KR102866725B1

KR102866725B1 - 유지성 효모 야로위아 리폴리티카 sur2 변이 균주 및 이를 이용한 스핑고이드 기반 전구체, 스핑고신 및 스핑고지질의 세포 표면 분비 생산방법

Info

Publication number: KR102866725B1
Application number: KR1020220088719A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 문혜연; 박해은; 신서현
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2025-10-02
Anticipated expiration: 2042-07-19
Also published as: KR20230016150A

Abstract

본 발명은 유지성 효모 야로위아 리폴리티카 sur2 변이 균주 및 이를 이용한 스핑고이드 기반 전구체, 스핑고신 및 스핑고지질의 세포 표면 분비 생산방법에 관한 것으로서, 유지성 효모 야로위아 리폴리티카에서 디하이드로스핑고신 C4-수산화효소를 코딩하는 SUR2 유전자를 비활성화시키기 위한 재조합 유전자 파쇄 벡터 시스템과 Ylsur2 결손 변이주 제작 기술, 상기 변이주의 균체와 배양액으로부터 분리한 지질 성분 분석을 통하여 축적된 스핑고신 전구체인 디하이드로스핑고신 및 스핑고신 기반 지질인 글루코실세라마이드가 세포 표면으로 매우 높은 효율로 분비 생산됨을 확인한 내용을 포함한다. Ylsur2 결손 변이주에 세라미다제 유전자를 추가로 도입하면 디하이드로스핑고신 및 스핑고신 분비 생산이 증가됨을 확인하고, 더 나아가 Ylsur2 결손 변이주에 SLD1 유전자가 추가 결손된 Ylsld1 sur2 이중 변이주를 제작하면 성장 회복과 더불어 스핑고신 및 인체형 글루코실세라마이드 분비 생산도 증가됨을 확인한 내용이 포함된다. 본 발명에 의하면, 안정성이 입증된 효모이자 지질성분 생산 우수 효모인 야로위아 리폴리티카에서 SUR2 유전자가 비활성화된 변이주에서 세포 표면으로 디하이드로스핑고신 및 글루코실세라마이드가 대량 분비됨을 확인함으로써, 스핑고신 전구체인 디하이드로스핑고신 뿐만 아니라 다양한 형태의 스핑고신 기반의 세라마이드를 대량생산할 수 있는 가능성을 제시한다.

Description

유지성 효모 야로위아 리폴리티카 sur2 변이 균주 및 이를 이용한 스핑고이드 기반 전구체, 스핑고신 및 스핑고지질의 세포 표면 분비 생산방법{Oleaginous yeast Yarrowia lipolytica sur2 mutant strain and method for cell surface-associated secretory production of sphingoid-based precursors, sphingosine and sphingolipids using the same}

본 발명은 유지성 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) sur2 변이 균주 및 이를 이용한 스핑고이드 기반 전구체, 스핑고신 및 스핑고지질의 세포 표면 분비 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 야로위아 리폴리티카의 파이토스핑고신(phytosphingosine) 생산에 관여하는 디하이드로스핑고신 C4-수산화효소를 코딩하는 SUR2 유전자가 비활성화된 변이주를 제작하고, 이를 이용하여 아세틸화 없이도 다양한 스핑고신(sphingosine) 전구체인 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine)과 스핑고신 기반 지질인 글루코실세라마이드(glucosylceramide)을 높은 효율로 세포 표면으로 분비 생산하는 방법에 관한 것이다. 더 나아가 야로위아 리폴리티카 sur2 변이 균주를 모균주로 하여 세라미다제 유전자 발현을 증폭시키거나 또는 SLD1 유전자를 추가적으로 비활성화시켜서 스핑고신(sphingosine)을 분비 생산하는 균주를 제작하는 방법에 관한 것이다.

스핑고지질은 스핑고신과 같은 스핑고이드 염기로부터 유도되는 지질 군을 나타내며, 주로 동물, 식물 및 미생물의 세포막에 존재한다. 세라마이드는 스핑고지질의 한 종류로서 스핑고이드 염기와 지방산으로 구성된 분자이다. 세라마이드는 피부의 상층인 각질층의 주요 지질 성분으로 세라마이드를 함유하는 조성물의 국소 도포로 피부의 장벽 기능 및 수분 보유 특성이 개선될 수 있다. 또한, 스핑고신, 디하이드로스핑고신을 포함한 스핑고이드 염기는 단백질 키나이제(protein kinase C, PKC)를 억제와 같은 여러 생리학적 효과를 매개하는 것으로 알려져 있으며 소염 및 항미생물 활성용의 조성물 또는 피부 및 모발 강화 조성물에 함유된다.

스핑고지질은 아미노산 세린(serine)과 지질 중 하나인 팔미테이트(palmitate)가 결합하여 세린 팔미토일전달효소(serine palmitoyltransferase, SPT)에 의해 세린에 팔미토일기가 붙음으로써 스핑고지질의 합성이 시작된다. SPT 효소 활성은 주로 기질인 포화 지방산의 농도에 의해 결정되어 스핑고지질의 생합성 정도를 조절하게 된다. 이후 3-케토 디하이드로스핑고신 환원효소(3-keto-dihydrosphingosine reductase) 의해 디하이드로스핑고신이 제작된다. 이 과정은 미생물, 식물, 동물에 공통적으로 존재하는 과정이다. 이후 식물은 파이토스핑고신(phytosphingosine)과 파이토세라마이드(phytoceramide)를 합성하여 최종적으로 글루코실 이노시톨 포스포 세라마이드 (glycosyl inositol phospho ceramides, GIPCs)와 글루코실세라마이드(glucosylceramide, GlcCer)를 생성하고, 동물은 이와 다르게 디하이드로스핑고신을 시작으로 세라마이드(ceramide)를 합성하여 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 갈락토실세라마이드(galactosylceramide), 갱글리오사이드(gangliosides), 글루코실세라마이드 등을 생산한다. 효모의 경우 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 다른 많은 비전통 효모 간에 스핑고지질 생합성에 매우 큰 차이를 가진다. 사카로마이세스 세레비시아 균주는 디하이드로스핑고신을 출발로 스핑고지질 불포화효소(sphingolipid desaturase) 효소를 코딩하는 DES1 유전자가 없어서 파이토스핑고신과 파이토세라마이드만을 만들어 만노실 이노시톨 포스포세라마이드(mannosyl inositol phospho ceramide, MIPC) 만을 생산하는 반면, 그 외 다른 많은 효모들은 DES1 유전자가 존재하여 디하이드로스핑고신을 시작으로 파이토세라마이드 뿐만 아니라 세라마이드도 생산하여 MIPC, GIPC, GlcCer를 생산할 수 있다(도 1).

이처럼 디하이드로스핑고신은 모든 생물의 스핑고지질 생산 과정에서 공통으로 존재하는 주요 물질로써 이를 이용하여 여러 종류의 스핑고지질을 합성해 나갈 수 있다. 따라서 스핑고지질 및 디하이드로스핑고신은 많은 화장품 산업에서의 중요한 성분으로 주목받고 있는데, 이러한 스핑고지질의 원료로는 지금까지 소 등의 동물 유래인 것이 사용되었지만 감염증의 문제로 인해 현재는 쌀, 밀, 대두나 감자 등의 식물성 스핑고지질이 주로 사용되고 있다. 하지만 동식물에 존재하는 스핑고지질의 양은 미량이기 때문에 추출 및 정제가 어렵고 비용이 높다는 점에서 이를 극복할 수 있는 새로운 생산 기술의 개발이 요망되고 있으며, 미생물을 이용한 스핑고지질 대량 생산 기술이 새로운 전략으로 주목을 받고 있다.

전통효모 사카로마이세스 세레비시아의 경우 4번째 탄소에 -OH기를 도입하는 디하이드로스핑고신 C4-수산화효소(dihydrosphingosine C4-hydroxylase)를 코딩하는 유전자인 SUR2가 결여된 돌연변이주에서 세포 내에 디하이드로스핑고신이 증가한 것을 확인한 바 있다. 하지만 그 생산 수준은 생체물(biomass) 1 g 당 대략 10 ug에 상응하는 세포 내 단백질 1 mg 당 단지 346 pmol인 것으로 나타났다. 이는 상용 공정에 있어서 효율적인 생산에 충분하지 못한 매우 낮은 수준이다. 야생형 사카로마이세스 세레비시아 균주 대상으로 디하이드로스핑고신 합성에 관여하는 3-케토디하이드로스핑고신 환원효소를 코딩하는 유전자인 TSC10의 증폭을 통해 디하이드로스핑고신 및 세라마이드의 합성 수준을 1 g 당 9.8 mg 수준으로 높인 재조합 효모가 기술되었다. 또한 SUR2 결손 균주에 인체 유래 DES1 유전자를 도입시켜 인간형 세라마이드(ceramide-NS)를 생산하는 재조합 효모 균주를 제작한 바 있다. 세라마이드와 달리 스핑고이드 염기는 세포자멸사(apoptosis)를 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 스핑고신을 포함한 여러 스핑고이드 염기들을 과생산하는 재조합 효모의 경우 문제가 발생할 수 있다. 피키아 시페라이(Pichia ciferrii)는 파이토스핑고신 및 그의 아세틸화 유도체를 배타적으로 생산하며, 그 생산 수준은 드 노보(de novo) 스핑고지질 생합성에 필요한 것보다 훨씬 더 높은 것으로 밝혀졌다. 즉 우수한 아세틸화효소를 통해 파이토스핑고신과 같은 스핑고이드 염기를 분비하여 이러한 문제를 우회할 수 있다. 실제로 시링고마이신 E(syringomycin E)를 이용하여 얻은 피키아 시페라이 SUR2 돌연변이 균주의 경우 디하이드로스핑고신 축적과 함께 그의 아세틸화 유도체를 과생산함이 확인되었다. 또한 피키아 시페라이는 사카로마이세스 세레비시아와는 달리 DES1이 존재하여 디하이드로스핑고신이 세라마이드로 전환될 수 있다. 스핑고지질 불포화효소 유전자 DES1의 과발현 및 추가적인 쥐 유래의 알칼라인 세라미다제 유전자의 도입으로 인해 세라마이드로부터 스핑고신을 떼어낼 수 있게 되면서 스핑고신 및 그의 아세틸화 유도체를 240 mg/L 수준까지 생산됨이 보고되었다.

유지성 효모(oleaginous yeast)인 야로위아 리폴리티카 효모는 소수성 기질을 잘 이용할 수 있는 특징이 있기 때문에 알칸과 같은 값싼 기질을 이용하여 잘 자랄 수 있을 뿐만 아니라 세포의 20% 이상 지방 함량으로 구성된 지방소립을 함유하고 있다. 이 지방소립은 대부분 트리아실 글리세리드(triacylglyceride, TAG)를 저장하고 있으며 에르고스테롤(ergosterol)과 같은 성분도 포함되며 그 양 조절을 위하여 세포 밖으로 분비 혹은 흡수한다고 알려져 있다. 야로위아 리폴리티카는 디하이드로스핑고신 합성 과정까지 미생물, 식물, 동물과 동일한 과정을 따르며, 다른 효모들의 특징과 비슷하게 이노시톨을 포함하는 여러 복잡한 스핑고지질들을 합성할 수 있다. 야로위아 리폴리티카에는 DES1 유전자가 존재하기 때문에 스핑고신을 기본 골격으로 한 여러 세라마이드 및 글루코실세라마이드를 생산할 수 있다. 야로위아 리폴리티카 균주의 경우 야생형 균주에 피키아 시페라이 아세틸화 효소 유전자인 ATF2와 SLI1를 도입하여 파이토스핑고신과 같은 스핑고이드 염기들의 아세틸화를 확인하였으며, 스핑고이드 염기에 인산기를 붙이는 스핑고이드 롱체인 베이스 키나아제(sphingoid long-chain base kinase)를 코딩하는 LCB4 유전자를 추가적으로 결손시켜 파이토스핑고신 및 그의 아세틸화 유도체 생산량을 142 mg/L 까지 높여, 최적 조건에서는 최대 650 mg/L 까지 생산함을 확인하였다. 다만, 야로위아 리폴리티카에서 아세틸화 없이, 세포 표면으로 디하이드로스핑고신, 스핑고신 및 글루코실세라마이드를 높은 효율로 대량 생산하는 기술은 개발되지 않았다.

한국공개특허 제10-2020-0031489호 (2020.03.24 공개)

본 발명의 목적은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주 내 sur2 유전자가 결손된 야로위아 리폴리티카 변이 균주 및 상기 균주를 이용한 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine), 스핑고신(sphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주 내 sur2 유전자가 결손되거나 발현이 억제된 야로위아 리폴리티카 변이 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine), 스핑고신(sphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide) 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주에 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 제공하고, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주에서 추가적으로 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자를 결손시킨, 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 제공하고, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 유지성 효모 야로위아 리폴리티카 sur2 변이 균주 및 이를 이용한 스핑고이드 기반 전구체, 스핑고신 및 스핑고지질의 세포 표면 분비 생산방법에 관한 것으로서, 유지성 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 디하이드로스핑고신 C4-수산화효소를 코딩하는 SUR2 유전자를 결손시켜 디하이드로스핑고신의 생산성이 현저히 증가된 변이주를 제작하고, 이를 이용하여 별도의 아세틸화 과정 없이 디하이드로스핑고신을 세포 표면으로 분비 생산하는 기술이다. 본 발명에 의하면, 인체에 대한 안정성이 입증된 GRAS인 야로위아 리폴리티카 sur2 변이주를 이용하면 디하이드로스핑고신을 대량 생산할 수 있을 뿐 아니라 더 나아가 타 효모들과는 달리 아세틸화 과정 없이 지방소립을 통해 세포 표면으로 분비하여 추출과정의 간소화가 가능하다. 또한, 야로위아 리폴리티카 sur2 변이주는 스핑고신 기반 지질인 글루코실세라마이드도 높은 효율로 세포 표면에 분비되는 특징을 보인다. 따라서 본 발명에서 제작된 야로위아 리폴리티카 sur2 변이주는 다양한 스핑고지질 생산 과정에서 공통으로 존재하는 주요 물질인 디하이드로스핑고신을 경제적으로 대량 생산할 수 있으며, 더 나아가 대사공학을 통해 다양한 형태의 스핑고신 및 세라마이드 등 여러 스핑고신 기반의 유용 물질을 대량 생산하는 인공 효모 개발을 위한 모균주로 제공될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 포유류, 식물, 효모의 스핑고지질 생합성 경로를 나타낸 그림이다.
도 2는 야로위아 리폴리티카 ku70 결손 균주 제작 모식도(A) 및 PCR을 통한 KU70 유전자 파쇄 확인 결과(B)이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비시아, 피키아 시페라이, 야로위아 리폴리티카 Sur2 단백질의 아미노산 서열과 도메인 분석(A) 및 sur2 결손 균주 제작을 위한 카세트 벡터 모식도와 PCR을 통한 SUR2 유전자 파쇄 확인 결과(B)이다.
도 4는 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 배지 종류에 따른 성장 곡선(A), 균체 현미경 사진(B) 및 다양한 세포벽 약화 조건 및 삼투압 스트레스 조건에서 성장을 분석한 결과(C)이다.
도 5는 디하이드로스핑고신 구조(A), 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주가 생산 분비하는 디하이드로스핑고신 확인을 위해 세포 표면, 세포 배양액, 세포질 샘플을 황산구리(CuSO₄) 검출법(B)과 닌하이드린(Ninhydrin) 검출법(C)을 사용하여 분석한 TLC 결과 및 사카로마이세스 세레비시아 sur2 결손 균주와의 비교를 통한 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 디하이드로스핑고신 분비 생산 효율을 비교한 TLC 분석 결과와 이를 정량화한 그래프(D)이다.
도 6은 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 세포 표면에서 추출한 디하이드로스핑고신에 대한 HPLC(A) 및 LC/MS/MS(B, C) 분석 결과이다.
도 7은 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 세포 표면, 세포 배양액, 세포질에서 추출한 글루코실세라마이드의 TLC 분석 결과(A)와 세포 표면 샘플에 대한 LC/MS 분석 결과(B) 및 세포질에서 추출한 이노시톨스핑고리피드의 변화를 확인한 TLC 분석 결과(C)이다.
도 8은 야로위아 리폴리티카 야생형 균주(A)와 sur2 결손 균주(B)의 스핑고지질 생합성 경로를 나타낸 도식이다.
도 9는 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에 다양한 형태의 세라미다제 유전자를 도입하여 스핑고신 생산을 증폭시키는 전략(A)과 TLC 분석 결과(B)이다.
도 10은 야로위아 리폴리티카, 캔디다 알비칸스, 피키아 파스토리스 Sld1 단백질의 아미노산 서열, 도메인 분석(A)과 sld1 결손 균주 제작을 위한 카세트 벡터 모식도와 PCR을 통한 SLD1 유전자 파쇄 확인 결과(B) 및 다양한 세포벽 약화 조건 및 삼투압 스트레스 조건에서 성장을 분석한 결과(C)이다.
도 11은 야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주의 스핑고지질 생합성 경로를 나타낸 도식(A)과 세포 표면에서 추출한 스핑고지질 분비 생산 효율을 비교한 TLC 분석 결과(B)와 글루코실세라마이드의 TLC 분석 결과(C) 및 LC/MS 분석 결과(D)이다.

이에, 본 발명자들은 유지성 효모 야로위아 리폴리티카에서 파이토스핑고신 및 파이토세라마이드 생합성 경로를 차단하기 위해 SUR2 유전자가 결손된 변이주를 제작하고, 이를 이용하여 높은 효율로 스핑고신 전구체 디하이드로스핑고신 및 스핑고신 기반 지질인 글루코실세라마이드(glucosylceramide)가 세포 표면으로 분비 생산되는 기술을 확립하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주 내 SUR2 유전자가 결손되거나 발현이 억제된 야로위아 리폴리티카 변이 균주를 제공한다.

상기 SUR2 유전자는 디하이드로스핑고신 C4-수산화효소(dihydrosphingosine C4-hydroxylase)를 코딩하는 유전자로서, 서열번호 4로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, Sur2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시될 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주는 수탁번호 KCTC 14592BP로 기탁된 균주(Yarrowia lipolytica sur2Δ) 일 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산이 증진될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide) 생산 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 배지에는 탄소원으로 글리세롤이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 방법은 추가적인 아세틸화 과정 없이 지방소립을 통해 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide)가 세포 표면으로 분비될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주에 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 제공한다.

바람직하게는, 상기 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 1 유전자 (hACER1), 서열번호 6으로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 2 유전자 (hACER2), 서열번호 7로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 3 유전자 (hACER3), 서열번호 8로 표시되는 마우스 알카리 세라미다제 1 유전자 (mACER1), 서열번호 9로 표시되는 N-단편 결손 인체 알카리 세라미다제 2 유전자 (hACER2(N12Δ)) 또는 서열번호 10으로 표시되는 야로위아 리폴리티카 세라미다제 유전자(YlYDC1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된, 인간 유래 알칼리 세라미다제 hACER1, hACER2 및 hACER3의 아미노산 서열은 각각 NCBI accession no. NP_597999.1, NCBI accession no. NP_001010887.2, NCBI accession no. AAH73853.1 일 수 있고, 마우스 유래 세라미다제 mACER1의 아미노산 서열은 NCBI accession no. NP_783858.1 일 수 있고, 야로위아 리폴리티카 유래 세라미다제 YlYdc1의 아미노산 서열은 NCBI accession no. QNP97986.1 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주에 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 야로위아 리폴리티카 변이 균주에서 추가적으로 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자를 결손시킨, 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 제공한다.

바람직하게는, 상기 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자는 서열번호 12로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, Sld1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시될 수 있다.

바람직하게는, 상기 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)은 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:1(4E)/16:0(2OH))일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주는 수탁번호 KCTC 14980BP로 기탁된 균주(Yarrowia lipolytica sld1Δ sur2Δ) 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주에서 추가적으로 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자를 결손시킨, 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산 방법을 제공한다.

더 나아가 본 발명에서 제작된 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주 또는 sld1 sur2 이중 결손 변이주를 모균주로 하여 대사공학을 통하여 다양한 형태의 스핑고신 기반의 유용 물질을 대량 생산하는 균주를 제작할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주 제작

1-1. 야로위아 리폴리티카 ku70 균주 제작

야로위아 리폴리티카 균주에서 상동재조합 (Homologous Recombination, HR) 기반의 유전자 조작 효율을 증가시키기 위해 KU70 유전자 파쇄를 통해 비상동말단연결(Non-homologous end joining, NHEJ)이 제거된 변이주를 일차적으로 제작하였다. Ku70과 Ku80은 함께 Ku 이성이량체(heterodimer)를 구성한 후 DNA 이중 가닥 절단 말단에 결합하여 DNA 복구의 비상동말단연결 경로에 관여한다. 야로위아 리폴리티카 PO1f (MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2) 균주의 지놈을 주판으로 하여 KU70 유전자인 YALI0C08701g 유전자(서열번호 2)의 promoter -286 bp 지점과 개방형 해독틀(opne reading frame, ORF) 472 bp 를 표 1에 기재되어 있는 Ylku70dNfw, Ylku70dNrv 프라이머를 이용하여 KU70 유전자의 5’ 부분을 PCR로 증폭하고 KU70 orf 1555 bp 지점 fw와 terminator 480 bp를 Ylku70dCfw, Ylku70dCrv를 이용하여 KU70 유전자의 3’ 부분을 PCR로 증폭한 후 추가적인 fusion PCR을 통해 N, C 단편을 연결 후 pT-blunt vector에 도입하여 벡터 pTB-ku70dNC 벡터를 얻었다. 이후 앞뒤로 동일한 특정 시퀀스 580bp를 가진 YlURA3 유전자를 pTB-ku70dNC 벡터 MluI 사이트에 도입하여 pTB-ku70dNC-YlURA3 벡터를 얻었다. pTB-ku70dNC-YlURA3를 주형으로 하여 표 1에 기재되어 있는 Ylku70dNfw, YlURA3Nrv의 프라이머를 이용하여 N 단편을 얻고 YlURA3Cfw, Ylku70dCrv 프라이머를 이용하여 C 단편을 얻어 야로위아 리폴리티카 PO1f 균주에 형질도입하여 세포내의 상동재조합을 통하여 Ylku70 파쇄 균주를 제작하였다(도 2A). 정확한 KU70 유전자의 파쇄 여부는 염색체를 추출 후 PCR을 통해 확인하였다(도 2B). 이후 KU70 결손 때 사용한 URA3 마커 회수를 위해 1 mg/ml 5-FOA가 포함된 YPD 배지에서 Ylku70 결손 균주를 배양하여, URA3 유전자가 제거되도록 유도하였다(도 2A).

1-2. 야로위아 리폴리티카 ku70 균주를 이용한 sur2 결손 균주 제작

본 발명자들은 야로위아 리폴리티카에서 파이토스핑고신 생합성 경로를 차단하기 위해 사카로마이세스 세레비시아 Sur2 단백질과 45.6% 동일성을 보이는 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 4)를 발굴하고 상동유전자 재조합을 이용하여 파쇄시키고자 하였다. 야로위아 리폴리티카 Sur2 단백질은 다른 효모와 약간의 구조적 차이를 보였다. 사카로마이세스 세레비시아에 비하면 약간 적은, 피키아 시페라이에 비하면 약간 많은 막도메인을 가지고 있었으며, C 말단에 소포체 시그널 시퀀스(ER signal sequence) 인 KKXX를 가지는 대신 polyampholyte, polar 구조를 가졌다. 그러나 fatty acid hydroxylase 도메인은 잘 보전되어 있었다(도 3A).

야로위아 리폴리티카 SUR2 유전자 파쇄 카세트를 제작하기 위해 SUR2 promoter -668 bp 지점과 개방형 해독틀(opne reading frame, ORF) 100 bp 를 표 1에 기재되어 있는 Ylsur2dNfw, Ylsur2dNrv 프라이머를 이용하여 SUR2 유전자의 5' 부분을 PCR로 증폭하고 SUR2 orf 1,011 bp 지점 fw와 terminator 639 bp를 Ylsur2dCfw, Ylsur2dCrv를 이용하여 SUR2 유전자의 3' 부분을 PCR로 증폭한 후 5' 부분과 3' 부분이 동시에 가지고 있는 MluI-NheI-SalI 부분을 이용한 fusion-PCR을 통해 5' 부분과 3' 부분을 연결한 후, pT Blunt 벡터에 도입하여 pTB-SUR2dNC 벡터를 제작하였다. 이후 YlLEU2 유전자 단편을 PCR로 증폭, NheI/SalI 처리 후 NheI/SalI 처리된 pTB-SUR2dNC 벡터와 연결시켜 pTB-SUR2d NC-YlLEU2 벡터를 제작하였다. 이후 pTB-SUR2dNC-YlLEU2 벡터에 SpeI/NsiI을 처리하여 카세트를 준비한 후 앞서 제작한 야로위아 리폴리티카 ku70 결손 균주에 형질전환을 수행하여 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주를 제작하였다(도 3B).

본 발명에 사용된 프라이머들은 표 1에 기재하였다.

Primer	Sequence (5`→3`)	Description
ku70dNfw	gagcggtttgctcgaaaccagt	YlKU70 deletion
ku70dNrv	tacagtcgacgcgtgggcgtatcgattatcgtcgtctgtgatatagatgattcg
ku70dCfw	cgatacgcccacgcgtcgactgtaaggctgagaagaaagtcaagag
ku70dCrv	gagcggtttgctcgaaaccag
URA3Nrv	cagctcggccagcatgag
URA3Cfw	ccaacctgtgtgcttctctgg
Ylsur2dNfw	cgaccgaaaatgtgcaagcg	YlSUR2 deletion
Ylsur2dNrv	acgagctagccgcgcgacgcgtcgagtggtggaatggagtgtttg
Ylsur2dCfw	gaacagtcgactggagcttctacttccgagc
Ylsur2dCrv	catgcgtcctctcctccacgattc
LEU2fw	cgcgcggctagctcgtcgcctgagtcatcatttat
LEU2rv	gctccagtcgactgttcggaaatcaacggatgctc
Scsur2dNfw	tcaccccgcgtccttcttcgggcagtcgcgcttttctccggcttctgcggaaattgaagctctaatttgtgagtttag	ScSUR2 deletion
Scsur2dCrv	ctcatcagttttcgaagatttcaagaaagtccgaagaacatttaagaccttttcaattcaattcatcattttttttttattctt	ScSUR2 deletion
TEF1pfw	ccggaattcagagaccgggttggcggcgt	hACER1 expression
TEF1p(h1)rv	tgcgaagatcgaaggcattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgc
hACER1fw	gagtataagaatcattcaaaatgccttcgatcttcgcataccaatc
hACER1rv	atcaccggcaaactatctgtctaacaatccttgtcatctccccgaa
XPR2t(h1)fw	ggggagatgacaaggattgttagacagatagtttgccggtgataattctctta
XPR2trv	ctagtctagaggggggctagccacgggcatctcacttgcgc
TEF1p(h2)rv	caccaatgaggtgctcccattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgc	hACER2 expression
hACER2fw	gagtataagaatcattcaaaatgggagcacctcattggtgg
hACER2rv	atcaccggcaaactatctgtctaggtaatcttaacgctgctctttttgttag
XPR2t(h2)fw	agagcagcgttaagattacctagacagatagtttgccggtgataattctctta
TEF1p(h2Δ)rv	cagtccacctcagacgacattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgc	hACER2 (12Δ) expression
hACER2(12Δ)fw	gagtataagaatcattcaaaatgtcgtctgaggtggactgg
hACER2(12Δ)rv	caccggcaaactatctgtctaggtaatcttaacgctgctctttttg
XPR2t(h2Δ)fw	gagcagcgttaagattacctagacagatagtttgccggtgataattctctta
TEF1p(h3)rv	cgatctgcggcgggggccattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgc	hACER3 expression
hACER3fw	gagtataagaatcattcaaaatggcccccgccgcagatcg
hACER3rv	atcaccggcaaactatctgtctagtgttttcgaagaggttcaaagagaatc
XPR2t(h3)fw	ctttgaacctcttcgaaaacactagacagatagtttgccggtgataattctctta
TEF1p(m1)rv	tccagggacgtgcattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgc	mACER1 expression
mACER1fw	gagtataagaatcattcaaaatgcacgtccctggaacgag
mACER1rv	atcaccggcaaactatctgtctaacagttcttatcattttcctggatctc
XPR2t(m1)fw	ggaaaatgataagaactgttagacagatagtttgccggtgataattctctta
TEF1p(YDC1)rv	gggattcctccaggtagcattttgaatgattcttatactcagaaggaaatgcttaacg	YlYDC1 expression
YlYDC1fw	gagtataagaatcattcaaaatgctacctggaggaatcccatacc
YlYDC1rv	atcaccggcaaactatctgtctagttgtgatggttaacaga
XPR2t(YDC1)fw	ctgttaaccatcacaactagacagatagtttgccggtgataattctcttaac
YlSLD1dNfw	atgcagacggataggtggtggg	YlSLD1 deletion
YlSLD1dNrv	ctcaagctggacaactggctcgatggtagctacttacgcgatcgtagggccagctg
YlSLD1dCfw	ccatcgatgaatgcgctagcatcccggtcgacgtgactgtgagcgacatcttcg
YlSLD1dCrv	cggctaaccagaaacggtcctatc

*밑줄 : 제한효소

본 발명에 제작된 균주는 표 2에 기재하였다.

Strain	Description	Source /Reference
Y. lipolytica PO1f	MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2	ATCC MYA-2613
Ylku70Δ	MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 ku70:tc	This study
S. cerevisiae BY4742	MATα his3A1 leu2A0 lys2A0 ura3A0	Open Biosystems
Ylsur2Δ	MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 ku70::tc sur2::YlLEU2	This study
Scsur2Δ	MATα his3A1 leu2A0 lys2A0 ura3A0 sur2::ScURA3	This study
hACER1/Ylsur2Δ	pIMR53-hACER1/Ylsur2Δ	This study
hACER2/Ylsur2Δ	pIMR53-hACER2/Ylsur2Δ	This study
hACER2(12Δ)/Ylsur2Δ	pIMR53-hACER2(12Δ)/Ylsur2Δ	This study
hACER3/Ylsur2Δ	pIMR53-hACER3/Ylsur2Δ	This study
mACER1/Ylsur2Δ	pIMR53-mACER1/Ylsur2Δ	This study
YlYDC1/Ylsur2Δ	pIMR53-YlYDC1/Ylsur2Δ	This study
Ylsld1Δ	MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 ku70::tc sld1::YlURA3	This study
Ylsld1Δ sur2Δ	MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 ku70::tc sur2::YlLEU2 sld1::YlURA3	This study

< 실시예 2> 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 성장 특징 분석

실시예 1에서 제작된 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주(Ylsur2△)의 탄소원 종류 및 배지 조성에 따른 성장 패턴을 확인하기 위해 Ylsur2△의 모균주인 Ylku70△/PO1f 균주와 비교 분석하였다. 2 ml의 YPD 배지에서 전배양한 균주 배양액을 YPD 혹은 GB 25 ml 배지에 OD600=0.1로 접종하여 28℃, 220 rpm 조건의 혼합 배양기로 배양하였으며, 일정 시간마다 OD₆₀₀값을 측정하여 성장 곡선 그래프를 작성하였다. 그 결과 YPD 배양 약 36 시간째 가장 높은 OD₆₀₀값을 보인 WT 균주에 비해 Ylsur2 결손 균주의 경우 그보다 약 2 배가량 더 오랜 시간인 72 시간째에 가장 높은 OD600값을 나타냈다. 즉 Ylsur2 결손 균주의 성장 패턴은 유도기(lag phase) 및 생장기(logarithmic growth phase)가 길어 정체기(stationary phase)에 도달하기까지 비교적 오랜 시간이 걸린다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 탄소원으로 글루코스가 아닌 8% 글리세롤을 포함하는 GB 배지에서 배양할 경우 정체기에 도달하기까지의 시간이 단축되어 야생형 균주와의 성장 차이를 어느 정도 극복하는 것을 확인하였다(도 4A).

또한, YPD 배지에서 24 시간 배양한 현미경 사진에서 Ylsur2 결손 균주가 모균주에 비해 훨씬 높은 비중으로 균사 형태로 성장하는 것을 확인하였다(도 4B).

야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 세포 내 구조 중 취약 부분을 알아보기 위해 온도 스트레스(30~39℃), 세포벽 및 삼투압 스트레스를 주는 물질(NaCl, SDS, CFW(=Fluorescent Brightener 28), caffeine), 그리고 항생제가 포함된 다양한 YPD 배지 조건에서 성장 패턴을 확인하였다. YPD 플레이트에 도말한 후 4일 동안 키운 결과, Ylsur2 결손 균주는 30℃부터 성장이 저해되고 33℃부터는 거의 자라지 못하는 것으로 보아 온도에 매우 민감해진 것을 확인할 수 있다. 또한, 삼투압 및 세포벽 스트레스에도 매우 민감해진 것을 확인할 수 있으며, 단백질 합성 억제 물질인 하이그로마이신(hygromycin B)이 포함된 배지 조건에서도 성장이 감소하였다. 이러한 특징은 정상적이지 않은 스핑고지질 생산으로 세포막이 약화되어 세포벽이 여러 스트레스에 취약해지고 항생제 물질 또한 세포 내로 쉽게 투과되어 나타난 결과로 여겨진다. 하지만 세포벽 스트레스 조건 중 하나인 카페인(caffeine)과 DNA 이중 가닥 분리 유도 물질인 지오신(zeocin)이 포함된 일부 배지에서 저항성을 보이기도 하였다(도 4C).

< 실시예 3> TLC 분석을 통한 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 디하이드로스핑고신 세포표면 분비 생산 확인

스핑고지질 성분들은 소수성인 특징으로 인해 배지 밖으로 분비되기보다 세포 표면에 뭉쳐 있는 특징을 가진다. 따라서 세포 표면에 모여있는 스핑고지질들을 회수하기 위해 배양 후 세포 펠렛(cell pellet)을 회수하여 1 g 당 10 ml의 메탄올을 첨가하고 30분간 소니케이션(sonication)을 수행하였다. 이후 건조를 통해 10 ml 메탄올에 녹여져 있는 샘플을 1 ml로 10 배 농축하여 최종적인 세포표면 샘플을 얻었다. 세포 배양액(supernatant) 샘플의 경우 균주 배양액을 원심분리하여 분리한 상층액을 동량의 클로로포름:메탄올(2:1, v/v)과 섞은 후 원심분리된 아래층을 사용하였다. 세포질(cytosol) 샘플의 경우 세포표면(surface) 샘플 회수 후 남은 세포 펠렛을 클로로포름:메탄올:물(20:10:1, v/v)에 풀어 비드비터(beadbeater)로 세포를 깨준 후 동결 건조시켜 메탄올에 녹여냈다. 모든 샘플은 동일하게 건조시킨 후 1 ml의 메탄올로 농축하여 준비하였다.

TLC silica gel 60 플레이트에 추출한 샘플을 10 ul씩 집적하여 클로로포름:메탄올:암모니아수(18:2:1)로 이루어진 비극성 용매를 사용하여 전개하였다. 전개 후 황산구리(CuSO4) 검출법을 사용하여 전체적인 지질 변화를 분석함과 동시에 닌하이드린(Ninhydrin) 용액을 사용하여 스핑고이드 염기, 그 중 디하이드로스핑고신을 확인하고자 하였다(도 5A). 전개 후 완전히 말린 TLC 플레이트를 황산구리와 닌하이드린 용액에 적셔준 뒤 완전히 건조 시켜 200℃에서 태워 확인하였다. 사용한 검출용액은 10% 황산구리의 경우 8% 황산에 녹여 사용하였으며, 0.2% 닌하이드린은 에탄올에 녹여 사용하였다. 비교를 위해 스핑고신, 디하이드로스핑고신 및 파이토스핑고신 표준품과 함께 전개하였다.

황산구리검출법을 사용한 TLC 분석 결과, Ylsur2 결손 균주의 세포표면(surface), 배양액(culture supernatant), 세포질(cytosol) 샘플 모두에서 디하이드로스핑고신을 확인할 수 있다. 이는 파이토스핑고신 합성을 담당하는 SUR2 유전자의 결손으로 인해 디하이드로스핑고신이 축적되는 것으로 해석할 수 있으며, 세포질(cytosol)뿐 아니라 세포표면(surface) 및 배양액(culture supernatant) 샘플에서도 디하이드로스핑고신이 확인되는 것으로 보아 지방 방울(lipid droplet)을 통해 분비될 수 있음을 나타낸다(도 5B).

본 실험에서는 순수한 스핑고이드염기만을 확인하기 위해 스핑고지질의 기본 골격인 세린의 아미노기(NH₂)에 반응할 수 있는 닌하이드린 검출법도 함께 사용하였다. 황산구리 검출법으로 확인한 디하이드로스핑고신 밴드가 닌하이드린 검출법으로도 확인되는 결과를 통해, 해당 물질은 스핑고지질의 아미노기(-NH₂)에 어떠한 물질도 연결되지 않은 스핑고이드염기 자체, 즉 디하이드로스핑고신임을 재확인하였다(도 5C). 이러한 결과들을 통해 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 디하이드로스핑고신이 축적되고 그중 많은 양이 세포 표면과 배지로 분비되고 있음을 유추할 수 있다.

야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 디하이드로스핑고신을 분비 생산하는 특징이 타 효모들과는 달리 본 균주만의 특이적인 현상임을 확인하기 위해 사카로마이세스 세레비시아와 야로위아 리폴리티카의 디하이드로스핑고신 세포 표면 분비 효율을 비교 분석하였다. 샘플 추출법 및 TLC 분석 방법은 실시예 3과 동일하며, 검출은 닌하이드린 용액을 이용하였다. TLC 분석 결과, 사카로마이세스 세레비시아 sur2 결손 균주의 세포표면(surface) 및 배양액(culture supernatant)에서 디하이드로스핑고신이 전혀 확인되지 않은 것으로 보아 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 특이적으로 디하이드로스핑고신이 분비 생산된다는 것을 알 수 있다(도 5D).

< 실시예 4> HPLC 및 LC/MS/MS 분석을 통한 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 디하이드로스핑고신 분비 생산 확인

실시예 3에서 사용한 세포표면(surface) 스핑고지질 샘플을 이용하여 HPLC 분석을 수행하였다. Cosmosil packed column 5C18-PAQ , 4.1ID x 250 mm 컬럼(40℃) 및 MeOH:water:ammonia (80:19.5:0.5) mobile phase를 0.5 ml/min 속도를 이용하여 210 mM UV detector로 분석한 결과, 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 디하이드로스핑고신 표준품과 동일한 위치에서 밴드가 확인되었다(도 6A). 한편, LC/MS/MS 분석을 수행한 결과에서도 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 생산되는 물질이 디하이드로스핑고신 표준품과 동일함을 확인하였다(도 6B 및 도 6C).

따라서, 본 발명에서 개발된 디하이드로스핑고신 분비 생산 효모 균주는 생산성 및 분리정제의 간편성 측면에서 복잡한 세포 내 추출법을 대신할 효과적인 대안으로 대두되고 있는 스핑고지질의 세포 표면 대량 생산을 위한 숙주로써 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

< 실시예 5> TLC 분석을 통한 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 글루코실세라마이드 및 이노시톨스핑고리피드 생합성 확인

야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 전체적으로 변화된 지질 성분을 분석하기 위해 스핑고지질 합성 경로의 최종 단계 물질인 글루코실세라마이드와 이노시톨스핑고리피드(Inositolsphingoilipid)를 확인하고자 하였다. 샘플 준비는 실시예 3 과 동일하게 준비하여 TLC 분석을 수행하였다. 글루코실세라마이드의 확인을 위해 전개 용매의 성분을 바꿔 클로로포름:메탄올:아세트산:물 (20:3.5:2.5:0.7, v/v)로 전개 후 검출용액에 적셔준 뒤 완전히 건조 시켜 80℃에서 반응시켰다. 검출용액은 황산:물:에탄올 (5:13:27) 45 ml 당 0.1 g의 오르시놀(orcinol)을 녹여 사용하는데, 이는 TLC 분석에서 글루코시드(glycosides) 및 글리코리피드(glycolipids)를 확인하기 위해서 사용되는 검출법 중 하나로 글루코실세라마이드의 글루코스(glucose)와 반응하여 TLC 플레이트 상에서 보라색 밴드로 나타난다. 비교를 위해 표준품은 GlcCer(d18:1(4E)/16:0)와 GlcCer(d18:2(4E,8E)/16:0(2OH))를 사용하였다.

TLC 분석 결과, 야로위아 리폴리티카 야생형 균주와 sur2 결손 균주의 세포표면(surface) 샘플에서 GlcCer(d18:2(4E,8E)/16:0(2OH)) 표준품과 일치하는 밴드가 나타났으며, Ylsur2 결손 균주에서 해당 밴드가 약간 진해진 것을 확인하였다. 또한 Ylsur2 결손 균주에서만 특이하게 GlcCer(d18:1(4E)/16:0) 표준품과 유사한 위치의 밴드가 나타났다(도 7A).

가장 많은 양의 글루코실세라마이드를 확인했던 세포표면(surface) 샘플을 가지고 LC/MS 분석을 수행한 결과, 야생형 균주와 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주 모두 GlcCer(d18:2(4E,8E)(9Me)/16:0(2OH)) 이 가장 많은 양으로 존재하며, Ylsur2 결손 균주에서 그 양이 약 3배 가량 증가하였다. 이외에도 WT, Ylsur2 결손 균주 모두에서 확인된 GlcCer(d18:2(4E)/16:0(2OH))은 GlcCer(d18:2(4E,8E)(9Me)/16:0(2OH))에 비해 매우 소량 존재함을 확인하였다. 도 7A에서 확인된 GlcCer(d18:1(4E)/16:0) 표준품과 일치하는 밴드는 매우 소량이기에 LC/MS 분석으로는 확인되지 않은 것으로 보인다(도 7A 및 도 7B).

다음으로, 야로위아 리폴리티카에 존재하는 또 다른 최종 스핑고지질 중 하나인 이노시톨스핑고리피드를 확인하기 위해 추가적인 TLC 분석을 진행하였다. 샘플 준비 및 TLC 분석 방법은 S. Tanaka and M. Tani. (2018)을 참고하였다. YPD, 8시간 배양한 균주의 cell pellet을 회수하여 ethanol/water/diethyl ether/pyridine/15 M ammonia (15:15:5:1:0.018, v/v) 350 ul과 함께 65도에서 15분 반응시킨 후 상층액을 분리하여 잘 말려준 뒤 monomethylamine(40% in methanol)/water (10:3, v/v) 130 ul으로 53도, 1시간 반응시켜 불필요한 인지질을 제거해주었다. 이후 잘 말려진 샘플을 chloroform/methanol/water (5:4:1, v/v) 60 ul에 녹여 준비하였다. TLC silica gel 60 플레이트에 야생형 균주와 Ylsur2 결손 균주에서 추출한 샘플을 15 ul씩 집적하여 클로로포름:메탄올:4.2M암모니아(9:7:2, v/v)로 이루어진 용매를 사용하여 전개하였다. 비교를 위해 참고한 논문에서 사용한 사카로마이세스 세레비시아 야생형 균주(BY4742)를 함께 분석하였다. 전개 후 황산구리(CuSO4) 검출법을 사용하여 확인하였으며, IPC, MIPC 및 M(IP)2C의 구분은 사카로마이세스 세레비시아 균주의 분석 결과로 유추하였다. TLC 분석 결과, 야로위아 리폴리티카 야생형 균주의 경우 파이토스핑고신 염기를 기본 골격으로 한 B type(t18:0/24:0) 혹은 지방 사슬에 수산화기가 붙은 C type(t18:0/24:0(2OH))이 주로 확인된 반면, 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 경우 파이토스핑고신이 전혀 만들어지지 않기 때문에 디하이드로스핑고신 염기를 기본 골격으로 한 A type(d18:0/24:0)과 지방 사슬에 수산화기가 붙은 B’ type(d18:0/24:0(2OH))도 약하게 확인되었다(도 7C).

따라서 TLC 및 세포표면 샘플의 LC/MS 결과를 기반으로 야로위아 리폴리티카 야생형 및 sur2 결손 균주의 스핑고지질 생합성 경로를 정리하자면 다음과 같다(도 8).

야로위아 리폴리티카 야생형 균주의 경우 대부분의 이노시톨스핑고리피드가 파이토세라마이드를 골격으로 하여 합성되며, LC/MS 결과에서 모든 type의 IPC와 MIPC(t18:0/24:0(2OH), C type)가 확인된 것으로 보아 대부분 Scs7로 인해 지방산 사슬에 수산화기(-OH)가 붙은 구조를 가진다. 또한 글루코실세라마이드는 이노시톨스핑고리피드에 비해 비교적 많은 양이 세포표면으로 분비되고 있으며 디하이드로스핑고신을 기본 골격으로 합성된다는 것을 확인하였다. 이후 △4 desaturase (Des1), α-hydroxylase (Scs7), △8 desaturase (Sld1), C9 methyltransferase (Mts1)가 작용하여 여러 구조의 세라마이드를 합성할 수 있다. 최종적으로 glucosylceramide synthase (Hsx11)에 의해 글루코실세라마이드를 합성하게 되며, 앞서 설명한 효소들이 모두 작용하여 만들어진 GlcCer(d18:2(4E,8E)(9Me)/16:0(2OH)) 구조가 가장 많은 비율로 존재한다(도 8A).

이와 달리 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주의 경우 파이토스핑고신 합성을 담당하는 SUR2 유전자의 결손으로 인해 디하이드로스핑고신을 골격으로 한 MIPC(d18:0/24:0, A type)를 합성해낸다는 것을 알 수 있다. 한편 야생형 균주에 비해 많은 양의 글루코실세라마이드가 세포표면으로 분비되는 것으로 보아 SUR2 유전자의 결손으로 인해 많은 양의 디하이드로스핑고신이 축적되어 이를 기본 골격으로 하는 글루코실세라마이드의 합성도 함께 증가하였음을 유추할 수 있다(도 8B).

<실시예 6> 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 세라미다제 유전자 과발현을 통한 스핑고신 생합성 증폭

야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 인체, 마우스 유래의 세라미다제 유전자를 추가 발현시켜 세라마이드로부터 스핑고신 생합성을 증폭하고자 하였다(도 9A). 세라마이드에서 스핑고신을 생산한다고 알려진 인체 유래의 세 종류의 알칼리 세라미다제 ACER1, ACER2, ACER3 및 마우스 유래의 세라미다제 ACER1을 코딩하는 유전자들을 야로위아 리폴리티카에 코돈 최적화를 통해 합성하였다. 인체 유래 알칼리 세라미다제 유전자 hACER1(서열번호 5), hACER2(서열번호 6), 및 hACER3(서열번호 7), 마우스 유래 세라미다제 유전자 mACER1(서열번호 8), 소포체 발현을 유도하기 위해 N말단 12개의 아미노산을 제거한 인체 유래 알칼리 세라미다제 2 유전자 hACER2(N12Δ)(서열번호 9), 야로위아 리폴리티카 유래의 세라미다제 유전자 YlYDC1(서열번호 10) 정보가 담긴 DNA 절편을 PCR 및 fusion PCR 방식으로 표 1에 기재된 프라이머를 활용하여 TEF1 promoter와 XPR2 terminator로 연결하여 준비한 후 pIMR53 CEN 벡터에 도입하여 pIMR53-hACER1, pIMR53-hACER2, pIMR53-hACER2(12Δ), pIMR53-hACER3, pIMR53-mACER1, pIMR53-YlYDC1을 제작하였다.

각각의 벡터를 Ylsur2 결손 균주에 도입하여 hACER1/Ylsur2Δ, hACER2/Ylsur2Δ, hACER2(N12Δ)/Ylsur2Δ, hACER3/Ylsur2Δ, mACER2/Ylsur2Δ, YlYDC1/Ylsur2Δ 균주를 제작하였다(표 2). 각 균주를 SC-U 배지에서 4일 배양한 pellet 샘플에 10 ml/g 되게 메탄올을 처리한 후 30분간 sonication 하여 원심분리하여 얻은 상등액을 TLC 분석에 사용하였다. 그 결과 세라미다제를 도입한 모든 균주에서 스핑고신 뿐만 아니라 디하이드로스핑고신의 생산이 증가하였다(도 9B). 그러나 글루코실세라마이드를 분석한 TLC 에서는 YlYDC1/Ylsur2Δ 균주에서만 글루코실세라마이드가 감소하는 양상을 보였다(도 9C). 비록 야로위아 리폴리티카 세라미다제 과발현 균주가 다른 세라미다제 과발현 균주들에 비해 스핑고이드 전구체의 축적이 더 우세하진 않지만, 세라마이드를 분해하여 스핑고신 및 디하이드로스핑고신을 생산하는 능력이 더 우세한 것으로 분석된다.

<실시예 7> 야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주 제작 및 성장 특징 분석

야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주에서 스핑고신 생합성 경로를 증폭하기 위해 △8 불포화효소(desaturase) 단백질을 코딩하는 SLD1 유전자(서열번호 12)를 추가적으로 상동유전자 재조합 기법을 이용하여 파쇄시키고자 하였다. 야로위아 리폴리티카 Sld1 단백질은 캔디다 알비칸스와 피키아 파스토리스와 달리 low complexity와 coiled coil 구조가 존재하는 약간의 구조적 차이를 보였다. 그러나 cytochrome b5-like heme/steroid binding, fatty acid fatty acid desaturase, histidine box, 막 도메인은 잘 보전되어 있었다(도 10A).

야로위아 리폴리티카 SLD1 유전자 파쇄 카세트를 제작하기 위해 SLD1 프로모터 -869 bp 지점과 개방형 해독틀(ORF) 152 bp을 포함한 SLD1 유전자의 5’부분을 PCR로 증폭하고, ORF 1,582 bp 지점과 terminator 955 bp를 포함한 SLD1 유전자의 3’ 부분을 PCR로 증폭한 후 5’ 부분과 3’ 부분이 동시에 가지고 있는 ClaI-NheI-SalI 부분을 이용한 fusion-PCR을 통해 5’ 부분과 3’부분을 연결한 후 pT Blunt 벡터에 도입하여 pTB-SLD1dNC 벡터를 제작하였다. 이후 YlURA3 유전자 단편을 PCR로 증폭한 후 ClaI/NheI을 처리하고 ClaI/NheI 처리된 pTB-SLD1dNC 벡터와 연결시켜 pTB-SLD1dNC-YlURA3(TcR) 벡터를 제작하였다. 이후 pTB-SLD1dNC-YlURA3(TcR) 벡터에 HindIII/NsiI을 처리하여 카세트를 준비한 후 앞서 제작한 야로위아 리폴리티카 야생형 균주 및 sur2 결손 균주에 형질전환을 수행하여야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주(Ylsld1△) 및 sld1 sur2 이중 결손 균주(Ylsld1△ sur2△)를 제작하였다(도 10B).

야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주의 성장 특징을 알아보기 위해 온도 스트레스(20~35℃), 삼투압 스트레스를 주는 물질(NaCl, Sorbitol, KCl), ER 스트레스를 주는 물질(Tunicamycin, DTT), 세포벽 스트레스를 주는 물질(Caffeine, SDS, CFW, Congo red, Hygromycin B)이 포함된 YPD 배지 조건에서 배양하였다. YPD 플레이트에 점적한 후 3일 동안 키운 결과, Ylsld1 결손 균주는 야생형 균주보다 정상적인 배양 조건에서도 성장이 약간 저해되었고 온도 스트레스 조건 하에서 더욱 성장이 저해됨이 관찰되었다. 또한, Ylsld1 결손 균주는 세포벽 스트레스를 유발하는 Congo red와 hygromycin B에 더욱 민감성이 증가되었으나 카페인이 포함된 배지에서 저항성을 보이기도 하였다. 이러한 특징은 정상적이지 않은 스핑고지질 생산으로 세포막이 약화되어 세포벽이 여러 스트레스에 취약해지고 분자량이 큰 항생제 물질 또한 세포 내로 쉽게 투과되어 나타난 결과로 여겨진다. 이에 반해 Ylsld1 sur2 이중 결손 균주는 Ylsur2 결손 균주에 비해 성장이 다소 회복되었고 스트레스 조건 배지 하에서도 증가된 저항성을 보였다. 그러나, KCl과 하이그로마이신(hygromycin B)이 포함된 일부 배지에서 더욱 증가된 민감성을 보였다. 이는 SUR2를 결손시키면서 과도하게 디하이드로스핑고신이 축적되면서 야기된 세포막의 구조 변화로 인한 불안정성이 SLD1 추가 결손으로 다소 안정화되면서 성장이 회복된 결과로 여겨진다(도 10C).

< 실시예 8> TLC 및 LC/MS 분석을 통한 야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주의 스핑고신 및 글루코실세라마이드 세포표면 분비 생산 확인

야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주, sld1 sur2 이중 결손 균주에서 전체적으로 변화된 지질 성분을 분석하기 위해 순수한 스핑고이드 염기와 스핑고지질 합성 경로의 최종 단계 물질인 글루코실세라마이드를 확인하고자 하였다. 샘플 준비는 실시예 3 과 동일하게 준비하여 TLC 분석을 수행하였다. TLC 분석 결과 야로위아 리폴리티카 sur2 결손 균주(Ylsur2△)에 비해 야로위아 리폴리티카 sld1 sur2 이중 결손 균주(Ylsld1△ sur2△)의 경우 디하이드로스핑고신의 생산량이 감소하였다(도 11A). 또한 Ylsur2 결손 균주에 비해 최종형의 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:2(4E,8E)9Me/16:0(2OH)) 생산량이 줄어들고 새로운 형태의 글루코실세라마이드 밴드(빨간색 화살표)가 생성된 것을 확인하였다. 새로운 글루코실세라마이드는 C8 double 밴드와 C9 methylation 수식이 없어서 보다 인체형 글루코실세라마이드와 유사한 구조를 갖는다(도 11B).

더 자세한 분석을 위해 LC/MS 분석을 수행한 결과 야로위아 리폴리티카 sld1 sur2 이중 결손 균주의 스핑가디에닌(sphingadiene, Sd) 생산이 차단되고, 줄어든 스핑가디에닌 양 만큼 스핑고신(sphingosine, So) 생산량이 증가하였으며, 디하이드로스핑고신의 양 역시 sur2 결손 균주에 비해 줄어든 것을 확인하였다. 또한 야로위아 리폴리티카 sld1 결손 균주 및 sld1 sur2 이중 결손 균주 모두 각각 대조군인 야생형 균주 및 Ylsur2 결손 균주에 비해 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:2(4E, 8E)9Me/16:0(2OH))의 양이 감소하였고, 대신 Sld1에 의한 C8 이중결합 생성 과정 및 Mts1에 의한 C9 methylation 과정이 생략된 세라마이드를 이용한 글루코실세라마이드 GlcCe(d18:1(4E)/16:0(2OH)) 생산량이 증가하였다(도 11C).

따라서 세포표면 샘플의 TLC 및 LC/MS 결과를 기반으로 Ylsld1△ sur2△ 균주의 스핑고지질 생합성 경로를 정리하자면 다음과 같다(도 11D). SUR2가 결손됨으로써 증가한 디하이드로스핑고신이 SLD1이 추가적으로 결손되면서 스핑고신 골격을 기반으로 한 세라마이드 대사 경로가 증가되어 디하이드로스핑고신의 양이 약간 감소하고, 스핑가디에닌의 생산 경로가 차단되면서 스핑고신이 증가하였음을 알 수 있다. 또한 스핑고리피드의 스핑고신의 8번째에 이중결합 생성을 차단함으로써 기존의 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:2(4E, 8E)/16:0(2OH))의 양이 감소하고 인체형 구조에 더 가까운 새로운 형태의 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:1(4E)/16:0(2OH))가 주요 글루코실세라마이드로 생산되었다(도 11D). 이는 야로위아 리폴리티카 SLD1 유전자 결손이 세라마이드에서 글루코실세라마이드가 생성되는 경로를 완전히 차단하는 것이 아니라 다른 우회 경로를 통해 글루코즈가 부착되어 최종적으로 구조가 변화된 글루코실세라마이드를 생산할 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14592BP

20210602

한국생명공학연구원

KCTC14980BP

20220519

서열목록 전자파일 첨부

Claims

야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주 내 SUR2 유전자가 결손되거나 발현이 억제된 야로위아 리폴리티카 변이 균주로서, 상기 변이 균주는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 균주.
제1항에 있어서, 상기 SUR2 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 균주.
제1항에 있어서, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 균주는 수탁번호 KCTC 14592BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 균주.
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 야로위아 리폴리티카 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide) 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 배지에는 탄소원으로 글리세롤이 포함되는 것을 특징으로 하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide) 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 방법은 추가적인 아세틸화 과정 없이 지방소립을 통해 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide)가 세포 표면으로 분비되는 것을 특징으로 하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 글루코실세라마이드(glucosylceramide) 생산방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 야로위아 리폴리티카 변이 균주에 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제8항에 있어서, 상기 세라미다제(ceramidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 1 유전자 (hACER1), 서열번호 6으로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 2 유전자 (hACER2), 서열번호 7로 표시되는 인체 알카리 세라미다제 3 유전자 (hACER3), 서열번호 8로 표시되는 마우스 알카리 세라미다제 1 유전자 (mACER1), 서열번호 9로 표시되는 N-단편 결손 인체 알카리 세라미다제 2 유전자 (hACER2(N12Δ)), 또는 서열번호 10으로 표시되는 야로위아 리폴리티카 세라미다제 유전자 (YlYDC1) 인 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제8항에 따른 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine) 또는 스핑고신(sphingosine)의 세포 표면 분비 생산 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 야로위아 리폴리티카 변이 균주에서 추가적으로 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자를 결손시킨, 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산이 증진된 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제11항에 있어서, 상기 △8 불포화효소(△8 desaturase)를 코딩하는 SLD1 유전자는 서열번호 12로 표시되는 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제11항에 있어서, 상기 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)은 글루코실세라마이드 GlcCer(d18:1(4E)/16:0(2OH))인 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제11항에 있어서, 상기 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주는 수탁번호 KCTC 14980BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주.
제11항에 따른 야로위아 리폴리티카 변이 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 스핑고신(sphingosine) 또는 인체형 글루코실세라마이드(glucosylceramide)의 세포 표면 분비 생산 방법.