KR20010005625A - 증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수의 확인 및 육종 방법 - Google Patents
증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수의 확인 및 육종 방법 Download PDFInfo
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Abstract
증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수의 육종 방법을 기재하고 있다. 상기 방법은 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌와 관련된 유전자 마커의 사용을 포함한다. 이들 유전자 마커는 육종 집단에서 커넬유 농도에 관하여 선택하는데 사용한다. 또한, 보다 우수한 자손을 생산할 것 같은 유전자 마커를 사용하여 보완적인 오일 모체 공급원의 선택 방법을 기재하고 있다. 또한, 옥수수 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌를 기재하고 있다.
Description
〈발명 분야〉
본 발명은 식물 육종학과 분자생물학 분야에 속한다. 더 자세하게, 본 발명은 증가된 커넬유 농도를 부여하는 옥수수 유전자좌를 유전자 마커를 이용하여 확인하고 그 확인에 있어 보조자로서 유전자 마커 이용, 증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수를 육종에 관한 것이다.
〈발명 배경〉
옥수수는 사람의 식량원, 동물 사료로서, 또한 탄수화물, 지방, 단백질 및 섬유소의 공급원으로서 이용되는 주된 작물이다. 옥수수는 주로 동물 사료에서 에너지 공급원으로서 또는 전분, 단백질 사료 분획, 섬유소, 플레이킹(flaking) 가루, 밀가루 및 오일를 얻기 위한 원료로서 이용된다.
전미국에 걸쳐 대부분의 시판 옥수수는 잡종 종자로부터 생산된다. 옥수수잡종 생산을 위해서는 교배시 농업적으로 우수한 잡종을 생산하는 우수한 옥수수 동종번식종의 발달이 필요하다. 옥수수 동종번식종을 개발해 오면서, 식물 재배업자는 농업적인 수행능력에 영향을 주는 많은 다른 형질을 선택한다. 이러한 형질에는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 줄기 강도, 꽂힘성(lodging), 질병 내성, 곡류 수분 및 수확량 등이 있다. 농업적 형질은 구별된 분포라기 보다 연속적 분포로 양적 측정되는 경향이 있다. 양적 특징은 일반적으로 동등하고 작은 효과를 갖는 몇몇 유전자에 의해 조절된다고 서술되어 있다. 또한, 관찰된 발현형이 부분적으로는 이러한 유전 요소와 환경 요소에 기인한다.
한 특성의 유전성은 넓은 의미에서 전체 표현형 변이에 대한 유전적 변이의 비율에 따라 정의된다. 많은 농업적인 형질은 낮은 유전성을 나타내는데, 즉, 양친 식물의 수행능으로부터 자손의 수행능을 예측할 수가 없다. 따라서, 낮은 유전성을 갖는 형질은 관찰된 변이와 비교하여 적은 유전적 변이 요소를 갖는다. 식물 재배업자에게 영향을 주는 문제는 식물의 유전적 조성의 가치를 농업적 형질 측정값으로부터 결정하기 어렵다는 것이다. 이들 측정법의 구별 능력을 최대화하기 위한 시도에서 재배업자는 유전적으로 연관된 개체와 다양한 환경 모두로부터 여러 가지 측정값을 수집한다. 이러한 전략은 식물 개선에 작은 유익이라도 만들어 내는 광범한 시도들의 사용과 관련되어 있으므로 유익한 공급원이 된다. 이는 다중 형질에 대하여 개선된 옥수수 계통이 동시에 선택된다는 사실과 연관되어 있어 소모적이고 비싼 노동력 모두에 있어서 우수한 옥수수 동종번식종을 개발하게 한다.
옥수수 육종 프로그램에서 신규 형질의 부가는 식물 재배업자에게 추가의 부담을 부여한다. 신규 형질의 유전적인 복잡성(즉, 단일 유전자 대 다수 유전자)에 따라서, 신규 형질을 갖는 우수 계통을 생산하는데 상당히 많은 시간과 노력이 요구된다. 그러한 형질 중 하나가 커넬유 농도이다.
증가된 커넬유 오일 농도를 갖는 옥수수는 가금(한 와이.(Han Y.) 등의 문헌[Poultry Sci. 66:103-111 (1987)]) 및 가축(노르드스트롬, 제이. 더블유.(Nordstrom, J.W.) 등의 문헌[J An. Sci 35(2):357-361(1972)])에 대한 개선된 사료값을 좌우하기 때문에 중요하다. 통상적인 옥수수 잡종 곡류는 4 % 오일을 함유한다. 커넬유 오일 농도를 증가시키려는 노력으로, 1896년 씨. 지. 홉킨스(C.G. Hopkins)에 의한 개방 수분된 cv. 부르즈 화이트(Burr's White)에서 장기간 재현 선택 프로그램(long-term recurrent selection program)을 개시하였다. 변형 물질 선택법을 사용하여 일리노이스 하이 오일(Illinois High Oil (IHO))로서 공지된 이러한 재현적으로 선택된 집단은 90 세대가 넘는 동안 증가된 오일 농도에 대하여 선택되었다(문헌[Dudley, J. W. and R.J. Lambert. (1992) Afaydica 37:1-7]). 결과로서, 집단내에서 20 %가 넘게 오일 농도가 증가되었다. 유도된 물질은 통상적인 변형체보다 실질적으로 보다 적게 얻어지기 때문에 생식세포질은 거의 사용되지 않았다(문헌[Alexander, D.E. (1988) In: Proc. 43rd Ann. Corn and Sorghum Res. Conf. Am. Seed Trade Assoc., Washington, D.C. pp 97-105)].
38 종의 개방 수분된 재배종 및 교배종을 사용하여 알렉산더(Alexander)는 커넬유를 증가시키기 위하여 제2의 재현 선택 프로그램(알렉소 교배법)을 개시하였다(문헌[Alexander, D.E. (1988) In: Corn and Corn Improvement. G.F. Spraque and J.W. Dudley eds. American Society of Agronomy, Madison WI. Pp 869-880]). 1 종의 이어(ear)의 오일 농도를 기준으로, 후세대에서는 1 종의 커넬의 오일 농도를 기준으로 한 선택법을 사용하여 28 세대에서 IHO에 대하여 동량의 오일 농가가 얻어졌다. 수행능이 통상적인 잡종과 동일하지 않았지만, 초기에 이용가능한 보다 큰 유전적 다양성으로 인하여 1 회 교배 잡종에서 알렉소-유도된 물질의 수율능(고농도 오일 번식종 X 통상적인 번식종)이 IHO에 대하여 향상되었다. 통상적인 식물 육종법을 사용하여 증가된 커넬유 오일 농도을 갖는, 농업적으로 우수한 옥수수 생식세포질의 개발은 또한 명백한 도전이다.
다양한 분석법을 사용하여 표현형적으로 커넬유 농도를 측정할 수 있다. 오일 농도는 비-개별적 분포를 나타내고, 몇몇 유전자좌에 의해서 조절된 정량적으로 유전된 형질에 대하여 공통적이다. 커넬유 측정으로 가장 높은 표현형 발현을 갖는 그러한 육종 계통을 선택한다. 불행히도, 이들의 진정한 유전적 조성을 기초로 하는 계통간에 구별한다는 것은 불가능하기 때문에 이들 대부분의 계통에서 고농도의 오일에 대한 유전적 잠재력은 제한된다. 이러한 농업적 수행능에 있어서 동시 선별을 수행할 때, 이러한 상태는 더욱 악화된다. 그러므로, 집단내 식물의 유전자형에 대한 선택법을 기초로 하는 것이 유리할 것이다. 복합 정량적인 형질에 대한 직접 선택법으로서 유전자 마커, 특히, 핵산 마커를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 그러므로, 증가된 오일을 부여하는 대립 유전자를 찾아내는 유전자 마커는 우수한 고농도 오일 옥수수 생식세포질을 발달시키는 식물 육종 프로그램을 위한 유리한 도구가 될 것이다.
증가된 오일 수율에 대하여 전조가 되는 유전자 마커의 확인에 대한 정보가 제한적으로 발표되어 있다. 카흘러, 에이. 에이.(Kahler,A.L.)의 문헌[Proc. 40th Ann. Corn and Sorghum Res. Conf. Am. Seed Trade Assoc..Washington D.C. pp.66-89(1985)]에서는 알렉소 교배법에서의 선택물의 25 세대 후 이소자임 대립 유전자 수의 변화를 측정하였고, 8 개의 유의한 유전자좌를 발견하였다. 이들 대부분의 대립 유전자 수의 변화는 또한 램덤 유전자 이동을 측정하는 시험에 있어서 유의하고, 이는 이러한 이소자임 대립 유전자에 기초한 선택법이 유용할 것이라는 결론을 내리기 어렵게 하였다. 보다 최근에는, 골드맨, 아이. 엘.(Goldman,I.L.)의 문헌[Crop Sci. 34:908-915(1994)], 및 베르케, 티.쥐 및 로케포드, 티.알.(Berke, T. G. and Rocheford,T.R.)의 문헌[Crop Sci. 35:1542-1549(1995)]에서는 RFLP 마커를 사용하여 일리노이스 장기간 선택 집단에서 오일 농도와 관련있는 유의한 마커 유전자좌를 확인하였다. 이러한 연구 결과, 부르즈 화이트로부터 유도된 집단에서 각각 25 개 및 31 개의 마커를 확인하였고, 이들은 오일을 증가시키는 것과 크게 관련되어 있었다. 중요 RFLP 마커 유전자좌에 의해서 확인된 몇몇 영역은 두 연구간에 공통적일 수 있지만, 두 연구에 사용되었던 15 개의 RFLP 마커 중 6 개는 오일 농도에 대한 그들의 효과가 일치하지 않았다. 이 연구에서, 사용된 집단은 공동 계통(부르즈 화이트)으로부터 유도되었지만, 상기 집단은 수많은 세대에 걸쳐서 다른 형질(오일 및 단백질)에 대하여 선택되었다. 확인된 많은 수의 오일 유전자좌는 각 분석 집단에 대하여 특이하다는 사실은 놀라운 일이 아니다. 그러므로, 육종 프로그램에서 사용되는 생식세포질의 특이적인 전조가 되는 유전자 마커를 찾아내는 것이 바람직하다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수에 대하여 신뢰가능하고, 예측가능한 육종 방법을 개시하고 있다. 본 방법은
a) 마커-보조 선택법에 의하여 옥수수 육종 집단으로부터 옥수수 식물을 선택하기 위해서 s1375, s1384, s1394, s14l6, s1422, s1432. s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s18l7, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, sl925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2O54, s2O55, s2O57, s2O58, s2O97, s2122, s2125, s215O, s2156 및 s2l75로 이루어진 군으로부터 선택된 1 개 이상의 유전자 마커를 사용하는 단계,
b) 선택된 옥수수 식물을 제2의 옥수수 식물과 교배시키는 단계
를 포함하고, 교배된 자손이 증가된 커넬유 농도를 나타내는 것을 특징으로 한다. 알렉소 교배 집단 또는 이들 자손들이 고농도 오일 옥수수 생식세포질의 공급원로 선호된다.
육종 집단을 만들기 위해 양친으로 사용하기 위한 옥수수 식물 또는 옥수수 계통을 찾아내는 방법을 개시하고 있으며, 본 방법은,
a) s1375, s1384, s1394, s14l6, s1422, s1432. s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s18l7, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, sl925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2O54, s2O55, s2O57, s2O58, s2O97, s2122, s2125, s215O, s2156 및 s2l75로 이루어진 군으로부터 선택된 1 개 이상의 유전자 마커로 옥수수 식물 또는 옥수수 계통의 유전자형을 결정하는 단계,
b) 이들의 유전자형에 기초하여 커넬유 농도에 대한 초과발현 분리체(transgressive segregant)를 생산할 것으로 예상되는 옥수수 식물 또는 옥수수 계통을 찾아내는 단계
를 포함하는, 육종 집단의 제작을 위한 양친으로서 사용하기 위한 옥수수 식물 또는 옥수수 계통의 확인 방법을 기재하고 있다.
본 발명은 옥수수의 증가된 커넬유 농도를 조절하는 유전자를 확인 선별하는 방법을 제공한다. 이들 오일 대립 유전자들은 처음에 알렉스 교배 육종군으로 구성되거나 유래된 개체들에서 찾아내었다. 또한, 새로운 고농도 옥수수 생식세포질을 개발할 목적으로 육종 프로그램내 고농도 오일 물질의 사용을 용이하게 하는 방법이다.
특히, 본 방법은 유전자 마커를 이용하여 옥수수 유종 프로그램내 계통있는 오일 육종값을 예측할 수 있다. 이러한 마커를 이용하는 오일 유전자좌의 간접적인 선별법에 의해서, 증가된 커넬유 농도에 대하여 가장 큰 유전적 잠재력을 갖는 계통을 선택한다.
본 발명에 따라서, 유전자 마커의 임의 형태를 사용하여 커넬유 농도와의 관련을 확인할 수 있다. 본 발명은 단지, 주어진 마커 유전자좌에서 다형성을 측정하는 능력에 의해서만 제한된다. 당업자는, 사용될 수 있는 다양한 유전자 마커 는, 이에 제한되지는 않지만, 제한 효소 단편 장다형(RFLPs), 램덤 증폭된 다형성 DNA(RAPD), 단독 서열 반복(SSR), AFLP, 다양한 단독 염기쌍 검출법, 알로자임 및 표현형 마커를 포함한다는 것을 알 것이다. 본 발명의 실시에 있어서 유용한 SSR 마커는 s1375, s1384, s1394, s14l6, s1422, s1432. s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s18l7, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, sl925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2O54, s2O55, s2O57, s2O58, s2O97, s2122, s2125, s215O, s2156 및 s2l75이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 옥수수 커넬유 농도의 발현을 조절하는 형질 유전자좌이다. 이들 유전자좌는 본 발명의 마커 유전자좌에 의해서 찾아내고 정의(맵핑)된다.
본 발명의 부가적인 실시태양은 본 육종법을 사용하여 생산된 옥수수 식물 및 고농도 오일 옥수수 생식세포질이다.
〈발명의 상세한 설명〉
표 1은 본 발명의 일부를 형성하는 유전자 마커에 대한 간단한 설명을 제공한다. 각 마커는 옥수수 게놈의 특이 마커 유전자좌의 증폭을 용이하게 하는 그의 구성 핵산 프라이머(정방향 및 역방향)에 의해서 정의된다. 또한, 각 서열에 대하여 요구되는 확인체를 나타낸다. 표 1에 기록된 확인체는 37 C.F.R.§1. 821 et seq에 의해서 요구되는 바와 같이, 하기 서열 목록에 기록된 것들과 상응한다.
〈옥수수 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌의 위치를 확정하는데 유용한 유전자 마커〉
본 발명의 목적을 위하여 본 발명자들은 하기 용어를 정의한다.
옥수수 : 임의의 변종, 재배종 또는 제아 메이스 엘.(Zea mays L.) 집단
우수종(elite) : 이 용어는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 우수한 낟알 품질 및 질병 내성과 같은 유리한 형질을 갖는 식물 또는 변종을 특징으로 한다. 종자 또는 곡물을 상업적으로 유리하게 생산하는데 이를 사용할 수 있다. 이 용어는 또한 이러한 식물 또는 변종의 근원이 되는 모체를 말한다.
고농도 오일 옥수수 생식세포질 : 이 용어는, 여러 가지 이종교배 조합에서 수컷 또는 암컷 양친 중 하나로서 사용되거나 자가 수분시, 높지 않은 농도의 오일 생식세포질에 의해서 생산된 커넬유와 비교할 때 증가된 오일의 커넬유를 생산하는 옥수수 식물을 특징으로 한다. 고농도 오일 옥수수 생식세포질의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 개방 수분된 변종, 잡종, 교배종, 번식 계통, 종족, 및 상기 중 하나로부터 유도된 옥수수 식물 또는 집단이 있다.
변종 또는 재배종 : 이 용어는 구조적 특징 및 수행능에 의해서 동일한 종류 범위내에서 다른 변종 또는 재배종으로 확인될 수 있는 유사한 식물군을 말한다.
계통 : 이 용어는 공동 계통으로부터의 개체군을 말하고, 변종보다 좀더 좁게 정의된 군을 말한다.
교배종 : 이 용어는 동종번식종, 잡종, 변종, 군집, 종족 또는 다른 교배종을 임의의 조합으로 교배시킴으로써 생성된 공지된 계통의 유전적 이종 식물 집단을 말한다.
동종번식종 : 이 용어는 거의 동종 개체, 변종 또는 계통을 말한다.
재조합 동종 번식종 : 완전한 동종접합성에 달할 때까지 각 세대를 반복적으로 자가 수분시킴으로써 발달된, 독립적으로 유도된 계통군을 말한다. 각각의 재조합 동종번식종은 통상적으로, 단독 종자 자손이라고 불리는 육종법을 사용하여 단독 F2 식물로부터 유도된다.
육종 : 조절된 유전자 조작을 통하여 식물종 또는 동물종을 개선시키는 기술 및 과학.
마커-보조 선택법 : 우수한 표현형 잠재력을 갖는 식물을 찾아내어 선별하는 유전자 마커의 사용. 형질 유전자좌 또는 형질 유전자좌들과 관련되도록 미리 결정된 유전자 마커를 사용하여 마커 유전자좌 및 형질 유전자좌 간의 결합에 의해서 형질 유전자좌에서 유전자형을 밝혀낸다. 바람직한 형질 대립 유전자를 함유하는 식물은 연관된 마커 유전자죄에서 이들의 유전자형을 근거로 하여 선택된다.
알렉소 교배종 : 일리노이즈 대학의 덴톤 알렉산더(Denton Alexander)에 의해서 개발된 재현 선택된 고농도 오일 옥수수 생식세포질. 알렉소 교배 고농도 오일 옥수수 생식세포질은 재현 선택 육종 프로그램에서 이들의 앞선 세대에 의해서 정의되는 다중 교배군으로 이루어진다.
육종군 : 바람직한 표현형의 특성을 갖는 1 개 이상의 개체를 찾기 위한 유전적 이종 식물군.
표현형 : 1 종 이상의 식물 특성의 관찰된 발현.
표현형값 : 형질 유전자좌에서 대립 유전자의 기대되는 발현의 측정값. 형질 유전자좌에서 또다른 대립 유전자와 비교하여 대립 유전자의 표현형값은 그의 발현력에 따라서 다르다. 개체의 표현형값, 및 그의 표현형 잠재력은 일정 형질에 대한 모든 유전자좌에서 그의 총 유전자형 조성을 근거로 한다.
초과발현 분리체(transgressive segregant) : 그 표현형이 양친에 의해서 예상되는 표현형 변이를 초과하는 개체.
유전자 마커 : DNA 다형성을 나타내는 표현형의 차이를 근거로 하는 임의의 형태학적, 생화학적 또는 핵산. 유전자 마커의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, RFLP, RAPD, 알로자임, SSR 및 AFLP가 있다.
마커 유전자좌 : 유전자 마커에 의해서 밝혀진 바와 같은 DNA 다형성의 유전적으로 정의된 위치.
형질 유전자좌 : 관찰된 특성에 기여하는 1 종 이상의 유전자 (대립 유전자)군을 위한 유전적으로 정의된 위치.
유전자형 : 연구중인 유전자좌에서 개개의 대립 유전자 조성.
제한 효소 단편 장다형(Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)) : 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 DNA의 크기 차이가 혼성화를 통하여 관찰되는 DNA-기초한 유전자 마커(문헌[Botstein, D. et al. 1980. Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331]).
램덤 증폭된 다형성 DNA(RAPD) : 짧은 서열의 임의의 프라이머를 사용하고, 생성되는 증폭 생성물이 크기별로 분리되고, 증폭 패턴에서 차이가 관찰되는 DNA 증폭 기초한 유전자 마커(문헌[Williams J.G.K. et al. 1990. Nucleic 4cids Res. 18:6531-6535]).
단순 서열 반복 (SSR) : 탠덤 반복된 서열 모티프의 짧은 스트레치가 증폭되고, 생성된 증폭 생성물이 크기별로 분리되고 뉴클레오티드 반복물의 길이 차이가 관찰되는 DNA 증폭에 기초한 유전자 마커(문헌[Tautz D. 1989. Nucleic Acids Res. 112:4127-4138]).
AFLP : 제한 뉴클레오티드에 의해 생성된 DNA 단편이 제한된 DNA 단편의 증폭을 용이하게 하는 짧은 DNA 단편에 결합(ligation)되는, DNA 증폭에 기초한 유전자 마커(문헌[Vos, P. et al. 1995. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414]). 증폭된 단편은 크기별로 분리되고 증폭 패턴의 차이가 관찰된다.
알로자임 : 전기영동하여 분리되고, 효소 활성에 대한 염색을 통하여 검출되는 효소 변형체(문헌[Stuber, C.W. and M.M. Goodman. 1983. USDA Agric. Res. Results, Southern Ser., No. 16]).
본 발명은 유전자 마커를 사용하여 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌의 발견에 관한 것이다. 커넬유 농도 및 유전자 마커 대립 유전자 모두에 대한 변형체가 존재하는 집단에서, 집단 구성원에 대한 오일 측정값 및 마커-기재 유전자형을 생성하였다. 최소 스퀘어스(squares)법을 사용하여 이러한 형질 유전자좌에 유전적으로 연관된 마커에 대하여 오일 농도 유전자좌의 위치를 결정하였다. 바람직한 오일 대립 유전자의 간접 선택법은 1 종 이상의 결합된 유전자 마커에서 상기 정보를 사용하여 수행할 수 있다. 선택된 옥수수 식물은 고농도 오일 표현형을 코딩하는 1 종 이상의 대립 유전자를 포함한다.
몇몇 상이한 집단 및 집단 형태는 중요한 형질 유전자좌를 찾는데 사용될 수 있음을 알고 있다. 몇몇 집단 형태는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 재조합 동종 번식종, 역교배종, F2 또는 이들의 자가수분 또는 상호교배 유도종 및 교배종이다. 또한, 집단내 표현형 및 유전자형의 변이를 측정하는 다른 방법은 집단간의 유전자형 및 표현형의 측정값인 것으로 이해된다. 이러한 대안에서, 제2의 집단은 제1 집단의 선별된 유도종이며, 선택은 중요한 형질(표현형 선택) 또는 특이적 마커 대립 유전자 (유전자형 선택) 중 하나일 수 있다. 또한, 당업자는 마커 유전자좌 및 형질 유전자좌 사이의 결합 관계를 결정하기 위하여 또다른 통계학적 접근법을 사용할 수 있다는 것을 알고 있다 .
또한, 본 발명을 하기 실시예에 정의한다. 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터 당업자는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 중요한 특성을 주장하고 있으며, 본 발명에 여러 변형 및 변화를 주어 이를 다양한 용도 및 상태에서 사용할 수 있게 한다.
〈실시예 1〉
증가된 커넬유 농도를 부여하는 유전자좌 찾기
군집 개발과 특성 측정
미국 아이오와주 윌리암버그 소재 홀덴 화운데이션 시드사에서 개발한 두 종류의 동종번식종 옥수수 계통인 LH119wx와 LH51를 교배군 ASKC28wx로부터 식물개체와 독립적으로 교배하였다(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 메릴랜드주 락빌 소재);고유번호 ATCC75105) (왁스 커넬은 대개 ASKC28로 나타내며 본인도 이와 같이 ASKC28을 왁스성을 갖는다고 명시함). F1 식물을 자가교배하여 생성된 F2군을 재배하였다. 각각의 F2 식물을 자가 교배하여 유도된 커넬은 6번의 자가교배로 여섯 세대를 통하여 하나의 자손 종자를 이용하여 발전시켰다. 여섯 세대로부터 20개 이하의 커넬을 재배하고 자가 교배시켜 각각의 재조합 고유 계통을 나타내는 7 세대 이어(ear)종을 생산하였다. 근적외선을 투광도를 사용하여 일정 종류내 각 군의 이어에 대한 오일 값을 결정하였다(문헌[Williams, P.C. (I 987) In: Near Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries; P.C. Williams and C. Norris, eds. American Association of Cereal Chemists]).
유전자형의 결정
각 194 (LH119wx x ASKC28wx) 또는 204 (LH51 x ASKC28wx) 개의 재조합 동종 번식종 계통을 나타내는 하나의 이어로부터 열 개의 종자를 습기가 있는 필터 종이위에서 발아시켰다. 발아된 종자로부터 뿌리 부분을 절단하고, 각 이어에 대하여 모으고, 자동화 DNA 추출기를 사용하여 추출하였다. 기구는 무레이, 엠. 쥐.(Murray, M.G.) 및 톰슨, 더블유. 에프.(Thompson, W.F. )의 CTAB법을 변형시켜 사용하였다(문헌[NucL Acids Res. 8:4321-4325(1980)]). 요프로(YoPro)-I(상표명) 요오디드(문헌[Molecular Probes, Inc., Eugene. OR])를 사용하여 형광성을 통해 DNA 시료를 정량하고, 4 μg/ml로 희석시켰다.
각 DNA 샘플에 대한 SSR 영역을 다음 프로토콜로 분석하였다.
1. 증폭 칵테일(표 2 참조) 10 ㎕를 추출된 DNA 5 ㎕(20 ng)에 가하는 단계;
2. 증폭 칵테일에 존재하는 프라이머에 상보적인 서열에 접하는 DNA 단편을 다음 프로토콜을 이용하여 PCR(미국 특허 제4,683,202호와 동 제4,68,195호) 증폭시키는 단계;
1) 95 ℃에서 50초, 54 ℃에서 50초 및 72 ℃에서 80초를 45회 반복
2) 72 ℃에서 300초 1회
3. 각 샘플 약 8 ㎕를 2% 메타포(Metaphor)(미국 마인주 록크랜드 소재 FMC사), 1X TBE 및 0.5 ug/ml의 에디티움 브로미드로 이루어진 아가로즈 겔에 적가시키고, 1X TBE 완충액 및 0.5 ug/ml의 에디티움 브로미드를 채운 수평 전기영동기에서 2 시간 동안 6.1 V/cm으로 전기영동시키는 단계; 및
4. DNA 밴드에 UV 형광을 조사하여 시각화하는 단계.
| 시약 | 스톡 농도 | 최종 농도 |
| 완충액* | 10 X | 10 X |
| dNTPs | 2 mM | 0.3 mM |
| 정방향 프라이머 | 40 μM | 0.45 μM |
| 역방향 프라이머 | 40 μM | 0.45 μM |
| 앰플리태크(AmpliTaq) 중합효소(상표명) | 5 U/μl | 0.05 U/μl |
| * 10X 완충액은 800 mM 트리스-OH, 200 mM(NH4)2SO2및 25 mM MgCl2로 이루어진 pH 9.0의 용액이임 |
오일 유전자좌
133개의 다형성 SSR 마커 유전자를 사용하여 LH119wxx ASKC28wx 교배로부터의 재조합 동종번식종의 유전자형을 결정하였고, 103개의 다형성 SSR 마커 유전자를 사용하여 LH51 x ASKC28wx-유도군의 유전자형 결정하였다. 또한, 이미 확립된 염색체 위치를 갖고 10개의 모든 옥수수(maize) 염색체(미국 알라바마주 헌츠빌 소재 리써치 지네틱스사로부터 입수)를 포함하는 공개적으로 이용가능한 22개의 다형성 SSR유전자좌로 두 개 모든 집단을 모두 맵핑하였다.
마커 유전자좌간의 유전적 연관성 및 거리는 맵메이커(MAPMAKER) 3.0(문헌[Lincoln S,E., et al. (1993) Whitehead Inst. Biomad. Res., Cambridge. MA])을 이용하여 각군에 대해 독립적으로 결정하였다. 그 결과, 10개의 옥수수 염색체에 해당하는 각 군에 대하여 10 개의 연관된 그룹이 확립하였다. 각 연관군은 공지된 SSR 마커에 대한 결합을 근거로 한 염색체에 해당하였다. LH119wx x ASKC28wx와 LH51 x ASKC28wx 집단내 23개와 10개의 마커 각각은 유전적 연관성 명백하게 확립되지 않았기 때문에 염색체 위치에 해당하지 않았다.
변이 분석을 사용하여 증가된 오일 농도를 부여하는 형질 유전자좌와 연관된 마커 유전자좌를 찾아내었다. 오일 농도는 종속 변수로서 사용하였고, 각 마커 유전자좌를 하나의 독립 변수로서 사용하여 아노바 사스 프록 지엘엠(SAS Proc GLM)(문헌[Edwards, M.D., et al.(1987) Genetics 116: 113-125])으로 별도의 아노바(ANOVA)를 계산하였다. 그러므로 각 아노바 테스트를 위해 마커 대립 유전자 종류의 평균 오일값을 비교하였다. p〈0.05일 경우 마커 유전자좌는 유의하다고 정하였다.
형질 유전자좌의 수와 그들의 예상 위치 모두를 결정하기 위하여 유의한 마커 유전자좌에 대한 연관된 데이터를 조사하였다. 동일한 연관군에 대해 유의한 마커 유전자좌는 동일한 형질 유전자좌 또는 다른 형질 유전자좌를 찾아낼 수 있다. 염색체에 따른 각 마커 유전자좌에 의해서 설명된 표현형 변이를 주의깊게 조사하여, 결합군에 대한 형질 유전자좌 수를 결정하였다. 동일한 결합군에 대하여 또하 유의하지 않은 마커 유전자좌에 의해서 간섭받지 않는 유의한 마커 유전자좌는 염색체상의 동일한 형질 유전자좌를 찾아내는 것으로 밝혀져 있다.
형질 유전자좌 수를 확인하기 위하여, 또한 맵메이커(Mapmaker)/QTL 1.0로써 결합군에 대한 마커 데이터 및 오일 데이터를 분석하였다(문헌[Lincoln, S.E. et al. (1990) Whitehead Inst. Biomed. Res., Cambridge, MA]). 맵메이커/QTL의 결과는 각 염색체에 대한 형질 유전자좌의 수에 대한 초기 분석과 일치하였다.
커넬유 농도를 조절하는 11 개 및 12 개의 유전자좌는 LH119wx x ASKC28wx 및 LH51 x ASKC28wx 재조합 동종번식종 집단 각각에 위치하였다. 각 오일 유전자좌는 1 종 이상의 마커 유전자좌에 의해서 정의된다.
두 집단 모두에서 동일한 마커 유전자좌를 사용하는 경우, 결합군의 결합이 가능하다. 대부분의 경우에 두 집단은 동일한 오일 유전자좌를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 공통 마커 유전자좌를 고려할 때, 커넬유 농도를 조절하는 총 17 개의 유전자좌를 발견하였다. 임의의 문자 지정으로 각 오일 유전자좌를 할당하였다 (표 3)
〈증가된 커넬유 농도를 부여하는 형질 유전자좌 위치에 유전적으로 결합하고 그의 전조가 되는 마커 유전자좌〉
비교가능한 경우, 한 집단에서 확인된 오일 유전자좌는 제2의 집단내 동일한 위치에서 확인되었다. 두 개의 예외로써, 한 집단에서는 오일 유전자좌가 발견되었지만, 제2의 집단에서는 발견되지 않았다. 첫번째 경우, 포지티브 오일 효과를 갖는 대립 유전자는 LH51에서 발견되었고, 따라서 LH1199wx x ASKC28wx 집단에서 동일한 유전자좌를 확인하는 것은 의외였을 것이다. 제2의 경우, 집단에서 다른 ASKC28wx-유도된 마커 대립 유전자를 분리하고, 따라서, 형질 유전자좌에서 ASKC28wx-대립 유전자의 오일 효과를 각 집단에서 측정하였다. LH119wxx ASKC28wx에서 분리한 가장 풍부한 ASKC28wx 오일 대립 유전자를 다른 LHI 19 유도 대립 유전자에 대하여 포지티브 오일 효과를 갖는 반면, LH51 x ASKC28wx 집단, 풍부한 ASKC28wx 대립 유전자는 포지티브 오일 효과를 갖지 않았다. 마커 sl480에 결합된 오일 유전자좌를 제외하고, 오일 농도에 대하여 포지티브 효과를 갖는 모든 대립 유전자는 ASKC28wx로부터 유도되었다.
〈실시예 2〉
증가된 커넬유 농도에 대한 유전자 마커를 사용하는, 육종 계통의 마커-보조 선택법
오일 형질 유전자좌와 연관된 유전자 마커는 오일의 농도에 대한 높은 전조가 되며, 이와 같이 마커-보조 선택 프로그램에서 커넬유의 간적접 측정으로서 사용될 수 있었다. 따라서, 연관된 마커 유전자좌로부터의 유전형 정보는 증가된 오일 농도를 갖는 육종 계통을 선별하는데 용이하게 이용될 것이다. 직접 오일 측정법은 다양한 유전자형 형질 유전자좌 조성과 이들의 표현형 효과를 구별할 수가 없다. 이 방법은 오일 유전자좌가 제한적으로 고정되어 있는 육종군을 분리하는 초기 세대에서 문제가 된다.
예를 들면, 옥수수 육종 프로그램의 목적은 증가된 커넬유 농도를 부여하는 형질의 대립 유전자를 갖는 신규 우수 육종 계통을 만드는 것이라고 할 수 있다. 이들 형질 대립 유전자는 고농도 오일 생식세포질을 1 종 이상의 우수한 동종 번식종 옥수수와 교배시킴으로써 도입할 것이다. 생성된 잡종을 통상적인 계통 육종 프로그램을 개시할 목적으로 자가 수분시켜 F2군을 생성시킬 수 있다(문헌[Allard, R.W.(1960) Principles of Plant Breeding. John Wiley ＆ Sons, Inc. New York. Pb115-128]).
원하는 유전자형을 갖는 이들 F2 중 개체를 찾아내기 위하여 식물 조직을 집단내 각 F2 개체로부터 수집하여 표 1에 열거된 SSR 마커 유전자좌로 유전자형을 결정하였다. 고농도 오일 공급원으로부터 유래된 SSR 마커 대립 유전자를 가장 높은 수로 갖는 이들 F2 개체들을 농업적 적교배에 근거하여 선별하여 골라내었다. 계속적인 동종교배와 선별과 함께 이종교배 상태의 오일 유전자좌를 고농도 또는 저농도의 오일 대립 유전자로 고정시킬 수 있다. 따라서, 마커 대립 유전자와 이에 따른 오일 대립 유전자 조성을 근거로 하여 육종 계통을 더 분리해내기 위해서 보다 후세대 물질의 유전자형을 결정하고 분리하는 것이 수행되어야 할 것이다.
집단 크기와 우연성에 따라서 오일 대립 유전자의 수가 알맞게 회수되지 않았기 때문에 계통 육종 프로그램의 결과, 동종번식종이 충분한 농업적 경쟁이나 충분한 커넬유 발현을 입증하지 못할 수도 있다. 따라서, 이들 새로운 동종번식종은 양친 물질로서 사용하여 새로운 육종 프로젝트를 개시할 수 있다. SSR 마커는 기술한 바와 같은 오일 선별법에 재사용될 수 있다.
추가 선별 방법에 대한 많은 변형들이 계획될 수 있다는 것은 당업자에게 이미 명백한 사실이다. 군집내에 존재하는 형질 오일 유전자좌를 찾어내는 1 종 이상의 마커 유전자의 대립 유전자 조성을 기초로 하여 선별될 것이다. 식물 개체, 종 또는 그들의 자손의 유전자형을 검사 선별하여 추가 선별이 이루어질 것이다. 유전자형 정보를 이용하여 다양한 예측 모델을 개발할 수 있고, 이는 다양한 선별 마커를 개발할 수 있다. 이들 모델은 마커 유전자좌에 의해 예측되는 효과를 측정할 수 있게 한다. 그 이유는 각각의 마커 유전자의 예측값이 형질 유전자좌의 발현성 뿐 아니라 상응하는 형질 유전자좌로부터의 유전자 거리에 의존하기 때문이다. 표현형 기준 선별법과 유전자형 기준 선별법을 조합한 선별법을 수행할 수도 있다.
본 명세서에 제시된 마커 유전자좌는 알렉소 교배군내 오일 유전자좌의 전조가 된다. ASKC28wx는 유전적으로 폐쇄된 집단의 28 차례의 오일 교배 세대를 나타내고, 앞선 교배 주기는 동일한 오일 유전자좌로 이루어져 있다. 상기 세대는 확인된 오일 유전자좌에서 이들의 대립 유전자 수에 있어서 단순하게 다를 것이라고 예상된다. 따라서, 초기 알레소 세대로부터 유래된 교배군내에서 본 발명에 개시된 마커 유전자좌가 오일 유전자좌를 찾아내고 오일 농도를 예측하는데 유용할 것이다.
〈실시예 3〉
증가된 커넬유 농도에 대한 초과발현 분리체 생성을 위한 양친으로서 사용하기 위한 옥수수 식물 확인
양친으로 이용할 경우 우수한 수행능을 갖는 자손을 생산할 가능성이 가장 큰 옥수수 식물 및 계통을 찾아내는 것이 중요한 일이다. 그러한 양친의 초과발현 분리체 자손은 고농도 오일 표현형을 부여하는 상보적인 대립 유전자 세트를 갖는 양친 교배의 결과일 것이다. 본 명세서에서 제공되는 정보를 사용하여, 일정 마커 유전자좌에서 바람직한 형질 수행능(즉, 고농도 오일)을 예상하는 마커 대립 유전자가 공지되어 있다. 그러한 마커 유전자좌에서 계통의 유전자형을 결정함으로써 양친으로서 그들 계통의 가치가 밝혀진다. 예를 들어, 5 개의 각각의 오일 유전자좌(A-E)에서 우수한 대립 유전자를 함유하는 한 개체를 만들기를 원한다면, 유전자좌 A, B 및 C에 대한 바람직한 대립 유전자로 이루어진 양친을 찾아내어 대립 유전자 B, D 및 E에서 바람직한 대립 유전자로 이루어진 양친과 교배시킬 수 있다. 이들 양친은, 5 개 모든 유전자좌에서 목적하는 대립 유전자를 함유하는 자손의 회복을 가능하게 하므로 보완적이다. 이상적으로는, 양친이 교배시 최대 상보성을 보장하도록 선택되어 많은 수의 바람직한 재조합체가 회수되었다.
Claims (20)
- a) s1375, s1384, s1394, s14l6, s1422, s1432. s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s18l7, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, sl925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2O54, s2O55, s2O57, s2O58, s2O97, s2122, s2125, s215O, s2156 및 s2l75로 이루어진 군으로부터 선택된 1 개 이상의 유전자 마커를 사용하여 마커-보조 선택법에 의해 옥수수 육종 집단으로부터 옥수수 식물을 선택하는 단계,b) 선택된 옥수수 식물을 제2의 옥수수 식물과 교배시키는 단계를 포함하고, 교배된 자손 옥수수 식물은 증가된 커넬유 농도를 나타내는 것을 특징으로 하는, 증가된 커넬유 농도를 갖는 옥수수의 육종 방법.
- 제1항에 있어서, 선택된 옥수수 식물이 알렉소(Alexho) 교배 집단 또는 그의 자손의 구성원인 방법.
- a) s1375, s1384, s1394, s14l6, s1422, s1432. s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s18l7, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, sl925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2O54, s2O55, s2O57, s2O58, s2O97, s2122, s2125, s215O, s2156 및 s2l75로 이루어진 군으로부터 선택된 1 개 이상의 유전자 마커로 옥수수 식물 또는 옥수수 계통의 유전자형을 결정하는 단계,b) 이들의 유전자형에 기초하여 커넬유 농도에 대한 초과발현 분리체(transgressive segregant)를 생산할 것으로 예상되는 옥수수 식물 또는 옥수수 계통을 찾아내는 단계를 포함하는, 육종 집단의 제작을 위한 양친으로서 사용하기 위한 옥수수 식물 또는 옥수수 계통의 확인 방법.
- s2O54, s1647, s1500, s1545, s1774 및 s2O97로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌(locus).
- s1817 및 s2O57로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- s1860, s1931, s2l5O 및 sl925로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- sl457, s2O55, s1757, s2l25, s1780, s1375, s1797, s1416, s1432 및 s1921로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- s1544, s1633, s1384, s1813, s1767, s2O58, s1933, s1513 및 s1484로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도 농도를 조절하는 유전자좌.
- s1476, s1772, s1816, s2l22 및 s1836으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- s1939 및 s1946으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- s1478, s1853 및 s1949로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- sl630, sl422 및 s2l56으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1756에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1922에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1529에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1394에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1750에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s1870에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 유전자 마커 s2l75에 의해서 맵핑된, 커넬유 농도를 조절하는 형질 유전자좌.
- 제1항의 방법에 의해서 생산된, 증가된 커넬유 농도를 나타내는 옥수수 식물.
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