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KR19990087515A - 환상 리포펩티드 물질의 탈아실화 방법 - Google Patents

환상 리포펩티드 물질의 탈아실화 방법 Download PDF

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KR19990087515A
KR19990087515A KR1019980706947A KR19980706947A KR19990087515A KR 19990087515 A KR19990087515 A KR 19990087515A KR 1019980706947 A KR1019980706947 A KR 1019980706947A KR 19980706947 A KR19980706947 A KR 19980706947A KR 19990087515 A KR19990087515 A KR 19990087515A
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마사미 에자키
카즈토시 사카모토
세이지 하시모토
노부타카 오하타
마사루 츠보이
미치오 야마시타
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후지야마 아키라
후지사와 야꾸힝 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 환상 리포 펩티드 물질, 구체적으로 하기 화학식 I로 표시되는 FR901397 물질 및 그 유사체의 아실 측쇄를 효과적으로 탈아실화할 수 있는 환상 리포펩티드 아실라아제 및 이 아실라아제를 이용한 환상 펩티드 물질의 제조 방법을 제공한다.
화학식 I
식 중, R1은 아실기,
R2는 히드록시기 또는 아실옥시기,
R3은 수소 또는 히드록시기,
R4는 수소 또는 히드록시기,
R5는 수소 또는 히드록시술포닐옥시기, 그리고
R6은 수소 또는 카르바모일기를 의미한다.

Description

환상 리포펩티드 물질의 탈아실화 방법
환상 리포펩티드 물질, 구체적으로 상기 FR901379 물질 및 그 유사체의 아실 측쇄를 효과적으로 탈아실화할 수 있는 아실라아제가 요구되고 있다.
본 발명은 효소 기술에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 환상(環狀) 리포펩티드 물질의 아실 측쇄를 탈아실화하는 신규한 아실라아제 및 이것을 이용한 탈아실화 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 미생물 콜레오포마(Coleophoma) sp. F-11899주(FERM BP-2635)에 의해 생산되는 FR901379 물질(일본 특허 공개 공보 1991-184921호에 기재) 및 FR901379 물질의 유사체의 아실 측쇄를 탈아실화하는 신규한 아실라아제 및 이것을 이용한 탈아실화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 발명자 등은 FR901379 물질 및 에치노칸딘(Echinocandin) B, 아쿨레아신(Aculeacin) A 등의 FR901379 물질 유사체로 대표되는 환상 리포펩티드 물질의 아실 측쇄를 탈아실화하는 신규한 아실라아제를 구하기 위해 예의 연구를 하였다. 그 결과, 미생물 스트렙토마이세스 어눌라투스(Streptomyces anulatus)가 생산하는 아실라아제를 새롭게 발견하고, 목적으로 하는 탈아실화를 효과적으로 행하는 데에 성공하였다.
이 신규 환상 리포펩티드 아실라아제 및 이것을 이용한 탈아실화 방법의 특징을 이하의 설명에서 밝힌다.
우선, 본 발명의 환상 리포펩티드 아실라아제 생산균에 대하여 설명한다.
신규 환상 리포펩티드 아실라아제 생산균은 구체적으로, 예를 들면 스트렙토마이세스 속(屬)에 속하는 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주, 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주나 또는 스트렙토마이세스 sp. 6907주이다.
이하, 이들 균주의 특징을 나타낸다.
신규 환상 리포펩티드 아실라아제 생산균인 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주라고 명명한 균주(이하, No.4811주라고 약칭함)는 후쿠시마켄에서 채취된 토양 시료로부터 새롭게 분리한 것이다. 이하에 No.4811주의 균학적(菌學的) 성질을 나타낸다.
각종 배지(培地)상에서의 특징
표 1은 No.4811주를 효모 엑기스·맥아 엑기스 한천, 오트밀 한천, 무기염·전분 한천, 글리세린·아스파라긴 한천, 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천 배지상에서, 30℃로 14 일간 배양시켰을 때, 발육 상태를 광학 및 주사형 전자 현미경으로 관찰한 특징을 정리하여 기재한 것이다. 색명은 문헌[Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978]을 사용하였다.
No.4811주의 각종 배지에 있어서 배양상의 특징
배지 배양 성상
효모엑기스·맥아엑기스 한천(ISP-2) G: 양호A: 풍부, 황회색(2B2)R: 갈색(7F4)S: 소량, 갈색
오트밀 한천(ISP-3) G: 양호 보통A: 풍부, 황회색(2C3)R: 갈색(7F4)S: 미량, 갈색
무기염·전분 한천(ISP-4) G: 양호A: 풍부, 황회색(2C3)R: 황갈색(5E4)S: 없음
글리세린·아스파라긴 한천(ISP-5) G: 양호A: 풍부, 황회색(2C3)R: 갈색(6E4)S: 없음
펩톤·효모 엑기스·철 한천(ISP-6) G: 보통A: 빈약, 백색R: 밝은 갈색(6D5)S: 없음
티로신 한천(ISP-7) G: 보통A: 보통, 황회색(2B2)R: 갈색(7F4)S: 없음
약호; G:생육 A:기균사(氣菌絲) R:생육 이면의 색 S:가용성 색소
기균사의 색은 황회색 내지 녹회색, 생육 이면의 색은 황갈색 내지 갈색, 가용성 색소는 엷은 갈색이고, 균체내 색소 및 가용성 색소는 pH 감수성이 없다. 멜라노이드 색소의 생산은 발견되지 않았다.
생리학적 특징
표 2는 No.4811주의 생리학적 특징을 정리하여 기재한 것이다.
No.4811주의 생리학적 특징
조건 성질
생육 온도 범위 4.0℃-35.0℃
젤라틴 액화 +
밀크 응고 ±
밀크 펩톤화 +
전분 분해 +
멜라노이드 색소 생산 -
탄소원 이용성
D-글루코오스 +
L-아라비노오스 +
D-크실로오스 +
이노시톨 -
만니톨 +
D-프룩토오스 +
L-람노오스 ±
수크로오스 -
라피노오스 -
+: 양성, ±: 유사 양성, -: 음성
No.4811주의 기생 균사(基生 菌絲)는 잘 발달하고, 불규칙하게 분지(分枝)하지만, 단열(斷裂)하지 않는다. 기생 균사로부터 신장한 기균사(氣菌絲)는 단순 분지하고, 긴 포자쇄(胞子鎖)를 형성한다. 기균사의 형상은 직상(直狀), 곡상(曲狀)으로 문헌[Pridham,T.G. et al.: Appl.Microbiol., 6: 54,1958] 등의 분류의 RF 유형에 속한다. 1개의 포자 연쇄는 20개 이상의 포자로 이루어진다. 포자는 표면이 평활하고, 0.5∼0.7 ㎛×0.7∼1.1 ㎛ 크기의 원통형이었다.
균핵, 포자낭(sporangium), 유주자(遊走子: zoospore)는 관찰되지 않았다.
세포벽 유형
세포벽의 아미노산은 문헌[Becker,B., M.P.Lechevalier, R.E.Gordon and H.A.Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964], 문헌[Yamaguchi, T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J.Bacteriol., 89: 444-453,1965] 등의 방법에 따라서, 모든 균체 분해물을 분석한 결과, LL-디아미노피멜산의 존재를 확인할 수 있었다. 따라서 본 균주의 세포벽 유형은 I형이라고 생각된다.
이상의 형태 관찰 및 화학 분석의 결과로부터 No.4811주는 문헌[Pridham, T.G. et al: Appl.Microbiol., 6: 54,1958]의 분류에 따르면, 스트렙토마이세스 속에 속한다고 생각된다. 그래서 본 균주를 문헌[Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 2. Spiecies descriptions from first study, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189, 1968; Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 3. Additional spiecies descriptions from first and second studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 279-392, 1968; Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 4. Spiecies descriptions from second, third and forth studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 19: 391-512. 1969], 문헌[Skerman, V. B., V. McGowan and P.H.A.Sneath: Approved list of bacterial names, Amended Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989], 및 문헌[Moore,W.E., E.P.Cato and L.V.H.Moore: Index of bacterial and Yeast Nomencultural Changes, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1992]에 기재된 스트렙토마이세스 속의 종과 비교하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 어눌라투스의 기재상의 성질과 본 주(株)의 성질은 거의 동일하였다. 이상으로부터 No.4811주를 스트렙토마이세스 어눌라투스로 동정(同定)하고, 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811이라고 명명하였다.
이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-3)에 FERM P-15377로서 1995년 12월 27일에 기탁되고, 더욱이 FERM BP-5808으로서 1997년 2월 3일에 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되어 있다.
신규 환상 리포펩티드 아실라아제 생산균인 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주라고 명명한 균주(이하, No.8703주라고 약칭함)는 후쿠시마켄에서 채취된 토양 시료로부터 새롭게 분리한 것이다. 이하에 No.8703주의 균학적 성질을 나타낸다.
각종 배지상에서의 특징
표 3은 No.8703주를 효모 엑기스·맥아 엑기스 한천, 오트밀 한천, 무기염·전분 한천, 글리세린·아스파라긴 한천, 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천 배지상에서, 30℃로 14 일간 배양시켰을 때, 발육 상태를 광학 및 주사형 전자 현미경으로 관찰한 특징을 정리하여 기재한 것이다. 색명은 문헌[Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978]을 사용하였다.
No.8703주의 각종 배지에 있어서 배양상의 특징
배지 배양 성상
효모 엑기스·맥아 엑기스 한천(ISP-2) G:양호A:풍부, 황회색(2B2)R:회갈색(5F4)S:없음
오트밀 한천(ISP-3) G:보통A:풍부, 황회색(2C3)R:회갈색(4C4)S:없음
무기염·전분 한천(ISP-4) G:양호A:풍부, 황회색(2C3)R:암회색(1F6)S:없음
글리세린·아스파라긴 한천(ISP-5) G:양호A:풍부, 황회색(2C3)R:올리브 갈색(4E5)S:없음
펩톤·효모 엑기스·철 한천(ISP-6) G:보통A:빈약, 백색R:황갈색(5D5)S:없음
티로신 한천(ISP-7) G:보통A:보통, 황회색(2B2)R:갈색(7F4)S:없음
약호; G:생육 A:기균사 R:생육 이면의 색 S:가용성 색소
기균사의 색은 황회색 내지 녹회색, 생육 이면의 색은 황갈색 내지 갈색, 가용성 색소는 엷은 갈색이고, 균체내 색소 및 가용성 색소는 pH 감수성이 없다. 멜라노이드 색소의 생산은 트립톤·효모 엑기스 브로스(broth), 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천에서 발견되었다.
생리학적 특징
표 4는 No.8703주의 생리학적 특징을 정리하여 기재한 것이다.
No.8703주의 생리학적 특징
조건 성질
생육 온도 범위 4.0℃-35.0℃
젤라틴 액화 +
밀크 응고 ±
밀크 펩톤화 +
전분 분해 +
멜라노이드 색소 생산 -
탄소원 이용성
D-글루코오스 +
L-아라비노오스 +
D-크실로오스 +
이노시톨 -
만니톨 +
D-프룩토오스 +
L-람노오스 +
수크로오스 -
라피노오스 -
+: 양성, ±:유사 양성, －:음성
이 균주는 이노시톨, 수크로오스 및 라피노오스를 이용할 수 없었다. 밀크를 펩톤화할 수 있었다. 생육 온도 범위는 4.0℃-35℃이었다.
No.8703주의 기생 균사는 잘 발달하고, 불규칙하게 분지하지만 단열하지 않는다. 기생 균사로부터 신장한 기균사는 단순히 분지하고, 긴 포자쇄를 형성한다. 기균사의 형상은 직상, 곡상으로 문헌[Pridham,T.G. et al.: Appl.Microbiol., 6: 54,1958] 등의 분류의 RF 유형에 속한다. 1개의 포자 연쇄는 20개 이상의 포자로 이루어진다. 포자는 표면이 평활하고, 원통형이었다. 포자의 크기는 0.5~0.8 ㎛×0.6~1.1 ㎛이었다. 균핵, 포자낭, 유주자는 관찰되지 않았다.
세포벽 유형
세포벽의 아미노산은 문헌[Becker.B., M.P.Lechevalier, R.E.Gordon and H.A.Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbio1., 12: 421-423, 1964], 문헌[Yamaguchi,T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J. Bacteriol., 89: 444-453, 1965] 등의 방법에 따라서, 모든 균체 분해물을 분석한 결과, LL-디아미노피멜산의 존재를 확인할 수 있었다. 따라서 본 균주의 세포벽 유형은 I형이라고 생각된다.
이상의 형태 관찰 및 화학 분석의 결과로부터 No.8703주는 문헌[Pridham,T.G.et al: Appl. Microbiol., 6: 54. 1958]의 분류에 따르면, 스트렙토마이세스 속에 속한다고 생각된다. 그래서 본 균주를 문헌[Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 2. Spiecies descriptions from first study, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189, 1968; Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 3. Additional spiecies descriptions from first and second studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 279-392, 1968; Shirling, E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 4. Spiecies descriptions from second, third and forth studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 19: 391-512, 1969], 문헌[Skerman,V.B., V.McGowan and P.H.A.Sneath: Approved list of bacterial names, Amended Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989] 및 문헌[Moore,W.E., E.P.Cato and L.V.H.Moore: Index of bacterial and Yeast Nomencultural Changes, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1992]에 기재된 스트렙토마이세스 속의 종과 비교하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 어눌라투스의 기재상의 성질과 본 주의 성질은 거의 동일하였다. 이상에서 No.8703주를 스트렙토마이세스 어눌라투스로 동정하고, 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703이라고 명명하였다.
이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-3)에 FERM P-15507로서 1996년 3월 8일에 기탁되고, 더욱이 FERM BP-5810으로서 1997년 2월 3일에 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되어 있다.
신규 환상 리포펩티드 아실라아제 생산균인 스트렙토마이세스 sp.No.6907주라고 명명한 균주(이하 No.6907주라고 약칭함)는 후쿠시마켄에서 채취된 토양 시료로부터 새롭게 분리한 것이다. 이하에 No.6907주의 균학적 성질을 나타낸다.
각종 배지상에서의 특징
표 5는 No.6907주를 효모 엑기스·맥아 엑기스 한천, 오트밀 한천, 무기염·전분 한천, 글리세린·아스파라긴 한천, 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천 배지상에서 30℃로 14 일간 배양시켰을 때, 발육 상태를 광학 및 주사형 전자 현미경으로 관찰한 특징을 정리하여 기재한 것이다. 색명은 문헌[Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978]을 사용하였다.
No.6907주의 각종 배지에 있어서 배양상의 특징
배지 배양 성상
효모 엑기스·맥아 엑기스 한천(ISP-2) G:양호A:풍부, 황회색(백4A2)R:회귤색(5B6)S:없음
오트밀 한천(ISP-3) G:보통A:풍부, 청회색(22C2)R:밝은 갈색(4D4)S:없음
무기염·전분 한천(ISP-4) G:양호A:풍부, 청회색(19C2)R:갈색(6F4)S:없음
글리세린·아스파라긴 한천(ISP-5) G:양호A:풍부, 청회색(22B2)R:적갈색(8E4)S:없음
펩톤·효모 엑기스·철 한천(ISP-6) G:보통A:없음R:회갈색(9F3)S:갈색
티로신 한천(ISP-7) G:양호A:보통, 황백색(4A2)R:어두운 진홍색(13F3)S:갈색
약호; G:생육 A:기균사 R:생육 이면의 색 S:가용성 색소
기균사의 색은 황회색 내지 청회색, 생육 이면의 색은 밝은 갈색 내지 갈색이고, 균체내 색소는 pH 감수성이 없다. 멜라노이드 색소의 생산은 트립톤·효모 엑기스 브로스, 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천에서 발견되었다.
생리학적 특징
표 6은 No.6907주의 생리학적 특징을 정리하여 기재한 것이다.
No.6907주의 생리학적 특징
조건 성질
생육 온도 범위 9.0℃-40.0℃
젤타틴 액화 +
밀크 응고 +
밀크 펩톤화 -
전분 분해 +
멜라노이드 색소 생산 +
탄소원 이용성
D-글루코오스 +
L-아라비노오스 +
D-크실로오스 +
이노시톨 +
만니톨 +
D-프룩토오스 +
L-람노오스 +
수크로오스 +
라피노오스 +
+:양성, ±:유사 양성, -:음성
이 균주는 시험한 모든 탄소원을 이용할 수 있었다. 밀크의 펩톤화는 되지 않았다. 생육 온도 범위는 9.0℃-40.0℃이었다.
No.6907주의 기생 균사는 잘 발달하고, 불규칙하게 분지하지만 단열하지 않는다. 기생 균사로부터 신장한 기균사는 단순히 분지하고, 긴 포자쇄를 형성한다. 기균사의 형상은 직상, 곡상 또는 불완전한 루프상으로 문헌[Pridham,T.G. et al.: Appl. Microbiol., 6: 54, 1958] 등의 분류의 RF 또는 RA 유형에 속한다. 1개의 포자 연쇄는 20개 이상의 포자로 이루어진다. 포자는 표면이 평활하고, 원통형이었다. 포자의 크기는 0.5~0.7 ㎛×0.7~1.3 ㎛이었다. 균핵, 포자낭, 유주자는 관찰되지 않았다.
세포벽 유형
세포벽의 아미노산은 문헌[Becker,B., M.P.Lechevalier, R.E.Gordon and H.A.Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964], 문헌[Yamaguchi,T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J. Bacteriol., 89: 444-453, 1965] 등의 방법에 따라서, 모든 균체 분해물을 분석한 결과, LL-디아미노피멜산의 존재를 확인할 수 있었다. 따라서 본 균주의 세포벽 유형은 I형이라고 생각된다.
이상의 형태 관찰 및 화학 분석의 결과로부터 No.6907주는 문헌[Pridham,T.G.et al: Appl. Microbiol., 6: 54, 1958]의 분류에 따르면, 스트렙토마이세스 속에 속한다고 생각된다. 그래서 본 균주를 문헌[Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 2. Spiecies descriptions from first study, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189, 1968; Shirling, E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 3. Additional spiecies descriptions from first and second studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18: 279-392, 1968; Shirling,E.B. and D.Gottlieb: Cooperative discription of type culture of Streptomyces. 4. Spiecies descriptions from second, third and forth studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 19: 391-512, 1969], 문헌[Skerman,V.B., V.McGowan and P.H.A. Sneath: Approved list of bacterial names, Amended Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989] 및 문헌[Moore.W.E., E.P.Cato and L.V.H.Moore: Index of bacterial and Yeast Nomencultural Changes, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1992]에 기재된 스트렙토마이세스 속의 종과 비교하였다. 그 결과, 동일 종이라고 판정할 수 있는 종을 발견할 수 없었기 때문에, 이 균주를 스트렙토마이세스 sp.No.6907이라고 명명하였다.
이 스트렙토마이세스 sp.No.6907주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-3)에 FERM P-15506으로서 1996년 3월 8일에 기탁되고, 더욱이 FERM BP-5809로서 1997년 2월 3일에 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되어 있다.
본 발명에서 말하는 「환상 리포펩티드 물질」이란 폴리펩티드 고리를 가지고, 이 고리 위에 측쇄로서, 「아실아미노기」를 가지는 물질을 말하며, 이 물질은 또 다른 측쇄를 가지고 있어도 좋다.
상기 「환상 리포펩티드 물질」의 대표예인 FR901379 물질은 미생물 콜레오포마 sp. F-11899주(FERM BP-2635)에 의해 생산되는 항진균 활성을 가진 이미 공지된 물질(일본 특허 공개 공보 1991-184921호에 기재)로서, 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물이다.
또한, FR901379 물질 유사체란 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그 염을 말한다.
식 중, R1은 아실기,
R2는 히드록시기 또는 아실옥시기,
R3은 수소 또는 히드록시기,
R4는 수소 또는 히드록시기,
R5는 수소 또는 히드록시술포닐옥시기, 그리고
R6은 수소 또는 카르바모일기를 의미한다.
본 발명의 신규 환상 리포펩티드 아실라아제는, 스트렙토마이세스 속에 속하는 균에서 유래된 아실라아제로서, 환상 리포펩티드 물질의 측쇄 「아실아미노기」를 탈아실화하여, 「아미노기」로 유도한 것으로, 구체적으로는 FR901379 물질 또는 그 염의 팔미토일 측쇄 또는 FR901379 물질을 함유한 상기 화학식 I로 표시되는 FR901379 물질 유사체 또는 그 염의 아실 측쇄를 탈아실화하여 환상 펩티드 물질, 구체적으로는 하기 화학식 IIa로 표시되는 화합물(FR179642 물질) 또는 그 염이거나 FR179642 물질을 함유한 하기 화학식 II로 표시되는 FR179642 유사체 또는 그 염을 생산시키는 아실라아제이다.
식 중, R2, R3, R4, R5및 R6은 상기와 같은 기를 의미한다.
화합물 I 및 화합물 II의 적합한 염은 관용의 무독성 모노염 또는 2염으로서, 금속염, 예를 들면 알칼리 금속염(예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염 등), 암모늄염, 유기 염기와의 염(예를 들면, 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜린염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염 등) 등, 유기산 부가염(예를 들면, 포름산염, 초산염, 트리플루오로아세트산염, 말레인산염, 주석산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염 등), 무기산 부가염(예를 들면, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 인산염 등), 아미노산(예를 들면, 알기닌, 아스파라긴산, 글루탐산 등)과의 염 등을 들 수 있다.
적합한 「저급 알킬」로서는 탄소 원자 수가 1개∼6개인 직쇄상 또는 분지쇄상 알킬, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸 및 헥실을 들 수 있고, 바람직하게는 탄소 원자 수가 1개∼4개인 알킬이 있고, 더욱 바람직하게는 메틸이 있다.
적합한 「고급 알킬」로서는, 헵틸, 옥틸, 3,5-디메틸옥틸, 3,7-디메틸옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 아이코실 등의 탄소 원자 수 7개∼20개의 직쇄상 또는 분지쇄상인 것을 들 수 있다.
적합한 「저급 알콕시」로서는, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, tert-펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 이소헥실옥시 등의 직쇄상 또는 분지쇄상인 것을 들 수 있다.
적합한 「고급 알콕시」로서는, 헵틸옥시, 옥틸옥시, 3,5-디메틸옥틸옥시, 3,7-디메틸옥틸옥시, 노닐옥시, 데실옥시, 운데실옥시, 도데실옥시, 트리데실옥시, 테트라데실옥시, 헥사데실옥시, 헵타데실옥시, 옥타데실옥시, 노나데실옥시, 아이코실옥시 등의 직쇄상 또는 분지쇄상인 것을 들 수 있다.
적합한 「아릴」로서는, 저급 알킬을 가지고 있어도 좋은 페닐(예를 들면, 페닐, 메시틸, 톨릴 등), 나프틸, 안트릴 등을 들 수 있다.
적합한 「아실아미노기」 또는 「아실기」의 「아실」부분으로서는, 카르복실산, 탄산, 카르밤산, 술폰산 등으로부터 유도되는 지방족 아실, 방향족 아실, 복소환(復素環) 아실, 아릴 치환 지방족 아실 및 복소환 치환 지방족 아실을 들 수 있다.
상기 「아실」의 적합한 예로서는, 할로겐(예를 들면, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오드 등), 히드록시, 상기 고급 알콕시, 상기 아릴 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 아릴(예를 들면, 페닐, 나프틸, 안트릴 등); 상기 저급 알콕시; 아미노; 보호된 아미노[바람직하게는 아실아미노, 예를 들면, 저급 알콕시 카르보닐아미노(예를 들면, 메톡시카르보닐아미노, 에톡시카르보닐아미노, 프로폭시카르보닐아미노, 부톡시카르보닐아미노, t-부톡시카르보닐아미노, 펜틸옥시카르보닐아미노, 헥실옥시카르보닐아미노 등) 등]; 디(저급)알킬아미노(예를 들면, 디메틸아미노, N-메틸에틸아미노, 디에틸아미노, N-프로폭시부틸아미노, 디펜틸아미노, 디헥실아미노 등); 저급 알콕시이미노(예를 들면, 메톡시이미노, 에톡시이미노, 프로폭시이미노, 부톡시이미노, t-부톡시이미노, 펜틸옥시이미노, 헥실옥시이미노 등); 상기 고급 알콕시 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 페닐(저급) 알콕시이미노 등의 아르(저급)알콕시이미노(예를 들면, 벤질옥시이미노, 펜에틸옥시이미노, 벤즈히드릴옥시이미노 등); 고급 알킬(예를 들면, 헵틸, 옥틸, 2-에틸헥실, 노닐, 데실, 3,7-디메틸옥틸, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 3-메틸-10-에틸도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 아이코실 등) 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 복소환 티오(바람직하게는, 피리딜티오); 아미노, 상기 보호된 아미노, 상기 고급 알킬 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는, 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 복소환기(예를 들면, 티에닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 푸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 티아디아조릴 등) 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는, 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 저급 알카노일(예를 들면, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 헥사노일, 피발로일 등);
고급 알카노일(예를 들면, 헵타노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 운데카노일, 라우로일, 트리데카노일, 미리스토일, 펜타데카노일, 팔미토일, 10,12-디메틸테트라데카노일, 헵타데카노일, 스테아로일, 노나데카노일, 아이코사노일 등);
상기 고급 알콕시 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 상기 아릴 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 저급 알케노일(예를 들면, 아크릴로일, 메타크릴로일, 크로토노일, 3-펜테노일, 5-헥세노일 등);
고급 알케노일(예를 들면, 4-헵테노일, 3-옥테노일, 3,6-데카디에노일, 3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리에노일, 4,10-헵타데카디에노일 등);
저급 알콕시카르보닐(예를 들면, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐, 부톡시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 펜틸옥시카르보닐, 헥실옥시카르보닐 등);
고급 알콕시카르보닐(예를 들면, 헵틸옥시카르보닐, 옥틸옥시카르보닐, 2-에틸헥실옥시카르보닐, 노닐옥시카르보닐, 데실옥시카르보닐, 3,7-디메틸옥틸옥시카르보닐, 운데실옥시카르보닐, 도데실옥시카르보닐, 트리데실옥시카르보닐, 테트라데실옥시카르보닐, 펜타데실옥시카르보닐, 3-메틸-10-에틸도데실옥시카르보닐, 헥사데실옥시카르보닐, 헵타데실옥시카르보닐, 옥타데실옥시카르보닐, 노나데실옥시카르보닐, 아이코실옥시카르보닐 등);
아릴옥시카르보닐(예를 들면, 페녹시카르보닐, 나프틸옥시카르보닐 등);
아릴글리옥시로일(예를 들면, 페닐글리옥시로일, 나프틸글리옥시로일 등);
적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상 가지고 있어도 좋은 아르(저급)알콕시카르보닐, 예를 들면, 니트로 또는 저급 알콕시를 가지고 있어도 좋은 페닐(저급) 알콕시카르보닐(예를 들면, 벤질옥시카르보닐, 페네틸옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐 등);
저급 알킬술포닐(예를 들면, 메틸술포닐, 에틸술포닐, 프로필술포닐, 이소프로필술포닐, 펜틸술포닐, 부틸술포닐 등);
상기 저급 알콕시, 상기 고급 알콕시 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 아릴술포닐(예를 들면, 페닐술포닐, 나프틸술포닐 등);
페닐(저급) 알킬술포닐 등의 아르(저급)알킬술포닐(예를 들면, 벤질술포닐, 펜에틸술포닐, 벤즈히드릴술포닐 등);
상기 할로겐; 저급 알킬(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실 등); 상기 고급 알킬; 상기 저급 알콕시, 상기 할로겐, 상기 아릴 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 10개) 가지고 있어도 좋은 저급 알콕시(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, t-부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등); 상기 할로겐 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 17개) 가지고 있어도 좋은 고급 알콕시(예를 들면, 헵틸옥시, 옥틸옥시, 2-에틸헥실옥시, 노닐옥시, 데실옥시, 3,7-디메틸옥틸옥시, 운데실옥시, 도데실옥시, 트리데실옥시, 테트라데실옥시, 펜타데실옥시, 3-메틸-10-에틸도데실옥시, 헥사데실옥시, 헵타데실옥시, 옥타데실옥시, 노나데실옥시, 아이코실옥시 등); 고급 알케닐옥시(예를 들면, 3-헵테닐옥시, 7-옥테닐옥시, 2,6-옥타디에닐옥시, 5-노네닐옥시, 1-데세닐옥시, 3,7-디메틸-6-옥테닐옥시, 3,7-디메틸-2,6-옥타디에닐옥시, 8-운데세닐옥시, 3,6,8-도데카트리에닐옥시, 5-트리데세닐옥시, 7-테트라데세닐옥시, 1,8-펜타데카디에닐옥시, 15-헥사데세닐옥시, 11-헵타데세닐옥시, 7-옥타데세닐옥시, 10-노나데세닐옥시, 18-이코세닐옥시 등); 카르복시; 상기 고급 알콕시 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 상기 아릴; 상기 저급 알콕시 또는 상기 고급 알콕시 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 3개) 가지고 있어도 좋은 아릴옥시(예를 들면, 페녹시, 나프틸옥시, 안트릴옥시 등) 등의 적당한 치환기를 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1개 내지 5개) 가지고 있어도 좋은 아로일(예를 들면, 벤조일, 나프토일, 안트릴카르보닐 등) 등을 들 수 있다.
상기 「아실기」중, 바람직한 것은 고급 알카노일이고, 특히 바람직한 것은 팔미토일기이다.
적합한 「아실옥시기」중의 「아실기」는 상기「아실기」에 대하여 예시한 것을 들 수 있다.
적합한 「아실옥시기」는 저급 알카노일옥시(예를 들면, 포르밀옥시, 아세틸옥시, 프로피오닐옥시, 부티릴옥시, 이소부티릴옥시, 발레릴옥시, 헥사노일옥시, 피발로일옥시 등) 또는 포스포녹시 등을 들 수 있다.
본 발명의 신규한 환상 리포펩티드 아실라아제는, 예를 들면 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주(FERM BP-5808), 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주(FERM BP-5810) 또는 스트렙토마이세스 sp.No.6907주(FERM BP-5809)와 같은 스트렙토마이세스 속에 속하는 아실라아제 생산 균주를 배양 배지속에서 배양함으로써 생산할 수 있다.
일반적으로, 이 신규 아실라아제는 이 신규 아실라아제 생산 균주가 동화할 수 있는 탄소원 및 질소원을 함유하는 수성 배지속에서, 바람직하게는 예를 들면 진탕(振蕩) 배양, 심부(深部) 배양 등의 호기성 조건하에서 배양함으로써 생산할 수 있다.
배지의 바람직한 탄소원으로서는 글루코오스, 크실로오스, 갈락토오스, 글리세린, 전분, 덱스트린 등과 같은 탄수화물을 들 수 있다. 다른 탄소원으로서는 말토스, 람노오스, 라피노오스, 아라비노오스, 만노오스, 살리신, 숙신산나트륨 등을 들 수 있다.
바람직한 질소원으로서는 효모·추출물, 펩톤, 글루텐밀, 면실분, 대두분, 옥수수·스티프(steep)·리커(liquor), 건조 효모, 소맥 배아(胚芽), 우모(羽毛)분, 낙화생분 등 및 예를 들면, 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 요소, 아미노산 등과 같은 무기 또는 유기질소 화합물을 들 수 있다.
탄소원 및 질소원은 바람직하게는 그들의 조합으로 사용되지만, 적량의 생육 인자 및 상당량의 무기 영양소를 함유하고 있으면 순도가 낮은 물질도 사용할 수 있고, 반드시 순수한 형태로 사용할 필요는 없다. 원하다면, 배지에 탄산나트륨 또는 탄산칼슘, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨, 마그네슘염, 구리염, 코발트염 등의 무기염을 첨가하여도 좋다. 특히 배양 배지가 현저하게 발포하는 경우에는, 필요에 따라 액상 파라핀, 지방유, 식물유, 광유 또는 실리콘과 같은 소포제를 첨가하여도 좋다.
이 신규 아실라아제를 대량 생산하는 조건으로서는, 심부 호기 배양이 바람직하다. 소량 생산에는 플라스크 또는 병속에서 진탕 배양 또는 표면 배양이 행하여진다. 또한, 대형 탱크내에서 생육을 실시하는 경우에는, 신규 아실라아제의 생산 공정에 있어서의 생육 지연을 피하기 위해서, 미생물의 전배양(前培養)을 이용하여 생산 탱크속에 균을 접종하는 것이 바람직하다. 즉, 비교적 소량의 배양 배지에 미생물의 포자 또는 균사를 접종하고, 그 접종 배지를 배양하여 미생물의 전배양 접종물을 우선 생산하고, 이어서 배양한 그 전배양 접종물을 무균적으로 대형 탱크에 옮기는 것이 바람직하다. 이 전배양 접종물을 생산하는 배지는 신규 아실라아제의 생산에 사용되는 배지와 실질적으로 같아도 좋고, 아니면 달라도 좋다.
배양 혼합물의 교반 및 통기(通氣)는 여러가지 방법으로 행할 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 이것에 준하는 교반 장치를 이용하거나, 발효기를 회전시키거나 또는 진탕하거나, 각종 펌프 장치를 이용하거나, 또는 배지중에 멸균 공기를 통과시킴으로써 행할 수 있다. 통기는 멸균 공기를 발효 혼합물을 통과시키는 것에 의해 행하여도 좋다.
발효는 통상, 온도 범위가 약 20℃∼32℃, 바람직하게는 25℃∼30℃이고, pH가 6∼8인 것이 바람직하며, 약 50∼150 시간 행하여지지만, 발효 조건 및 발효 규모에 따라 적절히 변화시켜도 좋다.
이렇게 하여 생산된 신규 아실라아제는 이미 알려져 있는 다른 생물학적 활성 물질의 회수에 통상 사용되는 관용의 방법으로 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 생산된 신규 아실라아제는 배양 균사속 및 여과액속에서 발견되고, 따라서 신규 아실라아제는 배양 브로스의 여과 또는 원심 분리에 의해 얻어지는 균사 및 여과액으로부터 감압 농축, 동결 건조, 상용의 용매에 의한 추출, pH 조정, 예를 들면 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등의 상용의 수지에 의한 처리, 예를 들면 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등의 상용의 흡착제에 의한 처리, 결정화, 재결정화 등의 관용의 방법에 의해 분리, 정제할 수 있다.
스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주, 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주, 및 스트렙토마이세스 sp. No.6907주에 의해 생산되는 아실라아제에 대하여 구체적으로 설명하기위해서 이하 실시예를 들지만, 본 발명이 그것들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1
스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주가 생산하는 아실라아제의 제조
옥수수 전분 1%, 글루코오스 1%, 낙화생분 0.5%, 대두분 0.5%, 건조 효모 0.5%, 탄산 칼슘 0.2%의 조성으로 이루어지는 종(種)배지 30 ml를 분주(分注)한 100 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주의 경사면 한천 배양물의 1∼2 백금 루프(platinum loop)를 접종하고, 30℃에서 3 일간 진탕 배양하여 종배양물로 하였다.
이어서, 수크로오스 4%, 낙화생분 1%, 건조 효모 1%, 인산 2수소칼륨 0.05%, 인산수소 2칼륨 0.12%, 황산마그네슘 7수화물 0.025%의 조성으로 이루어지는 생산 배지의 pH를 6.5로 조정하고, 이 생산 배지 100 ml를 분주한 500 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 상기 종배양물을 2 ml 접종하고, 30℃에서 3 일간 진탕 배양하여 효소 배양액으로 하였다.
실시예 1-2
스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주가 생산하는 아실라아제의 제조
옥수수 전분 1%, 글루코오스 1%, 낙화생분 0.5%, 대두분 0.5%, 건조 효모 0.5%, 탄산칼슘 0.2%의 조성으로 이루어지는 종배지 30 ml를 분주한 100 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주의 경사면 한천 배양물의 1∼2 백금 루프를 접종하고, 30℃에서 3 일간 진탕 배양하여 종배양물로 하였다.
이어서, 수크로오스 4%, 낙화생분 1%, 건조 효모 1%, 인산 2수소칼륨 0.05%, 인산수소 2칼륨 0.12%, 황산마그네슘 7수화물 0.025%의 조성으로 이루어지는 생산 배지의 pH를 6.5로 조정하고, 이 생산 배지 100 ml를 분주한 500 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 상기 종배양물을 2 ml 접종하고, 30℃에서 3 일간 진탕 배양하여 효소 배양액으로 하였다.
실시예 1-3
스트렙토마이세스 sp. No.6907주가 생산하는 아실라아제의 제조
가용성 전분 6%, 탈지 대두분 4%, 탄산칼슘 0.5%의 조성으로 이루어지는 종배지 30 ml를 분주한 100 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 경사면 한천 배양물의 1∼2 백금 루프를 접종하고, 30℃에서 3 일간 진탕 배양하여 종배양물로 하였다.
이어서, 수크로오스 4%, 낙화생분 1%, 건조 효모 1%, 탄산칼슘 0·5%의 조성으로 이루어지는 생산 배지의 pH를 6.5로 조정하고, 이 생산 배지 100 ml를 분주한 500 ml 삼각 플라스크를 120℃에서 20 분간 멸균하고, 이것에 상기 종배양물을 2 ml 접종하고, 30℃에서 4 일간 진탕 배양하여 효소 배양액으로 하였다.
실시예 1-4
스트렙토마이세스 속에 속하는 보존주가 생산하는 아실라아제의 제조
(재단) 발효 연구소(오사카시 요도카와구 쥬산봉마치 2-17-85)로부터 분양된 하기 스트렙토마이세스 속에 속하는 보존주에 대해서도 실시예 1-1과 동일한 방법에 의해 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주와 같은 효소 배양액을 얻을 수 있었다.
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) subsp. 그리세우스 IFO 13189
이어서, 본 발명의 신규 환상 리포펩티드 아실라아제를 이용한 환상 리포펩티드 항진균성 물질(예를 들면, FR901379 물질 및 그 유사체)의 아실 측쇄의 탈아실화 방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 탈아실화의 실시는 아래와 같이 하여 행할 수 있다.
적당한 생산 배지에 스트렙토마이세스 속에 속하고, 신규 아실라아제를 생산하는 미생물을 접종하여, 약 25℃∼35℃에서 수 일간 진탕 배양하고, 이것을 효소 배양액으로 한다. 이 배양액을 기질로서의 FR901379 물질 등의 환상 리포펩티드 물질에 첨가하고, 45℃∼60℃, pH를 약 6.0∼9로 유지하고, FR179642 물질 등의 환상 펩티드 핵을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 검출하여 분리하였다.
본 발명의 탈아실화법에 대하여 구체적으로 설명하기 위해서 이하 실시예를 들지만, 본 발명이 그것들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 2-1
실시예 1-1에서 얻은 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주의 배양액 700㎕에 FR901379 물질의 수용액(100 mg/ml) 100 ㎕(FR901379 물질로서 10 mg; 8.35 μ㏖), 메탄올 100 ㎕ 및 완충액(0.5M 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액; pH 6.0) 100 ㎕을 가하고, 30℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 4% 아세트산 1 ml를 첨가하여 반응을 종료시키고, 메탄올 2 ml를 가하고, 막(membrane) 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 후, HPLC에 의해 생성한 FR79642 물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다.
HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔(島津) SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(integrator)(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상(固定相)에는 리크로스퍼(LiChrospher) 100RP-18(e)(250 mm×4 mmi.d., 입경 5 ㎛)를 사용하고, 3% 아세토니트릴/ 0.5% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상(移動相)에 의해 1ml/분의 유속으로 FR179642 물질을 용리시켰다. FR179642 물질의 유지 시간은 약 6.3 분이었다. 이 결과에 기초하여 FR179642 물질의 생성량을 계산하면 730 ㎍(0.78 μ㏖)이었다.
실시예 2-2
실시예 1-2에서 얻은 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주의 배양액 700 ㎕에 FR901379 물질의 수용액(100 mg/ml) 100㎕(FR901379 물질로서 10 mg; 8.35 μ㏖), 메탄올 100 ㎕ 및 완충액(0.5M 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액; pH 6.0) 100 ㎕를 가하고, 30℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 4% 아세트산 1 ml를 첨가하여 반응을 종료시키고, 메탄올 2 ml를 가하고, 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 후, HPLC에 의해 생성한 FR179642 물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다.
HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 리크로스퍼 100RP-18(e)(250 mm×4 mmi.d., 입경 5 ㎛)을 사용하고, 3% 아세토니트릴/ 0.5% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 1 ml/분의 유속으로 FR179642 물질을 용리시켰다. FR179642 물질의 유지 시간은 약 6.3 분이었다. 이 결과에 기초하여 FR179642 물질의 생성량을 계산하면 830 ㎍(0.89 μ㏖)이었다.
실시예 2-3
실시예 1-3에서 얻은 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 배양액 700 ㎕에 FR901379 물질의 수용액(100 mg/ml) 100 ㎕(FR901379 물질로서 10 mg; 8.35 μ㏖), 메탄올 100 ㎕ 및 완충액(0.5M 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액; pH6.0) 100 ㎕을 가하고, 30℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 4% 아세트산을 첨가하여 반응을 종료시키고, 메탄올 2 ml를 가하고, 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 후, HPLC에 의해 생성한 FR179642 물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다.
HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 리크로스퍼 100RP-18(e)(250 mm×4 mmi.d., 입경 5 ㎛)을 사용하고, 3% 아세토니트릴/ 0.5% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 1 ml/분의 유속으로 FR179642 물질을 용리시켰다. FR179642 물질의 유지 시간은 약 6.3 분이었다. 이 결과에 기초하여 FR179642 물질의 생성량을 계산하면 560 ㎍(0.60 μ㏖)이었다. 라인웨버-버크(Lineweaver-Burk)법에 의해 결정할 때의 Km 값은 257 μM이고, Vmax는 14.3U/mg(단백질)이었다.
실시예 2-4
실시예 1-3에서 얻은 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 배양액 100 ㎕에 아쿨레아신 A의 디메틸술폭시드 용액(100 mg/ml) 100 ㎕(아쿨레아신 A로서 10 mg; 9.65 μ㏖), 1.2M KCl을 함유하는 500 mM 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액(pH 7.0) 500 ㎕, 물 300 ㎕을 가하고, 40℃에서 15 분간 반응시켰다. 4% 아세트산 l ml로 반응을 정지하고, 메탄올 2 ml를 첨가한 후, 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 다음, HPLC에 의해 생성한 아쿨레아신 A 핵물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다. HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 리크로스퍼 100RP-18(e) (4 mm×250 mmi.d., 입경 5 ㎛(Merck))를 사용하고, 4% 아세토니트릴수/ 1% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 1 ml/분의 유속으로 아쿨레아신 A 핵물질을 용리시켰다. 아쿨레아신 A 핵물질의 유지 시간은 약 8.7 분이었다. 이 결과에 기초하여 아쿨레아신 A 핵물질의 생성량을 계산하면 370 ㎍(0.47 μ㏖)이었다. 라인웨버-버크법에 의해 결정할 때의 Km 값은 279μM이고, Vmax는 16.8U/mg(단백질)이었다.
실시예 2-5
실시예 1-3에서 얻은 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 배양액에 100 ㎕에 에치노칸딘 B의 디메틸술폭시드 용액(100 mg/ml) 100㎕(에치노칸딘 B로서 10 mg; 9.43 μ㏖), 1.2M KCl을 함유하는 500 mM 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액(pH 7.0) 500 ㎕, 물 300 ㎕를 가하고, 40℃에서 15 분간 반응시켰다. 4% 아세트산 1 ml로 반응을 정지하고, 메탄올 2 ml을 첨가한 후, 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 다음, HPLC에 의해 생성한 에치노칸딘 B 핵물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다. HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 리크로스퍼 100RP-18(e)(4 mm×250 mmi.d., 입경 5 ㎛(Merck))를 사용하고, 4% 아세토니트릴수/ 1% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 1 ml/분의 유속으로 에치노칸딘 B 핵물질을 용리시켰다. 에치노칸딘 B 핵물질의 유지 시간은 약 8.7 분이었다. 이 결과에 기초하여 에치노칸딘 B 핵물질의 생성량을 계산하면 90 ㎍(0.11 μ㏖)이었다. 라인웨버-버크법에 의해 결정할 때의 Km 값은 146 μM이고, Vmax는 7.85U/mg(단백질)이었다.
스트렙토마이세스 속에 속하는 본 발명의 신규 아실라아제 생산균이 생산하는 아실라아제에 의한 환상 리포펩티드 항진균성 물질(예를 들면, FR901379 물질)의 아실 측쇄를 탈아실화하는 과정에 있어서의 특징을 이하에 설명한다.
또한, 이들 데이터는 상기 실시예 2-1, 실시예 2-2 또는 실시예 2-3에서 설명한 실험 방법을 이용하여, 완충액의 종류(0.5M 구연산나트륨 완충액, 0.5M 인산 2수소칼륨-인산수소 2나트륨 완충액 및 트리스·염산 완충액을 적절히 조합하여 사용), 반응 온도, 메탄올의 첨가 농도 등을 변경하여 얻은 것이다. 또한, 각각의 아실라아제의 활성은 반응 종료시 FR179642 물질의 농도(HPLC에서 측정)로 나타내고 있다.
반응시의 최적 pH
시험예 1-1 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주가 생산하는 아실라아제의 최적 pH
pH 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
3 0
4 90
5 440
6 630
6.5 710
7 770
8 810
9 740
시험예 1-2 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주가 생산하는 아실라아제의 최적 pH
pH 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
3 0
4 240
5 590
6 810
7 1,070
8 1,300
9 1,270
시험예 1-3 스트렙토마이세스 sp.6907주가 생산하는 아실라아제의 최적 pH
pH 반응종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
3 0
4 190
5 280
6 300
7 470
8 800
9 1,000
이상의 결과는, 본 발명의 실시에 있어서 어느 쪽의 아실라아제에 대해서도 반응은 약산성(pH4 부근) 이상에서 진행하고, pH가 높아질수록 반응 속도는 상승한다는 것을 나타내고 있다.
반응시의 최적 작용 온도
시험예 2-1 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주가 생산하는 아실라아제의 최적 온도
온도(℃) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
25 360
30 630
40 1,490
50 3,120
60 1,110
70 60
시험예 2-2 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주가 생산하는 아실라아제 의 최적 온도
온도(℃) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
25 410
30 770
40 1,760
50 3,160
60 2,110
70 120
시험예 2-3 스트렙토마이세스 sp. No.6907주가 생산하는 아실라아제의 최적 온도
온도(℃) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
25 600
30 710
40 3,010
50 4,620
60 1,660
70 130
이상의 결과는, 본 발명의 실시에 있어서 어느 쪽의 아실라아제에 대해서도 반응시 최적 작용 온도는 40℃ 내지 60℃인 것을 나타내고 있다.
반응시 메탄올 첨가의 효과
시험예 3-1 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주가 생산하는 아실라아제로 반응시킨 경우의 메탄올 효과
메탄올 농도(%) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
0 390
5 570
10 630
15 590
20 550
30 390
40 130
50 10
시험예 3-2 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주가 생산하는 아실라아제로 반응시킨 경우의 메탄올 효과
메탄올 농도(%) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
0 320
5 580
10 770
15 750
20 660
30 360
40 140
50 50
시험예 3-3 스트렙토마이세스 sp. No.6907주가 생산하는 아실라아제로 반응시킨 경우의 메탄올 효과
메탄올 농도(%) 반응 종료 후 FR179642 물질의 농도(㎍/ml)
0 330
5 580
10 710
15 630
20 530
30 140
40 130
50 90
이상의 결과는, 본 발명의 실시에 있어서 어느 쪽의 아실라아제에 대해서도, 5% 내지 20%의 메탄올이 반응액 속에 존재하면 활성은 1.6배 내지 2.2배로 상승한다는 것을 나타내고 있다.
이어서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 아실라아제 생산균을 배양하여 얻은 환상 리포펩티드 아실라아제에 대하여 구체적으로 설명한다.
·스트렙토마이세스 sp. No.6907주 유래의 아실라아제의 특징
1) 작용:
FR901379 및 에치노칸딘 B, 아쿨레아신 A 등의 FR901379 물질 유사체로 대표되는 환상 리포펩티드 물질의 지질 아실 부분의 탈아실화를 촉매한다.
2) 최적 pH: pH8∼9
3) 최적 작용 온도 범위: 50℃ 부근
4) 저해, 활성화 및 안정화:
메탄올: 반응액 중의 함량이 10%까지는 농도 의존적으로 활성화되고, 그 이상은 저해된다.
5) 분자량:
정제한 본 효소를 SDS-PAGE에 걸었더니 2개의 띠로 나누어졌다.
라지 펩티드 ; 61kD
스몰 펩티드 ; 19kD
6) 결정 구조:
정제된 단백질 양이 적고, 결정으로 이루어지지 않았다.
7) 아미노산 분석:
N 말단 아미노산 배열
라지 펩티드 ;
Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly- Leu-Leu-Leu-Gly-···
스몰 펩티드 ;
Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro- His-His-Val-Ala-···
8) 기질 특이성:
FR901379, 에치노칸딘 B 및 아쿨레아신 A에 대해서는 촉매 작용을 가지고 있다. 그러나 FR901469에 대해서는 작용을 가지지 않는다.
본 발명의 아실라아제에 대하여 구체적으로 설명하기 위해서 이하 실시예를 들지만, 본 발명이 그것들에 의해 한정되는 것은 아니다.
아실라아제의 정제:
실시예 3
실시예 1-3에서 얻은 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 배양액을 저온 하에, 1.5M KCl로 교반 추출하고, No.2 여과지로 걸러 얻은 추출 여과액을 UF막(아사히 화성(旭化成) AIP-1010)으로 걸러 탈염(20 mm 트리스-염산 완충액(pH9)으로 치환)하고, HP-20 칼럼에 패스시켰다. 얻어진 패스액을 DEAE-도요펄(Toyopearl) 칼럼(Cl-형)에 통과시키고, 0.3M NaCl을 함유하는 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 9)으로 용출하였다. 활성화분에 (NH4)2SO4를 0.5M 상당량을 첨가하여 용해시키고, 그 액을 페닐-도요펄(Phenyl-Toyopearl) 칼럼에 통과시키고, 0.1M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 8)으로 용출하였다. 얻어진 활성화분을 DF막(아사히화성; SIP-0013)으로 탈염 농축(20 mM 트리스-염산 완충액(pH 9)로 치환)하고, YMC-디올(Diol) 칼럼에 걸러 겔 여과를 행하고(이동상; 0.2M NaCl을 함유하는 0.1M 인산 2수소칼륨-인산수소2나트륨 완충액 pH 7.0), 더욱이 활성화분을 역상계(逆相系)의 코스모실(Cosmosil) 5C4-AR-300 칼럼에 걸러 분별 채취 정제를 행하였다[이동상; (A액) 0.5% 트리플루오로아세트산, (B액) 0.5% 트리플루오로아세트산-80% 아세트니트릴, A:B=60:40→40:60(직선 기울기)]. 이 정제한 아실라아제를 SDS-PAGE에 걸었더니, 2개의 띠로 분리되었다. 이것에 의해 분자량 61kD와 19kD의 2종류의 펩티드를 취득하였다.
기질 특이성:
FR901469 물질은 곰팡이 No.11243주(FERM BP-3373)에 의해 생산되는 항진균 활성을 가진 이미 알려진 물질(WO92/19648호 공보에 기재)로서, 하기 화학식 III으로 표시되는 화합물이다.
본 발명의 신규 아실라아제와 동일한 탈아실 작용을 가지는 악티노플라네스 우타헨시스(Actinoplanes utahensis) 유래의 아실라아제(일본 특허 공개 공보 1992-228072호에 기재)는 상기 화합물 FR901469 물질 또는 그 염에 대하여 촉매 활성을 나타내고, 하기 화학식 Ⅳ으로 표시되는 FR181131 물질(WO96/30399호에 기재)을 생산한다.
이에 대하여, 본 발명의 신규 아실라아제는 상기 화합물 FR901469 물질 또는 그 염에 대하여 촉매 활성을 나타내지 않는다.
이하, 실시예를 든다.
실시예 4-1
악티노플라네스 우타헨시스 IFO 13244를 문헌[J. Antibiotics, Vo1. 41, p. 1085-1092('88)]의 기재에 준하여 배양한 액 20 ml에 FR901469 물질의 수용액(200 mg/ml) 1 ml(FR901469 물질로서 0.2 g; 130 μ㏖), 인산 2나트륨 2.9 g, 물 60 ml를 가하고, 60℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 다음, HPLC에 의해 생성한 FR181131 물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다. HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시마쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 YMC AM303(4 mm×250 mmi.d.입경 5 ㎛)을 사용하고, 12.5% 아세토니트릴수/ 0.5% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 l ml/분의 유속으로 FR181131 물질을 용리시켰다. FR181131 물질의 유지 시간은 약 7.3분 이었다. 이 결과에 기초하여 FR181131 물질의 생성량을 계산하면 80 mg(68 μ㏖)이었다.
실시예 4-2
실시예 1-3에서 얻은 스트렙토마이세스 sp. No.6907주의 배양액 20 ml에 FR901469 물질의 수용액(200 mg/ml) 1 ml(FR901469 물질로서 0.2 g; 130 μ㏖), 인산 2나트륨 2.9 g, 물 60 ml을 가하고, 60℃에서 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 막 필터(0.45 ㎛)로 여과하여 고분자 단백질 등을 제거한 다음, HPLC에 의해 생성한 FR181131 물질을 210 nm에서 모니터하여 아실라아제 활성을 측정하였다. HPLC는 파장 가변 UV 검출기(시마쯔 SPD-10A) 및 펌프(시미쯔 LC-10AD) 및 적분기(시마쯔 C-R6A)로 구성하고, 고정상에는 YMC AM303(4 mm×250 mmi.d. 입경 5 ㎛)을 사용하고, 12.5% 아세토니트릴수/ 0.5% 인산 2수소암모늄으로 이루어지는 이동상에 의해 1 ml/분의 유속으로 FR181131 물질을 용리시켰다. FR181131 물질의 유지 시간은 약 7.3분 이었다. 이 결과에 기초하여 FR181131 물질의 생성량을 계산하면 2 mg(1.7 μ㏖) 이하(검출 한계 이하)이었다.
FR901379 물질을 생산하는 콜레오포마 sp. F-11899주 및 본 발명의 아실라아제를 생산하는 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주, 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주 및 스트렙토마이세스 sp. No.6907주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라키켄 츠쿠바시 하가시 1-1-3)에 기탁되어 있다.
미생물 기탁 번호
콜레오포마 sp. F-11899주 FERM BP-2635
스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주 FERM BP-5808
스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주 FERM BP-5810
스트렙토마이세스 sp. No.6907주 FERM BP-5809
No.11243주 FERM BP-3373

Claims (21)

  1. 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속(屬)에 속하는 균 유래의 환상 리포펩티드 아실라아제.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 I로 표시되는 환상 리포펩티드 물질 또는 그 염의 R1아실기의 탈아실화를 촉매하여, 하기 화학식 II로 표시되는 환상 펩티드 물질 또는 그 염을 생산하는 아실라아제:
    화학식 Ⅰ
    [식 중, R1은 아실기,
    R2는 히드록시기 또는 아실옥시기,
    R3은 수소 또는 히드록시기,
    R4는 수소 또는 히드록시기,
    R5는 수소 또는 히드록시술포닐옥시기, 그리고
    R6은 수소 또는 카르바모일기
    를 의미한다]
    화학식 Ⅱ
    [식 중, R2, R3, R4, R5및 R6은 상기와 동일한 기를 의미한다]
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학식 중에서 R5는 히드록시술포닐옥시기 및 R6은 카르바모일기인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  4. 제1항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  5. 제1항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811주인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  6. 제1항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703주인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  7. 제1항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 sp. No.6907주인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  8. 제1항에 있어서, 하기 성질을 가지는 아실라아제:
    1) 작용:
    FR901379 및 에치노칸딘(Echinocandin) B, 아쿨레아신(Aculeacin) A 등의 FR901379 물질 유사체로 대표되는 제1항의 환상 리포펩티드 물질의 지질 아실 부분의 탈아실화를 촉매함;
    2) 최적 pH: pH 8∼9;
    3) 최적 작용 온도의 범위: 50℃ 부근;
    4) 저해, 활성화 및 안정화:
    메탄올: 반응액 중의 함량이 10%까지는 농도 의존적으로 활성화되고, 그 이 상은 저해됨;
    5) 분자량:
    라지 펩티드 ; 61kD
    스몰 펩티드 ; 19kD
    6) 아미노산 분석:
    N 말단 아미노산 배열
    라지 펩티드;
    Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly- Leu-Leu-Leu-Gly-···
    스몰 펩티드;
    Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro- His-His-Val-Ala-···
    7) 기질 특이성:
    FR901379, 에치노칸딘 B 및 아쿨레아신 A에 대해서는 촉매 작용을 가지고 있지만, FR901469에 대해서는 작용을 가지지 않음.
  9. 제8항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 sp. No.6907주인 것을 특징으로 하는 아실라아제.
  10. 제1항의 아실라아제를 생산하는 스트렙토마이세스 속에 속하는 아실라아제 생산균.
  11. 제1항의 아실라아제를 생산하는 스트렙토마이세스 어눌라투스에 속하는 생산균.
  12. 스트렙토마이세스 어눌라투스(Streptomyces anulatus) No.4811.
  13. 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703.
  14. 스트렙토마이세스 sp. No.6907.
  15. 환상 리포펩티드 물질 또는 그 염을 스트렙토마이세스 속(屬)에 속하는 생산균에 의해 생산되는 아실라아제의 미정제 또는 정제 효소액과 접촉시켜, 지질 아실 부분을 탈아실화시키는 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
  16. 하기 화학식 I로 표시되는 환상 리포펩티드 물질 또는 그 염을, 수성 용매 중에서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 아실라아제 생산균을 배양하여 얻은 아실라아제의 미정제 또는 정제 효소액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 II로 표시되는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
    화학식 Ⅰ
    [식 중, R1은 아실기,
    R2는 히드록시기 또는 아실옥시기,
    R3은 수소 또는 히드록시기,
    R4는 수소 또는 히드록시기,
    R5는 수소 또는 히드록시술포닐옥시기, 그리고
    R6은 수소 또는 카르바모일기를 의미한다]
    화학식 Ⅱ
    [식중, R2, R3, R4, R5및 R6은 상기와 동일한 기를 의미한다]
  17. 제16항에 있어서, 제16항의 식 중, R5는 히드록시술포닐옥시기이고, R6은 카르바모일기인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
  18. 제15항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
  19. 제15항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.4811인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
  20. 제15항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 어눌라투스 No.8703인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
  21. 제15항에 있어서, 아실라아제 생산균이 스트렙토마이세스 sp. No.6907인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 물질 또는 그 염의 제조 방법.
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