크기를 늘이기 위해 고립된 챔버 안으로 일정 압력으로 유체를 주입하는 것으로 구성된, 체내의 도관 또는 내장의 크기를 증가시키는 방법.