KR19990008444A - 전립선 암을 진단하는 방법 - Google Patents
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Abstract
포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법이 기술된다. 포유동물로부터 분리된 혈청이 제공된다. PSA가 상기 혈청에 첨가되고, 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 기초하여 포유동물이 전립선 암을 가지고 있는지가 결정된다. PSA와의 안정한 복합체를 형성할 수 있는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태도 또한 기술된다.
Description
본 발명의 목적은 전립선 암을 진단하기 위한 안전하고, 정확하며, 쉬운 테스트법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전립선 암 및 양성 전립선 증식증을 구별할 수 있는 전립선 암에 대한 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 전립선 암의 비-외과적 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 환자로부터 얻은 혈청을 검정함으로써 전립선 암에 대한 테스트법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 전립선 암의 진행을 모니터화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 전립선 암에 대한 치료 효과를 모니터화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 라디칼 전립선절제술 (radical prostatectomy) 후의 잔여 전립선 암의 존재에 대한 검정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 환자의 혈청에서 전립선 암 특이성 ACT 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전립선 암에 대한 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 PSA를 첨가하여, 형성된 PSA-ACT 복합체 (complex)의 양을 측정함으로써 전립선 암 특이성 ACT 수준을 검정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 포유동물에서 전립선 암을 진단하는 방법이 제공된다. 상기 포유동물로부터 혈청이 제공된다. PSA가 상기 혈청에 첨가되고, 형성된 ACT-PSA 복합체의 양은 예를 들면, Superdex 또는 Sephacryl의 크로마토그래피 (chromatography), 전기영동 (electrophoresis), 모세관 (capillary) 전기영동, 고체상 친화도 (solid phase affinity) 또는 예를 들면, 상기 PSA 또는 ACT에 대한 모노클로날 (monoclonal) 또는 폴리클로날 (polyclonal) 항체를 이용한 면역검정법 (immunoassay)에 의해 측정된다. (지금까지, 상기 PSA-ACT 복합체에 대한 유용한 모노클로날 항체는 없다. 그러나, 유용하게 될 때, 상기 검정법에 사용가능할 것이다.) 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 기초하여 상기 포유동물이 전립선 암을 갖는지가 결정된다.
한 실시예에서, 상기 PSA는 ACT-PSA 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 PSA에 결합할 수 있는 실질적으로 모든 ACT에 결합하기에 충분한 양으로 첨가되며, 상기 양은 적어도 약 500 ng/ml 내지 약 2000 ng/ml이며, 바람직하게는 약 1000 ng/ml 내지 약 2000 ng/ml이다. 바람직하게, 상기 ACT-PSA 복합체 형성은 예를 들면, 약 32℃부터 약 37℃까지의 온도에서, 예를 들면, 약 2 시간 내지 약 4 시간동안 진행된다. 상기 방법의 변형은 상기 혈청에 PSA를 첨가하기 전에 상기 혈청을 세분 (fractionating)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 전립선 암 혈청을 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청과 구별하는 방법을 제공하는 것이다. 전립선 암 혈청, 양성 전립선 증식증 혈청, 정상 혈청 및 테스트 혈청이 제공된다. 상기 혈청 각각에 PSA가 첨가된다. 각각의 상기 혈청과 함께 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 테스트 혈청이 전립선 암 혈청, 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청인지가 결정된다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 ACT의 전립선 암 특이적 형태를 측정하는 방법을 제공하는 것이다. ACT의 테스트 시료가 제공된다. 상기 ACT는 PSA와 접촉되고, 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 테스트 시료의 ACT가 전립선 암 특이성 ACT인지를 결정한다.
본 발명의 여전히 또다른 목적은 바람직하게 약 32℃부터 약 37℃까지의 온도에서, 바람직하게 약 2 시간 내지 약 4 시간 동안 PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있는 ACT의 분리된 암 특이적 형태를 제공하는 것이다. 상기 ACT는 약 60-66 kDa의 분자량을 가지며, 공지의 정상 서열의 변종이다 (챤드라 등 (Chandra et al.), 1983; 힐 등 (Hill et al.), 1984; 루빈 등 (Rubin et al.), 1990을 참조하라).
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 더 잘 이해하게 될 것이다.
본 발명은 전립선 암 (prostate cancer)을 진단하고, α1-안티키모트립신 (antichymotripsin, ACT)의 전립선 암 특이적 형태를 측정하는 방법에 관한 것이다.
전립선 암은 널리 알려진 의학적 질병이다. 전립선 암의 조직학적 증거에 따르면 50세 이상의 남성의 약 30-40%에서 발생하지만, 단지 약 9%의 남성만이 전립선 암의 임상 신호 또는 증상을 보이며, 매해 3%가 이 질병으로 죽는다 (Chirarodo, 1991). 종종 조기 예후 (prognosis)는 환자의 수명을 연장시킬 수 있다. 그러나, 전립선 암의 진단 및 모니터화 (monitoring)는 문제가 있다. 이제까지 사용되어 온 하나의 방법은 환자의 혈청내의 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen, PSA)의 양을 측정하는 것으로, PSA의 증가된 수준과 전립선 암의 발현 사이에 약간의 상호관련성을 보이는 것에 기초한다. 그러나, 상기 혈청 PSA 측정법의 장점은 상기 테스트 (test)의 오히려 낮은 특이성 때문에 논쟁의 여지가 있다. 릴자 등 (Lilja et al.)의 Cancer Supplement 70(1):230-234 (1992). PSA는 암의 전립선의 선 (gland)에서 뿐만 아니라, 정상적인 전립선의 선에서 발현되는 것으로 나타났다. 게다가, PSA의 증가된 수준은 전립선 암의 존재의 증가된 가능성을 나타내는 한, 상기 증가된 수준은 또한 양성의 전립선 증식증 및 다른 양성의 비뇨기적 질병이 있는 환자에서 높은 퍼센트로 발견된다. 전립선 암 및 양성 전립선 증식증 사이의 다소 개선된 구별법은 환자의 혈청내에 존재하는 PSA-ACT (α1-안티키모트립신) 복합체의 수준이 PSA 수준 단독으로 측정되는 것보다 더 측정되는지로 보고되어 왔다. 스텐만 등 (Stenman et al.)의 Cancer Res. 51:222-261 (1991), 릴자 등의 Clin. Chem. 37:1618-1625 (1991); 크리스텐슨 (Christensson et al.)의 J. Urology 150:100-105 (1993). 그러나, 이러한 방법들 역시 전립선 암에 대해 그렇게 특이적이지 않다. 이에, 전립선 암과 양성 전립선 증식증을 구별할 수 있는 정확한 진단 방법이 요구되고 있다.
도 1 내지 3은 각각, 전립선 암, BPH 및 정상 환자로부터 얻은 혈청내의 부가된 PSA의 용출 프로필 (elution proflie)이다.
본 발명은 포유동물에서 전립선 암을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물로부터 혈청이 제공된다. 상기 혈청에 PSA이 첨가되며, 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 기초하여 포유동물이 전립선 암인지가 결정된다.
전립선 암은 남성에게 영향을 주는 질병이다. 이것은 선암종 (adeno-carcinoma), 미분화된 전립선암종 (prostatic carcinoma), 편평 세포암종 (squamous cell carcinoma) 및 관 전이성암종 (ductal transitional carcinoma)를 포함하는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 전립선 암 진단은 예를 들면, 상기 질병의 존재를 진단하는 단계, 상기 질병의 진행을 모니터화하는 단계, 투여된 치료제의 효과를 모니터화하는 단계, 진정 (remission) 또는 외과술 후의 재발을 모니터화하는 단계, 및 예를 들면, 라디칼 전립선절제술과 같은 외과적 치료 후의 어떠한 잔존 전립선 암을 모니터화하는 단계를 포함한다. 포유동물은 인간이 아닌 포유동물뿐만 아니라 인간도 의미한다.
혈청은 예를 들면, 전체 혈액 혈청, 및 세포질 (plasma) 또는 조직 추출물을 포함한다. 사용된 상기 혈청은 처리되지 않은 혈청일 수 있거나 혹은 예를 들면, 알부민 (albumin), 유리 (free) PSA와 같은 어떠한 성분이 제거된 분별된 혈청 또는 소듐 아자이드 (sodium azide) 항생제와 같은 어떠한 물질이 첨가된 혈청으로 처리된 혈청일 수 있다. 상기 혈청은 α1-안티키모트립신 (ACT)를 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다.
PSA는 전립선 특이적 항원이다 (왕 등 (Wang et al), 1982). 이는 33 킬로달톤 (kilodalton)의 세린 프로테이나아제 (serine proteinase)의 활성 또는 불활성 전구체 (지모젠 (zymogen))일 수 있다. PSA는 전립선 분비상피 (secretory epithelium)내에서 생성된 단일 사슬 당단백질 (glycoprotein)이다. 본 발명에 사용된 PSA는 예를 들면 정액 (seminal fluid), 혈액 또는 전립선 조직과 같은 신체로부터 분리될 수 있거나, 또는 예를 들면, 화학적으로 또는 이 분야에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 재조합 DNA (recombinant DNA) 기술에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 바람직하게도, 사용된 PSA는 실질적으로 순수하고, 효소학적으로 활성 (적어도 40%)이 있다.
상기 PSA는 ACT와 접촉될 때, ACT-PSA 복합체를 형성할 수 있어야 한다. 바람직하게, 상기 PSA는 ACT-PSA 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 테스트되는 혈청내에 존재하는 실질적으로 모든 ACT에 결합하기에 충분한 양으로 첨가된다. 상기 PSA는 혈청내에 존재하는 ACT의 양을 약 4배 내지 약 8배 초과하는 양으로 첨가되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, PSA는 약 5배 내지 약 6배의 양으로 초과하여 첨가된다. 한 실시예에서, 상기 PSA는 적어도 약 0.5㎍/ml 내지 2㎍/ml의 양으로 첨가되며, 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 1.5㎍/ml의 양으로 첨가된다.
ACT-PSA 복합체 형성을 가능하게 하는 조건은 적절한 온도, 시간, 쉐이킹 (shaking) 및 반응 혼합물내의 Tris, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 또는 그 유사체가 존재하지 않아야 한다. PSA는 상기 혈청에 첨가될 수 있고, 예를 들면 약 32℃ 내지 약 37℃의 온도에서, 바람직하게 약 35℃ 내지 37℃의 온도에서 ACT-PSA 복합체를 형성하게 된다. 한 실시예에서, 예를 들면 약 32℃ 내지 약 34℃에서, 그리고 약 23℃ 내지 약 25℃, 그 다음으로 약 3℃ 내지 약 5℃로 연속적으로 다른 온도범위가 이용된다. 바람직하게, 초기 온도는 약 32℃이고, 그후 상기 온도는 약 23℃로 된 후, 약 4℃로 된다. 바람직하게, 상기 ACT-PSA 복합체 형성이 완성된다. 한 실시예에서, 상기 복합체 형성은 약 50 시간 내지 약 60 시간동안 진행된다. 복합체 형성은 시료가 쉐이킹되는 조건, 정치되는 조건 또는 연속적으로 쉐이킹되고 정치되는 조건하에서 진행될 수 있다. 바람직한 순서는 정치된 후, 쉐이킹되는 것이다. 한 바람직한 실시예에서, PSA 및 혈청의 혼합물은 쉐이킹없이 32℃에서 약 2 시간 동안 인큐베이션 (incubation)된 후, 4℃에서 약 48 시간 동안 쉐이킹된다.
형성된 ACT-PSA 복합체의 양은 예를 들면, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 (centrifugation), 고체상 친화도, 면역검정법 또는 웨스턴 블랏 (Western blots)의 농도분석 (densitometry)과 같은, 상기 복합체를 측정하기 위한 분야의 당업자에게 공지된 어떤 검정법에 의해서도 측정된다. 크로마토그래피의 바람직한 형태는, 예를 들면, Superdex, Sephacryl 같은 분자체 (molecular sieve) 크로마토그래피와 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. Superdex 크로마토그래피를 이용한 실시예인 실시예 1을 참고하라. 면역검정법은 예를 들면, PSA 또는 ACT 또는 PSA-ACT 복합체에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 면역검정법은 면역형광 (immunofluorometric) 검정법, 화학발광 (chemiluminescent) 검정법 및 RIA이다 (레이노넨 등 (Leinonen et al.), 1993; 쥬 등 (Zhou et al), 1993). 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 기초하여, 포유동물이 전립선 암을 갖고 있는지가 결정된다. 전립선 암 혈청은 비-전립선 암 혈청보다 ACT-PSA 복합체 수준이 더 높다.
또한 본 발명은 전립선 암 혈청을 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청과 구별하는 방법을 포함한다. 전립선 암 혈청, 양성 전립선 증식증 혈청, 정상 혈청 및 테스트 혈청이 제공된다. 상기 혈청 각각에 PSA가 첨가된다. 각 혈청과 함께 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 테스트 혈청이 전립선 암 혈청, 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 전립선 혈청인지가 결정된다.
상기 테스트 혈청내에 존재하는 혈청 형태의 결정은 형성된 ACT-PSA 복합체의 양의 함수이다. 만일 테스트 혈청이 전립선 암 혈청이라면, 높은 수준이 형성되는 반면, 만일 테스트 혈청이 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청이라면, 낮거나 무시할만한 수준으로 형성된다.
본 발명은 ACT의 전립선 암 특이적 형태를 측정하는 방법을 제공한다. ACT의 테스트 시료가 제공된다. 상기 ACT는 PSA와 접촉되고, 형성된 ACT-PSA 복합체의 양이 측정된다. 형성된 상기 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 테스트의 ACT가 전립선 암 특이적 ACT인지의 여부가 결정된다.
전립선 암 특이적 ACT는 전립선 암을 갖는 포유동물에 의해 생성되는 ACT의 형태이다. 전립선 암 특이적 ACT는 예를 들면, 양성 전립선 증식증 ACT 또는 정상 ACT와 같은 비-전립선 암 특이적 ACT와 비교하여 PSA와 안정한 복합체를 더욱 형성할 수 있다.
또 다른 면에서, 본 발명은 ACT의 분리된 암 특이적 형태를 포함한다. 바람직하게, 상기 ACT는 예를 들면, 전립선 암이 있는 환자로부터, 예를 들면, 그 환자의 혈청으로부터 분리된다. 상기 ACT는 또한 화학적으로 또는 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 재조합 DNA법에 의해 합성될 수 있다. ACT의 상기 특이적 형태는 공지의 서열의 변종이다 (공지의 서열에 대하여, 챤드라 등, 1983; 힐 등, 1984; 루빈 등, 1990을 참조하라). PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있는 ACT 형태는 변종으로 의미된다. ACT의 상기 특이적인 형태는 약 60 내지 66 kDa의 분자량을 갖는다. ACT의 상기 특이적인 형태는 PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있다. 상기 복합체들은 약 32℃ 내지 약 37℃의 온도에서, 약 4 시간 내지 약 8 시간동안 바람직하게 형성된다. 상기 ACT-PSA 복합체는 수성 매체에 용해되고, 100℃에서 SDS 처리에 안정하다.
실시예 1:정상, 양성 전립선 증식증 및 전립선 암 환자로부터 얻은 혈청들에 존재하는 ACT-PSA 복합체의 양을 결정하는 방법
본 실시예는 PSA가 전립선 암 환자로부터 얻은 혈청의 ACT와 복합체를 형성하나, 정상 또는 양성 전립선 증식증 환자로부터 얻은 혈청에서는 복합체의 어떠한 의미있는 양도 형성되지 않는다는 것을 설명한다.
인산염 완충 살린 용액으로 묽힌 20 μL의 순수한 유리 PSA 용액 (1㎍/20μL) (스탠포드 대학교로부터 얻은 기준 물질로 Sensabaugh 및 Blake 법 (1990)을 이용하여 토마스 스태미 (Thomas Stamey) 교수의 실험실에서 정제됨)은 다음 각각의 1 mL에 첨가되었다:
(1) 6% BSA-PBS 완충액 (탈이온수 6% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA), 50mM 디소듐 포스페이트 (disodium phosphate), 150mM 염화 나트륨 (sodium chloride), 0.1% 소듐 아자이드 (sodium azide)가 용해됨. pH 7.4, 0.2μ필터 (filter)시킴);
(2) 정상 여성 혈청 (스크린 (screen)된 건강한 혈액 기증자로부터 얻음);
(3) 정상 남성 혈청 (스크린된 건강한 혈액 기증자로부터 얻음);
(4) 양성 전립선 증식증 (BPH) 환자 혈청 (텍사스, 하우스톤의 MD Anderson Cancer Center로부터 얻음);
(5) 전립선 암 (PCa) 환자 혈청 (텍사스, 하우스톤의 MD Anderson Cancer Center로부터 얻음).
PSA의 첨가 전에, 500 μL의 PCa 환자 혈청은 Superdex 칼럼 (column)을 통하여 분별되었다. Superdex 200 (Pharmacia, Sweden) 칼럼 (90×1.5cms)은 용출 완충액으로 평형화되고, 전개 사이에 상기 칼럼은 0.25N 수산화 나트륨 용액을 상기 칼럼에 통과시킴으로써 세척되었다. 정상 남성, 정상 여성 및 BPH 환자로부터 분리된 혈청들은 상기 PSA 첨가 전에는 분별되지 않았는데, 이는 정상 남성 및 BPH 환자 혈청내의 전체 PSA가 각각 1.13 및 0.08 ng/mL이기 때문이었다. 분획 후, 이러한 작은 양의 PSA는 50 분획 이상으로 분포되며, 전체 PSA 검정의 민감도 한계값 이하로 희석된다.
순수한 유리 PSA의 첨가 후, 시료들은 볼텍스 (vortex)되었고, 32℃에서 2 시간동안 인큐베이션된 후, 쉐이커 (shaker)상에서 8 시간동안 실온으로 방치되었고, 그후, 4℃에서 48 시간동안 방치되었다. 모든 시료들은 분획될 때까지 크로마토그래피 냉각기 (3-4℃)내에 저장되었다. 상기 시료들은 상술된 바와 같이 Superdex 200 칼럼상에서 분획되었다. 상기 PSA 첨가 후, 상기 칼럼에 적용된 혈청의 양을 일정하게 유지시키고, 부피 증가 (1 mL 내지 1.02 mL)를 보상하기 위해, 510 mL의 모든 인큐베이션된 시료들 (PSA 용액의 첨가 전처럼 500 μL의 혈청 대신)이 Superdex 칼럼상에 적용되었다.
Bio-Rad Econo 분획 콜렉터 (collector) 시스템 (system)이 사용되었다. 연동 펌프 (peristaltic pump)의 유속 (flow rate) 및 분획 부피는 실험하는 동안 내내 일정하게 유지되었다: 유속은 0.1 mL/min (상기 펌프 상에 전시), 분획 부피는 1.1 mL이었다 (상기 분획 후 측정됨).
Superdex 칼럼을 통과한 후, 상기 시료의 단백질이 그들의 분자량에 기초하여 분리되었다. 유리 PSA는 약 30,000 달톤 (Dalton)에서 상기 칼럼으로부터 용출되었고, PSA-ACT 복합체는 약 95,000 달톤에서 용출되었다. 도 1은 전립선 암 환자의 혈청내에 첨가된 PSA의 용출 프로파일 (profile)이다. 도 2 및 3은 BPH 및 정상 혈청에 각각 첨가된 PSA의 용출 프로파일을 나타낸다. 사용된 용출 완충액은 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 0.02% BSA, 0.1% 소듐 아자이드, 0.1% Triton X-100이 용해된 탈이온수로서 pH 6.9이고, 0.2μ 필터되고 가스 제거된 (degassed) 것이다. 전체 PSA는 상기 ACS PSA 검정법을 이용하여 각 분획마다 측정되었다 (블루스테인 등 (Bluestein et al.), 1993; 쥬 등, 1994). 상기 ACS PSA 검정법은 유리 및 복합된 PSA 형태를 모두 인지한다. 30,000 및 95,000 달톤 피크 (peak) 이하의 전체 PSA는 유리 PSA 및 PSA-ACT 복합체를 각각 정량하기 위해 적분되었다.
PCa 환자 혈청내에 첨가된 PSA의 분포를 계산하기 위해, PSA 첨가 전의 피크 적분 값을 PSA 첨가 후의 피크 적분값으로부터 뺐다.
표 1 및 2는 환자 시료를 테스트한 결과를 나타낸다.
| 적분된 피크내의 전체 PSA (ng) | ||
| 시료 | 유리 PSA | PSA-ACT 복합체 |
| 6% BSA-PBS 완충액에 첨가된 PSA | 992.7 | 5.6 |
| 정상 여성 혈청에 첨가된 PSA | 355.1 | 7.6 |
| 정상 남성 혈청에 첨가된 PSA | 373.9 | 10.0 |
| BPH 환자 혈청에 첨가된 PSA | 379.6 | 10.2 |
| PCa 환자 혈청에 첨가된 PSA | 456.4 | 72.0 |
| PCa 환자 혈청내에서 PSA의 첨가 전 및 후의 피크 적분 | ||
| 시료 | 유리 PSA | PSA-ACT 복합체 |
| 순수한 PCa 혈청 (전) | 51.4 | 299.8 |
| PCa 혈청 + PSA (후) | 507.8 | 371.8 |
상기 PCa 환자 혈청에는 이미 299.8 ng의 PSA 복합체(0.5 mL내에)가 있었고, 게다가, 72 ng의 첨가된 PSA와 함께 복합체를 형성할 수 있었다. BPH 및 정상 남성은 각각 0.08 및 1.13 ng/ML의 전체 PSA를 가졌고, 유리 PSA와 인큐베이션시킨 후 둘 다 10ng의 PSA 복합체(0.5 mL, 피크 적분 내)를 가졌다.
과량의 ACT가 BPH 및 정상 남성 혈청내에 존재할 지라도 (로렐 (Laurell) 및 젭슨 (Jeppsson), 1975; 힌즈 등 (Hinds et al), 1994), 상기 PSA는 PCa 환자 혈청내에서만 ACT와 복합체를 형성하였다. 이러한 결과는 PSA와의 복합체를 형성하는 ACT의 PCa 특이적 형태가 전립선 암 환자의 혈청내에서만 존재하기 때문이다.
실시예 2:암-특이적 ACT의 정제 및 분리
암-특이적 ACT는 키세 등 (Keesee et al.)의 PNAS 91:1913-1916 (1994)에 의해 사용된 것과 유사한 방법을 이용하여 정제 및 분리되었다. BPH 및 전립선 암 환자의 혈청은 Superdex 칼럼을 통하여 분획된다. 50-70 kDa 분자량의 단백질을 포함한 모든 분획은 모아져서 농축된다. 농축된 액을 2차원 전기영동시키는데, 여기서 제 1 차원은 등전 초점화 (isoelectric focusing)이고, 제 2 차원은 SDS-PAGE이다. 상기 젤 (gel)은 실버 스테인 (silver stain)으로 표지화된다. BPH 및 전립선 암 환자 혈청의 염색 양상이 비교되고, BPH내에는 없고 암 환자 혈청 내에서는 존재하는 형태가 상기 젤로부터 추출될 것이다. ACT의 상기 순수한 전립선 암 특이적 형태는 정상 ACT와 함께 어떠한 교차-반응성 (cross-reactivity)도 보이지 않으면서 상기 형태에 대한 모노클로날 항체를 증가시키는데 사용된다. 이러한 모노클로날 항체는 암-특이적 ACT에 대한 면역검정법을 향상시키는데 사용된다. 상기 검정법은 그것이 PSA-ACT 복합체가 아니라 특이적인 ACT (복합체 및 유리 ACT 모두)를 표지화하고 측정하기 때문에 PSA 첨가를 필요로하지 않는다.
특정화 실험이 더욱 수행된다. 2-D 전기영동 후, 단백질은 나이트로셀룰로우즈 막 (nitrocelullose membrane)으로 전이되고, 모든 ACT 형태를 인지하는 ACT에 대한 폴리클로날 항체로 표지화된다. BPH 및 전립선 암 환자의 혈청의 2-D 젤의 웨스턴 블랏의 비교로 전립선 암 특이적 ACT의 정체를 더욱 확인한다. ACT의 암 특이적 형태의 실질적인 양이 분리되고 더욱 특정화되면, 이온-교환- 및 친화성-크로마토그래피법 및 제조용- (preparative-) 및 모세관-전기영동과 같은 기술을 이용하여 정제될 수 있고, 정제된 물질의 서열 (sequence)이 결정될 수 있다.
이 분야에 통상의 지식을 가진 자는 단지 평범한 실험을 이용하여 상술된 본 발명의 특정 실시예와 대등한 많은 실험을 확인할 수 있을 것이다. 상기 및 모든 다른 유사한 실험이 하기 청구항에 의해 포함되어야 한다.
Claims (20)
- 포유 동물로부터 혈청을 제공하는 단계;상기 혈청에 PSA를 첨가하는 단계;형성된 ACT-PSA 복합체의 양을 측정하는 단계; 및형성된 상기 ACT-PSA 복합체의 양에 기초하여 상기 포유동물이 전립선 암을 갖고 있는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PSA는 상기 ACT-PSA 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 상기 PSA에 결합할 수 있는 실질적으로 모든 ACT에 결합하기에 충분한 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PSA는 적어도 약 500 내지 약 1000 ng/mL의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PSA는 상기 혈청에 첨가되고, 상기 ACT-PSA 복합체 형성은 약 32℃에서 약 37℃까지의 온도에서 진행됨을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PSA가 상기 혈청에 첨가된 후 약 4시간 내지 약 8시간 동안 상기 ACT-PSA 복합체를 형성하도록하는 단계를 더욱 포함하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 측정 단계는 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 고체상 친화도법, 웨스턴 블랏의 농도계 분석법 및 면역검정법으로 이루어진 군으로부터 선택된 검정법에 의한 것임을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 측정 단계는 Superdex, Sephacryl 및 다른 젤 투과 매체로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피에 의한 것임을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 측정 단계는 PSA, ACT 및 PSA-ACT 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체를 이용하는 면역검정법에 의한 것임을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 혈청을 상기 PSA와 접촉시키기 전에 상기 혈청을 분획하는 단계를 더욱 포함하는 포유동물내의 전립선 암을 진단하는 방법.
- 전립선 암 혈청, 양성 전립선의 증식증 혈청, 정상 혈청 및 테스트 혈청을 제공하는 단계;상기 각 혈청에 PSA를 첨가하는 단계;상기 각 혈청으로 형성된 ACT-PSA 복합체의 양을 측정하는 단계; 및형성된 상기 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 테스트 혈청이 전립선 암 혈청, 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청인지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 암 혈청을 양성 전립선 증식증 혈청 또는 정상 혈청과 구별하는 방법.
- ACT의 테스트 시료를 제공하는 단계;상기 ACT를 PSA와 접촉시키는 단계;형성된 ACT-PSA 복합체의 양을 측정하는 단계; 및형성된 상기 ACT-PSA 복합체의 양에 의해 상기 ACT의 테스트 시료가 전립선 암 특이적 ACT 인지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ACT의 전립선 암 특이적 형태를 측정하는 방법.
- PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 ACT는 공지의 서열의 변종임을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 ACT는 약 60-66 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 ACT는 약 32℃부터 37℃까지의 온도에서 상기 PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있음을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 ACT는 약 2 내지 약 8시간 동안 상기 PSA와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있음을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 PSA와의 안정한 복합체는 수성 매체에 용해될 수 있고, 100℃에서 SDS 처리에 안정함을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 13항에 있어서, 상기 ACT는 전립선 암이 있는 인간으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
- 제 19항에 있어서, 상기 ACT는 상기 인간의 혈청으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 ACT의 분리된 전립선 암 특이적 형태.
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