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KR19990087525A - 선택적 증식성을 부여하는 유전자 - Google Patents

선택적 증식성을 부여하는 유전자 Download PDF

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KR19990087525A KR1019980706959A KR19980706959A KR19990087525A KR 19990087525 A KR19990087525 A KR 19990087525A KR 1019980706959 A KR1019980706959 A KR 1019980706959A KR 19980706959 A KR19980706959 A KR 19980706959A KR 19990087525 A KR19990087525 A KR 19990087525A
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나까또미 히로따까
가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼
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Abstract

(a) 리간드가 결합하는 영역, (b) (a)의 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 (c) 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 세포에 도입하고, 이 세포에 리간드 자극을 줌으로써 세포를 선택적으로 증폭시키는 것이 가능해졌다.

Description

선택적 증식성을 부여하는 유전자
선천적 또는 후천적으로 유전자에 결함이 있어서 발생하는 질병, 즉 유전자 질환에 대해서는 지금까지 여러 가지 치료법이 연구되어 왔다. 그 하나로서, 결함 유전자 자체를 정상 유전자로 치환시키거나, 정상 유전자로 보충하는 등에 의해 유전자 질환을 근본적으로 해결하는 유전자 치료법이 있다.
이 유전자 치료에 있어서 중요한 것은 정상 유전자를 표적 세포에 정확히 도입함과 동시에, 도입된 유전자를 정확하게 발현시키는 것이다. 정상 유전자를 표적 세포에 도입하기 위한 유전자의 벡터로서는, 지금까지 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터 또는 리보좀 등으로 대표되는 비바이러스 벡터가 사용되어 왔다. 그러나, 그 어떤 벡터에도 표적 세포로의 유전자의 도입 효율의 저조 등의 결점이 존재하였다.
또한, 도입된 유전자의 발현 효율의 불량 등의 결점이 있어서, 치료에 불충분한 경우가 많았다. 이 경우에도, 아데노신데아미나제(ADA) 결손증과 같이, 정상 ADA 유전자가 도입된 세포가 생존 우위성(survival advantage) 또는 증식 우위성(growth advantage)을 획득하고, 체내에서 점차 선택되어 우위를 이루는 것으로 기대되는 것이면, 비록 유전자 도입 효과가 낮아도 점차 치료 효과가 나타나는 가능성도 있다. 그러나, 이와 같은 체내에서의 선택성이 기대되지 않는 종류의 치료용 유전자를 도입할 필요가 있는 경우도 많아 유전자를 도입한 세포를 선택적으로 증폭시키는 시스템의 확립이 요망되고 있다.
그러나, G-CSF는 호중구를 선택적으로 증식시키는 사이토카인(조혈 인자)으로서 이전부터 생각되어 왔으나, 근년에 G-CSF를 투여하면, 호중구의 증가가 나타날 뿐만 아니라, 조혈 간(幹)세포/전구세포의 체내 풀(pool)의 증가가 나타나는 것으로 보고되었다(임상 혈액., 35, 1080 (1994)). 또한, G-CSF가 기능하는 기구로서, G-CSF 자극에 의해 G-CSF 수용체가 활성화될 때는, G-CSF 수용체의 이량체화가 나타나고(Proc Growth Factor Res., 3(2), 131-141 (1991)), G-CSF 수용체에는 증식 유도 도메인과 분화 유도 도메인이 존재하는 것으로 보고되었다 (Cell., 74, 1079-1087 (1993)).
다시, G-CSF 수용체와 동일하게, 이량체화에 의해 활성화되는 수용체로서는 에스트로겐 수용체가 알려져 있고(J Biol Chem., 264, 2397-2400 (1989)), 세포 내에서 에스트로겐 수용체와 c-Abl 티로신키나제의 융합 단백질의 발현에 의해 c-Abl 티로신키나제의 활성화가 발생함이 보고되었다(The EMBO Journal., 12, 2809-2819 (1993)).
발명의 개시
본 발명은 치료용 유전자를 도입한 조혈 간세포 등을 체내 또는 체외에서 선택적으로 증폭시킴으로써 유전자 도입 효율이 낮다는 문제점을 극복하는 것을 겨냥한 것으로서, 조혈 간세포 등을 표적으로 한 유전자 치료의 기반이 되는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
현재, 유전자 치료 분야에 있어서는, 표적 세포로의 유전자의 도입 효율 및 도입된 유전자의 발현 효율 면에서 극복하여야 할 과제가 많다. 따라서, 유전자가 도입된 표적 세포만을 선택적으로 증식시키는 시스템이 확립된다면, 유전자 치료법이 비약적으로 발전할 수 있다는 것은 분명하다. 특히, 적혈구, 백혈구 등 많은 혈액 세포의 기본이 되는 세포이며, 유전자 치료의 표적 세포로서 가장 바람직한 조혈 간세포에 대하여, 이와 같은 시스템이 확립되면 유전자 치료 분야에서의 공헌도는 매우 크다.
본 발명자들은 호중구를 선택적으로 증식시키는 사이토카인(조혈 인자)으로서 종래로부터 생각되어온 G-CSF가 조혈 간세포의 증식도 야기하며, G-CSF 수용체가 활성화될 때 G-CSF 수용체의 이량체화가 나타나는 것을 감안하여, 유전공학적 방법을 사용하여 G-CSF 수용체의 이량체화에 의해 조혈 간세포를 증식시키는 시스템을 생각하게 되였다. 또한, 에스트로겐 자극에 의해 에스트로겐 수용체가 이량체화된다는 것을 감안하여 G-CSF 수용체 유전자와 에스트로겐 수용체 유전자의 키메라(chimera) 유전자를 제작하고, 이 키메라 유전자를 도입한 세포에 대하여 외부로부터 에스트로겐 자극을 부여함으로써 강제적으로 키메라 유전자의 생산물 중의 G-CSF 수용체 부분을 이량체화시키는 것을 생각하기에 이르렀다.
즉, 본 발명자들은 외부로부터의 에스트로겐 자극에 의해 키메라 유전자 생산물 중의 G-CSF 수용체 부분의 활성화를 일으키고, 유전자를 도입한 조혈 간세포를 선택적으로 증식시키는 시스템을 최초로 개발하여 이를 유전자 치료 분야에 응용하고자 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 리간드가 결합하는 영역, 이 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질, 이 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 이 벡터를 포함하는 세포 및 스테로이드 호르몬을 작용시킴으로써 상기 세포를 체내 내지 체외에서 선택적으로 증식시키는 방법 등에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 벡터가 외래 유전자를 포함하는 경우에는, 이 외래 유전자가 도입된 세포를 선택적으로 증식시키는 방법 등에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는,
(1) (a) 리간드가 결합하는 영역, (b) (a)의 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 (c) 사이토카인 수용체 또는 그 일부로 이루어지고 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질,
(2) "사이토카인 수용체 또는 그 일부로 이루어지고, 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역"이 G-CSF 수용체에 유래하는 (1) 기재의 융합 단백질,
(3) "리간드가 결합하는 영역"이 스테로이드 호르몬 수용체에서 유래하는 (1) 기재의 융합 단백질,
(4) 스테로이드 호르몬 수용체가 에스트로겐 수용체인 (3) 기재의 융합 단백질,
(5) (1) 기재의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터,
(6) (5) 기재의 벡터를 보유하는 세포,
(7) (6) 기재의 세포에 대하여, (1) 기재의 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 작용시켜 (6) 기재의 세포를 선택적으로 증식시키는 방법,
(8) (a) 리간드가 결합하는 영역, (b) (a)의 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 (c) 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자와 소망하는 외래 유전자를 포함하는 벡터,
(9) "회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역"이 사이토카인 수용체에서 유래하는 (8) 기재의 벡터,
(10) 사이토카인 수용체가 G-CSF 수용체인 (9) 기재의 벡터,
(11) "리간드가 결합하는 영역"이 스테로이드 호르몬 수용체에서 유래하는 (8) 기재의 벡터,
(12) 스테로이드 호르몬 수용체가 에스트로겐 수용체인 (11) 기재의 벡터,
(13) "융합 단백질을 코딩하는 유전자"와 "외래 유전자"가 동일 분자 상에 위치하고 있는 (8) 기재의 벡터,
(14) "융합 단백질을 코딩하는 유전자"와 "외래 유전자"가 별개의 분자 상에 위치하고 있는 (8) 기재의 벡터,
(15) (8) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 벡터를 보유하는 세포,
(16) (15) 기재의 세포에 대하여, (8) 기재의 벡터에 포함되는 유전자가 코딩하는 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 작용시켜 (15)에 기재된 세포를 선택적으로 증식시키는 방법,
(17) (a) (5) 또는 (8)에 기재된 벡터, 및 (b) 이 벡터에 포함되는 유전자가 코딩하는 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 리간드는 특정 단백질에 작용함으로써 그 단백질을 회합시키는 것이면 특별한 제한은 없으나, 스테로이드 호르몬이 적합하다. 스테로이드 호르몬으로서는, 예를 들면 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄코르티코이드 등을 들 수 있으며, 각각의 수용체 단백질과의 조합으로 사용된다. 또한, 본 발명에 사용되는 사이토카인 수용체는 회합함으로써 세포에 증식 활성을 부여하는 것이면 적합하고, 예를 들면 G-CSF 등의 사이토카인 수용체 패밀리 또는 c-kit 또는 flk2/flt3 등과 같은 티로신키나제 수용체 패밀리에 속하는 것 등이 있다.
본 발명의 융합 단백질에서의 "세포에 증식 활성을 부여하는 영역"으로서는, 세포내 증식 시그날을 전달하는 분자, 예를 들면, 사이토카인 수용체 분자 전체를 사용하는 것이 가능하지만, 분자 중의 세포에 증식 활성을 부여하는 영역만을 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 융합 단백질 유전자가 도입된 세포의 분화를 일으키지 않고 증식만을 발생시키기 때문에 그 세포를 본래의 형태로 증식시킬 때에 유리하다.
다시, 본 발명에서 사용되는 벡터에는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 단일종 분자의 벡터, 융합 단백질과 외래 유전자의 쌍방을 포함하는 단일종 분자의 벡터 이외에, 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터와 외래 유전자를 포함하는 벡터의 조합으로 이루어진 복수종의 분자로 이루어지는 벡터계, 예를 들면, 바이너리(binary) 벡터계도 포함된다. 이 복수종의 분자로 이루어지는 벡터계는 통상 동시 형질전환(co-transformation)에 의해 세포에 도입된다.
또한, 융합 단백질을 코딩하는 유전자와 외래 유전자를 동일 벡터에 삽입하는 경우에는, IRES(internal ribosom entry site)(일본 특개평 제6-509713호 공보)를 포함하는 디시스트론(dicistron)의 형태로 할 수 있다. 예를 들면, "5'-프로모터-외래 유전자-IRES-융합 단백질을 코딩하는 유전자-3'"의 구성을 갖는 벡터, 또는 "5'-프로모터-융합 단백질을 코딩하는 유전자-IRES-외래 유전자-3'"의 구성을 갖는 벡터를 사용할 수 있다. 상기 융합 단백질 유전자를 발현하는 세포의 거의 모두가 외래 유전자를 발현하도록 만들기 위해서는 전자의 형태가 일반적으로 사용된다.
또한, 본 발명에 있어서, 벡터가 도입되는 세포로서는 조혈 간세포, 임파계 세포, 이들의 혈구계 이외의 세포 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명은, 자기 복제 능력을 갖는 조혈 간세포에 적합하게 적용된다. 다시, 본 발명에서의 세포에 도입되는 외래 유전자에 대해서는 특별한 제한은 없으나, 유전자 치료 분야에서는 결함 유전자에 대응하는 정상 유전자를 사용하는 것이 유효하다.
본 발명은 유전공학 분야, 특히 유전자 치료 분야에 관한 것이다.
도 1의 (A)는 G-CSF 수용체와 에스트로겐 수용체의 키메라 분자(GCRER)를 나타낸 것이다. (B)는 G-CSF 수용체와 에스트로겐 수용체의 키메라 분자 중, G-CSF 수용체의 제5 아미노산 내지 제195 아미노산이 결실된 변이체 (GCR△(5-195)/ER)를 나타낸 것이다. (C)는 G-CSF 수용체와 에스트로겐 수용체의 키메라 분자중, G-CSF 수용체의 제5 아미노산 내지 제195 아미노산 및 제725 아미노산 내지 제756 아미노산이 결실된 변이체 (GCR△(5-195, 725-756)/ER)를 나타낸 것이다.
도 2는 G-CSF 수용체와 에스트로겐 수용체의 키메라 유전자를 조합 도입한 레트로바이러스 벡터 "pMX"를 나타낸 것이다.
도 3은 "pCMX-GCRER"을 사용하여 형질전환시킨 Ba/F3 세포의 증식을 경시적으로 나타낸 것이다.
도 4는 "pCMX-GCRER"을 사용하여 형질전환시킨 Ba/F3 세포에 대하여 다양한 농도의 에스트라디올 자극을 준 후의 Ba/F3 세포의 증식을 경시적으로 나타낸 것이다.
도 5는 "pCMX-GCR△(5-195)/ER)"을 사용하여 형질전환시킨 Ba/F3 세포의 증식을 경시적으로 나타낸 것이다.
도 6은 플라스미드 "pCMX-GCRER-IRES-CD24"를 나타낸 것이다.
도 7은 플라스미드 "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24)"를 나타낸 것이다.
도 8은 플라스미드 "pCMX-GCR△(5-195, 725-756)/ER-IRES-CD24)"를 나타낸 것이다.
도 9는 플라스미드 "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24)"를 도입한 Ba/F3 세포에서의 CD 24의 발현을 유동 세포 측광법(flow cytometry)에 의해 검출한 결과를 나타낸 것이다. 위는 "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24)"를 도입한 Ba/F3 세포에서의 결과이고, 아래는 대조용으로서 사용한 "pCMX-GCR△(5-195)/ER"을 도입한 Ba/F3 세포에서의 결과를 나타낸 것이다 (죽은 세포의 검출을 위해 사용한 요오드화 프로피듐(propidium iodide)으로부터의 시그널도 데이터에 포함됨).
도 10은 "vMXGCRER"이 도입된 골수세포에 의해 구성된 과립구-마크로파지계 콜로니를 나타내는 현미경 사진이다.
도 11은 "vMXGCR△(5-195)/ER"이 도입된 골수세포에 의해 구성된 적아구계 콜로니를 나타내는 현미경 사진이다.
도 12는 "vMXGCRER"이 도입된 골수세포에 의해 분화된 마크로파지를 라이트-김자(Wright-Giemsa) 염색한 현미경 사진이다.
도 13은 "vMXGCR△(5-195)/ER"이 도입된 골수세포에 의해 분화된 적아구를 라이트-김자(Wright-Giemsa) 염색한 현미경 사진이다.
<실시예 1> 선택적 증폭 유전자인 G-CSF 수용체/에스트로겐 수용체 키메라 유전자의 제작
G-CSF 수용체 전체와 에스트로겐 수용체의 리간드(에스트로겐) 결합 영역의 키메라 단백질(이하, 단순히 "GCRER"이라 칭한다)이 생산되도록 각각의 단백질을 코딩하는 cDNA의 융합 유전자를 제작하였다 (도 1 (A)). 이어서, G-CSF에 대한 반응성이 결여된 키메라 단백질을 생산하기 위하여, "GCRER"에 대응하는 융합 유전자 중, G-CSF 수용체의 세포외 도메인의 제5 아미노산인 Glu로부터 제195 아미노산인 Leu까지의 부분이 결실된 변이 유도체(이하, 단순히 "GCR△(5-195)/ER"이라 칭한다)를 제작하였다(도 1 (B)). 다시 상기 변이 유도체로부터 G-CSF 수용체의 분화 유도 도메인(725-756)을 포함한 부분이 결실된 변이 유도체(이하, 단순히 "GCR△(5-195, 725-756)/ER"이라 칭한다)를 제작하였다(도 1 (C)).
<실시예 2>
선택적 증폭 유전자인 G-CSF 수용체/에스트로겐 수용체 키메라 유전자가 도입된 Ba/F3 세포의 단리
실시예 1에서 제작된 3 종류의 선택적 증폭 유전자를 플라스미드 "pCMX"(Cancer Res. 56; 4164 (1996))에 조합 도입하여 제조한 플라스미드 10 ㎍을, ScaI으로 직선화한 블라스티사이딘(blasticidin) 내성 유전자를 갖는 "pSV2bsr"(가켄 세이야쿠제) 1 ㎍과 함께, IL-3 의존성 세포주인 Ba/F3 세포에 전기 천공법으로 도입하였다. 이어서, 전기 천공을 실시한 후의 세포를 5 x 105개씩 24웰 플레이트에 분배하고, 블라스티사이딘 10 ㎍/ml을 포함하는 배지에서 배양하였다. 그 결과, "pCMX-GCRER"을 도입한 경우에는 17웰 중 11웰에서, "pCMX-GCR△(5-195)/ER"의 경우에는 29웰 중 3웰에서, "pCMX-GCR△(5-195, 725-756)/ER"의 경우에는 52웰 중 52웰에서 블라스티사이딘 내성 세포의 증식이 나타났다.
이어서, 이들 블라스티사이딘 내성 세포를 각각의 웰에 IL-3을 사용하여 증식시킨 후, IL-3 대신 에스트라디올 10-7M을 가하여 배양한 결과, "pCMX-GCRER"을 도입한 경우에는, 11웰 중 7웰에서, "pCMX-GCR△(5-195)/ER"의 경우에는, 3웰 중 3웰에서, "pCMX-GCR△(5-195, 725-756)/ER"의 경우에는, 16웰 중 13웰에서 IL-3 비의존성·에스트로겐 의존성 세포 증식이 나타났다. 또한, "pCMX-GCRER" 대신 레트로바이러스 벡터인 "pMX"(Exp. Hematol. 24: 324(1996))에 "GCRER"을 삽입한 것(이하, 단순히 "pMX-GCRER"라 칭한다) (도 2)을 사용하여 동일한 실험을 실시한 결과, 각각 1 세포를 포함하는 24웰 중 2웰에서 IL-3 비의존성·에스트로겐 의존성 세포 증식이 나타났다.
또한, "pCMX-GCRER"을 도입한 세포에 대하여, 에스트라디올 대신, 1 nM의 G-CSF를 가한 결과, G-CSF에 의해 세포가 증식한 웰은 에스트라디올에 의해 세포가 증식한 웰과 일치하였다. 다시, 플라스미드가 도입되지 않은 Ba/F3 세포를 대조용으로서 사용한 결과, G-CSF 및 에스트라디올에 의한 증식이 확인되지 않았다. 또한, 목적하는 융합 단백질이 세포 내에서 생산되고 있는 것은 항G-CSF 수용체 항체 또는 항에스트로겐 수용체 항체를 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 확인되었다.
<실시예 3> 에스트라디올에 의한 세포 증식의 해석
실시예 2에서 한계 희석법에 의해 수득한 클론 중에서 에스트라디올에 대한 반응성이 좋은 것을 선택하여 아래의 실험(XTT 분석)에 사용하였다.
먼저, "pCMX-GCRER"을 도입한 Ba/F3 세포에 대한 검토를 실시하였다. 그 결과, G-CSF 및 에스트라디올 자극에 의한 IL-3 비의존성 세포 증식이 확인되었다(도 3). 다시, 에스트라디올의 농도를 10-14내지 10-7M에서 변화시켜 동일한 실험을 실시한 결과, 10-9내지 10-7M의 농도에서 세포 증식이 확인되었다(도 4). 이것은 10-9내지 10-7M의 농도에 의한 에스트라디올 자극에 의해 세포 증식 시그널이 전달되는 것을 시사한다.
이어서, "pCMX-GCR△(5-195)/ER"을 도입한 Ba/F3 세포에 대하여 검토를 실시하였다. 그 결과, G-CSF 자극에 의한 세포 증식은 차단되어 에스트라디올 자극에 의한 세포 증식만이 확인되었다(도 5).
동일하게, "pCMX-GR△(5-195, 725-756)/ER"을 도입한 Ba/F3 세포에서도, 에스트로겐 자극에 의해 세포 증식이 일어나고, G-CSF에 대한 반응성은 확인되지 않았다.
<실시예 4> IRES-CD24 발현 플라스미드의 제조
"pCMX-GCRER"을 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고, 벡터 단편("단편 1")을 회수하였다. 또한, "pCMX-GCRER" 및 "pCMX-GCR△(5-195)/ER" 각각에서, HindIII와 KpnI 단편(각각 "단편 2": 1672bp, "단편 3": 1099bp), EcoRI과 KbpI 단편(각각 "단편 4": 1888bp, "단편 5": 1792bp)를 회수하였다. pBCEC[pBluescriptIIKS에 EMCV 유래의 IRES 및 CD24를 연결한 것, Migita, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12075 (1995)]을 ApoI으로 소화하여 IRES-CD24를 포함하는 단편("단편 6": 950bp)를 회수하였다.
"단편 1", "단편 2" "단편 4" 및 "단편 6"을 라이게이션하여"pCMXGCRER-IRES-CD24"(도 6)을, "단편 1", "단편 3", "단편 4" 및 "단편 6"을 라이게이션하여 "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24"(도 7)을, "단편 1", "단편 3" "단편 5" 및 "단편 6"을 라이게이션하여 "pCMX-GCR△(5-195, 725-756)/ER-IRES-CD24"(도 8)을 구축하였다.
<실시예 5> CD24의 세포내 발현
Ba/F3을 PBS로 2회, "OPTI-MEMI"(Gibco-BRL사제)로 1회 세정한 107세포를 0.2 ml의 "OPTI-MEMI"에 현탁하고, "pCMX-GCRER-IRES-CD24", "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24", "pCMX-GCR△(5-195, 725-756)/ER-IRES -CD24"를 각각 10 mg씩 가한 후, "Gene Pulser"(BioRad사제)를 사용하여 290V, 960mF에서 도입하였다. 도입 후, 2 일간 10% FCS, 10U/ml mIL-3 (R&D SYSTEMS사제)를 포함하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 106세포를 5% FCS/PBS로 세정한 후, 1 mg/ml 항CD24 항체(Pharmingen사제)를 실온에서 30분 반응시키고, 5% FCS/PBS로 2회 세정한 후, 1:20으로 희석한 PE 표지 항마우스 항체(DAKO사제)를 실온에서 30분 반응시켜 5% FCS/PBS로 2회 세정하였다. 5 mg/ml 요오드화 프로피듐(propidium iodide)/PBS 1ml에 현탁하고, 유동 세포 측광법으로 585 nm의 검출기(Becton Dickinson)를 사용하여 CD24의 발현의 해석을 실시하였다. 그 결과, "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24"가 도입된 세포에서는, 많은 세포에서 CD24의 발현이 검출되었다.
또한, "pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24"가 도입된 세포의 대조용으로서, "pCMX-GCR△(5-195)/ER"이 도입된 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 9 및 표 1에 나타내었다. 또한, 죽은 세포의 검출을 위해, 사용한 요오드화 프로피듐으로부터의 시그널도 데이터치에 포함되어 있다.
도입 플라스미드 항CD24 항원(-) 세포 항CD24 항원(+) 세포
pCMX-GCR△(5-195)/ER-IRES-CD24 59.77% 40.23%
pCMX-GCR△(5-195)/ER 85.10% 14.90%
<실시예 6> 프로제니터(progenitor) 분석
생후 6주의 C57BL 마우스 4마리에 5-플루오로우라실(5FU: 와코 쥰야쿠샤제) 생리 식염수 용액(10 mg/ml)을 300 ml/마리의 양으로 정맥주사를 실시하였다. 투여 후 2 일째에, 대퇴골로부터 골수를 채취하고, "Lympholyte-M(Cederlane사제) 상에서 원심분리(1500 rpm, 25℃, 22 분)에 의해 단핵구를 단리하였다. 20% FCS, 100 U/ml IL6, 100 mg/ml 쥐 SCF를 첨가한 이스코프 변형 달베코 기본 배지(IMDM; Gibco사제)에서 2일간 배양하였다.
CH 296(다카라 슈조사제, Hanenberg, H. et al, Nature Med. 2: 876(1996))을 코팅한 플레이트(1146: 팔콘사제) 상에서 IL6와 SCF로 전자극시킨 골수세포 106개를 환경영양성 패키징 (ecotropic packaging) 세포주 "GP+E-86" (J. Virol. 62: 1120(1988))에 "pMX-GCRER"를 조합 도입하고, 배양 상등액에서 수득된 레트로바이러스 "vMXGCRER", 또는 환경영양성 패키징 세포주 "GP+E-86"에 "pMXGCR△(5-195)/ER"을 조합 도입하고 배양 상등액에서 수득된 레트로바이러스 "vMXGCR△(5-195)/ER"을 108개 포함하는 배양 상등액으로 현탁하고, IL6 및 SCF를 첨가하여 배양하였다.
2, 24, 26, 36, 38시간 후에 바이러스 상등액을 교환하였다. 6회째의 바이러스 상등액 교환의 24 시간 후에 세포를 104/웰이 되도록 메틸셀룰로스를 포함하는 배지(IMDM, 1.2% 메틸셀루로스 1500 cp; Waco, 20% FCS, 1% 탈이온화 BSA, 10 mM 2-머캅토에탄올, 107M b-에스트라디올)에서 배양하였다. 10일 배양 후, 콜로니를 현미경 관찰한 다음, 도말 표본을 작성하여 라이트-김자 염색 후, 구성 세포를 동정하였다.
그 결과, "vMXGCRER", "vMXGCR△(5-195)/ER"이 감염된 골수세포에서는 에스트다디올 자극으로 분화한 과립구-마크로파지계 콜로니, 적아구계 콜로니가 관찰되었다. 에스트라디올 자극에 의해 "vMXGCRER" 감염 골수세포로부터 형성된 과립구-마크로파지계 콜로니를 도 10에 나타내었다. 에스트라디올 자극에 의해 "vMXGCR△(5-195)/ER" 감염 골수세포로부터 형성된 적아구계 콜로니를 도 11에 나타내었다. 이들 콜로니의 구성 세포를 도말 표본으로 하여 라이트-김자 염색한 결과, 분화된 혈구 세포상이 수득되었다. "vMXGCRER" 감염 골수세포로부터 형성된 과립구-마크로파지계 콜로니의 도말 표본에서 관찰된 마크로파지의 라이트-김자 염색상을 도 12에, "vMXGCR△(5-195)/ER" 감염 골수세포로부터 형성된 적아구계 콜로니의 도말 표본에서 관찰된 적아구의 라이트-김자 염색상을 도 13에 나타내었다.
본 발명에 의해, 외래 유전자를 도입한 세포를 외부 자극에 의해 선택적으로 증폭시키는 것이 가능해지고, 표적 세포로의 유전자의 도입 효율 등이 낮은 경우에도, 유효한 유전자 치료가 가능하게 되었다. 또한, 본 발명에 의한 세포의 선택적 증폭 시스템은 다양한 혈액 세포에 적용이 가능하기 때문에, 유전자 치료의 대상이 되는 세포 범위의 확대가 시도되었다. 따라서, 본 발명에 의해 특히 유전자 치료 분야에서 중요한 기초 기술이 제공되였다.

Claims (17)

  1. (a) 리간드가 결합하는 영역, (b) (a)의 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 (c) 사이토카인 수용체 또는 그 일부로 이루어지고, 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, "사이토카인 수용체 또는 그 일부로 이루어지고, 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역"이 G-CSF 수용체에서 유래하는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, "리간드가 결합하는 영역"이 스테로이드 호르몬 수용체에서 유래하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 스테로이드 호르몬 수용체가 에스트로겐 수용체인 융합 단백질.
  5. 제1항의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
  6. 제5항의 벡터를 보유하는 세포.
  7. 제6항의 세포에 대하여 제1항의 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 작용시켜 제6항의 세포를 선택적으로 증식시키는 방법.
  8. (a) 리간드가 결합하는 영역, (b) (a)의 영역에 리간드가 결합하면 회합하는 영역, 및 (c) 회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자와 소망하는 외래 유전자를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, "회합하면 세포에 증식 활성을 부여하는 영역"이 사이토카인 수용체에서 유래하는 것인 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 사이토카인 수용체가 G-CSF 수용체인 벡터.
  11. 제8항에 있어서, "리간드가 결합하는 영역"이 스테로이드 호르몬 수용체에서 유래하는 것인 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 스테로이드 호르몬 수용체가 에스트로겐 수용체인 벡터.
  13. 제8항에 있어서, "융합 단백질을 코딩하는 유전자"와 "외래 유전자"가 동일 분자 상에 위치하고 있는 벡터.
  14. 제8항에 있어서, "융합 단백질을 코딩하는 유전자"와 "외래 유전자"가 별개의 분자 상에 위치하고 있는 벡터.
  15. 제8항 내지 14항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 보유하는 세포.
  16. 제15항의 세포에 대하여 제8항의 벡터에 포함되는 유전자가 코딩하는 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 작용시켜 제15항의 세포를 선택적으로 증식시키는 방법.
  17. (a) 제5항 또는 8항에 기재된 벡터, 및 (b) 이 벡터에 포함되는 유전자가 코딩하는 융합 단백질의 "리간드가 결합하는 도메인"에 작용하는 리간드를 포함하는 키트.
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