KR19990066965A

KR19990066965A - 신규 펩티드

Info

Publication number: KR19990066965A
Application number: KR1019980702898A
Authority: KR
Inventors: 요 나카하라; 사부로 하라; 유이치 가미쿠보; 스미요 다케모토; 세이지 미야모토
Original assignee: 사코 미쯔오; 사이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-08-16
Anticipated expiration: 2016-10-23
Also published as: EP0867450B1; EP0867450A1; AU7335796A; DE69633133T2; US6191113B1; WO1997015598A1; KR100465222B1; DE69633133D1; CA2232240A1; CA2232240C; ATE273322T1; AU719366B2; EP0867450A4; JP3930050B2

Abstract

염기성 이미노산이 풍부한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (A) 및 적어도 2개의 연속한 소수성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (B)를 함유하고, 펩티드 (A)의 C 말단에 펩티드 (B)가 직접 또는 수개의 아미노산 서열을 개재하여 결합되어 있을 것을 특징으로 하는 펩티드.

본 발명의 신규 펩티드는 우수한 평활근 세포 증식 억제능을 갖고 해당 신규 펩티드를 함유하는 제제는 평활근세포의 증식에 따라서 동맥경화, 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평골근내종의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

신규 펩티드

평활근 세포는 생체내에서는 대동맥의 혈관중막, 소화관, 폐 등에 존재하지만, 평활근 세포가 병적인 증식을 동반하는 질환으로서 동맥 경화, 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평활근육종 등이 알려져 있다.

먼저 동맥경화는 동맥벽의 비후, 개축, 경화, 기능저하를 나타내는 국재성의 동맥병변의 총칭으로, 병리학적으로는 세소동맥경화(micro-arteriosclerosis), 중막(media) 석회화, 죽상 동맥경화(atherosclerosis)의 3가지로 분류된다. 이 중에서도 죽상 동맥경화는 허혈성심질환이나 뇌졸중, 뇌경색의 원인이 되는 이유로 임상상 가장 중요한 문제가 되고 있다. 죽상 동맥경화가 관상동맥에 생겼을 경우, 내강을 협착하여 협심증을 야기하고 또한 죽상 동맥경화소가 파탄하면 혈전을 형성하여 불안정 협심증이나 심근경색등의 심각한 질병을 초래한다. 뇌동맥에 죽상 동맥경화가 발생한 경우에는 뇌경색 혹은 뇌내출혈을 일으키는 원인이 된다. 또한 하지(下肢) 지배 동맥(신하부대동맥에서 대퇴동맥)의 경우는 폐색성 동맥경화증을 야기한다. 이와 같이 죽상 동맥경화는 중대한 질병의 원인이 되고 있다.

죽상 동맥경화의 발생 메카니즘은 Russel Ross의“Injury to Response”설이 오늘날 널리 받아 들여지고 있다[Ross, R., Nature, 362, p 80l (1993)]. 즉 혈관의 내피세포는 상해를 받거나 혹은 고지혈증, 바이러스감염, 고혈압등의 자극을 받으면 평활근의 증식을 촉진하는 여러가지 증식인자를 생성한다. 그 결과 평활근이 증식하여 내막의 비후를 생기게 한다.

동맥경화의 내과적 치료법으로서 위험인자의 치료약으로서의 고지혈증제, 항압제의 투여, 발증원인을 억제하는 치료약으로서의 항산화제, 항혈소판제, 혈관확장제, 항응고제등의 투여가 실시되고 있는 현상이지만, 이들은 임상적으로 충분한 효과를 올리고 있다고는 말하기 어렵다.

한편, 동맥경화를 원인으로 해서 일어나는 협심증이나 심근경색증에 대하여, 근래 경피경관적 혈관형성술이나 죽종 절제술(아테레크트미), 레이저 절제술, 스텐트 유치술(stent implant) 등의 외과적 치료법이 시도되어 어느 정도의 성공을 거두고 있다. 특히, 경피경관적 혈관형성술(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty ; PTCA)은 혈류확보를 목적으로 하여 널리 이용되고 있다. PTCA는 관동맥바이패스술(CABG) 보다도 간편하고 반복해서 실행하는 것이 용이하며 고령자라도 수술후의 합병증이 적은 것 등을 이유로 협심증에 대한 근치적 치료법으로서 급속히 보급되어 요즈음에서는 협심증 치료법의 하나로서 정착하고 있다[Landau, C., N. Engl. J. Med., 330, p 981 (l994)].

그러나 이들 PTCA나 아테레크트미 등의 혈관형성술에 있어서, 과정의 개선, 기구의 개량, 새로운 방법의 개발이 시행되어 왔음에도 불구하고 여전히 중요한 문제가 미해결 상태로 남겨져 있다. 그 문제란, 수술후 3∼5개월에 25∼49%의 환자에게 보이는 재협착이다. 이 재협착은 PTCA나 CABG 등의 재치료를 필요로 하는 것이므로 환자생활에의 부담, 보험재정의 압박을 고려하면 대단히 심각한 문제이다. 재협착을 억제할 목적으로 각종 약제투여가 시행되고 있지만, 이들로서는 충분한 효과를 올리고 있다고는 말할 수 없다.

재협착의 발증기서(機序)에 대해서는 검토단계이기는 하지만, 혈관 평활근세포의 내막에 있어서의 증식이 원인인 것이 근래의 연구에서 제시되고 있다[Hanke. H. et a1., Circulation Res., 67, p65l (l990)]. 요컨대, 재협착은 밸룬 카테테르(balloon catheter) 등에 의해, 물리적으로 파괴된 혈관벽구조를 복구하기 위해 시작된 혈관 평활근세포의 증식반응에서 억제되지 않고 지나친 증식이 일어난 것에 의한 것으로 추정되고 있다. 그래서 협착부위의 평활근세포의 증식을 억제함으로써 재협착을 치료하려고 하는 시도가 행해지기 시작하였다. 예로서, 헤파린에 의한 임상시험[Ellis, S.G. et al., Am. Heart J., l17, p777 (1989)], 아스피린과 지피리다몰의 병용에 의한 임상시험[Schwartz, L. et al., N. Engl. J. Med., 3l8, p1714 (l988)] 등을 들 수 있지만, 어느 하나 재협착을 억제하는 것에 충분한 효과를 얻지 못하고 있다.

또한 허혈성심질환의 원인인 과도의 협착 혹은 폐색을 일으킨 관동맥에 대해서는, 전술의 관동맥혈관형성술 외에 자기의 다른 부위의 혈관(내흉동맥, 위대망동맥, 대복재정맥등이 주로 사용된다)을 이식하는 수술, 즉 관동맥바이패스술에 의해서 혈행을 재건하는 방법도 임상적으로 사용되고 있다. 관동맥바이패스술에 있어서도, 이식한 혈관(그래프트(graft))의 내막비후가 종종 발생하여 이식된 혈관의 내강을 협착함에 의해 혈행을 장해함으로써 임상적으로 문제시되고 있다. 이중 막비후의 형성에도 평활근 세포의 증식과 그것에 기인하는 세포외기질의 생성이 중심적인 역할을 다하고 있다고 되어 있어[Toshinobu Horie, Nippon Rinsho, 52, pl0l0 (l994)], 평활근 세포의 증식을 막는 것에 의해, 장기간에 걸쳐 그래프트의 개존성(patency)이 확보되는 것으로 기대되고 있다. 또한 관동맥 이외에도, 형성외과의 분야등에 있어서 사지의 외과적 손상 때, 손상된 혈관의 대체로서 자기혈관의 이식이 일반적으로 실행되고 있다. 이 경우에도 특히 정상혈관과의 문합부에 있어서 평활근 세포의 증식에 기인하는 내강협착이 발생하는 예가 많은 것이 알려져 있다.

또 상기와 같이 혈관을 이식할 때, 자기의 다른 부위의 혈관을 대신해서 인공적으로 제작된 혈관(이하, 인공혈관)을 대용하는 것도 실행되고 있다. 이 인공혈관은 관동맥 뿐만아니라 다른 혈관에도 이용된다. 예를 들어 사지절단후의 손상혈관의 대체, 인공투석환자에 있어서의 AV 션트술(shunt)용의 혈관의 대체등에도 사용된다. 그런데 인공혈관에 있어서도, 정상적인 혈관과의 문합부에 종종 내막비후가 생겨 혈류의 장해가 되는 것이 알려져 있다[Toshiya Shindo et al., Jinko Zoki, 22, p459(l993)]. 자기혈관, 인공혈관중 어느 하나에 있어서도 평활근 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 약제는 아직 없어 그 개발이 요망되고 있다.

또한 평활근 세포 유래의 악성 종양인 평활근육종은 자궁, 소화관에 많고 그 외에 후복막, 피하연부조직에도 발생하여 파괴적이고, 침윤성 있게 증식하고, 전이는 혈행성으로 폐에 많다. 평활근육종의 치료에서는 현재 외과적 절제와 일반적인 항암제의 투여가 병용되고 있지만, 일반적인 항암제는 부작용이 많아, 평활근 세포의 특이적 증식을 억제하는 약제의 개발이 기대되고 있다.

본 발명은 평활근 세포의 증식을 억제할 수 있는 신규의 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 펩티드를 함유하는 평활근 세포 증식을 억제하는 약제에 관한 것이다.

도 1은 전장형 TFPI 또는 C 말단영역 결손형 TFPI를 첨가하였을 때의 평활근세포 증식 억제효과를 나타낸 도면,

도 2는 3종의 TFPI의 C 말단영역 펩티드를 첨가하였을 때의 평활근세포 증식 억제효과를 나타낸 도면[펩티드 l: 인간 TFPI의 아미노산 254번의 리신으로부터 276번의 메티오닌에 해당하는 아미노산 서열을 KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM으로 나타내는 23개 아미노산 잔기의 펩티드, 펩티드 2: 인간 TFPI의 아미노산 254번의 리신으로부터 264번의 발린에 해당하는 아미노산 서열이 KTKRKRKKQRV로 나타내는 11개 아미노산 잔기의 펩티드, 펩티드 3: 인간 TFPI의 아미노산 265번의 리신으로부터 276번의 메티오닌에 해당하는 아미노산 서열이 KIAYEEIFVKNM으로 나타내는 l2개 아미노산 잔기의 펩티드].

도 3은 각종 농도의 TFPI의 C 말단영역 펩티드(펩티드 1)에 의한 평활근세포 증식 억제효과를 나타낸 도면.

도 4는 각종의 합성펩티드에 의한 평활근세포 증식 억제효과를 나타낸 도면.

[본 발명을 실시하기 위한 가장 좋은 유형]

본 발명의 펩티드는 염기성 아미노산이 풍부한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (A) 및 적어도 2 개의 연속한 소수성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (B)를 함유하여, 펩티드 (A)의 C 말단에 펩티드 (B)가 직접 또는 수개의 아미노산 서열을 개재하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드이다.

펩티드 (A)에서 염기성 아미노산으로서는, 리신(Lys 또는 K로 칭하는 경우도 있다), 아르기닌(Arg 또는 R로 칭하는 경우도 있다) 또는 히스티딘(His 또는 H로 칭하는 경우도 있다)을 들 수 있다. 펩티드 (A)에서 염기성 아미노산의 수는 예를 들어 당해 l3 개의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 경우, 적어도 4 개의 염기성 아미노산이 함유된다. 더욱이 당해 l3 개의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 있어서, 9 개의 염기성 아미노산이 포함되어 있으면 극히 뛰어난 평활근세포 증식억제능을 갖는다.

13 개의 아미노산중 9 개가 염기성 아미노산인 펩티드 (A)의 일례로서, Bal- Xal-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4 (단, Bal, Ba2, Ba3, Ba4, Ba5, Ba6, Ba7, Ba8 및 Ba9은 Lys, Arg 또는 His에서 선택되는 염기성 아미노산 ; Xal, Xa2, Xa3 및 Xa4는 임의의 아미노산)로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 또한 해당 펩티드의 염기성 아미노산의 구체적 일례로서는, Lys-Xal-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 더욱이 펩티드 (A)의 구체적 일례로서, Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile의 아미노산 서열을 들 수 있다.

한편 펩티드 (B)에서 소수성 아미노산은 하기의 아미노산으로부터 선택되는 것이다:

페닐알라닌(Phe 또는 F로 칭하는 경우도 있다), 이소로이신(Ile 또는 I로 칭하는 경우도 있다), 로이신(Leu 또는 L로 칭하는 경우도 있다), 메티오닌(Met 또는 M으로 칭하는 경우도 있다), 프롤린(Pro 또는 P로 칭하는 경우도 있다), 발린(Va1또는 V로 칭하는 경우도 있다), 트립토판(Trp 또는 W로 칭하는 경우도 있다), 및 티로신(Tyr 또는 Y로 칭하는 경우도 있다).

펩티드 (B)는 적어도 2 개의 연속한 상기의 소수성 아미노산을 함유하고 있으면 특히 한정되는 것이 아니지만, Ile-Phe를 함유하는 것이 바람직하다. 소수성 아미노산을 3 개 함유하는 경우는, Ile-Phe-Val을 함유하는 것이 바람직하다.

그리고 펩티드 (B)의 구체적 일례로서, Ile-Phe-Val-Xaa로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또 Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 함유하는 것을 들 수 있다. 해당 Xaa의 일례로서는, Lys 또는 Gln을 들 수 있다.

또한 본 발명의 펩티드의 구체적 일례로서, 조직인자 응고계 인히비터(TFPI)를 구성하는 아미노산 서열중, C 말단영역에 상응하는 아미노산의 펩티드를 들 수 있다. C 말단영역 아미노산이란, 일반적으로 쿠닛쯔 3 영역에서 카르복실 말단측(쿠닛쯔 3 영역은 포함하지 않는다)의 영역이며, 인간 TFPI 또는 토끼 TFPI의 경우, C 말단에서 37개 아미노산 잔기, 또는 쥐 TFPI의 경우, C 말단에서 30개 아미노산 잔기로 이루어지는 염기성 아미노산이 풍부한 직쇄상의 펩티드의 영역을 가리키지만, 본 발명의 목적으로 하는 평활근세포 증식을 억제하는 효과를 얻을 수 있는 한, TFPI의 C 말단영역의 아미노산 서열의 일부가 결손, 치환, 삽입, 추가 등을 한 유사체도 본 발명에 포함된다.

TFPI의 아미노산 서열에 대해서는, 인간[Wun, T.-C. et al., J. Bio1. Chem., 263, p6001(l988)], 원숭이[Kamei. S. et al., J. Biochem., 1l5, p708(1994)], 토끼[Wesselschmidt, R. L. et al., Nuc. Acids Res., 18, p6440(l990): Warn- Cramer, B. J. et al., Nuc. Acids Res., 20, p3642(1992)], 쥐[Enjyoji, K. et al., J. Biochem., l1l, p681(l992)] 등이 보고되고 있지만, 본 발명에 있어서 사용되는 C 말단영역의 펩티드는, 인간에게 투여하는 때는 면역적 거절반응을 최소로 억제하기 위해 또한 치료효과를 올리기 위해서, 인간 TFPI의 아미노산 서열을 참고로 하는 것이 바람직하다.

이 C 말단영역 아미노산 서열로서는, 인간 TFPI의 아미노산 254번의 리신으로부터 276번의 메티오닌에 해당한다. 아미노산 서열이 KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM[식중, N: 아스파라긴(Asn), E: 글루타민산(Glu), Q: 글루타민(Gln), A: 알라닌(Ala), V: 발린(Val), M: 메티오닌(Met), I: 이소로이신(Ile), F: 페닐알라닌(Phe), K: 리신(Lys), R: 아르기닌(Arg), T: 트레오닌(Thr), Y: 티로신(Tyr); 펩티드 1; 서열 번호 1]으로 나타내는 23개 아미노산 잔기의 펩티드를 일례로서 들 수 있다.

더욱이 인간 TFPI의 아미노산 253번의 이소로이신으로부터 276번의 메티오닌에 해당하는 아미노산 서열이 IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM(펩티드 20;서열 번호 20)으로 나타내는 24개 아미노산 잔기의 펩티드를 일례로서 들 수 있다.

또한 펩티드 l의 C 말단에서 3번째의 Lys를 Gln(글루타민)으로 치환한 KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVQNM(펩티드 5:서열 번호 5)은 펩티드 l 보다 더욱 뛰어난 평활근세포 증식억제능을 갖는다.

본 발명의 평활근세포 증식억제능을 갖는 펩티드를 함유하는 약제 조성물은, 평활근세포의 증식에 따르는 동맥경화, 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평활근육종의 치료 또는 예방에 유효한 약제가 될 수 있다. 해당 혈관형성술로서는, 경피경관적 혈관형성술, 죽종 절제술, 레이저 절제술, 스텐트 유치술 등을 들 수 있다.

본 발명의 펩티드 함유 약제 조성물은, 생체내에서의 반감기를 연장할 목적, 생체내에의 흡수력이나 환부국소에의 집중성을 향상시키는 목적 등, 의약품으로서의 효과를 높이기 위해서 그 일부가 화학적으로 변형된 유사체, 구체적으로는 N 말단의 아미노기나 C 말단의 카르복실기, 아미노산의 측쇄의 화학 변형체, 당이나 지질을 부가 또는 혼합한 것, 다른 화합물이나 단백질과의 융합체 등도 본 발명에 포함된다.

본 발명 펩티드의 제조방법은 특히 한정되지 않지만, 화학합성법 혹은 유전자조환기술에 의해 제조되는 것이 포함된다. 또한 어떠한 화학적 처리 또는 적당한 프로테아제를 사용하여 혈장 중에서 정제된 천연의 TFPI 또는 유전자조환기술에 의해서 제조된 TFPI에서 해당 펩티드를 절단하여(digestion) 이것을 채취, 정제하여 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 펩티드 함유 약제 조성물의 약효를 최대한으로 유지하기 위해서는 동결건조법등의 방법을 사용하여 건조한 상태로 밀봉보존하는 것이 바람직하다. 이 때 공지인 적당한 부형제 또는 안정화제와 혼합하여도 좋다.

또한 본 발명의 펩티드 함유 약제 조성물은, 안전성이 확인되는 한 고지혈증치료제, 강압제, 항산화제, 항혈소판제, 혈관확장제, 항응고제등의 다른 약제와 병용하여도 좋다.

본 발명의 펩티드를 함유하는 약제는, 약학적으로 유효한 담체등이 조합되고 적합하게 제제화되어서, 약물 분배 카테테르 등을 통해 혈관환부에 직접투여하는 방법, 스텐트나 밸룬 등의 표면에 도포하여 혈관환부에 투여하는 방법, 볼러스(bolus) 또는 연속적으로 정맥 및 동맥내에 주입하는 투여법등이 선택된다. 또한 용해하지 않고 분말을 직접 환부에 투여하는 방법, 또는 건조한 상태로 스텐트나 밸룬등의 혈관확장기구의 표면에 도포하는 방법도 선택할 수 있다. 더욱이 본 발명의 펩티드 함유 약제 조성물은, 용액상태 또는 고형상태로 경구투여하는 방법도 선택된다. 한편, 본 발명의 펩티드를 발현하기 위해 만들어진 유전자를 적당한 유전자 발현벡터로 혼입하고, 직접환부의 평활근세포에 도입하여 해당 펩티드를 환부로 과잉발현시키는 방법도 선택가능하다.

이하, 본 발명을 보다 깊게 이해하기 위해서 실시예에 따라서 설명하겠지만, 본 발명은 이들 실시예에 반드시 한정되는 것은 아니다.

이러한 상황에 있어서 본 발명자들은 동맥 경화 및 경피경관적 혈관형성술이나 다른 혈관형성술후의 재협착을 현저하게 방지하는 약제를 찾아내기 위해서 밸룬상해에 의해 제작한 혈관내막비후 모델 동물과 배양 혈관 평활근 세포를 이용하여, 재협착을 촉진시키는 중요한 인자와 그 저해인자의 검색을 시행하였다. 그 결과, 조직인자 응고계(pathway) 인히비터(TFPI)가 평활근 세포의 증식을 억제하는 완전히 신규인 작용이 있는 것을 찾아냈다(일본특허출원 평7-245548 호).

TFPI는 외인계 혈액 응고반응을 조해하는 기능을 가진 것으로 알려져 있는 생체내의 당단백질이다[Broze, G. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, p1886 (l987)]. 단백구조적으로는 일반적으로 쿠닛쯔(Kunitz) 영역으로 지칭되는 구조가 3가지 일렬로 존재하고(아미노 말단측에서 쿠닛쯔 1, 쿠닛쯔 2, 쿠닛쯔 3이라고 부른다), 더욱이 그 카르복실 말단측에 염기성 아미노산이 풍부한 영역(이하 C 말단 영역으로 부른다)을 볼 수 있다. 쿠닛쯔 1은 혈액응고인자의 하나인 활성화제 VII인자와 결합하여 그 프로테아제 활성을 중화하고 쿠닛쯔 2는 역시 혈액응고인자의 하나인 활성화제 X인자와 결합하여 그 프로테아제 활성을 중화하여, 이들의 작용에 의해 혈액응고반응을 초기의 단계에서 효과적으로 조해하고 있는 것으로 생각되고 있다. C 말단 영역은 음성 전하를 가진 글리코사미노글리칸, 특히 헤파린에 강하게 결합하는 것이 알려져 있다. 인간 TFPI는 276개의 아미노산으로 이루어져 분자량은 약 42,000이다.

본 발명자들은 TFPI의 평활근 세포 증식 억제효과에 주목하여 계속해서 검토를 거듭한 결과, (i) C 말단영역이 없는 TFPI(C 말단영역 결손형 TFPI)에는 평활근세포 증식 억제효과를 전혀 볼 수 없다는 것, (ⅱ) TFPI의 C 말단영역의 아미노산 서열과 같은 서열을 가진 합성 펩티드에 강한 효과가 인정되는 것에서, 이 평활근세포증식 억제효과는 TFPI의 C 말단영역에 의해서 얻어지고 있다는 것을 발견하였다. 그리고 더욱이, 해당 C 말단영역 펩티드의 유사체에 관해서 검토를 거듭한 결과, 염기성 아미노산이 풍부한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (A) 및 적어도 2개의 연속한 소수성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (B)를 함유하고 펩티드 (A)의 C 말단에 펩티드 (B)가 직접 또는 수개의 아미노산 서열을 개재하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드가 평활근 세포 증식 억제능을 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은, 상기 펩티드를 유효성분으로 한 평활근세포의 증식을 억제할 수 있는 신규 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 더욱 본 발명은 평활근세포의 증식에 따른 동맥경화, 경피경관적 혈관형성술이나 다른 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평활근육종을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

실시예 1. 전장형 TFPI 및 C 말단영역 결손형 TFPI의 조제

본 실시예에서 사용하는 TFPI는 Kamei et al.(특허출원 평5-188746호)이나 Enjyoji et al.[Biochemistry, 34, p5725 (l995)]에 기재한 방법에 따라서, 인간 TFPI의 cDNA를 도입한 챠이니즈 햄스터 난소 유래 세포주의 배양상징액으로부터, 항 TFPI 모노클로날 항체(HTFPI-K9(BIKOKEN KINKI l4467호))를 결합시킨 겔과 헤파린겔(Pharmacia-LKB)에 의한 친화성 크로마토그래피를 시행하여 정제하였다. 배양상징액 중에는 전장형 TFPI와 C 말단영역 결손형 TFPI가 존재하고 있지만, 헤파린겔에 의한 친화성 크로마토그래피의 용출을 염화나트륨의 농도구배 용출로 시행함에 따라서 이 양자를 분리정제할 수 있다. C 말단영역 결손형 TFPI는 0.4∼0.5 mo1/1, 전장형 TFPI은 0.8∼0.9 mol/1의 염화나트륨 농도로 용출된다. 아미노산 서열분석이나 SDS-PAGE 등의 분석결과, 이 방법으로 얻어진 전장형 TFPI는 손상안된 분자인 것이 확인되며, 한편 C 말단영역역 결손형 TFPI는 인간 TFPI의 N 말단에서부터 249번째의 아미노산인 리신과 250번째의 아미노산인 글리신 사이의 펩티드결합이 개열되어 생긴 분자, 즉 C 말단에서 27개 아미노산 잔기의 펩티드가 결실한 분자이었다.

실시예 2. 평활근세포 증식 억제작용에 있어서의 TFPI의 C 말단영역의 관여

평활근세포는 Kurabo K.K.사에서 구입한 인간 대동맥 유래 혈관평활근세포를 사용하였다. 평활근세포의 계대배양은 우태아혈청을 10% 포함하는 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(이하, DME라고 칭한다)로 시행하였다. 또 이하의 실험에는 계대수 6의 평활근세포를 사용하였다.

DME에 현탁한 평활근세포를, 5000 개/웰의 세포밀도로 48 웰 배양 플래이트(Iwaki Glass K.K.제)에 파종하여, 37℃의 CO₂인큐베이터로 배양하였다. 파종 이틀후, 50 ㎍/m1의 전장형 TFPI 또는 50 ㎍/ml의 C 말단영역 결손형 TFPI를 포함하는 DME, 대조로서는 아무것도 포함하지 않은 DME의 3종의 배지로 교환하여, 이후 이틀마다 신선한 같은 배지로 배지교환하면서 37℃의 CO₂인큐베이터안에서 배양을 계속하였다. 배지량은 웰당 O.3 m1로 하였다. 파종하여 9일후, 부착한 세포를 트립신/EDTA 용액으로 박리한 뒤, 혈구계산판을 사용하여 l 웰당의 세포수를 계측하였다. 도 l은 각 군 3웰의 세포수의 평균치와 표준편차를 그래프로 나타낸 것이다. 전장형 TFPI를 첨가한 군에서는 대조 비교해서 유의하게(스튜던트 t 검정: p<0.05) 세포수가 적고, 평활근 증식 억제효과가 나타났다. 한편, C 말단영역 결손형 TFPI에는 이 효과가 나타나고 있지 않으므로, 평활근세포의 증식을 억제하기 위해서는 TFPI의 C 말단영역이 필요하는 것을 보여주었다. 덧붙여서 말하면, 사이트톡스(Cytotox) 96 세포 독성 측정 키트(Promega사제)를 사용하여 전장형 TFPI에 세포독성이 있는지 없는지를 검토한 결과, 세포독성은 나타나지 않았으므로, 전장형 TFPI의 평활근세포 증식 억제효과는 세포독성에 의한 것은 아니었다.

실시예 3. 인간 TFPI의 C 말단영역 펩티드의 조제

TFPI의 C 말단영역의 펩티드 및 그 유사체의 평활근세포 증식 억제효과를 확인하기 위해, 이하에 나타내는 구조를 가지는 펩티드를 화학합성하였다.

펩티드 1 : 인간 TFPI의 아미노산 254번의 리신으로부터 276번의 메티오닌에 해당하는 아미노산 서열이 KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM (서열 번호 l)으로 나타내는 23개 아미노산 잔기의 펩티드.

펩티드 2 : 인간 TFPl의 아미노산 254번의 리신으로부터 264번의 발린에 해당하는 아미노산 서열이 KTKRKRKKQRV (서열 번호 2)로 나타내는 l1개 아미노산 잔기의 펩티드.

펩티드 3 : 인간 TFPI의 아미노산 265번의 리신으로부터 276번의 메티오닌에 해당하는 아미노산 서열이 KIAYEEIFVKNM (서열 번호 3)으로 나타내는 l2개 아미노산 잔기의 펩티드.

이하, 펩티드 1의 아미노산 서열의 일부가 결손, 치환, 삽입, 부가등이 행해진 펩티드를 합성하였다.

펩티드 4 :IFVKNMAYEEKTKRKRKKORVKI(서열 번호 4)

펩티드 5 : KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKQNM (서열 번호 5)

펩티드 6 : KTKRKRKKQRVKIAYEELLLKNL(서열 번호 6)

펩티드 7 : KTKRKRKKQRVKIIFVKNM (서열 번호 7)

펩티드 8 : KTKRKRKKQRVKIAYQQIFVKNM (서열 번호 8)

펩티드 9 : KTKRKRKKQRVKISFEEIFVKNM (서열 번호 9)

펩티드 10:LYKKIIKKLLESIAYEEIFVKNM (서열 번호 10)

펩티드 11:IKTKRKRKKQ (서열 번호 1l)

펩티드 12:IKTKRKRKKQRV (서열 번호 l2)

펩티드 l3:IKTKRKRKKQRVKI (서열 번호 l3)

펩티드 l4:IKTKRKRKKQRVKIAYEE (서열 번호 l4)

펩티드 l5:IKTKRKRKKQRVKIAYEEI (서열 번호 l5)

펩티드 l6:IKTKRKRKKQRVKIAYEEIF (서열 번호 l6)

펩티드 l7:IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFV (서열 번호 l7)

펩티드 l8:IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVK (서열 번호 18)

펩티드 l9:IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKN (서열 번호 l9)

펩티드 20:IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM (서열 번호 20)

또, 상기아미노산 서열중, 기호는 다음과 같이 정의된다〔A: 알라닌(Ala), E : 글리타민산(Glu), F: 페닐알라닌(Phe), I: 이소로이신(Ile), K: 리신(Lys), L: 로이신(Leu), M: 메티오닌(Met), N: 아스파라긴(Asn), Q: 글루타민(Gln), R: 아르기닌(Arg), S: 세린(Ser), T: 트레오닌(Thr), V: 발린(Val), Y: 티로신(Tyr)].

이들 펩티드의 화학합성은, 퍼킨 엘머 저팬 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Japan Applied Biosystems)사 제품 431 A 펩티드 신서사이저를 사용하여, 이 장치의 프로토콜에 따라서 FastMoc^TM고상합성법으로 실시하였다. 예를 들어, 상기 펩티드 l과 3의 합성에 있어서는, 0.25 mmo1의 Fmoc-L-Met-레진을, 펩티드 2의 합성에 있어서는 0.25 mmol의 Fmoc-L-Val-레진(모두 퍼킨 엘머 저팬 어플라이드 바이오시스템즈사 제품)을 사용하여, 펩티드의 N 말단에 대해서 순차적으로 아미노산을 결합시켰다. 그 밖의 펩티드도 동일하게 해서 제작하였다. 결합반응에 있어서, 아미노산으로서 퍼킨 엘머 저팬 어플라이드 바이오시스템즈사 제품의 Fmoc 보호 아미노산을 각각 l mmol 사용하였다. 얻어진 펩티드의 탈보호와 레진에서의 절단은 퍼킨 엘머 저팬 어플라이드 바이오시스템즈사의 프로토콜 「Introduction to Cleavage Techniques」에 기재된 방법으로 실시하였다.

다음으로, 탈보호와 레진에서의 절단을 실행한 조결정에서부터 증류수로 펩티드를 추출하여 동결건조에 의해서 조펩티드를 얻었다. 이것을 퍼킨 엘머 저팬 어플라이드 바이오시스템즈사 제품 Brownlee 역상 칼럼(직경 10 mm, 길이 250 mm)을 사용하고, 0.1% 트리플오로초산용액과 0.09% 트리플오로초산을 포함하는 70% 아세토니트릴 용액으로 농도 구배(0→100%)로 정제하였다.

실시예 4. 인간 TFPI의 C 말단영역 펩티드에 의한 평활근세포 증식 억제작용

실시예 2와 같이 세포를 파종하여, 파종 이틀후 각 농도의 C 말단영역 펩티드를 첨가한 DME로 교환하여 같은 배지에서의 배지교환을 이틀마다 실행하면서 37℃의 CO₂인큐베이터안에서 배양하였다. 배지량은 웰당 0.3 ml로 하여, 대조로서 아무것도 포함하지 않은 DME를 사용하였다. 파종하여 9일후, 실시예 2와 같이 1 웰당의 세포수를 계측하였다. 도 2는 각 군 3웰의 세포수의 평균치와 표준편차를 그래프로 하여 나타낸 것이다. 인간 TFPI의 C 말단측 23개 아미노산 잔기에 해당하는 펩티드 l을 20 ㎍/ml 첨가한 군에서는 대조와 비교해서 유의하게(스튜던트 t 검정: p<0.05) 세포수가 적었다. 따라서 펩티드 l 단독으로 유효한 평활근 증식억제제가 될 수 있는 것이 확인되었다.

한편, 펩티드 l의 N 말단측 ll 개 아미노산에 해당하는 펩티드 2 및 펩티드 l의 C 말단측 l2개 아미노산에 해당하는 펩티드 3은 20 ㎍/m1 첨가하여도 전혀 증식억제효과가 나타나지 않았다. 이들 사실로부터 펩티드 2 혹은 그 일부의 아미노산 서열과, 펩티드 3 혹은 그 일부의 아미노산 서열의 양자가 동일분자중에 공존하여 처음으로 평활근세포 증식 억제효과가 발휘되는 것으로 추측되었다.

실시예 5. 펩티드 l의 농도의존적 평활근세포 증식 억제효과

평활근세포는 쿠라보사에서 구입한 인간 대동맥 유래 혈관평활근세포를 사용하였다. 배지는 염기성 섬유 아세포증식인자(bFGF), 상피세포증식인자(EGF), 인슐린, 5% 우태아 혈청을 포함한 크라보사제 Humedia-SG 배지를 사용하였다. 또 이하의 실험에는 계대수 6의 평활근세포를 사용하였다.

Humedia-SG에 현탁한 세포를, 2500 개/웰의 세포밀도로 48 웰 배양플래이트(이와키 글라스 가부시키가이샤사 제품)에 파종하여, 37℃의 CO₂인큐베이터로 배양하였다. 파종 다음날, 각 농도의 펩티드 l을 포함한 Humedia-SG 배지에 교환(1웰당의 배지량0.3ml)하고, 이후 이틀마다 신선한 이 배지로 교환하면서 37℃에서 배양을 계속하였다. 파종해서 9일후, 실시예 2와 같이 l 웰당의 세포수를 계측하였다. 도 3은 각 군 4웰의 세포수의 평균치와 표준편차를 그래프로 하여 나타낸 것이다.

펩티드 l은 배지 중의 농도로 약 3∼5 μM 이상 존재하면 유의한 평활근세포증식 억제작용을 발휘하는 것이 뚜렸해 졌다. 단지, 본검토에 있어서는 지극히 증식인자가 풍부한 배지를 사용하고 있고, 일반적으로 평활근세포 증식용 배지로서 종종 사용되는 10% FCS 함유 DME 등을 사용한 경우나, 실제로 생체내에 투여한 경우에 있어서는 보다 적은 량으로 유의한 평활근세포 증식 억제효과를 발휘할 수 있는 가능성이 있다.

실시예 6. 각종 펩티드에 의한 평활근세포 증식 억제효과

실시예 5와 같이 세포를 파종하여, 다음날 최종 농도 20 μM가 되도록 실시예 3에서 제작한 각종 펩티드를 첨가한 Humedia-SG 배지로 배지교환하여 37℃로 배양을 계속하였다. 파종하여 10일후, 실시예 2와 같이 l 웰당의 세포수를 계측하였다. 도 4는 각 군 4웰의 세포수의 평균치와 표준편차를 그래프로 나타낸 것이다. 더구나 모든 펩티드를 첨가한 군에 있어서도 사세포율은 전체의 5% 이하였다.

그래프중에 나타내고 있는 사실로부터 이하의 결론에 다다르게 된다.

(1) 펩티드 1과 펩티드 2 + 3과의 비교

펩티드 2 + 3는, 펩티드 l의 N 말단측 l1 개 잔기에 해당하는 펩티드 2와 펩티드 l의 C 말단측 12 개 잔기에 해당하는 펩티드 3의 동일량 혼합물(각 20 μM)인 C 펩티드 l이 평활근세포의 증식을 더없이 강하게 억제하고 있는 데 대하여, 펩티드 2 + 3는 전혀 증식억제효과는 보이지 않았다. 이 결과로부터 평활근세포 증식억제효과를 발휘하기 위해서는 펩티드 2 중에 존재하는 특정한 아미노산 서열과, 펩티드중에 존재하는 특정한 아미노산 서열의 양자가 동일분자중에 존재하는 것이 필수적이라는 것이 뚜렸해 졌다.

(2) 펩티드 l과 펩티드 7∼9와의 비교

펩티드 7, 8, 9는 펩티드 l의 N 말단에서 세어서 l4번째의 아미노산 Ala에서 l7번째의 아미노산 Glu에 이르기까지의 4 개 잔기의 영역(Ala-Tyr-Glu-Glu)이 결실 또는 아미노산이 치환된 변형체이다. 이 영역을 결실 또는 임의의 아미노산으로 치환하더라도 펩티드 l과 같은 증식 억제효과를 갖는 것에서 펩티드 l의 N 말단측 l3 개의 아미노산 서열 및 C 말단측 6 개의 아미노산 서열이 평활근세포 증식억제에 밀접히 관여하고 있는 것이 분명해졌다.

(3) 펩티드 l과 펩티드 4와의 비교

펩티드 4는 펩티드 l의 N 말단측의 염기성 아미노산이 풍부한 l3 개의 아미노산 서열을 C 말단에, 그리고 소수성 아미노산이 많이 포함되는 C 말단측 6 개의 아미노산 서열을 N 말단에 배치한 펩티드이다. 이 펩티드 4에는 전혀 평활근세포 증식 억제효과가 인정되지 않은 것에서 염기성 아미노산이 풍부한 영역을 N 말단측에, 그 C 말단측에 소수성 아미노산이 풍부한 영역을 배치하는 것이 필수요건인 것이 분명해졌다.

(4) 펩티드 l과 펩티드 10과의 비교

펩티드 l0은, 펩티드 l의 N 말단측에 존재하는 염기성 아미노산이 풍부한 영역의 아미노산 서열을 염기성 아미노산의 함유량이 보다 적게 되도록 설계된 펩티드이다. 구체적으로는, 펩티드 l의 N 말단측 l2 개 아미노산을 혈소판 제4인자의 헤파린 결합부위인 LYKKIIKKLLES로 치환된 것이다. 펩티드 l에 있어서는, 염기성 아미노산이 풍부한 N 말단측 13 개 아미노산의 영역중, 염기성 아미노산은 9 개 존재하지만, 펩티드 l0에 있어서는 4 개이다. 염기성 아미노산을 4 개로 줄이는 것에 의해 펩티드 l과 비교해서 평활근세포 증식 억제효과는 크게 감소하지만, 그래도 역시 대조군에 비교하여 통계학적으로 유의한 평활근세포 증식 억제효과를 갖고 있는 것이 나타난다(스튜던트 t 검정에 의함. 위험율 5% 이내). 따라서, 염기성이 풍부한 영역에는 아미노산 13 개 중 적어도 4 개 이상의 염기성 아미노산이 포함되는 것이 필요하는 것이 분명해졌다.

(5) 펩티드 1과 펩티드 6와의 비교

펩티드 6는, 펩티드 1의 C 말단측 6 개 잔기의 영역(Ile-Phe-Val-Lvs- Asn-Met)내의 소수성 아미노산 Ile, Phe, Val, Met이, 다른 소수성 아미노산인 로이신(Leu)으로 치환된 펩티드이다. 펩티드 l에 비해서 증식 억제효과는 1/3 정도 감소하였지만, 오히려 강한 증식 억제효과를 갖고 있다는 것이 나타났다. 이 사실로부터, 펩티드의 C 말단측의 소수성 아미노산은 펩티드 1의 아미노산 서열에만 한정되는 것이 아니라, 임의의 소수성 아미노산으로 치환할 수 있는 것, 더욱이 해당 C 말단측의 소수성 아미노산이 평활근세포 증식 억제효과에 중요한 역할을 수행하고 있는 것이 분명해졌다.

(6) 펩티드 l과 펩티드 11∼20과의 비교

펩티드 20는, 펩티드 l의 N 말단에 소수성 아미노산인 Ile가 부가된 펩티드이다. 이 1 개의 아미노산의 부가에 의해, 펩티드 l에서 보인 증식 억제효과가 더한층 높아지는 것에서, 보다 강한 평활근세포 증식 억제효과를 가지는 펩티드를 설계하는 경우에는, 염기성이 풍부한 영역의 N 말단에 Ile등의 소수성 아미노산을 적어도 1개 부가하는 것이 바람직하다.

펩티드 11∼l9는, 펩티드 20의 C 말단의 아미노산을 여러개 결손시킨 펩티드이다. 상세하게는 펩티드 19∼14는 펩티드 20에서 1 개 잔기씩 아미노산을 결실시키고 있었던 형의 펩티드이고, 또한 펩티드 l3∼ll은 펩티드 l4에서 더욱 C 말단을 각각 4 개 잔기, 6 개 잔기, 8 개 잔기 결실시킨 펩티드이다. 이들을 비교검토한 결과, 펩티드 20에서 C 말단을 4 개 잔기 결실시킨 펩티드 16은 강한 증식 억제효과를 갖고 있지만, 5 개 잔기를 결실시킨 펩티드 l5는 거의 그 효과가 없어지는 것이 확인되었다.

(i) 상기 (2)의 검토 결과로부터, 펩티드 1의 N 말단에서 세어 l4번째의 아미노산 Ala에서 l7번째의 아미노산 Glu에 이르기까지의 4개 잔기의 영역(Ala-Tyr- Glu-Glu)은 증식 억제효과에 전혀 기여하고 있지 않는 것과 또한, (ii) 상기 (5)의 검토 결과로부터, 펩티드 l의 C 말단측 6 개 아미노산 중의 소수성 아미노산이 평활근세포 증식 억제에서 중요한 역할을 수행하고 있는 것에서, C 말단측에 적어도 2 개 연속한 소수성 아미노산이 존재하는 것을 필요로 하는 것이 분명해졌다.

(7) 펩티드 1과 펩티드 5와의 비교

펩티드 5는, 펩티드 1의 C 말단에서 3 번째에 존재하는 염기성 아미노산인 Lys를 비친수성의 아미노산인 Gln으로 변형시킨 펩티드이다. 이 아미노산 치환에 의해서, 펩티드 l의 증식억제효과는 더욱 높아졌다. 즉 뛰어난 평활근 증식 억제효과를 발휘하기 위해서는, 펩티드 1의 C 말단에서 3 번째에 존재하는 Lys를 Gln으로 치환하는 것이 바람직하다.

본 발명의 펩티드는 뛰어난 평활근세포 증식 억제효과를 갖고 있고, 평활근세포의 증식에 따르는 병적상태, 예를 들어 동맥경화, 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평활근육종의 예방 또는 치료제로서 유효하다. 본 발명의 펩티드를 사용하여 해당 약제를 제조하는 경우, 이하와 같은 이점을 얻을 수 있다.

(i) 인간혈장을 원료로서, 혹은 유전자조환기술을 이용하여 생산할 필요가 없고, 화학합성법에 의해서 염가로 대량 합성할 수가 있다. 또한 인간혈장이나 유전자조환에 사용하는 숙주에 연유되는 병원체의 혼입의 위험성이 없고, 지극히 안전한 제제를 제조할 수가 있다.

(ⅱ) 본 발명의 펩티드를, 평활근세포 증식 억제효과만을 가지는 펩티드로 구성함으로써, 그 밖의 영역에 기인하는 불필요한 생리적 작용이나 미지의 부작용을 배제할 수 있으며, 보다 고농도·대량투여가 가능해진다. 예를 들어, TFPI 전장의 분자를 투여한 경우에 발생한다고 예상되는 출혈성의 부작용을 배제하는 것이 가능하다.

(ⅲ) 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 적시 변형시키는 것에 의해, 혹은 적당한 화학 변형기술 등을 이용하여, 보다 효과가 높은 약제를 창제할 수 있다. 또한 경구투여가능한 약제로서 제제화하는 등, 투여법의 선택범위를 넓히는 것이 가능해진다.

서열 번호 : 1

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu

255 260 265

Glu Ile Phe Val Lys Ans Met

270 275

서열 번호 : 2

서열의 길이 : 1l

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수: 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val

255 260

서열 번호 : 3

서열의 길이: 12

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

265 270 275

서열 번호 : 4

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Ile Phe Val Lys Asn Met Ala Tyr Glu Glu Lys Thr Lys Arg Lys Arg

1 5 10 15

Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile

20

서열 번호 : 5

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

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서열의 종류 : 펩티드

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu

1 5 10 15

Glu Ile Phe Val Gln Asn Met

20

서열 번호 : 6

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu

1 5 10 15

Glu Leu Leu Leu Lys Asn Leu

20

서열 번호 : 7

서열의 길이 : l9

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수: 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ile Phe Val

1 5 10 15

Lys Asn Met

서열 번호 : 8

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Gln

1 5 l0 15

Gln Ile Phe Val Lys Asn Met

20

서열 번호 : 9

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ser Phe Glu

1 5 l0 l5

Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

20

서열 번호 : l0

서열의 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

서열

Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ile Ala Tyr Glu

1 5 l0 15

Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

20

서열 번호 : l1

서열의 길이 : l0

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln

255 260

서열 번호 : 12

서열의 길이 : l2

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Va1

255 260

서열 번호 : 13

서열의 길이 : l4

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile

255 260 265

서열 번호 : 14

서열이 길이 : 18

서열의 타입 : 아미노산

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토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys G1n Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu

270

서열 번호 : 15

서열의 길이 : l9

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile

270

서열 번호 : l6

서열의 길이 : 20

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile Phe

270

서열 번호 : 17

서열의 길이 : 2l

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수: 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile Phe Va1

270

서열 번호 : l8

서열의 길이 : 22

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys G1n Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile Phe Val Lys

270

서열 번호 : 19

서열이 길이 : 23

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn

270 275

서열 번호 : 20

서열의 길이 : 24

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

기원 인간 조직인자 응고계 인히비터

서열

Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

255 260 265

Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

270 275

Claims

염기성 아미노산이 풍부한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (A) 및 적어도 2개의 연속 소수성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (B)를 함유하여, 펩티드 (A)의 C 말단에 펩티드 (B)가 직접 또는 수개의 아미노산 서열을 개재하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (A) 중의 염기성 아미노산이 리신(Lys 또는 K로 칭하는 일도 있다), 아르기닌(Arg 또는 R로 칭하는 일도 있다) 또는 히스티딘(His 또는 H로 칭하는 일도 있다)으로 부터 선택되는 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (A)가 l3 개의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 중 4 개 이상이 염기성 아미노산인 펩티드.
제 3 항에 있어서, l3 개의 아미노산 서열 중 9 개가 염기성 아미노산인 펩티드.
제 1 또는 4 항에 있어서, l3 개의 아미노산 서열이, Bal-Xal-Ba2- Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4이며, 여기서 Bal, Ba2, Ba3, Ba4, Ba5, Ba6, Ba7, Ba8 및 Ba9는 Lys, Arg 및 His 중에서 선택되는 염기성 아미노산이며, Xal, Xa2, Xa3 및 Xa4는 임의의 아미노산인 펩티드.
제 5 항에 있어서, l3 개의 아미노산 서열이, Lys-Xal-Lys-Arg-Lys-Arg- Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4인 펩티드.
제 6 항에 있어서, 13 개의 아미노산 서열이, Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (B)에서 적어도 2개의 연속 소수성 아미노산이 하기의 아미노산 중에서 선택되는 펩티드:

페닐알라닌(Phe 또는 F로 칭하는 일도 있다)

이소로이신(Ile 또는 I로 칭하는 일도 있다)

로이신(Leu 또는 L로 칭하는 일도 있다)

메티오닌(Met 또는 M으로 칭하는 일도 있다)

프롤린(Pro 또는 P로 칭하는 일도 있다)

발린(Val 또는 V로 칭하는 일도 있다)

트립토판(Trp 또는 W로 칭하는 일도 있다) 또는

티로신(Tyr 또는 Y로 칭하는 일도 있다).
제 1 또는 8 항에 있어서, 펩티드 (B)에서 적어도 2개의 연속 소수성 아미노산이 Ile-Phe인 펩티드.
제 1, 8 또는 9 항에 있어서, 펩티드 (B)에서 적어도 2개의 연속 소수성 아미노산이 Ile-Phe-Val인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (B)의 아미노산 서열이 Ile-Phe-Val-Xaa인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (B)의 아미노산 서열이 Ile-Phe-Val-Xaa-Asn인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드 (B)의 아미노산 서열이 Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met인 펩티드.
제 11 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa가 Lys인 펩티드.
제 11 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa가 Gln인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열이 조직인자 응고계 인히비터(TFPI)의 C 말단영역인 펩티드.
제 16 항에 있어서, C 말단영역이 TFPI 중에서 N 말단 내지 적어도 쿠닛쯔 3까지의 아미노산 서열이 제거된 나머지의 C 말단 아미노산 서열인 펩티드.
제 16 또는 17 항에 있어서, C 말단영역이 서열 번호 l의 아미노산 서열인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호 5인 펩티드.
제 1 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호 20인 펩티드.
제 1 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 평활근 세포 증식 억제능을 가진 펩티드.
제 1 내지 21 항 중 어느 한 항의 펩티드를 함유하는 평활근 세포 증식을 억제하는 약제 조성물.
제 1 항 내지 21 항 중 어느 한 항의 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 평활근 세포의 증식에 따르는 동맥 경화, 혈관형성술후의 재협착, 혈관이식후의 내강협착 및 평활근육종의 치료 또는 예방에 유효한 약제.
제 23 항에 있어서, 혈관형성술이 경피경관적 혈관형성술, 죽종 절제술, 레이저 절제술, 스텐트 유치술 중 어느 하나인 약제.
제 23 또는 24 항에 있어서, 혈관형성술이 경피경관적 혈관형성술인 약제.