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KR19990072075A - 식물세포 배양에 의해 식물 화학물질을 생산하기 위한 생산 및스크리닝 방법 - Google Patents

식물세포 배양에 의해 식물 화학물질을 생산하기 위한 생산 및스크리닝 방법 Download PDF

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KR19990072075A
KR19990072075A KR1019980704381A KR19980704381A KR19990072075A KR 19990072075 A KR19990072075 A KR 19990072075A KR 1019980704381 A KR1019980704381 A KR 1019980704381A KR 19980704381 A KR19980704381 A KR 19980704381A KR 19990072075 A KR19990072075 A KR 19990072075A
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KR
South Korea
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plant
paclitaxel
chemicals
aqueous phase
hydrophobic phase
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Withdrawn
Application number
KR1019980704381A
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English (en)
Inventor
암란 두타
라메쉬 씨 판디
Original Assignee
지켐 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 지켐 인코포레이티드 filed Critical 지켐 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 식물세포 배양에 의해 식물 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 수성 상 및 이 수성 상에 비해 파클리탁셀(paclitaxel)에 대한 분배계수가 큰 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지중에서 특정 식물 화학물질을 생산하는 식물세포를 배양하는 단계를 포함한다. 식물 화학물질은 소수성 상으로부터 회수된다. 이 생산 방법을 사용하여 식물 세포 배양물중에서 특정 식물 화학물질을 생산하는 식물세포주를 스크리닝하는 방법도 또한 제공된다. 바람직한 식물 화학물질은 파클리탁셀이다.

Description

식물세포 배양에 의해 식물 화학물질을 생산하기 위한 생산 및 스크리닝 방법
식물 화학물질을 생산하고 세포주를 스크리닝하여 식물 화학물질 생산자를 동정하기 위한 현재의 기법은 반고상 배지상에서 또는 현탁액중에서 반복되는 2차 배양을 통하여 세포주를 특징화하는 것에 의존하고 있으며, 이때 그밖의 공정 향상 전략은 무시된다. 일단 고수율의 세포주가 발견되면, 공정 향상 전략이 적용되어, 공정 조건이 다시 최적화된다. 이것은 2상 배양과 같은 공정 향상 전략에 보다 순응하는 세포주가 1차 스크리닝에서는 무시될 수도 있다는 단점을 갖는다. 표준의 스크리닝 방법에서는, 배양 조건의 최적화는 2단계 공정으로서, 일단 스크리닝중에 이루어진 다음 가공 조건하에 이루어진다. 게다가, 표준의 방법에서는 세포내 식물 화학물질의 양을 검출하기 위하여 세포가 희생된다.
세포는 다양한 대사 제어 메카니즘에 의하여 불필요한 대사산물의 생산이 방지된다. 이것은 가치있는 2차 대사산물의 생산에 식물세포 배양물을 적용한다는 식물세포 배양에 의한 식물 화학물질 생산의 전체 목적에 반대되는 것이다. 이 문제를 공정 공학 관점에서 해결하기 위해서는, 1차 다운스트림(down-stream) 가공 단계의 통합에 의해 반응 부위로부터 생성물을 제거하는 것이 가능성있는 전략중 하나이다.
식물세포 배양의 통합된 발효 및 분리에 대한 주요 동기는 피드백 억제(feedback repression) 및 생성물 분해를 피하는 것과 관계있다. 피드백 억제는 높은 생성물 농도에 상응하는 효소 활성을 적응시킴으로써 세포의 생산성을 조절하는, 세포의 일단의 제어 메카니즘을 포함한다. 따라서, 높은 생성물 농도는 특정 생성물에 대한 세포의 최대 생산성을 감소시킨다. 증식과 생산은 직접 결부되지 않기 때문에 피드백 억제는 특히 2차 대산산물의 생성시에 일어난다. 생성물의 농도가 너무 높으면, 생물량 증가에 비하여 생성물 생산성이 감소되고, 따라서 기질 또는 전구체에 대한 대사산물의 수율이 낮아진다. 또한, 식물세포 배양에서 발효중 생성물의 분해를 피하는 것도 통합 공정을 사용하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 식물세포 발효는 통상적으로 2주동안 지속되며, 이 기간동안 세포외 효소 또는 광-관련 반응에 의해 2차 대산산물이 분해되어 생성물의 수율이 낮아질 수도 있다.
생산 향상 전략을 1차 스크리닝 기법에 통합하는 신규한 생산 및 스크리닝 기법에 대한 필요가 계속 일고 있다. 이러한 기법은 바람직하게는 비파괴적이고 신속하다.
발명의 요약
하나의 양상에서, 본 발명은 식물 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 수성 상 및 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지중에서 식물 화학물질을 생산하는 식물세포를 배양하는 단계를 포함한다. 소수성 상은 수성 상에 비해 식물 화학물질에 대한 분배계수가 크므로, 세포 배양에 의해 생산된 식물 화학물질은 소수성 상에 흡수된다. 바람직한 양태에서, 다상 배양 배지는 2상 배양 배지이다. 바람직한 식물 화학물질은 파클리탁셀(paclitaxel)이다.
소수성 상은 바람직하게는 다른 상들에 비해 식물 호르몬 및 식물세포 영양소에 대해 작은 분배계수를 갖는다. 소수성 상은 바람직하게는 고분자량의 알콜, 에스테르, 에테르, 트리글리세라이드, 할로겐화 용매 또는 실리콘을 포함한다. 특히 바람직한 소수성 상은 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤을 포함한다. 한 양태에서, 소수성 상은 수성상으로 미리 조정한다.
수성 상은 식물세포 배양의 생육력을 유지하는데 필요한 인자 및 임의적으로는 식물 화학물질 생산을 촉진하는 인자들을 포함한다. 이러한 인자들로는 식물 호르몬, 식물 화학물질 합성 전구체, 엘리시터(elicitor) 및 시그날 커플러(signal coupler)가 있다.
전형적인 바람직한 식물 호르몬으로는 옥신, 2-나프틸옥시아세트산, 1-나프틸아세트산, 사이토키닌, 키네틴, 6-벤질아미노 퓨린, 4-클로로페녹시아세트산, p-클로로페녹시아세트산, 2,4,5-트리클로로페녹시아세트산, 피클로람, N6-(22-이소펜틸)아데닌, 제아틴 및 6-(벤질아미노)-9-(2-테트라하이드로피라닐)-9H-퓨린이 있다. 파클리탁셀의 전형적인 바람직한 생합성 전구체로는 페닐알라닌 및 지베렐린 산이 있다. 파클리탁셀의 생산에 전형적인 바람직한 엘리시터로는 사이토스포라 아비에티스(Cytospora abietis) 또는 페니실리움 미놀루테움(Penicillium minoluteum)의 추출물이 있다. 파클리탁셀의 생성에 전형적인 바람직한 시그날 커플러는 자스몬산 또는 그의 염이다.
파클리탁셀을 제조하기 위한 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 식물세포 배양물은 탁수스 종(Taxus spp.) 세포주의 현탁 배양물이다. 본 발명의 파클리탁셀 생산 방법은 소수성 상으로부터 파클리탁셀을 연속 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 생산 향상 전략을 스크리닝 기법에 통합한 비파괴적 스크리닝 기법을 제공한다. 스크리닝 기법도 또한 비파괴적이고 신속하다. 세포는 수성 상 및 액체 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지중에서 생성물을 생산한다. 소수성 상은 수성 상보다 생성물에 대해 큰 분배계수를 갖거나 더 큰 친화성을 가져, 세포 배양에 의해 생산된 생성물이 소수성 상으로 추출된다. 바람직한 양태에서, 다상 배양 배지는 2상 배양 배지이다. 바람직한 소수성 상 및 수성 상은 전술한 것과 같다.
본 발명은 식물세포 배양에 의해 식물 화학물질을 생산하기 위한 세포주를 스크리닝(screening)하는 기법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 식물 화학물질을 배지 및 세포 상과 함께 존재하는 제 2 상으로 분비할 수 있는 액체 현탁 세포주를 스크리닝하는 것에 관한 것이다. 이 기법은 또한 배양된 식물세포로부터 식물 화학물질을 생산하는데 사용될 수 있다.
도 1은 파클리탁셀의 생산을 위한 2상 배양 배지를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 소수성 상으로부터 파클리탁셀을 연속 추출하기 위한 추가의 구성요소를 갖는, 파클리탁셀의 생산을 위한 2상 배양 배지를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 탁수스 현탁 세포주의 배양물내 추출 후 제 2 상인 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤의 HPLC 프로파일을 도시한 도면이다.
도 4A 및 도 4B는 각각 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤로 추출하기 전의 배지(A) 및 추출한 후의 배지(B)중의 파클리탁셀의 HPLC 프로파일을 도시하는 도면이다.
I. 본 발명
본 발명은 의약적으로 관심을 끄는 식물 화학물질을 생산하는 신규한 방법 및 식물세포 배양물의 스크리닝에 이러한 방법을 사용하여 관심을 끄는 특정 식물 화학물질을 생산하는 식물세포주를 동정하는 것에 관한 것이다. 이 방법의 중요한 특징은 수성 상 및 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지의 사용이다. 관심을 끄는 식물 화학물질은 소수성 상으로의 분배를 특징으로 한다.
식물 화학물질을 생산하는 세포를 파괴하는 기존의 세포 배양 스크리닝 및 생산 기법과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 식물 화학물질 함량에 대하여 소수성 상을 분석하기만 하면 되므로 비파괴적이다. 소수성 상은 수성 상과는 별개의 층을 형성하기 때문에, 샘플 채취가 더 용이하고, 원하는 식물 화학물질이 다른 배지 성분으로부터 분리된다.
II. 식물 화학물질의 생산 방법
따라서, 하나의 양상에서 본 발명은 원하는 식물 화학물질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 수성 상 및 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지중에서 식물 화학물질을 생산하는 식물세포를 배양하는 단계를 포함한다. 소수성 상은 수성 상에 비해 식물 화학물질에 대해 큰 분배계수를 가져, 세포 배양에 의해 생산된 식물 화학물질이 소수성 상에 흡수된다. 바람직한 양태에서, 다상 배양 배지는 2상 배양 배지이다.
본 발명의 방법에 의해 수성 상과 소수성 상 사이에 분배될 수 있는 식물 화학물질이 생산될 수 있다. 식물 화학물질은 특정 식물세포 배양에 의해 생산되고 분비된다. 특정 식물세포주에 의해 생산되고 분비된 식물 화학물질은 당분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 식물 화학물질은 암 치료에 사용되는 약제인 파클리탁셀이다.
파클리탁셀은 치료저항성 난소암 및 유방암의 치료에 유효한 것으로 입증되었으며, 폐암 및 결장암의 치료에 있어서는 I기 및 II기 실험중에 있다. 현재, 파클리탁셀은 탁수스 종의 식물 기관으로부터 유도되거나 또는 천연 공급원으로부터 단리된 파클리탁셀 중간생성물의 반합성 전환에 의해 유도된다. 현 방법의 대안으로서, 파클리탁셀을 식물세포 배양에 의해 생산할 수도 있다. 세포배양에 의한 파클리탁셀의 생산은 더 신뢰성있고 확인하기가 더 용이하다는 이점을 제공하며, 그 물질의 공급원의 파괴를 필요로 하는 천연 공급원으로부터의 생성물의 단리 방법에 비하여 재생가능한 공급원이다. 파클리탁셀은 탁수스 속의 세 주목에 의해 생산된다. 따라서, 파클리탁셀을 생산하는 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 식물세포 배양물은 탁수스 종 세포주의 현탁 배양물이다. 전형적인 이러한 세포주는 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 탁수스 메디아(Taxus media), 탁수스 바카타(Taxus baccata), 탁수스 쿠스피다타(Taxus cuspidata) 및 탁수스 히말라야(Taxus himalaya)와 같은 각종 주목의 상이한 기관에서 유래한다. 식물세포 배양물을 만드는 수단은 당분야에 널리 공지되어 있다.
특정 식물 화학물질을 생산하고 분비하는 세포주를 선택한 후, 그 세포주를 세포를 유지시키기 위한 수성 상 및 식물 화학물질을 분배시키기 위한 소수성 상을 함유하는 다상 배양 배지중에서 배양한다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 수성 상은 영양분 및 식물세포의 생육력을 유지하는데 필요한 그밖의 인자를 함유한다. 이들 인자로는 탄소원, 염 및 용존기체(예: 이산화탄소)가 있다. 30g/ℓ의 슈크로즈가 첨가된 감보르그 B-5 배지(Gamborg's B-5 medium)의 사용이 이후 실시예에 제시되어 있다.
수성 상은 선택적으로 식물 화학물질 생산을 자극하는 인자들을 포함한다. 이러한 인자들로는 식물 호르몬, 식물 화학물질의 파클리탁셀 생합성 전구체, 엘리시터 및 시그날 커플러가 있다.
전형적인 바람직한 식물 호르몬으로는 옥신, 2-나프틸옥시아세트산, 1-나프틸아세트산, 사이토키닌, 키네틴, 6-벤질아미노 퓨린, 4-클로로페녹시아세트산, p-클로로페녹시아세트산, 2,4,5-트리클로로페녹시아세트산, 피클로람, N6-(22-이소펜틸)아데닌, 제아틴 및 6-(벤질아미노)-9-(2-테트라하이드로피라닐)-9H-퓨린이 있다.
염기성 배지내 옥신, 2-나프틸옥시아세트산(NOA) 또는 1-나프틸아세트산(NAA)과 사이토키닌, 키네틴 또는 6-벤질아미노 퓨린(BAP)의 10:1 몰비의 혼합물이 파클리탁셀을 생산하는 세포주를 개시시키는데 유효하다.
파클리탁셀과 같은 식물 화학물질의 합성의 유도는 종종 진균, 세균 및 바이러스의 공격하에서 이루어지는 식물의 방어 메카니즘의 유발과 연루된다. 따라서, 식물 화학물질의 합성은 특정 엘리시터의 배양 배지에 병원체의 세포벽 성분을 첨가함으로써 자극될 수 있다. 하기 표 1에는 식물세포 배양에서 식물 화학물질의 생합성을 증진시키는데 성공적으로 사용된 전형적인 엘리시터가 기재되어 있다.
식물세포 배양물에서 유발된 식물 화학물질
식물 화학물질 식물세포 배양물 엘리시터원 증진량(X배)
해링토닌 알칼로이드(Harringtonine alkaloids) 세팔로 탁수스 해링티니아(Cephalo Taxus harringtinia) 베르티칠리움 달리아에(Verticillium dahliae) 51
메디카르핀(Medicarpin) 치체르 아리에티눔(Cicer arietinum) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 60
디오스제닌(Diosgenin) 디아스코레아 델토이데스(Diascorea deltoides) 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus) 3
모르핀(Morphine) 파파베르 솜니페룸(Papaver somniferum) 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) 20
연구 결과, 엘리시터는 비유발된 배양보다 짧은 생산 기간에 식물 화학물질 생산을 자극하는데 유용한 경향이 있는 것으로 나타났다. 특히, 진균인 사이토스포라 아비에티스 및 페니실리움 미놀루테움으로부터 제조된 조질의 엘리시터 추출물은 첨가된 지 24시간 이내에 파클리탁셀 생산을 자극할 수 있었다(미국 특허 제 5,019,504 호 참조).
진균 배양물을 회분식 현탁 배양물, 수획된 배양 여액 및 균질화된 균사체 덩어리중에서 증식시킨다. 배양 여액 및 균사체 균질화물을 회전 증발시켜 원래 체적의 1/20로 만든 다음, 투석하여 저분자량의 성분을 제거한다. 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후, 액체를 고압멸균하고, 세포 배양물에 방부제를 첨가하기 전에 -20℃에서 보관하였다.
최적의 엘리시터 농도, 특이성, 노출 시간, 및 배양 기간, 배지 조성 및 세포주 반응의 함수로서의 엘리시터 첨가 시기를 결정하기 위한 수단은 당분야에 널리 공지되어 있다. 전형적인 엘리시터 농도는 총 배양 체적의 0.3 내지 5체적%이다. 전형적인 노출 시간은 약 24시간 내지 약 48시간이다.
식물 화학물질의 생합성 전구체는 생산을 증진시킨다. 이러한 파클리탁셀의 생합성 전구체의 예는 페닐알라닌 및 지베렐린 산이다. 이들 전구체는 전형적으로 배양을 개시할 때 세포 배양물에 첨가된다. 파클리탁셀 생산은 이러한 생합성 전구체의 부재하에 일어날 수 있지만, 전구체가 사용되면 전형적으로 생산의 증진이 일어난다. 이러한 전구체의 최적 농도를 결정하는 수단은 당분야에 널리 공지되어 있다.
지베렐린 산(GA3)은 파클리탁셀 수율에 불리한 영향을 주지 않으면서 탁수스 쿠스피다타 세포 증식속도를 증가시키는 것으로 나타났다(페트-네토(Fett-neto, A. F.), 멜란슨(S. J. Melanson), 사카타(K. Sakata), 디코스모(F. DiCosmo)의 문헌[Biotechnology, 11, 731, 1993] 참조). GA3의 효과는 세포 증대를 강하게 촉진할 때 외래의 옥신 및 사이토키닌과의 상승작용성 효과에 기인하는 것으로 제안된 바 있다.
페닐알라닌은 윈터스타인 산(Winterstein acid)의 아미노산 전구체로서, 파클리탁셀 분자의 측쇄의 생합성에 필요하다. 0.1mM의 페닐알라닌을 배지에 첨가하면 세포 증식에 영향을 주지 않고 탁수스 쿠스피다타 배양에서 파클리탁셀 수율을 상당히 증진시키는 것으로 나타났다.
자스몬산은 최근 유발시 일어나는 시그날 변환 과정의 시그날 커플러로서 확인되었다(예를 들어, 군들라흐(Gundlach, H.), 뮬러(M. J. Muller), 쿠찬(T. M. Kutchan), 젱크(M. H. Zenk)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2389, 1992] 및 라인보드(Reinbothe, S.), 몰렌하우어(B. Mollenhauer), 라인보드(C. Reinbothe)의 문헌[The Plant Cell, 6, 1197, 1994] 참조). 파클리탁셀 생산은 탁수스 세포를 유발시키면 향상될 수 있다.
자스몬산은 2차 대산산물 생합성의 엘리시터 유도시 제 2 메신저(messenger)인 것으로 제안되었다. 2차 대사산물 유전자 발현에 대한 자스몬산염의 영향은 식물의 넓은 단면에서 발견되었다. 외래의 메틸화 자스몬산염의 첨가에 의한 2차 대산산물의 증진은 다수의 종에서 나타났다(군들라흐, 뮬러, 쿠찬, 젱크의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2389, 1992] 및 라인보드, 몰렌하우어, 라인보드의 문헌[The Plant Cell, 6, 1197, 1994] 참조).
자스몬산의 메틸 에스테르인 메틸 자스몬산염이 외래 첨가에 사용되는데, 그 이유는 식물세포에 의한 메틸화 형태의 흡수가 유리 자스몬산보다 더 효율적인 것으로 생각되고, 메틸화 형태를 시중에서 쉽게 입수할 수 있기 때문이다. 본 발명의 발명자들은 메틸화된 자스몬산염을 에스크촐치아 칼리포르니카(Eschscholtzia californica)의 세포 배양에 첨가하면 벤조페난트리딘 알칼로이드의 수율이 증진됨을 발견하였다(두타(Dutta, A.)의 문헌[Two-Phase Plant Cell Culture Integrated With Biosynthesis Enhancement Techniques, 미국 뉴저지주 뉴 브런스윅 소재의 뉴저지 주립대학 럭거스 박사학위 논문, 1995] 참조).
유발 및 전구체 공급으로서 이러한 증진 전략과 2차 대산산물의 배양물내 추출의 통합에는 통상적으로 상승작용이 있다. 알칼로이드의 생합성은 엘리시터, 전구체 및 메틸 자스몬산염의 첨가에 의해 구성량보다 상당히 증가된다. 피드백 억제의 크기는 대조 배양에서보다 또는 엘리시터 및 메틸 자스몬산염이 별개로 첨가된 경우보다 크다.
배양 배지는 식물세포 배양에 의해 생산되어 수성 배지로 분비되는 식물 화학물질을 흡수하는 소수성 상을 포함한다. 소수성 상은 수성 상보다 식물 화학물질에 대한 분배계수가 더 크기 때문에 식물 화학물질의 소수성 상으로의 흡수가 일어난다. 식물 화학물질이 수성 상으로부터 소수성 상으로 옮겨짐으로써 식물 화학물질 합성의 평형이 식물 화학물질을 더 많이 생산하는 쪽으로 변화되고, 따라서 생합성이 증폭된다.
소수성 상의 성분은 식물세포에 비독성이며, 특정 식물 화학물질에 대해 충분히 선택성이어서 식물 화학물질이 소수성 상에 분배된다. 수성 상 위에 상부 층을 형성하는 소수성 상이 바람직하다.
소수성 상은 바람직하게는 식물 호르몬, 영양소 및 수성 상에 존재하는 그밖의 인자들에 대해 작은 분배계수를 갖는다. 이러한 인자들의 소수성 상으로의 흡수는 소수성 상을 수성 상으로 미리 조정함으로써 최소화할 수 있다.
소수성 상은 바람직하게는 고분자량의 알콜, 소수성 에스테르, 에테르, 트리글리세라이드, 할로겐화 용매 또는 실리콘을 포함한다. 파클리탁셀 생산에 특히 바람직한 소수성 상으로는 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤이 있다. 파클리탁셀의 분배를 위한 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤의 사용은 실시예에 이후 상세하게 기술된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 수성 상(A) 및 소수성 상(H)을 갖는 2상 배양 배지의 개략적인 그림이 도 1에 기재되어 있다.
적합한 소수성 상을 결정하는 수단은 당분야에 널리 공지되어 있다. 간단하게 말하자면, 식물 화학물질의 수용액을 소수성 상에 노출시켜, 식물 화학물질이 소수성 상으로 분포 또는 분배되는 것을 측정한다. 소수성 상의 샘플을 메탄올로 추출하고, 불용분을 제거한다. 그 다음, 추출물을 농축하고, 확립된 HPLC 방법을 사용하여 분석한다(파클리탁셀은 이 시스템으로 용이하게 동정할 수 있다). 포토다이오드 어레이 디텍터(photodiode array detector)를 사용하여 파클리탁셀 피크의 동질성을 확인하고, UV 지문을 제공하여 파클리탁셀의 동질성을 확인할 수 있다. HPLC에서의 파클리탁셀 피크의 최종 확인은 LC-MS에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 생산 방법은 소수성 상으로부터 식물화학물질을 연속 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 파클리탁셀 생산을 위한 이러한 시스템의 예가 도 2에 도시되어 있다.
도 2를 보면, 적합한 식물세포 배양물이 수성 상(A)에 현탁되어 있다. 상부 층은 소수성 상(H)으로 이루어진다. 식물세포에 의해 분비되어 소수성 상으로 분배된 파클리탁셀은 카플리탁셀과 소수성 상에 존재하는 임의의 수성 배지 성분을 분리하는 분리기(예컨대, 원심분리기)로 보내진다(1). 수성 배지 성분은 배양 반응기의 수성 상으로 다시 재순환된다(3). 파클리탁셀은 메탄올 추출에 의해 파클리탁셀을 제거하는 추출기(예컨대, 중공 섬유)로 보내진다(2). 그 다음, 소수성 상의 성분이 반응기의 배양 배지로 다시 재순환된다(4). 메탄올로 추출된 파클리탁셀이 수집된다.
III. 파클리탁셀을 생산하는 배양물을 동정하기 위한 식물세포 배양물의 스크리닝 방법
식물화학물질을 생산하는 방법을 사용하면, 식물세포 배양물을 스크리닝하여 특정 식물 화학물질을 생산하는 식물세포 배양물을 동정할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법에 따라, 주어진 식물 화학물질을 생산하는 것으로 생각되는 식물세포 배양물을 수성 상 및 그 식물 화학물질에 대해 수성상보다 큰 분배계수를 갖는 소수성 상을 포함하는 배양 배지중에서 배양한다.
배양액을 식물 화학물질이 생산되고 소수성 상으로 분배되기에 충분한 기간동안 유지시킨다. 그 다음, 소수성 상에서 샘플을 취하여, 샘플중의 식물 화학물질의 존재를 결정하는데, 식물 화학물질이 존재하면 식물세포 배양액이 식물 화학물질을 생산함을 나타내는 것이다.
바람직한 양태에서, 식물 화학물질은 파클리탁셀이고, 세포주는 전술한 바와 같이 탁수스 종 세포주의 현탁 배양물이다. 수성 상 및 소수성 상의 바람직한 양태는 전술한 바와 같다.
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 예시하지만, 어떤 식으로든 명세서 및 청구의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에 보고된 실험 결과, 파클리탁셀은 소수성 상으로 분배됨으로써 수성 배지로부터 제거될 수 있었다. 이 실험에 사용된 수성 상(배지)은 30g/ℓ의 슈크로즈, 비타민 및 25μM의 알파-나프탈렌 아세트산이 함유된 감보르그 B-5 배지였다.
파클리탁셀의 모액은 10㎖의 메탄올에 20㎎의 조 파클리탁셀을 용해시킴으로써 제조하였다. 이 모액 약 0.1㎖를 150㎖의 수성 배지에 용해시켰다. HPLC에 의해 샘플을 분석한 결과, 수성 배지중의 파클리탁셀의 함량은 0.6㎎/ℓ이었다(도 4).
파클리탁셀-수용액을 분할하여 pH를 3.5, 5.45, 5.75, 6.36 또는 6.9로 조정하였다. 각 파클리탁셀 용액으로부터 3㎖씩 취하여 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤(트리카프릴린)의 소수성 상 3㎖와 혼합하고, 1분동안 보텍싱(vortexing)하였다. 1시간 후 상을 분리하고, 수성 배지를 HPLC에 의해 분석하였다.
트리카프릴린과 혼합한 후의 수성 배지에서는 파클리탁셀이 검출되지 않았는데, 이는 트리카프릴린이 수성 배지로부터 파클리탁셀을 완전히 제거하였음을 나타낸다.
실시예 2
탁수스 종의 식물 기관(예: 침엽, 잎, 줄기)의 단편을, 30g/ℓ의 슈크로즈, 0.8중량%의 아가, 비타민 및 25μM의 알파-나프탈렌 아세트산이 함유된 감보르그 B-5 배지에 넣고, 22℃의 배양기에 놔두었다. 2주 내지 3개월의 다양한 기간이 지난 후 분화되지 않은 세포의 칼루스(callus)가 식물 기관에 증식하였다. 칼루스를 동일한 배지에서 2차 배양하였다.
칼루스 2차 배양물을 분할하여 수성 배양 배지(30g/ℓ의 슈크로즈, 비타민 및 25μM의 알파-나프탈렌 아세트산이 함유된 감보르그 B-5 배지, pH 5.5)에 옮겨 현탁 배양물을 만들었다. 그 다음, 이들 현탁 세포 배양물을 수성 상으로서 감보르그 B-5 배지 및 소수성 상으로서 10체적%의 트리카프릴린을 함유하는 2상 배양 배지로 옮겼다.
현탁 세포 배양액을 빛을 차단한 회전식 진탕기(180rpm, 25℃)에서 50㎖의 배양 배지가 들어 있는 125㎖들이 진탕 플라스크중에서 증식시켰다. 30일동안 배양한 후 소수성 상의 샘플을 HPLC에 의해 파클리탁셀 함량에 대해 분석하였다(도 3).
소수성 상의 샘플을 메탄올로 추출하여 HPLC 분석하기 전에 임의의 포획된 수성 상을 제거하였다. 그 결과, 소수성 상에는 파클리탁셀이 510㎎/ℓ의 농도로 함유되어 있었다. 실시예 1의 결과와 함께 생각해 볼 때, 이들 데이터로부터 식물세포는 수성 상 및 소수성 상을 함유하는 2상 배양 배지중에서 증식할 수 있으며, 식물세포에 의해 생산되어 분비된 파클리탁셀이 소수성 상으로 분배됨을 알 수 있다.

Claims (17)

  1. 수성 상 및 이 수성 상에 비해 식물 화학물질에 대한 분배계수가 큰 소수성 상을 포함하는 다상 배양 배지중에서 식물 화학물질을 생산하는 식물세포를 배양함을 포함하는, 식물 화학물질의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    다상 배양 배지가 2상 배양 배지인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    소수성 상이 다른 상에 비해 식물 호르몬 및 식물세포 영양분에 대해 작은 분배계수를 갖는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    소수성 상이 고분자량의 알콜, 에스테르, 에테르, 트리글리세라이드, 할로겐화 용매 또는 실리콘을 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    소수성 상이 1,2,3-트리옥타노일 글리세롤을 포함하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    소수성 상을 수성 상으로 미리 조정한 방법.
  7. 제 2 항에 있어서,
    수성 상이 1종 이상의 식물 호르몬을 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    식물 호르몬이 옥신, 2-나프틸옥시아세트산, 1-나프틸아세트산, 사이토키닌, 키네틴, 6-벤질아미노 퓨린, 4-클로로페녹시아세트산, p-클로로페녹시아세트산, 2,4,5-트리클로로페녹시아세트산, 피클로람, N6-(22-이소펜틸)아데닌, 제아틴 또는 6-(벤질아미노)-9-(2-테트라하이드로피라닐)-9H-퓨린을 포함하는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서,
    식물 화학물질이 파클리탁셀(paclitaxel)인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    수성 상이 파클리탁셀의 생합성 전구체를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    생합성 전구체가 페닐알라닌 또는 지베렐린 산인 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    수성 상이 파클리탁셀 생산의 자극원을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    자극원이 사이토스포라 아비에티스(Cytospora abietis) 또는 페니실리움 미놀루테움(Penicillium minoluteum)의 추출물인 방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    식물세포 배양물이 탁수스 종(Taxus spp.) 세포주의 현탁 배양물인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    소수성 상으로부터 식물 화학물질을 연속 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 수성 상 및 이 수성 상에 비해 식물 화학물질에 대한 분배계수가 큰 소수성 상을 포함하는 배양 배지중에서 식물세포 배양물을 배양하고,
    소수성 상중의 식물 화학물질의 존재를 검출하여 식물세포 배양물이 식물 화학물질을 생산함을 확인함을 포함하는,
    식물 화학물질의 생산자를 동정하기 위해 식물세포 배양물을 스크리닝(screening)하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    식물 화학물질이 파클리탁셀인 방법.
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