KR19990072201A

KR19990072201A - 로타바이러스 항원, 로타바이러스 감염증에 대한백신 및 진단제와 항원 제조방법

Info

Publication number: KR19990072201A
Application number: KR1019980704569A
Authority: KR
Inventors: 오사무 나카고미; 토요코 나카고미; 시게키 무라카미; 타다시 이마가와
Original assignee: 무타이 마사히꼬; 자이단호우징한다이비세이부쯔뵤우겐큐우카이
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-20
Publication date: 1999-09-27
Also published as: US6110724A; PE72699A1; ID20581A; EP0878541A1; CN1209837A; EP0878541A4; WO1998017785A1

Abstract

본 발명은 대량 배양이 곤란한 로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 세포를 배양세포로부터 클로닝하고, 수득한 세포클론주에 로타바이러스를 계대하여 순화시킴에 의해 세포클론 순화 로타바이러스주를 작성하고, 이 순화 로타바이러스주 또는 이를 친주로 사용하여 작성한 리어솔턴트를 시드바이러스로 하여 배양하고, 이 배양물로부터 로타바이러스 항원을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항원의 제조 방법과 이 방법에 따라 수득된 로타바이러 항원, 이 항원을 사용하여 제조한 로타바이러스 감염증 백신 및 진단제를 제공하는 것이다. 이들 항원 백신 및 진단제는 로타바이러스 감염증에 관한 기초 연구 및 임상응용의 각 분야에 큰 기여를 할 수 있는 것이다.

Description

로타바이러스 항원, 로타바이러스 감염증에 대한 백신 및 진단제와 항원 제조방법

로타바이러스는 사람, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 쥐, 닭, 칠면조 등에 하리증(설사)을 일으키는 병원체로 전세계에 널리 분포되어 있다. 특히, 사람에게 로타바이러스 감염증은 유아구토하리증, 동계유아하리증, 백색변하리증, 소아가성콜레라등으로 주목되고 있다. 그의 예방 및 진단이 전세계적 규모로 강력하게 소망되고 있다.

이하에 로타바이러스에 대해 자세히 기술한다.

형태와 게놈(genome)구조:

국제바이러스분류위원회의 제 6차 보고에 의하면, 이 바이러스는 레오바이러스(Reoviridae)과에 속하고 엔벨롭(envelop)을 가지지 않는 내·외 2중(그 중간층을 포함하여 합계 3층)의 캡시드(capsid)구조로 구성된 직경 약 70㎚의 정 20면체로 되고, 내부 캡시드의 중심부에 직경 약 50㎚의 코어(core)를 가진다. 이 코어 내부에는 게놈이 존재하고, 이 게놈은 11분절의 2중 나선RNA(linear double-stranded RNA)로 구성되고, 이들 게놈 분절의 크기는 0.6 내지 3.3kbp 범위이다{"바이러스 분류학(virus taxonomy); 국제바이러스분류위원회의 제 6차 보고", 어치브 오브 바이로로지(Archives of Virology), 서플먼트(Supplement) 10, pp. 219-222, 1995}.

유전자형과 혈청형:

상기의 11게놈 분절 중에서 특히 제 4게놈 분절과 제 9게놈 분절(어떤 균주에서는 제 7 또는 제 8게놈 분절에 상응)이 백신 및 진단제의 개발에 주목을 끌고 있다. 한편, 세계 각지에서 분리된 로타바이러스 균주는 A에서 F까지의 6개군(serogroups)으로 분류되고, 각군은 각종의 혈청형(serotypes)으로 분류되고 편의를 위해, 추가적으로 로타바이러스는 유전자형(genotypes)에 의존하여 대별된다. 이들 분리된 균주는 항원성과 유전자형이 다양하다{"필드 바이로로지(Fields Virology)", 3rd ed., vol·12, pp. 1625-1629, 비.엔.필드(B. N. Fields et al.)편 등., 립핀콧-라벤 퍼블리셔(Lippincott-Raven Publishers), 1996, USA.} 이하에 이점에 대해 상술한다.

제 4게놈 분절은 바이러스입자의 표면에 스파이크(spike) 상으로 노출된 구조단백질 VP4를 코드(code)화 하고, 그 VP4의 기능은 혈구응집소, 중화항원, 프로테아제(protease)에 의해 촉진된 감염성, 병원성, 막융합, 세포로의 부착 등을 포함한다고 보고되거나 추정되어진다. 로타바이러스 균주는 이 VP4의 아미노산 배열과 그 유전자 RNA 혹른 cDNA와 상동성에 기하여 현재 20 유전자형(이하 "P 유전자형"이라함)으로 분류되고, 중화시험에 기하여 10 또는 14 혈청형(이하 "P 혈청형"이라함)으로 각각 분류된다.

제 9게놈 분절(어떤 균주에서는 제 7 또는 제 8게놈 분절)은 바이러스입자의 외측 캡시드 VP7을 코드화하고, 그 VP7의 기능은 중화항원 에피토프(epitope)와 2개의 소수성영역 등이 보유하는 것으로 보고되거나 추정된다. 로타바이러스 균주는 이 VP7의 중화시험에 기하여 14 혈청형(이하 "G 혈청형"이라함)으로 분류되어 있다.

로타바이러스 균주의 분류:

이전에 보고된 다수의 다양한 분리균주("필드 바이로로지" 3rd ed., vol. 2, p. 1627)중에서 상기 A군에 속하는 전형적인 사람 로타바이러스 대표균주와 본 발명자들이 분리하여 보고한 다음의 균주 즉, AU-1{져널 오브 클리닉컬 마이크로바이올로지(Jounal of Clinical Microbiology), 25, 1159-1164, 1987)}; AU 32(마이크로바이올로지 엔드 임뮤놀로지(Microbiology and Immunology), 34, 77-82, 19903}; AU64{어치브 오브 바이로로지(Archives of Virology), 19, 67-81, 1991)의 분류의 개요를 표 1에 예시하였다.

표 1

균주명	G혈청형 P혈청형 [유전자형]
WaDS-1PAU-1HochiST3AU32AU64	G1P1A[8]G2P1B[4]G3P1A[8]G3P3 [9]G4P1A[8]G4P2A[6]G9P1A[8]G1P1B[4]

혈청형의 검출빈도:

세계 각지의 로타바이러스의 G 혈청형의 검출빈도에 관하여 약 20의 연구보고에 따르면 G1형이 일본, 유럽국가, 오스트리아 및 중앙 아프리카 등에서 약 60내지 85%를 점하여 주류를 이루고, 잔여부분은 주로 G2형과 G3형이 점하고 있다. 반면, 인도, 태국, 방글라데시, 멕시코 등에서는 G1, G2, G3 및 G4가 산발적으로 검출되고, 전체에서 이들의 비율은 약 20 내지 80%이고, 이들형 이외에 다른형의 산재 또한 현저하게 관찰된다.

바이러스의 배양:

원숭이와 가축으로부터 분리된 로타바이러스는 통상 배양세포에서 비교적 용이하게 증식되기 때문에 그 배양 또는 계대배양은 반드시 곤란하지는 않다. 그러나, 소위 사람 로타바이러스의 세포배양에 의한 배양은 바이러스항원이 생산되어도 감염성 바이러스입자는 연속으로 계대하여 얻을 수 없는 불발감염(abortive infection)이 일어나고 따라서 계대배양이 극히 곤란하다. 그래서, 저증식능 사람 로타바이러스와 원숭이나 소 등의 고증식능 로타바이러스와의 사이에서 리어솔턴트(reassortant)를 작성하고, 사람 로타바이러스의 증식능의 향상을 도모하거나 또는 트립신(trypsin)으로 전처리한 사람 로타바이러스를 원숭이 유래의 세포 균주 MA104(ECACC No. 85102918)과 AGMK(African Green Monkey Kidney) 세포에서 배양한 후 트립신을 첨가 혼합한 유지 배지를 사용하여 회전배양에 로타바이러스를 접종하는 연구가 시도되었다. 현재에는 후자의 회전배양에 의해 주로 A군에 속하는 사람 로타바이러스의 실험실 내에의 직접배양 또는 분리가 가능하다. 그러나, 상기 이러한 회전배양에 있어서도 백신 및 진단제의 제조에 필요한 양의 바이러스항원을 회수할 수 없다. 더욱이, 현재 A군 이외의 로타바이러스의 배양 또는 계대배양은 매우 곤란한 상태이다.

바이러스 배양의 숙주:

로타바이러스의 증식을 허용하는 감수성 새포배양으로서는 상기 MA104와 GMK세포 이외에 FBK(Fetal Bovine Kidney), CMK(Cercopithecus Monkey Kidney), MK(Crab-eating Macaque Kidney) 등의 각 세포 또는 원숭이 유래의 CV-1, FRh L2, BSC-1, Vero, 개 유래의 MDCK, 사람 소장상피 유래의 CaCo-2 등의 각 세포주가 알려져 있다(WO 92/01784 일본특개평06-328107, "필드 비로로지", 3rd ed., vol.2, pp. 1647-1648, pp. 1661-1662). 더욱이, 백신의 제조를 목적으로 한 로타바이러스 항원의 양산에서는 다른 바이러스 백신의 제조에 사용되고 있는 Vero, DBS-FLC-1, DBS-

FLC-2, DBS-FRh L2, ESK-4, HEL, IMR-90, MRC-5, MRC-9, WI-38 및 WRL 68 등의 세포주가 이용될 수 있다("ATCC Microbes & Cells at work", 2nd ed., p. 144 American Type Culture Collection 1991, USA).

백신:

사람 로타바이러스 감염증에 대한 각종 백신은 1985년경부터 개발이 시도되어 왔다. 그 주류는 천연두 백신과 동일하게 항원성이 유사한 비인간 유래의 희석된 바이러스를 백신으로 대용하는 소위 제너방식(Jenerian Approach)에 의한 생백신(live vaccine)의 개발이다. 예컨데, 소 또는 원숭이 유래의 희석 바이러스 또는 사람과 소 양자로부터 또는 사람과 원숭이 양자로부터 각각 유래된 바이러스 2 균주간에 희석 리어솔턴트등을 사용한 생백신의 임상시험이 알려져 있다.(WO92/01784; EPO 130906; 일본특개평 06-328107; "Modern Vaccinology", pp. 213-229, E.Kurstak편, Plenum Medical Book Company 1994, USA; "Vaccines", 2nd ed., pp. 809-822, S. A. Plotolokin and E. A. Mortimer편, W. B. Saundors company 1994, USA; "The Jordan Report-Accelerated Development of Vaccines 1996", p. 46과 p. 68, National Institute of Health 발행, USA). 그렇지만, 이들 생백신 또는 그의 경구 투여에 관한 임상시험테이터가 축적됨에 따라 예방효과가 충분하지 않다는 판단이 강하게 나타났고, 따라서 현재에는 상기 제너방식과 다른 착상에 기한 백신의 제조가 모색되어지고 있다.

진단제:

폴리크로날(poly clonal) 또는 모노크로날 항체를 사용한 항원검출이 주류를 이루는데, 예컨데 EIA(Enzyme Immunoassay)내지 ELISA(Enzyme-linked Immunosorent Assay), 라텍스응집법, 수신적혈구응집반응 등의 키트(Kit)가 시판되고 있다. 한편, PAGE-SS(polyacrylamide gel electrophoresis with silver stain)과 PCR(polymerase chain reaction) 등의 수단에 의한 유전자 레벨(level)의 진단방법이 개발되고 있다("Principles and Practice of Infectious Diseases", 4th ed., vol.2, pp. 1450-1451, G. L. Mandell편 등, Churchill Livingstone 1995, USA). 그러나, 바이러스항원을 사용하여 항체검출하는 진단제는 아직 유포되지 않았기 때문에 환자에 있어 각종 항체의 잠정적 변화에 대한 데이터는 로타바이러스 감염증의 해명 및 예방과 치료의 대책에 극히 유용함에도 불구하고 여전히 충분치 않다.

본 발명은 상술한 바와 같이 사람 로타바이러스에 관한 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명의 목적은 세포배양에 관한 로타바이러스 항원의 양산이 곤란한 현상을 극복하고, 로타바이러스 감염증 백신 및 진단제의 제조에 필요한 로타바이러스 항원의 다량 제조법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 수득된 항원, 그 항원을 이용하여 제조한 로타바이러스 감염증 백신 및 진단제를 제공하는 것이다.

발명의 개시:

본 출원은 상기의 과제를 해결하기 위해 이하의 발명을 제공한다.

즉, 본 발명의 제 1측면은 로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 세포를 배양세포로부터 클로닝(cloning)하고, 수득된 세포클론주(cloned cell strain)에 로타바이러스를 계대하여 순화(馴化)시킨 세포클론 순화 로타바이러스주를 작성하고, 이 순화 로타바이러스주 또는 이를 친주로 사용하여 작성한 리어솔턴트를 시드(Seed)바이러스로 배양하고, 이 시드바이러스의 배양배지로부터 로타바이러스 항원을 분리 정제함을 특징으로 로타바이러스 항원의 제조방법이다.

본 발명의 제 1측면의 양호한 실시형태는 배양세포가 Vero세포(ATCC CCL 81) 인 것이다.

또한, 본 발명의 제 1측면의 또다른 양호한 실시형태는 세포클론주가 Vero CL-9(FERM BP-6028)인 것이다.

게다가, 본 발명의 제 1측면의 또다른 양호한 실시형태는 로타바이러스가 사람 로타바이러스주 AU32n 및 또는 AU64n인 것이다.

본 발명의 제 2측면은 상기한 방법에 의해 얻어진 로타바이러스 항원이다.

본 발명의 제 3측면은 상기한 본 발명의 제 2측면의 로타바이러스 항원을 불활화제로 불활화하여 제조된 불활화 항원이다.

본 발명의 제 4측면은 상기한 본 발명의 제 2측면의 로타바이러스 항원 또는 제 3측면의 불활화 항원을 면역감응을 일으키는 양만큼 함유하는 로타바이러스 감염증 백신이다.

본 발명의 제 5측면은 상기 본 발명의 제 2측면의 로타바이러스 항원 또는 제 3측면의 불활화 항원이고, 혈청형 또는 유전자형이 상호 다른 2종 이상의 항원을 각각 면역감응에 요구되는 양으로 포함하는 혼합 다가로타바이러스 감염증 백신 이다.

본 발명의 제 6측면은 상기한 본 발명의 제 2측면의 로타바이러스 항원 또는 제 3측면의 불활화 항원을 항원-항체 반응에 필요한 양을 포함하는 진단제이다.

본 발명의 제 7측면은 세포클론주 Vero CL-9(FERM BP-6028) 이다.

본 발명의 제 8측면은 세포클론 순화 사람 로타바이러스주 AU32n 이다.

본 발명의 제 9측면은 세포클론 순화 사람 로타바이러스주 AU64n 이다.

이 출원에서, "세포클론주"는 단일세포의 자손만으로 구성된 클론의 배양세포를 의미한다.

"순화(adaptation)"란 바이러스 배양에 사용한 세포의 종류와 온도등이 일정한 조건하에서 바이러스의 양산이 가능하도록 하기 위해 바이러스 증식능의 변이 또는 선택을 도모하여 그의 증식능을 합목적화하는 것을 의미한다. 예로서, 어떤 세포에 순화시킨 바이러스는 그 세포내에서 잘 증식하고, 또 저온 순화 바이러스는 저온에서 잘 증식한다.

"감수성(permissive)"이란 바이러스의 증식을 허용하는 세포의 성질 "permissive"를 의미한다. 예로서, "로타바이러스 감수성 세포"란 로타바이러스가 그 세포내에서 증식 또는 배양 될 수 있다는 것을 의미한다.

"세포클론 순화 바이러스주"란 세포클론주에 계대배양하여 순화시킨 바이러스를 의미한다.

기타 용어는 이하의 발명을 실시하는 최선의 형태의 기술에서 명백하게 된다.

발명을 실시하는 최선의 형태:

이 출원의 각 발명은 이하의 제 1 내지 제 4 공정을 순차로 행함에 의해 실시되어 진다.

제 1공정 : 세포배양으로부터 로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 세포 즉, 고도 감수성 세포를 클로닝 한다.

제 2공정 : 앞 공정에서 수득된 세포클론주에 로타바이러스를 계대배양하고, 순화시킨 세포클론 순화 로타바이러스주 즉, 세포클론주에서 극히 왕성 또는 고도로 증식하는 순화 로타바이러스주를 작성한다. 필요에따라, 이 순화 로타바이러스주를 친주로 사용하여 리어솔턴트를 작성한다. 게다가, 제 1공정에서 사용한 로타바이러스는 제 2공정에서 배양한 로타바이러스와 같을 필요는 없다.

제 3공정 : 앞 공정에서 얻은 순화주 또는 리어솔턴트를 시드바이러스로 하고, 이 시드바이러스를 대량 배양함에 의해 로타바이러스 항원 즉, 로타바이러스의 완전입자, 불완전입자, 항원성단백질, 게놈, 유전자 등을 양산한다.

제 4공정 : 앞 공정에서 수득된 완전입자, 불완전입자, 항원성단백질, 게놈, 유전자 등을 정제, 가공 내지는 수식함에 의해 백신, 진단제, 시약 등을 조제·제조한다.

상기의 공정순에 의해 이하에 순서대로 설명한다.

제 1공정에서 이용된 배양세포:

로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 세포를 클로닝하기 위해 대상 배양세포로서는 먼저, 배경기술로 "바이러스 배양의 숙주"의 란에 기재된 각종의 세포 또는 세포주를 이용할 수 있다. 게다가, 사용할 때에는 이들중 위해성 오염인자와 암유전자의 존재가 부정된 배양세포 예컨데, vero세포(ATCC CCL 81)의 사용이 바람직하다.

제 2공정에 이용된 로타바이러스:

앞 공정에서 수득한 세포클론주를 계대하고 순화시킨 로타바이러스로서는 상기 문헌("Fields Virology", 3rd ed., vol.2, p. 1627, Archives of Virology, 19, 67-81, 1991, 등)에 기재된 분리주 또는 임의의 로타바이러스주를 이용할 수 있다. 특히, 세포배양에서 계대가 곤란한 주 또는 항원생산량의 증수가 기대되는 바이러스주를 적용함이 좋다. 예로서, AU-1, AU 32 및 AU 64 등의 공지 주와 본 발명에 따라 제공되어진 백신제조용 바이러스주로서 적정 계대역으로 신규 사람 로타바이러스주 AU32n 및 AU64n 등이 양호하다.

세포배양 배지와 바이러스증식 배지:

공지되고 시판되는 배지 예컨데, 199배지, MEM(Eagle's Minimum Essential Medium)배지 BEM(Eagle's Basal Medium)배지, Hanks액 및 Dulbecco's의 인산완충액(PBS) 등을 사용할 수 있다. 이들의 조성과 조제법은 바이러스 실험, 세포배양, 조직배양 등에 관한 상용 텍스트("Cells & Tissue Culture; Laboratory Proceduress", 2 volumes in total, edited by A. Doyle et al., John Wiley & Sons 1993, USA) 및 시판 제품 카달로그에 상술 되어 있다. 또한, 이러한 배지와 염류용액은 보조제 내지는 첨가제를 첨가 혼합하여 수식 할 수 있다. 첨가제로서는 상용의 물질, 예로서 시판의 사람혈청, 송아지 태아혈청(FCS; Fetal calf serum), 항생물질, 탄산수소나트륨용액, 염화나트륨, 비필수아미노산 등에서 적의 선택하고 적정량 사용 할 수 있다. 예로, 배지 1ℓ당 첨가 혼합하는 첨가제의 최종 농도는 혈청류는 약 3∼25%(V/V), 탄산수소나트륨은 1∼6g, 염화나트륨은 약 0.1∼0.25몰, 또 비필수아미노산은 제품 카달로그에 기재된 표준량이 소망스럽다. 특히, 로타바이러스 증식 배지에는 프로테아제 혹은 트립신 등을 첨가 혼합하는 것이 바람직하다고 알려져 있다. 게다가, 로타바이러스 증식 배지중의 트립신의 최종 농도는 약 0.1∼10㎍/㎖ 이다.

세포배양과 세포 클로닝:

세포주를 계속 증식하지않을시는, 계대는 통상 세포배양 배지에서 약 1X10⁵∼4X10⁵세포/㎖의 세포부유액을 조제하고, 이 부유액을 배지용기 용적의 약 1/10∼1/5로 심어넣고, 예로서 100㎖ 용기에 약 10∼20㎖를 심어넣고 약 37℃에서 배양한다. 또한, 용기내의 저면상에 모노시트(monosheet)를 형성한 세포를 배양용기 면으로부터 박리하고 세포를 분산시키기에는, 통상 Ca 및 Mg 이온을 제거한 PBS로 제조된 최종 농도 약 0.25%(W/V) 트립신액을 이용한다.

세포의 클로닝은 통상적인 방법("Cells & Tissue Culture; Laboratory Procedures", vol.1, pp. 4B:3, supra.)을 따라 행할 수 있다. 예로서, 배양세포 모노시트를 트립신액에서 박리한 후, 세포배양 배지에 분산시켜 유리 단일세포의 부유액(약 1∼5세포/㎖)를 조제한 후, 이를 배양용기 예컨데 페트리디쉬 또는 마이크로테스트 플레이트등에 부유액을 접종하여 배양함에 의해 단일세포의 자손만으로 된 클론을 조제하는 방법(콜로니 형성법)에 의해 만족스럽게 수행될 수 있다. 수득된 콜로니는 개별로 배양되어 세포수를 증가시키면 클론화세포 또는 세포클론주가 얻어진다.

바이러스의 배양과 계대 및 순화:

세포배양을 숙주로 하는 바이러스 배양의 온도는 통상 약 20∼37℃이고 배양일수는 약 2∼16일 이다. 정치배양 또는 회전배양이 사용된다. 배양후의 배양액 상등액은 바이러스 부유액으로 바이러스계대에 제공된다. 바이러스계대는 바이러스 부유액을 순차로 새로이 배양한 세포에 접종하여 바이러스를 증식시킴에 의해 행해진다. 이 바이러스계대를 특정세포에서 약 2∼50회, 좋기로는 약 3 내지 20회 반복하여 행함에 의해 그 세포에서 매우 높게 증식하는 특정세포 순화바이러스주가 얻어진다. 또한 순화 바이러스주를 친주로 사용하여 다른 바이러스주와의 사이에 리어솔턴트를 작성함에 의해 순화바이러스주의 고도증식능을 다른 바이러스주로 이입할 수 있다. 예로서, 자외선(UV 파장 280㎚)을 조사하여 감염성을 실활시킨 로타바이러스주와 상기 순화 바이러스주(친주)와를 혼합 배양시키고, 양 바이러스주의 게놈 분절의 리어솔트먼트(reassortment)를 유도시킨후, 항 친주중화항체로 친주 바이러스를 실활시켜 제거함에 의해 살아있는 잔여 감염성 바이러스가 리어솔턴트로 얻어진다.

로타바이러스에 대한 고도 감수성세포 바이러스주의 선별:

각 세포클론에 로타바이러스를 접종하여 배양하고, 바이러스 증식을 통해 생산된 감염바이러스의 수, 바이러스입자 수 또는 바이러스 항원량을 측정한다. 이 경우 MOI(multiplicity of infection)의 차이에 따른 증식의 정도, 소위 바이러스 접종량의 차이에 따른 바이러스 생산량의 고저를 후술하는 방법에 의해 측정하는 것이 매우 중요하다. 이러한 측정치를 지표로하여 바이러스가 고도로 증식하는 세포클론을 스크리닝(screening)함에 의해 고도 감수성 세포클론주를 얻을 수 있다. 상기의 측정은 예컨데 플랙형성법(PFU; plaque forming unit의 계수), 포커스형성법(FFU; focus forming unit의 계수), ELISA, IME(immune electron microscopy) 등에 의해 행할 수 있다. 여기서, FFU의 계수는 바이러스의 감염·증식에 기인하여 형성된 감염세포 영역을 형광색소 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표시한 항체에서 염색하는 형광항체법, EIA(enzyme immunoassay) 등에 의해 행해질 수 있다.

바이러스와 그 항원의 양산 및 조제:

고도 감수성 세포클론주의 세포배양을 숙주로 사용하고 이 세포주에 순화된 바이러스주를 배양함에 의해 바이러스 및 그 항원을 양산한다. 구체적으로는, 배양 종료후, 예컨데 바이러스배양액을 저속원심분리한 상등액(예를들어, 드라이아이스를 유기용매로 동결 융해한 바이러스 감염세포의 부유액을 저속원심분리한 상등액등)을 채취함에 의하여 완전 바이러스입자와 그의 항원을 조제할 수 있다. 이렇한 조제물은 바이러스 부유액을 그대로 사용할 수도 있다. 이 부유액은 막여과법으로 균을 제거할 수 있고, 항생물질을 첨가할 수 있다. 또한, 이러한 부유액 액중 의 바이러스 항원은 막농축법, 밀도경사 초원심법, 자당용액층을 쿠션으로하여 그 위에 바이러스부유액을 얹어 초원심으로 분리하여 바이러스항원을 원심관의 저부에 침강시킨후 그 침강물을 재부유액으로하여 정제 바이러스항원을 조제할 수 있다.

백신원액의 조제:

상기 바이러스 부유액 또는 정제 바이러스항원을 사용하여 백신원액을 조제할 수 있다. 백신용 항원으로 바이러스 부유액중의 완전 바이러스입자, 불완전 바이러스입자, 비리온(virion)구조 단백질 예로 VP4, VP7, 중화반응 에피톱영역, 구조단백질의 번역후 수식체등, 또는 비리온 비구조단백질과 그의 번역후 수식체, 감염방어항원 등을 사용할 수 있다. 이러한 백신용항원은 통상의 불활화제로 고정화하여 입체구조를 안정화 할 수 있다. 불활성화제로는 예를들어, 포르말린, 페놀, 글루타르디알데하이드, β-프로피오락톤 등을 백신원액의 조제 전 또는 후에 첨가하여 사용할 수 있다. 포르말린을 사용하는 경우 그 첨가량은 약 0.005∼0.5%(V/V)이고, 불활화 온도는 약 2∼38℃이며 불활화 시간은 약 5∼180일 이다. 그러나, 이러한 불활화를 통해 항원성이 손상되는 경우에는 불활화 조건을 완화하는 유효한 수단, 예를들어 불활화제의 감량, 중성아미노산 또는 염기성아미노산 등의 첨가, 불활화 온도의 저하등이 필요하다. 또한, 불활화 공정에서 잔존하는 유리 포름알데히드는 필요에 따라 등량의 아황산수소나트륨을 첨가하여 중화하거나 투석을 통해 제거 할 수 있다. 이상에서 얻은 조제물은 백신원액으로서 다음공정에 제공된다.

백신의 조제:

상기의 백신 원액을 예컨데 배지 BME에서 희석하고, 백신중의 항원량이 항체 생산에 필요한 량이 되도록 조정 한다.

이때 백신의 내열성을 증강하는 안정화제 또는 면역원성을 높이는 보조제로서 아쥬반트(adjuvant)를 첨가 혼합할 수 있다. 예를들어, 안정화제로서는 당류와 아미노산류가 사용될 수 있고, 아쥬반트로서는 광물유(mineral oil), 식물유(vegetable oil), 명반(alum), 인산알루미늄, 벤토나이트(bentonite), 실리카, 뮤라밀 디펩티드 유도체(muramyl dipeptide derivatives), 사이모신(thymosin), 인터류킨(interleukin)등이 사용될 수 있다.

또한, 점막면역 혹은 국소면역의 유도를 목적으로 하여, 백신원액중의 바이러스 항원을 가공하거나 또는 수식할 수 있다. 이 유도를 위하여 예를들어 리포솜(liposome), 에멀젼, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 폴리젖산 및 폴리글리콜산 등을 사용한 DDS(druy delivery system)에 관한 기술이 적용될 수 있다.

다음, 상기 백신용액을 적당한 용적, 예를들어 약 1∼20㎖의 바이알(vial)에 분주하고 막아 밀봉한 후, 백신으로서 사용에 제공된다. 이 백신은 액상으로 될 뿐만 아니라 분주후 동결건조를 행하여 건조제제로서 사용에 제공될 수 있다. 또한, 경구투여를 목적으로 백신원액을 예를들어 시럽 또는 캔디로 가공할 수도 있다.

한편, 조제된 백신제제는 사용에 제공되기 전, 즉, 그 제조공정동안 및 소부분품으로 분주단계에 있어서 품질을 보증하기 위해 안전성과 유효성에 대해 검정을 행하여 백신으로서 적정성을 확인할 필요가 있다. 이러한 검정은 본 발명의 로타바이러스 백신과 유사한 제제에 관한 기준, 예를들어 일본약사법(법률제145호, 1960년) 및 1960년 후생성고시 제315호 및 1961년 후생성고시 제337호 개정에 기한 「생물학적 제제기준」에 정한 「불활화급성회백수염백신기준」의 규정, 상기 약사법 및 1993년 후생성고시 제217호에 기한 「생물학적 제제기준」에 정한 「일본뇌염백신」 및 「건조일본뇌염백신」의 양규정 또는 상기 약사법 및 1994년 후생성고시 제332호에 기한 「생물학적 제제기준」에 정한 「건조조직배양불활화 A형간염백신」의 규정 등에 준거하여 행해질 수 있다.

백신의 용법:

백신접종은 예를들어 1회분 약 0.25∼0.5㎖를 피하접종하거나, 1회분 약 1.0㎖를 경구투여하거나, 약 0.05㎖를 구강내에 주입하는 등에 의해 행해질 수 있다. 더욱이 이러한 접종은 약 2∼4주 간격으로 1∼3회정도 행함이 좋다. 그러나, 백신의 용법을 상기한 예로 한정하는 것은 아니다.

진단제의 제조:

상기한 바와 동일한 형태로 바이러스 부유액, 정제항원 등을 조제하고, 이들을 진단용 항원{예를들어, 침강반응, 응집반응, 중화반응, 형광항체법, 효소면역측정법, 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay) 등의 항원}으로 제공할 수 있다. 또한, 진단용 항원 또는 백신원액을 동물(예를들어, 토끼, 모르모토, 마우스등)의 복강내, 피하, 근육내 등에 접종하고, 이 동물의 혈청으로부터 항체를 작성할 수 있다. 이 항체는 예컨데 상기 각종 진단법으로의 항원 검출용으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 진단용의 항원 및 항체는 사용에 앞서 진단제중의 함량이 항원-항체반응을 발생하기에 필요한 양으로 희석조정하여 사용에 제공한다. 더욱이, 본 발명에 관한 로타바이러스의 게놈 및 유전자(cDNA)단편은 예를들어 유전자 진단용 프로브(probe) 시약 및 동정시약으로 제공된다.

이하 실시예에서 본 발명을 보다 자세히 설명하지만 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 세포배양에 의해 양산이 곤란한 로타바이러스(Rotavirus) 항원, 로타바이러스 감염증에 대한 백신 및 진단제와 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 본 발명은 로타바이러스 감염증의 예방과 진단에 유용한 진단제와 백신 및 그의 유효성분으로서 로타바이러스 항원에 관한 것이다. 본 발명은 특히 사람에 있어 로타바이러스 감염증의 예방과 진단에 기여하는 것이다.

실시예 1

(1) 세포의 클로닝

세포배양배지로서 최종농도 9%(v/v)의 FCS(Gibco사제·미국)를 첨가 혼합한 MEM을 사용하여 배양면적 25㎠의 용기내에 베로(Vero)세포(ATCC CCL81)를 37℃에서 배양하고 모노시트를 형성시켰다. 이 모노시트를 0.25%(w/v) 트립신(트립신 1:250 ; Difco사제·미국)액으로 배양용기면으로부터 박리하고, 세포를 분산시켜 유리 단일세포로 한 후, 저속원심(1500rpm, 5분)으로 세포를 모아 상기 배양배지내에서 세포수 2세포/㎖로 유리 단일세포의 부유액을 조정했다. 이 부유액을 세포배양용 96웰(96well)의 마이크로테스트 플레이드(Falcon MicrotestⅢ Plate ; Becton Dickinson사제·미국)의 각 웰에 0.2㎖씩 접종한 후, 탄산가스(co₂) 배양기내에서 37℃로 14일간 배양하여 각 웰면에 단일세포의 자손만으로 구성된 콜로니를 형성시켰다. 이들 각 콜로니의 세포를 순차로 보다 큰 배양용기내에서 3회 계대하여 세포수를 증가시켜 합계 40의 각 베로세포클론의 세포부유액을 수득했다.

(2) 로타바이러스 감수성 세포클론주의 스크리닝

상기 (1)에서 얻은 합계 40의 각 세포클론마다에 로타바이러스를 배양·증식시켜 각 배양상등액내에 로타바이러스 항원량을 ELISA에 의해 측정하고, 클로닝전의 베로세포에 비해 현저하게 높은 항원가를 가진 세포클론주를 이하의 a) 내지 c)로 검출한다.

a) 각 세포클론에서 바이러스 배양

상기 각 세포클론마다 상기 마이크로테스트 플레이트(96 웰 ; 횡방향 8웰 × 종방향 12웰)의 횡열 8웰에 할당하여 합계 40의 각 클론의 세포부유액을 각각 0.2㎖/웰로 접종하여 37℃에서 배양하고, 각 클론의 모노시트를 형성시킨후, 각 웰의 배양액을 혈청무첨가의 신선한 MEM과 교환하여 하루밤동안 배양한다. 이어서, 각 웰내의 세포에 후술하는 바이러스 증식배지(트립신 최종농도가 20㎍/㎖로 된 것)에서 37℃로 20분간 트립신처리로 활성화한 로타바이러스 AU64주를 0.05㎖/웰 접종하고, 37℃에서 30분간 정치하여 세포에 바이러스를 흡착시킨 후, 바이러스 증식배지로서 최종농도 0.5㎍/㎖의 트립신(트립신타잎 IX : Sigma사제, 미국)을 가한 MEM을 0.2㎖/웰 첨가하고, 37℃에서 7일간 바이러스를 배양하여 증식시켰다. 배양종료후, 각 웰내의 배양액은 바이러스 부유액(검체)으로하여 후술하는 바이러스 항원량의 측정에 제공했다. 여기서 비교대조로서 클로닝전의 상기 베로세포가 사용되었다.

b) 바이러스 항원량의 측정(일차 스크리닝)

pH 9.6의 50mM 탄산완충액에서 A군 로타바이러스에 대한 항체(모르모트 과면역혈청으로부터 정제한 IgG)를 희석하고, 농도 1.0㎍/㎖의 항체액을 조제했다. 이 항체액을 ELISA용 96웰의 테스트 플레이트(ELISA-PLATE;Greiner사제·독일)에 0.1㎖/웰 첨가하고 4℃에서 하루밤 정치하여 항체를 웰표면에 흡착시켰다. 흡착후, 세정액{최종농도 0.05%(w/v)의 트윈(tween) 20함유 PBS}으로 각 웰을 세정했다. 한편, 상술한 각 바이러스 부유액을 항원희석액{블록 에이스(Block Ace; 雪印乳業社製)를 탈이온수로 10배 희석}으로 5배 희석하여 조제한 각 검체를 상기 각 웰에 0.1㎖ 첨가하고, 25℃에서 90분간 일차반응시켰다. 이어서, 상기 세정액으로 웰을 세정한 후, 상기 항원희석액으로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 항로타바이러스 염소항체(peroxidase-laleled antirotavirus goat antibody; Viro stat사제, 미국)를 0.1㎖/웰 가하여 다시 25℃에서 90분간 2차반응시켰다. 이어서, 각 웰을 상기 세정액으로 세정한 후, 기질용액{최종농도 0.4㎎/㎖의 0-페닐렌디아민(和光純藥社製) 및 35%(v/v)의 과산화수소액(和光純藥社製)함유 0.5M 구연산-인산완충액(pH5.0)}을 0.1㎖/웰 첨가하고, 실온에서 10분간 퍼옥시다아제로 발색반응시켜 4N황산을 0.05㎖/웰 추가하여 반응을 정지시켰다. 반응정지후, 파장 490nm의 단색광으로 각 웰의 흡광도(OD)를 계측했다. 이상의 일차 스크리닝의 결과 비교대조의 OD에 비하여 5배 이상의 OD를 나타내는 6개의 검체를 세포클론주의 후보로 선정하여 후술하는 2차 스크리닝에 제공했다.

C) 바이러스 항원량의 측정(2차 스크리닝)

상기 (1)과 동일한 방법으로 상기 후보 6주의 각 세포클론을 마이크로테스트 플레이트에서 배양함과 동시에, 각 웰내의 세포에 AU64주 바이러스를 배양하여 증식시켰다. 단, 바이러스 부유액은 MOI와 다른 증식의 정도를 관찰하기 위해 4배 계단 희석하고, 희석 1계단에 대해 종 1열과 횡 2열을 할당했다. 추가로 바이러스 항원량의 측정은 일차 스크리닝과 동일한 방법인 ELISA로 행했다. 그 결과, 로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 고도감수성의 세포클론 3주를 얻고, 이들 균주를 각각 베로 CL-9(FERM BP-6028), 베로 CL-16 및 베로 CI-81-7로 명명했다.

실시예 2

로타바이러스의 순화:

실시예 1에서 수득한 베로 CL-9, 베로 CL-16 및 베로 CI-81-7의 각세포클론주와 비교대조로 클로닝전의 베로세포를 각각 세포배양배지로 MEM{최종 농도 9% (V/V)의 FCS(Gibco사제, 미국) 함유}을 사용하여 37℃에서 배양하고, 각 세포의 모노시트를 형성시켰다. 배양용기로서 조직배양용 시험관을 각 세포주당 2개 사용했다. 모노시트 형성후, 각 용기의 배지를 혈청 무첨가의 신선한 MEM과 교환하고, 하루밤 배양했다. 이어서, 각 용기내의 세포에 AU64주 바이러스 부유액 0.2㎖를 접종하고, 37℃에서 60분간 정치시켜 세포에 바이러스를 흡착시킨후 접종액을 제거하고, 바이러스 증식배지로서 MEM{최종 농도 0.5㎍/㎖의 트립신형 IX(Sigma 사제, 미국) 함유}을 1㎖/용기로 첨가하고, 37℃에서 7일간 바이러스를 회전 배양 했다. 배양 종료후, 배지액을 채취하고, 바이러스 부유액으로 -80℃에 보존했다. 이들 각 바이러스 부유액을 사용한 동일한 바이러스 배양을 반복하여 행함으로 바이러스를 7대에 걸쳐 계대했다. 각 계대의 바이러스 부유액에 대해 감염가(FFU)를 후술의 형광항체법(FA) 및 효소항체법(EIA)으로 측정했다.

챔버 슬라이드(Chamber slide; Nunc 사제, 미국) 내에 상기와 동일한 방법으로 배양한 각 세포클론주 및 비교대조세포에 10배 계단 희석한 각 계대의 바이러스 부유액을 접종하고, 37℃에서 2일간 배양한 후, 각 세포를 고정하고, 이어서 간접 FA 및 EIA에 의해 FFU를 계수했다. 세포의 고정은 PBS 및 탈이온수로 순차로 세포를 정숙하게 세정한 후 최종 농도 10%(V/V) 메탄올 첨가 아세톤 중에 실온으로 5분간 침적하여 했다.

또한, 상기 FA는 일차반응에 항 사람로타바이러스 모르모트 과면역 혈청을, 2차 반응에는 FITC-표시 모르모트 IgG 염소 IgG(Cappel 사제, 미국)를 각각 사용하여 행했다.

한편, EIA는 1차 반응에 A군 로타바이러스에 대한 모르모트 과면역혈청을, 2차 반응에는 퍼옥시다아제 표시 항모르모트 IgG 염소혈청(Cappel 사제, 미국)을, 그리고 발색반응에는 기질용액{최종농도 1㎎/㎖의 4-클로로-1-나프톨(Bio-Rad 사제, 미국), 20%(V/V)메타올, 및 1/1000 용적의 35%(v/v)과산화수소수 함유 트리스염산 완충액}을 각각 사용하여 행했다.

이상에 기하여 FFU 계수의 결과를 표 2에 나타낸다. 실시예 1에서 얻은 고도감수서의 각 세포클론주에 대한 로타바이러스의 순화는 순조롭게 진행되고, 감염 바이러스량 log(FFU/㎖ 단위로)가 6.5 이상의 계대바이러스를 클론화 베로세포 순화바이러스주로 하여 -80℃에서 보존했다.

표 2

바이러스계 대 수	세포클론주	비교 대조
바이러스계 대 수	베로 CL-9	베로 CL-16	베로 CL81-7	베로 CCL81
1234567	5.35.86.06.76.97.27.3	4.85.35.46.06.16.26.5	5.15.55.76.26.46.66.8	2.72.72.8----

수치 : log (FFU/㎖)

- : 실시하지 않음

베로 CCL81 : 클로닝전의 베로세포(ATCC CCL81)

실시예 3

(1) 신규 사람 로타바이러스주 AU64n의 분리

AGMK(20P a) 세포를 배양용 시험관 내에서 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하고, 모노시트를 형성시킨 후, 후술하는 바이러스 분리재료를 접종하기 전일에 신선한 무혈청 MEM와 배지교환했다.

한편, 바이러스 분리재료를 다음과 같이 제조했다. 로타바이러스 감염 유아의 하리변 0.1g을 MEM 0.9㎖에 부유하고, 이 부유액에 상술한 트립신형 IX를 최종 농도가 10㎍/㎖로 되게 첨가 혼합한 후, 37℃에서 20분간 보온했다. 이어서, 이를 미량 고속원심기로 10,000rpm에서 30초간 원심분리하여 그 상등액을 채취하고, MEM으로 10배 희석한 후, 구경 0.22㎛의 필터를 통해 제균 여과한다. 이 여액을 바이러스 증식용 배지(최종 농도 0.5㎍/㎖의 트립신형 IX를 첨가 혼합한 MEM)로 10배 계단 희석하여 바이러스 분리재료로 했다.

다음에 상기 AGMK세포의 배지를 폐기한 후, 각 시험관 내의 세포에 상기 바이러스 분리재료를 1㎖씩 접종한다. 이 시험관을 37℃에서 1시간 보온하여 분리재료중의 바이러스를 세포에 흡착시킨후 접종액을 버리고, 바이러스증식용 배지(1㎖/시험관)로 세포를 1회 세정했다. 그 후 세정액을 버리고 각 세포에 신선한 바이러스증식용 배지(1㎖/시험관)를 첨가하고 회전 배양했다. 이 배양하에서 CPE가 관찰된 세포를 그 배양액과 함께 동결 및 융해하여 검체를 조제하고, 각 검체에서 ELISA(실시예 1)에 의해 로타바이러스 항원을 검출하여 이 항원이 양성인 검체를 수득하고, 이 검체의 저속원심 분리한 상등액을 다음 계대에서 초대 바이러스로 제공했다.

(2) 신규 사람 로타바이러스주의 계대

상기의 초대 바이러스에 최종 농도를 10㎍/㎖로 한 트립신형 IX를 첨가 혼합하고, 37℃에서 90분간 보온처리(이하 " 바이러스의 활성화"라 칭함)를 행한 후, 이를 MEM으로 10배 희석하고, 상기 (1)과 동일한 방법으로하여 신선한 하기의 세포에 접종하여 배양하고 바이러스를 연속 계대했다. 그 결과, AGMK세포 5대, 다음 베로세포(ATCC CCL 81) 5대 및 추가로 베로 CL-9 세포(FERM BP-6028) 2대(이하 계대역을 "AGMK/5, 베로 CCL 81/5, 베로 CL-9/2"의 요령으로 표기함)로 이루어지는 사람 로타바이러스주를 얻었다.

이 신선하게 분리된 사람 로타바이러스주의 혈청형 및 유전자형은 본 발명자 들에 의해 이미 보고(31p b)된 혈청형 및 바이러스 게놈 RNA의 전기영동 패턴을 사용한 방법으로 분석한 결과 G1P1B[4]로 확인되었다. 혈청형 및 유전자형은 표 1에 표시된 분류에 따르면, AU64주와 동일하기 때문에 이 신규 사람 로타바이러스주를 AU64n이라고 명명했다.

(3) AU64n주 바이러스 "AGMK/S, Vero CCL81/5 및 Vero CL-9/2"의 순화

순화는 다음과 같이 플랙클로닝(plaque cloning)을 통해 수행했다. 탄산가스배양기중에 Vero CL-9 세포를 6웰 팔콘 플레이트(Falcon Plate ; Dickinson사제, 미국)상에서 모노시트로 될때까지 배양한 후, 배지를 무혈청 MEM으로 치환하고, 하루밤 추가로 배양한다. 이어서, 상기한 바와 같이 트립신으로 활성화한 AU64n주 바이러스를 바이러스증식용 배지에 10배 희석한 후, 이 용액을 상기의 세포에 1㎖/웰씩 접종했다. 37℃에서 1시간 보온하여 세포에 바이러스를 흡착시킨 후, 접종액을 버리고 아가(agar)배지{최종농도 0.7%(w/v) 아가로스(agarose) ME(FMCBIO PRODUCTS사제, 미국) 및 0.5㎍/㎖ 트립신형 IX을 첨가 혼합한 199배지}를 2㎖/웰로 중층하여 아가를 고화한 후, 플레이트를 뒤집어 배양을 계속했다. 바이러스 접종후 4일 및 7일째에 각각 상기 아가배지를 반복하여 중층하여 배양을 계속하고, 11일째에 추가로 색소{최종농도 0.003(w/v) 뉴트랄 레드(Neutral Red; 와코준야쿠사제)를 첨가혼합한 아가배지}를 중층하여 배양하고, 세포염색에 의해 플랙을 형성시켜 12일째에 직경이 크게 분리 독립한 플랙을 채취(클로닝)했다. 다음에, 이 플랙을 MEM에 부유하고, 상기(2)의 바이러스 계대와 동일한 방법으로 Vero CL-9 세포로 다시한번 바이러스를 증폭한 후, 다시 플랙클로닝을 행했다. 이 클로닝과 바이러스 증폭의 조작을 합계 3회 반복하여 행한 후, 추가로 Vero CL-9 세포로 2대 계대한 다음, 제4회째 플랙클로닝과 증폭을 각각 행하여 수득한 AU64n주 바이러스를 Vero CL-9 세포에 1대 계대를 더하여 사람 로타바이러스 AU64n주의 오리지날 시드(계대역은 "AGMK/5, Vero CCL81/5, Vero CL-9/12"임)를 작성했다. 각종 계대레벨(level)에의 감염가는 실시예 2와 동일한 방법인 log(FFU/㎖)로 측정되고 그 결과를 계대순에 따라 다음에 기재했다.

2.5, 3.7, 4.6, 5.4, 5.8(AGMK에 5대 계대)

2.8, 3.5, 3.6, 4.0, 4.4(Vero CCL 81에 5대 계대)

5.9, 6.4, 6.8, 7.0, 7.1, 7.1, 7.1, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2(Vero CL-9에 12대 계대)

실시예 4

(1) AU64n주 바이러스의 대량배양

배양 1회당 10개의 롤러보틀(roller bottle)을 사용하여 바이러스를 대량배양하고, 이 과정을 합계 8회 반복한다. 즉, 팔콘롤러보틀(Becton Dickinson사제, 미국; 제품번호 3027)로 회전배양한 Vero CL-9 세포의 배지를 무혈청 MEM으로 치환하고, 추가로 하루밤 배양한 후 배양배지를 폐기하고, 각 보틀의 세포에 실시예 3에서 얻은 AU64n주 오리지날 시드를 20㎖/보틀 접종했다. 게다가, 이 오리지날 시드는 트립신형 IX로 미리 활성화했다. 이어서, 37℃에서 1시간 회전하에 보온하여 세포에 바이러스를 흡착시킨 후 접종액을 폐기하고, 신선한 바이러스 증식용 배지를 80㎖/보틀 첨가하여 37℃에서 2일간 회전배양했다. 배양종료후 각 보틀의 배양물을 동결 융해하여 바이러스 부유액을 조제하고 이들을 모았다. 다음에, 바이러스 부유액을 저속원심분리(3,000rpm, 10분)한 후, 그 상등액(배양 1회당 800㎖)을 채취하여 조정제 바이러스 부유액으로 했다. 합계 8회 배양을 통해 수득된 각 조정제 바이러스 부유액에 대해 실시예 3의 (3)기재와 동일한 방법으로 바이러스 감염가(X10⁸FFU/㎖)를 측정한 결과, log(FFu/㎖)는 각각 4.9, 5.5, 10.0, 7.0, 7.5, 8.0, 4.2 및 4.0이었다.

(2) AU64n주 바이러스의 정제

상기 조정제 바이러스 부유액을 사용하여 1.2ℓ를 1롯트(lot)로 하여 합계 4롯트를 편성하고, 각 롯트의 바이러스를 다음과 같이 정제했다. 각 롯트의 조정제 바이러스 부유액을 원심분리(10,000rpm, 10분)한 후, 그 상등액을 채취하여 이를 다시 초원심분리(19,000rpm, 6시간)을 행하고, 그 침강물을 15mM PBS(pH7.5)에 부유하여 40㎖로 하고 30배농축액으로 했다. 이 농축액을 원심분리(10,000rpm, 10분)한 후, 그 상등액을 채취하여 이를 30%(w/v)자당 쿠션에 중층하여 초원심분리(38,000rpm, 3시간)하고, 초원심분리후의 침강분획을 15mM PBS(pH7.5)에 재부유하여 정제 AU64n주 바이러스를 얻었다. 재부유(6㎖/롯트)한 합계 4롯트의 바이러스 감염가를 측정하고 동시에 페놀시약법으로 단백질을 정량했다. 그결과 각 롯트(#1∼#4)의 바이러스 감염가(X10⁸PFU/㎖)와 [단백질량(㎎/㎖)]은 각각 #1:3.8[1.36], #2:4.8[1.10], #3:3.3[0.94], #4:1.3[1.57] 이었다.

(3) AU64n주 바이러스의 불활화

상기 각 롯트(#1∼#4)에서 재부유액(정제 AU64n주 바이러스)를 3㎖씩 채취하여 모아진 합계 12㎖의 재부유액당 단백질량이 100㎍/㎖가 되도록 15mM PBS(pH7.5)로 희석조정한 후, 최종농도가 0.1(v/v)%로 되도록 포르말린을 첨가혼합하여 4℃에서 2주간 정치했다. 이어서, 15mM PBS(pH7.5)에 대해 5℃에서 30시간 투석을 행했다. 투석종료 후의 불활화 바이러스 함유액에 대해 불활화 로타백신원액으로의 적격성을 확인하기 위해 각종시험을 행했다. 즉, 상술한 생물학적 제제기준에 정해진 "일본뇌염백신"의 규정에 따라 단백질 함량시험, 염색시험, 무균시험, 불활화시험 및 이상독성부정시험을 행했다. 다만, 불활화시험은 Vero CL-9 세포를 사용하여 행했다. 그결과, 상기의 불활화 바이러스 함유액은 백신원액으로 적격인 것이 확인되었다.

(4) 로타바이러스 감염증 백신의 조제

상기의 백신원액을 15mM PBS(pH7.5)로 희석하고 단백질량을 50㎍/㎖로 조정함에 의해 불활화 AU64n 백신을 조제했다. 한편, 불활화하지 않은 상기 4롯트로부터 각각 0.5㎖씩 채취하여 모은 재부유(정제 AU64n주 바이러스)의 단백질량을 상기와 동일한 방법으로 50㎍/㎖로 조정하여 생AU64n함유액으로 했다.

(5) 불활화 AU64n 백신의 면역원성의 측정

불활화 AU64n 백신을 단백질량 10㎍/1회분으로 2주간격으로 2회 4∼5주령의 ddy 마우스(7마리)에 접종하고, 그 2주째에 모두 혈액을 채취했다. 비교대조로서 상기 생 AU64n 함유액 및 15mM PBS(pH7.5) 양자를 사용하여 불활화 AU64n 백신과 동일하게 전자는 19마리 후자는 10마리의 마우스에 각각 접종 후 혈액을 채취했다. 채취한 각 혈청의 AU64n주에 대한 중화항체가를 60% 플랙감소법으로 측정했다. 이결과를 표 3에 나타냈으며, 이 백신의 우수한 면역원성이 확인되었다.

표 3

면역에 사용된 항원	중화항체가 ± 신뢰한도
불활화 AU64n 백신생 AU64n 함유액15mM PBS (pH7.5)	2.20 ±0.232.30 ±0.12≤1.60

중화항체가 : 개개의 마우스의 항체가(상용대수)의 기하평균치

신뢰한계 : 위험율 5%

(6) 불활하 AU64n 백신의 면역 특성

불활화 AU64n 백신으로 면역된 상기 마우스 면역혈청(7 마리)의 혈청형 또는 유전자형이 다른 로타바이러스에 대한 중화능을 60% 포커스감소법(focus reduction method)으로 측정했다. 그 결과를 표 4에 나타냈다. AU64n주를 유효성분으로 사용한 배신은 AU64n주 뿐만아니라 P 혈청형과 유전자형이 다른 Wa주 및 G 혈청형이 다른 DS-1주 양자의 감염 방어에 유효함을 나타내었다.

표 4

공격 바이러스	G·P 혈청형[유전자형]	중화항체가 ± 신뢰한도
AU64nWaDS-1	G1P1B[4]G1P1A[8]G2P1b[4]	2.19 ± 0.522.43 ± 0.431.90 ± 0.25

중화항체가 : 개개의 마우스의 항체가(상용대수)의 기하 평균치

신뢰한계 : 위험율 5%

실시예 5

신규 사람 로타바이러스주 AU32n의 취득:

실시예 3에 기재한 것과 동일한 방법으로 신규 사람 로타바이러스주를 분리하고 계대하여 감염가를 측정하고, 혈청형 및 유전자형을 해석했다. 즉, 로타바이러스 감염유아의 하리변에서 AGMK세포를 이용하여 사람 로타바이러스주를 분리하여 동일한 세포에서 2대 계대한 후, Vero CL-9 세포에 합계 8대 계대[제 1∼3대(플랙 클로닝), 제 4대(정치배양), 제 5대(플랙 클로닝), 제 6대(정치배양), 제 7∼8대(회전배양)]하여 세포클론 순화 사람 로타바이러스주(계대력은 AGMK/3, Vero CL-9/8)를 수득했다. 이 사람 로타바이러스주의 감염가 log(FFU/㎖)는 6.0이었다. 또한, 그 혈청형[유전자형]은 G9P1A[8]로 AU32주와 동일하였고, 이 신규 사람 로타바이러스주를 AU32n으로 명명했다.

실시예 6

Vero CL-9 세포에서 로타바이러스의 분리:

실시예 3의 (1)에 기재된 것과 동일한 방법으로 로타바이러스를 분리한다. 다만, AGMK 세포 대신에 Vero CL-9 세포를 사용하여 행한다.

본 발명은 로타바이러스 감염증에 관한 백신, 진단제, 시약 및 그들의 제조방법을 제공하는 것이고, 인류의 보건·세계의 의료행정·환경위생·축산 및 로타바이러스 감염증에 관한 기초·임상·응용을 위한 각 연구에 기여하는 것이다. 특히 본 발명은 소아구토하리증, 백색변하리증, 소아가성콜레라 등의 병명으로 두렵게하는 감염증에 대한 강력한 예방수단으로서의 백신을 제공하여 세상의 일반가정뿐만 아니라 세계보건기구(WHO)를 비롯하여 전세계의 의료·보건종사자에게 희망의 복음을 줄 수 있는 것이다.

Claims

로타바이러스의 증식을 고도로 허용하는 세포를 배양세포로 하여 클로닝(cloning)하고, 수득된 세포클론주에 로타바이러스를 계대하여 순화시킴에 의해 세포클론순화 로타바이러스주를 작성하고, 이 순화 로타바이러스주 또는 이 순화 로타바이러스주를 친주로 사용하여 작성한 리어솔턴트(reassortant)를 시드(seed)바이러스로 하여 배양하고, 이 시드바이러스의 배양배지로부터 로타바이러스 항원을 분리·정제함을 특징으로 하는 로타바이러스 항원의 제조방법.
배양세포가 Vero 세포(ATCC CCL81)인 제 1항의 로타바이러스 항원의 제조방법.
세포클론주가 Vero CL-9(FERM BP-6028)인 제 1항 또는 제 2항의 로타바이러스 항원의 제조방법.
로타바이러스가 사람 로타바이러스주 AU32n 및 또는 AU64n인 제 1항, 제 2항 또는 제 3항의 로타바이러스 항원의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항중 어느 하나의 방법에 따라 수득한 로타바이러스 항원.
제 5항의 로타바이러스 항원을 다시 불활화제로 불활화시켜 조제된 불활화 항원.
제 5항의 로타바이러스 항원 또는 제 6항의 불활화 항원을 면역을 가지는 양만큼 함유하는 로타바이러스 감염증 백신.
제 5항의 로타바이러스 항원 또는 제 6항의 불활화 항원에 있어, 혈청형 또는 유전자형이 상호 다른 2종 이상의 항원을 각각 면역을 가지는 양만큼 함유하는 혼합 다가(multivalent) 로타바이러스 감염증 백신.
제 5항의 로타바이러스 항원 또는 제 6항의 불활화 항원을 항원-항체 반응을 나타내는 양만큼 함유하는 진단제.
세포클론주 Vero CL-9(FERM BP-6028).
세포클론주 순화 사람 로타바이러스주 AU32n.
세포클론주 순화 사람 로타바이러스주 AU64n.